KR101214690B1 - 병저항성 관련 고추 아스파라진합성효소 유전자 ＣａＡＳ１ 및 이를 이용한 식물체의 병저항성 탐색 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고추식물에서 발생하는 병에 대한 방어반응에 관여하는 아스파라진합성효소 (pepper asparagine synthetase 1 gene, CaAS1) 유전자 및 이를 이용한 병 저항성에 기여하는 형질전환 식물체에 관한 것이다. 본 발명의 상기 유전자는 병원균의 공격에 대한 식물체의 방어반응 및 병저항성 식물체의 효율적이고 효과적인 분자적 육종을 위한 유전재료로서 유용하게 사용될 수 있으며, 식물병 저항성에 대한 탐색 및 작용 기작을 규명하는 도구로 이용될 수 있다.

Description

병저항성 관련 고추 아스파라진합성효소 유전자 ＣａＡＳ１ 및 이를 이용한 식물체의 병저항성 탐색 방법{Pepper (Capsicum annuum) asparagine synthetase 1 (CaAS1) gene and screening method of plant disease resistance using the same}

본 발명은 식물병 저항성 관련 신규 유전자인 고추의 아스파라진합성효소 유전자 (Pepper asparagine synthetase gene 1, CaAS1), 이를 이용한 식물체의 병저항성 탐색방법 및 병저항성 형질전환 식물체에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 고추 세균성 점무늬병(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 병원성 균주와 비병원성 균주에 감염될 때 저항성 반응에서 강하게 발현되는 식물병 방어 관련 신규 유전자인 CaAS1 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열을 제공하며, 이를 이용하여 생물적/화학적 저항성 유도 처리 시 저항성 관련 유전자 CaAS1의 차별적인 발현여부 및 식물체의 저항성 탐색방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 고추 식물에서 바이러스 유도 유전자 침묵(VIGS, virus-induced gene silencing) 현상을 통해 상기 CaAS1 유전의 발현을 불능화(knock down) 시켜 병저항성에 대한 아스파라진합성효소 유전자의 기능을 확인하고, 그리고 상기 CaAS1 유전자를 애기장대(Arabidopsis thaliana)에 형질전환을 통해 도입, 과발현(overexpression)시켜 CaAS1 유전자의 식물체 병저항성 증대효과를 확인하여, 이를 통한 식물병 저항성 형질전환 식물체를 제공하는 것에 관한 것이다. 이와 더불어 CaAS1 유전자가 불능화 되거나 과발현된 식물에서 아미노산 함량을 측정하여 식물에서의 CaAS1 유전자의 기능을 탐색한 것에 관한 것이다.

각종 병원균의 침입과 외부의 자극에 대하여 면역반응을 작동시켜 스스로를 보호하도록 식물은 진화해 왔다. 그러나 이러한 저항성 반응에도 불구하고, 식물이 외부의 자극이나, 병에 대하여 위협받게 되면, 작물의 생산 및 품질의 저하를 가져와 경제적으로 큰 피해를 일으키게 된다. 이러한 피해를 최소화하기 위하여 고추를 비롯한 다양한 경제작물의 병 저항성 품종의 육종에 대한 육성 프로그램들이 꾸준히 진행되어 왔으며, 병 저항성에 대한 이해 및 실제적 응용을 위해 식물에서의 저항성 기작에 대한 연구를 고추식물을 모델로서 수행하고 있다.

이러한 생물학적/물리적/환경적 스트레스에 대한 식물의 방어 반응 중에서 특히 식물이 병원체에 대하여 방어반응을 일으키는 데 중요한 역할을 하는 것은 식물과 병원균의 상호작용에 의한 식물의 병저항성의 발현과 이에 관련된 신호전달경로이다. 이러한 식물의 병 방어 기작 및 저항성 반응에 관련된 유전자가 어떻게 병원균을 인식하고, 어떠한 전달경로를 통하여 식물 전체에 반응하게 되는지 중요하게 연구되어져 왔으며, 이와 관련하여 생물학/생화학/세포생물학적인 방법을 이용한 병 방어(저항성) 유전자의 기능에 대한 연구가 이루어져 왔다. 병 방어(저항성) 유전자의 기능에 대한 생물학/생화학/세포생물학적인 연구는 식물의 생리 및 저항성에 관련된 기작을 연구하는데, 높은 가치를 가지게 되는 것은 물론, 작물의 분자육종을 통한 저항성 품종의 개발에 기여할 수 있다. 작물의 분자육종기술에서 유전공학적 기술의 개입은 근래 활발하게 이루어지고 있으며, 병 방어(저항성) 유전자를 통한 작물의 분자육종은 타 식물종의 외래 유전자를 사용할 수 있으며, 기존의 게놈단위로 가능하던 육종기술을 유전자 수준에서 가능하도록 하여 보다 효과적인 육종 효과를 보이며 현재의 육종의 기술을 극대화 시킬 수 있다는 장점이 있다.

한편, 아스파라진합성효소는 많은 식물들의 뿌리나 잎에 함유되어 있으며 글루타민이나 암모니아 경로에 관여하고 있다. 그리고 식물에서는 몇몇의 아스파라진합성효소가 식물병원균의 감염에 의하여 유도되는 것으로 연구되어 졌다. 특히 아스파라진합성효소는 아스파틱 엑시드를 아스파라진으로 생합성하는 데에 역할을 하고 있으며 높은 수준의 아스파라진합성효소의 활성 또한 병원균의 감염이후에 증가되어졌다. 특히 아스파라진합성효소 유전자는 곰팡이나, 세균, 곤충이나 포유동물의 공격과 같은 외부 자극에 대하여 발현이 증가하게 되고 이는 식물의 방어반응 관련 물질들의 합성을 이끌게 된다. 이러한 발견은 아스파라진합성효소의 병에 대한 반응 및 이와 관련된 병생성 관련 단백질(PR protein)의 유전자 정보의 축적이 가능해져서 식물의 병에 대한 신호전달에 대한 흥미로운 모형을 제공해 줄 수 있으며, 저항성을 일으키는 생화학적 변화를 이해함으로써, 병 저항성이 증진되는 생명공학적 식물을 개발하거나 식물의 병저항성 유전자 재료로서 분자육종에 실용적으로 이용될 수 있을 것이다.

고추는 가지과에 속한 우리나라에서는 오래전부터 김치 등의 한식요리에서 중요한 조미료로 사용되고 있는 대표적인 경제작물이다. 고추는 세균병, 진균병, 바이러스병이 다양하게 보고되고 있으며 난균류에 의한 역병과 진균에 의한 탄저병 및 세균에 의한 세균정점무늬병에 대한 피해가 가장 심각하게 보고되고 있다. 고추의 세균성 점무늬병은 잎, 잎자루, 줄기, 과경 및 열매에 나타나며 암갈색의 원형이나 부정형의 작은 점무늬를 형성하여 낙엽을 유발하고 수확량을 감소시키는 병으로서 더뎅이병 또는 반점세균병으로도 불리며 심각한 수준의 피해를 보이고 있다.

이러한 고추 세균성 점무늬병은 농약을 이용한 화학적 방제가 어려우므로 고추 세균성 점무늬병에 대한 피해를 최소화하기 위하여 고추 식물의 재배환경을 조절하여 경종적으로 방제하고 저항성 고추품종의 개발 및 생물학적 방제 등을 적절히 사용하는 것이 농민들에게 가장 효율적이고 경제적인 방제방법이다. 이들 방제 방법 중에서 병에 대하여 저항성을 가지고 있는 고추 품종의 개량 및 육종을 위하여 생명공학 기술에 기반하여 유용한 고추방어유전자를 이용하여 분자적 육종기술을 개발하는 것이 21세기 고추생산에 가장 바람직하다고 할 수 있다.

본 발명은 이와 같은 종래기술상의 과제를 해결하기 위한 것으로서, 그 목적은, 고추 세균성 점무늬병(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)에 대한 방어반응에 관여하는 것으로서 식물병 방어 관련 유전자의 하나인 고추 아스파라진합성효소를 코딩하는 CaAS1 유전자를 분리하여 해독함으로써 그 염기서열 정보 및 그에 따른 아미노산 서열 정보를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 상기 CaAS1 유전자를 이용하여 식물병 또는 화학물질에 대한 저항성 존재 여부를 탐색하는 식물체의 저항성 탐색방법을 제공하고자 하는 것이다.

더 나아가, 본 발명은 상기 CaAS1 유전자를 식물체에 도입하여 식물병에 저항성을 가지는 형질전환 식물체를 제작하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.

본 발명의 상기 목적은, 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 비병원성균주 접종에 대해 과민성 저항성 반응을 나타내는 녹광 고추 품종으로부터 분리한 신규 방어 관련 유전자 CaAS1을 확인하여 그 염기서열을 결정하고, 이를 이용하여 생물적/화학적 처리를 통하여 CaAS1의 발현 여부를 조사하고, 고추식물과 이 유전자를 과발현하는 형질전환 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서 CaAS1 유전자의 식물병 저항성 유도 기능을 확인하여 달성하였다.

따라서 본 발명은 식물병 방어 관련 유전자로서 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 고추 유래 아스파라진합성효소 단백질을 코딩하는 유전자 또는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 분리된 유전자(CaAS1)를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 분리된 아스파라진합성효소 단백질(CaAS1)을 제공한다.

나아가 본 발명은 상기 유전자를 이용하여 제조한 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 식물 발현 벡터이다. 상기 재조합 벡터는 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 pBIN35S::CaAS1 또는 TRV2:: CaAS1이다.

또한, 본 발명은 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터를 이용하여 제조한 형질전환된 식물체를 제공한다. 식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법 (Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 튜메파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다.

나아가 본 발명은 식물체로부터 mRNA 분리하여 CaAS1 유전자의 차별적 발현을 확인하는 단계를 포함하는 식물체의 저항성을 탐색하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자(CaAS1)의 발현 변화에 의한 식물체의 아스파라진 아미노산을 포함하는 아미노산의 함량을 측정하는 단계를 포함하는 식물체의 저항성 탐색방법을 제공한다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구성을 상세하게 설명하면 다음과 같다.

먼저, 본 발명은 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 비병원성균주 접종에 대해 과민성 저항성 반응을 나타내는 녹광고추 품종으로부터 mRNA를 분리하여 cDNA 라이브러리를 제작하고, 비병원성 균주를 접종한 고추식물의 잎과 접종하지 않은 건전한 고추식물에서 얻은 총 mRNA를 디옥시제닌(digoxygenin)으로 표지하여 프로브(Probe)를 만들고, 이 cDNA와 프로브를 이용 디퍼런셜 하이브리다이제이션(differential hybridization)을 수행하여 병 방어(저항성)에 관련될 것으로 추정되는 유전자를 선발하여 클론을 수득하고, 이 클론 중 아스파라진합성효소 (CaAS1) 유전자로 확인된 유전자의 염기서열을 해독(Sequencing)함으로써, CaAS1로 명명된 고추 녹광 품종의 CaAS1 단백질 코딩 유전자 염기서열(서열번호 1) 및 그로부터 코딩되는 아미노산 서열(서열번호 2)을 제공한다(도 1 참조).

본 발명에 의한 상기 수득된 클론들을 해독(Sequencing)한 후, 블라스트(Blast) 프로그램을 이용하여 그 5'-말단 서열을 GenBank에 등록된 유전자 데이터베이스와 비교함으로써 CaAS1 단백질 코딩 유전자를 확인하고 아스파라진합성효소 1(CaAS1) 유전자로 명명하였다. CaAS1 단백질은 아미노산 서열의 비교결과 애기장대의 단백질 아미노산 서열과 83%의 상동성을 나타내었고, 벼(oryza sativa), 콩(Glycine max)등의 작물의 아스파라진합성효소와 80% 정도의 상동성을 나타냄으로서 신규임을 알 수 있었다. (도 1 및 도 2 참조).

확인된 CaAS1 유전자 염기서열과 상기 염기서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 도 1에 나타내었다.

다음에, 본 발명은 생물적/화학적 처리를 한 식물체로부터 mRNA 분리하여 CaAS1 유전자의 차별적 발현을 확인하는 단계를 포함하는 식물체의 저항성을 탐색하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로는 상기 생물적 처리는 고추 세균성 점무늬병균의 병원성 또는 비병원성 세균 등 병원균을 예로 들 수 있다. 상기 화학적 처리는 살리실산(Salicylic acid)과 메틸자스모네이트 (methyl jasmonate)일 수 있다. 상기 CaAS1 유전자 발현 여부 확인은 노던 블럿, 실시간 RT-PCR, 마이크로어레이법을 비롯한 mRNA의 발현을 측정할 수 있는 다양한 방법들이 이용될 수 있다. 본 발명에 의한 CaAS1 유전자가 식물병원균 또는 화학물질에 의해 차별적으로 유도 발현되는 것을 실험을 통해 확인하였다(도 3 및 도 4 참조). 따라서 본 발명에 의한 CaAS1 유전자는 식물체의 저항성 탐색방법에 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기의 CaAS1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 고추식물에서 특이적으로 CaAS1 유전자가 억제된 식물체의 제작하고 병감수성이 증대되는 것을 확인하고, CaAS1 유전자가 과발현된 형질전환 애기장대 식물의 식물병 저항성 생성여부를 확인함으로써 새로운 병저항성 형질전환 식물체 및 저항성 분자 육종의 재료를 제공할 수 있다.

보다 구체적으로 본 발명은 또한 새롭게 개발된 바이러스 유도 유전자침묵(불능화)기술(virus-induced gene silencing (VIGS))에 이용되어지는 TRV(Tobacco Rattle Virus)를 이용하여 CaAS1 유전자를 TRV2 벡터(참고문헌: Baulcombe D. C. (1999) Fast forward genetics based on virus-induced gene silencing. Curr. Opin. Plant Biol. 2:109-113)에 도입시켜 재조합 벡터인 TRV2::CaAS1을 제공한다. 상기 재조합 벡터를 식물체에 도입하여 CaAS1의 발현이 억제된 VIGS 식물체를 제조하여 병감수성이 증대되는 것을 확인할 수 있었다 (도 5 ~ 도 8 참조).

또한 본 발명에 의한 CaAS1 유전자를 포함하는 재조합 벡터(pBIN35S::CaAS1)를 식물체에 도입하여 본 발명에 의한 CaAS1이 과발현된 형질전환 애기장대 식물을 제조하여 식물병 저항성의 증대를 확인할 수 있었다 (도 10 ~ 도 13 참조).

본 발명에 의한 고추 아스파라진합성효소의 기능을 불능화 시킨 고추 식물 및 아스파라진합성효소를 과발현시킨 애기장대 식물을 통하여 식물병원균에 대한 저항성 검정평가를 수행하여 병 저항성 발생여부를 알아 볼 수 있게 되었다(도 14 ~ 도 17 참조). 이러한 본 발명으로 아스파라진합성효소의 병에 대한 반응 및 이와 관련된 정보를 축적할 수 있게 되어 식물의 병에 대한 신호전달에 대한 흥미로운 모형을 제공해 줄 수 있으며, 저항성을 일으키는 생화학적 변화를 이해함으로써, 병 저항성이 증진되는 생명공학적 식물을 개발하는 데에 실용적으로 이용될 수 있을 것이다.

상술한 바와 같이, 본 발명은 고추 식물 세균병인 고추 세균성 점무늬병에 대한 방어반응에 관여하는 식물병 방어 관련 유전자인 신규 고추의 아스파라진합성효소 단백질을 코딩하는 CaAS1 유전자를 분리하여 해독함으로써 이에 따라 제공되어진 서열 정보 및 이에 따른 아미노산 서열 정보를 제공함과 더불어 고추 식물의 CaAS1 유전자가 식물병에 대한 저항성 반응에 기여하고 있음을 밝힘으로서, 이러한 정보를 바탕으로 식물체의 저항성 탐색의 방법의 제공이 가능하다. 특히 본 발명의 완성은 본 유전자의 발현을 통한 저항성 식물 육종 및 형질전환 식물체의 제작에 기여할 수 있는 효과를 볼 수 있어 저항성 품종 개발을 촉진할 수 있으며, 더 나아가서 식물의 육종산업의 발전에 기여할 수 있는 유용한 발명이다.

도 1은 본 발명에 의하여 고추 녹광 품종(Capsicum annuum L. cv. Nockwang)으로부터 클로닝한 고추 아스파라진합성효소 (CaAS1) 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명에 의한 고추 아스파라진합성효소 (CaAS1)의 아미노산 서열을 애기장대, 벼, 담배 등의 식물의 아스파라진합성효소 아미노산 서열과 비교한 alignment 도면이다.
도 3은 고추 녹광 품종에 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 병원성 균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a을 접종하였을 때 접종되지 않은 고추잎과 접종된 고추잎에서의 CaAS1 유전자 발현 유도 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 고추 녹광 품종에 살리실산(Salicylic acid)과 메틸자스모네이트 (methyl jasmonate)를 처리한 후 시간의 경과에 따른 CaAS1 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 바이러스-유도 유전자침묵(virus-induced gene silencing, VIGS)을 이용하여 CaAS1 유전자 발현이 억제된 고추 녹광 품종의 식물에 병원성 균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a의 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)을 접종하였을 때 고추병 방어(저항성) 관련 CaAS1 유전자 발현의 변화 패턴에 대한 결과 및 유전자 침묵을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 바이러스-유도 유전자침묵(virus-induced gene silencing, VIGS)을 이용하여 CaAS1 유전자 발현이 억제된 고추 녹광 품종의 식물에 병원성 균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a의 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)을 접종하였을 때 병 감수성이 증대되어 감수성 병징 확대 및 과민성세포사멸(트리판블루 염색) 감소에 대한 결과를 나타낸 사진이다.
도 7은 바이러스-유도 유전자침묵(virus-induced gene silencing, VIGS)을 이용하여 CaAS1 유전자 발현이 억제된 고추 녹광 품종의 식물에 병원성 균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a의 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)을 접종하였을 때 세균생장증대에 대한 검정결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 바이러스-유도 유전자침묵(virus-induced gene silencing, VIGS)을 이용하여 CaAS1 유전자 발현이 억제된 고추 녹광 품종의 식물에 병원성 균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a의 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)을 접종하였을 때 병 저항성에 관여하는 활성산소 및 전해질 전도도(이온유출)를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 바이러스-유도 유전자침묵(virus-induced gene silencing, VIGS)을 이용하여 CaAS1 유전자 발현이 억제된 고추 녹광 품종의 식물에 병원성 균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a의 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)을 접종하였을 때 CaAS1 유전자에 의하여 합성되어지는 아스파라진을 비롯한 아미노산의 함량을 나타낸 도면이다.
도 10은 고추 CaAS1 유전자를 과다발현시킨 형질전환 애기장대 식물에서 CaAS1 유전자의 과다발현에 대한 결과 및 애기장대의 저항성 관련 유전자의 발현에 대한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 고추 CaAS1 유전자를 과다발현시킨 형질전환 애기장대 식물에 세균성 병원균주인 슈도모나스 시링게 패소바 토마토 DC3000(Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000)과 비병원성 균주인 슈도모나스 시링게 패소바 토마토 DC3000 (에이브이알알피엠원)을 접종하였을 때 이 병에 대해 저항성을 보이고 있는 애기장대 잎의 반응을 관찰한 결과를 나타낸 사진이다.
도 12는 고추 CaAS1 유전자를 과다발현시킨 형질전환 애기장대 식물에 세균성 병원균주인 슈도모나스 시링게 패소바 토마토 DC3000(Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000)과 비병원성 균주인 슈도모나스 시링게 패소바 토마토 DC3000 (에이브이알알피엠원)을 접종하였을 때 이 병에 대해 저항성을 보이고 있는 식물세포에서 활성 산소(DAB 염색) 및 아닐린 블루 염색 (aniline blue staining)의 증가에 대한 결과를 나타낸 사진이다.
도 13은 고추 CaAS1 유전자를 과다발현시킨 형질전환 애기장대 식물에 세균성 병원균주인 슈도모나스 시링게 패소바 토마토 DC3000(Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000)과 비병원성 균주인 슈도모나스 시링게 패소바 토마토 DC3000 (에이브이알알피엠원)을 접종하였을 때 세균생장 감소로 병저항성 발현 결과를 나타낸 도면이다.
도 14는 고추 CaAS1 유전자를 과다발현시킨 형질전환 애기장대 식물에 세균성 병원균주인 슈도모나스 시링게 패소바 토마토 DC3000(Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000)과 비병원성 균주인 슈도모나스 시링게 패소바 토마토 DC3000 (에이브이알알피엠원)을 접종하였을 때 CaAS1 유전자에 의하여 합성되어지는 아스파라진을 비롯한 아미노산의 함량을 나타낸 도면이다.
도 15는 CaAS1이 과발현된 애기장대에서 애기장대에 노균병을 일으키는 하이알로 페르노스포라 Noco2(Hyaloperonospora arbidopsidis Noco 2)를 접종한 후 떡잎의 병징변화와 병징 확대, 과민성세포사멸 및 균사의 생장(트리판블루 염색)의 변화에 관한 도면이다.
도 16은 CaAS1이 과발현된 애기장대에서 애기장대에 노균병을 일으키는 하이알로 페르노스포라 Noco2(Hyaloperonospora arbidopsidis Noco 2)를 접종한 후 포자형성에 대한 결과를 나타낸다.
도 17은 CaAS1이 과발현된 애기장대에서 애기장대에 노균병을 일으키는 하이알로 페르노스포라 Noco2(Hyaloperonospora arbidopsidis Noco 2)를 접종한 후 상이한 병원균 분생자경 형성에 대한 결과를 나타낸다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1] CaAS1 유전자의 염기/아미노산 서열 결정

고추세균성점무늬병에 대한 병생성 관련 단백질(PR protein) 중 하나인 아스파라진합성효소 (CaAS1) 단백질 코딩 유전자 염기서열 및 그로부터 추론되는 아미노산 서열을 제공하기 위하여 하기와 같은 시험을 수행하였다.

고추 녹광 품종(Capsicum annuum cv. Nockwang)에 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)을 접종하고 18시간 동안 습실 처리한 후 저항성 병반인 과민성반응이 나타난 식물체를 습실에서 꺼내어 잎을 수거하였다.

다음에, 이 잎 표본으로부터 mRNA를 추출하여 역전사한 후 이를 PCR(Polymerase Chain Reaction) 증폭함으로써 cDNA 라이브러리를 제작하였다. 그리고 이렇게 제작된 cDNA 라이브러리로부터 개개의 cDNA 클론을 제조하여 나이론막(Hybond N+)에 일정하게 흡착시킨 후, 각각 고추세균성점무늬병균의 비병원성 균주를 접종한 고추식물의 잎과 접종하지 않은 건전한 고추식물의 잎에서 추출한 총 mRNA를 디옥시제닌(digoxygenin)으로 표지하여 프로브를 만든 다음, 디퍼런셜 하이브리다이제이션 (differential hybridization)을 수행하였다.

하이브리다이제이션 결과 비병원성 균주 접종된 식물체의 mRNA 프로브에 대해서만 집중적으로 증폭되어 나타난 유전자를 병 방어(저항성)에 관련된 유전자로 추정하고 클론을 수득하였다.

수득된 클론들을 해독(Sequencing)한 후, 블라스트(Blast) 프로그램을 이용하여 그 5'-말단 서열을 GenBank에 등록된 유전자 데이터베이스와 비교함으로써 CaAS1 단백질 코딩 유전자를 확인하고 고추 아스파라진합성효소 1(CaAS1) 유전자로 명명하였다. CaAS1 단백질은 아미노산 서열의 비교결과 애기장대의 단백질 아미노산 서열과 83%의 상동성을 나타내었고, 벼(oryza sativa), 콩(Glycine max)등의 작물의 아스파라진합성효소와 80% 정도의 상동성을 나타냄으로서 신규임을 확인 할 수 있었다.

[실시예 2] 식물 병원균 접종에 의한 고추식물에서의 CaAS1 유전자의 발현 탐색방법

상기 실시예 1에서 수득한 CaAS1 유전자의 저항성 탐색에의 이용방법을 확인하기 위해 다음과 같이 시험하였다.

[단계 1]

먼저 저항성 탐색방법을 구체적으로 제시하기 위하여, 식물체와 친화적 반응을 나타내는 고추 세균성 점무늬병원균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)중 병원성균주 Ds1과 불친화적 반응을 나타내는 비병원성 균주 Bv5-4a를 배양한 후, 10⁸ cfu/㎖의 농도로 4엽기의 고추 녹광 품종(Capsicum annuum cv. Nockwang)의 1, 2엽의 뒷면에 주사기를 이용하여 침투(Infiltration)시켜 접종하고, 접종 후에는 28℃, 100% 상대습도 조건에서 18시간 동안 습실처리 하였다. 접종 1, 5, 10, 15, 20, 25 시간 후에 각각 1, 2엽을 샘플링하여 RNA를 분리하고, 분리한 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔 상에서 전기영동한 후 나이론막 (Hybond N+)으로 전이시켰다.

다음으로 실시예 1에서 수득된 CaAS1 유전자를 14-dCTP-비오틴(14-dCTP-biotin)을 이용하여 표지한 후 PCR(Polymerase Chain Reaction)로 증폭 시킨 후 이를 반응액[0.25 M 인산완충액, 7% SDS, 1 mM EDTA, 5% 덱스트란 황산염(Dextran Sulfate)]에서 65℃로 16-24시간 동안 배양하여 하이브리다이제이션 (hybridization)을 실시하였다. 이렇게 비오틴(biotin)이 표지된 상기의 DNA 프로브는 나이론막에 붙어있는 mRNA에 붙게 되며 이 나이론막 위에 X-ray 필름을 얹게 되면 비오틴(biotin)이 표지된 DNA가 X-ray 필름을 감광시키므로, 이것으로 발현 여부를 알아볼 수 있게 하였다.

상기 노던블러팅 수행시 리보솜 RNA의 양을 모니터링 함으로써 동일량의 RNA 시료가 로딩 (loading) 되었음을 확인하였다. 이상의 실험결과를 도 3에 나타내었으며 실험의 결과 CaAS1 유전자는 고추 세균성점무늬병에 대한 고추식물의 저항성 반응은 병원성 균주와 비병원성 균주에 대하여 모두 발현이 나타났다. 특히, 친화적 반응에서는 CaAS1 유전자의 발현이 10시간 이후에 발현이 증가하여 25시간에 최고의 발현양을 나타낸 것이 관찰 되었다. 불친화적 반응을 나타내는 비병원성 균주에서는 접종 후 서서히 발현이 시작되어 5시간에서부터 발현이 강하게 나타나게 되고, 15시간에서 가장 강하게 발현되었다. 그 이후에도 증가된 발현양이 25시간째까지 유지되었으며 친화적 반응보다 CaAS1 유전자 발현이 매우 더 강하였다.

또한, 도 4에 나타난 바와 같이 고추 녹광 품종에 살리실산(Salicylic acid)과 메틸자스모네이트 (methyl jasmonate)를 처리한 후 시간의 경과에 따라 CaAS1 유전자의 발현이 유도되는 것을 확인할 수 있었다.

[실시예 3] CaAS1 유전자 발현의 억제에 의한 병 감수성 증가

고추식물에서 CaAS1 유전자의 발현이 억제되었을 때 병 발생과 관련 다른 유전자들의 유도 여부 및 병에 대한 감수성의 증가 여부를 알아보기 위하여, 실시예 1에서 수득한 CaAS1 유전자를 새롭게 개발된 바이러스 유도 유전자 침묵(VIGS, virus-induced gene silencing)에서 이용되어지는 TRV (Tobacco Rattle Virus)를 이용하여 CaAS1 유전자를 TRV2 벡터(참고문헌 : Baulcombe D. C. (1999) Fast forward genetics based on virus-induced gene silencing. Curr. Opin. Plant Biol. 2: 109-113)에 도입시켜 재조합 벡터인 TRV2::CaAS1을 제조하였다. 이렇게 제조한 재조합벡터 TRV2::CaAS1을 아그로박테리움 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciense strain GV 3101)에 전기천공법(electroporation)을 통하여 도입하고 다시 재조합벡터가 들어가 있는 GV3101 균주를 고추의 떡잎 생육기에 떡잎에 주사기를 사용하여 인필트레이션(infiltration) 방법을 이용하여 고추식물에 도입함으로써 CaAS1 유전자의 발현의 억제를 유도시켰다.

[단계 1]

CaAS1의 발현이 억제된 식물체에서 세균성 병에 대해 감수성이 증가되는지를 알아보기 위하여, 상기의 CaAS1 유전자의 발현이 억제된 고추 식물과 건전한 고추 녹광품종에 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 병원성균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a를 배양하고 접종한 후 각각의 식물에서 5시간과 15시간에 식물을 수거하여 RNA를 추출하여 RT-PCR을 통하여 관찰하였다.

도 5는 VIGS로 CaAS1의 발현이 불활성화된 고추식물에 병원성균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a의 접종 후 결과를 나타냈다.

[단계 2]

CaAS1의 발현이 억제된 식물체에서 감수성 반응의 결과를 알아보기 위하여, 트리판블루 염색(trypan blue staining)을 수행하였다. 도 5에서와 같이 CaAS1의 발현이 억제된 식물에서는 고추 세균성점무늬병균의 병원성균주 Ds1을 접종한 후 병의 발생이 더 심해져서 병감수성이 증대됨을 알 수 있으며, 비병원성 균주인 Bv5-4a를 접종한 후 트리판블루 염색 결과 건전식물에 비하여 과민성 세포사멸에서 차이를 나타내었다(도 6 참조). 또한 이러한 결과의 확인을 위하여 상기의 CaAS1 유전자의 발현이 억제된 고추 식물과 건전한 고추 녹광품종에 고추 세균성 점무늬병(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 병원성균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a를 배양하고 접종한 후 각각의 식물에서 12시간과 24시간에 식물을 수거하여 각각 활성산소와 병원균 침입 후 세포사멸 정도를 측정할 수 있는 이온전도도 (ion conductivity)를 측정하였다. 이 결과 또한 트리판블루 염색과 댑 염색결과와 같이 활성산소와 이온전도도 측정 결과에서도 차이를 나타내었다(도 8 참조).

[단계 3]

CaAS1의 발현이 억제된 식물체에서 병저항성 검정을 위하여 건전식물과 CaAS1의 발현이 억제된 식물체에 고추 세균성 점무늬병균의 병원성균주 Ds1과 비병원성 균주인 Bv5-4a를 접종한 후, 0일, 2일, 4일, 6일에 잎을 수거하여 식물 잎의 1 cm² 세균수를 측정한 후 그 결과를 도 7에 나타내었다.

실험결과 CaAS1의 발현이 억제된 식물체에서 건전식물에 비하여 병원성균주 Ds1과 비병원성 균주인 Bv5-4a 모두에서 감수성이 접종 후에 증대되고 있어 CaAS1 유전자가 병저항성에 관여함을 알 수 있었다(도 7 참조).

[실시예 4] CaAS1 유전자 발현의 억제에 따른 식물내의 아미노산 함량의 변화

CaAS1의 발현이 억제된 식물체에서 세균성 병을 접종 하였을 때, CaAS1의 발현이 억제에 대한 반응으로 아미노산 함량이 변화하는지를 알아보기 위하여, 상기의 CaAS1 유전자의 발현이 억제된 고추 식물과 건전한 고추 녹광품종에 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 병원성균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a를 배양하고 접종한 후 각각의 식물에서 0시간, 18시간과 36시간에 식물을 수거하여 아미노산 추출하여 함량을 관찰하였다. 또한 병원균을 접종하지 않은 건전 식물체와 CaAS1의 발현이 억제된 식물체에서의 아미노산 함량을 확인하였다.

[단계 1]

CaAS1 유전자의 발현이 억제된 고추 식물과 건전한 고추 녹광품종에 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 병원성균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a를 배양하고 접종한 후 시간별로 수거하여, 3% 5-설포살리실산이 함유된 70% 에탄올에서 추출하였다. 추출되어진 아미노산은 액체크로마토 그래피 (HPLC - High-performance liquid chromatography)를 통하여 각각의 아미노산의 함량을 측정하였다. 이렇게 측정된 결과는 아스파틱 엑시드가 CaAS1 유전자의 발현이 억제된 고추 식물과 건전한 고추 녹광품종에서는 유사한 함량을 보였으나, 병 접종이후에 아스파라진의 생합성에 작용하는 유전자로 알려진 CaAS1 유전자의 발현이 억제된 고추 식물에서 아스파라진의 함량이 낮아진 것을 확인할 수 있었다(도 9 참조). 또한 CaAS1 유전자의 발현의 억제에 의하여 낮아진 아스파라진의 함량은 병에 대한 감수성 반응에 기여하였다.

[실시예 5] CaAS1 유전자를 이용한 형질전환 식물체의 제조 및 CaAS1 유전자의 과다발현에 의한 병 저항성의 증가

식물체에서 CaAS1 유전자의 과다발현 시 다른 병 발생과 관련된 유전자들의 유도여부 및 병에 대한 저항성의 증가 여부에 대하여 알아보기 위하여, 실시예 1에서 수득한 CaAS1 유전자를 Stratagene에서 제공하는 pBIN3S 벡터에 도입시켜 pBIN35S::CaAS1을 제조한 후 이렇게 제조된 재조합 벡터인 pBIN35S::CaAS1을 아그로박테리움 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciense strain GV 3101)에 전기천공법(electroporation)을 통하여 도입하고 다시 재조합벡터가 들어가 있는 GV3101 균주를 꽃침지(floral dipping) 방법을 통하여 애기장대 식물에 도입함으로써 형질전환 시켜서 CaAS1 유전자의 과다발현을 유도시킨 후 하기와 같은 시험을 수행하였다.

[단계 1]

CaAS1 유전자가 과다발현된 식물체에서 세균성 병에 대한 저항성이 증가하였는지의 여부를 알아보기 위하여, 먼저 상기 CaAS1 유전자가 과다발현된 애기장대와 대조구로서의 야생형 애기장대 식물체에서 CaAS1의 발현을 관찰하였으며 그 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에서 #1, #11, #12는 사용된 형질전환 식물의 계통번호를 나타내고 CaAS1 유전자의 발현을 양적 리얼타임피씨알(quantitative RT-PCR)을 이용하여 관찰하였다. 실험결과 애기장대 식물에서 CaAS1이 과발현됨을 관찰할 수 있었다.

[단계 2]

상기와 같이 CaAS1이 과다발현된 식물에 슈도모나스 시링게 패소바 토마토 DC3000과 비병원성 균주인 슈도모나스 시링게 패소바 토마토 DC3000 (에이브이알알피엠원)균주를 10⁵ cfu/ml 농도로 접종하고 식물체의 변화를 관찰하였다(도 11). 또한 CaAS1 유전자가 과다발현된 식물체에서 저항성 반응이 나타나는 이유를 알아보기 위해 댑 염색(DAB staining)과 아닐린 블루 염색 (aniline blue staining)을 수행하였다. 그 결과 도 11 및 도 12에 나타난 바와 같이 CaAS1이 과다발현된 식물체에서 야생형에 비하여 세균성 병에 대하여 저항성 증가를 나타내고 있음이 관찰되었고, 특히 도 10에서는 댑 염색(DAB staining)과 아닐린 블루 염색 (aniline blue staining)의 결과를 통하여 CaAS1 유전자가 과다발현된 식물에서 저항성 식물에서 관찰되는 퍼옥시데이즈 활성에 의한 활성 산소가 증가와 캘로스(callose)가 축적되는 것을 관찰할 수 있었다.

[단계 3]

CaAS1이 과다발현된 식물에 슈도모나스 시링게 패소바 토마토 DC3000과 비병원성 균주인 슈도모나스 시링게 패소바 토마토 DC3000 (에이브이알알피엠원) 균주를 접종하고 식물체의 저항성의 검정을 수행하였다. 접종 후 0일과 3일에 잎을 수거하여 식물잎의 1 cm² 세균수를 측정한 후 그 결과를 도 13에 나타내었다.

도 13에서와 같이 병원성 균주와 비병원성 균주 모두에서 CaAS1 유전자가 과다발현된 식물에서 야생형 식물과 비교해서 병원세균의 생장이 유의성 있게 감소하여 병 저항성을 가지고 있는 것으로 관찰되었다.

[실시예 6] CaAS1 유전자 과발현의 따른 식물내의 아미노산 함량의 변화

CaAS1이 과다발현된 애기장대 식물에 슈도모나스 시링게 패소바 토마토 DC3000과 비병원성 균주인 슈도모나스 시링게 패소바 토마토 DC3000 (에이브이알알피엠원) 균주를 접종한 후 CaAS1의 과발현에 의하여 아미노산 함량이 변화하는지를 알아보기 위하여, 상기의 CaAS1이 과다발현된 애기장대 식물에 상기의 병원성 및 비병원성 균주를 접종한 후 각각의 식물에서 0시간, 18시간과 36시간에 식물을 수거하여 아미노산 추출하여 함량을 관찰하였다. 또한 병원균을 접종하지 않은 건전 식물체와 CaAS1의 과발현된 식물체에서의 아미노산 함량을 확인하였다.

[단계 1]

CaAS1이 과다발현된 애기장대 식물과 건전한 애기장대 식물에서 상기의 병원균을 접종한 이후에 시간별로 수거하여, 3% 5-설포살리실산이 함유된 70% 에탄올에서 추출하였다. 추출되어진 아미노산은 액체크로마토 그래피 (HPLC - High-performance liquid chromatography)를 통하여 각각의 아미노산의 함량을 측정하였다. 이렇게 측정된 결과는 병 접종 이후에 CaAS1 유전자가 과다발현된 애기장대 식물에서 아스파라진의 함량이 증가된 것을 확인할 수 있었다. 이에 CaAS1 유전자의 과발현에 의하여 높아진 아스파라진의 함량은 병에 대한 저항성 반응에 기여함을 확인하였다(도 14 참조).

[실시예 7] 하이알로페르노스포라 Noco2의 접종 후에 CaAS1 유전자의 과다발현된 식물에서 병 저항성의 변화

CaAS1이 과발현된 애기장대 식물체에 노균병을 일으키는 하이알로 페르노스포라 Noco2(Hyaloperonospora arabidopsidis Noco 2)를 접종한 후 시험을 수행하였다.

CaAS1이 과발현된 애기장대식물의 떡잎시기에 하이알로 페르노스포라 Noco2 를 5x10⁴ mL^-1의 농도로 스프레이를 통하여 뿌려주었다. 접종 후 17℃의 온도에서 습실 처리하였다.

[단계 1]

각각의 식물체에서 하이알로 페르노스포라균에 대한 저항성 여부를 관찰하기 위하여 접종 후 6일 째에 관찰하였고, 7일에 트리판 블루 염색을 수행하였다. 도 16 및 도 17과 같이 CaAS1이 과다발현된 식물에서 야생형에 비하여 분생자경(sporangiophores) 및 포자(spore)의 형성이 감소되어 저항성 반응을 관찰 할 수 있으며 트리판 블루 염색을 통하여 야생형에 비하여 균사의 생장이 덜 발달 되고 있음을 알 수 있었다.

[단계 2]

각각의 식물체에서 하이알로 페르노스포라균의 저항성 검정을 위하여 하이알로 페르노스포라균의 접종 후 형성되는 분생자경의 수를 센 후 0-5, 6-10, 11-15, 16-20, 20이상으로 그룹을 만든 후 평균값과 전체에 대한 비율(%)로 표시하였다. 도 17과 같이 건전한 식물에 비하여 CaAS1이 과다발현된 식물에서는 평균값과 비율에서도 야생형에 비하여 저항성을 나타냄을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였으나, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (8)

1. 식물병 저항성 관련 유전자로서 고추 유래 아스파라진합성효소를 코딩하는 하기 (a) 또는 (b)의 분리된 유전자(CaAS1):
   (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자;
   (b) 서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자.
2. 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 분리된 단백질 (CaAS1).
3. 제1항 기재의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
4. 제1항 기재의 유전자 또는 제3항 기재의 재조합 벡터에 의해 형질전환된 애기장대 식물체.
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