KR102207550B1 - 감소된 아스파라긴 함량을 갖는 식물 - Google Patents

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Abstract

아스파라긴 합성효소의 감소된 발현 또는 활성을 가지는 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물 또는 그의 부분이 제공되고, 아스파라긴 합성효소는 (i) 서열번호 1에 대해 적어도 90%의 서열 동일성 또는 서열번호 3 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7에 대해 적어도 72%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 폴리뉴클레오티드 서열; 또는 (ii) (i)에 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드; 또는 (iii) 서열번호 2 또는 서열번호 4 또는 서열번호 6 또는 서열번호 8에 대해 적어도 78%의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되며; 여기서 (i), (ii) 또는 (iii)에 기재된 아스파라긴 합성효소의 발현 또는 활성은 대조군 식물에 비교하여 감소된다.

Description

감소된 아스파라긴 함량을 갖는 식물
본 발명은 니코티아나 타바쿰 유래 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열 및 그의 변이체, 상동체 및 단편을 개시하고 있다. 상기 암호화된 폴리펩티드 서열과 그의 변이체, 상동체 및 단편 또한 개시하고 있다. 상기 하나 이상의 유전자들의 발현 또는 상기 암호화된 단백질(들)의 활성을 변형함으로써, 식물 내의 아스파라긴의 수준을 조절하는 것이 개시되어 있다.
아크릴아미드는 식 C3H5NO(IUPAC 명칭은 프로프-2-엔아미드임)의 화학적 화합물이고 그것의 잠재적 독성과 관련하여 관심이 증가하고 있다. 담배를 포함하는 흡연 물품의 에어로졸 중의 아크릴아미드의 기원은 상기 흡연 물품의 제조를 위해 사용된 담배 물질에 존재할 수 있는 아미노산 아스파라긴일 수 있다. 그러므로 식물, 특히 담배 제조에 사용된 그런 식물들에서 특정 아미노산 -예컨대 아스파라긴-의 수준을 감소시키는 것이 바람직할 수 있다.
US2013/0068240은 적어도 한 아미노산의 감소를 나타내어 담배의 가열 및/또는 연소시 변형되지 않은 본래의 담배 식물에 비교하여 적어도 하나의 아미노산으로부터 유래한 화합물의 감소된 수준을 생성하는 유전적으로 변형된 담배 식물 및 담배 제품을 기술한다. 궐련 연기 중의 감소된 수준의 아스파라긴 및 감소된 아크릴아미드 수준을 가지는 돌연변이 담배 주(line)를 얻기 위해 에틸메탄 설포네이트(EMS)로 종자를 돌연변이시키는 방법이 기술된다. 다양한 EMS 돌연변이들이 US2013/0068240에 기술된다. 연도 경화된(flue cured) 상부 줄기 잎에서, 세 개의 EMS 돌연변이, 즉 FC Up 10NH-5, FC Up 10NH-18 및 FC-Up 10NH-23은: (i) 각각 아스파라긴의 71%, 30% 및 62%의 감소; (ii) 각각 담배 연기 중의 아크릴아미드의 47%, 42% 및 44%의 감소; 및 (iii) 각각 연도 경화된 상부 줄기 담배의 니코틴의 38% 감소, 111% 증가 및 19% 감소를 나타냈다. 그러므로, 아스파라긴 및 아크릴아미드 감소의 각각 71% 및 47%의 최고 수준은 돌연변이 FC Up 10NH-5로 이루어졌다. 그러나, 이 돌연변이에서, 니코틴 수준은 대조군과 비교하여 38% 감소를 나타냈다. 연도 경화된 중간 줄기 잎에서, 세 개의 EMS 돌연변이, 즉 FC Mid 10NH-5, FC Up 10NH-18 및 FC-Up 10NH-23은: (i) 각각 아스파라긴의 6% 감소, 531% 증가 및 29% 감소; (ii) 각각 담배 연기 중의 아크릴아미드의 19% 감소, 140% 증가 및 200% 증가; 및 (iii) 각각 연도 경화된 중간 줄기 담배의 니코틴의 36% 감소, 113% 증가 및 19% 감소를 나타냈다. 그러므로, 19%의 아크릴아미드 감소의 최고 수준은 돌연변이 FC Up 10NH-5로 이루어졌지만 아스파라긴 수준은 단지 6% 감소되었고 니코틴 수준은 36% 감소하였다.
각각 71% 및 47%의 아스파라긴 및 아크릴아미드 감소의 최고 수준이 FC Up 10NH-5의 연도 경화된 상부 줄기 잎에서 발견된다. 그러나, 이 돌연변이에서 니코틴 수준은 대조군과 비교하여 38% 감소를 나타냈다. FC Up 10NH-5의 연도 경화된 중간 줄기 잎에서, 대조군과 비교하여 아크릴아미드 수준은 단지 19% 감소되었고, 아스파라긴 수준은 단지 6% 감소되었으며, 다시 니코틴 수준의 (36%의)감소가 있었다.
니코틴 수준의 감소는 담배 제품의 소비자가 동일한 수준의 니코틴을 받아들이기 위해 더 많은 담배를 소비할 것을 필요로 할 것이기 때문에 바람직하지 못하다. 또한 아스파라긴, 아크릴아미드 및 니코틴의 수준은 다양한 EMS 돌연변이들 사이에서 광범위하고 무작위로 달라진다는 것이 US2013/0068240에 제시된 결과로부터 명백하다.
식물에서 아스파라긴의 수준을 감소시키고 그로써 가열된 또는 연소된 식물 부분으로부터 생성된 에어로졸 중의 아크릴아미드의 양을 최소화하는 대체 방법을 찾는 것이 바람직하다. 또한 추가로 US2013/0068240에 개시된 것들보다 낮은 수준으로 아크릴아미드의 양을 추가로 감소시키는 방법을 찾는 것이 바람직하다. 또한 식물에서 니코틴의 수준을 유지하는 것이 바람직하다. 또한 이들 특성을 가진 식물을 지속적으로 생산할 수 있는 방법을 개발하는 것이 바람직하다. 본 발명은 이러한 요구를 해결하고자 한다.
NtASN1-S (서열번호 1), NtASN1-T (서열번호 3), NtASN3-S (서열번호 9), NtASN3-T (서열번호 11), NtASN5-S (서열번호 5) 및 NtASN5-T (서열번호 7)로 불리는 6개의 전장 아스파라긴 합성효소 유전자가 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)에서 확인되었다. ASN3-S 및 ASN3-T 유전자가 경화 중에 단지 빈약하게 발현되는 것으로 밝혀진 반면, 놀랍게도 NtASN1-S, NtASN1-T, NtASN5-S 및 NtASN5-T는 경화 중에, 예를 들면 경화의 처음 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100시간 동안 고도로 발현되는 것으로 밝혀졌다. 적합하게는, ASN3-S 또는 ASN3-T 유전자 또는 그로써 암호화된 단백질들은 본 개시에서 사용되지 않는다. NtASN1 및/또는 NtASN5 의 발현 또는 그로써 암호화된 단백질(들)의 활성을 감소시키는 것은 본원에서 경화된 잎-예컨대 경화된 중간-하부 줄기 잎의 아스파라긴의 감소된 수준에 기여하는 것으로 나타난다. 이것은 계속해서 경화된 잎의 가열 또는 연소시에 생성된 에어로졸에서 아크릴아미드의 감소된 수준을 초래한다. US2013/0068240에서 얻어진 결과와 대조적으로, NtASN1 또는 NtASN5 의 발현을 감소시키는 것은 잎의 아스파라긴의 감소를 초래할뿐만 아니라, 또한 에어로졸 중의 아크릴아미드의 감소를 지속적으로 초래한다. 이런 일관된 아스파라긴 및 아크릴아미드 수준의 감소는 대조군 식물과, 만약 더 높지 않다면, 거의 동일한, 경화된 잎의 니코틴의 수준을 수반한다. 유익하게도, 실질적으로, 니코틴 함량에 최소한의 영향을 미치거나 영향을 미치지 않으면서, 아스파라긴의 약 89%의 감소 및 아크릴아미드의 약 70% 감소의 낮은 값이 본 개시의 특정 구현예들에서 얻어질 수 있다.
이론에 의해 구속되기를 바라지 않으면서, 담배 에어로졸에서 생성된 아크릴아미드가 잎 경화 중에 생성되는 아스파라긴의 푸울(pool)에 의존적인 것으로 추가로 측정되었다. 따라서, 에어로졸 중의 아크릴아미드 수준은 경화 또는 건조의 초기 단계 중에 활성인 아스파라긴 합성효소의 발현 또는 활성을 조절(예컨대 감소)함으로써 경화 또는 건조 중에 생성된 아스파라긴의 푸울을 감소시킴으로써 조절(예컨대 감소)될 수 있다. 아스파라긴의 감소된 함량을 가지고 아스파라긴 합성효소의 감소된 발현 또는 기능을 나타내는 식물들이 기술된다. 구현예들에서, 이것은 경화 또는 건조 중에 발현되는, 본원에 기술된 아스파라긴 합성효소 코딩 서열의 RNA 간섭 또는 돌연변이를 사용하여 이루어진다. 아스파라긴 수준을 감소시키는 것은 에어로졸에 존재하는 아크릴아미드의 양을 감소시킨다. 담배에 적용될 때, 이것은 가열된 또는 연소된 담배 제품을 포함하여, 흡연 물품의 소비자에 의해 흡입되는 에어로졸에 존재하는 아크릴아미드의 더 낮은 양을 초래한다. 본 발명의 추가의 장점이 여기에 기술된다.
본 발명의 측면들 및 구현예들
본 발명의 측면들 및 구현예들이 첨부된 청구범위에 기재되어 있다.
한 측면에서, 아스파라긴 합성효소의 감소된 발현 또는 활성을 가지는 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물 또는 그의 부분이 제공되고, 상기 아스파라긴 합성효소는 (i) 서열번호 1에 대해 적어도 72% 또는 적어도 90%의 서열 동일성 또는 서열번호 3 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7에 대해 적어도 72%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 폴리뉴클레오티드 서열; 또는 (ii) (i)에 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드; 또는 (iii) 서열번호 2 또는 서열번호 4 또는 서열번호 6 또는 서열번호 8에 대해 적어도 78%의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되며; 여기서 (i), (ii) 또는 (iii)에 기재된 아스파라긴 합성효소의 발현 또는 활성은 대조군 식물에 비교하여 감소된다.
적합하게는, 식물은 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 조절 영역에 또는 코딩 서열에 적어도 하나의 유전자 변경을 포함한다.
도 1은 동일한 현장에서 재배되고(5개의 플롯 복제물의 평균) 동시에 경화된 3개의 상이한 버얼리 담배의 아스파르테이트(Asp), 글루타민(Glu), 아스파라긴(Asn) 및 총 유리 아미노산(aa) 함량을 도시한다. 3개의 버얼리는 TN90(A), Banket A1(B) 및 Kentucky 14(C)이다.
도 2는 버얼리 잎의 경화 중에 아스파라긴, 글루타민 및 아스파르테이트 진화의 시간-경과를 도시한다.
도 3은 아스파라긴 합성효소 활성 경로를 도시한다.
도 4는 담배 단일 등급, 버지니아(FC), 오리엔탈(OR), 카스투리(KS) 또는 버얼리(BU)에서의 아스파라긴의 존재와 버지니아(FC), 카스투리(KS) 및 오리엔탈(OR)의 혼합물을 포함하는 블렌드(RRP로 언급됨) 사이에 이미 존재하는 상관관계를 도시한다.
도 5는 스위스 버얼리 스텔라(Swiss Burley Stella)를 스위스에서 성장시키고 공기-경화된 곳간에서 10주 동안(고전적 농경 실시, BU-AC) 또는 연도-경화된 오븐에서, 정확히 스위스 버지니아 담배처럼(BU-FC) 경화시킬 때 얻어진 결과를 도시한다. 경화 후에, 잎 잎몸이 빻아지고 아스파라긴 측정이 수행된다(A). 담배 물질의 균질화된 분말(200 ㎛ 이하)이 만들어졌다. 균질화된 담배 물질은 에어로졸-생성 장치에 사용하기 위하여 필수적으로 WO2013098405에서 기술된 것과 같이 에어로졸-생성 물품에 사용되었다. 에어로졸-생성 물품은 에어로졸 중의 아크릴아미드 함량을 측정하기 위하여 헬스 캐나다 흡연 레짐(Health-Cnada smoking regime)을 사용하여 훈제되었다(B).
도 6은 아라비돕시스 단백질 AtASN1(At3g47340), AtASN2(At5g65010) 및 AtASN3(At5g10240) 및 토마토 단백질 Solyc06g007180 및 Solyc04g055200과 비교된 NtASN1-S, NtASN1-T, NtASN3-S, NtASN3-T, NtASN5-S, NtASN5-T에 상응하는 담배 유전자로부터 추론된 아미노산 서열의 계통수를 도시한다.
도 7은 2010년도에 스위스에서 성장된 스위스 버얼리 담배(Stella)의 경화 중에 ASN 유전자의 발현을 도시한다. ARN은 96시간 경화까지 현장에서(-4시간) 및 공기-경화 곳간에서 시간-경과 방식으로 수집된 잎 샘플(중간-줄기 위치)로부터 분리되었다. 특이적 프로브상의 유전자 발현은 아피메트릭스 톱어레이 칩(Affymetrix Tobarray chip)을 사용한 마이크로어레이 분석을 사용함으로써 측정되었다.
도 8은 48시간 경화 후에 스위스 버얼리(Stella, A & C) 및 스위스 버지니아(Bright, ITB 683, B & B) 담배에서의 ASN 유전자의 발현을 도시한다.
도 9는 2013년도에 페이에른 현장에서 성장된 4개의 상이한 버얼리 잎(하부 줄기 위치)에서 60시간 공기-경화 후에 ASN1, ASN5 (A) 및 ASN3(B)의 수확-후 발현을 도시한다.
도 10은 현장에서 성장된 성숙한 버얼리 담배로부터 수집된 8개의 조직에서의 ASN1, ASN5 (좌측 패널) 및 ASN3 (우측 패널)의 발현을 도시한다(미성숙한 꽃(Im_꽃; 하부의 잎,_LS,중간,_MS 및 상부,_US,줄기 위치; 꽃임, 뿌리, 꽃받침 및 줄기).
도 11은 MMV 또는 E4 프로모터의 제어 하에 온실에서 성장된 ASN1-RNAi 식물의 아스파라긴 함량 및 3일의 경화 후에 측정된 ASN1 전사물 수준을 도시한다. 아스파라긴의 양은 각 형질전환 사건의 15 식물로부터의 중간-바닥 줄기 잎 위치에서 측정되었다(A). ASN1 전사물의 상대적 발현은 각 형질전환 사건으로부터의 15 식물에서 3일의 경화 후에 수집된 RNA를 사용하여 qPCR에 의해 추정되었다(B).
도 12는 MMV 또는 E4 프로모터의 제어 하에 온실에서 성장된 ASN1-RNAi 식물에서의 글루타민, 아스파르테이트, 글루타메이트 및 니코틴 함량을 도시한다. Gln(A), Asp(B), Glu(C) 및 니코틴(D)의 양은 각 형질전환 사건의 15 식물로부터의 중간-바닥 줄기 잎 위치에서 측정되었다.
도 13은 MMV 또는 E4 프로모터의 제어 하에 온실에서 성장된 ASN5-RNAi 식물에서의 아스파라긴 함량 및 3일의 경화 후에 측정된 ASN5 전사물 수준을 도시한다. 아스파라긴의 양은 각 형질전환 사건의 15 식물로부터의 중간-바닥 줄기 잎 위치에서 측정되었다(A). ASN5 전사물의 상대적 발현은 각 형질전환 사건으로부터의 15 식물에서 3일의 경화 후에 수집된 RNA를 사용하여 qPCR에 의해 추정되었다(B).
도 14는 MMV 또는 E4 프로모터의 제어 하에 온실에서 성장된 ASN5-RNAi 식물에서의 글루타민, 아스파르테이트, 글루타메이트 및 니코틴 함량을 도시한다. Gln(A), Asp(B), Glu(C) 및 니코틴(D)의 양은 각 형질전환 사건의 15 식물로부터의 중간-바닥 줄기 잎 위치에서 측정되었다.
도 15는 ASN1- 및 ASN5-RNAi 주의 잎 바이오매스를 도시한다. 4개의 잎이 각 형질전환 사건의 4 식물로부터 중간-줄기 위치에서 수집되었고, 무작위로 선택되고 무게가 측정되었다. 중량 평균 및 표준 편차가 도시된다.
도 16은 스위스 버얼리(Stella) 공기-경화의 초기 단계 중에 CYP82E4의 발현을 도시한다. 전사물은 사이토크롬 P450 모노옥시게나제 CYP82E4에 대해 특이적 프로브 NtPMIa1g2e2_st를 기반으로 톱어레이 아피메트릭스 칩을 사용하여 측정되었다.
도 17은 ASN 변종에서의 아스파라긴 감소의 백분율을 도시한다. 백분율 값은 각 변종 주에 대하여 WT 외부-분리 개체에 대비하여 계산되었다.
도 18은 중간-바닥 줄기 위치에서 수확된 경화된 잎(4)의 바이오매스를 도시한다.
도 19는 WO2013/098405에서 기술된 것과 같이, ASN1-RNAi, ASN5-RNAi 및 그의 각각의 대조군 잎으로 만들어진 에어로졸 형성 물품을 가열함으로써 생성된 에어로졸 중의 아크릴아미드의 측정을 도시한다. 아스파라긴은 50% 버지니아 담배와 섞인 후 ASN1-RNAi, ASN5-RNAi 및 대조군 잎(도 11 및 도 13 참조)으로부터의 미세한 분말에서 측정되었다(A, C). 담배 블렌드는 캐스트(cast) 잎에서 형질전환되고 에어로졸 형성 물품 내에서 가열되었다. 다음에 아크릴아미드가 에어로졸에서 측정되었다(B, D).
도 20은 ASN1-RNAi 및 그의 각각의 대조군 중간-줄기 잎 잎몸의 절단-충전제로부터 만들어진 연소성 궐련의 연기에서의 아크릴아미드의 측정을 도시한다. 아스파라긴(패널 A)은 ASN1-RNAi 및 대조군 잎으로부터 제조된 절단-충전제에서 측정되었다. 연소성 궐련은 훈제되고 아크릴아미드는 연기에서 분석된다.
도 21은 ASN1-S_정지 돌연변이 및 대조군(WT 외부-분리개체) 잎으로 만들어진 에어로졸-생성 물품으로부터의 에어로졸 중의 아크릴아미드의 측정을 도시한다. 아스파라긴은 50% 버지니아 담배와 섞인 후 ASN1-S_정지 돌연변이 및 대조군 잎으로부터의 미세한 분말에서 측정되었다(A). 담배 블렌드는 캐스트 잎으로 형질전환되고 에어로졸-형성 물품으로부터 에어로졸이 생성되었다. 에어로졸 중의 아크릴아미드가 다음에 측정되었다(B).
도 22는 ASN-RNAi 식물을 생성하기 위해 사용된 벡터의 실례를 도시한다.
적합하게는, 아스파라긴 합성효소의 감소된 발현 또는 활성은 대조군 식물로부터 유래한 경화되거나 건조된 잎의 아스파라긴의 수준에 비교하여 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물 또는 그의 부분으로부터 유래한 경화되거나 건조된 잎의 아스파라긴의 수준의 감소를 부여하고, 적합하게 이때 아스파라긴의 수준은 대조군 식물에 비교하여 적어도 약 17% 감소된다.
적합하게는, 아스파라긴 합성효소의 감소된 발현 또는 활성은 대조군 식물로부터 유래한 경화되거나 건조된 잎에 비교하여 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물 또는 그의 부분으로부터 유래한 경화되거나 건조된 잎을 가열 또는 연소할 때 생성된 에어로졸 중의 아크릴아미드의 수준의 감소를 부여하고, 적합하게 이때 에어로졸 중의 아크릴아미드의 수준은 대조군 식물의 경화되거나 건조된 잎에 비교하여 적어도 20% 감소된다.
적합하게는, 대조군 식물의 경화되거나 건조된 잎 및 에어로졸보다 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물 또는 그의 부분으로부터 유래한 경화되거나 건조된 잎의 아스파라긴의 수준은 적어도 약 22% 낮고 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물 또는 그의 부분으로부터 유래한 경화되거나 건조된 잎을 가열 또는 연소할 때 생성된 에어로졸 중의 아크릴아미드의 양은 적어도 24% 낮으며; 적합하게는, 대조군 식물의 경화되거나 건조된 잎 및 에어로졸보다 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물 또는 그의 부분으로부터 유래한 경화되거나 건조된 잎의 아스파라긴의 수준은 적어도 약 44% 낮고 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물 또는 그의 부분으로부터 유래한 경화되거나 건조된 잎을 가열 또는 연소할 때 생성된 에어로졸 중의 아크릴아미드의 양은 적어도 66% 낮으며; 적합하게는, 대조군 식물의 경화되거나 건조된 잎 및 에어로졸보다 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물 또는 그의 부분으로부터 유래한 경화되거나 건조된 잎의 아스파라긴의 수준은 적어도 약 70% 낮고 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물 또는 그의 부분으로부터 유래한 경화되거나 건조된 잎을 가열 또는 연소할 때 생성된 에어로졸 중의 아크릴아미드의 양은 적어도 약 88% 낮다.
적합하게는, 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물 또는 그의 부분으로부터의 경화되거나 건조된 잎의 니코틴 수준은 대조군 식물의 경화되거나 건조된 잎의 니코틴 수준과 실질적으로 동일하다.
적합하게는, 글루타민, 아스파르트산 및 글루탐산의 형성은 대조군 식물의 경화되거나 건조된 잎에 비교하여 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물 또는 그의 부분으로부터 유래한 경화되거나 건조된 잎에서 증가된다.
적합하게는, 식물은 담배 또는 차(Camellia sinensis)로 구성되는 군으로부터 선택된다.
적합하게는, 담배 식물은 니코티아나 타바쿰 담배 식물, 바람직하게는 버얼리형(Burley type) 니코티아나 타바쿰 담배 식물이다.
적합하게는, 식물은 (i), (ii) 또는 (iii)에 기재된 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 각 사본에 적어도 하나의 돌연변이, 적합하게 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 RNA 전사물의 번역을 간섭하는 정지 돌연변이(들) 및/또는 유전자 단편(들)을 포함한다.
적합하게는, 아스파라긴 합성효소 뉴클레오티드 서열은 서열번호 19, 21 및 23의 정지 돌연변이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 위치와 동등한 위치에 정지 돌연변이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 아스파라긴 합성효소는 서열번호 20, 22 및 24의 정지 코돈의 위치와 동등한 위치에서 정지 코돈을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
적합하게는, 아스파라긴 합성효소는 서열번호 19, 21 및 23으로 구성되는 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 서열번호 19, 21 및 23으로 구성되는 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되거나, 또는 서열번호 20, 22 및 24에 기재된 폴리펩티드 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 필수적으로 구성된다.
적합하게는, 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물 또는 그의 부분으로부터의 잎 바이오매스의 양은 대조군 식물로부터의 잎 바이오매스의 양과 실질적으로 동일하다.
적합하게는, 잎은 공기 경화되고, 적합하게는, 공기 경화된 잎은 태양 경화되거나 화력(fire) 경화된다.
적합하게는, 잎은 공기 건조되고, 적합하게는, 공기 건조된 잎은 태양 건조되거나 화력 경화된다.
다른 측면으로, 본 개시의 식물로부터의 식물 재료 또는 경화되거나 건조된 식물 재료가 제공된다.
다른 측면으로, 본 개시의 식물 또는 식물 재료의 적어도 일부를 포함하는 식물 제품이 제공된다.
다른 측면으로, 대조군 식물로부터의 식물 재료에 비교하여 감소된 아스파라긴의 수준 및 식물 재료로부터 유래한 에어로졸 중의 감소된 아크릴아미드의 수준을 갖는 식물 재료의 제조 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 아스파라긴 합성효소를 암호화하고 서열번호 1에 대해 적어도 72% 또는 적어도 90% 서열 동일성 또는 서열번호 3 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7에 대해 적어도 72% 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 또는 그것의 부분을 제공하는 단계; (b) 식물 또는 그것의 부분에서 폴리뉴클레오티드의 발현 또는 그로써 암호화된 단백질의 활성을 감소시키는 단계; (c) 식물 또는 그것의 부분으로부터 식물 재료를 수확하는 단계;(d) 식물 재료를 건조 또는 경화시키는 단계; (e) 선택적으로, 식물 또는 그것의 부분에서 아스파라긴의 수준을 측정하고 및/또는 식물 또는 그것의 부분으로부터 유래한 에어로졸 중의 아크릴아미드의 수준을 측정하는 단계; 및 (f) 상기 식물 재료의 감소된 아스파라긴의 수준 및 상기 식물 재료로부터 유래한 에어로졸 중의 감소된 아크릴아미드의 수준을 가지는 경화되거나 건조된 식물 재료를 얻는 단계를 포함하고, 적합하게는, 니코틴 수준은 대조군 식물의 니코틴 수준과 실질적으로 동일하며; 적합하게는, 글루타민, 아스파르트산 및 글루탐산의 형성은 대조군 식물의 경화되거나 건조된 잎에 비교하여 증가된다.
적합하게는, 식물 재료는 수확 후 적어도 약 3일 동안 경화 또는 건조된다.
적합하게는, 식물 재료는 공기 경화되고, 적합하게는, 공기 경화된 잎은 태양 경화되거나 화력 경화된다.
적합하게는, 식물 재료는 공기 건조되거나 또는 태양 건조 또는 화력 건조된다.
이 방법에 의해 얻어진 또는 얻을 수 있는 식물 재료 또한 개시된다.
다른 측면으로, 하나 이상의 유전자 변경을 포함하지 않은 대조군 식물에 비교하여 식물로부터의 경화되거나 건조된 식물 재료 중의 감소된 아스파라긴의 수준 및 경화되거나 건조된 식물 또는 그것의 부분으로부터 유래한 에어로졸 중의 감소된 아크릴아미드의 수준과 상관되는 식물에서의 하나 이상의 유전자 변경을 확인하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 대조군 식물로부터의 식물 재료에 비교하여 식물로부터의 식물 재료 중의 감소된 아스파라긴의 수준 및 경화되거나 건조된 식물 재료로부터 유래한 에어로졸 중의 감소된 아크릴아미드의 수준을 가지는 경화되거나 건조된 식물을 확인하는 단계; (b) 단계 (a)에서 확인된 식물로부터 핵산 샘플을 제공하는 단계; 및 (c) 단계 (b)로부터의 핵산 샘플에서 아스파라긴 합성효소를 암호화하고 서열번호 1에 대해 적어도 72% 또는 적어도 90%의 서열 동일성 또는 서열번호 3 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7에 대해 적어도 72%의 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열의 하나 이상의 유전자 변경을 확인하는 단계를 포함한다.
다른 측면으로, 대조군 식물에 비교하여 감소된 아스파라긴의 수준 및 경화되거나 건조된 식물 재료로부터 유래한 에어로졸 중의 감소된 아크릴아미드의 수준을 가지는 식물 재료의 생산 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 본 개시에 따라 식물 또는 식물 재료를 제공하는 단계; (b) 식물로부터 식물 재료를 수확하는 단계; (c) 일정 시간 동안 식물 재료를 경화 또는 건조시키는 단계; 및 (d) 감소된 아스파라긴의 수준 및 경화되거나 건조된 식물 재료로부터 유래한 에어로졸 중의 감소된 아크릴아미드의 수준을 가지는 경화되거나 건조된 식물 재료을 얻는 단계를 포함하고, 적합하게는, 니코틴 수준은 대조군 식물의 니코틴 수준과 실질적으로 동일하며; 적합하게는, 글루타민, 아스파르트산 및 글루탐산의 형성은 상기 대조군 식물에 비교하여 증가된다.
다른 측면으로, 아스파라긴 합성효소를 암호화하고 서열번호 1에 대해 적어도 72% 또는 적어도 90%의 서열 동일성 또는 서열번호 3 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7에 대해 적어도 72%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는, 또는 아스파라긴 합성효소를 암호화하고 서열번호 19, 21 및 23에 대해 적어도 72%의 서열 동일성을 가지되, 서열번호 19, 21 및 23에 대해 적어도 72%의 서열 동일성을 가지는 서열은 서열번호 19, 21 및 23의 정지 코돈의 위치와 동등한 위치에서 정지 코돈을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 분리된 폴리뉴클레오티드 서열이 제공되며, 바람직하게는 상기 분리된 폴리뉴클레오티드는 합성 폴리뉴클레오티드 또는 cDNA이다.
다른 측면으로, 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 분리된 폴리펩티드가 제공된다.
다른 측면으로, 아스파라긴 합성효소를 암호화하고 서열번호 2 또는 서열번호 4 또는 서열번호 6 또는 서열번호 8 또는 서열번호 20 또는 서열번호 22 또는 서열번호 24에 대해 적어도 78%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는, 또는 아스파라긴 합성효소를 암호화하고 서열번호 2 또는 서열번호 4 또는 서열번호 6 또는 서열번호 8 또는 서열번호 20 또는 서열번호 22 또는 서열번호 24에 대해 적어도 78%의 서열 동일성을 가지되, 단 서열번호 20 또는 서열번호 22 또는 서열번호 24에 대해 적어도 78%의 서열 동일성을 가지는 서열이 서열번호 20 또는 서열번호 22 또는 서열번호 24에서 정지 코돈의 위치에 동등한 위치에서 정지 코돈을 포함하는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 분리된 폴리펩티드가 제공되며, 바람직하게 상기 분리된 폴리뉴클레오티드는 합성 폴리뉴클레오티드 또는 cDNA이다.
다른 측면으로, 본원에 기술된 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 구성체, 벡터 또는 발현 벡터가 제공된다.
다른 측면으로, 본원에 기술된 식물로부터의 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물 세포가 제공된다.
다른 측면으로, 본원에 기술된 세포를 포함하는 경화되거나 건조된 식물 재료가 제공된다.
다른 측면으로, 본원에 기술된 식물 재료를 포함하는 담배 제품 또는 흡연 물품이 제공된다.
기재된 구현예들의 하나 이상의 조합이 또한 개시된다.
몇몇 장점들
본원에서 아스파라긴이 경화 동안에 능동적으로 생성되는 것으로 나타난다. 이런 아스파라긴의 축적은 경화된 식물 재료가 가열되거나 연소될 때 생성된 에어로졸에서 아크릴아미드의 형성을 유도하는 것으로 나타난다. 유익하게도, NtASN1-S, NtASN1-T, NtASN5-S 및 NtASN5-T는 경화 중에, 특히 경화가 시작될 때부터 고도로 발현된다. 이들 유전자의 하나 이상의 발현을 감소시키는 것은 아스파라긴의 수준이 경화 과정 전체를 통해 감소될 수 있기 때문에 에어로졸 중의 아크릴아미드의 더 낮은 수준을 초래할 수 있다.
본원에서 기술된 변형된 식물의 니코틴 수준에 대한 영향은 제한되고, 그것은 변형된 식물이 담배 식물의 제조를 위해 사용되도록 의도될 때 바람직하다.
본원에 기술된 방법은 경화 또는 건조 중에 아스파라긴의 축적이 감소되고 에어로졸 중의 아크릴아미드의 형성이 또한 감소되는 식물을 일관되게 초래한다.
상업적 목적을 위해 본원에 기술된 변형된 식물을 사용할 때 유익한 잎 바이오매스 및 표현형에 대한 영향은 제한된다.
본 발명은 소비자에게 더 많이 허용될 수 있는 비-유전적 변형된 식물이 생성되는 것을 허용한다.
본 발명은 US2013/0068240에서와 같이 EMS 돌연변이 식물의 사용에 한정되지 않는다.
EMS 돌연변이 식물은 번식 후 농작물에 개선된 특성을 줄 수 있는 가능성이 적을 수 있다. 일단 번식이 시작되면, EMS 돌연변이 식물의 바람직한 특성(들)은 상이한 이유로 손실될 수 있다. 예를 들어, 여러 돌연변이가 필요할 수 있고, 돌연변이는 우성 또는 열성일 수 있으며, 유전자 표적에서 점 돌연변이의 확인은 도달하기 어려울 수 있다. 대조적으로, 본 발명은 바람직한 표현형을 가지는 식물을 생성하기 위하여 특이적으로 조작될 수 있고 및/또는 녹아웃될 수 있는 특정 유전자의 사용을 탐색한다. 개시는 다른 담배 변종 또는 농작물에도 적용될 수 있고, 그로써 적어도 아크릴아미드를 감소시키기 위하여 바람직한 해결책을 제공할 수 있다.
정의
본 출원의 범위 내에서 사용되는 기술적인 용어들 및 표현들은 식물 및 분자 생물학의 관련된 분야에서 통상적으로 적용되는 의미가 일반적으로 주어져야 한다. 모든 이하의 용어 정의는 본 출원의 완전한 내용에 적용된다. 용어 "포함하는(comprising)"은 다른 요소 또는 단계를 배제하지 않고 부정관사 "a" 또는 "an"는 복수를 배제하지 않는다. 단일 단계는 청구항에 인용된 여러 개의 특징의 기능을 충족시킬 수도 있다. 주어진 숫자 값 또는 범위의 문맥에서 용어 "약", "필수적으로" 및 "대략"은 주어진 값 또는 범위의 20% 이내, 10% 이내, 또는 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 이내의 값 또는 범위를 말하는 것이다.
용어 "단리된(isolated)"은 자연적인 환경으로부터 얻어진 개체를 나타낸 것이지만 이 용어는 어떠한 정제도도 내포하지 않는다.
"발현 벡터"는 핵산의 발현을 가능하게 하기 위한 핵산 성분의 조합을 포함하는 핵산 비히클(vehicle)이다. 적절한 발현 벡터는 원형의, 이중 가닥의 핵산 플라스미드; 선형의 이중가닥의 핵산 플라스미드; 및 임의의 기원의 다른 기능적으로 동등한 발현 벡터와 같은 과잉 염색체 복제가 가능한 에피솜(episome)을 포함한다. 발현 벡터는 이하에서 정의된 바와 같이 핵산, 핵산 구성체 또는 핵산 접합체(conjugate) 상류에 위치하고 작동가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter)를 적어도 포함한다.
용어 "구성체(construct)"는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥, 재조합 핵산 단편을 나타낸 것이다. 구성체는 상보적인 "센스 또는 암호화 가닥"으로 염기쌍을 이룬 "주형 가닥(template strand)"을 포함한다. 주어진 구성체는 두 가지 가능한 방향으로 벡터로 삽입될 수 있는데, 즉, 발현 벡터 같은 벡터 내에 위치한 프로모터의 방향과 관련해서 동일한(또는 센스) 방향 또는 역(또는 안티-센스) 방향으로 삽입될 수 있다.
"벡터(vector)"는 핵산, 핵산 구성체 및 핵산 접합체 기타 등등의 수송을 가능하게 하기 위한 핵산 성분들의 조합을 포함하는 핵산 비히클을 나타낸 것이다. 적절한 벡터는 원형의, 이중가닥의 핵산 플라스미드; 선형의 이중가닥의 핵산 플라스미드; 및 임의의 기원의 다른 벡터와 같은 과잉 염색체 복제가 가능한 에피솜을 포함한다.
"프로모터(promoter)"는 전형적으로 이중가닥의 DNA 단편의 상류에 위치하고 작동가능하게 연결되어 있는, 핵산 요소/서열을 나타낸 것이다. 프로모터는 관심 있는 고유한 유전자(native gene)에 근접한 영역으로부터 전체적으로 유도될 수 있거나, 다른 고유한 프로모터 또는 합성 DNA 세그먼트로부터 유도되는 다른 요소로 구성될 수 있다.
용어 "상동성(homology), 동일성(identity) 또는 유사성(similarity)"은 서열 정렬(sequence alignment)에 의해서 비교되는 두 개의 폴리펩티드 사이 또는 두 개의 핵산 분자 사이에서의 서열 유사 정도를 의미한다. 비교되는 두 개의 별개의 핵산 서열 사이의 상동성 정도는 상응하는 위치에서 동일하거나, 일치하는 뉴클레오티드의 수의 함수이다. 동일성 퍼센트는 육안 검사와 산술적 계산에 의해서 결정될 수 있다. 대안적으로, 두 개의 핵산 서열의 동일성 퍼센트는 ClustalW, BLAST, FASTA 또는 Smith-Waterman 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여 서열 정보를 비교하여 결정될 수도 있다. 두 서열에 대한 백분율 동일성은 다음 사항에 따라 상이한 값을 가질 수 있다: (i) 서열들을 일렬배열하기 위해 사용된 방법, 예를 들면 ClustalW, BLAST, FASTA, Smith-Waterman(상이한 프로그램으로 실행됨) 또는 3D 비교로부터의 구조적 정렬; 및 (ii) 배열 방법에 의해 사용된 매개변수들, 예를 들면 국소적 대비 전체적 배열, 사용된 쌍-득점 매트릭스(예를 들면 BLOSUM,62, PAM250, Gonnet 등) 및 갭-페널티, 예를 들면 함수 형태 및 상수. 정렬을 만들면, 두 서열 사이의 백분율 동일성을 계산하는 상이한 방법이 있다. 예를 들면 당업자는 (i) 최단 서열의 길이; (ii) 정렬의 길이; (iii) 서열의 평균 길이; (iv) 비-갭 위치의 수; 또는 (iv) 오버행을 배제한 등가 위치들의 수에 의해 동일성의 수를 나눌 수 있다. 나아가, 백분율 동일성은 또한 매우 길이 의존적인 것이 인지될 것이다. 그러므로, 서열의 쌍이 더 짧을수록, 당업자가 우연히 일어날 것으로 예상할 수 있는 서열 동일성은 더 높아진다. 대중적인 다수의 정렬 프로그램 ClustalW(Nucleic Acids Research (1994) 22, 4673-4680; Nucleic Acids Research (1997), 24, 4876-4882)는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 다수의 정렬을 생성하기 위한 적합한 방법이다. ClustalW에 대한 적합한 매개변수는 다음과 같을 것이다: 폴리뉴클레오티드 정렬에 대하여: 갭 오픈 페널티 = 15.0, 갭 연장 페널티 = 6.66 및 매트릭스 = Identity. 폴리펩티드 정렬에 대하여: 갭 오픈 페널티 = 10.0, 갭 연장 페널티 = 0.2 및 매트릭스 = Gonnet. DNA 및 단백질 정렬에 대하여: ENDGAP = -1 및 GAPDIST = 4. 기술분야의 숙련자들은 최적의 서열 정렬을 위해 이것들 및 다른 매개변수들을 다르게 하는 것이 필요할 것이라는 것을 인식할 것이다. 적합하게는, 백분율 동일성의 계산이 그러한 정렬로부터 (N/T)로서 계산되며, 이때 N은 동일한 잔기를 공유하는 서열이 위치한 위치의 수이고 T는 갭을 포함하지만 오버행을 배제한 비교된 위치의 총 수이다.
"변이체"는 실질적으로 유사한 서열을 의미한다. 변이체는 야생형 서열과 유사한 기능 또는 실질적으로 유사한 기능을 가질 수 있다. 아스파라긴 합성효소의 경우, 유사한 기능은 동일 조건 하에서 아스파르테이트의 아스파라긴으로의 변환의 야생형 효소 기능의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%이다. 아스파라긴 합성효소의 경우, 실질적으로 유사한 기능은 동일 조건 하에서 아스파르테이트의 아스파라긴으로의 변환의 야생형 효소 기능의 적어도 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다. 변이체는 야생형 폴리펩티드에 비해 감소된 아스파라긴 합성효소 활성 수준을 갖는 효소를 초래하는 하나 이상의 유리한 돌연변이를 가질 수 있다. 변이체는 자신의 아스파라긴 합성효소 활성이 녹아웃되는 결과를 초래하는 하나 이상의 유리한 돌연변이를 가질 수 있다 (즉, 100% 억제, 따라서 비-기능성 폴리펩티드). 예시적인 야생형 ASN1-S의 변이체는 야생형 ASN1-S 폴리펩티드에 비해 아스파라긴이 약 17% 감소하는 결과를 초래하는 유리한 정지 돌연변이를 갖는 ASN1-S_W156* (서열번호 19 및 20)이다. 예시적인 야생형 ASN1-T의 변이체는 야생형 ASN1-S 폴리펩티드에 비해 아스파라긴이 약 83% 감소하는 결과를 초래하는 유리한 정지 돌연변이를 갖는 ASN1-T_W156*(서열번호 21 및 22)이다. 예시적인 야생형 ASN5-S의 변이체는 야생형 ASN1-S 폴리펩티드에 비해 아스파라긴이 약 44% 감소하는 결과를 초래하는 유리한 정지 돌연변이를 갖는 ASN5-S_Q66* (서열번호 23 및 24)이다.
용어 "식물"은 수명 주기 또는 발생(development) 중 임의의 단계의 임의의 식물 또는 그 일부, 및 그의 후손을 의미한다. 한 구현예에서, 식물은 "담배 식물"로서, 니코티아나(Nicotiana) 속에 속하는 식물을 의미한다. 바람직한 담배 식물 종들이 본원에서 기재되어 있다. 적합하게는, 식물은 대조군 식물에 비해 하나 이상의 유전자들의 발현 또는 하나 이상의 단백질들의 활성이 조절되는 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물이다. 적합하게는, 식물에게 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물을 부여하는 변경은 하나 이상의 유전자들의 발현의 조절 또는 하나 이상의 단백질들의 활성의 조절을 초래한다. 특정 구현예들에서, 상기 변경은 유전적 변경 또는 유전적 변형이다.
"식물 부분"은, 식물 세포, 식물 원형질체, 전체 식물이 재생될 수 있는 식물 세포 조직 배양물, 식물 캘러스, 식물 덩어리, 식물 또는 식물의 부분, 예컨대 배아, 화분, 꽃밥, 난자, 씨앗, 잎, 꽃, 줄기, 가지, 열매, 뿌리, 뿌리 끝 등에 무손상되어 있는 식물 세포를 포함한다. 자손, 변이체 및 재생된 식물의 돌연변이는 또한 그들이 본원에 기재된 도입된 폴리뉴클레오티드를 포함하고 있는 경우라면 본 발명의 범위 내에 포함된다. 식물의 잎이 본 개시에서 사용하기에 특히 바람직하다.
"식물 세포"는 식물의 구조적 및 생리학적 단위를 의미한다. 식물 세포는 세포벽이 없는 원형질체, 단리된 단일 세포 또는 배양된 세포 형태일 수도 있고, 또는 이들에 한정하는 것은 아니지만 식물 조직, 식물 기관, 또는 전체 식물과 같은 보다 조직화된 단위의 일부분으로서일 수도 있다.
용어 "식물 재료"는 바이오매스, 잎, 줄기, 뿌리, 꽃 또는 꽃 부분, 열매, 꽃가루, 난세포, 접합체(zygote), 종자, 꺾꽂이용 가지, 분비물, 추출물, 세포 또는 조직 배양물, 또는 식물의 임의의 기타 부분 또는 생성물을 포함하는, 식물로부터 수득가능한 임의의 고체, 액체 또는 기체 조성물, 또는 그의 조합을 의미한다. 한 구현예에서, 식물 재료는 바이오매스, 줄기, 종자 또는 잎을 포함하거나, 이로 구성된다. 다른 구현예에서, 식물 재료는 잎을 포함하거나, 이로 구성된다.
용어 "품종(variety)"은 동일한 종의 다른 식물로부터 구분되는 일정한 특징을 공유하는 식물의 집단을 의미한다. 하나 이상의 뚜렷한 특징을 가지면서, 품종은 이러한 품종 내의 개체들 사이에서 전체적인 변이가 매우 작은 것을 더욱 특징으로 한다. 품종은 종종 상업적으로 판매되고 있다.
본원에 사용되는 용어 "계통(line)" 또는 "육종 계통(breeding line)"은 식물 육종 동안에 사용되는 식물군을 나타낸다. 계통은 다른 특징에 대해서는 개체들 간에 약간의 변화가 있을 수도 있지만, 관심 있는 하나 이상의 특징에 대해서는 개체들 간에 변화가 거의 없으므로 변이체와 구별될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 ‘비-자연 발생’은 자연적으로 형성되지 않거나 또는 자연에 존재하지 않는 실체(예를 들어, 폴리뉴클레오티드, 유전자 돌연변이, 폴리펩티드, 식물, 및 식물 세포 및 식물 재료)를 기재한 것이다. 이러한 비-자연 발생 실체 또는 인위적인 실체는 본원에 기재된 방법 또는 본 기술분야에 공지된 방법에 의해서 제조, 합성, 개시, 변형, 개입, 또는 조작될 수도 있다. 이러한 비-자연 발생 실체 또는 인위적인 실체는 사람에 의해서 제조, 합성, 개시, 변형, 개입, 또는 조작될 수도 있다. 따라서 예시에 의해서, 비-자연 발생 식물, 비-자연 발생 식물 세포 또는 비-자연 발생 식물 재료는 안티센스 RNA, 간섭성 RNA, 메가뉴클레아제 및 기타 등등과 같은 유전자 조작 기술에 의해서 제조될 수도 있다. 추가적인 예시에 의해서, 비-자연 발생 식물, 비-자연 발생 식물 세포 또는 비-자연 발생 식물 재료는 제1 식물 또는 식물 세포로부터 제2 식물 또는 식물 세포(그 자체는 자연적으로 발생할 수도 있음)로 하나 이상의 유전자 돌연변이 (예를 들어 하나 이상의 다형성)를 유전자이입 또는 전달하여 제조됨으로써, 그 결과물인 식물, 식물 세포 또는 식물 재료 또는 그의 후손은 자연적으로 형성되지 않거나 또는 자연에 존재하지 않는 유전자 구성(예를 들어, 게놈, 염색체 또는 그의 단편)을 포함할 수 있게 된다. 따라서 생성된 식물, 식물 세포 또는 식물 재료는 인공적이거나 또는 비-자연 발생한 것이다. 따라서, 생성된 유전자 서열이 제1 식물 또는 식물 세포로부터의 상이한 유전적 배경을 포함하는 제2 식물 또는 식물 세포에서 자연 발생하더라도, 인공적이거나 또는 비-자연 발생 식물 또는 식물 세포는 제1 자연 발생 식물 또는 식물 세포에서 유전자 서열을 변형하여 제조될 수도 있다.
용어 "조절(modulating)"은 폴리펩티드의 발현 또는 활성을 감소, 억제, 증가 또는 이와 달리 영향을 미치는 것을 의미할 수도 있다. 상기 용어는 또한 이에 한정하는 것은 아니지만, 전사 활성을 조절하는 것을 포함할 수 있는, 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 활성을 감소, 억제, 증가 또는 이와 달리 영향을 주는 것을 의미할 수도 있다.
본원에서 사용되는 용어 "감소하다" 또는 "감소된"은 이에 한정하는 것은 아니지만, 폴리펩티드 활성, 전사 활성, 및 단백질 발현과 같은 양 또는 활성에 대해, 약 10% 내지 약 99%의 감소, 또는 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100% 또는 그 이상의 감소를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "억제하다" 또는 "억제된"은 이에 한정하는 것은 아니지만, 폴리펩티드 활성, 전사 활성, 및 단백질 발현 같은 양 또는 활성에 대해, 약 98% 내지 약 100%의 감소, 또는 적어도 98%, 적어도 99%, 그러나 특히 100%의 감소를 의미한다.
세포의 형질전환은 안정적일 수도 있고 일시적일 수도 있다. 용어 "일시적 형질전환" 또는 "일시적으로 형질전환된" 또는 이의 변형은 외인성 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포의 게놈 내로 통합시키지 않고 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입시키는 것을 말한다. 대조적으로, 용어 "안정적인 형질전환" 또는 "안정적으로 형질전환된"은 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 세포의 게놈 내로 도입 및 통합하는 것을 말한다. 용어 "안정적인 형질전환체"는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 게놈 또는 세포기관 DNA에 안정적으로 통합시킨 세포를 말한다. 본 개시의 핵산, 구성체 및/또는 벡터로 형질전환된 유기체 또는 그의 세포는 일시적으로 뿐만 아니라 안정적으로 형질전환될 수 있음을 이해해야 한다. 소정의 구현예들에서, 안정적인 형질전환이 바람직하다.
본원에서 사용되는 용어 "증가하다" 또는 "증가된"은 이에 한정하는 것은 아니지만, 폴리펩티드 활성, 전사 활성, 및 단백질 발현 같은 양 또는 활성에 대해, 약 5% 내지 약 99%의 증가, 또는 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100% 또는 그 이상의 증가를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이 그리고 양의 문맥에서 사용될 때 용어 "실질적으로"는 상기 양이, 비교되고 있는 양의 적어도 약 10%, 적어도 약 9%, 적어도 약 8%, 적어도 약 7%, 적어도 약 6%, 적어도 약 5%, 적어도 약 4%, 적어도 약 3%, 적어도 약 2%, 적어도 약 1%, 또는 적어도 약 0.1%를 의미한다.
대조군 식물 또는 대조군 식물 세포 기타 등등의 문맥에서 용어 "대조군(control)"은 관심 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성이 조절되지 않아서 효소의 발현 또는 활성이 조절된 식물 또는 식물 세포와 비교 또는 참조를 제공할 수 있는 식물 또는 식물 세포를 의미한다. 따라서, 본 발명과 관련하여, 대조군은 아스파라긴 합성효소의 발현 또는 활성을 감소시키는 적어도 하나의 유전자 변경을 포함하지 않을 것이다. 대조군 식물 또는 식물 세포는 빈(empty) 벡터를 포함할 수 있다. 대조군 식물 또는 식물 세포는 야생형 식물 또는 야생형 식물 세포에 해당할 수 있다. 이러한 경우 모두에서, 대상 식물과 대조군 식물은 비교 목적으로 동일한 프로토콜을 사용하여 배양되고 수득된다. 본원에 기술된 유전자 또는 폴리펩티드의 수준, 비율, 활성 또는 분포의 변화, 또는 식물 표현형의 변화, 특히 아스파라긴의 축적 감소 및/또는 아크릴아미드의 축적 감소 및/또는 글루타민 축적 증가 및/또는 아스파르트산의 축적 증가 및/또는 글루탐산의 축적 증가는 대상 식물을 대조군 식물과 비교하여 측정될 수 있으며, 적합하게는 대상 식물과 대조군 식물이 동일한 프로토콜을 사용하여 배양 및/또는 수확된 것이다. 대조군 식물은 대상 식물의 표현형 변화를 측정하기 위한 기준점을 제공할 수 있다. 표현형 변화의 측정은 식물 발생, 노화 도중이나, 건조 후를 포함하여, 식물에서 언제라도 측정될 수 있다. 표현형 변화의 측정은 생장 챔버, 온실 또는 현장에서 생장한 식물로부터를 포함하여, 임의의 조건 하에서 생장한 식물에서 측정할 수 있다. 식물 표현형의 변화는 아스파라긴 함량 및/또는 글루타민 함량 및/또는 아스파르트산 함량 및/또는 글루탐산 함량 측정 (Moldoveanu (2005)에 기술됨) 및/또는 아크릴아미드 함량 측정 (as described in Papousek 외, 2014 및/또는 Onoa 외., 2003 및/또는 United States Environmental Protection Agency Method 8032A - Acrylamide by Gas Chromatography, Revision 1, December 1996에 기술됨)에 의해 측정 가능하고 및/또는 니코틴 함량 측정(Cooperation Centre for Scientific Research Relative to Tobacco Recommended (CORESTA) Method Number 62, Determination of nicotine in tobacco and tobacco products by gas chromatographic analysis (February 2005) 이용) 은 당업계에 주지되어 있는 방법들을 사용하여 경화 또는 건조하기 전 및/또는 도중 및/또는 후에 모니터링할 수 있다. 유리 아미노산 분석은 Moldoveanu (2005)에서 채택된 방법을 사용하여 수행된다.
발명의 상세한 설명
한 구현예에서, 서열목록에 보이는 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함해서, 본원에 기재된 임의의 서열에 대해 적어도 60%의 서열 동일성을 가지는, 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 단리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 적합하게는, 단리된 폴리뉴클레오티드는 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 78%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성된다. 더욱 적합하게는, 단리된 폴리뉴클레오티드는 적어도 72%, 73%, 74%, 75%, 78%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성된다. 본원에 기술된 서열의 정렬을 표 1에 보여주고 있다.
다른 구현예에서 서열번호 1 또는 서열번호 3 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7 또는 서열번호 9 또는 서열번호 11과 적어도 60% 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되는 단리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 적합하게는, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열번호 1 또는 서열번호 3 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7 또는 서열번호 9 또는 서열번호 11은 서열번호 1 또는 서열번호 3 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7 또는 서열번호 9 또는 서열번호 11과 적어도 약 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 78% 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성된다. 더욱 적합하게는, 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 3 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7 또는 서열번호 9 또는 서열번호 11과 적어도 약 72%, 73%, 74%, 75%, 78%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성된다.
적합하게는, 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성된다.
적합하게는, 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7 또는 서열번호 9 또는 서열번호 11과 적어도 약 72%, 73%, 74%, 75%, 78%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성된다.
다른 구현예에서 서열번호 19 또는 서열번호 21 또는 서열번호 23과 적어도 60% 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되는 단리된 폴리뉴클레오티드가 제공되며, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 19 또는 서열번호 21 또는 서열번호 23에 제시된 위치에 동등한 위치에서 정지 코돈을 암호화하는 돌연변이를 포함하는 것으로 제공된다.
적합하게는, 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 19 또는 서열번호 21 또는 서열번호 23과 적어도 약 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 78%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성된다. 더욱 적합하게는, 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 19 또는 서열번호 21 또는 서열번호 23과 적어도 72%, 73%, 74%, 75%, 78%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성된다.
다른 구현예에서, 서열번호 1 또는 서열번호 3 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7 또는 서열번호 9 또는 서열번호 11과 실질적 상동성(즉, 서열 유사성) 또는 실질적 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되는 단리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
다른 구현예에서 서열번호 19 또는 서열번호 21 또는 서열번호 23과 실질적 상동성(즉, 서열 유사성) 또는 실질적 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되는 단리된 폴리뉴클레오티드가 제공되며, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 19 또는 서열번호 21 또는 서열번호 23에 제시된 위치에 동등한 위치에서 정지 코돈을 암호화하는 돌연변이를 포함하는 것으로 제공된다.
다른 구현예에서, 서열번호 1 또는 서열번호 3 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7 또는 서열번호 9 또는 서열번호 11의 서열과 적어도 약 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 78%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9% 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드 변이체가 제공된다. 적합하게는, 서열번호 1 또는 서열번호 3 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7 또는 서열번호 9 또는 서열번호 11의 서열과 적어도 72%, 73%, 74%, 75%, 78%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9% 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드 변이체가 제공된다.
적합하게는, 서열번호 1의 서열과 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9%의 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드 변이체가 제공된다.
적합하게는, 서열번호 3 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7 또는 서열번호 9 또는 서열번호 11의 서열과 적어도 약 72%, 73%, 74%, 75%, 78%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9% 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드 변이체가 제공된다.
다른 구현예에서, 서열번호 19 또는 서열번호 21 또는 서열번호 23의 서열과 적어도 약 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 78%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9% 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드 변이체가 제공되며, 상기 폴리뉴클레오티드 변이체는 서열번호 19 또는 서열번호 21 또는 서열번호 23에 제시된 위치에 동등한 위치에서 정지 코돈을 암호화하는 돌연변이를 포함하는 것으로 제공된다. 적합하게는, 서열번호 19 또는 서열번호 21 또는 서열번호 23의 서열과 적어도 약 72%, 73%, 74%, 75%, 78%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9% 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드 변이체가 제공되며, 상기 폴리뉴클레오티드 변이체는 서열번호 19 또는 서열번호 21 또는 서열번호 23에 제시된 위치에 동등한 위치에서 정지 코돈을 암호화하는 돌연변이를 포함하는 것으로 제공된다.
또 다른 구현예에서, 서열번호 1 또는 서열번호 3 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7 또는 서열번호 9 또는 서열번호 11의 대응하는 단편과 적어도 약 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 78%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 실질적 상동성(즉, 서열 유사성) 또는 실질적 동일성을 가지는 서열번호 1 또는 서열번호 3 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7 또는 서열번호 9 또는 서열번호 11의 단편이 제공된다.
또 다른 구현예에서, 서열번호 1의 대응하는 단편과 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 실질적 상동성(즉, 서열 유사성) 또는 실질적 동일성을 가지는 서열번호 1의 단편들이 제공된다.
또 다른 구현예에서, 서열번호 3 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7 또는 서열번호 9 또는 서열번호 11의 대응하는 단편과 적어도 약 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 78%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 실질적 상동성(즉, 서열 유사성) 또는 실질적 동일성을 가지는 서열번호 3 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7 또는 서열번호 9 또는 서열번호 11의 단편이 제공된다.
적합하게는, 서열번호 1 또는 서열번호 3 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7 또는 서열번호 9 또는 서열번호 11의 대응하는 단편과 적어도 약 72%, 73%, 74%, 75%, 78%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9% 서열 동일성을 가지는 실질적 상동성(즉, 서열 유사성) 또는 실질적 동일성을 가지는 서열번호 1 또는 서열번호 3 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7 또는 서열번호 9 또는 서열번호 11의 폴리뉴클레오티드 변이체의 단편이 제공된다.
적합하게는, 서열번호 1의 대응하는 단편과 적어도 약 72%, 73%, 74%, 75%, 78%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9% 서열 동일성을 가지는 실질적 상동성(즉, 서열 유사성) 또는 실질적 동일성을 가지는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 변이체의 단편이 제공된다.
적합하게는, 서열번호 3 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7 또는 서열번호 9 또는 서열번호 11의 대응하는 단편과 적어도 약 72%, 73%, 74%, 75%, 78%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9% 서열 동일성을 가지는 실질적 상동성(즉, 서열 유사성) 또는 실질적 동일성을 가지는 서열번호 3 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7 또는 서열번호 9 또는 서열번호 11의 폴리뉴클레오티드 변이체의 단편이 제공된다.
다른 구현예에서, 서열번호 19 또는 서열번호 21 또는 서열번호 23의 대응하는 단편과 적어도 약 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 78%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 실질적 상동성(즉, 서열 유사성) 또는 실질적 동일성을 가지는 서열번호 19 또는 서열번호 21 또는 서열번호 23의 폴리뉴클레오티드 단편이 제공되며, 상기 단편은 서열번호 19 또는 서열번호 21 또는 서열번호 23에 제시된 위치에 동등한 위치에서 정지 코돈을 암호화하는 돌연변이를 포함하는 것으로 제공된다. 적합하게는, 서열번호 19 또는 서열번호 21 또는 서열번호 23의 대응하는 단편과 적어도 약 72%, 73%, 74%, 75%, 78%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9% 서열 동일성을 가지는 실질적 상동성(즉, 서열 유사성) 또는 실질적 동일성을 가지는 서열번호 19 또는 서열번호 21 또는 서열번호 23의 폴리뉴클레오티드 변이체의 단편이 제공되며, 상기 단편은 서열번호 19 또는 서열번호 21 또는 서열번호 23에 제시된 위치에 동등한 위치에서 정지 코돈을 암호화하는 돌연변이를 포함하는 것으로 제공된다.
또 다른 구현예에서, 아스파라긴 합성효소로서 작용하는 폴리펩티드를 암호화하는 서열번호 1 또는 서열번호 3 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7 또는 서열번호 9 또는 서열번호 11과 충분하거나 상당한 정도의 동일성 또는 유사성을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 적합하게는, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드(들)은 서열번호 2 또는 서열번호 4 또는 서열번호 6 또는 서열번호 8 또는 서열번호 10 또는 서열번호 12에 기재된 단백질 활성의 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상인 아스파라긴 합성효소 활성을 갖는 단백질을 암호화한다. 폴리펩티드가 기능적 아스파라긴 합성효소인지를 결정하기 위해, Romagni & Dayan (2000) J Agric Food Chem. May;48(5):1692-6에 의해 기술된 분석을 이용할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 아스파라긴 합성효소로서 작용하는 폴리펩티드를 암호화하는 서열번호 19 또는 서열번호 21 또는 서열번호 23과 충분하거나 상당한 정도의 동일성 또는 유사성을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공되며, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 19 또는 서열번호 21 또는 서열번호 23에 제시된 위치에 동등한 위치에서 정지 코돈을 암호화하는 돌연변이를 포함하는 것으로 제공된다. 적합하게는, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드(들)은 서열번호 19 또는 서열번호 21 또는 서열번호 23에 기재된 단백질 활성의 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상인 아스파라긴 합성효소 활성을 갖는 단백질을 암호화한다.
소정의 구현예들에서, 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되며, 서열번호 1 및 서열번호 3 및 서열번호 5 및 서열번호 7과 적어도 72% 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드의 발현이 조절된다.
소정의 구현예들에서, 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되며, 서열번호 1과 적어도 90% 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드의 발현이 조절된다.
소정의 구현예들에서, 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되며, 서열번호 3 및 서열번호 5 및 서열번호 7과 적어도 72% 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드의 발현이 조절된다.
소정의 구현예들에서, 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되며, 서열번호 1 또는 서열번호 3 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7과 적어도 72% 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드의 발현이 조절된다.
소정의 구현예들에서, 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되며, 서열번호 1과 적어도 90% 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드의 발현이 조절된다.
소정의 구현예들에서, 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되며, 서열번호 3 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7과 적어도 72% 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드의 발현이 조절된다.
소정의 구현예들에서, 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되며, 서열번호 1 및 서열번호 3과 적어도 72% 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드의 발현이 조절된다. 소정의 구현예들에서, 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되며, 서열번호 1과 적어도 90% 서열 동일성을 가지며 서열번호 3과 적어도 72% 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드의 발현이 조절된다. 소정의 구현예들에서, 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되며, 서열번호 5 및 서열번호 7과 적어도 72% 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드의 발현이 조절된다. 소정의 구현예들에서, 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되며, 서열번호 1 및 서열번호 3 및 서열번호 5 및/또는 서열번호 7과 적어도 72% 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드의 발현이 조절된다. 소정의 구현예들에서, 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되며, 서열번호 1과 적어도 90% 서열 동일성을 가지며 서열번호 3 및 서열번호 5 및/또는 서열번호 7과 적어도 72% 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드의 발현이 조절된다. 소정의 구현예들에서, 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되며, 서열번호 1 및/또는 서열번호 3 및 서열번호 5 및 서열번호 7과 적어도 72% 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드의 발현이 조절된다. 소정의 구현예들에서, 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되며, 서열번호 1과 적어도 90% 서열 동일성을 가지며 그리고/또는 서열번호 3 및 서열번호 5 및 서열번호 7과 적어도 72% 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드의 발현이 조절된다.
소정의 구현예들에서, 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되며, 서열번호 19 및 서열번호 21 및 서열번호 23과 적어도 72% 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드의 발현이 조절되며, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 19 또는 서열번호 21 또는 서열번호 23에 제시된 위치에 동등한 위치에서 정지 코돈을 암호화하는 돌연변이를 포함하는 것으로 제공된다.
소정의 구현예들에서, 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되며, 서열번호 19 또는 서열번호 21 또는 서열번호 23과 적어도 72% 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드의 발현이 조절되며, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 19 또는 서열번호 21 또는 서열번호 23에 제시된 위치에 동등한 위치에서 정지 코돈을 암호화하는 돌연변이를 포함하는 것으로 제공된다.
소정의 구현예들에서, 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되며, 서열번호 19 및 서열번호 21과 적어도 72% 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드의 발현이 조절되며, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 19 및 서열번호 21에 제시된 위치에 동등한 위치에서 정지 코돈을 암호화하는 돌연변이를 포함하는 것으로 제공된다.
소정의 구현예들에서, 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되며, 서열번호 21 및 서열번호 23과 적어도 72% 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드의 발현이 조절되며, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 21 및 서열번호 23에 제시된 위치에 동등한 위치에서 정지 코돈을 암호화하는 돌연변이를 포함하는 것으로 제공된다.
소정의 구현예들에서, 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되며, 서열번호 19 및 서열번호 21 및/또는 서열번호 23과 적어도 72% 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드의 발현이 조절되며, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 19, 서열번호 21 및 서열번호 23에 제시된 위치에 동등한 위치에서 정지 코돈을 암호화하는 돌연변이를 포함하는 것으로 제공된다.
소정의 구현예들에서, 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되며, 서열번호 19 및/또는 서열번호 21 및 서열번호 23과 적어도 72% 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드의 발현이 조절되며, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 19, 서열번호 21 및 서열번호 23에 제시된 위치에 동등한 위치에서 정지 코돈을 암호화하는 돌연변이를 포함하는 것으로 제공된다.
본원에 기재된 폴리뉴클레오티드는 비변형되었거나 변형된 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)일 수도 있는, 뉴클레오티드의 중합체를 포함할 수 있다. 따라서, 폴리뉴클레오티드는 제한하지 않고, 게놈 DNA, 상보성 DNA(cDNA), mRNA, 또는 안티센스 RNA 또는 이들의 단편(들)일 수 있다. 더욱이, 폴리뉴클레오티드는 단일가닥 또는 이중가닥 DNA, 단일가닥 및 이중가닥 영역들의 혼합물인 DNA, DNA 및 RNA를 포함하는 혼성 분자, 또는 단일가닥 및 이중가닥 영역들의 혼합물을 가지는 혼성 분자 또는 이들의 단편(들)일 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA, 또는 둘 다 또는 이들의 단편(들)을 포함하는 삼중가닥 영역들로 구성될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 염기, 예컨대 포스포티오에이트(phosphothioate)를 함유할 수 있으며, 펩티드 핵산일 수 있다. 일반적으로, 폴리뉴클레오티드는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오티드, 또는 개별 뉴클레오티드의 단리된 혹은 클로닝된 단편, 또는 전술한 것들의 조합으로부터 조립될 수 있다. 비록 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열이 DNA 서열로 보여지지만, 상기 서열은 그의 대응하는 RNA 서열, 및 그의 역보체를 포함해서, 그의 상보성(예를 들어, 완전히 상보적인) DNA 또는 RNA 서열을 포함한다.
일부 경우에 예를 들면, 포스포라미데이트(phosphoramidate), 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 포스포로디티오에이트(phosphorodithioate), 또는 O-메틸포스포로아미다이트(O-methylphosphoroamidite) 연결을 포함하는 대안적인 골격(backbone); 및 펩티드 폴리뉴클레오티드 골격 및 연결기를 가질 수도 있는 폴리뉴클레오티드 유사체가 포함되지만, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 포스포디에스테르(phosphodiester) 결합을 함유할 것이다. 다른 유사체 폴리뉴클레오티드로는 양성 골격; 비이온성 골격, 및 비-리보오스 골격을 가지는 것을 포함한다. 리보오스-인산 골격의 변형은 다양한 이유 때문에 생길 수도 있는데, 예를 들면, 생리학적 환경 또는 바이오칩 상 프로브로서의으로서의 분자들의 안정성 및 반감기를 증대시키기 위한 이유이다. 자연 발생 폴리뉴클레오티드 및 유사체의 혼합이 생길 수 있다; 대안적으로, 상이한 폴리뉴클레오티드 유사체들의 혼합, 및 자연 발생 폴리뉴클레오티드 및 유사체의 혼합이 생길 수도 있다.
예를 들면, 포스포라미데이트(phosphoramidate), 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 포스포로디티오에이트(phosphorodithioate), O-메틸포스포라미다이트(O-methylphosphoroamidite) 연결기 및 펩티드 폴리뉴클레오티드 골격 및 연결기를 포함해서, 다양한 폴리뉴클레오티드 유사체가 공지되어 있다. 다른 유사체 폴리뉴클레오티드로는 양성 골격, 비이온성 골격, 및 비-리보오스 골격을 가지는 것을 포함한다. 하나 이상의 카보사이클릭 당을 함유하는 폴리뉴클레오티드가 또한 포함된다.
다른 유사체로는 펩티드 폴리뉴클레오티드 유사체인 펩티드 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 골격은 자연 발생 폴리뉴클레오티드의 고 전하의 포스포디에스테르 골격과 대조적으로, 중성 조건 하에서 실질적으로 비이온성이다. 이것은 이점을 야기할 수도 있다. 첫째, 펩티드 폴리뉴클레오티드 골격은 개선된 혼성화 동역학(hybridization kinetics)을 보여줄 수도 있다. 펩티드 폴리뉴클레오티드는 불일치 대비 완전 일치 염기쌍을 위해 더 큰 용융점 변화를 가진다. DNA 및 RNA는 일반적으로 간격 불일치의 경우에 2-4°C의 용융점 강하를 보여준다. 비이온성 펩티드 폴리뉴클레오티드 골격의 경우, 상기 강하는 7-9°C에 더 가깝다. 마찬가지로, 그의 비이온성 성질 때문에, 이 골격들에 부착된 염기의 혼성화는 염 농도에 상대적으로 민감하지 않다. 또한, 펩티드 폴리뉴클레오티드는 세포 효소에 의해 변성되지 않을 수도 있고 더 적은 범위로 변성될 수도 있으므로, 더 안정적일 수도 있다.
개시된 폴리뉴클레오티드, 및 그 단편의 용도 중에는 핵산 혼성화 분석에서 프로브로서 또는 핵산 증폭 분석에 사용하기 위한 프라이머로서 용도가 있다. 이러한 단편은 일반적으로 적어도 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 또는 그 이상의 연결된 뉴클레오티드의 DNA 서열을 포함하고 있다. 다른 구현예들에서, DNA 단편은 적어도 약 10, 15, 20, 30, 40, 50 또는 60 또는 그 이상의 연결된 뉴클레오티드의 DNA 서열을 포함하고 있다. 따라서, 한 측면에서, 아스파라긴 합성효소 활성을 갖는 단백질을 암호화하거나, 프로브 또는 프라이머 또는 양쪽 모두의 사용을 포함하는 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 검출하기 위한 방법 또한 제공된다. 예시적인 프라이머는 서열번호 13 내지 16에 제시되어 있다. 따라서, 추가 측면은 13, 서열번호 14, 서열번호 15 또는 서열번호 16과 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 이들 프라이머를 사용하여 아스파라긴 합성효소 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 검출하는 방법 및 그의 용도가 개시되어 있다.
폴리뉴클레오티드에 대한 혼성화 조건의 선택 및 적절한 조건을 고안하기 위한 지침에 영향을 미치는 기본적인 매개변수는 Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)에 의해 기재되어 있다. 본원에 기재된 아미노산 서열과 유전 암호의 지식의 조합을 이용해서, 축퇴성 올리고뉴클레오티드의 세트가 생성될 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 DNA 단편이 단리되고 증폭되는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에서 프라이머로서 유용하다. 소정의 구현예들에서, 축퇴성 프라이머는 유전자 라이브러리를 위한 프로브로서 사용될 수 있다. 이러한 라이브러리는 이에만 한정하는 것은 아니지만, cDNA 라이브러리, 게놈 라이브러리, 및 심지어 전자 발현 서열 태그(EST) 또는 DNA 라이브러리를 포함한다. 이러한 방법에 의해서 식별되는 상동성 서열은 본원에서 인식되는 서열의 상동성을 인식하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다.
또한 감소된 엄격성 조건, 전형적으로 중간 엄격성 조건, 및 일반적으로 높은 엄격성 조건 하에서 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드와 혼성화되는 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 프라이머 또는 프로브)가 잠재적으로 사용될 수 있다. 혼성화 조건의 선택 및 적절한 조건을 고안하기 위한 지침에 영향을 미치는 기본적인 매개변수는 예를 들어, 폴리뉴클레오티드의 길이 또는 염기 조성을 기초로 당업계 숙련자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 중간 엄격성 조건을 얻는 한가지 방법은 5x 표준 구연산나트륨, 0.5% 도데실 황산나트륨, 1.0 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(pH 8.0), 약 50% 포름아미드의 혼성화 완충액, 6x 표준 구연산나트륨을 함유하는 예비세정 용액의 사용, 및 약 55℃의 혼성화 온도 (또는 약 42℃의 혼성화 온도로, 약 50%의 포름아미드를 함유하는 것과 같은, 다른 유사한 혼성화 용액), 및 0.5x 표준 구연산나트륨, 0.1% 도데실 황산나트륨에서의 약 60℃의 세정 조건과 연관된다. 일반적으로, 높은 엄격성 조건은 상기와 같은 혼성화 조건으로서 정의되지만, 약 68℃, 0.2x 표준 구연산나트륨, 0.1% 도데실 황산나트륨으로 세정한다. SSPE(1x SSPE는 0.15M 염화나트륨, 10 mM 인산나트륨, 및 1.25 mM 에틸렌디아민테트라아세트산, pH 7.4)는 혼성화 및 세정 완충액에서 표준 구연산나트륨(1 x 표준 구연산나트륨은 0.15 M 염화나트륨 및 15 mM 구연산나트륨)에 대해 치환될 수 있고; 혼성화가 완료된 후에 15 분 동안 세정을 수행한다. 세정 온도 및 세정 염 농도는, 당업자들에게 공지되고 이하에 더 설명된 바와 같이, 혼성화 반응 및 듀플렉스 안정성을 지배하는 기본적인 원리들을 적용함으로써, 요망되는 엄격성 정도(degree of stringency)를 달성하기 위해 필요한 대로 조정될 수 있음을 이해해야 한다(예를 들어, 문헌[Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y)] 참조). 미공지된 서열의 표적 폴리뉴클레오티드에 폴리뉴클레오티드를 혼성화할 때, 혼성체 길이는 혼성화 폴리뉴클레오티드의 길이로 추정된다. 공지된 서열의 폴리뉴클레오티드가 혼성화할 때, 혼성체 길이는 폴리뉴클레오티드의 서열을 정렬하고 최적의 서열 상보성의 영역 또는 영역들을 식별하여 결정될 수 있다. 길이가 50 미만의 염기쌍인 것으로 예상되는 혼성체를 위한 혼성화 온도는 혼성체의 용융점 보다 5℃ 내지 10℃ 적어야 하고, 이때 용융점은 다음의 식에 따라 결정된다. 길이가 18 미만의 염기쌍인 혼성체의 경우, 용융점(℃)=2(A+T 염기 수)+4(G+C 염기 수)이다. 길이가 18 초과의 염기쌍인 혼성체의 경우, 용융점(℃)=81.5+16.6(log10 [Na+])+0.41(% G+C)-(600/N)이고, 이때 N은 혼성체 내의 염기 수이고, [Na+]는 혼성화 완충액 내의 나트륨 이온의 농도이다(1x 표준 구연산나트륨=0.165M에 대한 [Na+]). 전형적으로, 각각의 이러한 혼성화 폴리뉴클레오티드는 혼성화하는 폴리뉴클레오티드의 길이의 적어도 25%(일반적으로 적어도 50%, 60%, 또는 70%, 가장 일반적으로 적어도 80%)인 길이를 가지고, 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 대해 적어도 60%(예를 들어, 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)의 서열 동일성을 가진다.
당업자에 의해서 이해되는 것처럼, 선형 DNA는 두 가지 가능한 배향: 5'→3' 방향과 3'→5' 방향을 가진다. 예를 들어, 참조 서열이 동일한 폴리뉴클레오티드 분자/가닥 내에서 5'→3' 방향에 위치하고, 두번째 서열이 5'→3' 방향에 위치하면, 이때 참조 서열 및 두번째 서열은 동일한 방향으로 배향되거나, 또는 동일한 배향을 가진다. 전형적으로, 주어진 프로모터의 조절 하에 관심 있는 프로모터 서열 및 유전자는 동일한 배향으로 위치한다. 그러나, 5'→3' 방향에 위치하는 참조 서열과 관련해서는, 두번째 서열이 동일한 폴리뉴클레오티드 분자/가닥 내에서 3'→5' 방향에 위치하면, 이때 참조서열 및 두번째 서열은 안티센스 방향으로 배향되거나, 안티센스 배향을 가진다. 서로에 대하여 안티센스 배향을 가지는 두 가지 서열은, 참조서열(5'→3' 방향) 및 참조 서열의 역상보성 서열(5'→3'에 위치하는 참조 서열)이 동일한 폴리뉴클레오티드 분자/가닥 내에 위치한다면, 동일한 배향을 가지는 것으로 대안적으로 설명될 수 있다. 본원에서 기재한 서열은 5'→3' 방향으로 보여진다.
본원에서 제공되는 재조합 구성체는 단백질 발현 및/또는 활성 수준을 조절하기 위해 식물 또는 식물 세포를 형질전환하는 데에 사용될 수 있다. 재조합 폴리뉴클레오티드 구성체는 본원에 기재된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 암호화하며, 폴리펩티드를 발현하는데 적절한 조절 영역에 작동가능하게 연결되는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 따라서 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 암호화하는 암호화 서열을 포함할 수 있다. 단백질 발현 및/또는 활성 수준이 조절되는 식물 또는 식물 세포는 돌연변이, 비-자연 발생, 트랜스제닉, 인공 또는 유전자 조작 식물 또는 식물 세포를 포함할 수 있다. 적합하게는, 식물 또는 식물 세포는 재조합 DNA의 안정적인 통합에 의해서 변경된 게놈을를 포함한다. 재조합 DNA는 유전자 조작되었고 세포의 외부에서 구축된 DNA를 포함하고 자연 발생 DNA 또는 cDNA 또는 합성 DNA를 함유하는 DNA를 포함한다. 식물은 처음에 형질전환된 식물 세포로부터 재생된 식물 및 후속 세대 또는 형질전환된 식물의 교배로부터의 후손 식물을 포함할 수 있다. 적합하게는, 변형은 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현 또는 활성을 대조군 식물과 비교해서 변경시킨다.
재조합 폴리뉴클레오티드에 의해서 암호화된 폴리펩티드는 고유한 폴리펩티드이거나 세포에 이형일 수 있다. 일부 경우에, 재조합 구성체는 조절 영역에 작동가능하게 연결되는, 발현을 조절하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 적절한 조절 영역의 실시예들이 본원에서 설명되고 있다.
본원에 기재된 바와 같은 재조합 폴리뉴클레오티드 구성체를 함유하는 벡터가 또한 제공된다. 적절한 벡터 골격은 예를 들어 플라스미드, 바이러스, 인공 염색체, 세균 인공 염색체, 효모 인공 염색체, 또는 박테리오파지 인공 염색체와 같이 본 기술분야에 일상적으로 사용되는 것들을 포함한다. 적절한 발현 벡터는 제한 없이, 예를 들어 박테리오파지, 배큘로바이러스(baculoviruse), 및 레트로바이러스로부터 유도되는 플라스미드 및 바이러스 벡터를 포함한다. 수많은 벡터 및 발현 시스템이 시판 중이다. 벡터는 예를 들어 복제 원점, 지지체 결합 영역(scaffold attachment region) 또는 마커를 포함할 수 있다. 마커 유전자는 식물 세포에 대해 선택할 수 있는 표현형을 부여할 수 있다. 예를 들어, 마커는 항생제(예를 들어, 카나마이신, G418, 블레오마이신, 또는 하이그로마이신), 또는 제초제(예를 들어, 글리포세이트, 클로술푸론 또는 포스피노트리신)에 대한 내성과 같은, 살생제 내성을 부여할 수 있다. 또한, 발현 벡터는 발현된 폴리펩티드의 조작 또는 검출(예를 들어, 정제 또는 위치결정)을 용이하게 하기 위해 고안된 태그 서열을 포함할 수 있다. 루시퍼라아제, 베타-글루쿠로니다아제, 녹색 형광 단백질, 글루타티온 S-전이효소, 폴리히스티딘, c-myc 또는 헤마글루티닌 서열과 같은 태그 서열은 전형적으로 암호화된 폴리펩티드와의 융합으로서 발현된다. 이러한 태그는 카르복실 또는 아미노 말단을 포함해서, 폴리펩티드 내에 어느 곳에서나 삽입될 수 있다.
식물 또는 식물 세포는 안정적으로 형질전환되도록 그의 게놈 내로 통합된 재조합 폴리뉴클레오티드를 가져서 형질전환될 수 있다. 본원에서 설명한 식물 또는 식물 세포는 안정적으로 형질전환된다. 안정적으로 형질전환된 세포는 전형적으로 각각의 세포분열시에도 도입된 폴리뉴클레오티드를 보유한다. 식물 또는 식물 세포는 일시적으로 형질전환되어서 재조합 폴리뉴클레오티드가 그의 게놈 내로 통합되지 않을 수 있다. 일시적으로 형질전환된 세포는 전형적으로 각각의 세포분열시에 도입된 재조합 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 손실함으로써 상기 도입된 재조합 폴리뉴클레오티드가 충분한 수의 세포분열 후에 딸세포에서 검출될 수 없도록 한다. 게놈 편집의 이용 또한 고려된다.
바이오리스틱(biolistics), 유전자 총(gun)기술, 아그로박테리움-매개 형질전환, 바이러스 벡터-매개 형질전환 및 전기천공법을 포함해서, 많은 방법은 본원에서 모두 포괄하는 식물 세포를 형질전환하기 위해 본 기술분야에 이용 가능하다. 외래 DNA를 식물 염색체 내로 통합하기 위한 아그로박테리움 시스템은 식물 유전공학을 위해 광범위하게 연구되고, 변형되고 채택되어왔다. 센스 또는 안티센스 배향으로, 조절 서열에 작동가능하게 연결되는, 정제된 대상 단백질에 대응하는 DNA 서열을 포함하는 네이키드 재조합 DNA 분자는 통상적인 방법에 의해서 적절한 T-DNA 서열에 연결된다. 이들은 폴리에틸렌 글리콜 기술에 의해서나 전기천공법 기술에 의해서 원형질체 내로 도입되는데, 두 기술 모두 표준이다. 대안적으로, 정제된 대상 단백질을 암호화하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 이러한 벡터는 살아있는 아그로박테리움 세포 내로 도입되고, 그런 다음 DNA를 식물 세포 내로 전달한다. T-DNA 벡터 서열을 동반하지 않는 네이키드 DNA에 의한 형질전환은 원형질체와 DNA-함유 리포솜의 융합을 통해서나 전기천공법을 통해서 달성될 수 있다. T-DNA 벡터 서열을 동반하지 않은 네이키드 DNA는 불활성의, 고속의 미세투사물을 통해서 세포를 형질전환하는 데에도 사용될 수 있다.
세포 또는 배양된 조직이 형질전환을 위한 수용체 조직으로서 사용된다면, 원하는 경우에 식물은 당업자에게 공지된 기술에 의해서 형질전환된 배양물로부터 재생될 수 있다.
재조합 구성체에 포함될 조절 영역의 선택은 이에만 한정하는 것은 아니지만, 효능, 선택가능성, 유도성, 바람직한 발현수준, 및 세포- 또는 조직-우선적 발현을 포함하는 여러 요인에 따라 달라진다. 암호화 서열에 비해 조절 영역을 적절히 선택하고 위치시켜서 암호화 서열의 발현을 조절하는 것은 당업자에게 일상적인 일이다. 폴리뉴클레오티드의 전사는 유사한 방식으로 조절될 수 있다. 일부 적절한 조절 영역은 소정의 세포 유형에서, 전사를 유일하게 또는 우세하게 개시한다. 식물 게놈 DNA에 있는 조절 영역을 식별하고 특징화하기 위한 방법이 본 기술분야에 공지되어 있다.
프로모터의 예로는 다른 조직 또는 세포 유형(예를 들어, 뿌리-특이적 프로모터, 신초-특이(shoot-specific) 프로모터, 물관-특이(xylem-specific) 프로모터)에 존재하거나, 또는 상이한 발생 단계 동안에 존재하거나, 또는 상이한 환경조건에 반응하여 존재하는 조직-특이적 인자에 의해 인식되는 조직-특이적 프로모터를 포함한다. 프로모터의 예로는 특정한 유도인자(inducer)를 필요로 하지 않고 대부분의 세포 유형에서 활성화될 수 있는 기본구성 프로모터를 포함한다. RNAi 폴리펩티드 생산을 조절하기 위한 프로모터의 예로는 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S (CaMV/35S), SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos 또는 유비퀴틴- 또는 파세올린-프로모터를 포함한다. 당업자라면 재조합 프로모터의 다수 변이를 생성할 수 있다.
조직-특이적 프로모터는 식물 발생 동안의 특정 시간에 식물 영양조직 또는 생식조직과 같은 세포 또는 조직에서만 활성화되는 전사 조절 요소이다. 조직-특이적 발현은 예를 들어, 특정 조직에서의 폴리뉴클레오티드의 발현이 선호될 때 유리할 수 있다. 발생의 조절 하에서 조직-특이적 프로모터의 예시는 예를 들어, 뿌리 또는 잎과 같은 식물 영양조직, 또는 열매, 배주, 종자, 꽃가루, 암술, 꽃, 또는 임의의 배 조직과 같은 생식조직과 같은 소정의 조직에서만 (또는 주로) 전사를 개시할 수 있는 프로모터를 포함한다. 생식조직-특이적 프로모터는 예를 들어, 꽃밥-특이, 배주-특이, 배-특이, 배젖-특이, 외피-특이, 종자 및 종피-특이, 꽃가루-특이, 꽃잎-특이, 꽃받침-특이, 또는 그들의 조합일 수 있다.
잎-특이적 프로모터의 예로는 피루브산, C4 식물(옥수수)의 오르토인산 디키나아제(PPDK) 프로모터, 옥수수의 cab-m1Ca+2 프로모터, 애기장대(Arabidopsis thaliana) myb-관련 유전자 프로모터 (Atmyb5), 리불로오스 이인산 카복실라아제(RBCS) 프로모터(예를 들어 잎 및 광-육종 모종에서 발현된 토마토 RBCS 1, RBCS2 및 RBCS3A 유전자, 발생중인 토마토 열매에서 발현된 RBCS1 및 RBCS2 또는 고수준으로 잎새 및 잎관에 있는 엽록소 세포에 거의 배타적으로 발현된 리불로오스 이인산 카복실라아제 프로모터)를 포함한다.
노화-특이적 프로모터의 예로는 열매 숙성, 잎의 노화 및 탈리 동안에 활성인 토마토 프로모터, 시스테인 프로테아제를 암호화하는 유전자의 옥수수 프로모터, 82E4의 프로모터 및 SAG 유전자의 프로모터를 포함한다.
소정의 구현예들에서, 노화-특이적 프로모터가 바람직하다. 적합하게는, 프로모터는 E4 프로모터일 수 있다. TheE4 프로모터는 Plant Mol Biol. (2008) Mar;66(4):415-27에서 리포터 유전자로 GUS를 사용하여 담배에 적합한 노화 프로모터로 보고되었다. 다른 예시적인 프로모터는 Plant Cell. (1999) Jun;11(6):1073-80에 기재된 SAG12 프로모터이다.
Anther-특이적 프로모터들이 추가 예시이다. 당업자에게 공지된 적절한 뿌리-우선적 프로모터가 선택될 수도 있다. 종자-우선적 프로모터는 종자-특이적 프로모터(종자 저장 단백질의 프로모터와 같은 종자 발생 동안에 활성인 프로모터들) 및 종자-발아 프로모터(종자 발아 동안에 활성인 프로모터들)을 모두 포함한다. 이러한 종자-우선적 프로모터는 이들에만 한정하지 않지만, Cim1 (사이토키닌-유도 메세지); cZ19B1 (옥수수 19 kDa 제인); milps (myo-이노시톨-1-포스페이트 합성효소); Zm-40로도 공지된 mZE40-2; nuclc; 및 celA(셀룰로오스 합성효소)를 포함한다. 감마-제인은 배젖-특이적 프로모터다. Glob-1은 배낭-특이적 프로모터다. 쌍자엽의 경우, 종자-특이적 프로모터는 이들에만 한정하지 않지만, 콩 베타-파세올린, 나핀, β-콘글리시닌, 콩 렉틴, 크루시페린 등을 포함한다. 단자엽의 경우, 종자-특이적 프로모터는 이들에만 한정하지 않지만, 옥수수 15 kDa 제인(zein) 프로모터, 22 kDa 제인 프로모터, 27 kDa 제인 프로모터, g-제인 프로모터(gzw64A 프로모터, Genbank 등록번호 S78780과 같은) 27 kDa 감마-제인 프로모터, 왁시(waxy) 프로모터, 수축된 1 프로모터, 수축된 2 프로모터, 글로불린 1 프로모터(Genbank 등록번호 L22344 참조), Itp2 프로모터, cim1 프로모터, 옥수수 end1 및 end2 프로모터, nuc1 프로모터, Zm40 프로모터, eep1 및 eep2; lec1, 티오레독신 H 프로모터; mlip15 프로모터, PCNA2 프로모터; 및 수축된 2 프로모터를 포함한다.
유도성 프로모터의 예시는 병원체 공격, 혐기성 조건, 상승된 온도, 광, 가뭄, 저온, 또는 고농도 염에 반응성이 있는 프로모터를 포함한다. 병원체-유도성 프로모터는 병인성-관련 단백질(PR 단백질)로부터 유래된 것을 포함하는데, 이 단백질은 다음의 병원체 감염에 의해 유도된다(예를 들어, PR 단백질, SAR 단백질, 베타-1,3-글루카나아제, 키티나아제).
식물 프로모터와 더불어, 다른 적절한 프로모터는 세균 기원, 예를 들어, 옥토핀 합성효소 프로모터, 노팔린 합성효소 프로모터 및 (Ti 플라스미드로부터 유도되는) 다른 프로모터로부터 유래될 수도 있고, 또는 바이러스 프로모터(예를 들어, 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV)의 35S 및 19S RNA 프로모터, 담배 모자이크 바이러스의 기본구성 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV) 19S 및 35S 프로모터, 또는 현삼 모자이크 바이러스 35S 프로모터)로부터 유래될 수도 있다. 소정의 구현예들에서, MMV(미라빌리스 모자이크 바이러스) 프로모터가 바람직하다. 소정의 구현예들에서, 35S 프로모터가 바람직하다.
다른 측면에서, 서열 목록에서 보이는 임의의 폴리펩티드를 포함해서, 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드 서열과 적어도 60% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되는 단리된 폴리펩티드가 제공되어 있다. 적합하게는, 단리된 폴리펩티드는 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성된다.
한 구현예에서, 단리된 폴리펩티드는 서열번호 2 또는 서열번호 4 또는 서열번호 6 또는 서열번호 8 또는 서열번호 10 또는 서열번호 12와 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성된다. 다른 구현예에서, 단리된 폴리펩티드는 서열번호 2 또는 서열번호 4 또는 서열번호 6 또는 서열번호 8 또는 서열번호 10 또는 서열번호 12와 적어도 78%, 79%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성된다.
한 구현예에서, 단리된 폴리펩티드는 서열번호 20 또는 서열번호 22 또는 서열번호 24와 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되며, 상기 폴리펩티드는 서열번호 20 또는 서열번호 22 또는 서열번호 24에 제시된 위치에 동등한 위치에서 정지 코돈 돌연변이를 포함하는 것으로 제공된다.
다른 구현예에서, 단리된 폴리펩티드는 서열번호 20 또는 서열번호 22 또는 서열번호 24와 적어도 78%, 79%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되며, 상기 폴리펩티드는 서열번호 20 또는 서열번호 22 또는 서열번호 24에 제시된 위치에 동등한 위치에서 정지 코돈 돌연변이를 포함하는 것으로 제공된다. 다른 구현예에서, 서열번호 2 또는 서열번호 4 또는 서열번호 6 또는 서열번호 8 또는 서열번호 10 또는 서열번호 12와 적어도 약 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드 변이체에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 폴리펩티드가 제공된다.
다른 구현예에서, 서열번호 20 또는 서열번호 22 또는 서열번호 24와 적어도 약 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드 변이체에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 폴리펩티드 변이체가 제공되며, 상기 폴리펩티드는 서열번호 20 또는 서열번호 22 또는 서열번호 24에 제시된 위치에 동등한 위치에서 정지 코돈 돌연변이를 포함하는 것으로 제공된다.다른 구현예에서, 서열번호 2 또는 서열번호 4 또는 서열번호 6 또는 서열번호 8 또는 서열번호 10 또는 서열번호 12의 폴리펩티드의 단편 또는 서열번호 2 또는 서열번호 4 또는 서열번호 6 또는 서열번호 8 또는 서열번호 10 또는 서열번호 12의 대응하는 단편과 적어도 약 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 서열번호 2 또는 서열번호 4 또는 서열번호 6 또는 서열번호 8 또는 서열번호 10 또는 서열번호 12의 단편이 제공된다.
다른 구현예에서, 서열번호 20 또는 서열번호 22 또는 서열번호 24의 폴리펩티드의 단편 또는 서열번호 20 또는 서열번호 22 또는 서열번호 24의 대응하는 단편과 적어도 약 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 서열번호 20 또는 서열번호 22 또는 서열번호 24의 단편이 제공되며, 상기 폴리펩티드는 서열번호 20 또는 서열번호 22 또는 서열번호 24에 제시된 위치에 동등한 위치에서 정지 코돈 돌연변이를 포함하는 것으로 제공된다.소정의 구현예들에서, 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되며, 서열번호 2 또는 서열번호 4 또는 서열번호 6 또는 서열번호 8과 적어도 78% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드의 활성이 조절된다. 소정의 구현예들에서, 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되며, 서열번호 2 및 서열번호 4 및 서열번호 6 및 서열번호 8과 적어도 78% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드의 활성이 조절된다. 소정의 구현예들에서, 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되며, 서열번호 2 및 서열번호 4와 적어도 78% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드의 활성이 조절된다. 소정의 구현예들에서, 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되며, 서열번호 6 및 서열번호 8과 적어도 78% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드의 활성이 조절된다. 소정의 구현예들에서, 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되며, 서열번호 2 및 서열번호 4 및 서열번호 6 및/또는 서열번호 8과 적어도 78% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드의 활성이 조절된다. 소정의 구현예들에서, 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되며, 서열번호 2 및/또는 서열번호 4 및 서열번호 6 및 서열번호 8과 적어도 78% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드의 활성이 조절된다.
소정의 구현예들에서, 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되며, 서열번호 20 또는 서열번호 22 또는 서열번호 24와 적어도 78% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드의 활성이 조절되며, 상기 폴리펩티드는 서열번호 20 또는 서열번호 22 또는 서열번호 24에 제시된 위치에 동등한 위치에서 정지 코돈 돌연변이를 포함하는 것으로 제공된다.
소정의 구현예들에서, 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되며, 서열번호 20 및 서열번호 22 및 서열번호 24와 적어도 78% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드의 활성이 조절되며, 상기 폴리펩티드는 서열번호 20 및 서열번호 22 및 서열번호 24에 제시된 위치에 동등한 위치에서 정지 코돈 돌연변이를 포함하는 것으로 제공된다.
소정의 구현예들에서, 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되며, 서열번호 20 및 서열번호 22와 적어도 78% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드의 활성이 조절되며, 상기 폴리펩티드는 서열번호 20 및 서열번호 22에 제시된 위치에 동등한 위치에서 정지 코돈 돌연변이를 포함하는 것으로 제공된다.
소정의 구현예들에서, 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되며, 서열번호 22 및 서열번호 24와 적어도 78% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드의 활성이 조절되며, 상기 폴리펩티드는 서열번호 22 및 서열번호 24에 제시된 위치에 동등한 위치에서 정지 코돈 돌연변이를 포함하는 것으로 제공된다.
소정의 구현예들에서, 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되며, 서열번호 20 및 서열번호 24와 적어도 78% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드의 활성이 조절되며, 상기 폴리펩티드는 서열번호 20 및 서열번호 24에 제시된 위치에 동등한 위치에서 정지 코돈 돌연변이를 포함하는 것으로 제공된다.
소정의 구현예들에서, 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되며, 서열번호 20 및 서열번호 22 및/또는 서열번호 24와 적어도 78% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드의 활성이 조절되며, 상기 폴리펩티드는 서열번호 20 및 서열번호 22 및/또는 서열번호 24에 제시된 위치에 동등한 위치에서 정지 코돈 돌연변이를 포함하는 것으로 제공된다.
소정의 구현예들에서, 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되며, 서열번호 20 및/또는 서열번호 22 및 서열번호 24와 적어도 78% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드의 활성이 조절되며, 상기 폴리펩티드는 서열번호 20 및/또는 서열번호 22 및 서열번호 24에 제시된 위치에 동등한 위치에서 정지 코돈 돌연변이를 포함하는 것으로 제공된다. 상기 폴리펩티드는 아스파라긴 합성효소로서 작용하기에 충분하거나 상당한 정도의 동일성 또는 유사성을 포함하는 서열의 단편을 포함할 수 있다. 폴리펩티드(들)의 단편은 통상적으로 전장 서열의 활성의 일부 또는 전부 - 예컨대 활성의 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100%를 보유한다.
본원에서 논의된 바와 같이, 폴리펩티드는 또한, 임의의 유형의 변경(예, 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환; 글리코실화 상태의 변화; 재접힘 또는 이성질화, 3차원 구조 또는 자가결합 상태에 영향을 미치는 변화)을 도입하여 생성된 돌연변이를 포함하는데, 이들은 아스파라긴 합성효소로서의 기능 또는 활성의 일부 또는 전부를 여전히 가지도록 제공된다. 적합하게는, 아스파라긴 합성효소로서의 기능 또는 활성은 조절, 감소 또는 억제된다. 적합하게는, 아스파라긴 합성효소로서의 기능 또는 활성은 아스파라긴 합성효소 활성이 검출가능하지 않도록 억제된다.
폴리펩티드는 임의의 유형의 변경(예를 들어, 아미노산의 삽입, 결실, 또는 치환; 글리코실화 상태의 변화; 재접힘, 이성질화, 3차원 구조, 또는 자가-결합 상태에 영향을 미치는 변화)을 도입하여 생성되는 변이체를 포함하는데, 이들은 의도적으로 조작되거나 자연적으로 단리될 수 있다. 변종은 무증상(silent) 변화를 만들고 기능적으로 동등한 단백질을 야기하는 변경을 가질 수도 있다. 의도적인 아미노산 치환은 물질의 2차 결합 활성이 보유되는 한 잔기의 극성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성 및 양친매성 성질의 유사성을 기초로 하여 이루어질 수도 있다. 예를 들어, 음전하된 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하고; 양전하된 아미노산은 라이신 및 아르기닌을 포함하고; 유사한 친수성 값을 가지는 비전화된 극성 헤드기를 가지는 아미노산은 루신, 이소루신, 발린, 글리신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 티로신을 포함한다. 보존성 치환은, 예를 들어 하기의 표에 따라서 이루어질 수도 있다. 두번째 컬럼의 동일한 블록 내의 아미노산 및 바람직하게는 세번째 컬럼의 동일한 선 내의 아미노산은 서로 치환될 수 있다:
Figure 112018024443910-pct00001
폴리펩티드는 성숙 단백질 또는 미성숙 단백질 또는 미성숙 단백질로부터 유래한 단백질일 수도 있다. 폴리펩티드는 공지의 방법을 이용해서 선형 형태 또는 고리형일 수도 있다. 폴리펩티드는 통상적으로 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 또는 적어도 40, 또는 적어도 50, 또는 적어도 100, 또는 적어도 200, 또는 적어도 300, 또는 적어도 400, 또는 적어도 500, 또는 적어도 600 개의 인접 아미노산을 포함한다.
또한 서열번호 2 또는 서열번호 4 또는 서열번호 6 또는 서열번호 8 또는 서열번호 10 또는 서열번호 12 또는 그에 100% 서열 동일성을 가지는 서열번호 20 또는 서열번호 22 또는 서열번호 24에 의하여 암호화된 폴리펩티드 또는 서열번호 2 또는 서열번호 4 또는 서열번호 6 또는 서열번호 8 또는 서열번호 10 또는 서열번호 12 또는 서열번호 20 또는 서열번호 22 또는 서열번호 24에 제시된 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성된 폴리펩티드가 개시되어 있다.
폴리펩티드는 형질전환 또는 재조합 숙주 세포를 폴리펩티드를 발현하기에 적합한 배양 조건 하에서 배양하여 제조될 수도 있다. 그런 다음 결과물인 발현된 폴리펩티드는 공지의 정제 공정을 이용해서 이러한 배양물로부터 정제될 수도 있다. 폴리펩티드의 정제는 폴리펩티드에 결합할 시약을 함유하는 친화도 컬럼; 이러한 친화도 수지에 대한 하나 이상의 컬럼 단계; 소수성 상호작용 크로마토그래피와 연관된 하나 이상의 단계; 또는 면역친화도 크로마토그래피를 포함할 수도 있다. 대안적으로, 폴리펩티드는 또한 정제를 용이하게 하는 형태로 발현될 수도 있다. 예를 들면, 그것은 말토오스 결합 폴리펩티드, 글루타티온-5-전이효소, his-tag 또는 티오레독신의 폴리펩티드들과 같은, 융합 폴리펩티드로서 발현될 수도 있다. 융합 폴리펩티드의 발현 및 정제를 위한 키트는 시판중이다. 폴리펩티드는 에피토프(epitope)에 태그되고 후속으로 이러한 에피토프에 유도되는 특정한 항체를 사용하여 정제될 수도 있다. 폴리펩티드르 추가적으로 정제하기 위하여 역상 고성능 액체 크로마토그래피와 같은, 하나 이상의 액체 크로마토그래피 단계가 이용될 수 있다. 상기 정제 단계의 일부 또는 전부는 다양하게 조합되어서 실질적으로 상동성인 재조합 폴리펩티드를 제공하기 위해 이용될 수 있다. 이렇게 정제된 폴리펩티드에는 다른 폴리펩티드가 사실상 없고 "실질적으로 정제된 폴리펩티드"로서 본원에서 정의되고; 이러한 정제된 폴리펩티드는 폴리펩티드, 단편, 변이체 기타 등등을 포함한다. 폴리펩티드와 단편의 발현, 단리, 및 정제는 이에만 한정하는 것은 아니지만 본원에 기재된 방법을 포함해서, 임의의 적절한 기술에 의해 달성될 수 있다.
발현된 폴리펩티드를 친화도-정제하기 위해서, 폴리펩티드에 대해 생성된 모노클로날 항체와 같은 친화도 컬럼을 이용하는 것이 또한 가능하다. 이러한 폴리펩티드는, 예를 들어, 사용을 위해서 고염 용리 완충액 이후 저염 완충액으로 투석하거나 또는 이용되는 친화도 매트릭스에 따라 pH 또는 다른 성분을 변화시키는 종래의 기술을 이용하여 친화도 컬럼으로부터 제거되거나, 또는 친화도 부분의 자연 발생 기질을 사용하여 경쟁적으로 제거될 수 있다.
단리된 또는 실질적으로 정제된 폴리뉴클레오티드 또는 단백질 조성물이 개시되어 있다. “단리된” 또는 “정제된” 폴리뉴클레오티드 또는 단백질, 또는 이들의 생물학적 활성 부분은, 자연적으로 발생하는 환경에서 발견되는 폴리뉴클레오티드 또는 단백질과 일반적으로 동반하거나 상호 작용하는 구성성분이 실질적으로 또는 필수적으로 없다. 따라서, 단리된 또는 정제된 폴리뉴클레오티드 또는 단백질은 재조합 기술에 의해 생산된 경우 기타 세포 물질, 또는 배양 배지가 실질적으로 없거나, 화학적으로 합성된 경우 화학적 전구체나 기타 화학물질이 실질적으로 없다. 선택적으로, “단리된” 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드가 유도되는 유기체의 게놈 DNA에서 자연적으로 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 폴리뉴클레오티드의 5’ 및 3’ 말단에 위치한 서열) 측면에 배치되는 서열(선택적으로 단백질 암호화 서열)이 없다. 예를 들어, 다양한 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드가 유도되는 세포의 게놈 DNA에서 자연적으로 폴리뉴클레오티드 측면에 배치되는 뉴클레오티드 서열을 약 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, 또는 0.1 kb 미만 함유할 수 있다. 세포 물질이 실질적으로 없는 단백질은 약 30%, 20%, 10%, 5%, 또는 1% 미만(건조 중량 기준)의 악성화 단백질을 갖는 단백질 제제를 포함하고 있다.
또한 폴리펩티드는 공지의 종래의 화학적 합성에 의해서 제조될 수도 있다. 합성 수단에 의해서 폴리펩티드 또는 그의 단편을 구성하기 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 고유한 폴리펩티드와 1차, 2차 또는 3차 구조 또는 형태 특성을 공유하기 때문에, 합성적으로 구성된 폴리펩티드 서열은 생물학적 활성을 포함해서, 일반적인 생물학적 특성을 가질 수도 있다.
유전적 배경에서의 차이는 핵산 서열결정, 유전자 마커(예를 들어, 현미부수체(microsatellite) RNA 마커)의 존재 여부와 같은, 본 기술분야에 공지된 표현형 차이에 의하거나 분자 생물학 기술에 의해서 검출될 수 있다.
본원에 기재된 폴리펩티드에 면역반응성이 있는 항체가 또한 제공된다. 본원에서 기재한 폴리펩티드, 단편, 변이체, 융합 폴리펩티드, 기타 등등은 그것에 면역반응성이 있는 항체를 생산하는 "면역원"으로서 이용될 수 있다. 이러한 항체는 항체의 항원-결합 자리를 통해서 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수도 있다. 특이적으로 결합하는 항체는 폴리펩티드, 상동체, 및 변이체를 특이적으로 인식하고 결합하지만, 다른 분자들과는 그렇지 않다. 한 구현예에서, 항체는 본원에서 개시된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드에 대해 특이적이고, 다른 폴리펩티드와 교차 반응하지 않는다.
더욱 특이하게는, 폴리펩티드, 단편, 변이체, 융합 폴리펩티드, 기타 등등은 항체 형성을 이끌어내는 항원 결정기 또는 에피토프를 함유하고 있다. 이러한 항원 결정기 또는 에피토프는 선형이든지 입체형태(불연속적)일 수 있다. 입체형태 또는 불연속적인 에피토프는 폴리펩티드 접힘 시에 매우 근접하게 되는 폴리펩티드 사슬의 다른 영역들로부터의 아미노산 부위로 구성되어 있는 반면, 선형 에피토프는 폴리펩티드의 아미노산의 단일 부위로 구성되어 있다. 에피토프는 본 기술분야에 공지된 방법에 의해 식별될 수 있다. 추가적으로, 폴리펩티드 유래 에피토프는 분석시에 연구 시약으로 사용될 수 있고, 배양된 혼성세포에서 폴리클로날 항체 혈청 또는 상청액과 같은 물질로부터의 특이적 결합 항체를 정제하는 데에 사용될 수 있다. 이러한 에피토프 또는 그의 변이체는 고체상 합성, 폴리펩티드의 화학적 또는 효소 분해, 또는 재조합 DNA 기술을 사용하는 것과 같은 본 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 생산될 수 있다.
폴리펩티드에 대한 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체는 모두 종래의 기술에 의해 제조될 수 있다. 또한 폴리펩티드에 대해 특이적인 모노클로날 항체를 생산하는 혼성 세포주도 본원에서 고려된다. 이러한 혼성세포는 종래의 기술에 의해서 제조되고 식별될 수 있다. 항체 생산의 경우, 다양한 숙주 동물들은 폴리펩티드, 단편, 변이체, 또는 그의 돌연변이를 주입해서 면역시킬 수 있다. 이러한 숙주 동물은 이에만 한정하는 것은 아니지만 몇 가지만 예를 들면 토끼, 마우스와 랫트를 포함할 수도 있다. 다양한 항원보강제가 면역 반응을 증가시키는 데에 사용될 수도 있다. 숙주 종에 따라, 그러한 항원보강제는 이들에만 한정되지 않지만, 프로인트(Freund's) (완전 및 불완전), 수산화알루미늄 같은 미네랄 겔, 리졸레시틴 같은 계면 활성 물질, 플루로닉 폴리올, 다중 음이온, 펩티드, 유유제, 키홀 림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀, 및 BCG (bacille Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 포자충 같은 잠재적으로 유용한 인간 항원보강제를 포함한다. 모노클로날 항체는 종래의 기술에 의해 회수될 수 있다. 이러한 모노클로날 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, 및 그의 서브클래스를 포함하는 임의의 면역글로불린 클래스 중 하나일 수도 있다.
또한 항체는 시험관 내 또는 생체 내에서 폴리펩티드 또는 단편의 존재를 검출하기 위한 분석에 사용될 수 있다. 항체는 면역친화도 크로마토그래피에 의해 폴리펩티드 또는 단편을 정제하는 데에 이용될 수 있다.
폴리뉴클레오티드와 그에 의해 암호화된 폴리펩티드의 단편들이 또한 개시되어 있다. 폴리뉴클레오티드의 단편들은 고유의 단백질의 생물학적 활성을 보유하는 단백질 단편들을 암호화할 수도 있다. 대안적으로, 혼성화 프로브 또는 PCR 프라이머로서 유용한 폴리뉴클레오티드의 단편들은 일반적으로 생물학적 활성을 보유하는 단편 단백질을 암호화하지 않는다. 또한, 개시된 뉴클레오티드 서열의 단편들은 본원에 논의된 바와 같이, 재조합 구성체 내에 조립될 수 있는 것들을 포함한다. 폴리뉴클레오티드 서열의 단편들은 적어도 약 25개 뉴클레오티드, 약 50개 뉴클레오티드, 약 75개 뉴클레오티드, 약 100개 뉴클레오티드, 약 150개 뉴클레오티드, 약 200개 뉴클레오티드, 약 250개 뉴클레오티드, 약 300개 뉴클레오티드, 약 400개 뉴클레오티드, 약 500개 뉴클레오티드, 약 600개 뉴클레오티드, 약 700개 뉴클레오티드, 약 800개 뉴클레오티드, 약 900개 뉴클레오티드, 약 1000개 뉴클레오티드, 약 1100개 뉴클레오티드, 약 1200개 뉴클레오티드, 약 1300개 뉴클레오티드, 또는 약 1500개 뉴클레오티드, 약 2000개 뉴클레오티드, 약 3000개 뉴클레오티드, 약 4000개 뉴클레오티드, 약 5000개 뉴클레오티드, 약 6000개 뉴클레오티드, 약 7000개 뉴클레오티드, 약 8000개 뉴클레오티드, 약 9000개 뉴클레오티드, 약 10000개 뉴클레오티드, 약 15000개 뉴클레오티드, 약 20000개 뉴클레오티드, 및 본원에 기재된 최대 전장 폴리펩티드를 암호화하는 전장 폴리뉴클레오티드 범위일 수도 있다. 폴리펩티드 서열의 단편들은 적어도 약 25개 아미노산, 약 50개 아미노산, 약 75개 아미노산, 약 100개 아미노산, 약 150개 아미노산, 약 200개 아미노산, 약 250개 아미노산, 약 300개 아미노산, 약 400개 아미노산, 약 500개 아미노산, 약 600개 아미노산, 및 본원에 기재된 최대 전장 폴리펩티드 범위일 수도 있다.
본원에 기술된 아스파라긴 합성효소(들)의 발현 또는 활성을 감소시키는 것은 다양한 수단에 의해 이루어질 수 있는 것이 인지되어야 한다. 특정 구현예에 따르면, 아스파라긴 합성효소(들)의 발현을 감소시키는 것은, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 안티센스, siRNA, 리보자임 또는 DNA자임 분자를 포함하여, 전사 및/또는 번역을 간섭하는 다양한 분자들을 사용하여 게놈 및/또는 전사물 수준에서 수행될 수 있다. 결실, 삽입, 부위 특이적 돌연변이, 징크-핑거 뉴클레아제 등을 포함하여, 하나 이상의 돌연변이를 적어도 하나의 유전자에 삽입하는 것 또한 사용될 수 있다. 다른 구현예들에 따르면, 발현은 길항제, 또는 폴리펩티드 등을 절단하는 효소들을 사용하여 단백질 수준에서 억제될 수 있다.
한 측면으로, 적어도 하나의 돌연변이와 (i) 아스파라긴 합성효소를 암호화하고 서열번호 1 또는 서열번호 3 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7에 대해 적어도 72%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 폴리뉴클레오티드; (ii) (i)에서 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드; (iii) 아스파라긴 합성효소를 암호화하고 서열번호 2 또는 서열번호 4 또는 서열번호 6 또는 서열번호 8에 대해 적어도 78%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 폴리펩티드; 또는 (iv) (i)에서 기재된 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 구성체, 벡터 또는 발현 벡터를 포함하며, 여기서 적어도 하나의 돌연변이는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하지 않는 대조군 식물에 비교하여 아스파라긴 합성효소의 발현 또는 활성을 감소시키는 돌연변이 식물 또는 그것의 부분이 기술된다. 다른 측면으로, 적어도 하나의 돌연변이와 (i) 아스파라긴 합성효소를 암호화하고 서열번호 1에 대해 적어도 90%의 서열 동일성 또는 서열번호 3 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7에 대해 적어도 72%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 폴리뉴클레오티드; (ii) (i)에서 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드; (iii) 아스파라긴 합성효소를 암호화하고 서열번호 2 또는 서열번호 4 또는 서열번호 6 또는 서열번호 8에 대해 적어도 78%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 폴리펩티드; 또는 (iv) (i)에서 기재된 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 구성체, 벡터 또는 발현 벡터를 포함하며, 여기서 적어도 하나의 돌연변이는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하지 않는 대조군 식물에 비교하여 아스파라긴 합성효소의 발현 또는 활성을 감소시키는 돌연변이 식물 또는 그것의 부분이 기술된다.
그러므로 식물 또는 식물 세포는 NtASN1-S (서열번호 1) 및/또는 NtASN1-T (서열번호 3) 및/또는 NtASN3-S (서열번호 9) 및/또는 NtASN3-T (서열번호 11) 및/또는 NtASN5-S (서열번호 5) 및/또는 NtASN5-T (서열번호 7)에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 이때 상기 돌연변이는 상기 유전자 또는 그로써 암호화된 단백질의 감소된 발현 또는 감소된 기능을 초래한다. 식물 또는 식물 세포는 기술된 것과 같이, NtASN1-S (서열번호 1) 또는 NtASN1-T (서열번호 3) 또는 NtASN5-S (서열번호 5) 또는 NtASN5-T (서열번호 7)에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 이때 상기 돌연변이는 상기 유전자 또는 그로써 암호화된 단백질의 감소된 발현 또는 감소된 기능을 초래한다. 식물 또는 식물 세포는 기술된 것과 같이, NtASN1-S (서열번호 1) 및 NtASN1-T (서열번호 3) 또는 NtASN5-S (서열번호 5) 및 NtASN5-T (서열번호 7)에서 하나 이상의 돌연변이(예를 들면 본원에 기술된 것과 같은 넌센스 돌연변이 등)를 포함하고, 이때 상기 돌연변이는 상기 유전자 또는 그로써 암호화된 단백질의 감소된 발현 또는 감소된 기능을 초래한다. 돌연변이(들)의 발현 또는 기능은 조절, 억제 또는 감소될 수 있다. 본원에 기술된 하나 이상의 돌연변이 외에, 돌연변이 식물 또는 식물 세포는 하나 이상의 다른 유전자 또는 폴리펩티드에 하나 이상의 추가의 돌연변이를 가질 수 있다. 소정의 구현예들에서, 돌연변이는 하나 이상의 다른 유전자 또는 폴리펩티드에 하나 이상의 추가의 돌연변이를 가질 수 있다. NtASN1-S, NtASN1-T, NtASN5-S 및 ASN5-T의 돌연변이들이 본원에 기술된다. 소정의 구현예들에서, 하나 이상의 돌연변이는 글루타미나제 도메인에 있다.
3개의 정지 돌연변이는 ASN5-T 사본에서가 아닌, ASN1-S (ASN1-S_W156* - 서열번호 19 및 20), ASN1-T (ASN1-T_W156* - 서열번호 21 및 22) 및 ASN5-S (ASN5-S_Q66* - 서열번호 23 및 24) 사본에서 확인된다. 정지 돌연변이가 ASN5-T에서 확인되지 않았기 때문에, 비-정지 돌연변이가 잠재적 후보로서 확인되었다. ASN5-T_G59D에 대해서가 아니라, 상응하는 WT 분리 개체에 비교하여 ASN1-S W156*, ASN1-T_W156* 및 ASN5-S_Q66*에서의 아스파라긴 감소에 대한 명백한 경향이 있었다. 가장 강력한 감소는 ASN1-T_W156*에 대해(83%) 관찰되었고, 이어서 ASN5-S_Q66*에 대해(44%), 최종적으로 ASN1-S_W156*에 대해(17%) 관찰되었다. ASN5-T_G59D 주는 아스파라긴의 약간의 증가를 보였다. ASN1-S 및 ASN5-S에서 정지 돌연변이는 식물 바이오매스 및 크기에 영향을 미치지 않았다. Canales 등 (2012)에 따르면, 모든 Nt-ASN 유전자에서의 돌연변이는 글루타민으로부터 암모니아를 방출하는 글루타미나제 도메인에 위치하고, 합성효소 도메인은 Nt-ASN에서 아미노산 R211부터 D451 일치 영역에 위치한다.
상기 돌연변이체 식물 또는 식물 세포는 돌연변이(들)에 대해 이형접합성 또는 동형접합성일 수 있다. 상기 돌연변이체 식물 또는 식물 세포는 적어도 하나의 돌연변이에 대해 이형접합성이고 적어도 하나의 다른 돌연변이에 대해 동형접합성일 수 있다. 적합하게는, 상기 돌연변이체 식물 또는 식물 세포는 돌연변이(들)에 대해 동형접합성이다.
상기 돌연변이체는 서열번호 2의 아미노산 위치 156에 동등한 위치에서 돌연변이(예를 들어, 정지 코돈을 야기하는 넌센스 돌연변이)를 가질 수 있다. 그러한 돌연변이체의 예는 본원에 기재된 바와 같이 ASN1-S_W156*이다.
상기 돌연변이체는 서열번호 4의 아미노산 위치 156에 동등한 위치에서 돌연변이(예를 들어, 정지 코돈을 야기하는 넌센스 돌연변이)를 가질 수 있다. 그러한 돌연변이체의 예는 본원에 기재된 바와 같이 ASN1-T_W156*이다.
상기 돌연변이체는 서열번호 6의 아미노산 위치 66에 동등한 위치에서 돌연변이(예를 들어, 정지 코돈을 야기하는 넌센스 돌연변이)를 가질 수 있다. 그러한 돌연변이체의 예는 본원에 기재된 바와 같이 ASN5-S_Q66*이다.
이 돌연변이들의 조합 또한 고려된다. 상기 조합은 ASN1-S_W156* 및 ASN1-T_W156*의 조합; 또는 ASN1-S_W156* 및 ASN5-S_Q66*의 조합; 또는 ASN1-T_W156* 및 ASN5-S_Q66*의 조합; 또는 ASN1-S_W156*, ASN1-T_W156* 및 ASN5-S_Q66*의 조합을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 식물 또는 상기 식물에서 유래된 식물 재료에서 아스파라긴의 수준을 감소시키는 방법이 제공되어 있으며, 상기 방법은 적어도 하나의 아스파라긴 합성효소 유전자의 발현을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 상기 식물의 게놈 내로 도입시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 적어도 하나의 아스파라긴 합성효소 유전자는 NtASN1-S, NtASN1-T, NtASN5-S 또는 Nt ASN5-T을 암호화한다. 적합하게는, NtASN1-S, NtASN1-T, NtASN5-S 또는 NtASN5-T에서의 돌연변이(들) 이외에, 하나 이상의 돌연변이가 적어도 1개, 2개 또는 3개 이상의 추가 아스파라긴 합성효소 유전자의 적어도 하나의 대립형질 내로 도입될 수 있다. NtASN1-S 및 NtASN1-T 또는 NtASN5-S 및 NtASN5-T 에서의 돌연변이 또한 고려된다.
또한, 아스파라긴의 수준이 감소된 식물을 확인하는 방법이 제공되어 있으며, 상기 방법은 NtASN1-S, NtASN1-T, NtASN5-S 또는 ASN5-T에서 하나 이상의 돌연변이의 존재에 대해 관심있는 식물로부터의 핵산 샘플을 스크리닝하는 단계를 포함한다. 적합하게는, 상기 방법은 NtASN1-S에서 돌연변이의 존재에 대해, NtASN1-T에서 돌연변이의 존재에 대해, 또는 NtASN5-S에서 돌연변이의 존재에 대해, 또는 NtASN5-T에서 돌연변이의 존재에 대해, 상기 핵산 샘플 또는 관심 있는 대상 식물로부터의 또 다른 핵산 샘플을 스크리닝하는 단계를 추가로 포함한다.
또한, NtASN1-S, NtASN1-T, NtASN5-S 또는 NtASN5-T를 암호화하는 유전자에서 하나 이상의 돌연변이에 대해 이종접합성이거나 동형접합성인 식물 또는 식물 세포 가 개시되어 있으며, 여기서 상기 돌연변이(들)는 유전자의 발현 감소 또는 이로부터 암호화된 단백질의 감소된 기능을 초래한다.
일부 구현예에서, 상기 바람직한 돌연변이(들)는 돌연변이유발 접근방법을 이용하여 식물 또는 식물 세포 내로 도입되며, 상기 도입된 돌연변이는 본 기술분야의 숙련자들에게 공지된 방법들-예컨대 서던 블롯(Southern blot) 분석, DNA 시퀀싱, PCR 분석, 또는 표현형 분석을 이용하여 식별되거나선택된다. 유전자 발현에 영향을 주는 돌연변이 또는 암호화된 단백질의 기능을 방해하는 돌연변이는 본 기술분야에 주지된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 유전자 엑손에서의 삽입성 돌연변이는 일반적으로 결손 돌연변이체를 초래한다. 보존된 잔기에서의 돌연변이는 암호화된 단백질의 대사 기능을 억제 또는 감소시키는 데 특히 효과적일 수 있다.
돌연변이체 폴리뉴클레오티드와 폴리펩티드를 수득하기 위한 방법이 또한 개시되어 있다. 식물 세포 또는 식물 재료를 포함해서, 관심있는 임의의 식물은 자리-특이적 돌연변이 유발, 올리고뉴클레오티드-특이적 돌연변이 유발, 화학적-유도 돌연변이 유발, 방사-유도 돌연변이 유발, 변형된 염기를 이용하는 돌연변이 유발, 간격 이중체 DNA(gapped duplex DNA)를 이용하는 돌연변이 유발, 이중가닥 파괴 돌연변이 유발, 수선-결핍 숙주 균을 이용하는 돌연변이 유발, 총 유전자 합성에 의한 돌연변이 유발, DNA 셔플링(shuffling) 및 기타 동등한 방법들을 포함해서, 돌연변이 유발을 유도하기 위해서 공지된 다양한 방법에 의해 유전적으로 변형될 수 있다.
돌연변이 폴리펩티드 변이체는 하나 이상의 돌연변이 폴리펩티드 변이체를 포함하는, 비-자연 발생 돌연변이 또는 트랜스제닉 식물(예를 들어, 돌연변이, 비-자연 발생, 트랜스제닉, 인공 또는 유전자 조작 식물) 또는 식물 세포를 형성하는 데에 사용될 수 있다. 적합하게는, 돌연변이 폴리펩티드 변이체는 돌연변이되지 않은 폴리펩티드의 활성을 보유한다. 돌연변이 폴리펩티드 변이체의 활성은 돌연변이되지 않은 폴리펩티드보다 높거나, 낮거나 또는 거의 동일할 수도 있다.
본원에 기재된 뉴클레오티드 서열 및 폴리펩티드에서의 돌연변이는 인공 돌연변이 또는 합성 돌연변이 또는 유전자 조작 돌연변이를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열 및 폴리펩티드에서의 돌연변이는 시험관 내 또는 생체 내 조작 단계를 포함하는 공정을 통해서 수득되거나 또는 수득가능한 돌연변이일 수 있다. 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열 및 폴리펩티드에서의 돌연변이는 인간에 의한 개입을 포함하는 공정을 통해서 수득되거나 또는 수득가능한 돌연변이일 수 있다. 예시로서, 공정은 예컨대 돌연변이 유발, 기형 발생, 또는 발암성 유기 화합물, 예를 들어 에틸 메탄술포네이트(EMS) 같은 외인성 첨가 화학물질을 사용하는 돌연변이 유발을 포함할 수도 있는데, 이것은 유전 물질에서 무작위 돌연변이를 생성한다. 추가적인 예시로서, 공정은 본원에 기재된 하나 이상의 유전자 조작 단계와 같은 하나 이상의 유전자 조작 단계 또는 그의 조합을 포함할 수도 있다. 추가적인 실시예에 의해서, 공정은 하나 이상의 식물 교배 단계를 포함할 수도 있다.
식물에서 하나 이상의 아스파라긴 합성효소 폴리펩티드의 활성은, 변환 활성이 그 아스파라긴 합성효소 폴리펩티드의 변환 활성을 억제하도록 변형되지 않았으며 동일한 프로토콜을 사용하여 배양되고 수득된 식물에서 동일한 아스파라긴 합성효소 폴리펩티드(들)의 변환 활성 보다 통계적으로 낮은 경우에 본 발명에 따라 감소되거나 억제된다. 식물에서 하나 이상의 아스파라긴 합성효소 폴리펩티드의 활성은, 본원에 기재된 검정 방법에 의해 검출가능하지 않을 때 제거되는 것으로 간주된다. 아스파라긴 합성효소 폴리펩티드의 활성을 결정하는 방법이 본원에 기재되어 있다.
돌연변이유발 외에도, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 중 하나 이상의 발현 또는 활성을 조절할 수 있는 조성물은 이들에만 제한하지는 않지만, 하나 이상의 내인성 유전자(들)의 전사를 간섭할 수 있는 서열-특이적 폴리뉴클레오티드; RNA 전사체(예, 이중가닥 RNA, siRNA, 리보자임)의 번역을 간섭할 수 있는 서열-특이적 폴리뉴클레오티드; 하나 이상의 단백질의 안정성을 간섭할 수 있는 서열-특이적 폴리펩티드; 기질 또는 조절 단백질과 관련해서 하나 이상의 단백질의 효소 활성 또는 하나 이상의 단백질의 결합 활성을 간섭할 수 있는 서열-특이적 폴리뉴클레오티드; 하나 이상의 단백질에 대한 특이성을 나타내는 항체; 하나 이상의 단백질의 안정성 또는 하나 이상의 단백질의 효소 활성 또는 하나 이상의 단백질의 결합 활성을 간섭할 수 있는 소분자 화합물; 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 결합하는 아연 핑거 단백질; 및 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 대한 활성을 가지는 메가뉴클레아제를 포함한다. 유전자 편집 기술, 유전적 편집 기술 및 게놈 편집 기술이 본 기술분야에 주지되어 있다.
한 가지 유전자 편집 방법은 세포가 수선 메커니즘에 반응할 수 있는 이중가닥 파단을 유도하는 전사 활성제-유사 효과기 뉴클레아제(transcription activator-like effector nuclease; TALEN)를 사용하는 것을 포함한다. 비-상동 말단 연결은 결합을 위한 서열 중첩이 거의 없거나 전무한 경우에 이중가닥 파단의 각 측으로부터 DNA를 다시 연결한다. 이러한 수선 메커니즘은 삽입 또는 결실, 또는 염색체 재배열을 통해 게놈의 오류를 유발한다. 그러한 임의의 오류는 비-기능성 위치에서 암호화되는 유전자 산물을 제공할 수도 있다. 또 다른 유전자 편집 방법은 세균 CRISPR/Cas 시스템의 사용을 포함한다. 세균과 고세균은 바이러스 및 플라스미드 DNA를 침입하는 것에 대항하는 적응성 면역 시스템의 일부인 CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)이라고 불리는 염색체 요소를 보여주고 있다. II 유형 CRISPR 시스템에서, CRISPR RNA(crRNA)는 trans-activating crRNA (tracrRNA) 및 CRISPR-associated (Cas) 단백질로 기능해서 표적 DNA의 이중가닥 파단을 도입한다. Cas9에 의한 표적 절단은 crRNA과 tracrRNA 사이의 염기 쌍 뿐만 아니라 crRNA와 표적 DNA 사이의 염기 쌍이 필요하다. 표적 인식은 NGG 서열을 따르는 protospacer-adjacent motif (PAM)라고 불리는 짧은 모티브의 존재에 의해 촉진된다. 이 시스템은 게놈 편집을 위해 이용될 수 있다. Cas9은 보통 crRNA 및 tracrRNA으로 이루어진 이중 RNA에 의해 프로그래밍된다. 그러나, 이들 RNA의 코어 성분은 Cas9 표적화를 위한 단일 혼성체 '가이드 RNA'에 결합될 수 있다. 자리 특이적 절단을 위한 표적 DNA에 대해 비-암호화 RNA 가이드를 사용하면 TALEN 같은 기존의 기술보다 훨씬 더 간단하다는 것을 약속한다. CRISPR/Cas 전략을 사용하여, 뉴클레아제 복합체를 재표적화하는 것은 단지 새로운 RNA 서열의 도입만을 필요로 하며, 단백질 전사 인자의 특이성을 재조작할 필요가 없다.
안티센스 기술은 폴리펩티드의 발현을 조절하는 데 사용될 수 있는 다른 주지의 방법이다. 억제될 유전자의 폴리뉴클레오티드는 클로닝되고 조절 영역 및 전사 종결 서열에 작동가능하게 연결되어서 RNA의 안티센스 가닥이 전사될 수 있게 된다. 그런 다음 재조합 구성체는 식물 세포 내로 형질전환되고 RNA의 안티센스 가닥이 생산된다. 폴리뉴클레오티드는 억제될 유전자의 전체 서열일 필요는 없지만, 전형적으로 억제될 유전자의 센스 가닥의 적어도 일부분에 실질적으로 상보적일 것이다.
폴리뉴클레오티드는 리보자임, 또는 촉매 RNA 내로 전사될 수도 있는데, 이것은 mRNA의 발현에 영향을 미친다. 리보자임은 사실상 어느 표적 RNA에 특정하게 쌍을 이루도록 고안되고 특정 위치에서 포스포디에스테르 구조를 절단할 수 있고, 그에 의해서 표적 RNA를 기능적으로 불활성시킬 수 있다. 이형 폴리뉴클레오티드는 특정한 mRNA 전사체를 절단하도록 고안된 리보자임을 암호화함에 따라, 폴리펩티드의 발현을 막을 수 있다. 자리-특이적 인식 서열에서 mRNA를 절단하는 다양한 리보자임이 사용될 수 있지만, 망치머리형 리보자임(hammerhead ribozyme)이 특정한 mRNA를 파괴하는 데 유용하다. 망치머리형 리보자임은 표적 mRNA와 상보적인 염기쌍을 형성하는 측면영역(flanking region)에 의해 생긴 위치에서 mRNA를 절단한다. 유일한 요건은 표적 RNA가 5'-UG-3' 뉴클레오티드 서열을 함유하는 것이다. 망치머리형 리보자임의 구조 및 생산이 본 기술분야에 공지되어 있다. 망치머리형 리보자임 서열은 전달 RNA (tRNA) 같은 안정적인 RNA에 끼어 들어가서 생체 내 절단 효능을 증가시킬 수 있다.
한 구현예에서, RNA 전사체(들)의 번역을 간섭할 수 있는 서열-특이적 폴리뉴클레오티드는 RNA를 간섭한다. RNA 간섭 또는 RNA 침묵(silencing)은 특이적인 mRNA가 효소 변성을 목표로 삼을 수 있는 진화적으로 보존되는 공정이다. 이중가닥 RNA(이중가닥 RNA)는 세포 (예를 들어, 이중가닥 RNA 바이러스, 또는 간섭 RNA 폴리뉴클레오티드)에 의해서 도입되거나 또는 생산되어서 간섭 RNA 경로를 개시한다. 이중가닥 RNA는 RNases III에 의한 21-23 bp 길이의 다중 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 이중체로 변환될 수 있고, 이것은 이중가닥 RNA-특이적 엔도뉴클레아제이다. siRNA는 ATP-의존 공정을 통해서 siRNA의 풀림을 촉진하는 RNA-유도 침묵 복합체에 의해 후속적으로 인식될 수 있다. siRNA의 풀린 안티센스 가닥은 활성화된 RNA-유도 침묵 복합체를, siRNA 안티센스 가닥에 대해 상보적인 서열을 포함하는 표적 mRNA로 유도한다. 표적 mRNA 및 안티센스 가닥은 A-형 나선을 형성할 수 있고, A형 나선의 주된 홈(groove)은 활성화된 RNA-유도 침묵 복합체에 의해 인식될 수 있다. 표적 mRNA는 siRNA 가닥의 5'-말단의 결합 자리에 의해서 정의되는 하나의 자리에서 활성화된 RNA-유도 침묵 복합체에 의해서 절단될 수 있다. 활성화된 RNA-유도 침묵 복합체는 또 다른 절단 경우를 촉매하기 위해서 재활용될 수 있다. NtASN1-S과 NtASN1-T 사본 둘 다 침묵시키는 데 사용 가능한 NtASN1-S 유래 코딩 서열의 예가 서열번호 17에 보여지고 있다. 따라서, 또 다른 측면은 서열번호 17에 제시된 뉴클레오티드 서열, 또는 이에 적어도 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 가지는 서열에 관한 것이다. NtASN1-S과 NtASN1-T 사본 둘 다 침묵시키는 데 사용 가능한 NtASN5-T 유래 코딩 서열의 예가 서열번호 18에 보여지고 있다. 따라서, 또 다른 측면은 서열번호 17에 제시된 서열에 관한 것이다. 따라서, 또 다른 측면은 서열번호 18에 제시된 뉴클레오티드 서열, 또는 이에 적어도 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 가지는 서열에 관한 것이다. 이들 코딩 서열을 사용하는 유전자 침묵 방법 및 그의 용도 또한 고려된다.
간섭 RNA 발현 벡터는 mRNA, pre-mRNA, 또는 관련 RNA 변이체의 발현 수준을 감소시켜서 RNA 간섭 활성을 나타내는 간섭 RNA 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 간섭 RNA 구성체를 포함할 수도 있다. 예시적인 구성체가 도 22에 보여지고 있다. 발현 벡터는 본원에서 더 설명된 바와 같이, 상류에 위치하고 간섭 RNA 구성체에 작동가능하게 연결되어 있는 프로모터를 포함할 수도 있다. 간섭 RNA 발현 벡터는 전사 종결 및 폴리아데닐화 신호, 및 다양한 선택성 마커와 같은 당업자에게 공지된 다른 서열을 포함해서, 적절한 최소 코어 프로모터, 관심있는 간섭 RNA 구성체, 상류 (5') 조절 영역, 하류 (3') 조절 영역을 포함할 수도 있다.
폴리뉴클레오티드는 이중가닥 구조(즉, 안티센스 가닥과 상보성 센스 가닥을 포함하는 이중가닥 RNA 분자), 이중가닥 헤어핀-유사 구조, 또는 단일가닥 구조(즉, 단지 안티센스 가닥을 포함하는 ssRNA 분자)를 포함해서, 다양한 형태로 생산될 수 있다. 구조는 자가-상보성 센스 및 안티센스 가닥을 가지는, 이중체, 비대칭 이중체, 헤어핀 또는 비대칭 헤어핀 2차 구조를 포함할 수도 있다. 이중가닥 간섭 RNA는 이중가닥 siRNA로 효소적으로 변환될 수 있다. siRNA 이중체의 가닥 중 하나는 표적 mRNA 및 관련 RNA 변이체 내에서 상보성 서열에 결합(anneal)할 수 있다. siRNA/mRNA 이중체는 서열-의존 방식으로 다수 자리에서 RNA를 절단할 수 있는 RNA-유도 침묵 복합체에 의해서 인식되고, 그 결과 표적 mRNA 및 관련 RNA 변이체의 변성을 야기한다.
이중가닥 RNA 분자는 줄기-고리 구조의 단일 올리고뉴클레오티드로부터 조립된 siRNA, 뿐만 아니라 자가 상보성 센스 및 안티센스 가닥을 포함하는 2 개 이상의 고리 구조 및 줄기를 가지는 원형 단일가닥 RNA를 포함할 수도 있는데, 여기서 siRNA 분자의 자가-상보적 센스 및 안티센스 영역이 폴리뉴클레오티드계 또는 비-폴리뉴클레오티드계 링커(들)에 의하여 연결된 것이고, 여기서 원형 RNA는 생체 내 또는 시험관 내에서 간섭 RNA를 매개할 수 있는 활성 siRNA 분자를 생성하도록 처리될 수 있다.
작은 헤어핀 RNA 분자들의 용도가 또한 고려된다. 그것들은 역상보성 (센스) 서열과 더불어, 특이적인 안티센스 서열을 포함하는데, 전형적으로 스페이서 또는 루프 서열에 의해서 분리되어 있다. 스페이서 또는 루프의 절단은 단일가닥 RNA 분자 및 그의 역보체를 제공해서, 그들이 결합되어 이중가닥 RNA 분자를 형성할 수도 있다(선택적으로 각각 또는 모든 가닥의 3' 말단 또는 5' 말단에서 한 개, 두 개, 세 개 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 첨가 또는 제거를 가져올 수도 있는 후속적인 처리 단계들에 의함). 스페이서는 충분히 길어서, 스페이서 절단(그리고, 선택적으로, 각각 또는 모든 가닥의 3' 말단 또는 5' 말단에서 한 개, 두 개, 세 개, 네 개 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 첨가 또는 제거를 가져올 수도 있는 후속적인 처리 단계들) 이전에, 안티센스 및 센스 서열이 이중가닥 구조(또는 줄기)를 결합하고 형성할 수 있게 한다. 스페이서 서열은 일반적으로 이중가닥 폴리뉴클레오티드로 결합될 때, 작은 헤어핀 RNA를 포함하는, 두 개의 상보성 뉴클레오티드 서열 영역 사이에 위치하는 무관한 뉴클레오티드 서열이다. 스페이서 서열은 일반적으로 약 3 내지 약 100개의 뉴클레오티드를 포함하고 있다.
관심있는 RNA 폴리뉴클레오티드는 헤어핀 이중체를 생산하기 위해서 적절한 서열 조성, 루프 크기, 및 줄기 길이를 선택하여 생산될 수 있다. 헤어핀 이중체의 줄기 길이를 고안하기에 적절한 범위는 약 14-30 뉴클레오티드와 같은- 적어도 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20의 뉴클레오티드, 약 30-50 뉴클레오티드, 약 50-100 뉴클레오티드, 약 100-150 뉴클레오티드, 약 150-200 뉴클레오티드, 약 200-300 뉴클레오티드, 약 300-400 뉴클레오티드, 약 400-500 뉴클레오티드, 약 500-600 뉴클레오티드, 및 약 600-700 뉴클레오티드의 줄기 길이를 포함한다. 헤어핀 이중체의 루프 길이를 고안하기에 적절한 범위는, 헤어핀 이중체의 줄기 길이가 상당하다면 약 4-25 뉴클레오티드, 약 25-50 뉴클레오티드 또는 그 이상의 루프 길이를 포함한다. 소정의 구현예들에서, 이중가닥 RNA 또는 ssRNA 분자는 길이가 약 15 내지 약 40의 뉴클레오티드이다. 또 다른 구현예에서, siRNA 분자는 길이가 약 15 내지 약 35의 뉴클레오티드의 이중가닥 RNA 또는 ssRNA 분자이다. 또 다른 구현예에서, siRNA 분자는 길이가 약 17 내지 약 30의 뉴클레오티드의 이중가닥 RNA 또는 ssRNA 분자이다. 또 다른 구현예에서, siRNA 분자는 길이가 약 19 내지 약 25의 뉴클레오티드의 이중가닥 RNA 또는 ssRNA 분자이다. 또 다른 구현예에서, siRNA 분자는 길이가 약 21 내지 약 23 뉴클레오티드의 이중가닥 RNA 또는 ssRNA 분자이다. 소정의 구현예들에서, 21 뉴클레오티드보다 긴 이중체 영역을 가지는 헤어핀 구조는 루프 서열과 길이에 관계없이, 효과적인 siRNA-유도 침묵을 촉진할 수도 있다. RNA 간섭에 사용되는 예시적인 코딩 서열은 서열번호 17 및 18에 제시되어 있다.
표적 mRNA 서열은 전형적으로 길이가 약 14 내지 약 50의 뉴클레오티드이다. 따라서, 표적 mRNA는 바람직하게는 표적 서열에 대해 이하의 기준 중 하나 이상을 충족시키는, 약 14 내지 약 50의 뉴클레오티드 길이의 영역이 스캔될 수 있다: 약 2:1 내지 약 1:2의 A+T/G+C 비율; 표적 서열의 5' 말단에서의 AA 디뉴클레오티드 또는 CA 디뉴클레오티드; 표적 mRNA에 고유한 10 이상의 연속된 뉴클레오티드의 서열(즉, 동일한 식물로부터의 다른 mRNA에 존재하지 않는 서열); 및 세 개 넘는 연속된 구아닌(G) 뉴클레오티드 또는 세 개 넘는 연속된 시토신(C) 뉴클레오티드가 "배치(run)"되지 않음. 이러한 기준은 본 기술분야에 공지된 다양한 기술을 이용해서 측정될 수 있는데, 예를 들어 BLAST 같은 컴퓨터 프로그램을 사용해서, 선택된 표적 서열이 표적 mRNA에 대해 고유한지 여부를 결정하기 위해 공개적으로 이용할 수 있는 데이터베이스를 검색할 수 있다. 대안적으로, 표적 서열 (및 고안된 siRNA 서열)은 시판중인 컴퓨터 소프트웨어 (예를 들어, 시판중인 OligoEngine, Target Finder 및 siRNA Design Tool)를 사용해서 선택될 수 있다.
한 구현예에서, 표적 mRNA 서열은 상기 기준 중 하나 이상을 충족시키는, 약 14 내지 약 30 길이의 뉴클레오티드에서 선택된다. 또 다른 구현예에서, 표적 서열은 상기 기준 중 하나 이상을 충족시키는, 약 16 내지 약 30 길이의 뉴클레오티드에서 선택된다. 추가적인 구현예에서, 표적 서열은 상기 기준 중 하나 이상을 충족시키는 약 19 내지 약 30 길이의 뉴클레오티드에서 선택된다. 또 다른 구현예에서, 표적 서열은 상기 기준 중 하나 이상을 충족시키는, 약 19 내지 약 25 길이의 뉴클레오티드에서 선택된다.
예시적인 구현예에서, siRNA 분자는 본원에 기재된 임의의 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 중의 적어도 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 그 이상의 연속된 뉴클레오티드에 대해 상보적인 특이적 안티센스 서열을 포함한다.
siRNA 분자에 포함되는 특이적 안티센스 서열은 표적 서열의 보체와 동일하거나, 또는 실질적으로 동일할 수 있다. 한 구현예에서, siRNA 분자에 포함되는 특이적 안티센스 서열은 표적 mRNA 서열의 보체에 대해 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하다. 서열 동일성을 결정하는 방발현벡터법은 본 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들면 University of Wisconsion Computer Group (GCG) 소프트웨어 또는 NCBI 웹사이트에서 제공되는 BLASTIN 프로그램을 사용해서 결정될 수 있다.
siRNA 분자의 특이적 안티센스 서열은 표적 mRNA의 서열로부터 한 개, 두 개, 세 개, 네 개 또는 그 이상의 뉴클레오티드에서 변해서(예를 들어, 전이(transition) 또는 전좌(transversion)를 포함하는, 뉴클레오티드 치환에 의해서) 가변성을 나타낼 수도 있다. 이러한 뉴클레오티드 치환이 이중가닥 RNA 분자의 안티센스 가닥에 존재하면, 치환체 뉴클레오티드가 전형적으로 수소결합 염기-쌍을 형성하는, 센스 가닥의 상보적 뉴클레오티드는 이에 상응하게 치환될 수도 있고, 그렇지 않을 수도 있다. 하나 이상의 뉴클레오티드 치환이 안티센스 가닥이 아닌, 센스 서열에서 일어나는 이중가닥 RNA 분자가 또한 고려된다. siRNA 분자의 안티센스 서열이 상술한 바와 같이, siRNA 및 표적 뉴클레오티드 서열 사이의 하나 이상의 불일치를 포함할 때, 불일치는 안티센스 서열의 3' 말단, 5' 말단 또는 중앙부에서 발견될 수도 있다.
또 다른 구현예에서, siRNA 분자는 엄격성 조건 하에서 자연 발생 표적 유전자 또는 표적 mRNA의 일부분에 선택적으로 혼성화할 수 있는, 특이적인 안티센스 서열을 포함한다. 본 기술분야의 숙련자에게 공지된 바와 같이, 혼성화 조건의 엄격도 변화는 혼성화 및 세정 단계에 사용되는 시간, 온도 또는 용액 농도를 변경하여 얻을 수도 있다. 또한 적절한 조건은 부분적으로, 사용되는 구체적인 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 표적 mRNA 또는 유전자의 서열에 의존한다.
식물에 이중가닥 RNA-침묵을 유도하기 위한 하나의 방법은 헤어핀 RNA를 생산하는 유전자 구조체에 의한 형질전환이다(Smith 등 (2000) Nature, 407, 319-320 참조). 이러한 구성체는 표적 유전자 서열의 역 영역을 포함하는데, 적절한 스페이서에 의해서 분리되어 있다. 스페이서 단편으로서 기능적인 식물 인트론 영역을 삽입하는 것은 인트론 접합 헤어핀 RNA를 생성시키기 때문에 유전자 침묵 유도의 효능을 추가적으로 증가시킨다(Wesley 등 (2001) Plant J., 27, 581-590). 적합하게는, 줄기 길이는 길이가 약 50 뉴클레오티드 내지 약 1 킬로베이스(kilobase)이다. 인트론 접합 헤어핀 RNA를 생산하기 위한 방법이 본 기술분야에 잘 기재되어 있다(예를 들어, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry (2008) 72, 2, 615-617 참조).
이중체 또는 이중가닥 구조, 예를 들어 이중가닥 RNA 또는 작은 헤어핀 RNA를 가지는 간섭 RNA 분자는 둔단(blunt end)을 가지거나 또는 3' 또는 5' 돌출(overhang)을 가질 수 있다. 본원에서 사용되는, "돌출(overhang)"은 하나의 RNA 가닥의 3’-말단이 다른 가닥의 5' 말단 위로 확장될 때(3' 돌출), 또는 그 반대일 때(5' 돌출) 이중체 구조로부터 돌출되는, 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들을 의미한다. 돌출을 포함하는 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 디옥시리보뉴클레오티드 또는 그의 변형된 버전일 수 있다. 한 구현예에서, 간섭 RNA 분자의 적어도 한 가닥은 길이가 약 1 내지 약 6 뉴클레오티드인 3' 돌출을 가진다. 다른 구현예들에서, 3' 돌출은 길이가 약 1 내지 약 5 뉴클레오티드, 약 1 내지 약 3 뉴클레오티드 및 약 2 내지 약 4 뉴클레오티드이다.
간섭 RNA 분자가 분자의 하나의 말단에서 3' 돌출을 포함할 때, 다른 말단은 둔단일 수 있거나 또는 돌출(5' 또는 3')을 가질 수 있다. 간섭 RNA 분자가 분자의 양쪽 말단 전부에서 돌출을 포함할 때, 돌출들의 길이는 동일하거나 상이할 수도 있다. 한 구현예에서, 간섭 RNA 분자는 분자의 양쪽 말단 전부에 약 1 내지 약 3 뉴클레오티드의 3' 돌출을 포함한다. 추가의 구현예에서, 간섭 RNA 분자는 분자의 양쪽 말단 전부에서 2 뉴클레오티드의 3' 돌출을 가지는 이중가닥 RNA이다. 그러나 또 다른 구현예에서, 간섭 RNA의 돌출을 포함하는 뉴클레오티드는 TT 디뉴클레오티드 또는 UU 디뉴클레오티드이다.
표적 mRNA 서열에 대한 하나 이상의 돌출을 포함하는 간섭 RNA 분자의 동일성 퍼센트를 결정할 때, 돌출(들)은 고려될 수도 있거나, 그렇지 않을 수도 있다. 예를 들어, 3' 돌출의 뉴클레오티드 및 이중가닥의 5'-말단 또는 3'-말단으로부터의 최대 2개의 뉴클레오티드는 siRNA 분자의 활성의 상당한 손실 없이 변형될 수도 있다.
간섭 RNA 분자는 하나 이상의 5' 또는 3'-캡(cap) 구조를 포함할 수 있다. 간섭 RNA 분자는 간섭 RNA 분자의, 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 센스와 안티센스 가닥 모두에서의 3'-말단에서; 또는 센스가닥, 안티센스 가닥, 또는 센스와 안티센스 가닥의 5'-말단에서 캡 구조를 포함할 수 있다. 대안적으로, 간섭 RNA 분자는 간섭 RNA 분자의 3'-말단과 5'-말단 모두에서 캡 구조를 포함할 수 있다. 용어 "캡 구조"는 올리고뉴클레오티드의 말단 중 하나에서 포함된 화학적 변형을 의미하고, 이것은 분자를 엑소뉴클레아제 변성으로부터 보호하고, 또한 세포 내에서 전달 또는 위치결정을 용이하게 할 수 있다.
간섭 RNA 분자에 적용할 수 있는 또 다른 변형은 간섭 RNA 분자의 활성, 세포 분포, 세포 섭취, 생체이용가능성 또는 안정성을 증가시키는 하나 이상의 부분 또는 접합체의 간섭 RNA 분자에 대한 화학적 연결이다. 폴리뉴클레오티드는 본 기술분야에 잘 정립되어 있는 방법에 의해 합성되거나 변형될 수도 있다. 화학적 변형은 이들에만 한정하는 것은 아니지만, 2' 변형, 비-천연 염기의 도입, 리간드에 대한 공유결합, 및 인산염 결합의 티오인산 결합으로의 대체를 포함할 수도 있다. 본 구현예에서, 이중체 구조의 온전성은 적어도 하나, 및 전형적으로 두 가지 이상의 화학적 결합에 의해서 강화된다. 화학적 결합은 다양한 주지 기술, 예를 들면, 공유, 이온 또는 수소 결합의 도입; 소수성 상호작용, 반데르발스(van der Waals) 또는 적층 상호작용; 금속-이온 배위에 의해서, 또는 퓨린 유사체 사용을 통해서 달성될 수도 있다.
두 개의 단일가닥 중 하나 또는 전부의 뉴클레오티드는 변형되어서 세포 효소, 예를 들어 제한 없이 소정의 뉴클레아제와 같은 것의 활성을 조절할 수도 있다. 세포 효소의 활성을 조절하기 위한 기술은 이들에만 한정하는 것은 아니지만, 2'-아미노 변형, 2'-플루오로 변형, 2'-알킬 변형, 비전하된 골격 변형, 모르폴리노 변형, 2'-O-메틸 변형, 및 포스포라미데이트를 포함해서 본 기술분야에 공지되어 있다. 따라서 이중가닥 RNA에 대한 뉴클레오티드의 적어도 하나의 2'-히드록실기는 화학 작용기에 의해서 치환된다. 또한 적어도 하나의 뉴클레오티드는 변형되어서 잠긴 뉴클레오티드를 형성할 수도 있다. 이러한 잠긴 뉴클레오티드는 리보오스의 2'-산소와 리보오스의 4'-탄소를 연결시키는 메틸렌 또는 에틸렌 다리를 함유한다. 잠긴 뉴클레오티드를 올리고뉴클레오티드에 도입하는 것은 상보적 서열에 대한 친화도를 향상시키고 용융점을 몇 도 증가시킨다.
리간드는 간섭성 RNA 분자에 접합되어서 예를 들어 그의 세포 흡수를 강화시킬 수도 있다. 소정의 구현예들에서, 소수성 리간드가 분자에 접합되어서 세포막의 직접 침투를 용이하게 한다. 이러한 접근들이 안티센스 올리고뉴클레오티드의 세포 투과를 용이하게 하기 위해 사용되어 왔다. 소정의 예들에서, 올리고뉴클레오티드에 대한 양이온 리간드의 접합은 종종 뉴클레아제에 대한 개선된 내성을 야기한다. 양이온 리간드의 대표적인 예시는 프로필암모늄 및 디메틸프로필암모늄을 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 양이온 리간드가 올리고뉴클레오티드를 통해서 분산될 때 mRNA에 대한 그들의 높은 결합 친화도를 보유할 수 있다.
본원에 기재된 분자 및 폴리뉴클레오티드는 고체상 합성의 주지된 기술을 사용해서 제조될 수도 있다. 본 기술분야에 공지된 이러한 합성을 위한 임의의 다른 수단이 추가적으로 또는 대안적으로 채택될 수도 있다.
다양한 구현예는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 본원에 기재된 하나 이상의 간섭 RNA 구성체를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다. 예시적인 구성체가 도 21에 보여지고 있다.
다양한 구현예는 헤어핀 구조를 형성하기 위해 자가-결합(annealing)할 수 있는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 본원에 기재된 하나 이상의 간섭 RNA 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 하나 이상의 간섭 RNA 구성체를 포함하는 발현 벡터에 관한 것으로, 여기서 상기 구성체는 (a) 본원에서 기재된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; (b) 헤어핀 구조의 루프를 형성하는, 스페이서 요소를 암호화하는 두번째 서열; 및 (c)　상기 첫번째 서열의 역상보성 서열을 포함하고 상기 첫번째 서열과 동일한 배향으로 위치하는 세번째 서열을 포함하고, 여기서 상기 두번째 서열은 상기 첫번째 서열과 상기 세번째 서열 사이에 위치하고, 그리고 상기 두번째 서열은 상기 첫번째 서열과 상기 세번째 서열에 작동가능하게 연결되어 있다.
개시한 서열은 헤어핀 구조를 형성하지 않는 다양한 폴리뉴클레오티드를 구성하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 이중가닥 RNA는 (1) 첫번째 프로모터에 작동가능하게 연결되어 DNA의 첫번째 가닥을 전사하고, (2) 두번째 프로모터에 작동가능하게 연결되어 DNA 단편의 상기 첫번째 가닥의 역상보성 서열을 전사하여 형성될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 각각의 가닥은 동일한 발현 벡터, 또는 상이한 발현 벡터로부터 전사될 수 있다. RNA 간섭 활성을 가지는 RNA 이중체는 siRNA로 효소적으로 변환되어서 RNA 수준을 조절할 수 있다.
따라서 다양한 구현예는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 자가-결합할 수 있는 간섭 RNA 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 본원에 기재된 간섭 RNA 구성체를 포함하는 발현 벡터에 관한 것으로, 상기 구성체는 (a) 본원에서 기재된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; 및 (b) 상기 첫번째 서열과 동일한 배향으로 위치한, 첫번째 서열의 상보성(예를 들어, 역상보성) 서열을 포함하는 두번째 서열을 포함한다.
다양한 조성물 및 방법은 유전자 발현의 공동-억제(co-suppression)를 촉진하여 본원에 기재된 하나 이상의 폴리펩티드(또는 본원에 기재된 그의 임의의 조합)의 내인성 발현 수준을 조절하기 위해 제공된다. 공동-억제 현상은 이식유전자의 다중 사본을 식물 세포 숙주 내로 도입한 결과로서 발생한다. 이식유전자의 다중 사본의 통합시킨 결과 이식유전자 및 표적 내인성 유전자의 조절된 발현이 생길 수 있다. 공동-억제 정도는 이식유전자와 표적 내인성 유전자 간의 서열 상동성의 정도에 따라 달라진다. 내인성 유전자와 이식유전자 전부 침묵하는 것은 전사를 차단할 수 있는 침묵된 자리(즉, 관심있는 내인성 프로모터 및 내인성 유전자)의 광범위한 메틸화에 의해 발생할 수 있다. 대안적으로, 일부 경우에, 외인성 유전자와 이식유전자의 공동-억제는 전사후 유전자 침묵(post transcriptional gene silencing)에 의해 일어날 수 있으며, 전사체는 생산될 수 있지만 증가된 변성율이 전사체의 축적을 차단한다. 전사후 유전자 침묵에 의한 공동-억제 메커니즘은 RNA 간섭과 유사한 것으로 사료되는데, RNA는 이러한 공정들에서 중요한 개시제이면서 표적으로 보인다는 점에서 그러하고, 어쩌면 mRNA의 RNA-지시 변성을 통해서, 동일한 분자 구조에 의해서 적어도 부분적으로 매개될 수도 있다.
핵산의 공동-억제는 이식유전자로서, 핵산의 다중 사본 또는 그의 단편을 관심있는 식물의 게놈 내로 통합하여 달성할 수 있다. 숙주 식물은 핵산 또는 그의 단편에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 벡터로 형질전환될 수 있다. 다양한 구현예는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 내인성 유전자의 공동-억제를 촉진하기 위한 발현 벡터에 관한 것이다.
다양한 구현예는 폴리뉴클레오티드(들)의 다중 사본을 식물 게놈으로 통합시켜서 본원에 기재된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(들) (또는 본원에 기재된 그의 임의의 조합)의 발현 수준을 조절하기 위한 방법에 관한 것으로, 식물 세포 숙주를 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되어 있는 프로모터를 포함하는 발현 벡터로 형질전환하는 것을 포함한다.
다양한 조성물 및 방법은 mRNA의 번역을 조절하여 내인성 유전자 발현 수준을 조절하기 위해서 제공된다. 숙주 식물 세포는, 프로모터와 관련해서 안티센스 배향으로 위치하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되어서, mRNA의 일부분에 서열 상보성을 가지는 RNA 폴리뉴클레오티드의 발현을 가능하게 하는 프로모터를 포함하는, 발현 벡터로 형질전환될 수 있다.
mRNA의 번역을 조절하기 위한 다양한 발현 벡터는 그 서열이 프로모터와 관련해서 안티센스 배향으로 위치하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되어 있는 프로모터를 포함할 수도 있다. 안티센스 RNA 폴리뉴클레오티드의 길이는 다양할 수 있으며, 약 15-20 뉴클레오티드, 약 20-30 뉴클레오티드, 약 30-50 뉴클레오티드, 약 50-75 뉴클레오티드, 약 75-100 뉴클레오티드, 약 100-150 뉴클레오티드, 약 150-200 뉴클레오티드, 및 약 200-300 뉴클레오티드일 수도 있다.
또한 전위인자(transposon)(예를 들어, IS 요소)를 관심있는 식물의 게놈 내로 도입하여 유전자가 불활성되도록 표적화될 수 있다. 이러한 이동가능한 유전자 요소는 유성 교배-수정에 의해 도입될 수 있고 삽입 돌연변이는 단백질 활성 손실을 위해 스크리닝될 수 있다. 부모 식물에 있는 손상된(disrupted) 유전자는 다른 식물로 도입될 수 있는데, 이것은 부모 식물을, 예를 들어 유성 교배-수정에 의해서, 전위인자-유도 돌연변이 유발을 거치지 않는 식물과 교배함에 의한 것이다. 본 기술분야의 숙련자에게 공지된 임의의 표준 육종 기술이 채택될 수 있다. 한 구현예에서, 하나 이상의 유전자는 하나 이상의 전위인자의 삽입에 의해서 불활성될 수 있다. 하나 이상의 유전자가 손상되면, 돌연변이는 하나 이상의 유전자의 동형 손상, 하나 이상의 유전자의 이형 손상, 또는 동형 및 이형 손상 전부의 조합을 유발할 수 있다. 적절한 전이성 요소는 역전위인자, 레트로포존, 및 SINE-형 인자를 포함한다. 이러한 방법은 본 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있다.
대안적으로, 유전자는 식물에서 자가-절단 및 복제할 수 있는 많은 작은 원형 RNA로부터 유도되는 리보자임을 도입하여 불활성을 표적으로 할 수 있다. 이러한 RNA는 단독으로든지(바이로이드 RNA) 또는 보조 바이러스(위성 RNA)로 복제할 수 있다. 적절한 RNA의 예시는 아보카도 선블로치(sunblotch) 바이로이드(viroid)로부터 유래한 것들 및 담배 둥근무늬 바이러스, 루체른 일시적 줄무늬 바이러스, 벨벳 담배 반점 바이러스, 솔라넘 노디플로름 반점 바이러스, 및 지하 클로버 반점 바이러스로부터 유래한 위성 RNA를 포함한다. 다양한 표적 RNA-특이적 리보자임은 본 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있다.
여기에서 논의된 바와 같이, 하나 이상의 폴리펩티드의 발현은 비-트랜스제닉 수단에 의해서 -예컨대 여기에서 논의된 바와 같이, 하나 이상의 유전자에 하나 이상의 돌연변이를 생성해서 조절될 수 있다. 유전자 서열에서 무작위로 돌연변이를 도입하는 방법은 화학적 돌연변이 유발, EMS 돌연변이 유발 및 방사 돌연변이 유발을 포함할 수 있다. 하나 이상의 표적화된 돌연변이를 세포로 도입하는 방법은 이들에만 한정하는 것은 아니지만, 게놈 편집 기술, 특히 아연 집게 뉴클레아제-매개 돌연변이 유발 및 틸링(targeting induced local lesions in genomes: tilling), 동형 재조합, 올리고뉴클레오티드-지시 돌연변이 유발, 및 메가뉴클레아제-매개 돌연변이 유발을 포함한다. 한 구현예에서, TILLING이 이용된다. 이것은 변형된 발현 및/또는 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 생성 및/또는 식별하는 데 사용될 수 있는 돌연변이 유발 기술이다. 틸링은 또한 이러한 돌연변이를 운반하는 식물의 선별을 가능하게 한다. 틸링은 고 처리율(high-throughput) 스크리닝 방법과 고밀도 돌연변이 유발을 결합한다. 틸링을 위한 방법은 당 기술분야에 주지되어 있다(McCallum 등, (2000) Nat Biotechnol 18: 455-457 and Stemple (2004) Nat Rev Genet 5(2): 145-50 참조).
돌연변이의 일부 비제한적인 실시예는 적어도 하나의 뉴클레오티드, 단일 뉴클레오티드 다형성 및 단일 서열 반복의 결실, 삽입 및 과오 돌연변이다. 돌연변이 후에, 스크리닝은 미성숙 중지 코돈 또는 다른 한편으로는 비-기능적인 유전자를 형성하는 돌연변이를 식별하기 위해서 수행될 수 있다. 돌연변이 후에, 스크리닝은 상승된 수준에서 발현될 수 있는 기능적 유전자를 형성하는 돌연변이를 식별하기 위해 수행될 수 있다. 돌연변이의 스크리닝은 서열결정에 의해서나, 유전자 또는 단백질에 특이적인 하나 이상의 프로브 또는 프라이머를 사용해서 수행될 수 있다. 조절된 유전자 발현, mRNA의 조절된 안정성, 또는 단백질의 조절된 안정성을 야기할 수 있는, 폴리뉴클레오티드의 특이적인 돌연변이는 또한 형성될 수 있다. 이러한 식물은 "비-자연 발생" 또는 "돌연변이" 식물로서 본원에서 참조된다. 전형적으로, 돌연변이 또는 비-자연 발생 식물은 조작되기 이전에 식물에 존재하지 않았던 외래 또는 합성 또는 인공 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA)의 일부분을 포함할 것이다. 외래 핵산은 적어도 10, 20, 30, 40, 50,100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 또는 1500 또는 그 이상의 연속된 또는 비-연속된 뉴클레오티드와 같은, 단일 뉴클레오티드, 2개 이상의 뉴클레오티드, 2개 이상의 연속된 뉴클레오티드 또는 2개 이상의 비-연속된 뉴클레오티드일 수도 있다.
돌연변이 또는 비-자연 발생 식물 또는 식물 세포는 조절된 단백질 수준을 야기하는 하나 이상의 유전자에서의 하나 이상의 돌연변이의 임의의 조합을 가질 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 또는 비-자연 발생 식물 또는 식물 세포는 단일 유전자에서의 단일 돌연변이; 단일 유전자에서의 다수 돌연변이; 2개 이상의 또는 3개 이상의 또는 4개 이상의 유전자에서의 단일 돌연변이; 또는 2개 이상의 또는 3개 이상의 또는 4개 이상의 유전자에서의 다수 돌연변이를 가질 수도 있다. 이러한 돌연변이의 실시예들이 본원에 기재되어 있다. 추가적인 실시예에 의해서, 돌연변이 또는 비-자연 발생 식물 또는 식물 세포는 단백질 또는 그의 일부분의 활성 자리를 암호화하는 유전자에서의 영역과 같은 유전자(들)의 특정한 일부분에서 하나 이상의 돌연변이를 가질 수도 있다. 추가적인 실시예에 의해서, 돌연변이 또는 비-자연 발생 식물 또는 식물 세포는 만약 그들이 유전자(들)의 활성 또는 발현을 조절한다면, 그것이 조절하는 유전자의 상류 또는 하류의 영역에서와 같은 하나 이상의 유전자(들)의 외부의 영역에서의 하나 이상의 돌연변이를 가질 수도 있다. 상류에 있는 요소는 프로모터, 증강 인자(enhancer) 또는 전사 인자를 포함할 수 있다. 증강 인자와 같은 몇몇 요소는 그것이 조절하는 유전자의 상류 또는 하류에 위치할 수 있다. 요소(들)은 그것이 조절하는 유전자 가까이에 위치할 필요가 없는데 이것은 그것이 조절하는 유전자의 수십만 염기쌍 상류 또는 하류에서 발견된 적이 있기 때문이다. 돌연변이 또는 비-자연 발생 식물 또는 식물 세포는 유전자(들)의 처음 100개의 뉴클레오티드 내에, 유전자(들)의 처음 200개의 뉴클레오티드 내에, 유전자(들)의 처음 300개의 뉴클레오티드 내에, 유전자(들)의 처음 400개의 뉴클레오티드 내에, 유전자(들)의 처음 500개의 뉴클레오티드 내에, 유전자(들)의 처음 600개의 뉴클레오티드 내에, 유전자(들)의 처음 700개의 뉴클레오티드 내에, 유전자(들)의 처음 800개의 뉴클레오티드 내에, 유전자(들)의 처음 900개의 뉴클레오티드 내에, 유전자(들)의 처음 1000개의 뉴클레오티드 내에, 유전자(들)의 처음 1100개의 뉴클레오티드 내에, 유전자(들)의 처음 1200개의 뉴클레오티드 내에, 유전자(들)의 처음 1300개의 뉴클레오티드 내에, 유전자(들)의 처음 1400개의 뉴클레오티드 내에, 또는 유전자(들)의 처음 1500개의 뉴클레오티드 내에 위치한 하나 이상의 돌연변이를 가질 수도 있다. 돌연변이 또는 비-자연 발생 식물 또는 식물 세포는 유전자(들) 또는 그의 조합의 처음, 두번째, 세번째, 네번째, 다섯번째, 여섯번째, 일곱번째, 여덟번째, 아홉번째, 열번째, 열한번째, 열두번째, 열세번째, 열네번째 또는 열다섯번째 세트의 100개의 뉴클레오티드 내에 위치한 하나 이상의 돌연변이를 가질 수도 있다. 돌연변이 폴리펩티드 변이체를 포함하는 돌연변이 또는 비-자연 발생 식물 또는 식물 세포(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 비-자연 발생 돌연변이 또는 트랜스제닉 식물 또는 식물 세포 기타 등등)가 개시되어 있다.
한 구현예에서, 식물의 종자가 돌연변이되고 나서 1세대 돌연변이 식물로 성장한다. 그런 다음 1세대 식물은 자가-수분되고 1세대 식물의 종자는 2세대 식물로 성장하는데, 그런 다음 이것은 그들의 좌위(loci)에서의 돌연변이를 위해 스크리닝된다. 돌연변이된 식물 재료는 돌연변이를 위해서 스크리닝될 수 있지만, 2세대 식물을 스크리닝하는 이점은 모든 체세포 돌연변이가 생식 돌연변이에 해당한다는 것이다. 당업자라면 이들에만 한정하는 것은 아니지만, 종자, 꽃가루, 식물 조직 또는 식물 세포를 포함해서, 다양한 식물 재료가 돌연변이 식물을 형성하기 위해 돌연변이되는 것을 이해할 것이다. 그러나 돌연변이된 식물 재료의 유형은 식물 핵산이 돌연변이를 위해 스크리닝될 때 영향을 줄 수도 있다. 예를 들어, 비-돌연변이된 식물이 수분되기 전에, 꽃가루가 돌연변이를 거친 경우, 이러한 수분으로부터 발생하는 종자는 1세대 식물로 성장한다. 1세대 식물의 모든 세포는 꽃가루에서 형성되는 돌연변이를 함유할 것이고; 따라서 이러한 1세대 식물은 2세대까지 기다리는 대신에 돌연변이를 위해 스크리닝될 것이다.
화학적 돌연변이원 또는 조사(radiation)를 포함해서, 점 돌연변이, 짧은 결실, 삽입, 전좌, 또는 전이를 생성하는 돌연변이원이 돌연변이를 형성하는 데에 사용될 수도 있다. 돌연변이원은 이들에만 한정하는 것은 아니지만, 에틸 메탄술포네이트, 메틸메탄 술포네이트, N-에틸-N-니트로소우레아, 트리에틸멜라민, N-메틸-N-니트로소우레아, 프로카르바진, 클로람부실, 시클로포스파미드, 디에틸 설페이트, 아크릴아미드 모노머, 멜파란, 질소 머스타드(mustard), 빈크리스틴, 디메틸니트로사민, N-메틸-N'-니트로-니트로소구아니딘, 니트로소구아니딘, 2-아미노퓨린, 7,12 디메틸-벤즈(자)안트라센, 에틸렌 산화물, 헥사메틸포스포아미드, 바이술판, 디에폭시알칸(디에폭시옥탄, 디에폭시부탄, 기타 등등), 2-메톡시-6-클로로-9[3-에틸-2-클로로-에틸)아미노프로필아미노]아크리딘 디하이드로클로라이드 및 포름알데히드를 포함한다.
원하는 표현형을 유발한다면, 돌연변이원에 의해서 직접적으로 야기되지 않은 좌위에서의 자발적 돌연변이가 또한 고려된다. 또한 적절한 돌연변이 유발제는 예를 들어, X-선, 감마선, 고속 중성자 조사 및 UV 방사와 같은 이온화 방사선을 포함한다. 당업자에게 공지된 식물 핵산 제조의 임의의 방법이 돌연변이 스크리닝을 위한 식물 핵산을 제조하기 위해 사용될 수도 있다.
각각의 식물, 식물 세포 또는 식물 재료로부터 제조되는 핵산은 돌연변이 유발된 식물 조직, 세포 또는 재료에서 기원하는 식물 집단의 돌연변이를 위한 스크리닝을 신속히 처리하기 위하여 선택적으로 풀링(pooling)할 수 있다. 하나 이상의 식물, 식물 세포 또는 식물 재료의 후속 세대가 스크리닝될 수 있다. 상기 선택적으로 모아진 그룹의 크기는 사용되는 스크리닝 방법의 민감도에 따라 달라진다.
핵산 샘플이 선택적으로 모아진 후에, 그들은 중합효소 연쇄 반응(PCR)과 같은 폴리뉴클레오티드-특이적 증폭 기술을 거칠 수 있다. 유전자 또는 유전자에 바로 인접한 서열에 특이적인 임의의 하나 이상의 프라이머 또는 프로브는 선택적으로 모아진 핵산 샘플 내에 서열을 증폭시키는 데에 이용될 수도 있다. 올리고뉴클레오티드 프라이머의 예는 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16에 제시되어 있다. 적합하게는, 서열번호 13 및 서열번호 14가 NtAsn-1를 검출하기 위해 조합하여 사용된다. 적합하게는, 서열번호 15 및 서열번호 16이 NtAsn-5를 검출하기 위해 조합하여 사용된다. 적합하게는, 하나 이상의 프라이머 또는 프로브는 유용한 돌연변이가 가장 발생하기 쉬운 좌위(locus)의 영역을 증폭시키도록 고안되어 있다. 가장 바람직하게는, 프라이머는 폴리뉴클레오티드의 영역 내에서 돌연변이를 감지하도록 고안되어 있다. 추가적으로, 점 돌연변이를 위한 스크리닝을 쉽게 하기 위해서, 프라이머(들) 및 프로브(들)가 공지의 다형성 자리를 피하는 것이 바람직하다. 증폭 산물의 검출을 용이하게 하기 위해서, 하나 이상의 프라이머 또는 프로브는 임의의 종래의 표지방법을 이용해서 표지될 수도 있다. 프라이머(들) 또는 프로브(들)는 본 기술분야에서 잘 이해되고 있는 방법을 사용해서 본원에서 기재된 서열을 기초로 고안될 수 있다.
증폭 산물의 검출을 용이하게 하기 위해서, 프라이머(들) 또는 프로브(들)가 임의의 종래의 표지 방법을 사용해서 표지될 수도 있다. 이들은 본 기술분야에서 잘 이해되고 있는 방법을 사용해서 본원에서 기재되어 있는 서열을 기초로 해서 고안될 수 있다. 다형성은 본 기술분야에 공지된 방법에 의해서 식별될 수도 있고 일부가 본 문헌에 기재되어 있다.
추가적인 측면에서 돌연변이 식물을 제조하기 위한 방법이 제공된다. 상기 방법은 본원에서 기재된 기능적인 폴리뉴클레오티드(또는 본원에서 기재된 그의 임의의 조합)를 암호화하는 유전자를 포함하는 식물의 적어도 하나의 세포를 제공하는 것을 포함한다. 다음에, 식물의 적어도 하나의 세포는 본원에서 기재된 폴리뉴클레오티드의 활성을 조절하기에 효율적인 조건 하에서 처리된다. 그런 다음 하나 이상의 돌연변이 식물 세포는 돌연변이 식물로 번식되며, 여기서 돌연변이 식물은 대조군 식물의 그것과 비교해서 조절된 수준의 기재된 폴리펩티드(들)(또는 본원에서 기재된 그의 임의의 조합)를 가진다. 돌연변이 식물을 제조하는 이러한 방법의 하나의 구현예에서, 상기 처리 단계는 적어도 하나의 세포를, 상술한 바와 같고 적어도 하나의 돌연변이 식물 세포를 수득하기에 효과적인 조건 하에서, 화학적 돌연변이 유발제로 거치게 하는 것을 포함한다. 이러한 방법의 또 다른 구현예에서, 상기 처리 단계는 하나 이상의 돌연변이 식물 세포를 수득하기에 효과적인 조건 하에서 하나 이상의 세포를 방사선원을 거치게 하는 것을 포함한다. 용어 "돌연변이 식물"은, 적합하게는 유전자 조작 또는 유전자 변형 이외의 수단에 의해서, 대조군 식물과 비교할 때 표현형이 변형되는 돌연변이 식물을 포함한다.
소정의 구현예들에서, 돌연변이 식물, 돌연변이 식물 세포 또는 돌연변이 식물 재료는 또 다른 식물, 식물 세포 또는 식물 재료에서 자연적으로 발생하였으며 원하는 형질을 부여하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 이러한 돌연변이는 그 식물에서 비-자연 발생하는 돌연변이를 형성하고 그것에 형질을 부여할 다른 식물, 식물 세포 또는 식물 재료(예를 들어, 돌연변이가 유도되는 식물에 대한 상이한 유전적 배경을 가지는 식물, 식물 세포 또는 식물 재료)에 통합(예를 들어, 침투)될 수 있다. 따라서 실시예에 의해서, 첫번째 식물에 자연적으로 발생하는 돌연변이는 첫번째 식물에 대해 상이한 유전적 배경을 가지는 두번째 식물과 같은 두번째 식물에 도입될 수도 있다. 그러므로 숙련자는 원하는 특성을 부여하는 본원에 기재된 유전자의 하나 이상의 돌연변이 대립형질을 게놈에 자연적으로 운반하는 식물을 검색하고 식별할 수 있다. 자연적으로 발생하는 돌연변이 대립형질(들)은 육종, 역교배 및 유전자이입을 포함하는 다양한 방법에 의해서 두번째 식물로 전달되어서, 본원에 기재된 유전자에서 하나 이상의 돌연변이를 가지는 계통, 변이체 또는 혼성체를 생성할 수 있다. 원하는 특성을 보여주는 식물은 돌연변이 식물의 풀(pool)로부터 스크리닝될 수도 있다. 적합하게는, 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열의 지식을 이용하여 선별이 수행된다. 결과적으로 대조군과 비교할 때 유전자 특성을 스크리닝할 수 있다. 이러한 스크리닝 접근은 본원에서 논의된 바와 같은 통상적인 핵산 증폭 및/또는 혼성화 기술의 적용을 포함할 수도 있다. 따라서 추가적인 측면은 돌연변이 식물을 식별하기 위한 방법에 관한 것으로, (a) 식물로부터 핵산을 포함하는 샘플을 제공하는 단계; 및 (b) 폴리뉴클레오티드의 핵산 서열을 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 대조군 식물의 폴리뉴크레오티드 서열과 비교시 상기 폴리뉴클레오티드의 서열에서의 차이는 상기 식물이 돌연변이 식물인 것을 나타낸다. 또 다른 측면에서, 대조군 식물과 비교하여 감소된 아스파라긴 수준을 축적하는 돌연변이 식물을 식별하는 방법을 제공하며, 상기 방법은, (a) 스크리닝될 식물로부터 샘플을 제공하는 단계; (b) 상기 샘플이 본원에 설명된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는지 결정하는 단계; 및 (c) 상기 식물의 적어도 상기 아스파라긴 함량을 결정하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 대조군 식물과 비교하여 감소된 아스파라긴 수준을 가지는 돌연변이 식물을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은, (a) 첫번째 식물로부터 샘플을 제공하는 단계; (b) 상기 샘플이 감소된 아스파라긴 수준을 초래하는 본원에 기재된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는지 결정하는 단계; 및 (c) 상기 하나 이상의 돌연변이를 두번째 식물로 전달하는 단계를 포함한다. 돌연변이(들)은 유전 공학, 유전자 조작, 유전자이입, 식물 육종, 역교배 및 기타 등등에 의한 것과 같이, 본 기술분야에 공지된 다양한 방법을 사용해서 두번째 식물로 전달될 수 있다. 한 구현예에서, 상기 첫번째 식물은 자연 발생 식물이다. 한 구현예에서, 상기 두번째 식물은 상기 첫번째 식물에 대해 상이한 유전적 배경을 가진다.
또 다른 측면에서, 대조군 식물과 비교하여 감소된 아스파라긴의 수준을 가지는 돌연변이 식물을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은, (a) 첫번째 식물로부터 샘플을 제공하는 단계; (b) 상기 샘플이 감소된 아스파라긴의 수준을 초래하는 본원에 기재된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는지 결정하는 단계; 및 (c) 상기 첫번째 식물로부터의 하나 이상의 돌연변이를 두번째 식물로 유전자이입하는 단계를 포함한다. 한 구현예에서, 상기 유전자이입하는 단계는 선택적으로 역교배 및 기타 등등을 포함해서, 식물 육종을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 첫번째 식물은 자연 발생 식물이다. 한 구현예에서, 상기 두번째 식물은 상기 첫번째 식물에 대해 상이한 유전적 배경을 가진다. 한 구현예에서, 상기 첫번째 식물은 재배품종 또는 엘리트 재배품종이 아니다. 한 구현예에서, 상기 두번째 식물은 재배품종 또는 엘리트 재배품종이다.
추가적인 측면은 본원에 기재된 방법에 의해서 얻어지거나 또는 얻을 수 있는 (재배품종 또는 엘리트 재배품종 돌연변이 식물을 포함하는) 돌연변이 식물에 관한 것이다. 소정의 구현예들에서, "돌연변이 식물"은 본원에 기재된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(들)의 서열 내에서와 같은, 식물의 특정한 영역에만 국소화되는 하나 이상의 돌연변이를 가질 수도 있다. 이러한 구현예에 따르면, 돌연변이 식물의 남은 게놈의 서열은 돌연변이 유발 전의 식물과 동일하거나 또는 실질적으로 동일할 것이다.
소정의 구현예들에서, 돌연변이 식물은 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 서열 내에서와 같은 식물의 하나 이상의 영역, 및 게놈의 하나 이상의 추가의 영역에서 국소화된 하나 이상의 돌연변이를 가질 수도 있다. 이러한 구현예에 따르면, 돌연변이 식물의 남은 게놈 서열은 돌연변이 유발 전의 식물과 동일하지 않거나 실질적으로 동일하지 않을 것이다. 소정의 구현예들에서, 돌연변이 식물은 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드(들)의 한 개 이상의, 두 개 이상의, 세 개 이상의, 네 개 이상의 또는 다섯 개 이상의 엑손에서 하나 이상의 돌연변이를 가지지 않을 수도 있고; 또는 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드(들)의 한 개 이상의, 두 개 이상의, 세 개 이상의, 네 개 이상의 또는 다섯 개 이상의 인트론에서 하나 이상의 돌연변이를 가지지 않을 수도 있고; 또는 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드(들)의 프로모터에서 하나 이상의 돌연변이를 가지지 않을 수도 있고; 또는 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드(들)의 3' 비번역 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 가지지 않을 수도 있고; 또는 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드(들)의 5' 비번역 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 가지지 않을 수도 있고; 또는 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드(들)의 암호화 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 가지지 않을 수도 있고; 또는 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드(들)의 비암호화 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 가지지 않을 수도 있고; 또는 그의 두 개 이상의, 세 개 이상의, 네 개 이상의, 다섯 개 이상; 또는 그의 여섯개 이상의 조합을 가지지 않을 수도 있다.
추가적인 측면에서 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 유전자에서 돌연변이를 포함하는 식물, 식물 세포, 또는 식물 재료를 식별하기 위한 방법이 제공되는데, (a) 식물, 식물 세포 또는 식물 재료가 돌연변이 유발을 거치게 하는 단계; (b) 상기 식물, 식물 세포 또는 식물 재료 또는 그의 후손로부터 핵산 샘플을 얻는 단계; 및 (c) 또는 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 변이체 또는 그의 단편을 암호화하는 유전자의 핵산서열을 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 서열에서의 차이는 하나 이상의 돌연변이를 나타낸다.
아연 집게(Zinc finger) 단백질은 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 발현 또는 활성을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열의 부분 또는 전부를 포함하는 게놈 DNA 서열은 아연 집게 뉴클레아제 매개 돌연변이 유발에 의해 변형된다. 게놈 DNA 서열은 아연 집게 단백질 결합을 위한 특이적 자리로 검색된다. 대안적으로, 게놈 DNA 서열은 아연 집게 단백질 결합을 위한 두 개의 특이적 자리로 검색되며, 여기서 상기 두 자리는 모두 대향하는 가닥에 위치해 있으며 함께 인접해 있는데, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 염기쌍 만큼 떨어져 있다. 따라서, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드에 결합하는 아연 집게 단백질이 제공된다.
아연 집게 단백질은 유전자에서 선택된 표적 자리를 인식하기 위해 조작될 수도 있다. 아연 집게 단백질은 자연적인 아연 집게 DNA-결합 도메인 및 비-자연적인 아연 집게 DNA-결합 도메인으로부터 절단(truncation) 또는 확장 또는 선별 방법, 예를 들어, 이에 한정하는 것은 아니지만, 파지 표시 선별, 세균 2-혼성 선별 또는 세균 1-혼성 선별과 연결된 자리-특이적 돌연변이 유발에 의하여 유도되는 모티프(motif)의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 용어 "비-자연적인 아연 집게 DNA-결합 도메인"은 표적 핵산 내의 3-염기쌍 서열을 결합하고, 변형될 핵산을 포함하는 세포 또는 유기체에서 발생하지 않는, 아연 집게 DNA-결합 도메인을 나타낸다. 표적 유전자에 고유한 특이적 뉴클레오티드 서열을 결합하는 아연 집게 단백질을 고안하기 위한 방법은 본 기술분야에 공지되어 있다.
아연 집게 뉴클레아제는 폴리뉴클레오티드에 결합하는 아연 집게 단백질을 위해 코딩하는 첫번째 폴리뉴클레오티드와, 비-특이적 엔도뉴클레아제, 예를 들어, 이에만 한정하는 것은 아니지만 유형 IIS 엔도뉴클레아제를 위해 코딩하는 두번째 폴리뉴클레오티드의 융합을 형성하여 구축될 수도 있다. 아연 집게 단백질과 뉴클레아제와의 융합 단백질은 두 개의 염기쌍으로 이루어진 스페이서를 포함할 수도 있고 대안적으로, 스페이서는 세 개, 네 개, 다섯 개, 여섯개 또는 일곱개 또는 그 이상의 염기쌍으로 이루어질 수 있다. 다양한 구현예에서, 아연 집게 뉴클레아제는 이중가닥 파손을 폴리뉴클레오티드의 게놈 DNA 서열의 조절 영역, 암호화 영역, 또는 비-암호화 영역에 도입하고 폴리뉴클레오티드의 발현수준의 감소, 또는 그에 의해 암호화되는 단백질 활성의 감소를 유도한다. 아연 집게 뉴클레아제에 의한 절단(cleavage)은 종종 비-상동 말단 결합에 의한 DNA 수선을 따르는 절단 자리에서 DNA가 결실되는 결과를 가져온다.
다른 구현예에서, 아연 집게 단백질은 폴리뉴클레오티드의 조절 서열에 결합하도록 선택될 수도 있다. 더욱 구체적으로, 조절 서열은 전사 개시 자리, 개시 코돈, 엑손 영역, 엑손-인트론 경계, 종결자, 정지 코돈을 포함할 수도 있다. 따라서 본 발명은 본원에 기재한 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 부근 또는 내부에서의 아연 집게 뉴클레아제-매개 돌연변이 유발에 의해 생성되는, 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물 또는 식물 세포, 및 아연 집게 뉴클레아제-매개 돌연변이 유발에 의해 이러한 식물 또는 식물 세포를 제조하기 위한 방법을 제공한다. 아연 집게 단백질과 아연 집게 뉴클레아제를 식물로 전달하기 위한 방법은 메가뉴클레아제의 전달을 위해 이하에 기재된 것들과 유사하다.
또 다른 측면에서, I-CreI와 같은 메가뉴클아제를 사용해서, 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 또는 그렇지 않으면 유전적으로 변형된 식물을 제조하기 위한 방법이 제공된다. 자연 발생 메가뉴클레아제뿐만 아니라 재조합 메가뉴클레아제는 식물의 게놈 DNA 내의 단일 자리 또는 상대적으로 적은 자리에 구체적으로 이중가닥 파손을 야기하여 본원에 기재된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 파괴하는 데에 사용될 수 있다. 메가뉴클레아제는 변경된 DNA-인식 성능을 가지는 조작된 메가뉴클레아제일 수도 있다. 메가뉴클레아제 단백질은 본 기술분야에 공지된 다양한 상이한 메커니즘에 의해 식물 세포로 전달될 수 있다.
본 발명은 식물 세포 또는 식물에서 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드(들)(또는 본원에 기재된 이들의 임의의 조합)를 불활성화시키는 메가뉴클레아제의 용도를 포함한다. 특히, 본 발명은 메가뉴클레아제를 사용하여 식물에서 폴리뉴클레오티드를 불활성화시키기 위한 방법을 제공하는데, (a) 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 세포를 제공하는 단계; (b) 메가뉴클레아제 또는 메가뉴클레아제를 암호화하는 구성체를 상기 식물 세포로 도입하는 단계; 및 (c) 상기 메가뉴클레아제가 상기 폴리뉴클레오티드(들)를 실질적으로 불활성화시킬 수 있게 하는 단계를 포함한다.
메가뉴클레아제는 폴리뉴클레오티드의 암호화 영역 내에 메가뉴클레아제 인식 자리를 절단하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 절단은 종종 비-상동 말단 결합에 의한 돌연변이 DNA 수선을 따르는 메가뉴클레아제 인식 자리에서 DNA가 결실되는 결과를 가져온다. 유전자 암호화 서열에서의 이러한 돌연변이는 전형적으로 유전자를 불활성화하기에 충분하다. 식물 세포를 변형시키기 위한 이러한 방법은 첫째로 적절한 형질전환 방법을 사용하여 식물 세포로 메가뉴클레아제 발현 카세트를 전달하는 것을 포함한다. 최대 효율을 위해, 메가뉴클레아제 발현 카세트를 선택성(selectable) 마커에 연결시키고 선택제의 존재 하에 성공적으로 형질전환된 세포를 선택하는 것이 바람직하다. 이 접근법은 메가뉴클레아제 발현 카세트를 게놈 내로 통합시키는 결과를 가져올 것이지만, 식물에 조절 승인이 요구되는 경우에는 바람직하지 않을 수도 있다. 이러한 경우에, 메가뉴클레아제 발현 카세트(및 연결된 선택성 마커 유전자)가 통상적인 육종 기술을 사용해서 후속 식물 세대에서 떨어져 나갈 수도 있다. 대안적으로, 식물 세포는 처음에는 선택성 마커가 없는 메가뉴클레아제 발현 카세트로 형질전환될 수도 있고 그리고 선택제가 없는 매질에서 생장할 수도 있다. 이러한 조건 하에서, 처리된 세포의 한 부분은 메가뉴클레아제 발현 카세트를 얻을 것이고 그리고 메가뉴클레아제 발현 카세트를 게놈 내로 통합하지 않고 조작된 메가뉴클레아제를 일시적으로 발현할 것이다. 이것은 형질전환 효율에 중요하지 않기 때문에, 이러한 후자의 형질전환 절차는 더 많은 수의 처리된 세포가 스크리닝되어서 원하는 게놈 변형을 얻는 것이 필요하다. 상기 접근법은 또한 아연 집게 단백질 또는 아연 집게 뉴클레아제를 사용할 때 식물 세포를 변형하는 데에 적용될 수도 있다.
메가뉴클레아제 발현 카세트의 전달 이후, 식물 세포는, 처음에는, 사용된 구체적인 형질전환 절차에 대해 전형적인 조건 하에서 생장한다. 이것은 종종 어둠에서 26˚C 미만의 온도에서 매질 위에서 생장하는 형질전환된 세포를 의미할 수도 있다. 이러한 표준 조건은 기간, 바람직하게는 1-4일 동안 사용되어서 식물 세포가 형질전환 공정으로부터 복구될 수 있도록 할 수 있다. 이러한 초기의 복구 기간을 따르는 임의의 지점에서, 생장온도를 올려서, 상기 조작된 메가뉴클레아제의 활성을 자극해서 메가뉴클레아제 인식 자리를 절단하고 돌연변이시킬 수도 있다.
소정의 적용분야의 경우, 폴리뉴클레오티드를 식물의 게놈으로부터로부터 정확하게 제거시키는 것이 바람직할 수도 있다. 이러한 적용분야는 한 쌍의 조작된 메가뉴클레아제를 이용할 수 있는데, 이들 각각은 의도된 결실의 양쪽 면 위에서 메가뉴클레아제 인식 자리를 절단한다. 유전자를 인식하고 그것에 결합하며 게놈 내로 이중가닥의 파손을 도입할 수 있는 TAL 효과기 뉴클레아제(TAL Effector Nucleases; TALENs)도 사용될 수 있다. 따라서, 또 다른 측면에서, TAL 효과기 뉴클레아제를 사용해서 본원에 기재된 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 또는 그렇지 않으면 유전자 변형된 식물이 고려된다.
니코티아나 타바쿰의 버얼리 품종에서 경화 중에 아스파라긴 합성에 관여하는 것으로 확인된 유전자는 다른 식물 및 다른 품종의 식물에 적용될 수도 있다. 따라서, 본 발명은 다른 식물에서 재현 가능하고, 변이주를 이용한 육종에 적용 가능할 가능성이 있다.
본 발명에 사용하기 위한 적절한 식물은 이들에만 한정하는 것은 아니지만, 단자엽 및 쌍자엽 식물 및 식물 세포계를 포함하고, 이것은 다음의 과들 중 하나로부터의 종을 포함한다: 쥐꼬리망초과, 부추과, 알스트로에메리아세, 수선화과, 협죽도과, 야자과, 국화과, 매자나무과, 빅사세(Bixaceae), 십자화과, 브로멜리아시에, 삼과, 석죽과, 개비자나무과, 명아주과, 콜키카시에(Colchicaceae), 박과, 마과, 마황과, 에리트록실라시에(Erythroxylaceae), 대극과, 콩과, 꿀풀과, 아마과, 석송과, 아욱과, 멜란티움과, 파초과, 도금양과, 니사나무과, 양귀비과, 침엽수, 질경이과, 벼과, 장미과, 꼭두서니과, 버드나무과, 무환자나무과, 가지과, 주목과, 차나무과, 또는 포도과.
적절한 종은 오크라, 침엽수, 관상수, 겨이삭, 파속식물, 알스트로에메리아, 아나나스, 안드로그라피스, 안드로포곤, 향쑥속, 아룬도, 아트로파, 매자나무, 베타(Beta), 빅사(Bixa), 배추속 식물, 금잔화, 동백나무, 캠토테카(Camptotheca), 대마초, 고추, 카르타무스, 일일초, 개비자나무, 국화, 기나나무, 수박, 커피, 콜키쿰, 콜레우스, 오이, 쿠쿠르비타, 우산대바랭이, 흰독말풀, 패랭이속, 디기칼리스, 항염, 오일야자, 마황, 에리언투스(Erianthus), 에리트록실룸(Erythroxylum), 유클리티스, 페스투카(Festuca), 야생딸기, 갈란투스, 글리신, 고시피움, 해바라기, 파라고무, 호르데움, 사리풀잎, 자트로파, 상추종, 아마, 롤리움, 루피너스, 토마토, 석송속, 마니호트, 알팔파, 박하, 억새, 바나나, 니코티아나, 벼, 수수속, 양귀비속, 파르테니움, 페니세튬, 피튜니아, 갈풀, 산조아재비, 소나무, 새포아풀, 포인세티아, 포플러스, 라우월피아, 피마자, 장미, 사탕수수, 버드나무, 혈근초, 스코폴리아, 호밀, 가지속, 수수, 스파르티나, 시금치, 타나세튬, 주목, 테오브로마, 트리티코세케일, 밀, 우니올라(Uniola), 꽃창포과, 빙카속, 리파리아 및 옥수수 속의 일원을 포함할 수도 있다.
적절한 종은 수수속 아종, 수수 아종, 억새 아종, 사탕수수 아종, 에리언투스(Erianthus) 아종, 포플러스 아종, 큰파란줄기(나도기름새), 페니세튬 퍼푸레움(부들), 갈풀(리이드 케너리그라스), 우산잔디(버뮤다 그래스), 페스투카 아룬디나세아(넓은 잎김의털), 스파르티나 펙티나타(프레리 코디-잔디), 알팔파 벼종(알팔파), 아룬도 도낵스(물대), 호밀(라이), 버드나무 아종 (버드나무), 유칼립투스 아종 (유칼립투스), 트리티코세케일(트리틱 밀 타임스 라이), 대나무, 헬리안투스 안누스(해바라기), 카르타무스 홍화(잇꽃), 자트로파 쿠르카스(자트로파), 피마자 코뮤니스(피마자유), 오일야자(야자), 아마(플랙스), 배추속 식물, 사탕무우 (사탕무), 마니호트 자리공(카사야), 리코페르시콘 에스쿨렌텀(토마토), 렉투카 사티바(상추), 무시클리제 알카(바나나), 가지속 감자(감자), 배추속 식물(브로콜리, 꽃양배추, 양배추), 동백나무 차나무(차), 야생딸기 아나나세 (딸기), 테오브로마 카카오(코코아), 커피 아라비카(커피), 리파리아 포도 (포도), 아나나스 코모수스(파인애플), 캅시쿰 안눔(핫 & 스위트 페퍼), 알리움 세파(양파), 쿠쿠미스 멜로(멜론), 오이(오이), 쿠쿠르비타 맥시마(호박), 쿠쿠르비타 (호박), 스피나세아 올레라세아(시금치), 시트룰루스 라나투스(수박), 아벨모스쿠스 에스쿨렌투스(오크라), 솔라넘 멜로지나(가지), 장미 아종 (장미), 패랭이속 카요필러스(카네이션), 피튜니아 아종 (피튜니아), 포인세티아 풀체리마(포인세티아), 루피너스 알부스(루핀), 우니올라 파니쿨라타(귀리), 벤트그래스(겨이삭 아종), 포플러스 트레물로이드(아스펜), 소나무 아종 (소나무), 침엽수 아종 (침염수), 관상수 아종 (단풍나무), 호르데움 불가레(보리), 모아 프라텐시스(큰새포아풀), 롤리움 아종 (라이그래스) 및 큰조아재비(티모시), 수수속 버들명아주(수수속 풀), 수수56싸리나무56 (수수, 수수류), 마스칸투스 기간투스(억새), 사탕수수 종 (사탕수수), 포플러스, 제아 메이즈(옥수수), 글리신 맥스(콩), 배추속 식물 나프스(카놀라), 트리티쿰 애스티븀(밀), 고시피움 허수튬(코튼), 오리자 사티바(쌀), 헬리안투스 안누스(해바라기), 메디카고 사티바(알팔파), 베타 불가리스(사탕무), 또는 페니세튬 글라우쿰(진주 기장)을 포함할 수 있다.
다양한 구현예는 유전자 발현 수준을 조절하기 위해 변형된 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물 또는 식물 세포에 관한 것으로, 그에 따라 폴리펩티드의 발현수준이 대조군과 비교시 관심있는 조직 내에서 조절되는 식물 또는 식물 세포-예컨대 담배 식물 또는 담배 식물 세포-를 생산할 수 있다. 상기 개시된 조성물 및 방법은 N. 루스티카 및 N. 타바쿰(예를 들어, LA B21, LN KY171, TI 1406, Basma, Galpao, Perique, Beinhart 1000-1 및 Petico)을 포함해서, 니코티아나 속의 임의의 종에 적용될 수 있다. 다른 종은 N. acaulis, N. acuminata, N. africana, N. alata, N. ameghinoi, N. amplexicaulis, N. arentsii, N. attenuata, N. azambujae, N. benavidesii, N. benthamiana, N. bigelovii, N. bonariensis, N. cavicola, N. clevelandii, N. cordifolia, N. corymbosa, N. debneyi, N. excelsior, N. forgetiana, N. fragrans, N. glauca, N. glutinosa, N. goodspeedii, N. gossei, N. hybrid, N. ingulba, N. kawakamii, N. knightiana, N. langsdorffii, N. linearis, N. longiflora, N. maritima, N. megalosiphon, N. miersii, N. noctiflora, N. nudicaulis, N. obtusifolia, N. occidentalis, N. occidentalis subsp. hesperis, N. otophora, N. paniculata, N. pauciflora, N. petunioides, N. plumbaginifolia, N. quadrivalvis, N. raimondii, N. repanda, N. rosulata, N. rosulata subsp. ingulba, N. rotundifolia, N. setchellii, N. simulans, N. solanifolia, N. spegazzinii, N. stocktonii, N. suaveolens, N. sylvestris, N. thyrsiflora, N. tomentosa, N. tomentosiformis, N. trigonophylla, N. umbratica, N. undulata, N. velutina, N. wigandioides, 및 N. x sanderae을 포함하고 있다.
또한 담배 재배품종 및 엘리트(elite) 담배 재배품종의 용도도 본원에서 고려된다. 따라서 트랜스제닉, 비-자연 발생 또는 돌연변이 식물은 하나 이상의 트랜스제닉 유전자, 또는 하나 이상의 유전자 돌연변이 또는 그의 조합을 포함하는, 담배 품종 또는 엘리트 담배 재배품종일 수 있다. 각각의 담배 품종 또는 담배 재배품종(예를 들어, 엘리트 담배 재배품종)에서 이 돌연변이가 자연적으로 발생하지 않는다는 가정 하에, 유전자 돌연변이(들)(예를 들어, 하나 이상의 다형성)는 각각의 담배 품종 또는 담배 재배 품종(예를 들어, 엘리트 담배 재배품종)에서 자연적으로 존재하지 않는 돌연변이일 수 있거나 또는 자연 발생 유전자 돌연변이(들)일 수 있다.
특히 유용한 니코티아나 타바쿰 품종은 버얼리종, 다크종(dark type), 연도 경화된, 및 오리엔탈형 담배를 포함한다. 품종 또는 재배품종의 비-제한적인 예로는 다음과 같다: BD 64, CC 101, CC 200, CC 27, CC 301, CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 800, CC 900, Coker 176, Coker 319, Coker 371 Gold, Coker 48, CD 263, DF911, DT 538 LC Galpao tobacco, GL 26H, GL 350, GL 600, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, HB 04P LC, HB3307PLC, Hybrid 403LC, Hybrid 404LC, Hybrid 501 LC, K 149, K 326, K 346, K 358, K394, K 399, K 730, KDH 959, KT 200, KT204LC, KY10, KY14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, KY907LC, KY14xL8 LC, Little Crittenden, McNair 373, McNair 944, msKY 14xL8, Narrow Leaf Madole, Narrow Leaf Madole LC, NBH 98, N-126, N-777LC, N-7371LC, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC7, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, NC 2002, Neal Smith Madole, OXFORD 207, PD 7302 LC, PD 7309 LC, PD 7312 LC, ’Periqe' tobacco, PVH03, PVH09, PVH19, PVH50, PVH51, R 610, R 630, R 7-11, R 7-12, RG 17, RG 81, RG H51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, Speight 168, Speight 172, Speight 179, Speight 210, Speight 220, Speight 225, Speight 227, Speight 234, Speight G-28, Speight G-70, Speight H-6, Speight H20, Speight NF3, TI 1406, TI 1269, TN 86, TN86LC, TN 90, TN 97, TN97LC, TN D94, TN D950, TR (Tom Rosson) Madole, VA 309, VA359, AA 37-1, B13P, Xanthi (Mitchell-Mor), Bel-W3, 79-615, Samsun Holmes NN, KTRDC number 2 Hybrid 49, Burley 21, KY8959, KY9, MD 609, PG01, PG04, PO1, PO2, PO3, RG11, RG 8, VA509, AS44, Banket A1, Basma Drama B84/31, Basma I Zichna ZP4/B, Basma Xanthi BX 2A, Batek, Besuki Jember, C104, Coker 347, Criollo Misionero, Delcrest, Djebel 81, DVH 405, Galpao Comum, HB04P, Hicks Broadleaf, Kabakulak Elassona, Kutsage E1, LA BU 21, NC 2326, NC 297, PVH 2110, Red Russian, Samsun, Saplak, Simmaba, Talgar 28, Wislica, Yayaldag, Prilep HC-72, Prilep P23, Prilep PB 156/1, Prilep P12-2/1, Yaka JK-48, Yaka JB 125/3, TI-1068, KDH-960, TI-1070, TW136, Basma, TKF 4028, L8, TKF 2002, GR141, Basma xanthi, GR149, GR153, Petit Havana. 본원에서 특정하게 식별되지 않는다고 하더라도 상기한 것들의 낮은 컨버터 아변종도 또한 고려된다.
한 구현예에서, 니코티아나 타바쿰의 버얼리종 품종이 사용된다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 다른 식물은 차 (Camellia sinensis)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
구현예들은 또한 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드(또는 본원에 기재된 그의 임의의 조합)의 발현 또는 활성을 조절하기 위해서 변형된 돌연변이 식물, 비-자연 발생 식물, 혼성 식물 또는 트랜스제닉 식물을 생산하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 유리하게는, 얻어진 돌연변이 식물, 비-자연 발생 식물, 혼성 식물 또는 트랜스제닉 식물은 대조군 식물에 대한 전체적인 외관과 동일하거나 또는 실질적으로 동일할 수도 있다. 성숙도, 식물당 잎의 수, 줄기 높이, 잎 삽입각도, 잎 크기(폭 및 길이), 마디 거리, 및 잎몸-주맥 비율과 같은 다양한 표현형 특성은 현장 관측에 의해서 측정될 수 있다.
하나의 측면은 본원에 기재된 돌연변이 식물, 비-자연 발생 식물, 혼성 식물 또는 트랜스제닉 식물의 종자에 관한 것이다. 바람직하게는, 종자는 담배 종자이다. 추가적인 측면은 본원에 기재된 돌연변이 식물, 비-자연 발생 식물, 혼성 식물 또는 트랜스제닉 식물의 꽃가루 또는 배주에 관한 것이다. 또한, 웅성 불임성을 부여하는 핵산을 포함하는, 본원에 기재된 돌연변이 식물, 비-자연 발생 식물, 혼성 식물 또는 트랜스제닉 식물이 제공된다.
본원에 기재된 돌연변이 식물, 비-자연 발생 식물, 혼성 식물 또는 트랜스제닉 식물 또는 그의 일부분의 재생가능한 세포의 조직 배양이 제공되며, 배양은 부모의 모든 형태학적 및 생리학적 특성을 표현시킬 수 있는 식물을 재생한다. 재생가능한 세포는 이들에만 한정하는 것은 아니지만, 잎, 꽃가루, 배아, 자엽, 배축, 뿌리, 뿌리 끝, 꽃밥, 꽃 및 그의 일부, 밑종자, 싹, 줄기, 줄기대 또는 중과피 및 포자낭 또는 그로부터 유도되는 캘러스 또는 원형질체를 포함한다.
또 다른 측면은, 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물 또는 세포로부터 유도되었거나 유도가능한 경화된 식물 재료- 예컨대 경화된 잎 또는 경화된 담배-에 관한 것으로, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 발현 또는 그에 따라 암호화된 단백질의 활성이 감소되고 결과적으로 아스파라긴 수준 감소를 초래한다.
적합하게는 상기 식물(예를 들어, 잎)의 외관은 대조군 식물과 실질적으로 동일하다. 적합하게는, 식물은 담배 식물이다.
또한, 구현예는, 감소된 아스파라긴 수준을 갖는 식물 또는 식물 성분(예, 잎 - 예컨대, 경화된 잎 또는 건조 잎) 또는 식물 세포를 초래할 수 있는 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 중 하나 이상의 발현 또는 활성을 조절하기 위해 변형된 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물 또는 식물 세포를 생산하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
본원에 기재한 방법에 따라서 얻어지는 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물은 대조군 식물에 대한 시각적인 외관과 유사하거나 또는 실질적으로 동일할 수도 있다. 한 구현예에서, 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물의 잎 중량은 대조군 식물과 실질적으로 동일하다. 한 구현예에서, 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물의 잎 개수는 대조군 식물과 실질적으로 동일하다. 한 구현예에서, 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물의 잎 중량 및 잎 개수는 대조군 식물과 실질적으로 동일하다. 한 구현예에서, 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물의 줄기 높이는 예를 들어, 현장 이식 뒤 한 달, 두 달, 세 달 이상 또는 토핑 뒤 10일, 20일, 30일 또는 36일 이상에서, 대조군 식물과 실질적으로 동일하다. 예를 들어, 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물의 줄기 높이는 대조군 식물의 줄기 높이보다 작지 않다. 또 다른 구현예에서, 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물의 엽록소 함량은 대조군 식물과 실질적으로 유사하다. 또 다른 구현예에서, 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물의 줄기 높이는 실질적으로 대조군 식물과 동일하고 그리고 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물의 엽록소 함량은 실질적으로 대조군 식물과 동일하다. 다른 구현예에서, 비-자연 발생 돌연변이 또는 트랜스제닉 식물의 잎의 크기 또는 형태 또는 수 또는 착색은 실질적으로 대조군 식물과 동일하다. 적합하게는, 식물은 담배 식물이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 식물의 적어도 일부분(예를 들어, 잎-예컨대 경화 또는 건조 잎-또는 담배) 내의 아스파라긴의 양을 조절하는(예, 감소시키는) 방법을 제공하며, 상기 방법은, (i) 본원에 기재된 하나 이상의 폴리펩티드의 발현 또는 활성을 조절하는(예. 감소시키는) 단계로서, 적합하게는 여기서, 상기 폴리펩티드(들)는 본원에 기재된 대응하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 단계; (ii) 단계 (i)에서 수득된 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물의 적어도 일부분 (예, 잎-예컨대, 경화된 잎) 내의 아스파라긴의 함량을 측정하는 단계; 및 (iii) 상기 아스파라긴 함량이 대조군 식물과 비교하여 감소된 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물을 식별하는 단계를 포함한다. 적합하게는, 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물의 시각적인 외관은 대조군 식물과 실질적으로 동일하다. 적합하게는, 식물은 담배 식물이다.
다른 측면에서, 경화 또는 건조 식물 재료 - 예컨대 경화 또는 건조 잎-의 적어도 일부분 내의 아스파라긴의 양을 감소시키는 방법으로, (i) 본원에 기재된 폴리펩티드의 하나 이상의 발현 또는 활성을 감소시키는 단계로, 적합하게는, 여기서 상기 폴리펩티드(들)은 본원에 기재된 대응하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 단계; (ii) 식물 재료-예컨대 상기 잎 중 하나 이상-을 수확하고 일정 시간 동안 경화 또는 건조시키는 단계; (iii) (ii) 단계에서 얻은 경화 또는 건조 식물 재료의 적어도 일부분 내의 아스파라긴 함량을 측정하는 단계; 그리고 (iv) 상기 아스파라긴 함량이 대조군 식물에 비해 감소된 경화 또는 건조 식물 재료를 식별하는 단계를 포함한다.
대조군에 비해 발현의 감소는 약 5% 내지 약 100%, 또는 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 100%의 감소일 수도 있으며, 전사 활성 또는 폴리뉴클레오티드 발현 또는 폴리펩티드 발현의 감소 또는 이들의 조합을 포함한다.
대조군에 비해 활성의 감소는 약 5% 내지 약 100%, 또는 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 100%의 감소일 수도 있다.
본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 및 재조합 구성체는 관심있는 식물 종, 적합하게는 담배에서의 효소의 발현을 조절하기 위해서 사용될 수 있다.
많은 폴리뉴클레오티드 기반 방법은 예를 들어, 식물 및 식물 세포에서의 유전자 발현을 증가시키기 위해서 사용될 수 있다. 실시예에 의해서, 형질전환될 식물과 상용성이 있는 것으로 식물 및 식물 세포에서 유전자를 과발현시킬 수 있는 상류의 프로모터와 함께 관심있는 유전자를 포함하는 구성체, 벡터 또는 발현 벡터가 제조될 수 있다. 예시적인 프로모터는 본원에 기재되어 있다. 형질전환에 따라서 적절한 조건 하에서 성장할 때, 프로모터는 식물 또는 그의 특이적 조직에서의 효소의 수준을 조절(예를 들어 감소)하기 위하여 발현을 유도할 수 있다. 하나의 예시적인 구현예에서, 식물 및 식물 세포에서 유전자를 과발현시키기 위하여 본원에 기재된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 (또는 본원에 기재된 이들의 임의의 조합)을 운반하는 벡터가 생성된다. 벡터는 트랜스젠의 상류에 식물에서 모든 조직에서의 구성적인 발현을 유도하는 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S 프로모터와 같은 적절한 프로모터를 가진다. 벡터는 또한 형질전환된 캘리(calli) 및 세포주를 선별하기 위한 항생제 내성 유전자를 가진다.
다양한 구현예는 폴리뉴클레오티드의 다중 사본을 식물 게놈 내로 통합시켜서 본원에 기재된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 발현 수준을 감소시키기 위한 방법에 관한 것으로, 본원에 기재된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되어 있는 프로모터를 포함하는 발현 벡터로 식물 세포 숙주를 형질전환하는 것을 포함한다. 재조합 폴리뉴클레오티드에 의해서 암호화된 폴리펩티드는 고유한 폴리펩티드이거나 세포에 이형일 수 있다.
본원에 기재된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(또는 본원에 기재된 그의 임의의 조합)의 돌연변이 대립형질을 운반하는 식물은 유용한 계통, 변이체 및 혼성체를 형성하기 위하여 식물 육종 프로그램에 사용될 수 있다. 특히, 돌연변이 대립형질은 상술한 상업적으로 중요한 변이체로 침투(introgress)된다. 본원에 기재된 비-자연 발생 식물 또는 트랜스제닉 식물을 상이한 유전자 동일성을 포함하는 식물과 교배하는 것을 포함하는 식물 육종 방법이 제공된다. 방법은 추가로 바람직한 유전적 특성 또는 유전적 배경을 가지는 후손이 얻어질 때까지 후손 식물을 다른 식물과 교배시키는 단계 및 선택적으로 반복 교배하는 단계를 더 포함할 수도 있다. 이러한 육종 방법에 의해 작용하는 한가지 목적은 바람직한 유전적 특성을 특히 상업적으로 관심이 있는 다른 변이체, 육종 계통, 혼성체 또는 재배 품종에 도입시키기 위한 것이다. 또 다른 목적은 단일 식물 변이체, 계통, 혼성체 또는 재배 품종에서의 상이한 유전자의 유전자 변형의 적층(stacking)을 용이하게 하기 위한 것이다. 종내 교배뿐만 아니라 종간의 교배가 고려되고 있다. 이러한 교배로부터 발생하는 후손 식물은 또한 육종 계통으로도 지칭되며, 이들은 본 발명의 비-자연 발생 식물의 실시예이다.
한 구현예에서, 비-자연 발생 식물을 생산하기 위한 방법이 제공되고, (a) 후손 담배 종자를 얻기 위해서 돌연변이 또는 트랜스제닉 식물을 제2 식물과 교배시키는 단계; (b) 비-자연 발생 담배 식물을 얻기 위해서 식물 성장 조건 하에서 후손 종자를 성장시키는 단계를 포함한다. 본 방법은 추가로 (c) 후손 종자를 얻기 위해서 비-자연 발생 식물의 이전 세대를 그 자체 또는 또 다른 식물과 교배시키는 단계; (d) 추가적인 비-자연 발생 식물을 얻기 위해서 식물 성장 조건 하에서 단계 (c)의 후손 종자를 성장시키는 단계 및 (e) 비-자연 발생 식물의 추가적인 세대를 얻기 위해서 단계 (c)와 (d)를 여러번 계속 교배시키고 성장시키는 단계를 포함한다. 본 방법은 선택적으로 단계 (a) 이전에 특이적이고 돌연변이 또는 트랜스제닉 식물과 동일하지 않은 유전적 동일성을 가지는 부모식물을 제공하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 육종 프로그램에 따라서, 비-자연 발생 식물의 세대를 생성하기 위해 교배 및 성장 단계를 0회 내지 2회, 0회 내지 3회, 0회 내지 4회, 0회 내지 5회, 0회 내지 6회, 0회 내지 7회, 0회 내지 8회, 0회 내지 9회, 또는 0회 내지 10회 반복한다. 역교배는 부모 중 하나의 그것과 가까운 유전적 동일성을 가지는 다음 세대에서의 후손 식물을 얻기 위해 후손이 그의 부모 또는 그의 부모와 유전적으로 동일한 또 다른 식물과 교배되는 방법의 예시이다. 식물 육종, 특히 식물 육종을 위한 기술은 주지되어 있고 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 본 방법은 추가로 이러한 방법에 의해서 생성되는 비-자연 발생 식물을 제공한다. 소정의 구현예들은 상기 식물을 선별하는 단계를 배제한다.
본원에서 설명하는 방법의 일부 구현예에서, 육종으로부터 발생하는 계통 및 변이체 유전자를 위한 스크리닝은 표준 현장 절차를 사용해서 현장에서 평가된다. 본래의 돌연변이를 유발하지 않는 부모를 포함하는 대조군 표현형이 포함되고 개체는 무작위의 완전한 블록 설계 또는 다른 적절한 현장 설계로 현장에 배열되어 있다. 담배의 경우, 표준 작물학적인 관행이 사용되는데 예를 들어 담배가 경화 또는 건조 이전과 그 동안의 화학적 및 다른 일반적인 테스트를 위해 수확되고, 계량되고, 샘플링된다. 데이터의 통계학적인 분석이 수행되어서 부모 계통에 대한 선택된 계통의 유사성을 확인할 수 있다. 선택된 식물의 세포유전학적 분석은 경우에 따라서 수행되어서 염색체 조성 및 염색체 쌍 관계를 확인할 수 있다.
DNA 지문분석, 단일 뉴클레오티드 다형성, 마이크로새틀라이트 마커, 또는 유사한 기술은 본원에 기재된 바와 같은, 유전자의 돌연변이 대립형질을 다른 식물 내로 전달 또는 육종하기 위해서 마커-보조 선택(MAS) 육종 프로그램에 사용될 수 있다. 예를 들어, 육종자는 작물학상으로 바람직한 유전자형과 돌연변이를 포함하는 유전자형을 혼성화하여 분리된 개체군들을 형성할 수 있다. F2 또는 역교배 세대에서의 식물은 본원에 기재된 기술 중 하나를 이용해서, 게놈 서열 또는 그의 단편으로부터 개발되는 마커를 이용해서 스크리닝될 수 있다. 돌연변이 대립형질을 가지는 것으로 확인된 식물은 역교배되거나 자가수분되어서 스크리닝될 두번째 개체군을 형성할 수 있다. 예상되는 유전 패턴 또는 사용되는 MAS 기술에 따라, 원하는 각각의 식물의 확인을 보조하기 위하여 역교배의 각각의 주기 전에 선택된 식물을 자가-수분하는 것이 필요하다. 역교배 또는 다른 육종 절차는 반복되는 부모의 원하는 표현형이 복구될 때까지 반복될 수 있다.
육종 프로그램에서, 성공적인 교배는 수정된 F1 식물을 생산한다. 선택된 F1 식물은 부모 중 하나와 교배될 수 있고, 첫번째 역교배 세대 식물은 변이체 유전자 발현(예를 들어, 유전자의 null 버전)을 위한 재검증된 개체군을 생산하기 위해서 자가수분된다. 역교배, 자가 수분 및 스크리닝의 과정은 예를 들어, 마지막 스크리닝이 반복되는 부모에 생식력이 있고, 합리적으로 유사한 식물을 생산할 때까지 적어도 4번 반복된다. 바람직하다면, 식물은 자가수분되고 후손은 변이체 유전자 발현을 나타내는 식물을 확인하기 위해서 그 이후에 다시 스크리닝된다. 일부 구현예에서, F2 세대의 식물 개체군은 변이체 유전자 발현을 위해 스크리닝되고, 예를 들어, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드(또는 본원에 기재된 그의 임의의 조합)을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열 정보를 기초로 하여 프라이머를 가지는 PCR 방법을 사용해서, 표준 방법에 따라서 유전자의 부재로 인해, 예를 들면, 식물은 폴리펩티드를 발현하는 것이 실패하는 것으로 확인된다.
혼성체 변종은 첫번째 변종의 교배모수(female parent) 식물(즉, 종자 부모(seed parent))의 자가수분을 방지함으로써, 교배모수 식물을 수정시키는 두번째 변이체의 웅성 부모 식물로부터의 수분을 허용함으로써, 그리고 F1 혼성체 종자를 교배모수 식물에 형성함시킴으로써 제조될 수 있다. 교배모수 식물의 자가수분은 꽃 발생의 초기단계에 꽃을 제거함으로써 억제될 수 있다. 선택적으로, 웅성불임성의 형태를 통해 교배모수 식물의 꽃가루 형성을 방지할 수 있다. 예를 들어, 웅성불임성은 세포질 웅성불임성(CMS) 또는 이식 유전자가 소포자 생성 및/또는 꽃가루 형성, 또는 자기 불화합성을 억제하는 트랜스제닉 웅성불임성에 의해 생성될 수 있다. CMS가 포함된 교배모수 식물은 특히 유용하다. 교배모수 식물이 CMS인 구현예에서, 꽃가루는 웅성가임 식물로부터 수확되고, 교배모수 식물의 암술머리에 수동적으로 적용되고, 얻어진 F1 종자가 수확된다.
본원에 기재된 변종과 계통은 단일 교배 F1 혼성체를 형성하는데 사용될 수 있다. 이러한 구현예에서, 부모 변종의 식물은 웅성 친 식물에서 교배모수 식물로 자연적 교배수분을 촉진시키기 위해 실질적으로 동형인 인접한 단일 개체군으로써 자랄 수 있다. 교배모수 식물에서 형성된 F1 종자는 선택적으로 기존의 방법으로 수확된다. 대량으로 두 부모 식물 품종을 재배할 수 있고, 교배모수에 의해 형성된 F1 혼성체 종자 및 자가 수분의 결과로 인한 웅성 친에 형성된 종자와의 조합을 수확할 수 있다. 대안으로, 삼원 교혼성체는 단일 교배 F1 혼성체가 교배모수로써 사용되고, 다른 웅성 친과 교배되는 경우 수행될 수 있다. 다른 대안으로, 이중-교배 혼성체는 두 개의 다른 단일 교배의 F1 후손이 그들 스스로 교배되는 경우 생성된다.
돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물의 개체는 원하는 특성이나 표현형을 가지는 개체군을 스크리닝하거나 또는 선별할 수 있다. 예를 들어, 단일 트랜스제닉 경우의 후손의 개체군은 그에 의해서 암호화되는 폴리펩티드의 원하는 수준의 발현 또는 활성을 갖는 식물을 위해 스크리닝할 수 있다. 물리적, 생화학적 방법은 발현 또는 활성 수준을 식별하는 데 사용될 수 있다. 이것은 폴리뉴클레오티드의 검출을 위한 서던 분석 또는 PCR 증폭; RNA 전사체를 검출하기 위한 노던블롯, S1 RNase 보호, 프라이머 신장법 또는 RT-PCR 증폭; 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드의 효소 또는 리보자임 활성을 검출하기 위한 효소 분석법; 및 폴리펩티드를 검출하기 위한 단백질 겔 전기천공법, 웨스턴블롯, 면역침강법, 및 효소-연결 면역분석법을 포함한다. 가시적 분자결합화, 효소 염색, 및 면역 염색법과 같은 다른 기술들은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 발현을 검출하는데 사용될 수 있다.
하나 이상의 재조합 폴리뉴클레오티드, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 구성체, 하나 이상의 이중가닥의 RNA, 하나 이상의 컨쥬게이트 또는 하니 이상의 벡터/발현 벡터를 포함하는 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물 세포 및 식물이 본원에 기재되어 있다.
제한 없이, 본원에 기재된 식물은 본 발명에 따라서 발현 또는 활성이 조절되기 전후에 다른 목적을 위해서 변형될 수 있다. 하나 이상의 다음 유전적 변형은 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물체에 존재할 수 있다. 한 구현예에서, 질소 대사 중간체의 변환에 관여하는 하나 이상의 유전자는 조절되어, 건조시, 대조군 식물보다, 적어도 하나의 담배 특이 니트로사민의 수준이 낮은 식물(예컨대 잎)을 생산한다. 조절될 수 있는 유전자의 비제한적인 예는 니코틴에서 노르니코틴으로의 변환에 참여하는 CYP82E4, CYP82E5 및 CYP82E10과 같은 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 유전자를 포함하고, WO2006091194, WO2008070274, WO2009064771 및 PCT/US2011/021088에 기재되어 있으며 본원에 상세히 기재되어 있는 바와 같다. 한 구현예에서, 중금속 흡수 또는 중금속 전달에 관여하는 하나 이상의 유전자가 조절되어, 변형(들) 없는 대조군 식물 또는 그의 부분보다 낮은 중금속 함유량을 가지는 식물 또는 식물의 부분(잎과 같은)을 생산한다. 이들에만 제한하는 것은 아니지만, 예를 들어 양이온 확산 촉진자(CDF)와, Irt와 같은 단백질(ZIP)인 Zrt과, 양이온 교환체(CAX) 과, 구리 운반자(CORT), 중금속 P 형 ATP 분해효소(예를 들어, WO2009074325에 설명된 HMAs) 과, 자연적 저항성 관련 대식세포 단백질(NRAMP)의 동족체의 패밀리 및 카드뮴 같은 중금속의 수송에 관여하는 ATP 결합(ABC) 수송체(예를 들어, WO2012/028309에 설명된 MRPs)의 유전자를 포함하는데, 여기서 사용된 중금속의 용어는 전이 금속을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이 중금속이란 용어는 전이 금속을 포함한다. 다른 조절의 예는 제초제 저항성을 포함하며, 예를 들면, 글리포세이트는 광범위 스펙트럼의 제초제의 활성 성분이다. 글리포세이트 저항성 트랜스제닉 식물은 aroA 유전자(쥐티푸스균 및 E.coli에서 글리포세이트 EPSP 합성효소)를 전이시킴으로써 개발되었다. 술포닐우레아 저항성 식물은 애기장대의 돌연변이 ALS(아세토락테이트 합성효소)를 형질전환시킴으로써 생성되었다. 돌연변이 긴털비름에서 광계 II 의 OB 단백질은 식물에 형질전환되어 아트라진 저항성 트랜스제닉 식물을 생산하였다. 그리고 브로목시닐 내성 트랜스제닉 식물은 세균 폐렴간균에서 bxn 유전자를 삽입하여 생산된다. 다른 예시적인 변형에 의하여 곤충 저항성 식물이 야기된다. 바실러스 튜링겐시스(Bt) 독소는, 피라미드식 cry1Ac 및 cry1C Bt 유전자가 각각 단일 단백질에 저항성 있는 배추좀나방을 조절하여 저항성 곤충의 진화를 명백히 지연시키는 브로콜리에서 최근에 기술된 바와 같이, Bt 저항성 해충의 출현을 지연시키는 효과적인 방법을 제공할 수 있다. 또 다른 예시적인 변형은 병원체(예를 들어, 바이러스, 세균, 곰팡이)로 인한 질병에 저항하는 식물을 야기한다. Xa21 유전자(세균성 마름병에 저항성)를 발현하는 식물과 Bt 융합 유전자 및 키티나제 유전자(노란 줄기 나무좀에 저항성 및 다발에 내성) 둘 다 발현된 식물이 제조된 바 있다. 또 다른 예시적인 변형은 웅성불임성과 같은 생식 능력을 바꾸는 결과를 초래한다. 또 다른 예시적인 변형은 비 생물적 스트레스(예를 들면, 가뭄, 온도, 염도)에 내성이 있는 식물을 야기하고, 내성 트랜스제닉 식물은 애기장대로부터 아실 글리세롤 포스페이트 효소가 전이됨으로써 생산된다. 만니톨 및 소르비톨의 합성에 관여하는 만니톨 탈수소효소 및 소르비톨 탈수소효소를 코딩하는 유전자는 가뭄 저항성을 향상시킨다. 다른 예시적 변형은 저장 단백질과 기름이 증가된 식물, 광합성 효율이 향상된 식물, 저장수명이 늘어난 식물, 탄수화물 함량이 향상된 식물, 및 곰팡이 저항성 식물; 알칼로이드의 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 식물을 야기할 수 있다. S-아데노실-L-메티오닌(SAM) 및/또는 시스타티오닌 감마 합성효소(CGS)의 발현이 조절된 트랜스제닉 식물이 또한 고려된다.
하나 이상의 이러한 형질들은 다른 재배종으로부터 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물 내로 이입되거나 또는 곧바로 형질전환(transform)될 수 있다. 형질(들)을 본 발명의 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물에 유전자이입하는 것은 계통 육종, 역교배, 이중-반수체 육종 등과 같은 당업계에 공지된 임의의 식물 육종 방법에 의해 달성될 수 있다(Wernsman, E. A, and Rufty, R. C. 1987. Chapter Seventeen. Tobacco. Pages 669-698 In: Cultivar Development. Crop Species. W. H. Fehr (ed.), MacMillan Publishing Co, Inc., New York, N.Y 761 pp. 참조). 상기 기재한 분자생물학-기반의 기술들, 특히 RFLP 및 마이크로새틀라이트 마커들이 그러한 역교배에서 자손(progeny)들이 반복친(recurrent parent)과 가장 높은 유전적 동일성을 가지는지 확인하기 위하여 사용될 수 있다. 이는 반복친과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 99% 유전적 동일성을 가진, 더욱더 바람직하게는 반복친과 유전적으로 동일한, 그리고 공여친(donor parent)으로부터 이입된 형질을 추가로 포함하는 담배 품종들의 생산을 가속화하게 해 준다. 그러한 유전적 동일성의 확인은 본 기술분야에 공지된 분자 마커들에 기초할 수 있다.
최종 역교배는 전이되는 핵산(들)의 순수한 육종 자손을 제공하기 위해 자가교배될 수 있다. 도출되는 식물들은 일반적으로 본 발명의 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물들의 모든 형태학적 및 생리학적 특징들, 및 추가적으로 전이된 형질(들)을 필수적으로 가진다(예를 들어, 하나 이상의 단일 유전자 형질들). 적절한 시험 프로토콜을 결정하기 위해, 정확한 역교배 프로토콜은 바뀌는 형질에 의존할 것이다. 비록 전이되는 형질이 우성 대립형질일 경우 역교배 방법들이 단순화되지만, 열성 대립형질 역시 전이될 수 있다. 이 경우에, 원하는 형질이 성공적으로 전이되었는지 여부를 결정하기 위해 자손에 대해 시험을 진행할 필요가 있을 수 있다.
다양한 구현예는, 아스파라긴 합성효소 함량을 감소시키기 위해 폴리뉴클레오티드(또는 본원에 기재된 그의 임의의 조합)의 발현 수준이 감소되는 돌연변이 식물, 비-자연 발생 식물 또는 트랜스제닉 식물, 뿐만 아니라 바이오매스를 제공한다.
그러한 식물들의 일부, 특히 담배 식물들, 그리고 더욱 특히 담배 식물들의 잎몸(leaf lamina) 및 주맥(midrib)이 에어로졸 형성 재료들, 에어로졸 형성 장치들, 흡연 물품, 흡연가능한 물품, 무연(smokeless) 제품, 및 담배 제품을 비제한적으로 포함하는 다양한 소비성 제품의 제조에 도입되거나 사용될 수 있다. 에어로졸 형성 재료의 예는 비제한적으로 담배 조성물, 담배, 담배 추출물, 대담배(cut tobacco), 컷 필터(cut filter), 경화 또는 건조 담배, 팽창 담배(expanded tobacco), 균질화된 담배, 재구성(reconstituted) 담배, 및 파이프 담배를 포함한다. 흡연 물품 및 흡연가능한 물품은 에어로졸 형성 장치들의 종류이다. 흡연 물품 또는 흡연가능한 물품의 예는 비제한적으로 궐련(cigarette), 소형엽궐련(cigarillos), 및 여송연(cigar)을 포함한다. 무연 제품의 예는 씹는 담배류 및 코담배류를 포함한다. 소정의 에어로졸 형성 장치에서는, 연소 (또는 태움) 대신에, 담배 조성물 또는 다른 에어로졸 형성 재료가 예를 들면, 하나 이상의 전기 가열 요소들 또는 탄소 열원에 의해 가열되어 에어로졸을 생성한다. 통상적으로 가열식 흡연 물품에서는, 에어로졸은 열원으로부터, 열원의 내부, 그 주위 또는 그 하류에 위치할 수 있는, 물리적으로 분리된 에어로졸 형성 기재 또는 물질로의 열 전달에 의해 발생된다. 흡연 동안, 휘발성 화합물이 열원으로부터의 열의 전달에 의해서 에어로졸 형성 기재로부터 방출되고 흡연 물품을 통해 흡인된 공기에 연행된다. 상기 방출된 화합물은 냉각되면서 응축되어 사용자가 흡입하게 되는 에어로졸을 형성한다. 이러한 장치는, 예를 들면, 에어로졸 발생 장치로부터 가열식 흡연 물품의 에어로졸 형성 기재로의 열 전달에 의해 에어로졸이 발생되는 전기 가열식 에어로졸 발생 장치를 포함하고 있다. 적합하게는, 에어로졸 형성 기재의 가열 동안, 담배의 연소 또는 태움이 일어나지 않는다. 적합한 에어로졸 형성 물품은 WO2013/098405에 기재되어 있으며, 에어로졸 발생 장치의 내부 가열 요소에 의해 가열될 때 흡입 가능한 에어로졸을 발생시키는 에어로졸 형성 기재를 포함하고 있다. 그것은 내부 가열 요소를 포함하는 전기 가열식 에어로졸 발생 장치를 포함할 수 있다. 그것은 선형으로 순차적 배열로, 에어로졸 형성 기재, 에어로졸 형성 기재의 바로 하류에 위치하는 지지 요소, 상기 지지 요소의 하류에 위치하는 에어로졸 냉각 요소, 및 에어로졸 형성 기재, 상기 지지 요소와 에어로졸 냉각 요소를 둘러싸고 있는 외부 래퍼를 추가로 포함하고 있을 수 있다. 상기 지지 요소는 에어로졸 형성 기재와 접경하고 있을 수 있다. 에어로졸 형성 기재는 에어로졸 발생 장치의 가열 요소에 의해 관통 가능할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "연소"는 반응물 분자, 즉 연료와 산화제가 혼합되어 동시에 열을 방출하면서 생성물 분자가 되는 레독스 화학 반응을 의미한다. 연소는 원래의 반응물 기질에 존재하는 질산염의 분해로부터 형성되지 않은, 기체 생성물 내의 질소 산화물의 적절한 양의 존재, 및 동시적인 전체 발열 공정의 명백한 증거에 의해 명백하게 나타낼 수 있다. 연소를 위한 기체 생성물 내의 질소 산화물의 적절한 양의 진화는 관심 조건 (예를 들어, 공기 중)에서 형성된 질소 산화물의 전체 양과 동일한 조건에서 그러나 산소 부존재 하에 (예를 들어, 순수한 질소 또는 헬륨 대기에서) 형성된 질소 산화물을 비교함으로써 결정될 수도 있다. 다른 종류의 가열 에어로졸 형성 장치에서는, 가연성 연료 또는 열원으로부터 물리적으로 분리되어 열원의 내부, 주위 또는 하류에 위치하는 에어로졸 형성 재료로 열이 전달되어 에어로졸이 생성된다. 무연 담배 제품 및 다양한 담배-함유 에어로졸 형성 물질들은 박편, 필름, 타블렛, 거품, 또는 구슬과 같은 임의의 포맷의 다른 성분 상에 증착된, 다른 성분과 혼합된, 다른 성분에 둘러싸인 또는 다른 성분들과 결합된, 건조 입자, 세절, 과립, 분말 또는 슬러리를 비롯한, 임의의 형태의, 담배를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 '연기'는 흡연 물품, 예컨대 가연성 궐련에 의해서, 또는 에어로졸 형성 물질을 연소하여 생산되는 에어로졸의 유형을 설명하는 데 사용된다.
소정의 구현예에서, 식물 재료를 연소시키거나 태우지 않고 가열하는 것이 바람직하다.
한 구현예에서, 본원에 기재된 돌연변이, 트랜스제닉 및 비-자연 발생 담배 식물들로부터 건조된 식물 재료가 또한 제공될 수 있다. 녹색 담뱃잎들을 경화하는 공정들은 공기 경화(air-curing), 화건(fire-curing), 화력 경화(flue-curing) 및 태양 경화(sun-curing)를 비제한적으로 포함하는 본 기술분야에 공지된 기술들이다. 녹색 담뱃잎들을 경화하는 공정은 수확된 담배의 종류에 의존한다. 예를 들어, 버얼리(Burley) 및 소정의 어두운 색깔의 종은 보통 공기-경화하고, 그리고 파이프 담배, 씹는 담배, 및 코담배는 보통 화건한다.
다른 구현예에서, 본원에 기술된 돌연변이, 트랜스제닉 및 비-자연 발생 식물로부터 건조된 식물 재료가 또한 제공된다. 잎을 건조시키는 과정들은 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람들에 의해 알려지고 제한 없이 공기-건조 및 태양-건조를 포함한다. 잎을 건조시키는 정확한 과정은 수확되는 식물의 유형에 좌우된다. 적합하게는, 식물 재료는 수확 후에 건조된다. 그러므로, 건조된 물질 및 수확-후 건조된 물질의 사용이 본원에서 고려된다. 건조 과정은 하나 이상의 노쇠 관련 유전자를 활성화시킬 수 있다. 본원에 기술된 유전자 및 단백질의 발현 또는 활성은 경화 또는 건조 중에 모니터링될 수 있다. 마찬가지로, 아스파라긴, 니코틴, 글루타민, 아스파트산 및 글루탐산의 수준은 경화 또는 건조 중에 모니터링될 수 있다. 실례로, 측정은 경화 또는 건조의 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100시간 후에 이루어질 수 있다. 추가의 실례로, 측정은 0일, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 또는 10일 또는 그 이상이 지난 후에 이루어질 수 있다.
다른 구현예에서, 본원에 기술된 돌연변이 담배 식물, 트랜스제닉 담배 식물 또는 비-자연 발생 담배 식물로부터 식물 재료- 예컨대 잎, 바람직하게는 경화되거나 건조된 잎-을 포함하는 담배-함유 에어로졸 형성 물질을 포함하는 담배 제품이 기술된다. 본원에 기술된 담배 제품은 변형되지 않은 담배를 추가로 포함할 수 있는 혼합 담배 제품일 수 있다.
경화 또는 건조(예를 들면 3일 경화 또는 건조) 후에 본원에 기술된 식물, 식물의 부분, 식물 재료, 식물 제품 또는 담배 제품의 아스파라긴의 양은 대조군 식물에 비교하여 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100% 더 낮다-예컨대 약 200% 또는 300% 더 낮다. 적합하게는, 경화 또는 건조(예를 들면 3일 경화 또는 건조) 후에 본원에 기술된 식물, 식물의 부분, 식물 재료, 식물 제품 또는 담배 제품의 아스파라긴의 양은 대조군에 비교하여 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100% 더 낮고-예컨대 약 200% 또는 300% 더 낮고, 더 적합하게는, 대조군에 비교하여 적어도 약 80% 더 낮거나 또는 적어도 약 90% 더 낮다.
경화 또는 건조(예를 들면 3일 경화 또는 건조) 후에 본원에 기술된 식물, 식물의 부분, 식물 재료, 식물 제품 또는 담배 제품의 아스파라긴의 양은 약 40 mg/g 건조 중량 잎 또는 그 미만, 보다 적합하게는 약 35 mg/g 건조 중량 잎 또는 그 미만, 보다 적합하게는 약 30 mg/g 건조 중량 잎 또는 그 미만, 보다 적합하게는 약 25 mg/g 건조 중량 잎 또는 그 미만, 보다 적합하게는 약 20 mg/g 건조 중량 잎 또는 그 미만, 보다 적합하게는 약 15 mg/g 건조 중량 잎 또는 그 미만, 보다 적합하게는 약 12 mg/g 건조 중량 잎 또는 그 미만, 보다 적합하게는 약 10 mg/g 건조 중량 잎 또는 그 미만 또는 보다 적합하게는 약 5 mg/g 건조 중량 잎 또는 그 미만이다. 적합하게는, 잎은 식물의 바닥-중간 줄기 위치로부터 수확된다.
경화 또는 건조 후에 식물, 식물의 부분, 식물 재료, 식물 제품 또는 담배 제품으로부터 유도되고 가열에 의해 얻어진 에어로졸 중의 아크릴아미드의 양은 대조군에 비교하여 적어도 약 70% 더 낮다. 실례로, 경화 또는 건조 후에 담배 제품으로부터 유도되고 가열에 의해 얻어진 에어로졸 중의 아크릴아미드의 양은 궐련당 약 1.5 μg이다.
경화 또는 건조 후에 식물, 식물의 부분, 식물 재료, 식물 제품 또는 담배 제품으로부터 유도되고 연소에 의해 얻어진 에어로졸 중의 아크릴아미드의 양은 대조군에 비교하여 적어도 약 55% 더 낮다. 실례로, 경화 또는 건조 후에 담배 제품으로부터 유도되고 연소에 의해 얻어진 에어로졸 중의 아크릴아미드의 양은 궐련당 약 2.5 μg이다.
적합하게는, 경화 또는 건조 후에 식물, 식물의 부분, 식물 재료, 식물 제품 또는 담배 제품으로부터 유도되고 연소 또는 가열에 의해 얻어진 에어로졸 중의 아크릴아미드의 양은 대조군에 비교하여 적어도 약 55% 내지 약 70% 더 낮다. 실례로, 경화 또는 건조 후에 담배 제품으로부터 유도되고 연소 또는 가열에 의해 얻어진 에어로졸 중의 아크릴아미드의 양은 궐련당 약 1.5 μg 및 궐련당 약 2.5 μg이다.
식물, 식물의 부분, 식물 재료, 식물 제품 또는 담배 제품 또는 에어로졸 중의 니코틴의 양은 대조군 식물로부터의 식물, 식물 부분, 식물 재료, 훈연성 물품, 훈연하지 않은 제품 I 에어로졸로부터의 니코틴의 양과 실질적으로 동일할 수 있다. 예를 들어, 니코틴의 양은 대조군 식물에 존재하는 니코틴의 양의 약 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 또는 그 미만 내에 있을 수 있다. 적합하게는, 니코틴의 양은 대조군 식물에 존재하는 니코틴의 양의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 또는 그 미만 내에 있다. 니코틴의 양은 전형적으로 약 15 내지 20 mg/g 건조 중량 잎의 바이오매스이다.
한 구현예에서, 경화 후 식물, 식물의 부분, 식물 재료, 식물 제품 또는 담배 제품(예를 들면 경화된 캐스트 잎)의 아스파라긴의 양은 대조군보다 적어도 약 20% 더 낮고(예를 들면 적어도 약 22% 더 낮음) 경화 후 식물, 식물의 부분, 식물 재료, 식물 제품 또는 담배 제품(예를 들면 경화된 캐스트 잎)으로부터 유래한 에어로졸 중의 아크릴아미드의 양은 대조군보다 적어도 약 25% 더 낮다(예를 들면 적어도 약 24% 이하). 다른 구현예에서, 경화 후 식물, 식물의 부분, 식물 재료, 식물 제품 또는 담배 제품(예를 들면 경화된 캐스트 잎)의 아스파라긴의 양은 약 12 mg/g 건조 중량 이하이고 경화 후 식물, 식물의 부분, 식물 재료, 식물 제품 또는 담배 제품(예를 들면 경화된 캐스트 잎)으로부터 유래한 에어로졸 중의 아크릴아미드의 양은 약 2.5 μg/궐련 이하이다. 적합하게는, 니코틴의 수준은 대조군의 니코틴의 수준과 실질적으로 동일하다.
다른 구현예에서, 경화 후 식물, 식물의 부분, 식물 재료, 식물 제품 또는 담배 제품(예를 들면 경화된 캐스트 잎)의 아스파라긴의 양은 대조군보다 적어도 약 70% 더 낮고(예를 들면 적어도 약 66% 더 낮음) 경화 후 식물, 식물의 부분, 식물 재료, 식물 제품 또는 담배 제품으로부터 유래한 에어로졸 중의 아크릴아미드의 양은 대조군보다 적어도 약 45% 더 낮다(예를 들면 적어도 약 44% 더 낮다). 다른 구현예에서, 경화 후 식물, 식물의 부분, 식물 재료, 식물 제품 또는 담배 제품(예를 들면 경화된 캐스트 잎)의 아스파라긴의 양은 약 12 mg/g 건조 중량 이하이고 경화 후 식물, 식물의 부분, 식물 재료, 식물 제품 또는 담배 제품으로부터 유래한 에어로졸 중의 아크릴아미드의 양은 약 3 μg/궐련 이하이다. 적합하게는, 니코틴의 수준은 대조군의 니코틴의 수준과 실질적으로 동일하다.
다른 구현예에서, 경화 후 식물, 식물의 부분, 식물 재료, 식물 제품 또는 담배 제품(예를 들면 경화된 캐스트 잎)의 아스파라긴의 양은 대조군보다 적어도 약 90% 더 낮고(예를 들면 적어도 약 88% 더 낮음) 경화 후 식물, 식물의 부분, 식물 재료, 식물 제품 또는 담배 제품으로부터 유래한 에어로졸 중의 아크릴아미드의 양은 대조군보다 적어도 약 70% 더 낮다. 다른 구현예에서, 경화 후 식물, 식물의 부분, 식물 재료, 식물 제품 또는 담배 제품(예를 들면 경화된 캐스트 잎)의 아스파라긴의 양은 약 5 mg/g 건조 중량 이하이고 경화 후 식물, 식물의 부분, 식물 재료, 식물 제품 또는 담배 제품으로부터 유래한 에어로졸 중의 아크릴아미드의 양은 약 1.5 μg/궐련 이하이다. 적합하게는, 니코틴의 수준은 대조군의 니코틴의 수준과 실질적으로 동일하다.
다른 구현예에서, RNAi를 통한 NtASN1의 발현의 조절은 (i) 경화 또는 건조 후에 식물, 식물의 부분, 식물 재료, 식물 제품 또는 담배 제품(예를 들면 경화된 캐스트 잎)의 아스파라긴의 양을 24% 내지 약 89%(예를 들면 약 35 mg/g 내지 약 5 mg/g으로) 감소시킬 수 있고; (ii) 니코틴 수준을 대조군 식물에 존재하는 니코틴의 양(예를 들면 약 15 내지 20 mg/g 건조 중량 잎의 바이오매스)의 약 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 또는 그 미만으로 유지할 수 있으며; 및 (iii) 에어로졸 중의 아크릴아미드의 수준을 적어도 약 70% 내지 1.5 3 μg/궐련 이하로 감소시킬 수 있다. 잎 바이오매스의 양은 일반적으로 약 300 내지 400 g이다.
다른 구현예에서, RNAi를 통한 NtASN5의 발현의 조절은 (i) 경화 또는 건조 후에 식물, 식물의 부분, 식물 재료, 식물 제품 또는 담배 제품(예를 들면 경화된 캐스트 잎)의 아스파라긴의 양을 약 35% 내지 약 66%(예를 들면 약 31 mg/g 내지 약 18 mg/g으로) 감소시킬 수 있고; (ii) 니코틴 수준을 대조군 식물에 존재하는 니코틴의 양(예를 들면 약 15 내지 20 mg/g 건조 중량 잎의 바이오매스)의 약 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 또는 그 미만으로 유지할 수 있으며; 및 (iii) 에어로졸 중의 아크릴아미드의 수준을 적어도 약 44% 내지 약 3 μg/궐련 이하로 감소시킬 수 있다. 잎 바이오매스의 양은 일반적으로 약 300 내지 400 g이다.
다른 구현예에서, 돌연변이유발을 통한 NtASN1의 발현의 조절은 (i) 경화 또는 건조 후에 식물, 식물의 부분, 식물 재료, 식물 제품 또는 담배 제품(예를 들면 경화된 캐스트 잎)의 아스파라긴의 양을 약 17% 내지 약 83%(예를 들면 약 19.4 mg/g 내지 약 4.7 mg/g으로) 감소시킬 수 있고; 및 (iii) 에어로졸 중의 아크릴아미드의 수준을 적어도 약 24% 내지 약 2.5 μg/궐련 이하로 감소시킬 수 있다.
다른 구현예에서, 돌연변이유발을 통한 NtASN5의 발현의 조절은 경화 또는 건조 후에 식물, 식물의 부분, 식물 재료, 식물 제품 또는 담배 제품(예를 들면 경화된 캐스트 잎)의 아스파라긴의 양을 약 44%(예를 들면 약 14.5 mg/g으로) 감소시킬 수 있다. 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물은 예를 들면 농업에서 다른 용도를 가질 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물들은 동물 사료 또는 인간 음식 제품을 만들기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 돌연변이 식물, 비-자연 발생 식물, 또는 트랜스제닉 식물을 재배하고, 재배된 식물들로부터 종자를 채취하는 것을 포함하는 종자의 생산 방법들을 제공한다. 본원에 기재된 식물의 종자는 본 기술분야에 공지된 수단들에 의하여 유지되고 포장 재료에 의하여 포장되어 제조품을 형성할 수 있다. 종이 및 천과 같은 포장 재료들은 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 종자의 포장은 라벨, 예를 들어, 내부의 종자의 유형을 기재한 포장 재료에 고정된 태그 또는 라벨, 포장 위에 프린트된 라벨을 포함할 수 있다.
식별, 선발, 또는 교배를 위한 식물의 유전자형 검사(genotyping)를 위한 조성물, 방법 및 키트는 폴리뉴클레오티드 샘플 내 폴리뉴클레오티드(또는 본원에 기재된 그의 임의의 조합)의 존재를 감지하는 수단을 포함할 수 있다. 따라서, 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드들의 적어도 일부를 특이적으로 증폭하기 위한 하나 이상의 프라이머들과 선택적으로 하나 이상의 프로브들 및 선택적으로 증폭 또는 감지를 수행하기 위한 하나 이상의 시약을 포함하는 것으로 기술된다.
따라서, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드(들)에 대응하는 약 10 이상의 인접 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머들 또는 프로브들이 개시되어 있다. 상기 프라이머들 또는 프로브들은 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드(들)에 혼성화(예를 들어, 특이적으로 혼성화)하는 약 15, 20, 25, 30, 40, 45 또는 50 이상의 인접 뉴클레오티드들을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다. 일부 구현예들에서, 프라이머들 또는 프로브들은 유전자 식별(예를 들어, 서던(Southern) 혼성화) 또는 분리(예를 들어, 세균 콜로니 또는 박테리오파지 플라크들의 in situ 혼성화) 또는 유전자 검출(예를 들어, 핵산 증폭 또는 검출에서의 하나 이상의 증폭 프라이머들로서)에 사용될 수 있는 약 10 내지 50 인접 뉴클레오티드들, 약 10 내지 40 인접 뉴클레오티드들, 약 10 내지 30 인접 뉴클레오티드들 또는 약 15 내지 30 인접 뉴클레오티드들을 포함할 수 있다. 하나 이상의 특이적 프라이머들 또는 프로브들은 폴리뉴클레오티드(들)의 일부 또는 전체를 증폭하거나 검출하기 위하여 디자인되고 사용될 수 있다. 구체적인 예시로서, 핵산- 예를 들어 DNA 또는 RNA를 암호화하는 핵산 조각을 증폭하기 위한 중합효소 연쇄반응(PCR) 프로토콜에서 두 개의 프라이머가 사용될 수 있다. 중합효소 연쇄반응은 또한 핵산 서열에서 유래된 하나의 프라이머 및 핵산 서열의 상류 또는 하류의 서열- 예를 들어 프로모터 서열, mRNA 전구체의 3' 말단 또는 벡터로부터 유래된 서열에 혼성화하는 제2 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다. 시험관 내(in vitro) 폴리뉴클레오티드의 증폭을 위하여 유용한 열적 및 등온 검사법(thermal and isothermal technique)의 예는 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 샘플은는 본원에 기재된 식물, 식물 세포 또는 식물 재료 또는 식물, 식물 세포 또는 식물 재료로부터 유래된 담배 제품 또는 이들로부터 파생된 것일 수 있다.
추가적인 측면에서, 샘플 내의 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드(들)(또는 본원에 기재된 그의 임의의 조합)를 검출하는 방법이 또한 제공되며, (a) 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 포함하는 것으로 간주되는 샘플을 제공하는 단계; (b) 뉴클레오티드(들)의 적어도 일부를 특이적으로 검출하는 하나 이상의 프라이머들 또는 하나 이상의 프로브들과 상기 샘플을 접촉시키는 단계; 및 (c) 증폭 산물의 존재를 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 산물의 존재는 샘플 내의 폴리뉴클레오티드(들)의 존재를 나타내는 것이다. 추가적인 측면에서, 폴리뉴클레오티드(들)의 적어도 일부를 특이적으로 검출하기 위한 하나 이상의 프라이머들 또는 프로브들의 용도가 또한 제공된다. 폴리뉴클레오티드(들)의 적어도 일부를 특이적으로 검출하기 위한 하나 이상의 프라이머들 또는 프로브들을 포함하는, 폴리뉴클레오티드(들)의 적어도 일부를 검출하기 위한 키트가 또한 제공된다. 키트는 폴리뉴클레오티드 증폭-예를 들어 중합효소 연쇄반응-을 위한 시약 또는 프로브 혼성-검출 기술-예를 들어 서던 블롯, 노던 블롯, 인 시츄 혼성화, 또는 마이크로어레이를 위한 시약을 포함할 수 있다. 키트는 항체 결합-검출 기술, 예를 들어, 웨스턴 블롯, ELISA, SELDI 질량 분석기 또는 테스트 스트립을 위한 시약을 포함할 수 있다. 키트는 DNA 서열 분석을 위한 시약을 포함할 수 있다. 키트는 식물 재료, 경화되거나 건조된 식물 재료 또는 경화되거나 건조된 잎에서 적어도 아스파라긴 함량 및/또는 아크릴아미드 에어로졸 함량을 측정하기 위한 시약 및 지침을 포함할 수도 있다.
일부 구현예들에서, 키트는 기술된 방법들 하나 이상을 위한 설명을 포함할 수 있다. 기술된 키트는 유전적 동일성 측정, 계통발생학적 연구, 유전자형 검사, 하플로타이핑(haplotyping), 계통 분석 또는 식물 교배에서 특히 공우성 스코어링(co-dominant scoring)과 함께 유용할 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물, 식물 세포 또는 식물 재료의 유전자형 검사 방법을 제공한다. 유전자형 검사는 염색체 쌍의 상동체들을 구분하는 수단을 제공하며 식물 개체들 내에서 분리 개체(segregant)들을 구분하는데 사용될 수 있다. 분자 마커 방법들은 계통발생학적 연구, 작물의 변이체들 간의 유전적 연관성 분석, 체세포 교잡종 또는 잡종(cross)의 판별, 단일 유전자 특질들에 영향을 미치는 염색체 분절들의 위치 판별, 맵(map)-기반 클로닝, 및 양적 유전 연구에 사용될 수 있다. 유전자형 분석의 구체적인 방법은 증폭산물 길이 다형성(AFLP)을 포함한 모든 분자 마커 분석 기술들이 사용될 수 있다. AFLP는 뉴클레오티드 길이의 다양성에 의해 유발되는 증폭 단편들 사이의 차이의 산물이다. 따라서, 본 발명은 AFLP 분석과 같은 기술들을 이용하여 하나 이상의 유전자들 또는 핵산들의 분리(segregation) 및 이들 유전자들 또는 핵산들과 유전적으로 연결된 염색체 서열들을 이해하는 수단을 제공할 수 있다.
한 구현예에서, 본원에서 기술한 돌연변이, 트랜스제닉 및 비-자연 발생 식물의 경화되거나 건조된 식물 재료가 또한 제공된다. 예를 들어, 담뱃잎들을 경화 또는 건조하는 공정들은 당업자에게 알려져 있으며, 비제한적으로 공기 경화, 화건, 화력 경화 및 태양 경화를 포함한다. 녹색 담뱃잎들을 경화하는 공정은 본원에서 기술한 수확된 담배의 종류에 의존한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 돌연변이, 트랜스제닉 및 비-자연 발생 식물 유래 식물 재료 - 예컨대 잎, 적합하게는 경화된 식물 재료를 포함하는 담배 제품을 포함하거나 또는 본원에 기재된 방법들에 의하여 생산되는 담배 제품이 기재되어 있다. 본원에 기재된 담배 제품은 변형되지 않은 담배를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 돌연변이, 트랜스제닉 및 비-자연 발생 식물의 식물 재료, 바람직하게는 잎-예를 들어 경화되거나 건조된 잎-을 포함하는 담배 제품이 기술되어 있다. 예를 들어, 식물 재료는 담배 제품의 내부 또는 외부에 추가될 수 있으며 연소에 의하여 희망하는 향이 발산된다. 이 구현예에 따른 담배 제품은 변형되지 않은 담배 또는 변형된 담배일 수 있다. 이 구현예에 따른 담배 제품은 본원에 기재된 유전자들 외에 하나 이상의 유전자들이 변형된 돌연변이, 트랜스제닉 또는 비자연적으로 발생한 식물로부터 파생된 것일 수 있다.
본 발명은 발명을 더 구체적으로 기술하기 위하여 제공되는 하기 실시예에서 추가적으로 기술된다. 본 발명을 수행하기 위하여 현재 고려되는 바람직한 형태를 제공하는 실시예들은 설명을 위한 것으로서, 발명을 한정하기 위한 것이 아니다.
실시예
실시예 1 - 경화된 담배 잎에서 아스파라긴의 합성
담배 잎, 특히 버얼리 재배종의 잎을 경화하는 동안, 아스파라긴은 능동적으로 생성되어 경화된 잎에 존재하는 총 아미노산의 약 50%에 기여한다. 도 1에서, 동일한 현장과 곳간에서 성장되고 나란히 공기-경화된 3개의 버얼리 담배 품종의 경화된 잎에서, 주로 아스파라긴 증가로부터 유발되는, 아스파라긴 및 총 유리 아미노산의 증가가 도시된다. 놀랍게도, 아스파라긴은 경화 중에 현저하게 축적되는 단독 아미노산이다. 아스파라긴이 초기 경화 단계 중에 합성되는 것을 고려하면, 다음에 반응은 글루타민 및 아스파르테이트를 기질로서 사용하는 아스파라긴 합성효소 활성에 좌우된다. 그러나, 도 1에서, Asp 및 Gln은 아스파라긴에 비교하여 작은 증가만을 나타내며, 그로써 Gln 및 Asp의 푸울이 긴 공기-경화 과정(>2개월) 동안 달라질 가능성이 있음을 시사한다. 글루타메이트의 푸울에서는 변화가 관찰되지 않았다(데이터는 제시되지 않음).
도 2는 Gln이 경화의 처음 4일(96시간) 동안에 증가한 후 아스파라긴 축적이 개시될 때 감소하는 것을 나타낸다. 대조적으로, 아스파르테이트의 푸울은 대부분 평평하게 유지되지만, 일부 변동이 관찰될 수 있다. 임의의 특정 이론에 의해 구속되기를 바라지 않으면서, 관찰된 글루타민의 푸울은 경화의 처음 4 내지 5일 동안 아스파라긴을 생성하기 위해 아스파라긴 합성효소(들)에 대한 기질로서 작용할 수 있었다(도 3 참조).
상기에서 언급된 것과 같이, 경화 중에 관찰된 아스파라긴 축적은 노쇠-유래한 아스파라긴 합성효소의 특이적 활성으로부터 유발될 수 있었다. 일단 가열되거나 연소되면, 아스파라긴 및 환원당은 마일라드 반응을 통해 에어로졸에서 아크릴아미드를 생성할 가능성을 가진다. 양호한 상관관계가 경화된 담배 잎 또는 담배 블렌드에 축적된 아스파라긴과 에어로졸에서 측정된 아크릴아미드 사이에 존재한다(도 4 참조). 임의의 특정 이론에 의해 구속되기를 바라지 않으면서, 이것은 에어로졸 중의 아크릴아미드의 증가가 아스파라긴의 존재에 엄격하게 좌우되는 것을 시사한다. 또한, 잎 조직의 아스파라긴의 존재는 또한 도 5에서 나타낸 것과 같이, 사용된 경화 과정에 관련된다.
실시예 2 - 담배에서의 아스파라긴 합성효소 유전자
6개의 전장 아스파라긴 합성효소 유전자를 담배에서 확인하고 NtASN1-S, NtASN1-T, NtASN3-S, NtASN3-T, NtASN5-S 및 NtASN5-T으로 부른다. 흥미롭게도, 아라비돕시스는 아스파라긴 합성효소 AtASN1, AtASN2 및 AtASN3에 관련된 3개의 유전자를 가지고 토마토는 단지 2 전장 유전자(Solyc06g007180 및 Solyc04g055200)에 관련된다. 담배 게놈으로부터 추출된 게놈 서열로부터 유래한 잠재적인 단백질 서열을 사용하는 계통발생적 분석(Sierro 외, 2014)은 진화 중에 아스파라긴 합성효소의 두 그룹이 분기되는 것을 시사한다(도 6 참조). 실제로, Solyc04g055200, AtASN2 & 3을 포함하는 한 그룹은 NtASN3-S 및 NtASN3-T에 밀접하다. 이 그룹에 속하는 AtASN2의 유전자 생성물은 체관부에 위치하고 외관상으로는 녹색 조직에서 질소 동화, 분포 및 재동원에 필수적이다(Gaufichon 등, 2013 Plant Cell Environ. Feb;36(2):328-42.). 이 그룹은 클래스 II의 Dicot 하위클래스에 속한다. Solyc06g007180, AtASN1, NtASN1-S, NtASN1-T, NtASN5-S 및 NtASN5-T를 포함하는 제2 그룹은 클래스 I의 Dicot 하위클래스에 속한다(Gaufichon 등, 2010 Ann Bot. 2010 Jun;105(7):1141-57). AtASN1의 과잉발현은 꽃과 발달하는 장각과에서 아스파라긴 함량의 증가 및 종자 단백질 함량의 상승에 기여하고, 그로써 조직을 가라앉히기 위해 공급원으로부터의 아스파라긴의 증대된 수송을 입증한다. 이것은 AtASN1의 그룹이 질소 공급원의 종자로의 위치변경에 더 많이 충당되어 적절한 종자 발아 및 질소-제한 기질에 대한 종자 뿌리기의 고도의 관용이 허용되는 것을 시사한다(Lam 등, 2003 Plant Physiol. 2003 Jun;132(2):926-35).
유전자 생성물 사이의 백분율 동일성은 NtASN3-S 및 NtASN3-T가 동일하고, Solyc04g055200 및 AtASN3에 매우 밀접한(85% 동일성) 것을 나타내며, 이런 유전자 클러스터가 진화 중에 상대적으로 잘-보존되었고, 식물 조직에서 질소 동화를 유지할 가능성이 있는 것을 시사한다(상기 참조). 흥미롭게도, NtASN1-S/NtASN1-T 및 NtASN5-S/NtASN5-T의 각 N. 실베스트리스 및 N. 토멤토시포르미스 추론된 단백질 사본들은 둘 다 98%로 밀접한 고백분율의 동일성을 공유한다. 그것은 두 ASN1 및 ASN5 사본의 유전자 기능이 각 담배 조상 사이에서 보존될 가능성이 있고 토마토와 아라비돕시스에서 발견되는 것과 같이 하나의 단일 공통 조상으로부터 유도될 가능성이 있음을 시사한다. 나아가, NtASN5-S는 Solyc06g007180과 95%의 동일성을 공유하고 그것은 유사한 기능을 시사한다.
아스파라긴이 버얼리 담배의 공기-경화 과정 동안 빠르게 증가하는 것을 안다면, 경화의 초기 단계 중에 아스파라긴의 생성(도 1 및 도 2 참조)은 단백질 또는 폴리펩티드의 단백질 가수분해성 분해로부터 직접적으로 유발되지 않지만 경화 중에 드노보 합성으로부터 유발될 수 있다. 그렇다면, 그리고 상기 언급한 것과 같이, 아스파라긴 합성은 활성 아스파라긴 합성효소(들)로부터만 비롯될 수 있다.
경화 중에 아스파라긴 합성효소 유전자들의 발현을 측정하기 위하여, 톱어레이 아피메트릭스 유전자 칩(Martin 등 BMC Genomics 2012, 13:674) 을 사용하여 마이크로어레이 분석으로부터 수집된 데이터를 분석한다. 잎 RNA를 경화의 처음 96시간 동안 시간-경과 방식으로 분리한다. 6개의 ASN 코딩 서열(ASN1-T에 대해 NtPMIa1g47375e1_st; ASN1-S에 대해 NtPMIa1g31395e1_st; ASN5-T에 대해 NtPMIa1g25255e1_st; ASN5-S에 대해 NtPMIa1g57337e1_st; ASN3-T에 대해 NtPMIa1g152348e1_st 및 ASN3-S에 대해 NtPMIa1g121582e1_st)과 매칭되는 특이적 프로브들(100% 동일성)을 확인한다. RNA 제조를 위해, 잎이 공기-경화 곳간에서 매달려 있는 순간을 시간 0으로 하여, 잎을 현장에서 직접(-4시간) Stella(CH-버얼리)의 중간-줄기 위치에서 수집한다. ASN3-S 및 ASN3-T 만이 공기-경화 중에 버얼리 잎에서 빈약하게 발현된다. 대조적으로, ASN1-S, ASN1-T 및 ASN5-S는 경화(노쇠, 갈변화 단계)가 시작될 때 고도로 발현되는 반면, ASN5-T는 수득 직후에 상향-조절된 후 경화의 처음 96시간 동안 일정하게 감소한다(도 7).
특히 고도의 서열 상동성을 공유하는 유전자들에 대해 마이크로어레이 분석에서 일어날 수 있는 임의의 교차-혼성화를 조사하기 위하여, ASN1-S/T 및 ASN5-S/T의 발현을 RNAseq 기술을 사용하여 분석한다. 데이터를 도 8에 제시한다. 스위스 버얼리 "Stella"(도 8)에서, RNA-seq 데이터는 ASN5-T가 다른 3개의 ASN1/5 사본들보다 경화 중에 덜 유도되고(도 7 참조), ASN1-T가 공기-경화의 처음 2일 후에 가장 집중적으로 발현된 유전자임을 보여준다. 그러한 ASN 유전자 활성은 오븐에서 고전적으로 경화된 스위스 브라이트 버지니아 "ITB683"에서 유사한 강도로 발생하지 않는다. 그런 담배에서 ASN1-S/T 및 ASN5-S/T의 발현은 48시간 경화 후에 낮게 유지된다. 두 담배에서 모두, ASN3S/T 발현은 경화에 의해 유도되지 않고(도 8 c&d), 그러므로 도 7에 제시된 아피메트릭스 데이터를 확인한다.
버얼리 잎의 경화의 초기 단계 중에 ASN 유전자 유도의 왕성함을 시험하기 위하여, 스위스 현장에서 동시에 성장된(2013년도) 4개의 상이한 버얼리 목록(BU1-4: Saplack, BanketA1, Stella 및 TN90)으로부터 곳간에서 60시간 경화 전과 후에 RNA를 분리한다. RNA의 분리 시점은, TN90이 스위스에서 갈변화가 시작되는 데 더 많은 시간이 필요하기 때문에 60시간으로 연장한다. 발현 데이터(도 9)는 버얼리 잎 ASN1-T 및 ASN5-T가 공기-경화 중에 각각 가장 많이 및 가장 적게 발현된 ASN 유전자들이고(BU2의 ASN1-T 제외), 그러므로 도 8에 제시한 데이터를 확인한다. 전사물 ASN1-S 및 ASN5-S 는 상이한 버얼리 목록의 잎들에서 경화의 초기 단계 중에 일정하게 그리고 계속해서 발현된다. 도 9b는 N. 토멘토시포르미스 및 N. 실베스트리스로부터 비롯되는 두 ASN3 사본이 둘 다 경화 중에 유도되지 않는 것을 확인해주고, 그로써 AtASN2에 더 가까운(도 6 참조) 이들 두 사본이 아스파라긴의 생리적 푸울을 유지하기 위해 식물생장과 관련된 식물 조직에서 더 많은 기초적 기능을 할 가능성이 있음을 간접적으로 확인해준다.
개화 단계에서 및 현장에서 성장된 TN90 식물로부터 수집한 8개의 조직에서 상응하는 전사물의 분석은 ASN5-T가 잎에서보다 꽃에서 더 활성이고, ASN5-T RNA 사본들이 미성숙한 꽃, 꽃?? 및 꽃받침에서 특히 발견되는 것을 시사한다(도 10, 좌측 패널 참조). 잎에서 발현되는 것에 더불어, ASN1-T 및 ASN1-S는 또한 아마도, 이종상동성 유전자 AtASN1에 대해 아라비돕시스에서 이미 기술된 기능인 (Lam 등, 2003 Plant Physiol. 2003 Jun;132(2):926-35) 질산염을 동화시키기 위하여 꽃잎에서 강력하게 발현된다(도 6 참조). ASN3-S/T는 이들 8개의 조직 전부에서 낮은 기초 발현을 나타낸다(도 10, 우측 패널 참조).
실시예 3 - ASN1 및 ASN5 RNAi TN90e3 주
버얼리 담배 식물에서 ASN1-S/ASN1-T 및 ASN5-S/ASN5-T 사본의 침묵을, 그것이 경화된 버얼리 잎에서 아스파라긴을 감소시키는 데 기여하는지의 여부를 측정하기 위해 조사한다. 특이적 DNA 단편들을 강력한 구성성 MMV(미라빌리스 모자이크 바이러스) 프로모터 또는 노쇠 프로모터 E4(아스파라긴 합성효소) 사이에서 클론한다. ASN 유전자 단편을 MMV 또는 E4와 아그로박테리움 튜메파시엔스의 노팔린 합성효소 유전자의 3' nos 터미네이터 서열(Cheng 등, 2003 In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant, 39 595 604) 사이에 양 옆에 둔다. 이 연구에서 사용한 구성체의 다이아그램을 도 22에 도시한다. 버얼리 담배 주 TN90e4e5e10(Zyvert)을 표준 아그로박테리움-매개 형질전환 프로토콜을 사용하여 5개의 구성체 각각으로 개별적으로 형질전환시킨다. TN90e4e5e10(Zyvert)는 노르니코틴 생성을 방지하기 위하여, 담배의 주요 아스파라긴 합성효소 유전자(Lewis 외, 2010)인 CYP82E4, CYP82E5v2 및 CYP82E10에서 녹아웃 돌연변이들을 함유한 에틸메탄 설포네이트(EMA) 돌연변이유발된 버얼리 집단으로부터의 선택을 나타낸다. 그런 배경 주를 사용하는 것은 앞으로의 TSNA 데이터를 해석할 때 잠재적인 복합현상을 피할 수 있다.
각각의 이식유전자를 높은 수준으로 발현하는 식물의 선택을 가능하게 하기 위해, 각각의 구성체에 대해 적어도 10개의 독립적인 T0 식물을 qPCR에 의해 분석한다. 종자를 최고 수준의 ASN 침묵 사건을 나타내는 각 구성체의 3개의 T0 주로부터 수득한다. RNAi 유전자 단편(들)이 유전된 T1 자손이 효과적인 유전자 침묵을 수행하는지의 여부를 시험하기 위하여, RNA를 독립적으로 형질전환 사건이 일어난 선택된 4개의 식물로부터 추출하여 앞으로의 필드 시험(2016)에 활용할 수 있는 T2 종자를 얻는다. TN90e4e5e10(Zyvert) 대조군 주를 배경으로서 사용하여 형질전환의 효율을 비교한다.
3개의 독립적인 형질전환 사건을 ASN1 및 ASN5 전사물의 수준을 기준으로 T0 ASN1-RNAi 및 ASN5-RNAi 식물에서 선택한다. ASN1-RNAi 식물을 MMV 프로모터 또는 E4 프로모터 중 어느 하나의 제어 하에 ASN1-T 및 ASN1-S 사본 둘 다를 침묵시키기 위해 생성하고, ASN5-RNAi 식물을 MMV 프로모터 또는 E4 프로모터 중 어느 하나의 제어 하에 ASN5-T 및 ASN5-S 사본 둘 다를 침묵시키기 위해 생성한다. 각 형질전환 사건에 대해 15개의 식물을 카나마이신에 대해 선택하고 온실에서 성장시킨다. 성숙할 때, 중간-바닥 위치에서 4개의 잎을 각 식물로부터 수집하여 7주 동안 공기-경화를 수행한다.
아미노산 및 니코틴의 농도를 HPLC-MS에 의해 측정한다: 곱게 간 담배의 부분표본(~30 mg)을 에탄올-물(1:1; 6 mL)로 45분 동안 50℃에서 추출한다. 원심분리한 추출물을 10-배로 희석한다. 액체 크로마토그래피를 이용한 분리를 아미드 칼럼(Waters Acquity BEH amide, 2.1 x 150 mm, 1.7 μm) 상에서 45℃에서 수행하는데, 물+0.25% 포름산 중의 2 mM 암모늄 포르메이트(용출액 A) 및 아세토니트릴+0.1% 포름산(용출액 B)의 구배로, 용출 구배(0분 - 10% A, 0.5분 - 10% A, 4분 - 60% A, 4.5분 - 60% A, 4.6분 - 10% A, 6.8분 - 10% A; 유량 0.5 ml/분)를 적용하여 용출한다. 아미노산의 질량 분광분석적 검출을 위해 Q Exactive 기기(Thermo Scientific)를 전체 스캔 질량 스펙트럼을 얻게 되는 포지티브 전기분무 모드로 사용한다. 추출물 중의 니코틴 농도를 광다이오드 UV/VIS 검출기의 260 nm 자취에서 그것의 피크 면적으로부터 계산한다.
아스파라긴을 경화된 잎 잎몸에서 측정한다. 갈변화 단계 중에 3일 경화 후에, 잎몸의 펀치를 추출하고, RNA를 각 식물로부터 분리하고 qPCR을 수행한다. 도 11a에서, ASN1 RNAi 유전자 단편은 MMV 및 E4 프로모터 둘 다의 제어 하에 경화된 잎 샘플에서 아스파라긴 수준, 상이한 형질전환 사건에서 달라지는 아스파라긴의 양에 영향을 미치는 것으로 나타난다. E284-4는 24%의 아스파라긴의 감소를 나타낸 반면, E284-6은 나란히 성장된 배경 식물인 TN90e4e5e10(Zyvert)에 비교하여 89%의 아스파라긴 감소를 나타냈다. 아스파라긴 함량은 두 프로모터 MMV 또는 E4에 대한 3일 경화 후에 측정된 ASN1 RNA의 수준과 상관되고(도 11b), 그것은 아스파라긴이 경화 중에 합성되며 ASN1-T 및/또는 ASN1-S 사본이 경화의 초기 단계 중에 아스파라긴 생성에 관여하는 것을 확인해준다. MMV와 같은 두 구성성 프로모터 및 E4와 같은 노쇠 프로모터는 ASN1을 침묵시키기 위해 활성이다. E4 프로모터의 효율은 ASN1 유전자가 주로 경화된 잎에서 아스파라긴 생성에 기여하는 노쇠(갈변화) 중에 활성이어서, 공급원 잎으로부터 종자로 질소의 재분포의 가능성이 있는 것을 입증한다. 3일 경화 후에, 전사 분석과 나란히 아스파라긴을 또한 측정하고, 이미 6개의 시험된 주에 대해 유사한 아스파라긴 감소 프로파일이 보인 것처럼, 비록 이 아미노산의 단지 약 1/3만이 이 경화 기간 후에 합성되었지만(대조군 TN90e4e5e10(Zyvert) 중의16.4 mg/g, 데이터는 제시하지 않음), 이 아스파라긴의 피크는 잎 수득 후 9 내지 10일의 공기-경화 후에 최대이다(도 2 참조).
아스파라긴 합성효소는 잎에서 질산염 저장소로부터 동화된 질소 형태로서 암모니아를 고정시키는 제1 아미노산인 글루타민(Gln)으로부터 아민기를 아스파르테이트(Asp)에 전달한다. 이 활성으로부터 ATP를 사용하여, 아스파라긴(Asn) 및 글루타메이트(Glu, 또한 도 3 참조)의 형성을 초래한다. 그 결과 본 발명자들은 ASN1을 침묵시키는 것이 Gln 및 Asp의 증가 및 Glu의 감소를 초래할 것이라고 추측할 수 있다.
그러므로 동일한 샘플에서 Gln, Asp, Glu 및 니코틴의 양을 또한 분석한다. 아스파라긴의 강력한 감소를 나타내는 샘플, 즉 E281-6 및 E282-1에서 Gln의 부수적인 증가를 볼 수 있고 반대로 더 낮은 Gln 양은 낮은 아스파라긴을 나타내는 샘플, 즉 E282-7에서 볼 수 있다(도 12a). 두 Gln 및 아스파라긴에 대해, ASN1 유전자의 침묵으로부터 유발되는 아미노산 균형은 경화된 잎 내에서 반대 방법으로 변형된다. 유사한 효과가 또한 Asp 및 Glu에 대해 관찰되지만, Gln에 대해서보다 덜 현저하다. 두 Asp 및 Glu는 유사한 Gln 프로파일을 나타내는 모든 형질전환된 주에서 증가(~1.5 내지 3배)를 나타낸다(E282-7에서 Asp는 제외됨). 아스파라긴 합성효소 활성을 보면(도 3 참조), Glu의 증가는 예상되지 않았다.
니코틴 함량은 MMV 구성체에서나 E4 구성체에서 ASN1 침묵의 침묵에 의해 영향을 받지 않으며, 그것은 ASN1-S 및/또는 ASN1-T의 활성은 니코틴 합성 경로에 관련되지 않고 초기 노쇠 프로그램 중에 수득-후 잎 성숙에 제한되는 것을 확인해준다.
유사한 실험을 RNAi 트랜스제닉 주를 사용하여 ASN5-S 및 ASN5-T를 침묵시키기 위해 수행한다. 데이터는 ASN5 RNAi 단편이 구성성 프로모터 MMV의 제어 하에 발현되고 E4 프로모터의 제어하에서는 발현되지 않거나 약간만 발현될 때 아스파라긴이 특히 두 주에서 효과적으로 감소된 것을 나타낸다(도 13a). 흥미롭게도, 데이터는 3일의 경화 후에 qPCR에 의해 추정된 ASN5 mRNA의 수준과 단지 부분적으로만 상관된다(도 13b). 먼저, E4 프로모터의 제어하에 형질전환체 사건은 MMV의 제어하에서보다 더 풍부한 ASN5 mRNA를 나타내고, 그것은 E4 프로모터가 ASN5를 침묵시키는 것에 대해 MMV 프로모터보다 덜 효과적인 것을 확인해주며, 그것은 아마도 ASN5 단백질 합성 프로그램이 잎 수득 후 ASN1 단백질의 생성보다 더 빠르게 더 먼저 일어나는 것을 가리킨다(도 7). 특정 주에서, 아스파라긴의 백분율은, 예를 들면 E303-14를 E303-16과 또는 E305-5를 E305-15와 비교하여, mRNA 수준과 상관되지 않는다. 이것은 ASN5-T 사본이 경화된 잎에 존재하지 않거나 약간만 존재하지만(도 9) 오히려 개화 조직 내에 존재하는 활성에 관여한다는 사실에 기인할 수 있다(도 10). 3일의 경화 후에, 아스파라긴을 또한 측정하고, ASN1 트랜스제닉 주(상기 본문 참조)에 대해서와 같이 6개의 주에 대한 유사한 아스파라긴 감소 프로파일을 나타낸다(데이터는 제시하지 않음).
Gln, Asp, Glu 및 니코틴의 양을 또한 ASN5-RNAi 주에서 측정한다(도 14). ASN1-RNAi 주에서, Gln의 부수적인 증가를, 아스파라긴의 강력한 감소를 보이는 샘플, 즉 E303-1 및 E303-16에서 볼 수 있고, 반대로 더 낮은 Gln 양은 더 높은 아스파라긴 함량을 나타내는 샘플, 즉 E303-14 및 E-305-16에서 볼 수 있다. E305-5는 대조군 및 자매 주인 E-305-15 및 E305-16에 비교하여 10% 미만의 아스파라긴 감소 및 증가된 Gln, Asp 및 Glu를 나타내고, 그것은 특정 경우에 E4 프로모터가 ASN5 사본을 부분적으로 침묵시킬 수 있음을 시사한다. E303-1 주는 대조군에 비교하여 최고 mRNA 감소(도 13b), 강력한 아스파라긴 감소(66%, 도 13a) 및 관련된 Gln(14배), Asp(3배) 및 Glu(3배) 증가를 나타낸다(도 14a, b 및 c). 그러므로, ASN1-RNAi 식물에 대해서와 같이, ASN5를 침묵시키는 것은 아스파라긴의 현저한 감소 및 Gln, Asp 및 Glu의 증가를 초래한다. 니코틴 수준은 ASN1-RNAi 주에 대해 관찰된 것과 같이, ASN5-RNAi 식물에서 달라지지 않고(도 14d), 그것은 반응이 니코틴 경로와 단절되지 않았음을 시사한다.
각 형질전환 사건 및 대조군 주에서 중간-줄기 위치의 잎의 무게를 측정한다. 데이터는 ASN1- 및 ASN5-RNAi 식물들이 온실과 같은 제어된 환경에서 성장될 때 잎 바이오매스의 주요 변화를 보이지 않는다(도 15).
결론적으로, 두 ASN1 및 ASN5 유전자 패밀리는 상응하는 MMV RNAi 주에서 침묵되고, 그로써 ASN1 및 ASN5 유전자 사본이 둘 다 버얼리 경화 중에 아스파라긴의 합성에 관여하는 것을 가리킨다.
두 ASN1 및 ASN5 전사물 패밀리가 MMV 프로모터 하에서 제어된 상응하는 ASN1-RNAi 및 ASN5-RNAi 식물에서 침묵하는지의 여부를 측정하기 위하여 교차-qPCR 분석을 수행한다. 표 2에서, 데이터는 ASN5-RNAi 식물에서 두 ASN1 및 ASN5 전사물이 침묵되는 것을 나타내지만, 이것은 ASN1-RNAi 식물에서, 특히 ASN1-1 및 ASN1-2 주에 대해 덜 분명하다. 이런 관찰은 두 ASN5 및 ASN1 (S&T) 유전자가 매우 유사하고, 동일한 유전자 클러스터에 속한다는 사실에 기인할 가능성이 있다(도 6). 그러나 이것은 또한 경화된 잎에서 아스파라긴 합성을 변경시키기 위해 ASN1 유전자 클러스터를 단지 비활성화시키는 것만으로도 충분한 것을 가리킬 수 있다.
버얼리 경화 중에 CYP82E4의 발현의 분석은 E4 프로모터가 단지 48시간 경화 후에 완전히 활성이 되는 것을 나타내고, 그로써 E4 프로모터의 제어 하에 모든 트랜스제닉 구성체 또는 유전자 단편이 초기 경화 단계(>48시간)에서 후기에 발현되는 것을 시사한다. 그러므로, 도 11 및 도 13에 제시된 데이터를 기반으로, ASN1 침묵이 MMV 및 E4 프로모터에 의해 동등하게 구동될 수 있기 때문에, ASN1-T 및 -S가 경화 과정의 처음 단계 동안 후기에 활성화되는 것으로 예상된다. E4 프로모터는 ASN5의 침묵을 약하게 제어하고, 그로써 ASN1 유전자가 유래한 잎-노쇠 프로그램에 관련된 사건들의 순서에 의해 제어되는 것을 시사한다.
실시예 4 - ASN 변종(EMS 돌연변이) 주
두 ASN1-S 및 -T 사본 및 두 ASN5-S 및 -T 사본에 대한 ASN EMS-돌연변이들을 확인한다. 특이적 돌연변이들을 예상된 엑손 서열에서의 게놈 DNA에 대해 스크리닝한다. 3개의 정지 돌연변이를 ASN5-T 사본이 아닌, ASN1-S (ASN1-S_W156*), ASN1-T (ASN1-T_W156*) 및 ASN5-S (ASN5-S_Q66*) 사본에서 확인한다. 정지 돌연변이가 ASN5-T에서 확인되지 않기 때문에, 정지 코돈을 대체할 수 있는 잠재적 후보로서 0.0004의 SIFT 득점을 나타내는 비-정지 돌연변이(ASN5-T_G59D)를 선택한다.
M2 부모로부터, 돌연변이를 은닉하는(변종) 또는 선택된 유전자에서 돌연변이되지 않은(WT 외부-분리개체) 자손 종자를 유전자형 분류하고, 확인하고 현장에 심는다. 각 선택된 변종의 10개의 식물을 현장에서의 가변성(즉 비-상동성 질산염 발효 및 토양 변화)의 임의의 영향을 방지하기 위하여 개별적인 플롯으로 그의 상응하는 WT 외부-분리개체의 10개의 식물 옆에서 성장시킨다. 4개의 중간-바닥 줄기 잎을 수득 시점에 수집하고 2개월 동안 공기-경화된 곳간에서 줄에 매달아 놓는다. 잎을 가늘게 자르고 잎몸을 미세한 분말로 간다. 아스파라긴(mg/g)을 각 잎 푸울에서 측정한다. 비록 약간의 변화가 플롯별 가변성으로 인해 관찰될 수 있지만, ASN5-T_G59D에 대해서가 아니라, ASN1-S_W156*, ASN1-T_W156* 및 ASN5-S_Q66*에서 그의 상응하는 WT 분리개체에 비교하여 아스파라긴 감소에 대한 분명한 경향성을 볼 수 있다(표 3 참조).
아스파라긴 감소의 백분율을 도 17에 도시한다. 가장 강력한 감소는 ASN1-T_W156*에 대해 관찰되고(83%), 다음에 ASN5-S_Q66*에 대해(44%), 마지막으로 ASN1-S_W156*에 대해(17%) 관찰된다. ASN5-T_G59D 주는 아스파라긴의 약간의 증가를 보였다. ASN 변종들에서 아스파라긴의 함량은 경화 중에 유전자 활성화 수준과 상관된다. 실제로, ASN1-T는 경화 중에 ASN5-S보다, 그리고 48시간 및 60시간 경화 후에 ASN1-S보다 많이 발현된다(도 8 및 도 9 참조). 그러나 이런 관찰은 여전히 주의를 기울여야 하는데, 현장에서 단지 하나의 플롯으로부터 유발되는 ASN1-T_W156* 및 ASN1-T_W156*과 이 주에 대한 WT 외부-분리개체 식물 둘 다가 이 현장 실험에서 바이오매스의 강력한 감소를 나타냈기 때문이다(도 18 참조).
ASN1-T_W156* 및 그것의 상응하는 WT 외부-분리개체 ASN1-T_WT* 둘 다에서 바이오매스의 감소는 두 변종 주에서 여전히 존재하는 다른 돌연변이(들)로부터 유발될 가능성이 있다. 실제로, ASN1/5-RNAi 주를 사용한 트랜스제닉 실험은 ASN1-T 및 임의의 다른 ASN1 및 ASN5 사본들이 식물 높이 및 바이오매스 표현형에 아무런 영향을 미치지 않는 것을 가리키는 경향이 있다(도 15 참조). 배경과 교배로 다양한 AA37 및 후속되는 식물 자가수정은 본 발명자들이 ASN1-T 정지 돌연변이가 식물 크기에 미치는 임의의 효과에 대해 결론을 내릴 수 있게 해줄 것이다. 도 18은 또한 ASN1-S 및 ASN5-S에서의 정지 돌연변이가 식물 바이오매스에 아무런 영향을 미치지 않는 것을 보여준다. 이것은 또한 꽃과 같이(도 10 참조), 다른 조직에 우선적으로 관여하는 발현 데이터에 따른(도 7 및 도 8) 가능성이 있는 ASN5-T에서의 G59D 점 돌연변이에 대해 타당하다.
제2 현장 시험을 ASN1-T에 대한 유사한 정지 돌연변이(10개의 외부-분리개체 식물 및 10개의 정지 돌연변이 식물을 포함하여 6 플롯), ASN1-S(10개의 외부-분리개체 식물 및 10개의 정지 돌연변이 식물을 포함하여 6 플롯) 및 ASN5-S(10개의 외부-분리개체 식물 및 10개의 정지 돌연변이 식물을 포함하여 9 플롯)에 대한 유사한 정지 돌연변이로 수행한다. 잎 경화(중간-줄기 위치에 있는 6개의 잎) 후에, ASN1-T 정지 돌연변이 식물은 잎 잎몸에서 외부-분리개체에 비교하여 19%의 아스파라긴 감소를 나타내고, ASN1-S 정지 돌연변이 식물은 잎 잎몸에서 외부-분리개체에 비교하여 23%의 아스파라긴 감소를 나타내며, 마지막으로, ASN5-S 정지 돌연변이 식물은 잎 잎몸에서 외부-분리개체에 비교하여 약 10%의 아스파라긴 감소를 나타낸다. 이들 결과는 표 3에서 나타낸 앞선 결과들을 확인해주며, 선택된 중단-돌연변이가 경화된 잎에서 아스파라긴을 감소시키는 데 효과적인 것을 입증한다. ASN-RNAi 주로부터의 아스파라긴 데이터와 비교할 때, 3개의 정지 돌연변이 ASN1-T_W156*, ASN1-S_W156* 및 ASN5-S_Q66*의 조합은 경화된 잎의 잎몸에서 유사한 아스파라긴 감소를 제공해야 한다.
본 발명자들은 이러한 데이터로부터 ASN1-S, ASN1-T 및 ASN5-S가 버얼리 담배의 잎 공기-경화 중에 아스파라긴의 형성에 관여한다고 결론내린다.
실시예 5 - ASN 트랜스제닉 주에서 아스파라긴 감소가 아크릴아미드 형성에 미치는 영향
트랜스제닉 주 MMV-ASN1-RNAi 주(E281-6 주 및 그것의 각각의 대조군, 도 11 참조) 및 MMV-ASN5-RNAi 주(E303-1 주 및 그것의 각각의 대조군, 도 13 참조)의 잎으로부터의 잎몸 분말을 50%의 버지니아 담배 분말과 섞어서 제조 명세를 따라 슬러리 및 캐스트 잎 물질을 만든다. 에어로졸-형성 물품을 제조하였고 그것을 가열함으로써 생성된 에어로졸에 대해 분석을 수행하여(헬스 캐나다 레짐) 아크릴아미드를 측정하였다. 데이터를 도 19에 나타낸다. 70% 아크릴아미드의 감소로 전달된 ASNA1-RNAi 주에서 88% 감소를 나타낸 아스파라긴을 상응하는 담배 대조군에 비교하였다. 유사한 데이터를 제2 트랜스제닉 주를 사용하여 얻어서, 에어로졸에서 40%의 아크릴아미드 감소에 대해 ASN5-RNAi 주의 잎에서 66% 감소를 나타내는 아스파라긴을 담배 대조군에 비교하였다.
아크릴아미드는 흡연자에 대한 생물학적 마커이다(Naufal 등, 2011). 아크릴아미드의 생성을 또한 연소성 궐련 연기에서 분석한다(도 20). 연소성 궐련을 다음의 과정을 사용하여 ASN1-RNAi 식물의 중간-줄기 경화된 잎으로부터 제조한다. 담배 잎을 22℃ 및 60% 주변 습도에서 조건화한다. 절단-충전제를 중간-립(rib) 제거 후에 잎의 잎몸으로부터 제조한다. 궐련을 손으로 만들고, 전기 궐련 분사기계 "Powermatic 2"로 표준 궐련 튜브를 사용하여 충전한다. 궐련에 삽입한 절단-충전제의 무게를 다르게 하여(800 mg 주변에서) 120 내지 140 mm 워터 게이지에 상응하는 인발 저항성(Resistance To Draw)을 얻는다. 다음에 각 궐련을 단단하게 하기 위해(경도) 손으로 제어한다. 일단 절단-충전제 세트에 대해 매개변수들이 결정되면, 그것들을 만들어진 일련의 각 궐련 스틱(샘플당 200)에 대해 유지한다.
제어된 시설에서, 담배 절단-충전제 내의 아스파라긴의 함량(도 20)은 캐스트-잎에 대한 블렌드 분말에서 측정된 아스파라긴의 함량(도 19 참조)과 비교할만 하였고 도 11에서 측정된 양에 비해 약 10% 낮았다. 그런 차이는 수득 시간에 잎 줄기 위치, 버얼리 경화 후에 상부 줄기 잎보다 낮은 줄기 잎에 더 풍부한 아스파라긴에 기인한다. 그러나, 야생형 식물에 비교하여 ASN-RNAi의 아스파라긴의 감소는 도 11 및 도 19에 제시된 데이터와 유사하였다. 흥미롭게도, 아크릴아미드의 감소는 에어로졸 생성 물품 에어로졸에서(70%)보다 연소성 궐련 연기에서 덜 효과적이었고(57%), 그것은 아마도 아스파라긴의 형성을 유도하는 마일라드 반응이 연소되거나 다 타버린 담배 제품보다 가열된 제품에서 더 효과적인 것을 나타낸다.
아크릴아미드의 감소는 또한 ASN1-S 정지 돌연변이로부터의 잎몸으로 만들어진 에어로졸 형성 물품으로부터의 에어로졸에서 효과적이다(도 21). 그러나, 이 경우에 이런 감소는 예를 들어 ASN1-T에 비교하여(도 17에 도시된 데이터를 기반으로) 경화된 잎에서 아스파라긴 합성에 대한 기여자로서 ASN1-S 단독의 제한된 영향으로 인해 제한된다. 데이터는 두 ASN-RNAi 트랜스제닉 주 및 ASN 돌연변이 주에서, 경화된 잎몸의 아스파라긴의 감소가 가열에 의해 생성된 연소성 궐련 연기 및 에어로졸 중의 아크릴아미드의 후속적인 감소와 동시에 일어나는 것을 나타낸다. 달리 말하면, ASN1 및 ASN5 유전자 사본을 녹-아웃 시키는 것은 담배 매트릭스 내에서 아스파라긴의 감소 및 가열에 의해 생성된 연소성 궐련 연기 및 에어로졸에서 아크릴아미드 형성의 감소를 초래한다.
참고문헌
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추가 측면은 아스파라긴 합성효소의 감소된 발현 또는 활성을 가지는 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 식물 또는 그의 부분에 관한 것이고, 상기 아스파라긴 합성효소는 (i) 서열번호 1 또는 서열번호 3 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7에 대해 적어도 72%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 폴리뉴클레오티드 서열; 또는 (ii) (i)에서 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드; 또는 (iii) 서열번호 2 또는 서열번호 4 또는 서열번호 6 또는 서열번호 8에 대해 적어도 78%의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되며; 여기서 (i), (ii) 또는 (iii)에서 기재된 아스파라긴 합성효소의 발현 또는 활성은 대조군 식물에 비교하여 감소된다.
추가 측면은 대조군 식물로부터의 식물 재료에 비교하여 감소된 수준의 아스파라긴 및 식물 재료로부터 유래한 에어로졸 중의 감소된 수준의 아크릴아미드를 가진 식물 재료의 제조 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 (a) 아스파라긴 합성효소를 암호화하고 서열번호 1 또는 서열번호 3 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7에 대해 적어도 72% 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 또는 그것의 부분을 제공하는 단계; (b) 식물 또는 그것의 부분에서 폴리뉴클레오티드의 발현 또는 그로써 암호화된 단백질의 활성을 감소시키는 단계; (c) 식물 또는 그것의 부분으로부터 식물 재료를 수확하는 단계; (d) 식물 재료를 건조 또는 경화시키는 단계; (e) 선택적으로, 식물 또는 그것의 부분에서 아스파라긴의 수준을 측정하고 및/또는 식물 또는 그것의 부분으로부터 유래한 에어로졸 중의 아크릴아미드의 수준을 측정하는 단계; 및 (f) 상기 식물 재료의 아스파라긴의 감소된 수준 및 상기 식물 재료로부터 유래한 에어로졸 중의 아크릴아미드의 감소된 수준을 가지는 경화되거나 건조된 식물 재료를 얻는 단계를 포함하고, 적합하게는, 니코틴 수준은 대조군 식물의 니코틴 수준과 실질적으로 동일하며; 적합하게는, 글루타민, 아스파르트산 및 글루탐산의 형성은 대조군 식물의 경화되거나 건조된 잎에 비교하여 증가된다.
본원에 인용된 또는 설명된 간행물은 이전에 본 출원의 출원일에 앞서 공개된 관련 정보를 제공한다. 본원에서 언급된 것은 그러한 공개에 선행하지 않음을 발명자가 인정하는 것으로 해석되지 않는다. 상기 명세서에서 언급된 모든 간행물은 본원에 참조로 인용된다. 발명의 다양한 수정 및 변형은 발명의 범위 및 사상에서 벗어나지 않으며 당 기술분야의 숙련자에게 명백할 것이다. 발명이 특정한 선호되는 구현예들과 관련하여 설명되었지만, 청구범위에 기재된 발명은 이러한 특정 구현예들에 부당하게 한정되지 않아야 하는 것이 이해되어야 한다. 실제로, 세포적, 분자적 및 식물 생물학 또는 관련 분야의 본 기술분야의 숙련자에게 명백한 것을 포함하는, 본원 발명을 실시하기 위하여 기술된 모드들의 다양한 변형들이 이하의 청구범위에 포함된다.
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SEQUENCE LISTING <110> Philip Morris Products S.A. <120> REDUCTION OF ASPARAGINE CONTENT IN PLANTS <130> P10251EP <140> 15184528.6 <141> 2015-09-09 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3646 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 1 atgtgcggga tcttggctgt tttgggttgt tctgatgatt ctcaggccaa aagggttcgt 60 gttctcgagc tctctcgcag gtaaattata tttcccttct tttctgtatt gttaatgtta 120 ttgtgttgcg ttattatatt gattcttttt atgagaaagt agtttcctga acgtttgcat 180 tttagaataa aagaagacta aagcttaaga tagattatat atttagatat tcttgacgtg 240 gacctatatc ttagattcac aatataattt tctcggacca actgttttag catgacttgt 300 aaatgatgtt gatatgaaaa gctgtgattt aattagtagg agtaattcat ttccatgtta 360 caattactta tctttctcct ccttgtgttc ttgccactgc tagaggcaga tctataattc 420 ctacttagag tattgaacac attgtacttt tgaaattgta agtgtgcagt ttaatatttg 480 ttaaaatttt gaaggttttt ttaattacat gtatatcgtg acgttatata gcctctctac 540 ccgcataagg taggggtaat gtctgcgtac aaataggctg atttcactct gtgttcagtt 600 gaatcaatat atgcggcatc caccactgtt tgcaaatgca tgggaatgga 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Arg Ile Glu Lys Trp Val Leu Arg Asn Ala 420 425 430 Phe Asp Asp Asp Gln Asn Pro Tyr Leu Pro Lys His Ile Leu Tyr Arg 435 440 445 Gln Lys Glu Gln Phe Ser Asp Gly Val Gly Tyr Ser Trp Ile Asp Gly 450 455 460 Leu Lys Asp His Ala Ser Arg Leu Val Ser Asp Ser Met Leu Ala Asn 465 470 475 480 Ala Ser Phe Val Tyr Pro His Asn Thr Pro Thr Thr Lys Glu Gly Tyr 485 490 495 Tyr Tyr Arg Thr Ile Phe Glu Arg Tyr Phe Pro Lys Asn Ala Ala Arg 500 505 510 Glu Thr Val Pro Gly Gly Pro Ser Val Ala Cys Ser Thr Ala Lys Ala 515 520 525 Val Glu Trp Asp Ala Ala Trp Ser Lys Asn Leu Asp Pro Ser Gly Arg 530 535 540 Ala Ala Leu Gly Val His Ala Ala Ala Tyr Glu Asp Ala Ser Glu Val 545 550 555 560 Lys Thr Thr Val Ala Thr Asp Thr Pro Gln Lys Leu Glu Val Asp Lys 565 570 575 Ala Ala Val Ala Val 580 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 tcacatatat tccctcataa cacac 25 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 aagaagcatc ccactctaca gctt 24 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 atatcttccc tcacaacact ccaact 26 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 ctaccggaag gatcaaggtt gt 22 <210> 17 <211> 330 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 17 tcacatatat tccctcataa cacacccatt acaaaggaag catactacta taggatgatt 60 ttcgagcgct ttttcccaca gaattcagct gggctaaccg ttcctggagg agcaagtgtg 120 gcgtgtagca cagctaaagc tgtagagtgg gatgcttctt ggtcaaagaa ccttgatcct 180 tcaggcaggg ctgctattgg tgtacataac tcggcttatg agaatcatgt acctgctatg 240 gctaatggga atttgaccaa aaaaatcatt ggtcgtgtgc cttctatggt agaagttggt 300 gctgctcccg agctcacaat aaagagttag 330 <210> 18 <211> 364 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 18 gaccagattg gagtgggata tatcaacatg gtgattttta cttagcacat caacgtttag 60 caattatcga tcctacttct ggtgatcagc ctctgtttaa tcaagataag actattgttg 120 ttacagtcaa tggagaaatt tacaatcatg agaaacttcg taatcttatg cctaatcaca 180 agttcagaac cggaagtgat tgtgatgtta ttgcacatct ttatgaagaa tatggagaaa 240 attttgtgga catgttggat ggggtgttct cttttgtatt gttggatacg cgcgataaca 300 gctttcttgc tgctcgtgat gcgattggaa ttactcccct ctatattggt tggggacttg 360 atgg 364 <210> 19 <211> 1815 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 19 atgtgcggga tcttggctgt tttgggttgt tctgatgatt ctcaggccaa aagggttcgt 60 gttctcgagc tctctcgcag gtaggttgaa gcatcgtgga ccagattgga gtgggctgta 120 tcaacatggg gactgttact tggcacatca gcgtctagct attgttgatc ctgcttccgg 180 tgatcaacct ctgtttaacg aagataagac gattgttgtt acggtaggta aatggagaga 240 tctacaatca cgagcaactt cgtaagcaaa tgcctaatca taagttccgg actggcagtg 300 actgtgatgt cattgcacac ctagtagtat gaagaacatg gagaagattt tgtggacatg 360 ctggatggga tcttcgcttt tgtgttattg gatactcgag ataacagctt tcttgttgct 420 cgtgatgcca ttggaattac ttccctttat attggttggg gacttgatgg tagggtctgt 480 atgaatatca tctgagctta agggcttgaa tgatgactgc gaacattttg aagttttccc 540 accagggcac ttgtactcta gcaagaatgg cggctttagg aggtggtaca atcctccttg 600 gttctctgag gccattcctt ccactcgtta tgatccctta gttctcaggc gtgcctttga 660 aaatgtaggc tgttatcaaa aggttgatga ctgatgtccc ctttggtgtt ctcctctccg 720 ggggactcga ttcatccttg gttgcttcga ttactgctcg ctacttggct ggtacaaagg 780 ctgccaagca gtggggagca cagcttcatt ccttctgtgt tggccttgag gtagggctca 840 ccggatctca aggctgcaag agaagttgct gactacttgg gaaccgttca ccacgagttt 900 cacttcaccg ttcaggtagg atggaattga tgcaattgaa gatgttattt accatattga 960 gacatacgat gtaacgacaa tcagagcaag cactcctatg ttccttatgt cgcgtaagat 1020 taagtcacta ggagtgaaga tggtcatatc tggggaagga tctgatgaag tgtttggtgg 1080 ctacttgtac tttcacaagg ctcccaacaa ggaagagttc cacaaggaaa catgtcgcaa 1140 ggtagattaa agcgcttcac caatatgact gcttaagagc aaataagtca acatctgcat 1200 ggggtttaga agctagagtc cctttcctag ataaggagtt catcaatgtt gccatgagta 1260 ttgatccaga gtggaagttg agattaaacc agagcaaagg aggattgaaa agtgggctct 1320 aaggagggcc tttgatgatg aggagcatcc ttatctccca aaggtagcac atcctgtata 1380 ggcaaaaaga acaattcagt gatggcgtgg gcatagttgg atagatggac tcaaagcaca 1440 tgctgaacaa catgtaggtg accaatagga tgatgtttaa tgcttcacat atattccctc 1500 ataacacacc cattacaaag gaagcatact actataggat gattttcgag cgctttttcc 1560 cacaggtaga attcagctgg gctaaccgtt cctggaggag caagtgtggc gtgtagcaca 1620 gctaaagctg tagagtggga tgcttcttgg tcaaagaacc ttgatccttc aggcagggct 1680 gctattggtg tacataactc ggcttatgag aatcatgtac ctgctatggc taatgggaat 1740 ttgaccaaaa aaatcattgg tcgtgtgcct tctatggtag aagttggtgc tgctcccgag 1800 ctcacaataa agagt 1815 <210> 20 <211> 155 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 20 Met Cys Gly Ile Leu Ala Val Leu Gly Cys Ser Asp Asp Ser Gln Ala 1 5 10 15 Lys Arg Val Arg Val Leu Glu Leu Ser Arg Arg Leu Lys His Arg Gly 20 25 30 Pro Asp Trp Ser Gly Leu Tyr Gln His Gly Asp Cys Tyr Leu Ala His 35 40 45 Gln Arg Leu Ala Ile Val Asp Pro Ala Ser Gly Asp Gln Pro Leu Phe 50 55 60 Asn Glu Asp Lys Thr Ile Val Val Thr Val Asn Gly Glu Ile Tyr Asn 65 70 75 80 His Glu Gln Leu Arg Lys Gln Met Pro Asn His Lys Phe Arg Thr Gly 85 90 95 Ser Asp Cys Asp Val Ile Ala His Leu Tyr Glu Glu His Gly Glu Asp 100 105 110 Phe Val Asp Met Leu Asp Gly Ile Phe Ala Phe Val Leu Leu Asp Thr 115 120 125 Arg Asp Asn Ser Phe Leu Val Ala Arg Asp Ala Ile Gly Ile Thr Ser 130 135 140 Leu Tyr Ile Gly Trp Gly Leu Asp Gly Ser Val 145 150 155 <210> 21 <211> 1818 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 21 atgtgcggga tcttggctgt tttgggttgt tctgatgatt ctcaggccaa aagggttcgt 60 gttctcgagc tctctcgcag gtaggttgaa gcatcgtgga ccagattgga gtgggctgta 120 tcaacatggg gactgttact tggcacatca gcgtctagct attgttgatc ctgcttccgg 180 tgatcaacct ctgtttaacg aagataagac gattgttgtt acggtaggta aatggagaga 240 tctacaatca cgagcaactt cgcaagcaaa tgcctgatca taagttccgg actggaagtg 300 actgtgatgt cattgcacac ctagtagtat gaagaacatg gagaagattt tgtggacatg 360 ctggatggga tcttcgcttt tgtgttactg gatactcgag ataacagctt tcttgttgct 420 cgtgatgcca ttggaattac ttccctttat attggttggg gacttgatgg tagggtctgt 480 atgaatatca tctgagctta agggcttgaa tgatgactgc gaacattttg aagttttccc 540 accaggacac ttgtactcta gcaagaatgg cggctttagg aggtggtaca atcctctttg 600 gttctctgag gctattcctt ccactcctta tgatccctta gttctcaggc gcgcctttga 660 aaatgtaggc tgttatcaaa aggttgatga ctgatgtccc ttttggtgtt ctgctctccg 720 ggggactcga ttcatccttg gttgcttcga ttactgcccg ctacttggct ggcacaaagg 780 ctgccaagca gtggggagca cagcttcatt ccttctgtgt tggccttgag gtagggatca 840 ccggatctca aggctgcaag agaagttgct gactacttgg gaaccgttca ccacgagttt 900 cacttcaccg ttcaggtagg atggaattga tgcaattgaa gatgttattt accatattga 960 gacatacgat gtaacgacaa tcagagcaag cactcctatg ttccttatgt cgcgtaagat 1020 taagtcacta ggagtgaaga tggttatatc tggggaaggc tctgatgaag tgtttggtgg 1080 ctacttgtac tttcacaagg ctcccaacaa ggaagagttc cacaaggaaa catgtcgcaa 1140 ggtagattaa agcacttcac caatatgact gtttaagagc aaataagtca acatctgcat 1200 ggggcttaga agctagagtg cctttcctag ataaggagtt catcaatgtt gccatgagta 1260 ttgatccaga gtggaagttg gtagattaaa ccagagcaaa ggaggattga gaagtgggct 1320 ctaaggaggg cctttgatga tgaggagcat ccctatctcc caaaggtagc acatcctata 1380 caggcagaaa gaacaattca gtgatggcgt aggctatagt tggatagatg gactcaaagc 1440 acatgctgaa caacatgtag gtgaccaata ggatgatgct taatgcttca catatattcc 1500 ctcataacac accgattaca aaggaagcat actattatag gatgattttc gagcgctttt 1560 tcccacaggt agaattcagc tgggctaacc gttcctggag gagcgagtgt ggcgtgtagc 1620 acagctaaag ctgtagagtg ggatgcttct tggtcaaaga accttgatcc ttcaggaagg 1680 gctgctattg gtgtacataa ctcagcttat gagaatcatg aacctgctat ggctaatggg 1740 aatttggcca caaaaatcat tggccgtgcg ccgtctatgg tagaagttgg tgctgctcat 1800 gagctcacaa taaggagt 1818 <210> 22 <211> 155 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 22 Met Cys Gly Ile Leu Ala Val Leu Gly Cys Ser Asp Asp Ser Gln Ala 1 5 10 15 Lys Arg Val Arg Val Leu Glu Leu Ser Arg Arg Leu Lys His Arg Gly 20 25 30 Pro Asp Trp Ser Gly Leu Tyr Gln His Gly Asp Cys Tyr Leu Ala His 35 40 45 Gln Arg Leu Ala Ile Val Asp Pro Ala Ser Gly Asp Gln Pro Leu Phe 50 55 60 Asn Glu Asp Lys Thr Ile Val Val Thr Val Asn Gly Glu Ile Tyr Asn 65 70 75 80 His Glu Gln Leu Arg Lys Gln Met Pro Asp His Lys Phe Arg Thr Gly 85 90 95 Ser Asp Cys Asp Val Ile Ala His Leu Tyr Glu Glu His Gly Glu Asp 100 105 110 Phe Val Asp Met Leu Asp Gly Ile Phe Ala Phe Val Leu Leu Asp Thr 115 120 125 Arg Asp Asn Ser Phe Leu Val Ala Arg Asp Ala Ile Gly Ile Thr Ser 130 135 140 Leu Tyr Ile Gly Trp Gly Leu Asp Gly Ser Val 145 150 155 <210> 23 <211> 1818 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of ASN5-S stop mutant: ASN5-S_Q66* <220> <221> mutation <222> (199)..(201) <400> 23 atgtgtggaa tcttggcttt gttgggttgt tcagatgatt ctcaggccaa aagggttcga 60 gttcttgagc tctctcgcag gcaggttgaa gcatcgtgga ccagattgga gtgggatata 120 tcaacatggt gatttttact tagcacatca acgtttagca attatcgatc ctgcttctgg 180 tgatcagcct ctgtttaatt aagataagac gattgttgtt acagtaggtc aatggagaga 240 tttacaatca tgagaaactt cgtaatctta tgcctaatca caagttcaga actggaagtg 300 attgtgatgt tattgcacat cttgtagtat gaagaatatg gagaaaattt tgtggacatg 360 ttggatgggg tgttctcttt tgtattgttg gatacgcgcg ataacagctt tcttgctgct 420 cgtgatgcaa ttggaattac tcccctatat attggttggg gacttgatgg taggctctgt 480 gtggatttca tctgagctaa aaggattaaa tggtgactgt gaacattttg aagttttccc 540 tcccggtcac ttgtactcga gcaagaatgg cgggtttagg agatggtaca atcctcaatg 600 gttctctgag gctattccat caaatcctta cgacccctta gttttgagac gtgccttcga 660 aaatgtaggc tgttatcaaa cgattgatga ccgatgtccc ctttggtgtt ctgctctccg 720 ggggacttga ttcgtctttg gttgcttctg tcactgctcg ctacttggct ggaacaaaag 780 ctgctaagca atggggagca cagcttcatt ccttctgtgt tggtctcgag gtagggctca 840 ccagatctca aggctgcaag agaagttgct gactatttgg gaaccgttca ccacgagttc 900 accttcacag ttcaggtagg atggaattga tgctattgaa gatgttattt accatatcga 960 gacatacgat gtaacaacga tcagagcaag cactcctatg ttccttatgt cgcgtaagat 1020 taaatcactg ggagttaaga tggtcatatc aggggaaggc tcagatgaac tgtttggcgg 1080 ctatttgtac ttccacaagg ctccgaacaa ggaagaattc catgtggaga catgtcacaa 1140 ggtagataaa agcgcttcac caatacgact gtttgagagc aaataaggca acatcagcat 1200 ggggcttaga agctagagta ccatttctgg ataaagagtt catcaacgtt gctatgagta 1260 tcgatcctga atggaagatg gtagattaaa cacgatcatg gtaggatcga gaagtgggtt 1320 cttaggaagg cttttgatga tgaggagcaa ccctatctcc caaaggtagc atattctgta 1380 ccggcagaaa gaacaattca gtgatggcgt aggctatagt tggatcgatg gactcaaagc 1440 acatgctgaa caacatgtag gtgactgata ggatgatgct taatgctgca catatcttcc 1500 ctcacaacac tccaactaca aaggaagcat actattacag gatgattttc gagaggttct 1560 tcccacaggt agaattcagc aaggctaact gttcctggag gaccgagtat agcttgcagc 1620 acagctaaag ctattgagtg ggatgcttcg tggtcgaaca accttgatcc ttccggtagg 1680 gctgcaatcg gtgtacataa ctcggcttat gacgatcatc tccccgatgt tggtaatggg 1740 aatttggaca caacgatcat cgataatgtg ccgaggatgg taggagtggg tgctgctgca 1800 gagctcacaa taaggagc 1818 <210> 24 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of ASN5-S stop mutant: ASN5-S_Q66* <400> 24 Met Cys Gly Ile Leu Ala Leu Leu Gly Cys Ser Asp Asp Ser Gln Ala 1 5 10 15 Lys Arg Val Arg Val Leu Glu Leu Ser Arg Arg Leu Lys His Arg Gly 20 25 30 Pro Asp Trp Ser Gly Ile Tyr Gln His Gly Asp Phe Tyr Leu Ala His 35 40 45 Gln Arg Leu Ala Ile Ile Asp Pro Ala Ser Gly Asp Gln Pro Leu Phe 50 55 60 Asn 65

Claims (42)

  1. 아스파라긴 합성효소의 발현 또는 활성이 감소된 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물로서, 상기 아스파라긴 합성효소는
    (i) 서열번호 1 또는 서열번호 3 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 폴리뉴클레오티드 서열; 또는
    (ii) (i)에 기재된 폴리뉴클레오티드에 의하여 암호화되는 폴리펩티드; 또는
    (iii) 서열번호 2 또는 서열번호 4 또는 서열번호 6 또는 서열번호 8을 가지는 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되고;
    여기서 (i), (ii) 또는 (iii)에 기재된 아스파라긴 합성효소의 발현 또는 활성은 대조군 식물에 비교하여 감소된 것이고,
    여기서, 상기 아스파라긴 합성효소의 감소된 발현 또는 활성은 대조군 식물로부터 유래한 경화되거나 건조된 중간-바닥 줄기 잎의 아스파라긴의 수준에 비교하여 상기 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물 또는 그의 부분으로부터 유래한 경화되거나 건조된 중간-바닥 줄기 잎의 아스파라긴의 수준의 적어도 17% 감소, 및
    대조군 식물로부터 유래한 경화되거나 건조된 중간-바닥 줄기 잎에 비교하여 상기 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물 또는 그의 부분으로부터 유래한 경화되거나 건조된 중간-바닥 줄기 잎을 가열 또는 연소할 때 생성된 에어로졸 중의 아크릴아미드의 수준의 적어도 20% 감소를 부여하는 것이고,
    상기 중간-바닥 줄기 잎은 줄기의 중간 위치부터 바닥 위치까지에서 수확된 잎을 포함하는 것인,
    돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 담배 식물은 상기 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 서열에 적어도 하나의 유전자 변경을 포함하고, 상기 유전자 변경은 서열번호 19, 21 및 23의 정지 돌연변이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 위치와 동등한 위치에서 정지 돌연변이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 서열번호 20, 22 및 24의 상기 정지 코돈의 위치 중 하나 이상과 동등한 위치에서 정지 코돈을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는,
    돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 대조군 식물의 경화되거나 건조된 중간-바닥 줄기 잎 및 에어로졸보다 상기 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물 또는 그의 부분으로부터 유래한 경화되거나 건조된 중간-바닥 줄기 잎의 아스파라긴의 수준은 적어도 22% 낮고 상기 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물 또는 그의 부분으로부터 유래한 경화되거나 건조된 중간-바닥 줄기 잎을 가열 또는 연소할 때 생성된 에어로졸 중의 아크릴아미드의 양은 적어도 24% 낮은, 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물 또는 그의 부분으로부터의 경화되거나 건조된 중간-바닥 줄기 잎의 니코틴 수준은 대조군 식물의 경화되거나 건조된 중간-바닥 줄기 잎의 니코틴 수준과 동일하거나, 10% 이하의 차이를 갖고; 또는
    여기서 글루타민, 아스파르트산 및 글루탐산의 형성은 대조군 식물의 경화되거나 건조된 중간-바닥 줄기 잎에 비교하여 상기 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물 또는 그의 부분으로부터 유래한 경화되거나 건조된 중간-바닥 줄기 잎에서 증가되는, 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 담배 식물은 (i), (ii) 또는 (iii)에서 기재된 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 각 사본에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 상기 돌연변이는 서열번호 19, 21 및 23의 정지 돌연변이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 위치와 동등한 위치에서의 정지 돌연변이, 또는 서열번호 20, 22 및 24의 정지 코돈의 위치와 동등한 위치에서의 정지 코돈을 암호화하는 것인,
    돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물.
  6. 삭제
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 아스파라긴 합성효소는 서열번호 19, 21 및 23으로 구성되는 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 서열번호 19, 21 및 23으로 구성되는 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되거나, 또는 서열번호 20, 22 및 24에 기재된 폴리펩티드 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 필수적으로 구성되고; 또는
    여기서 상기 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물 또는 그의 부분으로부터의 잎 바이오매스의 양은 대조군 식물로부터의 잎 바이오매스의 양과 동일하거나, 10% 이하의 차이를 갖고, 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물.
  8. 제3항에 있어서, 상기 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물 또는 그의 부분으로부터 유래한 경화되거나 건조된 중간-바닥 줄기 잎 및 상기 대조군 식물로부터 유래한 경화되거나 건조된 중간-바닥 줄기 잎은 공기 경화 또는 공기 건조된 것인, 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물.
  9. 제1항 또는 제2항의 담배 식물로부터의 식물 재료.
  10. 제1항 또는 제2항의 담배 식물의 적어도 일부를 포함하는 식물 제품.
  11. 대조군 식물로부터의 식물 재료에 비교하여 감소된 아스파라긴의 수준 및 식물 재료로부터 유래한 에어로졸 중의 감소된 아크릴아미드의 수준을 갖는 식물 재료의 제조 방법으로, 상기 방법은
    (a) 아스파라긴 합성효소를 암호화하고 서열번호 1 또는 서열번호 3 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 담배 식물 또는 그것의 부분을 제공하는 단계;
    (b) 상기 담배 식물 또는 그것의 부분에서 상기 (a)의 폴리뉴클레오티드의 발현 또는 그에 의해 암호화된 단백질의 활성을 감소시키는 단계;
    (c) 상기 담배 식물 또는 그것의 부분으로부터 식물 재료를 수확하는 단계;
    (d) 상기 식물 재료를 건조 또는 경화시키는 단계; 및
    (f) 감소된 아스파라긴의 수준 및 상기 식물 재료로부터 유래한 에어로졸 중의 감소된 아크릴아미드의 수준을 가지는 경화되거나 건조된 식물 재료를 얻는 단계를 포함하고,
    여기서, 상기 감소된 아스파라긴의 수준은 대조군 식물로부터 유래한 경화되거나 건조된 중간-바닥 줄기 잎의 아스파라긴의 수준에 비교하여 상기 담배 식물 또는 그의 부분으로부터 유래한 경화되거나 건조된 중간-바닥 줄기 잎의 아스파라긴의 수준의 적어도 17% 감소를 부여하고,
    상기 감소된 아크릴아미드의 수준은 대조군 식물로부터 유래한 경화되거나 건조된 중간-바닥 줄기 잎에 비교하여 상기 담배 식물 또는 그의 부분으로부터 유래한 경화되거나 건조된 중간-바닥 줄기 잎을 가열 또는 연소할 때 생성된 에어로졸 중의 아크릴아미드의 수준의 적어도 20% 감소를 부여하는 것이고,
    상기 중간-바닥 줄기 잎은 줄기의 중간 위치부터 바닥 위치까지에서 수확된 잎을 포함하는 것인, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 식물 재료는 수확 후 적어도 3일 동안 경화 또는 건조된 것이고; 또는 상기 식물 재료는 공기 경화되거나 공기 건조된 것인, 방법.
  13. 제11항 또는 제12항의 방법에 의해 얻어졌거나 얻을 수 있는 식물 재료.
  14. 대조군 식물에 비교하여 감소된 아스파라긴의 수준 및 경화되거나 건조된 식물 재료로부터 유래한 에어로졸 중의 감소된 아크릴아미드의 수준을 가지는 식물 재료의 생산 방법으로, 상기 방법은
    (a) 제1항 또는 제2항에 따른 담배 식물을 제공하는 단계;
    (b) 상기 담배 식물로부터 식물 재료를 수확하는 단계;
    (c) 상기 식물 재료를 일정 시간 동안 경화 또는 건조시키는 단계; 및
    (d) 감소된 아스파라긴의 수준 및 경화되거나 건조된 식물 재료로부터 유래한 에어로졸 중의 감소된 아크릴아미드의 수준을 가지는 경화되거나 건조된 식물 재료를 얻는 단계를 포함하는, 방법.
  15. 제9항의 식물 재료를 포함하는 담배 제품.
  16. 제3항에 있어서, 대조군 식물의 경화되거나 건조된 중간-바닥 줄기 잎 및 에어로졸보다 상기 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물 또는 그의 부분으로부터 유래한 경화되거나 건조된 중간-바닥 줄기 잎의 아스파라긴의 수준은 적어도 44% 낮고 상기 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물 또는 그의 부분으로부터 유래한 경화되거나 건조된 중간-바닥 줄기 잎을 가열 또는 연소할 때 생성된 에어로졸 중의 아크릴아미드의 양은 적어도 66% 낮은, 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물.
  17. 제16항에 있어서, 대조군 식물의 경화되거나 건조된 중간-바닥 줄기 잎 및 에어로졸보다 상기 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물 또는 그의 부분으로부터 유래한 경화되거나 건조된 중간-바닥 줄기 잎의 아스파라긴의 수준은 적어도 70% 낮고 상기 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물 또는 그의 부분으로부터 유래한 경화되거나 건조된 중간-바닥 줄기 잎을 가열 또는 연소할 때 생성된 에어로졸 중의 아크릴아미드의 양은 적어도 88% 낮은, 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물.
  18. 제1항에 있어서, 상기 담배 식물은 니코티아나 타바쿰 담배 식물인, 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물.
  19. 제1항에 있어서, 상기 담배 식물은 버얼리형(Burley type) 니코티아나 타바쿰 담배 식물인, 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물.
  20. 제5항에 있어서, 상기 담배 식물은 상기 정지 돌연변이(들) 또는 상기 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 RNA 전사물의 번역을 간섭하는 유전자 단편(들)을 포함하는, 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물.
  21. 제8항에 있어서, 상기 공기 경화된 중간-바닥 줄기 잎은 태양 경화되거나 화력(fire) 경화되고; 상기 공기 건조된 중간-바닥 줄기 잎은 태양 건조되거나 화력 건조된 것인, 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물.
  22. 제11항에 있어서, 니코틴 수준이 대조군 식물의 니코틴 수준과 동일하거나, 10% 이하의 차이를 갖는, 방법
  23. 제11항에 있어서, 글루타민, 아스파르트산 및 글루탐산의 형성이 대조군 식물의 경화되거나 건조된 중간-바닥 줄기 잎에 비교하여 증가되는, 방법.
  24. 제12항에 있어서, 상기 공기 경화된 식물 재료는 태양 경화되거나 화력 경화된 것이고, 상기 공기 건조된 식물 재료는 태양 건조되거나 화력 건조된 것인, 방법.
  25. 제14항에 있어서, 니코틴 수준이 대조군 식물의 니코틴 수준과 동일하거나, 10% 이하의 차이를 갖는, 방법
  26. 제14항에 있어서, 글루타민, 아스파르트산 및 글루탐산의 형성이 대조군 식물의 경화되거나 건조된 중간-바닥 줄기 잎에 비교하여 증가되는, 방법.
  27. 아스파라긴 합성효소의 발현 또는 활성이 감소된 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물의 부분으로서, 상기 아스파라긴 합성효소는
    (i) 서열번호 1 또는 서열번호 3 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 폴리뉴클레오티드 서열; 또는
    (ii) (i)에 기재된 폴리뉴클레오티드에 의하여 암호화되는 폴리펩티드; 또는
    (iii) 서열번호 2 또는 서열번호 4 또는 서열번호 6 또는 서열번호 8을 가지는 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되고;
    여기서 (i), (ii) 또는 (iii)에 기재된 아스파라긴 합성효소의 발현 또는 활성은 대조군 식물에 비교하여 감소된 것이고,
    여기서, 상기 아스파라긴 합성효소의 감소된 발현 또는 활성은 대조군 식물로부터 유래한 경화되거나 건조된 중간-바닥 줄기 잎의 아스파라긴의 수준에 비교하여 상기 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물의 부분으로부터 유래한 경화되거나 건조된 중간-바닥 줄기 잎의 아스파라긴의 수준의 적어도 17% 감소, 및
    대조군 식물로부터 유래한 경화되거나 건조된 중간-바닥 줄기 잎에 비교하여 상기 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물의 부분으로부터 유래한 경화되거나 건조된 중간-바닥 줄기 잎을 가열 또는 연소할 때 생성된 에어로졸 중의 아크릴아미드의 수준의 적어도 20% 감소를 부여하는 것이고,
    상기 중간-바닥 줄기 잎은 줄기의 중간 위치부터 바닥 위치까지에서 수확된 잎을 포함하는 것인,
    돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물의 부분.
  28. 제1항 또는 제2항의 식물로부터의 경화되거나 건조된 식물 재료.
  29. 제9항의 식물 재료를 포함하는 식물 제품.
  30. 제9항의 식물 재료를 포함하는 흡연 물품.
  31. 제13항의 식물 재료를 포함하는 담배 제품.
  32. 제13항의 식물 재료를 포함하는 흡연 물품.
  33. 제3항에 있어서,
    상기 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물 또는 그의 부분으로부터의 경화되거나 건조된 중간-바닥 줄기 잎의 니코틴 수준은 대조군 식물의 경화되거나 건조된 중간-바닥 줄기 잎의 니코틴 수준과 동일하거나, 10% 이하의 차이를 갖고; 또는
    여기서 글루타민, 아스파르트산 및 글루탐산의 형성은 대조군 식물의 경화되거나 건조된 중간-바닥 줄기 잎에 비교하여 상기 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물 또는 그의 부분으로부터 유래한 경화되거나 건조된 중간-바닥 줄기 잎에서 증가되는, 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물.
  34. 제3항에 있어서, 상기 담배 식물은 (i), (ii) 또는 (iii)에서 기재된 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 각 사본에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 상기 돌연변이는 서열번호 19, 21 및 23의 정지 돌연변이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 위치와 동등한 위치에서의 정지 돌연변이, 또는 서열번호 20, 22 및 24의 정지 코돈의 위치와 동등한 위치에서의 정지 코돈을 암호화하는 것인,
    돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물.
  35. 제4항에 있어서, 상기 담배 식물은 (i), (ii) 또는 (iii)에서 기재된 아스파라긴 합성효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 각 사본에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 상기 돌연변이는 서열번호 19, 21 및 23의 정지 돌연변이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 위치와 동등한 위치에서의 정지 돌연변이, 또는 서열번호 20, 22 및 24의 정지 코돈의 위치와 동등한 위치에서의 정지 코돈을 암호화하는 것인,
    돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물.
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 제3항에 있어서, 상기 아스파라긴 합성효소는 서열번호 19, 21 및 23으로 구성되는 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 서열번호 19, 21 및 23으로 구성되는 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되거나, 또는 서열번호 20, 22 및 24에 기재된 폴리펩티드 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 필수적으로 구성되고; 또는
    여기서 상기 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물 또는 그의 부분으로부터의 잎 바이오매스의 양은 대조군 식물로부터의 잎 바이오매스의 양과 동일하거나, 10% 이하의 차이를 갖고, 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물.
  40. 제4항에 있어서, 상기 아스파라긴 합성효소는 서열번호 19, 21 및 23으로 구성되는 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 서열번호 19, 21 및 23으로 구성되는 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되거나, 또는 서열번호 20, 22 및 24에 기재된 폴리펩티드 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 필수적으로 구성되고; 또는
    여기서 상기 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물 또는 그의 부분으로부터의 잎 바이오매스의 양은 대조군 식물로부터의 잎 바이오매스의 양과 동일하거나, 10% 이하의 차이를 갖고, 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물.
  41. 제5항에 있어서, 상기 아스파라긴 합성효소는 서열번호 19, 21 및 23으로 구성되는 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 서열번호 19, 21 및 23으로 구성되는 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되거나, 또는 서열번호 20, 22 및 24에 기재된 폴리펩티드 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 필수적으로 구성되고; 또는
    여기서 상기 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물 또는 그의 부분으로부터의 잎 바이오매스의 양은 대조군 식물로부터의 잎 바이오매스의 양과 동일하거나, 10% 이하의 차이를 갖고, 돌연변이, 비-자연 발생 또는 트랜스제닉 담배 식물.
  42. 삭제
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