JP2018527934A - アスパラギン含有量を低減させた植物体 - Google Patents

アスパラギン含有量を低減させた植物体 Download PDF

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Abstract

アスパラギンシンテターゼの発現または活性を低減させた、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体、またはその部分であって、該アスパラギンシンテターゼが、（ｉ）配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性、または配列番号３、もしくは配列番号５、もしくは配列番号７に対して少なくとも７２％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリヌクレオチド配列；または（ｉｉ）（ｉ）に記載したポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド；または（ｉｉｉ）配列番号２、もしくは配列番号４、もしくは配列番号６、もしくは配列番号８に対して少なくとも７８％の配列同一性を持つポリペプチドを、含むか、それから成るか、もしくはそれから実質的に成り；（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）に記載した該アスパラギンシンテターゼの発現または活性が、対照植物体と比較して低減された、該突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体、またはその部分が本明細書で説明されている。【選択図】なし

Description

本発明は、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ならびにその変異体、相同体、および断片に由来するアスパラギンシンテターゼをコードする遺伝子のポリヌクレオチド配列を開示する。それによりコードされるポリペプチド配列、ならびにその変異体、相同体、および断片も開示される。また、一つ以上のこの遺伝子の発現、またはそれによりコードされるタンパク質の活性を、植物体中のアスパラギンのレベルを調節するために改変することについて開示される。
アクリルアミドは、式Ｃ３Ｈ５ＮＯの化合物（ＩＵＰＡＣ名はプロパ−２−エナミド）であり、その潜在的な毒性に関する懸念が増大している。たばこを含む喫煙物品のエアロゾル中にあるアクリルアミドの発生源は、アミノ酸のアスパラギンである可能性があり、アスパラギンは該喫煙物品の製造に使用するたばこ材料の中に存在しうるものである。そのため、植物体中の、特にたばこの製造に使用する植物体中の特定のアミノ酸（アスパラギンなど）のレベルを低減させることが望ましい場合がある。
米国特許出願公開第２０１３／００６８２４０号には、概して、少なくとも一つのアミノ酸を低減させることを示した遺伝子組み換えたばこ植物体とたばこ製品とが記載され、そのたばこは、加熱および／または燃焼の際に、少なくとも一つのアミノ酸由来の化合物の発生レベルを、組み換えしていない親たばこ植物体と比べて低減させるようにしている。また、アスパラギンのレベルを低減させ、かつ紙巻たばこの煙中のアクリルアミドのレベルを低減させる突然変異体たばこ系統を得るために、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）で種子を突然変異誘発させることについて記載されている。種々のＥＭＳ突然変異体が、米国特許出願公開第２０１３／００６８２４０号に記述されている。熱風送管乾燥処理済みの上部の茎の葉において、三つのＥＭＳ突然変異体、すなわち、ＦＣ Ｕｐ １０ＮＨ−５、ＦＣ Ｕｐ １０ＮＨ−１８、およびＦＣ−Ｕｐ １０ＮＨ−２３が示したのは、（ｉ）アスパラギンのそれぞれ７１％、３０％、６２％低減；（ｉｉ）たばこの煙中アクリルアミドのそれぞれ４７％、４２％、４４％低減；（ｉｉｉ）熱風送管乾燥処理済みの上部の茎たばこにおけるニコチンのそれぞれ３８％低減、１１１％増加、１９％低減である。このように、最も高いアスパラギンおよびアクリルアミドの低減率はそれぞれ７１％および４７％であり、突然変異体ＦＣ−Ｕｐ １０ＮＨ−５で成し遂げられた。しかしながら、この突然変異体では、対照と比較してニコチンレベルが３８％低減していた。熱風送管乾燥処理済みの中間部の茎の葉において、三つのＥＭＳ突然変異体、すなわち、ＦＣ Ｍｉｄ１０ＮＨ−５、ＦＣ Ｕｐ １０ＮＨ−１８、およびＦＣ−Ｕｐ １０ＮＨ−２３が示したのは、（ｉ）アスパラギンのそれぞれ６％低減、５３１％増加、２９％低減；（ｉｉ）たばこの煙中アクリルアミドのそれぞれ１９％低減、１４０％増加、２００％増加；（ｉｉｉ）熱風送管乾燥処理済みの中間部の茎たばこにおけるニコチンのそれぞれ３６％低減、１１３％増加、１９％低減である。このように、最も高いアクリルアミドの低減率は１９％であり、ＦＣ Ｕｐ １０ＮＨ−５で成し遂げられたが、アスパラギンの低減率はわずか６％であり、ニコチンレベルが３６％低減していた。
最も高いアスパラギンおよびアクリルアミドの低減率はそれぞれ７１％および４７％であり、ＦＣ−Ｕｐ １０ＮＨ−５である熱風送管乾燥処理済みの上部の茎の葉で見られている。しかし、この突然変異体では、対照と比較してニコチンレベルが３８％低減していた。ＦＣ Ｕｐ １０ＮＨ−５である熱風送管乾燥処理済み中間部の茎の葉において、アクリルアミドレベルはわずか１９％低減し、アスパラギンレベルはわずか６％低減するのみであり、対照と比較したニコチンレベルはまたも低減（３６％）した。
ニコチンレベルが低減するのは望ましくないが、これはたばこ製品の消費者が、同じレベルのニコチンを得るためにより多くのたばこを吸う必要が生じるからである。米国特許出願公開第２０１３／００６８２４０号に提示された結果から、アスパラギン、アクリルアミド、およびニコチンのレベルは、種々のＥＭＳ突然変異体間で大きく、またランダムに変動することも明らかになっている。
植物体におけるアスパラギンレベルを低減させ、それにより、植物体の加熱または燃焼された部分から生じるエアロゾル中のアクリルアミド量を最小化するための、別の方法を見出すことが望ましい。アクリルアミドの量を、米国特許出願公開第２０１３／００６８２４０号に開示されたレベルよりも少ないレベルにさらに低減する方法を見出すことも望ましい。また、植物体中のニコチンレベルを維持することも望ましい。これらの特性を備えた植物体をばらつきなく生産することができる方法を開発することも望ましい。本発明は、このニーズに対処することを探究するものである。
ＮｔＡＳＮ１−Ｓ（配列番号：１）、ＮｔＡＳＮ１−Ｔ（配列番号：３）、ＮｔＡＳＮ３−Ｓ（配列番号：９）、ＮｔＡＳＮ３−Ｔ（配列番号：１１）、ＮｔＡＳＮ５−Ｓ（配列番号：５）、およびＮｔＡＳＮ５−Ｔ（配列番号：７）と称する六つの完全長アスパラギンシンテターゼ遺伝子を、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）において特定した。ＡＳＮ３−Ｓ遺伝子およびＡＳＮ３−Ｔ遺伝子は、乾燥処理中、不完全に発現するのみであることがわかったのに対し、驚いたことに、ＮｔＡＳＮ１−Ｓ、ＮｔＡＳＮ１−Ｔ、ＮｔＡＳＮ５−Ｓ、およびＮｔＡＳＮ５−Ｔは、乾燥処理中（例えば、乾燥処理の最初の１０時間、２０時間、３０時間、４０時間、５０時間、６０時間、７０時間、８０時間、９０時間または１００時間の間に）、高発現することがわかった。ＡＳＮ３−Ｓ遺伝子もしくはＡＳＮ３−Ｔ遺伝子、またはそれによりコードされるタンパク質は、本開示では使用しないのが適切である。ＮｔＡＳＮ１および／もしくはＮｔＡＳＮ５の発現、またはそれによりコードされるタンパク質の活性を低減させることは、乾燥処理済みの葉（乾燥処理済みの中間下部の茎の葉など）のアスパラギンレベルの低減に寄与すると、本明細書に示されている。これにより、乾燥処理済みの葉を加熱または燃焼させる際に生成するエアロゾル中のアクリルアミドのレベルが減じることになる。米国特許出願公開第２０１３／００６８２４０号で得られた結果とは対照的に、ＮｔＡＳＮ１またはＮｔＡＳＮ５の発現を低減させることで、葉中のアスパラギンが低減するだけでなく、エアロゾル中のアクリルアミドも一様に低減する。アスパラギンレベルおよびアクリルアミドレベルを一様に低減させても、対照植物体と比して多くはないにせよ、略同等の乾燥処理済みの葉中のニコチンレベルをもたらす。有利なことには、本開示の特定の実施形態では、実質的にニコチン含有量への影響を最小限にするかまたは影響を及ぼさずに、アスパラギンの約８９％低減およびアクリルアミドの約７０％の低減といった減じた値が得られうる。
理論に束縛されることを望まないが、たばこエアロゾルで生成されるアクリルアミドは、葉の乾燥処理中に発生するアスパラギンのプールに依存することがさらに明らかになっている。従って、乾燥処理または乾燥の初期段階で活性であるアスパラギンシンテターゼの発現または活性を調節する（例えば、減じる）ことにより、乾燥処理または乾燥中に発生するアスパラギンのプールを低減させることで、エアロゾル中のアクリルアミドレベルを調節（例えば、減少）することができる。アスパラギンの含有量を低減させた、かつアスパラギンシンテターゼの発現または機能を低減させた植物体が記載されている。実施形態では、これは、乾燥処理もしくは乾燥間に発現する本明細書に記載のアスパラギンシンテターゼコード配列のＲＮＡ干渉または突然変異を用いることで達成される。アスパラギンレベルを低減させることで、エアロゾル中に存在するアクリルアミドの量を減じる。これをたばこに適用すると、喫煙物品（加熱式または燃焼式たばこ製品を含む）の消費者によって吸入されるエアロゾル中に存するアクリルアミドの量を減じることになる。本発明のさらなる利点が本明細書で述べられる。
発明の態様および実施形態
本発明の態様および実施形態は、付属されている請求の範囲に記載している。
一態様では、アスパラギンシンテターゼの発現または活性を低減させた、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体、またはその部分であって、該アスパラギンシンテターゼが、（ｉ）配列番号１に対して少なくとも７２％もしくは少なくとも９０％の配列同一性、または配列番号３、もしくは配列番号５、もしくは配列番号７に対して少なくとも７２％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリヌクレオチド配列；または（ｉｉ）（ｉ）に記載したポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド；または（ｉｉｉ）配列番号２、もしくは配列番号４、もしくは配列番号６、もしくは配列番号８に対して少なくとも７８％の配列同一性を持つポリペプチドを、含むか、それから成るか、もしくはそれから実質的に成り；（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）に記載した該アスパラギンシンテターゼの発現または活性が、対照植物体と比較して低減された、該突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体、またはその部分が提供されている。
好適には、該植物体は、制御領域に、またはアスパラギンシンテターゼをコードするポリヌクレオチドのコード配列に、少なくとも一つの遺伝子改変を含む。
好適には、アスパラギンシンテターゼの発現または活性を低減させることにより、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体、またはその部分由来の乾燥処理または乾燥済みの葉におけるアスパラギンのレベルを、対照植物体由来の乾燥処理または乾燥済みの葉におけるアスパラギンのレベルと比べて低減させ、そこで好適には、アスパラギンのレベルを、対照植物体と比べて少なくとも約１７％低減させる。
好適には、アスパラギンシンテターゼの発現または活性を低減させることにより、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体、またはその部分由来の乾燥処理または乾燥済みの葉を加熱または燃焼させる際に生成するエアロゾル中のアクリルアミドのレベルを、対照植物体由来の乾燥処理または乾燥済みの葉と比べて低減させ、そこで好適には、エアロゾル中のアクリルアミドのレベルを、対照植物体の乾燥処理または乾燥済みの葉と比べて少なくとも２０％低減させる。
好適には、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体、またはその部分由来の乾燥処理または乾燥済みの葉におけるアスパラギンのレベルは、対照植物体の乾燥処理または乾燥済みの葉よりも少なくとも約２２％少なく、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体、またはその部分由来の乾燥処理または乾燥済みの葉を加熱または燃焼させる際に生成するエアロゾル中のアクリルアミドの量は、対照植物体のエアロゾルよりも少なくとも２４％少なく；そこで好適には、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体、またはその部分由来の乾燥処理または乾燥済みの葉におけるアスパラギンのレベルは、対照植物体の乾燥処理または乾燥済みの葉と比べて少なくとも約４４％少なく、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体、またはその部分由来の乾燥処理または乾燥済みの葉を加熱または燃焼させる際に生成するエアロゾル中のアクリルアミドの量は、対照植物体のエアロゾルと比べて少なくとも６６％少なく；そこで好適には、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体、またはその部分由来の乾燥処理または乾燥済みの葉におけるアスパラギンのレベルは、対照植物体の乾燥処理または乾燥済みの葉と比べて少なくとも約７０％少なく、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体、またはその部分由来の乾燥処理または乾燥済みの葉を加熱または燃焼させる際に生成するエアロゾル中のアクリルアミドの量は、対照植物体のエアロゾルと比べて少なくとも約８８％少ない。
好適には、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体、またはその部分由来の乾燥処理または乾燥済みの葉におけるニコチンのレベルは、対照植物体の乾燥処理または乾燥済みの葉におけるニコチンのレベルと実質的に同じである。
好適には、グルタミン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸は、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体、またはその部分由来の乾燥処理または乾燥済みの葉において、対照植物体の乾燥処理または乾燥済みの葉と比べてより多く形成される。
好適には、植物体は、たばこ、または茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）から成る群から選択される。
好適には、たばこ植物体は、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）のたばこ植物体であり、好ましくはバーレータイプのタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）のたばこ植物体である。
好適には、植物体は、（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）に記載したアスパラギンシンテターゼをコードするポリヌクレオチド配列の各コピーにおいて、少なくともの一つの突然変異、好適には、アスパラギンシンテターゼをコードするＲＮＡ転写物の翻訳を妨げる停止変異および／または遺伝子断片を含む。
好適には、アスパラギンシンテターゼヌクレオチド配列は、停止変異をコードするヌクレオチド配列を、配列番号１９、配列番号２１、および配列番号２３における停止変異をコードするヌクレオチド配列の位置に相当する位置で含むか、またはアスパラギンシンテターゼは、終止コドンをコードするヌクレオチド配列を、配列番号２０、配列番号２２、および配列番号２４における終止コドンの位置に相当する位置で含む。
好適には、アスパラギンシンテターゼは、配列番号１９、配列番号２１、および配列番号２３から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含むか、または配列番号１９、配列番号２１、および配列番号２３から成る群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるか、または配列番号２０、配列番号２２、および配列番号２４に記載したポリペプチド配列を含むか、それから成るか、もしくはそれから実質的に成る。
好適には、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体、またはその部分の植物体由来の葉のバイオマス量は、対照植物体由来の葉のバイオマス量と実質的に同じである。
好適には、葉は空気乾燥処理され、そこで好適には、空気乾燥処理済みの葉は、日光乾燥処理または火力乾燥処理されている。
好適には、葉は空気乾燥され、そこで好適には、空気乾燥済みの葉は、日光乾燥または火力乾燥されている。
別の態様では、本開示の植物体由来の植物材料、または乾燥処理もしくは乾燥済みの植物材料が提供されている。
別の態様では、本開示の植物体または植物材料の少なくとも一部分を含む植物産物が提供されている。
別の態様では、植物材料であって、対照植物体由来の植物材料と比べて、アスパラギンのレベルが低減し、かつ該植物材料由来のエアロゾル中のアクリルアミドのレベルが低減した該植物材料の調製方法であって、該方法が、（ａ）アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号１に対して少なくとも７２％もしくは少なくとも９０％の配列同一性、または配列番号３、もしくは配列番号５、もしくは配列番号７に対して少なくとも７２％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリヌクレオチドを含む、植物体またはその部分を提供する工程と；（ｂ）該植物体またはその部分において、ポリヌクレオチドの発現、またはそれによってコードされるタンパク質の活性を低減させる工程と；（ｃ）該植物体またはその部分由来の植物材料を収穫する工程と；（ｄ）該植物材料を乾燥または乾燥処理する工程と；（ｅ）任意選択的に、該植物体もしくはその部分におけるアスパラギンのレベルを測定する、および／または該植物体もしくはその部分由来のエアロゾル中のアクリルアミドのレベルを測定する工程と；（ｆ）乾燥処理または乾燥済みの植物材料であって、アスパラギンのレベルが低減し、かつ該植物材料由来のエアロゾル中のアクリルアミドのレベルが低減した、該乾燥処理または乾燥済みの植物材料を取得する工程と、を含み、好適には、ニコチンのレベルが、対照植物体におけるニコチンのレベルと実質的に同じであり；好適には、グルタミン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸が、対照植物体の乾燥処理または乾燥済みの葉と比べてより多く形成される、該方法が提供されている。
好適には、植物材料は、収穫後、少なくとも約３日間の間、乾燥処理または乾燥される。
好適には、植物材料は空気乾燥処理され、好ましくは、該空気乾燥処理済みの葉は、日光乾燥処理または火力乾燥処理されている。
好適には、植物材料は空気乾燥か、日光乾燥か、または火力乾燥される。
この方法によって得られるか、または得ることが可能な植物材料も開示される。
別の態様では、植物体において一つ以上の遺伝子改変を識別する方法であって、該植物体が、該一つ以上の遺伝子改変を含まない対照植物体に比べて、該植物体由来の乾燥処理または乾燥済みの植物材料におけるアスパラギンのレベルの低減と、該乾燥処理もしくは乾燥済みの植物体またはその部分由来のエアロゾル中のアクリルアミドのレベルの低減とに関連する、該方法が、（ａ）対照植物体由来の植物材料と比べて、該植物体由来の植物材料におけるアスパラギンのレベルが低減し、かつ乾燥処理または乾燥済み植物材料由来のエアロゾル中のアクリルアミドのレベルが低減した、乾燥処理または乾燥済みの植物体を識別する工程と；（ｂ）工程（ａ）で識別された植物体由来の核酸試料を提供する工程と；（ｃ）工程（ｂ）からの核酸試料において、アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号１に対して少なくとも７２％もしくは少なくとも９０％の配列同一性、または配列番号３、もしくは配列番号５、もしくは配列番号７に対して少なくとも７２％の配列同一性を持つ、ポリヌクレオチド配列内の一つ以上の遺伝子改変を識別する工程と、を含む、該方法が提供されている。
別の態様では、対照植物体と比べて、アスパラギンのレベルが低減し、かつ乾燥処理または乾燥済み植物材料由来のエアロゾル中のアクリルアミドのレベルが低減した、植物材料の生成方法であって、該方法が、（ａ） 本開示の植物体または植物材料を提供する工程と；（ｂ）該植物体由来の植物材料を収穫する工程と；（ｃ）該植物材料をある期間の間、乾燥処理または乾燥する工程と；（ｄ）乾燥処理または乾燥済みの植物材料であって、アスパラギンのレベルが低減し、かつ該乾燥処理または乾燥済み植物材料由来のエアロゾル中のアクリルアミドのレベルが低減した、該乾燥処理または乾燥済みの植物材料を得る工程と、を含み、好適には、ニコチンのレベルが、対照植物体におけるニコチンのレベルと実質的に同じであり；好適には、グルタミン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸が、対照植物体と比べてより多く形成される、該方法が提供されている。
別の態様では、アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号１に対して少なくとも７２％もしくは少なくとも９０％の配列同一性、または配列番号３、もしくは配列番号５、もしくは配列番号７に対して少なくとも７２％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るか、あるいは、アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号１９、配列番号２１、および配列番号２３に対して少なくとも７２％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成り、ただし、配列番号１９、配列番号２１、および配列番号２３に対して少なくとも７２％の配列同一性を持つ配列が、配列番号１９、配列番号２１、および配列番号２３内の終止コドンの位置に相当する位置で終止コドンをコードするヌクレオチド配列を含むという条件付きである、単離ポリヌクレオチド配列であって、好ましくは、該単離ポリヌクレオチドが、合成ポリヌクレオチドまたはｃＤＮＡである、該配列が提供されている。
別の態様で、本明細書で説明したポリヌクレオチドによりコードされた単離ポリペプチドが提供されている。
別の実施形態で、アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号２、もしくは配列番号４、もしくは配列番号６、もしくは配列番号８、もしくは配列番号 ２０、もしくは配列番号 ２２、もしくは配列番号 ２４に対して少なくとも７８％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、もしくはそれから実質的に成るか、または、アスパラギンシンテターゼをコードし、配列番号２、もしくは配列番号４、もしくは配列番号６、もしくは配列番号８、もしくは配列番号 ２０、もしくは配列番号 ２２、もしくは配列番号 ２４に対して少なくとも７８％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、もしくはそれから実質的に成り、ただし、配列番号 ２０、もしくは配列番号 ２２、もしくは配列番号 ２４に対して少なくとも７８％の配列同一性を持つ配列が、配列番号 ２０、もしくは配列番号 ２２、もしくは配列番号 ２４内の終止コドンの位置に相当する位置で終止コドンを含むという条件付きである、単離ポリヌクレオチドであって、好ましくは、該単離ポリヌクレオチドが合成ポリヌクレオチドまたはｃＤＮＡである、該単離ポリヌクレオチドが提供されている。
別の態様で、本明細書で説明した単離ポリヌクレオチドを含む構築物、ベクターまたは発現ベクターが提供されている。
別の態様で、本明細書で説明した植物体由来の、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組み換えの植物体細胞が提供されている。
別の態様で、本明細書で説明した細胞を含む、乾燥処理または乾燥済みの植物材料が提供されている。
別の態様で、本明細書で説明した植物材料を含む、たばこ製品または喫煙物品が提供されている。
記載した実施形態のうちの一つ以上の組み合わせもまた開示される。
アスパラギンは乾燥処理の間に盛んに生成されることが本明細書に示されている。アスパラギンの蓄積は、乾燥処理済み植物材料が加熱または燃焼される際に生成するエアロゾル中のアクリルアミドの形成をもたらすことが示されている。好都合なことに、ＮｔＡＳＮ１−Ｓ、ＮｔＡＳＮ１−Ｔ、ＮｔＡＳＮ５−Ｓ、およびＮｔＡＳＮ５−Ｔは、乾燥処理の間、特に乾燥処理の初期から、高発現する。これらの遺伝子のうちの一つ以上の発現を低減させることにより、アスパラギンのレベルを乾燥処理工程の間を通して低減させることができるため、その結果としてエアロゾル中のアクリルアミドのレベルを減じることができる。
本明細書で説明した改変植物体におけるニコチンのレベルには限定的な影響しかなく、これは、改変植物体をたばこ植物体の生産に使用することを意図した場合に望ましいことである。
本明細書で説明した方法は、乾燥処理または乾燥の間にアスパラギンの蓄積を低減させ、かつエアロゾル中のアクリルアミドの形成も減じる植物体を一様にもたらす。
葉のバイオマスおよび表現型には限定的な影響しかなく、これは、本明細書で説明した改変植物体を商業目的で用いる際に有利である。
本開示により、消費者に受け入れられ易いと思われる遺伝子組み換えではない改変植物体が生成できるようになる。
本開示は、米国特許出願公開第２０１３／００６８２４０号に記載のＥＭＳ突然変異体である植物体の使用に制限されるものではない。ＥＭＳ突然変異体である植物体は、育種後の作物に改善特性をもたらす可能性が低い場合がある。一旦育種を開始すると、ＥＭＳ突然変異体である植物体の望ましい特性は種々の理由で失われうる。例えば、いくつかの突然変異が所望され、その突然変異は優性であるかまたは劣性である可能性があり、遺伝子標的における点突然変異を特定するのが困難である恐れがある。対照的に、本開示は、所望の表現型を有する植物体を生成するために、特異的に操作および／またはノックアウトされうる特定の遺伝子を活用する。本開示は、他のたばこ品種または作物に適用され、それにより、少なくともアクリルアミドを減少させる所望の解決策を提供することができる。
図１は、同一圃場（五つのプロット反復の平均）で栽培され、一斉に乾燥処理された、３種の異なるバーレーたばこにおけるアスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン（Ｇｌｕ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、およびすべての遊離アミノ酸（ａａ）の含有量を示す。３種のバーレーは、ＴＮ９０（Ａ）、Ｂａｎｋｅｔ Ａ１（Ｂ）、およびＫｅｎｔｕｃｋｙ １４（Ｃ）である。 図２は、バーレー葉を乾燥処理する間の、アスパラギン、グルタミン、およびアスパラギン酸の発生量の経時変化を示す。 図３は、アスパラギンシンテターゼ活性化経路を示す。 図４は、たばこの単一グレードであるバージニア（ＦＣ）、オリエント（ＯＲ）、カストリ（ＫＳ）、またはバーレー（ＢＵ）、およびバージニア（ＦＣ）とカストリ（ＫＳ）とオリエント（ＯＲ）との混合を含むブレンド（ＲＲＰと称する）におけるアスパラギンの存在間にある相関を示す。 図５は、スイスで栽培されたスイスバーレーＳｔｅｌｌａが、空気乾燥処理室で１０週間（伝統的な農作業、ＢＵ−ＡＣ）か、または熱風送管乾燥処理オーブン（スイスバージニアたばこと全く同様、ＢＵ−ＦＣ）のいずれかで乾燥処理された場合に得られた結果を示す。乾燥処理後、葉身を粉砕し、アスパラギンの定量を行った（Ａ）。均質化したたばこ材料の粉末（２００ミクロン以下）を作製した。均質化したたばこ材料は、エアロゾル発生装置と共に使用するのに、基本的に国際公開第２０１３０９８４０５号に記載の通りにエアロゾル発生物品で使用された。エアロゾル発生物品を、カナダ保健省の喫煙方式を用いて喫煙して、エアロゾル中のアクリルアミドの含有量を算出した（Ｂ）。 図６は、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）タンパク質のＡｔＡＳＮ１（Ａｔ３ｇ４７３４０）、ＡｔＡＳＮ２（Ａｔ５ｇ６５０１０）、およびＡｔＡＳＮ３（Ａｔ５ｇ１０２４０）、ならびにトマトタンパク質Ｓｏｌｙｃ０６ｇ００７１８０およびＳｏｌｙｃ０４ｇ０５５２００と比較した、ＮｔＡＳＮ１−Ｓ、ＮｔＡＳＮ１−Ｔ、ＮｔＡＳＮ３−Ｓ、ＮｔＡＳＮ３−Ｔ、ＮｔＡＳＮ５−Ｓ、ＮｔＡＳＮ５−Ｔに相当するたばこ遺伝子から推定されるアミノ酸配列の系統樹を示す。 図７は、２０１０年にスイスで栽培されたスイスバーレーたばこ（Ｓｔｅｌｌａ）を乾燥処理する間の、ＡＳＮ遺伝子の発現を示す。ＡＲＮは、圃場で（約４時間）、および９６時間の乾燥処理の間に空気乾燥処理室内で、経時的に採取された葉の試料（中間部の茎位置）から単離された。特異的プローブでの遺伝子発現は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ製Ｔｏｂａｒｒａｙチップを用いたマイクロアレイ分析を用いることにより算出された。 図８は、４８時間乾燥処理した後のスイスバーレー（Ｓｔｅｌｌａ、Ａ＆Ｃ）とスイスバージニア（ブライト、ＩＴＢ ６８３、Ｂ＆Ｂ）たばこにおけるＡＳＮ遺伝子の発現を示す。 図９は、２０１３年にパイェルヌの圃場で栽培された４種の異なるバーレー葉（下部の茎位置）における６０時間空気乾燥処理後のＡＳＮ１、ＡＳＮ５（Ａ）およびＡＳＮ３（Ｂ）の収穫後の発現を示す。 図１０は、圃場で栽培された成熟したバーレーたばこから採取した８つの組織（未成熟花（Ｉｍ＿花）；下部の茎位置の葉（＿ＬＳ）、中間部の茎位置の葉（＿ＭＳ）、および上部の茎位置の葉（＿ＵＳ）；花弁、根、咢片、ならびに茎）におけるＡＳＮ１、ＡＳＮ５（左側パネル）およびＡＳＮ３（右側パネル）の発現を示す。 図１１は、ＭＭＶプロモーターまたはＥ４プロモーターの制御下、温室栽培されたＡＳＮ１−ＲＮＡｉ植物体におけるアスパラギンの含有量と、３日間の乾燥処理後に測定されたＡＳＮ１の転写レベルとを示す。アスパラギンの量は、各形質転換事象を有する１５個の植物体に由来した中間下部の茎の葉位置で測定された（Ａ）。ＡＳＮ１転写物の相対的発現量は、各形質転換事象由来の１５個の植物体において、３日間の乾燥処理後に採取したＲＮＡを用いたｑＰＣＲで見積もられた（Ｂ）。 図１２は、ＭＭＶプロモーターまたはＥ４プロモーターの制御下、温室栽培されたＡＳＮ１−ＲＮＡｉ植物体におけるグルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸およびニコチンの含有量を示す。Ｇｌｎ（Ａ）、Ａｓｐ（Ｂ）、Ｇｌｕ（Ｃ）、およびニコチン（Ｄ）の量は、各形質転換事象を有する１５個の植物体に由来した中間下部の茎の葉位置で測定された。 図１３は、ＭＭＶプロモーターまたはＥ４プロモーターの制御下、温室栽培されたＡＳＮ５−ＲＮＡｉ植物体におけるアスパラギンの含有量と、３日間の乾燥処理後に測定されたＡＳＮ５の転写レベルとを示す。アスパラギンの量は、各形質転換事象を有する１５個の植物体に由来した中間下部の茎の葉位置で測定された（Ａ）。ＡＳＮ５転写物の相対的発現量は、各形質転換事象由来の１５個の植物体において、３日間の乾燥処理後に採取したＲＮＡを用いたｑＰＣＲで見積もられた（Ｂ）。 図１４は、ＭＭＶプロモーターまたはＥ４プロモーターの制御下、温室栽培されたＡＳＮ５−ＲＮＡｉ植物体におけるグルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸およびニコチンの含有量を示す。Ｇｌｎ（Ａ）、Ａｓｐ（Ｂ）、Ｇｌｕ（Ｃ）、およびニコチン（Ｄ）の量は、各形質転換事象を有する１５個の植物体に由来した中間下部の茎の葉位置で測定された。 図１５は、ＡＳＮ１−ＲＮＡｉ系統およびＡＳＮ５−ＲＮＡｉ系統の葉バイオマスを示す。四つの葉が各形質転換事象を有する４個の植物体から中間部の茎位置で採取され、ランダムに選択、および秤量された。重量平均および標準偏差が示されている。 図１６は、スイスバーレー（Ｓｔｅｌｌａ）の空気乾燥処理初期段階におけるＣＹＰ８２Ｅ４の発現を示す。転写量は、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼＣＹＰ８２Ｅ４に対する特異的プローブＮｔＰＭＩａ１ｇ２ｅ２＿ｓｔに基づくＴｏｂａｒｒａｙ Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップを用いて測定された。 図１７は、ＡＳＮ変異体におけるアスパラギンの低減率を示す。各変異体系統の百分率の値が、野生型（ＷＴ）ｏｕｔ−ｓｅｇｒｅｇａｎｔに対して計算された。 図１８は、中間下部の茎位置で収穫された乾燥処理済みの葉（４）のバイオマスを示す。 図１９は、ＡＳＮ１−ＲＮＡｉ葉、ＡＳＮ５−ＲＮＡｉ葉、およびそのそれぞれの対照葉から作製されたエアロゾル形成物品（国際公開第２０１３／０９８４０５号に記載）を加熱することより発生するエアロゾル中のアクリルアミドを定量した値を示す。５０％バージニアたばことブレンドした後、ＡＳＮ１−ＲＮＡｉ葉、ＡＳＮ５−ＲＮＡｉ葉、および対照葉の微粉中のアスパラギンを定量した（図１１および図１３を参照）（Ａ、Ｃ）。たばこブレンドをキャストリーフにし、エアロゾル形成物品内で加熱した。続いて、エアロゾル中のアクリルアミドを定量した（Ｂ、Ｄ）。 図２０は、ＡＳＮ１−ＲＮＡｉおよびその各対照の中間部の茎の葉身からなるカットフィラーから作製された、可燃性紙巻たばこの煙中のアクリルアミドを定量した値を示す。ＡＳＮ１−ＲＮＡｉ葉および対照葉から調製されたカットフィラー中のアスパラギンを定量した（パネルＡ）。可燃性紙巻たばこを喫煙し、煙中のアクリルアミドを分析する。 図２１は、ＡＳＮ１−Ｓ＿停止変異体および対照（野生型ｏｕｔ−ｓｅｇｒｅｇａｎｔ）の葉から作製されたエアロゾル発生物品からのエアロゾル中のアクリルアミドを定量した値を示す。５０％バージニアたばことブレンドした後、ＡＳＮ１−Ｓ＿停止変異体の葉と対照の葉の微粉中にあるアスパラギンを定量した（Ａ）。たばこブレンドをキャストリーフにし、エアロゾルをエアロゾル形成物品から発生させた。続いて、エアロゾル中のアクリルアミドを定量した（Ｂ）。 図２２は、ＡＳＮ−ＲＮＡｉ植物体を産するのに使用するベクターの例を示す。
定義
本明細書の範囲内で使用される技術的な用語および表現には一般に、植物体および分子生物学の関連分野でそれらに共通して適用される意味が与えられる。以下の用語の定義はどれも、本明細書の全内容に適用される。「含む、備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、それ以外の要素または工程を除外するものではなく、また不定冠詞「ａ」もしくは「ａｎ」は、複数であることを除外するものではない。ある一つの工程が、請求の範囲に列挙された複数の特徴の機能を実現することもある。所定の数値または範囲の文脈での「約」、「本質的に」および「およそ」という用語は、所定の値または範囲の２０％以内、１０％以内、または５％、４％、３％、２％または１％以内である値または範囲を意味する。
「単離した」という用語は、その天然の環境から取り去った任意の実体を意味するが、この用語は、いかなる精製の度合いも暗示してはいない。
「発現ベクター」は、核酸の発現を可能にするための核酸成分の組み合わせを含む核酸媒体である。適切な発現ベクターには、円形の二本鎖核酸プラスミド、線形の二本鎖核酸プラスミド、およびその他の任意の起源の機能的に等価な発現ベクターなど、染色体外の複製が可能なエピソームが含まれる。発現ベクターは、上流に位置し、下記に定義する通り、核酸、核酸構築物または核酸結合体に作用できるように連結された、少なくともプロモーターを含む。
「構築物」という用語は、一つ以上のポリヌクレオチドを備える二本鎖の組み換え体核酸断片を意味する。構築物は、補完的「センス鎖またはコード鎖」と対になった「テンプレート鎖」塩基を含む。所定の構築物を、ベクター（発現ベクターなど）内に位置するプロモーターの向きに対して同一（またはセンス）または反対（またはアンチセンス）のいずれかの方向に、可能性のある２つの方向でベクターに挿入できる。
「ベクター」は、核酸、核酸構築物および核酸結合体、およびこれに類するものの運搬を可能にするための核酸成分の組み合わせを含む、核酸媒体を意味する。適切なベクターには、円形の二本鎖核酸プラスミド、線形の二本鎖核酸プラスミド、およびその他の任意の起源のベクターなど、染色体外の複製が可能なエピソームが含まれる。
「プロモーター」は、一般に上流に位置し、二本鎖ＤＮＡ断片に作用できるように連結された核酸の要素／配列を意味する。プロモーターは、所定の未変性遺伝子に最も近い領域に完全に由来することも、または異なる未変性のプロモーターまたは合成ＤＮＡセグメントに由来する異なる要素から構成することもできる。
「相同性、同一性または類似性」という用語は、配列の整列によって比較した２個のポリペプチド間または２個の核酸分子間の配列の類似性の度合いを意味する。比較対象の２個の不連続な核酸配列間の相同性の度合いは、比較可能な位置での同一または一致するヌクレオチドの数の関数である。同一性のパーセント値は、目視検査および数学的計算によって決定しうる。別の方法として、２個の核酸配列の同一性のパーセント値は、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡまたはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎなどのコンピュータプログラムを使用して、配列情報を比較することにより決定しうる。二つの配列の同一性のパーセント値は以下に依存して異なる値をとりうる：（ｉ）例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（異なるプログラムで実装）または３Ｄ比較による構造的整列などの、配列を整列するのに用いる方法；ならびに（ｉｉ）整列方法（例えば、ローカルアライメント対グローバルアライメント）に用いるパラメータ、使用される対スコア行列（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＡＭ２５０、Ｇｏｎｎｅｔなど）、およびギャップペナルティ（例えば、関数形式および定数）。整列させた後、二つの配列間の同一性のパーセント値を計算する様々な方法がある。例えば、同一性の数を、（ｉ）最短配列長；（ｉｉ）整列長；（ｉｉｉ）配列の平均長：（ｉｖ）非ギャップ位置の数；または（ｉｖ）オーバーハングを除く等価位置の数で除してもよい。さらに、同一性のパーセント値は、長さにも大きく依存することが理解されるだろう。従って、配列の対が短いほど、偶然生じる考えられる配列同一性がより高くなる。一般的な多重整列プログラムＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （１９９４） ２２， ４６７３−４６８０；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （１９９７）， ２４， ４８７６−４８８２）は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの多重整列を作成するのに好適な方法である。ＣｌｕｓｔａｌＷの適切なパラメータは以下の通りである：ポリヌクレオチド整列について：ギャップオープンペナルティ＝１５．０、ギャップ伸長ペナルティ＝６．６６、行列＝Ｉｄｅｎｔｉｔｙ。ポリペプチド整列について：ギャップオープンペナルティ＝１０．０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．２、行列＝Ｇｏｎｎｅｔ。ＤＮＡおよびタンパク質の整列について：ＥＮＤＧＡＰ＝−１、およびＧＡＰＤＩＳＴ＝４。当業者であれば、最適な配列の整列のためにこれらのパラメータおよび他のパラメータを変える必要がありうることに留意するであろう。続いて、好適には、同一性のパーセント計算値は、こうした整列からＮ／Ｔ（Ｎは、配列が同一残基を共有している位置の数、Ｔは、ギャップを含めるがオーバーハングを除いて比較される位置の総数である）として計算される。
「変異体」は、実質的に類似した配列を意味する。変異体は、野生型配列と類似した機能または実質的に類似した機能を持ちうる。アスパラギンシンテターゼでは、類似した機能は、同一の条件下で、アスパラギン酸をアスパラギンに変換する野生型酵素機能の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％である。アスパラギンシンテターゼでは、実質的に類似した機能は、同一の条件下で、アスパラギン酸をアスパラギンに変換する野生型酵素機能の少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。変異体は、野生型ポリペプチドと比較してアスパラギンシンテターゼ活性のレベルが低減した酵素を結果的にもたらす、一つ以上の好都合な突然変異を持つことができる。変異体は、それらのアスパラギンシンテターゼ活性が結果的にノックアウトされる一つ以上の好都合な突然変異を持つことができる（すなわち、１００％抑制、よって非機能的ポリペプチド）。野生型ＡＳＮ１−Ｓの例示的な変異体は、ＡＳＮ１−Ｓ＿Ｗ１５６＊（配列番号１９および２０）であり、これは、野生型ＡＳＮ１−Ｓポリペプチドと比較してアスパラギンを約１７％低減させる好都合な停止変異を有する。野生型ＡＳＮ１−Ｔの例示的な変異体は、ＡＳＮ１−Ｔ＿Ｗ１５６＊（配列番号２１および２２）であり、これは、野生型ＡＳＮ１−Ｓポリペプチドと比較してアスパラギンを約８３％低減させる好都合な停止変異を有する。野生型ＡＳＮ５−Ｓの例示的な変異体は、ＡＳＮ５−Ｓ＿Ｑ６６＊（配列番号２３および２４）であり、これは、野生型ＡＳＮ１−Ｓポリペプチドと比較してアスパラギンを約４４％低減させる好都合な停止変異を有する。
「植物」という用語は、そのライフサイクルまたは発育の任意の段階にある任意の植物もしくはその部分、およびその子孫を意味する。一つの実施形態で、植物体は「たばこ植物体」であり、これはたばこ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）に属する植物体を意味する。好ましい種のたばこ植物体は、本明細書に記述される。好適には、植物体は、一つ以上遺伝子の発現または一つ以上タンパク質の活性が対照植物体に比べて調節された、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組み換えの植物体である。好適には、植物体を、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組み換えの植物体に変える改変により、一つ以上遺伝子の発現または一つ以上タンパク質の活性が調節されるようになる。特定の実施形態では、改変は、遺伝子改変か、または遺伝子修飾である。
「植物の部分」は、植物体細胞、植物プロトプラスト、そこから再生可能な植物全体を再生可能な植物体細胞組織培養、植物カルス、植物凝集塊、ならびに植物体または植物体の部分（胚、花粉、葯、胚珠、種子、葉、花、茎、枝、果実、根、根の先端部およびこれに類するものなど）内で無傷の植物体細胞を含む。再生された植物体の子孫、変異体および突然変異体も、本明細書に記載された導入済みのポリヌクレオチドを含む場合、本開示の範囲内に含まれる。植物体の葉は、本開示における使用に特に好ましい。
「植物体細胞」とは、植物の構造的および生理学的な単位を指す。植物体細胞は、細胞壁のない原形質体、単離した単一の細胞、もしくは培養した細胞の形態で、または、植物組織、植物器官、または植物全体などを含むがこれらに限定されない、より高次の組織的単位の部分であってもよい。
「植物材料」という用語は、バイオマス、葉、茎、根、花または花の部分、果実、花粉、卵細胞、接合体、種子、切断物、分泌物、抽出物、細胞または組織培養物、または植物体のその他任意の部分または生成物を含めた、植物体から獲得しうる任意の固体、液体またはガス状の組成、またはその組み合わせを意味する。一つの実施形態で、植物材料は、バイオマス、幹、種子または葉を含むか、またはそれらから構成される。別の実施形態で、植物材料は、葉を含むか、またはそれらから構成される。
「品種」という用語は、同じ種の他の植物体と区別する一定の特性を共有する植物体の母集団を意味する。一つ以上の特有の形質を有しながらも、品種は、その品種内の個体間で非常に些細な全体的変化によって特性付けられる。品種は、しばしば市販されていることがある。
「系統」または「育種系統」という用語は、本明細書で使用されるとき、植物体の育種時に使用される植物体群を意味する。系統は、他の形質について個体間でいくらかの変化がある場合もあるが、一つ以上の所定の形質について個体間での変化はわずかしか現れないため、品種と区別しうる。
本明細書で使用されるとき、「非天然（の）」という用語は、天然では形成されないかまたは天然には存在しない物質（例えば、ポリヌクレオチド、遺伝子突然変異、ポリペプチド、植物体、植物体細胞および植物材料）を意味する。こうした非天然の物質または人工的な物質は、本明細書で説明したか、または当業界において公知の方法によって、作成、合成、開始、修飾、介在、または操作されうる。こうした非天然の物質または人工的な物質は、人によって作成、合成、開始、修飾、干渉、または操作されうる。こうして、一例として、非天然の植物体、非天然の植物体細胞または非天然の植物材料は、遺伝子操作技術（アンチセンスＲＮＡ、干渉ＲＮＡ、メガヌクレアーゼおよびこれに類するものなど）を用いて作製されうる。さらなる例として、非天然の植物体、非天然の植物体細胞または非天然の植物材料は、結果的に得られる植物体、植物体細胞または植物材料またはその子孫が天然では形成されないかまたは天然には存在しない遺伝的構成（例えば、ゲノム、染色体またはそのセグメント）を含むように、一つ以上の遺伝的突然変異（例えば、一つ以上の多型）を第一の植物体または植物体細胞から第二の植物体または植物体細胞（これはそれ自体が天然でありうる）に遺伝子移入するかまたは移動することで作成しうる。結果的に得られる植物体、植物体細胞または植物材料は、こうして人工的なものであるか、または天然のものではない。従って、人工的または非天然の植物体または植物体細胞は、結果的に得られる遺伝子配列が第一の植物体または植物体細胞とは異なる遺伝的背景を備える第二の植物体または植物体細胞内で自然発生する場合であっても、第一の天然の植物体または植物体細胞内での遺伝子配列を修飾することにより作成しうる。
「調節する」という用語は、低減、抑制（阻害）、増大またはその他の方法でポリペプチドの発現または活性に影響を及ぼすことを意味しうる。この用語はまた、転写活性の調節を含むがこれに限定されない、ポリペプチドをコードする遺伝子の活性を低減する、抑制する、増大する、またはその他の方法で影響を及ぼすことを意味しうる。
本明細書で使用されるとき、「減少する」または「低減される」という用語は、限定はされないが、ポリペプチド活性、転写性の活性およびタンパク質発現などの、量または活性の約１０％〜約９９％の減少、または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％以上の減少を意味する。
本明細書で使用されるとき、「抑制する」または「抑制された」という用語は、限定はされないが、ポリペプチド活性、転写性の活性およびタンパク質発現などの、量または活性の、約９８％〜約１００％の減少、または少なくとも９８％、少なくとも９９％、特に１００％の減少を意味する。
細胞の形質転換は、安定的であっても過渡的であってもよい。「過渡的形質転換」もしくは「過渡的に形質転換する」という用語またはその変化形は、外因性ポリヌクレオチドを宿主細胞のゲノムに組み込むことなく、一つ以上の外因性ポリヌクレオチドを細胞に導入することを意味する。一方、「安定的形質転換」または「安定的に形質転換する」という用語は、一つ以上の外因性ポリヌクレオチドを細胞のゲノムに導入し、組み込むことを意味する。「安定形質転換体」という用語は、一つ以上の外因性ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡまたはオルガネラＤＮＡに安定的に組み込まれた細胞を意味する。本開示の核酸、構築物、および／またはベクターで形質転換された生物体またはその細胞は、過渡的にも安定的にも形質転換されうることが理解されるべきである。特定の実施形態では、安定的形質転換が好ましい。
本明細書で使用されるとき、「増加する」または「増加された」という用語は、限定はされないが、ポリペプチド活性、転写性の活性およびタンパク質発現などの、量または活性の約５％〜約９９％の増大、または少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％以上の増大を意味する。
本明細書で使用されるとき、および量の文脈で使用されるとき、「実質的」という用語は、その量が、比較される量の少なくとも約１０％、少なくとも約９％、少なくとも約８％、少なくとも約７％、少なくとも約６％、少なくとも約５％、少なくとも約４％、少なくとも約３％、少なくとも約２％、少なくとも約１％、または少なくとも約０．１％であることを意味する。
対照植物体または対照植物体細胞の文脈での「対照」という用語およびこれに類するものは、対象の遺伝子またはタンパク質の発現または活性が調節されておらず、それゆえに酵素の発現または活性が改変された植物体または植物体細胞との比較または参照を提供できる、植物体または植物体細胞を意味する。従って、本発明の文脈では、対照は、アスパラギンシンテターゼの発現または活性を低減させる遺伝子改変を一つも含むことはないことになる。対照植物体または植物体細胞は、空のベクターを備えうる。対照植物体または植物体細胞は、野生型植物体または野生型植物体細胞などに対応しうる。こうしたすべての場合において、被験植物および対照植物体は、比較目的で同一のプロトコルを使用して培養および収穫がなされる。本明細書に記載された遺伝子もしくはポリペプチドのレベル、比率、活性、もしくは分布の変化、または植物体の表現型の変化、特にアスパラギンの蓄積の低減、および／もしくはアクリルアミドの蓄積の低減、および／もしくはグルタミンの蓄積の増加、および／もしくはアスパラギン酸の蓄積の増加、および／もしくはグルタミン酸の蓄積の増加は、被験植物体を対照植物体と比較することにより測定することができ、そこで好適には、該被験植物体および対照植物体は、同一のプロトコルを使用して栽培および／または収穫されたものである。対照植物体は、被験植物体の表現型の変化を測定するための基準点を提供することができる。表現型の変化の測定は、植物の成長中、老化時、または乾燥処理後を含めて、植物中で任意の時点で測定されうる。表現型の変化の測定は、グロースチャンバー内、温室内、または野原で成長した植物体からのものを含め、任意の条件下で成長した植物体中で測定することができる。表現型の変化は、アスパラギン含有量、および／もしくはグルタミン含有量、および／もしくはアスパラギン酸含有量、および／もしくはグルタミン酸含有量（Ｍｏｌｄｏｖｅａｎｕ （２００５）に記載）を測定することによって計測することができ、ならびに／またはアクリルアミド含有量（Ｐａｐｏｕｓｅｋ ｅｔ ａｌ．， ２０１４、および／またはＯｎｏａ ｅｔ ａｌ．， ２００３、および／またはアメリカ合衆国環境保護庁Ｍｅｔｈｏｄ ８０３２Ａ−Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｂｙ Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ， Ｒｅｖｉｓｉｏｎ １， Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９６）、および／もしくはニコチン含有量（ＣＯＲＥＳＴＡ（Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｔｏ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ）Ｍｅｔｈｏｄ Ｎｕｍｂｅｒ ６２を使用、Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｉｃｏｔｉｎｅ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ ａｎｄ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｂｙ ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ （Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００５））は、乾燥処理もしくは乾燥の前、および／またはその間、および／またはその後に、当業界で周知の方法を用いてモニターすることができる。遊離アミノ酸分析を、Ｍｏｌｄｏｖｅａｎｕ （２００５）を基にした方法を用いて行った。
一つの実施形態で、配列リストに示す任意のポリヌクレオチドを含めた、本明細書で説明した任意の配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を持つポリヌクレオチド配列を含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成る単離ポリヌクレオチドが提供されている。単離ポリヌクレオチドは、それに対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７８％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を持つ配列を含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成ることが適切である。単離ポリヌクレオチドは、それに対して少なくとも７２％、７３％、７４％、７５％、７８％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を持つ配列を含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成ることがさらに適切である。本明細書で説明した配列の整列を表１に示す。
別の実施形態で、配列番号１、または配列番号３、または配列番号５、または配列番号７、または配列番号９、または配列番号１１に対して少なくとも６０％の配列同一性を持つポリヌクレオチド配列を含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成る単離ポリヌクレオチドが提供されている。単離ポリヌクレオチドの配列番号１、または配列番号３、または配列番号５、または配列番号７、または配列番号９、または配列番号１１は、配列番号１、または配列番号３、または配列番号５、または配列番号７、または配列番号９、または配列番号１１に対して少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、７８％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％の配列同一性を持つ配列を含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成ることが適切である。単離ポリヌクレオチドは、配列番号１、または配列番号３、または配列番号５、または配列番号７、または配列番号９、または配列番号１１に対して少なくとも７２％、７３％、７４％、７５％、７８％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を持つ配列を含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成ることがさらに適切である。
単離ポリヌクレオチドは、配列番号１に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を持つ配列を含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成ることがさらに適切である。
単離ポリヌクレオチドは、配列番号３、または配列番号５、または配列番号７、または配列番号９、または配列番号１１に対して少なくとも７２％、７３％、７４％、７５％、７８％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を持つ配列を含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成ることがさらに適切である。
別の実施形態で、配列番号１９、または配列番号２１、または配列番号２３に対して少なくとも６０％の配列同一性を持つポリヌクレオチド配列を含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成る単離ポリヌクレオチドが提供されているが、ただし該単離ポリヌクレオチドは、配列番号１９、または配列番号２１、または配列番号２３に記載された位置に相当する位置で終止コドンをコードする突然変異を含むという条件付きである。
単離ポリヌクレオチドは、配列番号１９、または配列番号２１、または配列番号２３に対して少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、７８％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％の配列同一性を持つ配列を含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成ることが適切である。単離ポリヌクレオチドは、配列番号１９、または配列番号２１、または配列番号２３に対して少なくとも７２％、７３％、７４％、７５％、７８％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を持つ配列を含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成ることがさらに適切である。
別の実施形態で、配列番号１、または配列番号３、または配列番号５、または配列番号７、または配列番号９、または配列番号１１に対して実質的な相同性（すなわち、配列の類似性）または実質的な同一性を持つポリヌクレオチドを含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリヌクレオチドが提供されている。
別の実施形態で、配列番号１９、または配列番号２１、または配列番号２３に対して実質的な相同性（すなわち、配列の類似性）または実質的な同一性を持つポリヌクレオチドを含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリヌクレオチドが提供されているが、ただし該単離ポリヌクレオチドは、配列番号１９、または配列番号２１、または配列番号２３に記載された位置に相当する位置で終止コドンをコードする突然変異を含むという条件付きである。
別の実施形態で、配列番号１、または配列番号３、または配列番号５、または配列番号７、または配列番号９、または配列番号１１の配列に対して少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、７８％，８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％の配列同一性を持つ、ポリヌクレオチド変異体が提供されている。好適には、配列番号１、または配列番号３、または配列番号５、または配列番号７、または配列番号９、または配列番号１１の配列に対して少なくとも約７２％、７３％、７４％、７５％、７８％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％の配列同一性を持つ、ポリヌクレオチド変異体が提供されている。
好適には、配列番号１の配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％の配列同一性を持つポリヌクレオチド変異体が提供されている。
好適には、配列番号３、または配列番号５、または配列番号７、または配列番号９、または配列番号１１の配列に対して少なくとも約７２％、７３％、７４％、７５％、７８％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％の配列同一性を持つ、ポリヌクレオチド変異体が提供されている。
別の実施形態で、配列番号１９、または配列番号２１、または配列番号２３の配列に対して少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、７８％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％の配列同一性を持つポリヌクレオチド変異体が提供されているが、ただし該ポリヌクレオチド変異体は、配列番号１９、または配列番号２１、または配列番号２３に記載された位置に相当する位置で終止コドンをコードする突然変異を含むという条件付きである。好適には、配列番号１９、または配列番号２１、または配列番号２３の配列に対して少なくとも約７２％、７３％、７４％、７５％、７８％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％の配列同一性を持つポリヌクレオチド変異体が提供されているが、ただし該ポリヌクレオチド変異体は、配列番号１９、または配列番号２１、または配列番号２３に記載された位置に相当する位置で終止コドンをコードする突然変異を含むという条件付きである。別の実施形態で、配列番号１、または配列番号３、または配列番号５、または配列番号７、または配列番号９、または配列番号１１の対応する断片に対して少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、７８％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％の配列同一性を持つ、それに対して実質的な相同性（すなわち、配列の類似性）または実質的な同一性を備えた、配列番号１、または配列番号３、または配列番号５、または配列番号７、または配列番号９、または配列番号１１の断片が提供されている。
別の実施形態で、配列番号１の対応する断片に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％の配列同一性を持つ、それに対して実質的な相同性（すなわち、配列の類似性）または実質的な同一性を備えた、配列番号１の断片が提供されている。
別の実施形態で、配列番号３、または配列番号５、または配列番号７、または配列番号９、または配列番号１１の対応する断片に対して少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、７８％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％の配列同一性を持つ、それに対して実質的な相同性（すなわち、配列の類似性）または実質的な同一性を備えた、配列番号３、または配列番号５、または配列番号７、または配列番号９、または配列番号１１の断片が提供されている。
好適には、配列番号１、または配列番号３、または配列番号５、または配列番号７、または配列番号９、または配列番号１１の対応する断片に対して少なくとも約７２％、７３％、７４％、７５％、７８％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％の配列同一性を持つ、それに対して実質的な相同性（すなわち、配列の類似性）または実質的な同一性を備えた、配列番号１、または配列番号３、または配列番号５、または配列番号７、または配列番号９、または配列番号１１のポリヌクレオチド変異体の断片が提供されている。
好適には、配列番号１の対応する断片に対して少なくとも約７２％、７３％、７４％、７５％、７８％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％の配列同一性を持つ、それに対して実質的な相同性（すなわち、配列の類似性）または実質的な同一性を備えた、配列番号１のポリヌクレオチド変異体の断片が提供されている。
好適には、配列番号３、または配列番号５、または配列番号７、または配列番号９、または配列番号１１の対応する断片に対して少なくとも約７２％、７３％、７４％、７５％、７８％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％の配列同一性を持つ、それに対して実質的な相同性（すなわち、配列の類似性）または実質的な同一性を備えた、配列番号３、または配列番号５、または配列番号７、または配列番号９、または配列番号１１のポリヌクレオチド変異体の断片が提供されている。
別の実施形態で、配列番号１９、または配列番号２１、または配列番号２３の対応する断片に対して少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、７８％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％の配列同一性を持つ、それに対して実質的な相同性（すなわち、配列の類似性）または実質的な同一性を備えた、配列番号１９、または配列番号２１、または配列番号２３のポリヌクレオチド断片が提供されているが、ただし該断片は、配列番号１９、または配列番号２１、または配列番号２３に記載された位置に相当する位置で終止コドンをコードする突然変異を含むという条件付きである。好適には、配列番号１９、または配列番号２１、または配列番号２３の対応する断片に対して少なくとも約７２％、７３％、７４％、７５％、７８％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％の配列同一性を持つ、それに対して実質的な相同性（すなわち、配列の類似性）または実質的な同一性を備えた、配列番号１９、または配列番号２１、または配列番号２３のポリヌクレオチド変異体の断片が提供されているが、ただし該断片は、配列番号１９、または配列番号２１、または配列番号２３に記載された位置に相当する位置で終止コドンをコードする突然変異を含むという条件付きである。
別の実施形態で、アスパラギンシンテターゼとして機能するポリペプチドをコードする配列番号１、または配列番号３、または配列番号５、または配列番号７、または配列番号９、または配列番号１１に対して十分または実質的な度合いの同一性または類似性を備えたポリヌクレオチドが提供されている。本明細書で説明したポリヌクレオチドは、配列番号２、または配列番号４、または配列番号６、または配列番号８、または配列番号１０、または配列番号１２に記載されたタンパク質の活性の少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％以上であるアスパラギンシンテターゼ活性を有するタンパク質をコードすることが適切である。ポリペプチドが機能的なアスパラギンシンテターゼであるかを判定するために、Ｒｏｍａｇｎｉ ＆ Ｄａｙａｎ （２０００） Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ． Ｍａｙ；４８（５）：１６９２−６に記載されたアッセイを使用することができる。別の実施形態で、アスパラギンシンテターゼとして機能するポリペプチドをコードする配列番号１９、または配列番号２１、または配列番号２３に対して十分または実質的な度合いの同一性または類似性を備えたポリヌクレオチドが提供されているが、ただし該ポリヌクレオチドは、配列番号１９、または配列番号２１、または配列番号２３に記載された位置に相当する位置で終止コドンをコードする突然変異を含むという条件付きである。本明細書で説明したポリヌクレオチドは、配列番号１９、または配列番号２１、または配列番号２３に記載されたタンパク質の活性の少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％以上であるアスパラギンシンテターゼ活性を有するタンパク質をコードすることが適切である。
特定の実施形態では、アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号１、および配列番号３、および配列番号５、および配列番号７に対して少なくとも７２％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリヌクレオチドの発現が調節される。
特定の実施形態では、アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリヌクレオチドの発現が調節される。
特定の実施形態では、アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号３、および配列番号５、および配列番号７に対して少なくとも７２％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリヌクレオチドの発現が調節される。
特定の実施形態では、アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号１、または配列番号３、または配列番号５、または配列番号７に対して少なくとも７２％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリヌクレオチドの発現が調節される。
特定の実施形態では、アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリヌクレオチドの発現が調節される。
特定の実施形態では、アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号３、または配列番号５、または配列番号７に対して少なくとも７２％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリヌクレオチドの発現が調節される。
特定の実施形態では、アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号１、および配列番号３に対して少なくとも７２％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリヌクレオチドの発現が調節される。特定の実施形態では、アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性と、配列番号３に対して少なくとも７２％の配列同一性とを持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリヌクレオチドの発現が調節される。特定の実施形態では、アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号５および配列番号７に対して少なくとも７２％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリヌクレオチドの発現が調節される。特定の実施形態では、アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号１、および配列番号３、および配列番号５、および／または配列番号７に対して少なくとも７２％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリヌクレオチドの発現が調節される。特定の実施形態では、アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性と、配列番号３、および配列番号５、および／または配列番号７に対して少なくとも７２％の配列同一性とを持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリヌクレオチドの発現が調節される。特定の実施形態では、アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号１、および／または配列番号３、および配列番号５、および配列番号７に対して少なくとも７２％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリヌクレオチドの発現が調節される。特定の実施形態では、アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性、ならびに／または配列番号３、および配列番号５、および配列番号７に対して少なくとも７２％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリヌクレオチドの発現が調節される。
特定の実施形態では、アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号１９、および配列番号２１、および配列番号２３に対して少なくとも７２％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリヌクレオチドの発現が調節されるが、ただし該ポリヌクレオチドは、配列番号１９、または配列番号２１、または配列番号２３に記載された位置に相当する位置で終止コドンをコードする突然変異を含むという条件付きである。
特定の実施形態では、アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号１９、または配列番号２１、または配列番号２３に対して少なくとも７２％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリヌクレオチドの発現が調節されるが、ただし該ポリヌクレオチドは、配列番号１９、または配列番号２１、または配列番号２３に記載された位置に相当する位置で終止コドンをコードする突然変異を含むという条件付きである。
特定の実施形態では、アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号１９および配列番号２１に対して少なくとも７２％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリヌクレオチドの発現が調節されるが、ただし該ポリヌクレオチドは、配列番号１９および配列番号２１に記載された位置に相当する位置で終止コドンをコードする突然変異を含むという条件付きである。
特定の実施形態では、アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号２１および配列番号２３に対して少なくとも７２％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリヌクレオチドの発現が調節されるが、ただし該ポリヌクレオチドは、配列番号２１および配列番号２３に記載された位置に相当する位置で終止コドンをコードする突然変異を含むという条件付きである。
特定の実施形態では、アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号１９、および配列番号２１、および／または配列番号２３に対して少なくとも７２％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリヌクレオチドの発現が調節されるが、ただし該ポリヌクレオチドは、配列番号１９、配列番号２１、および配列番号２３に記載された位置に相当する位置で終止コドンをコードする突然変異を含むという条件付きである。
特定の実施形態では、アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号１９、および／または配列番号２１、および配列番号２３に対して少なくとも７２％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリヌクレオチドの発現が調節されるが、ただし該ポリヌクレオチドは、配列番号 １９、配列番号２１、および配列番号２３に記載された位置に相当する位置で終止コドンをコードする突然変異を含むという条件付きである。
本明細書で説明したポリヌクレオチドは、未変性または変性のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）としうるヌクレオチドの重合体を含めることができる。従って、ポリヌクレオチドは、限定はされないが、ゲノムＤＮＡ、補完的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ｍＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡまたはその断片とすることができる。その上、ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ、一本鎖および二本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む混成体分子、または一本鎖のおよび二本鎖の領域またはその断片の混合物を持つ混成体分子とすることができる。さらに、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方またはその断片を含む、三重鎖領域で構成されることもできる。ポリヌクレオチドは、ホスホチオアートなどの一つ以上の変性塩基を含むことができ、またペプチド核酸とすることができる。一般的に、ポリヌクレオチドは、単離したかまたはクローン化したｃＤＮＡの断片、ゲノムＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、または個別ヌクレオチド、上記の組み合わせから組み立てることができる。本明細書で説明したポリヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列として示しているが、配列には、それらの対応するＲＮＡ配列、およびその逆相補を含む、それらの補完的（例えば、完全に補完的な）ＤＮＡまたはＲＮＡ配列が含まれる。
本明細書で説明したポリヌクレオチドは、一般的にリン酸ジエステル結合を含むが、一部のケースでは、ポリヌクレオチド類似物は、例えば、ホスホルアミド酸、ホスホロチオ酸、ホスホロジチオ酸、またはＯ−メチルホホロアミダイト連鎖、ならびにペプチドポリヌクレオチドのバックボーンおよび連鎖を含む、代わりのバックボーンを持ちうる。その他の類似体ポリヌクレオチドは、陽性のバックボーンを持つもの、非イオン性バックボーン、および非リボースバックボーンを含む。例えば、こうした分子の生理学的環境での、またはバイオチップ上のプローブとしての安定性および半減期を増大させるためなどの様々な理由で、リボース−リン酸塩バックボーンの修飾を行いうる。天然のポリヌクレオチドおよび類似物の混合物を作成することができるが、別の方法として、異なるポリヌクレオチド類似物の混合物、ならびに天然のポリヌクレオチドおよび類似物の混合物を作成しうる。
様々なポリヌクレオチド類似物、例えば、ホスホルアミド酸、ホスホロチオ酸、ホスホロジチオ酸、Ｏ−メチルホホロアミダイト連鎖およびペプチドポリヌクレオチドのバックボーンおよび連鎖などが知られている。その他の類似体ポリヌクレオチドは、陽性のバックボーンを持つもの、非イオン性バックボーン、および非リボースバックボーンを含む。一つ以上の炭素環式糖を含むポリヌクレオチドも含まれる。
その他の類似物は、ペプチドポリヌクレオチド類似物であるペプチドポリヌクレオチドを含む。これらのバックボーンは、天然のポリヌクレオチドの多価のリン酸ジエステルバックボーンとは対照的に、中性条件下で実質的に非イオン性である。これは結果的に有利となりうる。まず、ペプチドポリヌクレオチドバックボーンは、ハイブリッド形成動態学を改善しうる。ペプチドポリヌクレオチドは、ミスマッチの塩基対と完全に一致した塩基対を比較すると融解温度でより大きな変化を持つ。ＤＮＡおよびＲＮＡは、一般に内部でのミスマッチについて２〜４℃の融解温度の低下を示す。非イオン性ペプチドポリヌクレオチドバックボーンについては、この低下は７〜９℃に近い。同様に、それらが持つ非イオン性から、これらのバックボーンに付着した塩基のハイブリッド形成は、塩分濃度に対して比較的鈍感である。さらに、ペプチドポリヌクレオチドは、細胞の酵素によって劣化することも、より小さな範囲に分解されることもないと考えられ、そのためより一層安定性がありうる。
開示されたポリヌクレオチド、およびその断片の用途の中には、核酸ハイブリダイゼーションアッセイでのプローブとしての断片の用途や、核酸増幅アッセイで使用するプライマーがある。こうした断片は、一般的にＤＮＡ配列の少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０以上の連続するヌクレオチドを備える。その他の実施形態で、ＤＮＡ断片は、ＤＮＡ配列の少なくとも約１０、１５、２０、３０、４０、５０または６０以上の連続するヌクレオチドを備える。従って、一態様において、アスパラギンシンテターゼ活性を有するタンパク質をコードするか、またはアスパラギンシンテターゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを検出するための、プローブもしくはプライマーまたはその両方の使用を含む方法も提供されている。例示的なプライマーは、配列番号 １３〜１６に記載されている。従って、さらなる態様は、以下の配列番号に少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％配列同一性を持つヌクレオチド配列を含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るオリゴヌクレオチドプライマーに関する：配列番号１３、配列番号 １４、配列番号 １５、または配列番号 １６。また、アスパラギンシンテターゼ活性を備えたタンパク質をコードするポリヌクレオチドの検出に、これらのプライマーを用いる方法と、その使用とが開示される。
ポリヌクレオチドに対するハイブリッド形成条件の選択に影響する基本的なパラメータおよび適切な条件を考案するための手引きについては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．、Ｅ． Ｆ． ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ． Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．）により記載されている。遺伝暗号の知識と本明細書で説明したアミノ酸配列との組み合わせを用いて、縮重オリゴヌクレオチドのセットを作成できる。こうしたオリゴヌクレオチドは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法鎖反応（ＰＣＲ）など、プライマーとして有用であり、そこでＤＮＡ断片が単離され増幅される。ある一定の実施形態で、縮重プライマーは、遺伝的ライブラリ用のプローブとして使用できる。こうしたライブラリは、ｃＤＮＡライブラリ、ゲノムライブラリ、またさらには電子的な発現配列タグまたはＤＮＡライブラリを含むが、これに限定されない。この方法によって識別された相同配列は次に、本明細書で特定した配列の相同体を特定するためのプローブとして使用される。
また、潜在的な用途は、低い厳密度の条件下で、通常はやや厳密な条件で、また一般に高い厳密度の条件下で、本明細書で説明したポリヌクレオチドに対してハイブリッド形成する、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド（例えば、プライマーまたはプローブ）の用途である。ハイブリッド形成条件の選択に影響する基本的なパラメータおよび適切な条件を考案するための手引きについては、当該技術分野の当業者であれば、例えば、ポリヌクレオチドの長さまたは塩基の組成に基づき、容易に特定できる。やや厳密な条件の達成の一つの方法は、５×標準クエン酸ナトリウム、０．５％ナトリウムドデシル硫酸塩、１．０ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ｐＨ ８．０）、約５０％ホルムアミドのハイブリッド形成緩衝液、６×標準クエン酸ナトリウムを含む予洗溶液をハイブリッド形成温度約５５℃で（または約５０％ホルムアミドを含むものなど、その他の類似したハイブリッド形成溶液をハイブリッド形成温度約４２℃で）使用することと、０．５×標準クエン酸ナトリウム、０．１％ナトリウムドデシル硫酸塩中での約６０℃の洗浄条件とが関与する。一般的に、高い厳密度の条件は、上記のハイブリッド形成条件として定義されるが、洗浄はおよそ６８℃で、０．２×標準クエン酸ナトリウム、０．１％ナトリウムドデシル硫酸塩である。ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ塩化ナトリウム塩化物、１０ｍＭリン酸ナトリウム、および１．２５ｍＭエチレンジアミン四酢酸、ｐＨ７．４）を、ハイブリッド形成および洗浄緩衝液中で標準クエン酸ナトリウム（１×標準クエン酸ナトリウムは、０．１５Ｍ塩化ナトリウム塩化物および１５ｍＭクエン酸ナトリウム）と置換でき、洗浄はハイブリッド形成の完了後１５分間実施される。当然のことながら、洗浄する温度および洗浄する塩分濃度は、当業者にとって公知であり、下記にさらに説明のある、ハイブリッド形成反応および二重鎖の安定性を支配する基本原則を適用することにより、望ましい度合いの厳密性を達成するために必要に応じて調整できる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｅ． Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ， ａｎｄ Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ （１９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙを参照）。ポリヌクレオチドを未知の配列の標的ポリヌクレオチドにハイブリッド形成するとき、混成体の長さは、ポリヌクレオチドのハイブリッド形成の長さであると想定される。既知の配列のポリヌクレオチドをハイブリッド形成するとき、混成体の長さは、ポリヌクレオチドの配列を整列させ、最適な配列の補完性のある領域を識別することにより決定できる。長さが５０塩基対未満であると予想される混成体についてのハイブリッド形成温度は、混成体の融解温度よりも５〜１０℃低いべきだが、ここで、融解温度は以下の等式によって決定される。長さが１８塩基対未満の混成体では、融解温度（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）である。長さが１８塩基対を超える混成体では、融解温度（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）であり、式中、Ｎは混成体中の塩基の数、［Ｎａ＋］はハイブリッド形成緩衝液中のナトリウムイオン濃度（１×標準クエン酸ナトリウムの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）である。通常、こうしたそれぞれのハイブリッド形成用ポリヌクレオチドは、ハイブリッド形成の対象となるポリヌクレオチドの長さの少なくとも２５％（少なくとも５０％、６０％、または７０％であることが一般で、少なくとも８０％が最も一般的）の長さを持ち、またハイブリッド形成の対象となるポリヌクレオチドと少なくとも６０％の配列同一性（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）を持つ。
当業者であれば理解できるように、直鎖ＤＮＡは、５’−３’方向と３’−５’方向の２つの潜在的な方向性を持つ。例えば、基準配列が５’−３’方向に配置されており、かつ第二の配列が同一のポリヌクレオチド分子／鎖内で５’−３’方向に配置されている場合には、基準配列および第二の配列は同一の方向を向いており、すなわち同一の方向を持つ。通常、所定のプロモーターの制御下にある関心のプロモーター配列および遺伝子は、同一の方向に配置される。ただし、５’−３’方向に配置されている基準配列に関して、第二の配列が同一のポリヌクレオチド分子／鎖内で３’−５’方向に配置されている場合には、基準配列および第二の配列は、アンチセンスの方向を向いており、すなわちアンチセンス方向である。相互に対してアンチセンス方向を持つ２つの配列は、これとは別に、基準配列（５’−３’方向）および基準配列の逆相補配列（５’−３’方向に配置されている基準配列）が同一のポリヌクレオチド分子／鎖内に配置されている場合に、同一の方向を持つとも説明できる。本明細書に記載した配列は、５’−３’方向で示されている。
本明細書で提供されている組み換え体構築物は、タンパク質の発現および／または活性レベルを調節するために、植物体または植物体細胞を転換するために使用できる。組み換え体ポリヌクレオチド構築物は、本明細書で説明した一つ以上のポリヌクレオチドをコードし、ポリペプチドを発現するのに適切な制御領域に作用できるように連結された、ポリヌクレオチドを備えることができる。こうして、ポリヌクレオチドは、本明細書で説明したポリペプチドをコードするコード配列を備えることができる。タンパク質の発現または活性レベルが調節される植物体または植物体細胞は、突然変異体、非天然、遺伝子組み換え、人造または遺伝子組み換えの植物体または植物体細胞を含むことができる。植物体または植物体細胞は、組み換えＤＮＡの安定した組み込みによって改変されたゲノムを含むことが適切である。組み換えＤＮＡは、遺伝子組み換えされ、細胞の外に構築されたＤＮＡを含み、また天然のＤＮＡ、またはｃＤＮＡ、または合成ＤＮＡを含むＤＮＡを含む。植物体は、当初の形質転換された植物体細胞から再生された植物体や、形質転換した植物体の後の世代または交雑種からの子孫植物体を含むことができる。修飾によって、本明細書で説明したポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現または活性が、対照植物体と比較して改変されることが適切である。
組み換え体ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドは、未変性のポリペプチドとすることも、または細胞に対して異質組織とすることもできる。一部の場合では、組み換え体構築物は、発現を調節し、制御領域と作用できるように連結されたポリヌクレオチドを含む。適切な制御領域の例は、本明細書で説明している。
本明細書で説明したものなど、組み換え体ポリヌクレオチド構築物を含むベクターも提供されている。適切なベクターバックボーンは、例えば、プラスミド、ウイルス、人工染色体、細菌人工染色体、酵母人工染色体、またはバクテリオファージ人工染色体など、当業界で日常的に使用されているものを含む。適切な発現ベクターは、例えば、バクテリオファージ、バキュロウイルス、およびレトロウイルスに由来するプラスミドおよびウイルスのベクターを含むがこれらに限定はされない。多数のベクターおよび発現システムが市販されている。ベクターは、例えば、複製の起源、足場アタッチメント領域またはマーカーを含むことができる。マーカー遺伝子は、植物体細胞に対して選択可能な表現型を与えることができる。例えば、マーカーは、抗生物質（例えば、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、またはハイグロマイシン）、または除草剤（例えば、グリホサート、クロルスルフロンまたはフォスフィノスリシン）などの殺生物剤耐性を与えることができる。さらに、発現ベクターは、発現されたポリペプチドの操作または検出（例えば、精製または局在化）を促進するようデザインされたタグ配列を含むことができる。ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、緑蛍光タンパク質蛍光タンパク質、グルタチオンＳ−転移酵素、ポリヒスチジン、ｃ−ｍｙｃまたは赤血球凝集素配列などのタグ配列が、一般にコードされたポリペプチドと融合したものとして表現される。こうしたタグは、カルボキシルまたはアミノのいずれかの終端も含めた、ポリペプチド内のどこにでも挿入できる。
植物体または植物体細胞は、安定して転換されるようにそのゲノムに組み入れられた組み換え体ポリヌクレオチドを持つことで転換させることができる。本明細書で説明した植物体または植物体細胞は、安定して転換させることができる。安定して転換された細胞は通常、毎回の細胞分裂でも導入されたポリヌクレオチドを保持する。植物体または植物体細胞はまた、組み換え体ポリヌクレオチドがそのゲノムに組み入れられないように、過渡的に転換させることができる。過渡的に転換された細胞は通常、十分な数の細胞分裂の後で、導入された組み換え体ポリヌクレオチドが娘細胞内で検出されないように、導入された組み換え体ポリヌクレオチドのすべてまたは一部を毎回の細胞分裂で失う。ゲノム編集の使用も考慮されている。
植物体細胞を転換するための数多くの方法が当業界で利用でき、微粒子銃、遺伝子銃テクニック、アグロバクテリウム媒介の形質転換、ウイルスベクター媒介の形質転換およびエレクトロポーレーションを含めて、これらすべてを本明細書に含む。外来性ＤＮＡを植物体染色体に組み入れるためのアグロバクテリウムシステムが、植物体遺伝子工学で広範にわたり研究、修正、および開発されてきた。センスまたはアンチセンスの方向に作用できるように制御配列に連結された、主題の精製済みタンパク質に対応するＤＮＡ配列を含む、裸の組み換えＤＮＡ分子が、従来の方法により適切なＴ−ＤＮＡ配列に結合される。これらはポリエチレングリコール技術によるか、またはエレクトロポーレーション技術によってプロトプラストに導入されるが、どちらも標準技術である。別の方法としては、主題の精製済みタンパク質をコードする組み換えＤＮＡ分子を含むこうしたベクターを生きたアグロバクテリウム細胞に導入し、次いで、その細胞によりＤＮＡを植物体細胞内に移動させる。Ｔ−ＤＮＡベクター配列を伴わない裸のＤＮＡによる形質転換は、プロトプラストとＤＮＡ含有リポソームとの融合によるか、またはエレクトロポーレーションによって達成できる。Ｔ−ＤＮＡベクター配列を伴わない裸のＤＮＡは、不活性の高速微粒子銃によって細胞を転換するために使用することもできる。
細胞または培養組織が形質転換のための受容体組織として使用される場合、植物体は、希望に応じて、当業者にとって公知の技術によって転換した培養体から再生することができる。
組み換え体構築物に含める制御領域の選択は、効率、選択可能性、誘導性、望ましい発現レベル、および細胞優先的または組織優先的な発現を含むがこれに限定されない、いくつかの要因に依存する。コード配列に対して制御領域を適切に選択し配置することにより、コード配列の発現を調節することは、当業者にとって日常的な事柄である。ポリヌクレオチドの転写は、類似した方法で調節できる。一部の適切な制御領域は、転写のみで、または主にある一定の細胞型で開始される。植物体ゲノムＤＮＡ内の制御領域の識別および特性付けをするための方法は、当業界において公知である。
プロモーターの例として、異なる組織または細胞型（例えば、根特異的プロモーター、苗条特異的プロモーター、木部特異的プロモーター）に存在するか、または異なる発育段階で存在するか、または異なる環境的条件に応じて存在する、組織特異的要因によって認識される組織特異的プロモーターが挙げられる。プロモーターの例として、ほとんどの細胞型で特定の誘導物質を必要とせずに活性化できる構成的プロモーターが挙げられる。ＲＮＡｉポリペプチド生成を制御するためのプロモーターの例として、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ（ＣａＭＶ／３５Ｓ）、ＳＳＵ、ＯＣＳ、ｌｉｂ４、ｕｓｐ、ＳＴＬＳ１、Ｂ３３、ｎｏｓ、またはユビキチンプロモーターもしくはファゼオリンプロモーターが挙げられる。当業者は、組み換え体プロモーターの複数の変形物を生成することができる。
組織特異的プロモーターは、植物体組織または生殖組織など特定の細胞または組織で、植物体の発育中の特定時点にのみ活性である転写制御要素である。組織特異的発現は、例えば、ある一定の組織内のポリヌクレオチドの発現が好ましい時に、有利なことがある。発育管理下の組織特異的プロモーターの例は、植物体組織（例えば、根または葉）、または生殖組織（果実、胚珠、種子、花粉、雌しべ、花、または任意の胚性の組織など）など、ある一定の組織内でのみ（または主として限定的に）転写を開始できるプロモーターを含む。生殖組織特異的プロモーターは、例えば、葯特異的、胚珠特異的、胚特異的、胚乳特異的、外皮特異的、種子および種皮特異的、花粉特異的、花弁特異的、咢片特異的、またはその組み合わせが考えられる。
葉特異的プロモーターの例として、ビルビン酸塩、Ｃ４植物体（トウモロコシ）由来のオルソリン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）プロモーター、トウモロコシ由来のｃａｂ−ｍ１Ｃａ＋２プロモーター、シロイヌナズナｍｙｂ関連遺伝子プロモーター（Ａｔｍｙｂ５）、リブロース二リン酸カルボキシラーゼ（ＲＢＣＳ）プロモーター（例えば、葉および人工光栽培苗木で発現するトマトＲＢＣＳ１、ＲＢＣＳ２およびＲＢＣＳ３Ａ遺伝子、栽培中のトマト果実で発現するＲＢＣＳ１およびＲＢＣＳ２、または葉身および葉鞘の葉肉細胞でほぼ排他的に高レベルで発現するリブロース二リン酸カルボキシラーゼプロモーター）が挙げられる。
老化特異的プロモーターの例として、果実の成熟、老化および葉の脱離時に活性となるトマトプロモーター、システインプロテアーゼをコードする遺伝子のトウモロコシプロモーター、８２Ｅ４のプロモーター、およびＳＡＧ遺伝子のプロモーターが挙げられる。
特定の実施形態では、老化特異的プロモーターが好ましい。好適には、プロモーターは、Ｅ４プロモーターでありうる。Ｅ４プロモーターは、レポーター遺伝子としてＧＵＳを用いるたばこの適切な老化プロモーターとして、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． （２００８） Ｍａｒ；６６（４）：４１５−２７に報告されている。他の例示的なプロモーターは、ＳＡＧ１２プロモーターであり、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ． （１９９９） Ｊｕｎ；１１（６）：１０７３−８０に記載されている。
別の特異的プロモーターが、さらなる例となる。当業者にとって公知の根優先的プロモーターを選択しうる。種子優先的プロモーターは、種子特異的プロモーター（種子の発育時に活性なプロモーターで、種子保存タンパク質のプロモーターなど）と、種子発芽プロモーター（種子の発芽時に活性なプロモーター）の両方を含む。こうした種子優先的プロモーターは、Ｃｉｍ１（サイトカイニン誘発されたメッセージ）、ｃＺ１９Ｂ１（トウモロコシ１９ ｋＤａ ｚｅｉｎ）、ｍｉｌｐｓ（ミオ−イノシトール−１−リン酸塩合成酵素）、ｍＺＥ４０−２（別称、Ｚｍ−４０）、ｎｕｃｌｃ、およびｃｅｌＡ（セルロース合成酵素）を含むが、これに限定されない。Ｇａｍａ−ｚｅｉｎは、一つの胚乳特異的プロモーターである。Ｇｌｏｂ−１は、一つの胚特異的プロモーターである。双子葉植物体では、種子特異的プロモーターは、マメβ−ファゼオリン、ナピン、β−コングリシニン、ダイズレクチン、クルシフェリン、およびこれに類するものを含むが、これに限定されない。単子葉植物体では、種子特異的プロモーターは、トウモロコシ１５ ｋＤａ ｚｅｉｎプロモーター、２２ ｋＤａ ｚｅｉｎプロモーター、２７ ｋＤａ ｚｅｉｎプロモーター、ｇ−ｚｅｉｎプロモーター、２７ ｋＤａ γ−ｚｅｉｎプロモーター（ｇｚｗ６４Ａプロモーターなど、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ第Ｓ７８７８０号を参照）、ｗａｘｙプロモーター、シュランケン１プロモーター、シュランケン２プロモーター、グロブリン１プロモーター（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ第Ｌ２２３４４号を参照）、Ｉｔｐ２プロモーター、ｃｉｍ１プロモーター、トウモロコシ ｅｎｄ１およびｅｎｄ２プロモーター、ｎｕｃ１プロモーター、Ｚｍ４０プロモーター、ｅｅｐ１およびｅｅｐ２、ｌｅｃ１、チオレドキシンＨプロモーター、ｍｌｉｐ１５プロモーター、ＰＣＮＡ２プロモーター、およびシュランケン−２プロモーターを含むが、これに限定されない。
誘導性プロモーターの例は、病原体の攻撃、嫌気性条件、高温、光、乾燥、低温、または高塩分濃度に反応するプロモーターを含む。病原体誘導性プロモーターは、病原性に関連したタンパク質（ＰＲタンパク質）に由来するものを含み、これは病原体（例えば、ＰＲタンパク質、ＳＡＲタンパク質、β−１，３−グルカナーゼ、キチナーゼ）による感染に続いて誘発される。
植物体プロモーターに加えて、適切なその他のプロモーターを細菌性の起源（例えば、オクトピン合成酵素プロモーター、ノパリン合成酵素プロモーターおよびＴｉプラスミドに由来するその他のプロモーターなど）から誘導したり、ウイルスのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓおよび１９Ｓ ＲＮＡプロモーター、たばこモザイクウイルスの構成的プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓおよび３５Ｓプロモーター、またはゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓプロモーター）から誘導しうる。特定の実施形態では、ミラビリスモザイクウイルス（ＭＭＶ）プロモーターが好ましい。特定の実施形態では、３５Ｓプロモーターが好ましい。
別の態様で、配列リストに示す任意のポリペプチドを含めた、本明細書で説明した任意のポリペプチド配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を持つポリペプチド配列を含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成る単離ポリペプチドが提供されている。単離ポリペプチドは、それに対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％の配列同一性を持つ配列を含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成ることが適切である。
一実施形態で、単離ポリペプチドは、配列番号２、または配列番号４、または配列番号６、または配列番号８、または配列番号１０、または配列番号１２に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％の配列同一性を持つ配列を含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成る。別の実施形態で、単離ポリペプチドは、配列番号２、または配列番号４、または配列番号６、または配列番号８、または配列番号１０、または配列番号１２に対して少なくとも７８％、７９％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％の配列同一性を持つ配列を含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成る。
一実施形態で、単離ポリペプチドは、配列番号２０、または配列番号２２、または配列番号２４に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％の配列同一性を持つ配列を含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るが、ただし該ポリペプチドは、配列番号２０、または配列番号２２、または配列番号２４に記載された位置に相当する位置で終止コドン変異を含むという条件付きである。
別の実施形態で、単離ポリペプチドは、配列番号２０、または配列番号２２、または配列番号２４に対して少なくとも７８％、７９％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％の配列同一性を持つ配列を含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るが、ただし該ポリペプチドは、配列番号２０、または配列番号２２、または配列番号２４に記載された位置に相当する位置で終止コドン変異を含むという条件付きである。別の実施形態で、配列番号２、または配列番号４、または配列番号６、または配列番号８、または配列番号１０、または配列番号１２に対して少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％の配列同一性を持つ、ポリヌクレオチド変異体によってコードされるアミノ酸配列を含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリペプチド変異体が提供されている。
別の実施形態で、配列番号２０、または配列番号２２、または配列番号２４に対して少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％の配列同一性を持つ、ポリヌクレオチド変異体によってコードされるアミノ酸配列を含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリペプチド変異体が提供されているが、ただし該ポリペプチドは、配列番号２０、または配列番号２２、または配列番号２４に記載された位置に相当する位置で終止コドン変異を含むという条件付きである。別の実施形態で、配列番号２、または配列番号４、または配列番号６、または配列番号８、または配列番号１０、または配列番号１２の対応する断片に対して少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％の配列同一性を持つ、配列番号２、もしくは配列番号４、もしくは配列番号６、もしくは配列番号８、もしくは配列番号１０、もしくは配列番号１２のポリペプチドの断片か、または配列番号２、もしくは配列番号４、もしくは配列番号６、もしくは配列番号８、もしくは配列番号１０、もしくは配列番号１２の断片が提供されている。
別の実施形態で、配列番号２０、または配列番号２２、または配列番号２４の対応する断片に対して少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％の配列同一性を持つ、配列番号２０、もしくは配列番号２２、もしくは配列番号２４のポリペプチドの断片か、または配列番号２０、もしくは配列番号２２、もしくは配列番号２４の断片が提供されているが、ただし該ポリペプチドは、配列番号２０、または配列番号２２、または配列番号２４に記載された位置に相当する位置で終止コドン変異を含むという条件付きである。特定の実施形態では、アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号２、または配列番号４、または配列番号６、または配列番号８に対して少なくとも７８％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリペプチドの活性が調節される。特定の実施形態では、アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号２、および配列番号４、および配列番号６、および配列番号８に対して少なくとも７８％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリペプチドの活性が調節される。特定の実施形態では、アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号２および配列番号４に対して少なくとも７８％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリペプチドの活性が調節される。特定の実施形態では、アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号６および配列番号８に対して少なくとも７８％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリペプチドの活性が調節される。特定の実施形態では、アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号２、および配列番号４、および配列番号６、および／または配列番号８に対して少なくとも７８％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリペプチドの活性が調節される。特定の実施形態では、アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号２、および／または配列番号４、および配列番号６、および配列番号８に対して少なくとも７８％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリペプチドの活性が調節される。
特定の実施形態では、アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号２０、または配列番号２２、または配列番号２４に対して少なくとも７８％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリペプチドの活性が調節されるが、ただし該ポリペプチドは、配列番号２０、または配列番号２２、または配列番号２４に記載された位置に相当する位置で終止コドン変異を含むという条件付きである。
特定の実施形態では、アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号２０、および配列番号２２、および配列番号２４に対して少なくとも７８％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリペプチドの活性が調節されるが、ただし該ポリペプチドは、配列番号２０、および配列番号２２、および配列番号２４に記載された位置に相当する位置で終止コドン変異を含むという条件付きである。
特定の実施形態では、アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号２０および配列番号２２に対して少なくとも７８％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリペプチドの活性が調節されるが、ただし該ポリペプチドは、配列番号２０および配列番号２２に記載された位置に相当する位置で終止コドン変異を含むという条件付きである。
特定の実施形態では、アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号２２および配列番号２４に対して少なくとも７８％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリペプチドの活性が調節されるが、ただし該ポリペプチドは、配列番号２２および配列番号２４に記載された位置に相当する位置で終止コドン変異を含むという条件付きである。
特定の実施形態では、アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号２０および配列番号２４に対して少なくとも７８％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリペプチドの活性が調節されるが、ただし該ポリペプチドは、配列番号２０および配列番号２４に記載された位置に相当する位置で終止コドン変異を含むという条件付きである。
特定の実施形態では、アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号２０、および配列番号２２、および／または配列番号２４に対して少なくとも７８％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリペプチドの活性が調節されるが、ただし該ポリペプチドは、配列番号２０、および配列番号２２、および／または配列番号２４に記載された位置に相当する位置で終止コドン変異を含むという条件付きである。
特定の実施形態では、アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号２０、および／または配列番号２２、および配列番号２４に対して少なくとも７８％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリペプチドの活性が調節されるが、ただし該ポリペプチドは、配列番号２０、および／または配列番号２２、および配列番号２４に記載された位置に相当する位置で終止コドン変異を含むという条件付きである。ポリペプチドは、アスパラギンシンテターゼとして機能するのに十分または実質的な度合いの同一性または類似性を含む配列の断片を含みうる。ポリペプチドの断片は、その活性の少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％などの、完全長配列の活性の一部またはすべてを保持するのが典型的である。
本明細書に考察するように、ポリペプチドはまた、アスパラギンシンテターゼとしてのそれらの機能または活性の一部またはすべてがまだある場合に、任意のタイプの変更（例えば、アミノ酸の挿入、欠失、または置換；グリコシル化状態の変化；再折り畳みもしくは異性化、三次元構造、または自己会合状態に影響を及ぼす変化）の導入により生成される突然変異体も含む。アスパラギンシンテターゼとしての機能または活性は、調節、低減または抑制されることが適切である。アスパラギンシンテターゼとしての機能または活性は、アスパラギンシンテターゼ活性が検出されないように抑制されることが適切である。
ポリペプチドは、任意のタイプの変更（例えば、アミノ酸の挿入、欠失、または置換、グリコシル化状態の変化、再折り畳みまたは異性化に影響を及ぼす変化、三次元構造、または自己会合状態）の導入により生成される変異体を含み、これは故意に操作したりまたは自然に単離されたりすることがある。変異体は、静的な変化を生成する改変を持つことができ、結果的に機能的に等価なタンパク質ができる。物質の二次的な結合活性が保持されている限り、極性、充電、溶解性、疎水性、親水性および残基の両親媒性の類似性に基づき、意図的にアミノ酸を置換しうる。例えば、負の電荷を帯びたアミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含み、正電荷を帯びたアミノ酸は、リシンおよびアルギニンを含み、ならびに類似した親水性値を持つ無電荷の極性頭基を備えたアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンを含む。伝統的な置換は、例えば、下記の表に従い行いうる。第二の列の同一ブロックにあるアミノ酸および好ましくは第三の列の同一系統にあるアミノ酸は、相互に置換しうる。
ポリペプチドは、成熟タンパク質または未成熟タンパク質または未成熟タンパク質に由来するタンパク質としうる。ポリペプチドは、公知の方法を使用して線形または環状にしうる。ポリペプチドは、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、または少なくとも４０個、または少なくとも５０個、または少なくとも１００個、または少なくとも２００個、または少なくとも３００個、または少なくとも４００個、または少なくとも５００個、または少なくとも６００個の連続するアミノ酸を含むのが典型的である。
配列番号２、もしくは配列番号４、もしくは配列番号６、もしくは配列番号８、もしくは配列番号１０、もしくは配列番号１２、もしくは配列番号２０、もしくは配列番号２２、もしくは配列番号２４によりコードされるポリペプチドであって、それに対して１００％の配列同一性を持つポリペプチドか、または配列番号２、もしくは配列番号４、もしくは配列番号６、もしくは配列番号８、もしくは配列番号１０、もしくは配列番号１２、もしくは配列番号 配列番号２０、もしくは配列番号２２、もしくは配列番号２４に記載された配列を含むか、それから成るか、もしくはそれから実質的に成るポリペプチドについても、開示されている。
ポリペプチドは、ポリペプチドを発現するのに適切な培養条件下で変換したかまたは組み換え体である宿主細胞を培養することにより準備しうる。結果的として得られる発現済みのポリペプチドは次に、公知の精製プロセスを使用して、その培養物から精製しうる。ポリペプチドの生成は、ポリペプチドに結合される薬剤を含む親和性カラムか、そうした親和性樹脂に対する一つ以上のカラム工程か、疎水性相互作用クロマトグラフィーが関与する一つ以上の工程か、または免疫親和性クロマトグラフィーかを含みうる。別の方法として、ポリペプチドは精製を促進する形態で発現されうる。例えば、これは、マルトース結合ポリペプチド、グルタチオン−５−転移酵素、ｈｉｓ−ｔａｇまたはチオレドキシンのものなど、融合ポリペプチドとして表現されうる。融合ポリペプチドの発現および精製のためのキットは市販されている。ポリペプチドは、抗原決定基でタグ付けして、その後でこうした抗原決定基を配向する特定の抗体を使用して精製しうる。逆相高速液体クロマトグラフィーなどの一つ以上の液体クロマトグラフィー工程を採用して、ポリペプチドをさらに精製することができる。上述の精製工程のいくつかまたは全部を様々な組み合わせで採用して、実質的に均質な組み換え体ポリペプチドを提供することができる。こうして精製したポリペプチドは、他のポリペプチドが実質的に含まれていないものとすることができ、本明細書では「実質的に精製されたポリペプチド」と定義され、こうした精製したポリペプチドは、ポリペプチド、断片、変異体、およびこれに類するものを含む。ポリペプチドおよび断片の発現、単離、および精製は、本明細書に記載した方法を含むがこれらに限定されない任意の適切な技術によって成し遂げることができる。
また、発現したポリペプチドの親和性精製をするために、ポリペプチドに対して生成されたモノクローナル抗体などの、親和性カラムを利用することも可能である。これらのポリペプチドは、例えば、高濃度塩溶出緩衝液内に入れた後に使用する低めの濃度の塩緩衝液に透析するか、または利用される親和性基質に応じてｐＨまたはその他の成分を変化させることにより、従来的なテクニックを使用して親和性カラムから除去するか、または親和性部分の天然の基質を使用して競合的に除去することができる。
単離されたかまたは実質的に精製されたポリヌクレオチドまたはタンパク質の組成が開示されている。「単離された」または「精製された」ポリヌクレオチドまたはタンパク質、またはその生物学的に活性な部分は、実質的にまたは本質的に、その天然の環境内で通常見つかるポリヌクレオチドまたはタンパク質に伴うかまたはそれと相互に作用する構成要素は含まれていない。従って、単離または精製されたポリヌクレオチドまたはタンパク質は、組み換え技術によって生成された場合、その他の細胞性材料または培養液が実質的に含まれておらず、または化学合成された場合、化学的前駆物質またはその他の化学物質が実質的に含まれていない。最適には、「単離」ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する生物体のゲノムＤＮＡ内のポリヌクレオチド（例えば、ポリヌクレオチドの５’端および３’端に位置する配列）に自然の状態で隣接する配列（最適には、タンパク質をコードする配列）を含まない。例えば、各種の実施形態で、単離ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する細胞のゲノムＤＮＡ内のポリヌクレオチドが自然の状態で隣接する、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含みうる。細胞性材料を実質的に含まないタンパク質は、約３０％、２０％、１０％、５％、または１％未満（乾燥質量による）の汚染するタンパク質を持つタンパク質の調製物を含む。
ポリペプチドは、公知の従来的な化学合成によっても生成されうる。合成的な手段によりポリペプチドまたはその断片を構成するための方法は、当業者にとって公知である。合成的に構成されたポリペプチド配列は、一次、二次または三次の構造的特性または配座特性を未変性のポリペプチドと共有することによって、生物活性を含めて、それらと共通の生物学的性質を所有しうる。
遺伝的背景の差異は、表現型的差異により、または核酸配列決定、遺伝的マーカー（例えば、ミクロサテライトＲＮＡマーカー）の存在または不在など、当業界において公知の分子生物学技術により検出できる。
本明細書で説明したポリペプチドと免疫反応性のある抗体も提供されている。本明細書に記載のある通り、ポリペプチド、断片、変異体、融合ポリペプチド、およびこれに類するものは、それと免疫反応性のある抗体の生成において「免疫原」として採用できる。こうした抗体は、抗体の抗原結合部位を介してポリペプチドに特異的に結合されうる。特異的に結合される抗体は、ポリペプチド、相同体、および変異体を特異的に認識しそれと結合するが、他の分子とは結合しない抗体である。一つの実施形態で、抗体は本明細書に記載したアミノ酸配列酸配列を持つポリペプチドに特異的であり、他のポリペプチドとは交差反応しない。
さらに具体的に言えば、ポリペプチド、断片、変異体、融合ポリペプチド、およびこれに類するものは、抗体の生成を誘発する抗原決定基またはエピトープを含む。これらの抗原決定基またはエピトープは、直鎖状または立体配置的（不連続）のどちらでもよい。直鎖状の抗原決定基は、ポリペプチドのアミノ酸の単一の部分で構成され、一方、立体配置的または不連続のエピトープは、ポリペプチドの折り畳みに伴い近傍にもたらされたポリペプチド鎖の異なる領域からのアミノ酸の部分で構成される。エピトープは、当業界において公知の任意の方法により識別できる。さらに、ポリペプチドに由来するエピトープは、研究用試薬として、アッセイで、および培養したハイブリドーマからのポリクローナル血清または上澄みなどの物質から特定の結合抗体を精製するために、使用できる。こうしたエピトープまたはその変異体は、固体相合成、化学薬品または酵素によるポリペプチドの切断、または組み換えＤＮＡ技術の使用など、当業界において公知の技術を使用して作成できる。
ポリペプチドに対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方は、従来的な技術により準備することができる。ポリペプチドに対して特異的なモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ株細胞も、本明細書で意図されている。こうしたハイブリドーマは、従来的な技術により製造・識別ができる。抗体の製造のために、ポリペプチド、断片、変異体、またはその突然変異体を注射することにより、様々な宿主動物を免疫化しうる。こうした宿主動物は、数例を挙げると、ウサギ、マウス、およびラットを含みうるが、これに限定されない。免疫学的反応を増大させるために様々なアジュバントを使用しうる。宿主の種にもよるが、こうしたアジュバントは、Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ（完全および不完全）、アルミニウム水酸化物などのミネラルゲルや、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシニアン、ジニトロフェノールなどの界面活性剤、および潜在的に有用なＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）やコリネバクテリウム・パルヴムなどのヒトアジュバントを含むが、これに限定されない。モノクローナル抗体は、従来的な技術によって回復できる。こうしたモノクローナル抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびその任意の下位クラスを含む、任意の免疫グロブリンクラスに属するものとしうる。
抗体は、生体外でまたは生体内のいずれかでポリペプチドまたは断片の存在を検出するアッセイで使用することもできる。抗体は、免疫親和性クロマトグラフィーによるポリペプチドまたは断片の精製に採用することもできる。
それによってコードされたポリヌクレオチドおよびポリペプチドの断片も開示されている。ポリヌクレオチドの断片は、未変性のタンパク質の生物活性を保持するタンパク質断片をコードしうる。別の方法として、ハイブリッド形成プローブまたはＰＣＲプライマーとして有用なポリヌクレオチドの断片は一般的に、生物活性を保持している断片タンパク質をコードしない。その上、開示されたヌクレオチド配列の断片は、本明細書で考察したとおり、組み換え型構築物内で組み立てられうるものを含む。ポリヌクレオチド配列の断片は、少なくとも約２５個のヌクレオチド、約５０個のヌクレオチド、約７５個のヌクレオチド、約１００個のヌクレオチド、約１５０個のヌクレオチド、約２００個のヌクレオチド、約２５０個のヌクレオチド、約３００個のヌクレオチド、約４００個のヌクレオチド、約５００個のヌクレオチド、約６００個のヌクレオチド、約７００個のヌクレオチド、約８００個のヌクレオチド、約９００個のヌクレオチド、約１０００個のヌクレオチド、約１１００個のヌクレオチド、約１２００個のヌクレオチド、約１３００個のヌクレオチド、または約１５００個のヌクレオチド、約２０００個のヌクレオチド、約３０００個のヌクレオチド、約４０００個のヌクレオチド、約５０００個のヌクレオチド、約６０００個のヌクレオチド、約７０００個のヌクレオチド、約８０００個のヌクレオチド、約９０００個のヌクレオチド、
約１００００個のヌクレオチド、約１５０００個のヌクレオチド、約２００００個のヌクレオチドから、本明細書に記載したポリペプチドをコードする完全長ポリヌクレオチドまでの範囲としうる。ポリペプチド配列の断片は、少なくとも約２５個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸、約７５個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸、約１５０個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸、約２５０個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸、約５００個のアミノ酸、約６００個のアミノ酸から、または本明細書に記載した完全長ポリペプチドまでの範囲としうる。
本明細書で説明したアスパラギンシンテターゼの発現または活性の低減は、種々の手段によって成し遂げられると理解されるべきである。特定の実施形態によると、アスパラギンシンテターゼの発現は、転写および／または翻訳を妨げる種々の分子（以下に限定されないが、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ分子、リボザイム分子、またはＤＮＡザイム分子を含む）を用いて、ゲノムレベルおよび／または転写レベルで低減されうる。欠失、挿入、部位特異的突然変異、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、および類似のものを含めた、一つ以上の突然変異を少なくとも一つの遺伝子に挿入することも用いられうる。他の実施形態によると、発現は、アンタゴニストまたはポリペプチドを切断する酵素などを用いてタンパク質レベルで抑制されうる。
一態様で、少なくとも一つの突然変異と、（ｉ）アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号１、もしくは配列番号３、もしくは配列番号５、もしくは配列番号７に対して少なくとも７２％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、もしくはそれから実質的に成るポリヌクレオチド；（ｉｉ）（ｉ）に記載したポリヌクレオチドによりコードしたポリペプチド；（ｉｉｉ）アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号２、もしくは配列番号４、もしくは配列番号６、もしくは配列番号８に対して少なくとも７８％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、もしくはそれから実質的に成るポリペプチド；または（ｉｖ）（ｉ）に記載した単離ポリヌクレオチドを含む構築物、ベクター、もしくは発現ベクターと、を含み、該少なくとも一つの突然変異が、一つも突然変異を含まない対照植物体と比較して、アスパラギンシンテターゼの発現または活性を低減させる、突然変異体である植物体またはその部分が説明されている。別の態様で、少なくとも一つの突然変異と、（ｉ）アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性、または配列番号３、もしくは配列番号５、もしくは配列番号７に対して少なくとも７２％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリヌクレオチド；（ｉｉ）（ｉ）に記載したポリヌクレオチドによりコードしたポリペプチド；（ｉｉｉ）アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号２、もしくは配列番号４、もしくは配列番号６、もしくは配列番号８に対して少なくとも７８％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、もしくはそれから実質的に成るポリペプチド；または（ｉｖ）（ｉ）に記載した単離ポリヌクレオチドを含む構築物、ベクター、もしくは発現ベクターと、を含み、該少なくとも一つの突然変異が、一つも突然変異を含まない対照植物体と比較して、アスパラギンシンテターゼの発現または活性を低減させる、突然変異体である植物体またはその部分が説明されている。
従って、植物体または植物体細胞は、ＮｔＡＳＮ１−Ｓ（配列番号１）、および／またはＮｔＡＳＮ１−Ｔ（配列番号３）、および／またはＮｔＡＳＮ３−Ｓ（配列番号９）、および／またはＮｔＡＳＮ３−Ｔ（配列番号１１）、および／またはＮｔＡＳＮ５−Ｓ（配列番号５）、および／またはＮｔＡＳＮ５−Ｔ（配列番号７）において、一つ以上突然変異を含むことができ、該突然変異により、該遺伝子またはそれによってコードされるタンパク質の発現を低減させるか、または機能を低下させることになる。植物体または植物体細胞は、記載されたように、ＮｔＡＳＮ１−Ｓ（配列番号１）、またはＮｔＡＳＮ１−Ｔ（配列番号３）、またはＮｔＡＳＮ５−Ｓ（配列番号５）、またはＮｔＡＳＮ５−Ｔ（配列番号７）において、一つ以上突然変異を含むことができ、該突然変異により、該遺伝子またはそれによってコードされるタンパク質の発現を低減させるか、または機能を低下させることになる。植物体または植物体細胞は、記載されたように、ＮｔＡＳＮ１−Ｓ（配列番号１）およびＮｔＡＳＮ１−Ｔ（配列番号３）、またはＮｔＡＳＮ５−Ｓ（配列番号５）およびＮｔＡＳＮ５−Ｔ（配列番号７）において、一つ以上突然変異（例えば、本明細書に記載のナンセンス突然変異または類似のもの）を含むことができ、該突然変異により、該遺伝子またはそれによってコードされるタンパク質の発現を低減させるか、または機能を低下させることになる。突然変異体の発現または機能は、調節、抑制または低減されうる。本明細書に記載の一つ以上の突然変異は別として、突然変異体である植物体または植物体細胞は、一つ以上のその他の遺伝子またはポリペプチドにおいて一つ以上のさらなる突然変異を持つことができる。特定の実施形態では、突然変異体は、一つ以上のその他の遺伝子またはポリペプチドにおける一つ以上のさらなる突然変異を持ちうる。ＮｔＡＳＮ１−Ｓ、ＮｔＡＳＮ１−Ｔ、ＮｔＡＳＮ５−Ｓ、およびＡＳＮ５−Ｔの突然変異体が、本明細書に記載されている。特定の実施形態では、一つ以上突然変異は、グルタミナーゼドメインにある。
三つの停止変異が、ＡＳＮ１−Ｓ（ＡＳＮ１−Ｓ＿Ｗ１５６＊−配列番号１９および２０）、ＡＳＮ１−Ｔ（ＡＳＮ１−Ｔ＿Ｗ１５６＊−配列番号２１および２２）、ならびにＡＳＮ５−Ｓ（ＡＳＮ５−Ｓ＿Ｑ６６＊−配列番号２３および２４）のコピーにおいて特定されているが、ＡＳＮ５−Ｔコピーにおいては特定されていない。ＡＳＮ５−Ｔでは停止変異は特定されなかったが、ノンストップ変異が潜在的な候補として特定された。ＡＳＮ１−Ｓ＿Ｗ１５６＊、ＡＳＮ１−Ｔ＿Ｗ１５６＊、およびＡＳＮ５−Ｓ＿Ｑ６６＊には、対応する野生型分離個体（ｓｅｇｒｅｇａｎｔ）と比べてアスパラギンが低減する顕著な傾向があったが、ＡＳＮ５−Ｔ＿Ｇ５９Ｄにはなかった。最も高い低減率はＡＳＮ１−Ｔ＿Ｗ１５６＊（８３％）で見られ、次いでＡＳＮ５−Ｓ＿Ｑ６６＊（４４％）、ＡＳＮ１−Ｓ＿Ｗ１５６＊（１７％）の順であった。系統ＡＳＮ５−Ｔ＿Ｇ５９Ｄでは、アスパラギンのわずかな増加が見られた。ＡＳＮ１−ＳおよびＡＳＮ５−Ｓにおける停止変異は、植物体のバイオマスおよびサイズにはいかなる影響も及ぼさなかった。Ｃａｎａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１２によると、すべてのＮｔ−ＡＳＮ遺伝子における突然変異は、グルタミンからアンモニアを放出するグルタミナーゼドメイン内に位置し、その合成酵素ドメインは、Ｎｔ−ＡＳＮのアミノ酸Ｒ２１１〜Ｄ４５１のコンセンサス領域に局在している。
該突然変異体である植物体または植物体細胞は、突然変異に対してヘテロ接合性であっても、ホモ接合性であってもよい。該突然変異体である植物体または植物体細胞は、少なくとも一つの突然変異に対してはヘテロ接合性、および少なくとも一つの別の突然変異に対してはホモ接合性となりうる。好適には、突然変異体である植物体または植物体細胞は、突然変異に対してホモ接合性である。
突然変異体は、配列番号２のアミノ酸位置１５６に相当する位置に突然変異（例えば、終止コドンをもたらすナンセンス変異）を有しうる。こうした突然変異体の例は、本明細書に記載のＡＳＮ１−Ｓ＿Ｗ１５６＊である。
突然変異体は、配列番号４のアミノ酸位置１５６に相当する位置に突然変異（例えば、終止コドンをもたらすナンセンス変異）を有しうる。こうした突然変異体の例は、本明細書に記載のＡＳＮ１−Ｔ＿Ｗ１５６＊である。
突然変異体は、配列番号６のアミノ酸位置６６に相当する位置に突然変異（例えば、終止コドンをもたらすナンセンス変異）を有しうる。こうした突然変異体の例は、本明細書に記載のＡＳＮ５−Ｓ＿Ｑ６６＊である。
これらの突然変異の組み合わせも意図されている。該組み合わせとして、ＡＳＮ１−Ｓ＿Ｗ１５６＊とＡＳＮ１−Ｔ＿Ｗ１５６＊との組み合わせ、またはＡＳＮ１−Ｓ＿Ｗ１５６＊とＡＳＮ５−Ｓ＿Ｑ６６＊との組み合わせ、またはＡＳＮ１−Ｔ＿Ｗ１５６＊とＡＳＮ５−Ｓ＿Ｑ６６＊との組み合わせ、またはＡＳＮ１−Ｓ＿Ｗ１５６＊とＡＳＮ１−Ｔ＿Ｗ１５６＊とＡＳＮ５−Ｓ＿Ｑ６６＊との組み合わせが挙げられうる。
別の態様では、植物体における、または該植物体由来の植物材料におけるアスパラギンレベルを低減させる方法であって、該植物体のゲノムに、少なくとも一つのアスパラギンシンテターゼ遺伝子の発現を低減させる一つ以上の突然変異を導入することを含み、該少なくとも一つのアスパラギンシンテターゼ遺伝子が、ＮｔＡＳＮ１−Ｓ、ＮｔＡＳＮ１−Ｔ、ＮｔＡＳＮ５−Ｓ、またはＮｔＡＳＮ５−Ｔをコードする、該方法が提供されている。ＮｔＡＳＮ１−Ｓ、ＮｔＡＳＮ１−Ｔ、ＮｔＡＳＮ５−Ｓ、またはＮｔＡＳＮ５−Ｔでの突然変異に加えて、一つ以上の突然変異が、少なくとも一つ、二つ、もしくは三つ、またはさらにそれ以上のアスパラギンシンテターゼ遺伝子のうちの少なくとも一つの対立遺伝子にも導入されうる。ＮｔＡＳＮ１−ＳおよびＮｔＡＳＮ１−Ｔ、またはＮｔＡＳＮ５−Ｓおよび ＮｔＡＳＮ５−Ｔにおける突然変異も意図されている。
アスパラギンのレベルが低減した植物体を識別する方法であって、対象の植物体由来の核酸試料を、ＮｔＡＳＮ１−Ｓ、ＮｔＡＳＮ１−Ｔ、ＮｔＡＳＮ５−Ｓ、またはＡＳＮ５−Ｔにおける一つ以上の突然変異の有無についてスクリーニングすることを含む、該方法が提供されている。好適には、該方法は、該対象の植物体由来の該核酸試料または別の核酸試料を、ＮｔＡＳＮ１−Ｓにおける突然変異の有無、ＮｔＡＳＮ１−Ｔにおける突然変異の有無、ＮｔＡＳＮ５−Ｓにおける突然変異の有無、ＮｔＡＳＮ５−Ｔにおける突然変異の有無についてスクリーニングすることをさらに含む。
また、ＮｔＡＳＮ１−Ｓ、ＮｔＡＳＮ１−Ｔ、ＮｔＡＳＮ５−Ｓ、またはＮｔＡＳＮ５−Ｔをコードする遺伝子内の一つ以上の突然変異に対してヘテロ接合性またはホモ接合性である植物体または植物体細胞も開示され、そこで、前述の突然変異は、遺伝子の発現を低減させるか、またはそれによりコードされたタンパク質の機能を低下させるものである。
一部の実施形態で、好都合な突然変異は、植物体または植物体細胞に変異誘発性のアプローチを使用して導入され、導入された突然変異は、サザンブロット分析、ＤＮＡ配列決定、ＰＣＲ分析、または表現型分析など、当業者にとって周知の方法を使用して特定または選択される。遺伝子発現に影響を与えるか、またはコードされたタンパク質の機能を妨げる突然変異は、当業界で周知の方法を使用して決定されうる。遺伝子エクソンにおける挿入性の突然変異は、通常は結果的にヌル突然変異体をもたらす。保存された残基における突然変異は、コードされたタンパク質の代謝機能の抑制または低減に特に有効でありうる。
突然変異体のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを獲得するための方法も開示されている。植物体細胞または植物材料を含めた、関心の任意の植物体は、突然変異を誘発することが知られている様々な方法により遺伝的に修飾でき、これには、部位特異的変異誘発、オリゴヌクレオチドを標的とした変異誘発突然変異誘発、化学的に誘発された突然変異誘発、照射誘発された突然変異誘発、修飾塩基を利用した突然変異誘発、ギャップ二重鎖ＤＮＡを利用した突然変異誘発、二本鎖分解突然変異誘発、修復欠損宿主系統を利用した突然変異誘発、合計遺伝子合成による突然変異誘発、ＤＮＡシャフリングおよびその他の同等な方法が含まれる。
突然変異ポリペプチド変異体は、一つ以上の突然変異ポリペプチド変異体を含む、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組み換えの植物体（例えば、突然変異体、非天然の、遺伝子導入、人造または遺伝子組み換え植物体）または植物体細胞を作成するために使用できる。突然変異ポリペプチド変異体は、未成熟のポリペプチドの活性を保持することが適切である。突然変異ポリペプチド変異体の活性は、未成熟のポリペプチドと比較して、高い、低い、またはほぼ同一でありうる。
本明細書で説明したヌクレオチド配列およびポリペプチドでの突然変異は、人造の突然変異または合成的な突然変異または遺伝子組み換えの突然変異を含むことができる。本明細書で説明したヌクレオチド配列およびポリペプチドでの突然変異は、生体外または生体内の操作手順を含む工程によって獲得されるか、または獲得可能な突然変異とすることができる。本明細書で説明したヌクレオチド配列およびポリペプチドでの突然変異は、人による介入を含む工程によって獲得されるか、または獲得可能な突然変異とすることができる。一例として、工程は、遺伝子材料内で無作為な突然変異を生成する、変異原性、催奇性、または発癌性の有機化合物（例えば、エチルメタンスルホン酸塩（ＥＭＳ））などの外因的に追加した化学物質を使用した突然変異誘発を含みうる。さらなる例として、工程は、一つ以上の遺伝子工学工程（本明細書で説明されている一つ以上の遺伝子工学工程など）またはその組み合わせを含みうる。さらなる例として、工程は一つ以上の植物体交雑工程を含みうる。
植物体内での一つ以上のアスパラギンシンテターゼポリペプチドの活性は、本開示に従って低減または抑制されるが、これは、その変換活性が、アスパラギンシンテターゼポリペプチドの変換活性を抑制するようには改変されていない、かつ同一のプロトコルを使用して栽培および収穫がなされた、植物体内の同一のアスパラギンシンテターゼポリペプチドの変換活性よりも統計的に低い場合である。植物体内でのアスパラギンシンテターゼポリペプチドの活性は、本明細書に記載したアッセイ法によって検出されない場合、無くなっていると見なされる。アスパラギンシンテターゼポリペプチドの活性を測定する方法は、本明細書に記載されている。
突然変異誘発以外に、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのうちの一つ以上の発現または活性を調節できる組成物として、一つ以上の内在性遺伝子の転写を妨害できる配列特異的ポリヌクレオチド、ＲＮＡ転写物（例えば、二本鎖ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム）の翻訳を妨害できる配列特異的ポリヌクレオチド、一つ以上のタンパク質の安定性を妨害できる配列特異的ポリペプチド、一つ以上のタンパク質の酵素活性または基質もしくは調節タンパク質に関する一つ以上のタンパク質の結合活性を妨害できる配列特異的ポリヌクレオチド、一つ以上のタンパク質に対して特異性を示す抗体、一つ以上のタンパク質の安定性または一つ以上のタンパク質の酵素活性または一つ以上のタンパク質の結合活性を妨害できる小分子化合物、一つ以上のポリヌクレオチドを結合するジンクフィンガータンパク質、および一つ以上のポリヌクレオチドに対して活性を持つメガヌクレアーゼが挙げられるが、これに限定されない。遺伝子編集技術、遺伝的編集技術およびゲノム編集技術は、当業界で周知である。
遺伝子編集の一つの方法には、細胞が修復メカニズムに反応できる二本鎖の分解を誘発する、転写活性化剤様差動因子ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の使用が関与する。非相同末端結合により、アニーリングのための配列の重複が非常に少ないかまたは全くない二本鎖切断のうちのどちらかの側からＤＮＡが再結合される。この修復機メカニズムは、挿入または欠失、または染色体の再配列によるゲノム内の誤りを誘発する。こうした誤りがあると、その位置で遺伝子産物が非機能的なものにコードされる。遺伝子編集の別の方法には、細菌性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用が関与する。バクテリアおよび古細菌は、侵入するウイルスＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡに対して保護する適応的免疫系の一部である、群生性等間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）と呼ばれる染色体要素を示す。Ｔｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムで、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）は、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）およびＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質と機能して、標的ＤＮＡに二本鎖切断を導入する。Ｃａｓ９による標的の切断は、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの間の塩基対だけでなく、ｃｒＲＮＡと標的ＤＮＡの間の塩基対形成を必要とする。標的認識は、配列ＮＧＧと一致する、フォトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる短いモチーフの存在によって促進される。このシステムは、ゲノム編集用に利用できる。Ｃａｓ９は通常は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡで構成される二重ＲＮＡによってプログラムされる。ただし、これらのＲＮＡのコア成分は、Ｃａｓ９ターゲティングのために単一の混成体「案内ＲＮＡ」に組み入れることができる。部位特異的切断のための標的ＤＮＡに対する非翻訳ＲＮＡガイドの使用が、ＴＡＬＥＮなどの既存の技術よりも著しく単純明快であることが約束される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ法を使用すると、ヌクレアーゼ錯体の再ターゲティングには、新しいＲＮＡ配列の導入のみを必要とし、タンパク質転写因子の特異性を設計し直す必要がない。
アンチセンス技術は、ポリペプチドの発現の調節に使用できるもう一つの公知の方法である。抑制される遺伝子のポリヌクレオチドは、ＲＮＡのアンチセンス鎖が転写されるように、クローン化され、調整部分に作用できるように連結されている。次に、組み換え体構築物は植物体細胞に変形し、ＲＮＡのアンチセンス鎖が生成される。ポリヌクレオチドが抑制されるために遺伝子の全配列である必要はないが、通常は抑制の対象となる遺伝子のセンス鎖の少なくとも一部分に対して実質的に相補的である。
ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡの発現に影響を及ぼすリボザイムまたは触媒ＲＮＡに転写しうる。リボザイムは、実際的に任意の標的ＲＮＡと特異的に対をなし、リン酸ジエステルバックボーンを特定の位置で切断し、それによって標的ＲＮＡを機能的に不活性化するように設計できる。異質組織ポリヌクレオチドは、特定のｍＲＮＡ転写物を切断するよう設計されたリボザイムをコードでき、こうしてポリペプチドの発現が阻止される。ハンマーヘッド型リボザイムは特定のｍＲＮＡを破壊するのに有用であるが、ｍＲＮＡを部位特異的認識配列で切断する様々なリボザイムを使用することができる。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡと補完的塩基対を形成するフランキング領域によって指図される位置でｍＲＮＡを切断する。唯一の要件は、標的ＲＮＡが５’−ＵＧ−３’ヌクレオチド配列を含むことである。ハンマーヘッド型リボザイムの構成および製造は、当業界において公知である。ハンマーヘッド型リボザイム配列は、生体内での切断効率を増大させるために、輸送ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）などの安定したＲＮＡに埋め込むことができる。
一つの実施形態で、ＲＮＡ転写物の翻訳を妨害できる配列特異的ポリヌクレオチドは干渉ＲＮＡである。ＲＮＡ干渉またはＲＮＡサイレンシングは、進化的に保守的なプロセスであり、そのプロセスによって特定のｍＲＮＡを酵素による劣化の標的にすることができる。二本鎖ＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）は、干渉ＲＮＡ経路を開始するために、細胞（例えば、二本鎖ＲＮＡウイルス、または干渉ＲＮＡポリヌクレオチド）によって導入または生成される。二本鎖ＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ特異的エンドヌクレアーゼであるＲＮａｓｅｓ ＩＩＩによって、長さが２１〜２３ｂｐの複数の低分子干渉ＲＮＡ二重鎖に転換できる。その後で、低分子干渉ＲＮＡは、ＡＴＰ依存性のプロセスによって低分子干渉ＲＮＡの巻き戻しを促進するＲＮＡ誘発サイレンシング複合体によって認識できる。巻き戻された低分子干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖は、活性化したＲＮＡ誘発サイレンシング複合体を、低分子干渉ＲＮＡアンチセンス鎖に相補的な配列を含む標的とされたｍＲＮＡに案内する。標的とされたｍＲＮＡおよびアンチセンス鎖は、Ａ型らせんを形成でき、Ａ型らせんの主要な溝は活性化したＲＮＡ誘発サイレンシング複合体によって認識できる。標的ｍＲＮＡは、活性化したＲＮＡ誘発サイレンシング複合体によって、低分子干渉ＲＮＡ鎖の５’端の結合部位によって限定される単一の部位で切断できる。活性化したＲＮＡ誘発サイレンシング複合体は、別の切断事象を触媒するために再利用できる。ＮｔＡＳＮ１−ＳコピーとＮｔＡＳＮ１−Ｔコピーの両方をサイレンシングするのに使用することができるＮｔＡＳＮ１−Ｓ由来のコード配列の例を、配列番号１７に示す。そこで、さらなる態様が、配列番号１７に記載したヌクレオチド配列か、またはそれに対して少なくとも７２％、７３％、７４％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を持つ配列に関連する。ＮｔＡＳＮ１−ＳコピーとＮｔＡＳＮ１−Ｔコピーの両方をサイレンシングするのに使用することができるＮｔＡＳＮ５−Ｔ由来のコード配列の例を、配列番号１８に示す。そこで、さらなる態様が、配列番号１７に記載した配列に関連する。従って、さらなる態様が、配列番号１８に記載したヌクレオチド配列か、またはそれに対して少なくとも７２％、７３％、７４％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を持つ配列に関連する。これらのコード配列を用いて遺伝子サイレンシングさせる方法、およびその使用も考慮される。
干渉ＲＮＡ発現ベクターは、ｍＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、または関連するＲＮＡ変異体の発現レベルを低減することにより、ＲＮＡ干渉活性を示す干渉ＲＮＡポリヌクレオチドをコードする干渉ＲＮＡ構築物を備えうる。例示的な構築物を図２２に示す。発現ベクターは、本明細書でさらに説明する通り、上流に位置し、干渉ＲＮＡ構築物に作用できるように連結されたプロモーターを備えうる。干渉ＲＮＡ発現ベクターは、適切な最小のコアプロモーター、関心の干渉ＲＮＡ構築物、上流（５’）制御領域、下流（３’）制御領域（転写終結およびポリアデニレーションシグナルを含む）、および当業者にとって公知である様々な選択マーカーなどのその他の配列を備えうる。
ポリヌクレオチドは、二重鎖構造（すなわち、アンチセンス鎖と相補的センス鎖とを備えた二本鎖ＲＮＡ分子）、二本鎖ヘヤピン様の構造、または一本鎖構造（すなわち、アンチセンス鎖のみを備えたｓｓＲＮＡ分子）を含む、様々な形態で生成できる。構造は、二重鎖、非対称二重鎖、自己相補的センス鎖およびアンチセンス鎖を持つ二次的なヘヤピンまたは非対称ヘヤピン構造を含みうる。二本鎖干渉ＲＮＡは、酵素学的に二本鎖低分子干渉ＲＮＡに変換できる。低分子干渉ＲＮＡ二重鎖の一本の鎖は、標的ｍＲＮＡおよび関連するＲＮＡ変異体内でアニールして相補配列にすることができる。低分子干渉ＲＮＡ／ｍＲＮＡ二重鎖は、ＲＮＡを複数の部位で配列に依存した方法で切断できるＲＮＡ誘発サイレンシング複合体によって認識され、その結果、標的ｍＲＮＡおよび関連するＲＮＡ変異体の劣化がもたらされる。
二本鎖ＲＮＡ分子は、幹ループ構造の単一のオリゴヌクレオチドから組み立てた低分子干渉ＲＮＡ分子であって、ここで低分子干渉ＲＮＡ分子の自己相補的センスおよびアンチセンス領域が、ポリヌクレオチドベースあるいは非ポリヌクレオチドベースのリンカーによって連結されたものと、二つ以上のループ構造および自己相補的センス鎖およびアンチセンス鎖を備えた幹を持つ、環状の一本鎖ＲＮＡであって、ここで環状のＲＮＡを生体内または生体外で処理して、干渉ＲＮＡを媒介する能力のある活性の低分子干渉ＲＮＡ分子を生成することができるものとを含みうる。
小ヘアピンＲＮＡ分子の使用も意図されている。これらは、逆相補（センス）配列に加えて特定のアンチセンス配列を備え、これは一般にスペーサーまたはループ配列で分離されている。スペーサーまたはループの切断により、それらがアニールして二本鎖ＲＮＡ分子を形成しうるように、一本鎖のＲＮＡ分子およびその逆相補が提供される（随意に、一方または両方の鎖の３’端または５’端での一つ、二つ、三つまたはそれ以上のヌクレオチドの追加または除去につながりうる追加的な処理ステップがある）。スペーサーは、スペーサーの切断（および、随意に、結果的に一方または両方の鎖の３’端または５’端での一つ、二つ、三つ、四つ、またはそれ以上のヌクレオチドの追加または除去につながりうるその後の処理ステップ）の前に、二本鎖構造（または幹）のアニールと形成をするために、アンチセンスおよびセンス配列を許容する十分な長さのものとすることができる。スペーサー配列は通常、二つの補完的ヌクレオチド配列領域の間に位置する関連性のないヌクレオチド配列であり、これは、二本鎖ポリヌクレオチドにアニールされたときに小ヘアピンＲＮＡを備える。スペーサー配列は一般的に、約３〜約１００個のヌクレオチドを含む。
関心の任意のＲＮＡポリヌクレオチドは、ヘアピン二重鎖を生成するために適切な配列組成、ループサイズ、および幹の長さを選択することで生成できる。ヘアピン二重鎖の幹の長さを設計するための適切な範囲は、少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のヌクレオチドの幹長を含むが、これは、約１４〜３０個のヌクレオチド、約３０〜５０個のヌクレオチド、約５０〜１００個のヌクレオチド、約１００〜１５０個のヌクレオチド、約１５０〜２００個のヌクレオチド、約２００〜３００個のヌクレオチド、約３００〜４００個のヌクレオチド、約４００〜５００個のヌクレオチド、約５００〜６００個のヌクレオチド、および約６００〜７００個のヌクレオチドなどである。ヘアピン二重鎖のループ長さを設計するための適切な範囲は、ループの長さが約４〜２５個のヌクレオチド、約２５〜５０個のヌクレオチド、あるいはヘアピン二重鎖の幹が相当に長い場合にはより長くなる。ある一定の実施形態で、二本鎖ＲＮＡまたはｓｓＲＮＡ分子は、長さが約１５〜約４０個のヌクレオチドである。別の実施形態で、低分子干渉ＲＮＡ分子は、長さが約１５〜約３５個のヌクレオチドである二本鎖ＲＮＡまたはｓｓＲＮＡ分子である。別の実施形態で、低分子干渉ＲＮＡ分子は、長さが約１７〜約３０個のヌクレオチドである二本鎖ＲＮＡまたはｓｓＲＮＡ分子である。別の実施形態で、低分子干渉ＲＮＡ分子は、長さが約１９〜約２５個のヌクレオチドである二本鎖ＲＮＡまたはｓｓＲＮＡ分子である。別の実施形態で、低分子干渉ＲＮＡ分子は、長さが約２１〜約２３個のヌクレオチドである二本鎖ＲＮＡまたはｓｓＲＮＡ分子である。ある一定の実施形態で、２１個ヌクレオチドを上回る二重鎖領域を備えるヘヤピン構造は、ループの配列および長さに関係なく、効果的な低分子干渉ＲＮＡ依存性のサイレンシングを促進しうる。ＲＮＡ干渉に用いられる例示的なコード配列は、配列番号１７および１８に記載されている。
標的ｍＲＮＡ 配列は通常、長さが約１４〜約５０個のヌクレオチドである。従って、標的ｍＲＮＡは長さが約１４〜約５０個のヌクレオチドの領域についてスキャンできるが、これは標的配列について、Ａ＋Ｔ／Ｇ＋Ｃ比率が約２：１〜約１：２であること、標的配列の５’端にＡＡ ジヌクレオチドまたはＣＡ ジヌクレオチドがあること、標的ｍＲＮＡに対して一意の少なくとも連続して１０個のヌクレオチドの配列があること（すなわち、配列が、同じ植物体に由来する別のｍＲＮＡ配列内には存在しない）、ならびに三つ以上の連続的なグアニン（Ｇ）ヌクレオチドまたは三つ以上の連続的なシトシン（Ｃ）ヌクレオチドの「並び」がないこと、といった基準を一つ以上満たすことが好ましい。これらの基準は、当該技術分野において公知の様々なテクニックを使用して評価でき、例えば、ＢＬＡＳＴなどのコンピュータプログラムを公に利用可能なデータベースの検索に使用して、選択した標的配列が標的ｍＲＮＡに対して一意であるかどうかを判断できる。別の方法として、標的配列は、市販されているコンピュータソフトウェア（例えば、市販品であるＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ、Ｔａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒおよび低分子干渉ＲＮＡ設計ツール）を使用して選択できる（また低分子干渉ＲＮＡ配列を設計できる）。
一つの実施形態で、標的ｍＲＮＡ配列は、上記の基準のうち一つ以上を満たす、長さが約１４〜約３０個のヌクレオチドであるものが選択される。別の実施形態で、標的の配列は、上記の基準のうち一つ以上を満たす、長さが約１６〜約３０個のヌクレオチドであるものが選択される。さらなる実施形態で、標的の配列は、上記の基準のうち一つ以上を満たす、長さが約１９〜約３０個のヌクレオチドであるものが選択される。別の実施形態で、標的の配列は、上記の基準のうち一つ以上を満たす、長さが約１９〜約２５個のヌクレオチドであるものが選択される。
模範的な一つの実施形態で、低分子干渉ＲＮＡ分子は、本明細書で説明したポリヌクレオチド配列のどれか一つの少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上の連続するヌクレオチドに対して相補的な特定のアンチセンス配列を備える。
低分子干渉ＲＮＡ分子を含む特定のアンチセンス配列は、標的配列の相補体と同一または実質的に同一とすることができる。一つの実施形態で、低分子干渉ＲＮＡ分子を含む特定のアンチセンス配列は、標的ｍＲＮＡ配列の相補体と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％だけ同一である。配列同一性を決定する方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）ソフトウェアのＢＬＡＳＴＮプログラム、またはＮＣＢＩウェブサイトで提供されているものを使用して決定することができる。
低分子干渉ＲＮＡ分子の特定のアンチセンス配列は、標的ｍＲＮＡの配列の一つ、二つ、三つ、四つまたはそれ以上のヌクレオチドで変化（例えば、ヌクレオチド置換により、移行またはトランスバージョンを含む）をさせることにより、可変性を示しうる。こうしたヌクレオチド置換が二本鎖ＲＮＡ分子のアンチセンス鎖内に存在するとき、それを用いて置換ヌクレオチドが一般に水素結合塩基対を形成するセンス鎖内の相補的ヌクレオチドは、それに伴い置換されることも置換されないこともある。一つ以上のヌクレオチド置換がセンス配列内で発生しているが、アンチセンス鎖では発生していない、二本鎖ＲＮＡ分子も意図されている。低分子干渉ＲＮＡ分子のアンチセンス配列が、上述の通り、低分子干渉ＲＮＡのヌクレオチド配列と標的ヌクレオチド配列との間の一つ以上のミスマッチを含むとき、そのミスマッチは、３’終端、５’終端またはアンチセンス配列の中央部分に存在しうる。
別の実施形態で、低分子干渉ＲＮＡ分子は、天然の標的遺伝子または標的ｍＲＮＡの一部に対して、厳密な条件の下で選択的にハイブリッド形成する能力を持つ特定のアンチセンス配列を備える。当業者にとって公知の通り、ハイブリッド形成条件の厳密性のばらつきは、ハイブリッド形成および洗浄の工程に使用する時間、温度または溶液の濃度を変化させることにより達成されうる。また、適切な条件は、使用する特定のヌクレオチド配列、例えば、標的ｍＲＮＡまたは遺伝子の配列に部分的に依存することがある。
植物体での二本鎖ＲＮＡ−サイレンシングを誘発するための一つの方法は、ヘアピンＲＮＡを生成する遺伝子構築物を用いた形質転換である（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｎａｔｕｒｅ， ４０７， ３１９−３２０を参照）。こうした構築物は、適切なスペーサーにより分離された標的遺伝子配列の逆の領域を含む。スペーサー断片として機能的植物体イントロン領域を挿入することでさらに、イントロンがスプライスされたヘアピンＲＮＡが生成されるため、遺伝子サイレンシング誘導の効率が高まる（Ｗｅｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｐｌａｎｔ Ｊ．， ２７， ５８１−５９０）。幹の長さは、約５０個のヌクレオチド〜約１キロベースであることが適切である。イントロンスプライスしたヘアピンＲＮＡを生成するための方法は、当該技術分野で十分に説明されている（例えば、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （２００８） ７２， ２， ６１５−６１７を参照）。
二重鎖または二本鎖構造を持つ干渉ＲＮＡ分子（例えば、二本鎖ＲＮＡまたは小ヘアピンＲＮＡ）は、ブラントエンドを持つことができ、また３’または５’オーバーハングを持つことができる。本明細書で使用されるとき、「オーバーハング」は、一方のＲＮＡ鎖の３’−終端が他方の鎖の５’−終端を越えて延びるとき（３’オーバーハング）、またはその逆のとき（５’オーバーハング）に、二重鎖構造から突き出している、対をなしていないヌクレオチド（単一もしくは複数）を意味する。オーバーハングを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはそれらの変性バージョンとすることができる。一つの実施形態で、干渉ＲＮＡ分子の少なくとも一つの鎖は、約１〜約６個のヌクレオチドの３’オーバーハングを持つ。その他の実施形態で、３’オーバーハングは、長さが約１〜約５個のヌクレオチド、約１〜約３個のヌクレオチドおよび約２〜約４個のヌクレオチドである。
干渉ＲＮＡ分子が分子の一方の端で３’オーバーハングを含むとき、他方の端は、平滑末端とするか、または同様にオーバーハング（５’または３’）を持つことができる。干渉ＲＮＡ分子が分子の両方の端にオーバーハングを含むとき、オーバーハングの長さは同一または異なる長さとしうる。一つの実施形態で、干渉ＲＮＡ分子は、分子の両端で約１〜約３個のヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。さらなる実施形態で、干渉ＲＮＡ分子は、分子の両端に２個のヌクレオチドの３’オーバーハングを持つ二本鎖ＲＮＡである。なお別の実施形態で、干渉ＲＮＡのオーバーハングを含むヌクレオチドは、ＴＴジヌクレオチドまたはＵＵジヌクレオチドである。
一つ以上のオーバーハングを含む干渉ＲＮＡ分子の標的ｍＲＮＡ配列に対する同一性のパーセント値を決定するとき、オーバーハングは考慮に入れても入れなくてもよい。例えば、３’ オーバーハングからのヌクレオチドおよび二本鎖の５’−または３’−終端からの最高２個のヌクレオチドは、低分子干渉ＲＮＡ分子の活性を大幅に損失することなく修飾しうる。
干渉ＲＮＡ分子は、一つ以上の５’または３’−キャップ構造を含むことができる。干渉ＲＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方の３’終端に、干渉ＲＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方の５’終端に、キャップ構造を含むことができる。別の方法として、干渉ＲＮＡ分子は、干渉ＲＮＡ分子の３’終端および５’終端の両方にキャップ構造を含むことができる。「キャップ構造」という用語は、オリゴヌクレオチドのいずれかの終端に組み入れられる化学的修飾を意味し、これはエキソヌクレアーゼ劣化から分子を保護し、また細胞内での送達または局在化の促進もしうる。
干渉ＲＮＡ分子に適用可能な別の修飾は、一つ以上の部分または共役体の干渉ＲＮＡ分子への化学的連結であり、これは、干渉ＲＮＡ分子の活性、細胞の分布、細胞の摂取、生物学的利用能または安定性を高める。ポリヌクレオチドは、当該技術分野で十分に確立された方法によって合成または修飾をしうる。化学的修飾は、２’修飾、非天然の塩基の導入、リガンドへの共有結合、およびリン酸塩結合とチオリン酸塩結合の置換を含みうるが、これに限定されない。この実施形態で、二重鎖構造の完全性は、少なくとも一つ、および一般には二つの化学的結合によって強化される。化学的結合は、様々な公知の技術のうちどれかによって達成しうるが、例えば、共有結合、イオン結合または水素結合の導入や、疎水性相互作用、ファンデルワールスまたはスタッキング相互作用や、金属イオン配位によるか、またはプリン類似物の使用によるものなどがある。
二つの一本鎖の一方または両方でのヌクレオチドは、例えば、限定はされないが、ある一定のヌクレアーゼなど、細胞の酵素の活性化を調節するために修飾しうる。細胞の酵素の活性化を低減または抑制するための技術は、当該技術分野において公知であり、２’−アミノ修飾、２’−フルオロ修飾、２’−アルキル修飾、無電荷のバックボーン修飾、モルホリノ修飾、２’−Ｏ−メチル修飾、およびホスホルアミド酸を含むが、これに限定されない。こうして、二本鎖ＲＮＡ上のヌクレオチドの少なくとも一つの２’−ヒドロキシル基が化学基によって置換される。また、少なくとも一つのヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドを形成するために修飾しうる。こうしたロックトヌクレオチドは、リボースの２’−酸素をリボースの４’−炭素と結合するメチレン架橋またはエチレン架橋を含む。オリゴヌクレオチドへのロックトヌクレオチドの導入により、相補配列に対する親和性が改善され、融解温度が数度だけ上昇する。
リガンドは、例えば、その細胞吸収を高めるために干渉ＲＮＡ分子に結合されうる。ある一定の実施形態で、疎水性リガンドは、細胞の薄膜の直接的な浸透を促進するために分子と結合される。これらのアプローチは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞浸透を促進するために使用されてきた。ある一定の事例で、陽イオン性のリガンドをオリゴヌクレオチドに結合させることで、結果的にヌクレアーゼに対する抵抗性が改善されることがよくある。陽イオン性リガンドの代表例は、プロピルアンモニウムおよびジメチルプロピルアンモニウムを含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、陽イオン性リガンドがオリゴヌクレオチド全体に分散されたとき、ｍＲＮＡに対するそれらの高い結合親和性を保持できる。
本明細書で説明した分子およびポリヌクレオチドは、固体相合成の公知のテクニックを使用して準備しうる。当該技術分野において公知の合成のためのその他何らかの手段を、追加的にまたは別の方法として採用しうる。
様々な実施形態は、本明細書で説明した一つ以上のポリヌクレオチドまたは一つ以上の干渉ＲＮＡ構築物を含む、発現ベクターを対象とする。例示的な構築物を図２１に示す。
様々な実施形態は、自己アニーリングしてヘヤピン構造を形成する能力を持つ、本明細書で説明した一つ以上の干渉ＲＮＡポリヌクレオチドをコードする、一つ以上のポリヌクレオチドまたは一つ以上の干渉ＲＮＡ構築物を含む発現ベクターを対象とするが、ここで構築物は、（ａ）本明細書で説明した一つ以上のポリヌクレオチドと、（ｂ）ヘヤピン構造のループを形成する第二の配列と、（ｃ）第一の配列の逆相補配列を含み、第一の配列と同一の方向に位置する第三の配列とを含み、また、第二の配列は、第一の配列と第三の配列の間に配置され、第二の配列は、第一の配列と第三の配列と作用できるように連結されている。
開示された配列は、ヘヤピン構造を形成しない様々なポリヌクレオチドの構成に利用できる。例えば、二本鎖ＲＮＡは、（１）ＤＮＡの第一の鎖を第一のプロモーターに作用できるように結合することにより転写し、（２）ＤＮＡ断片の第一の鎖の逆相補配列を第二のプロモーターに作用できるように結合することにより転写して、形成できる。ポリヌクレオチドのそれぞれの鎖は、同一の発現ベクターから、または異なる発現ベクターから転写できる。ＲＮＡ干渉活性を持つＲＮＡ二重鎖は、酵素学的に低分子干渉ＲＮＡに変換してＲＮＡレベルを調節できる。
こうして、様々な実施形態は、自己アニーリングが可能な干渉ＲＮＡポリヌクレオチドをコードする、本明細書で説明した一つ以上のポリヌクレオチドまたは干渉ＲＮＡ構築物を含む発現ベクターを対象とするが、ここで、構築物は、（ａ）一つ以上の本明細書で説明したポリヌクレオチドと、（ｂ）第一の配列と同一の方向に配置された第一の配列の相補的（例えば、逆相補的）配列を含む第二の配列とを含む。
一つ以上の本明細書で説明したポリペプチド（または本明細書で説明した通りその任意の組み合わせ）の内在性発現レベルを、遺伝子発現のコサプレッションを促進することにより調節するための様々な組成および方法が提供されている。コサプレッションの現象は、導入遺伝子の複数のコピーを植物体細胞宿主に導入した結果として発生する。導入遺伝子の複数のコピーの組み込みによって、結果的に、導入遺伝子および標的とされた内在性遺伝子の発現が調節されうる。コサプレッションの度合いは、導入遺伝子と標的とされた内在性遺伝子との間の配列同一性の度合いに依存する。内在性遺伝子と導入遺伝子の両方のサイレンシングは、転写を除外できるサイレンスト座位（すなわち、関心の内在性のプロモーターおよび内在性の遺伝子）の広範囲なメチル化によって発生しうる。これとは別に、一部のケースでは、内在性遺伝子および導入遺伝子のコサプレッションは転写後の遺伝子サイレンシングによって発生することがあり、ここで転写物は生成できるものの、劣化の率が高まり、転写物の蓄積が妨げられる。転写後遺伝子サイレンシングによるコサプレッションのメカニズムは、ＲＮＡが重要な発動因子でありかつこれらのプロセスにおける標的であると考えられる点で、ＲＮＡ干渉と似たものであると考えられ、また、同じ分子機構によって少なくとも部分的に、恐らくｍＲＮＡのＲＮＡ誘導性の劣化によって媒介されうる。
核酸のコサプレッションは、核酸またはその断片の複数のコピーを、導入遺伝子として関心の植物体のゲノムに組み入れることによって達成できる。宿主植物体は、核酸またはその断片に作用できるように連結されたプロモーターを含む発現ベクターを用いて変形させることができる。様々な実施形態は、ポリヌクレオチドに作用できるように連結されたプロモーターを含む内在性遺伝子のコサプレッションを促進するための発現ベクターを対象とする。
様々な実施形態は、一つ以上の本明細書で説明したポリヌクレオチド（または本明細書で説明した通りのその任意の組み合わせ）の発現レベルを、ポリヌクレオチドの複数のコピーを植物体ゲノムに組み入れることにより調節するための方法を対象とするが、これには、ポリヌクレオチドに作用できるように連結されたプロモーターを含む発現ベクターを用いて、植物体細胞宿主を形質転換させる工程が含まれる。
ｍＲＮＡの翻訳を調節することによって内在性遺伝子の発現レベルを調節するための様々な組成および方法が提供されている。宿主植物体細胞は、ポリヌクレオチドに作用できるように連結されたプロモーターであって、ｍＲＮＡの一部に対して相補配列を持つＲＮＡポリヌクレオチドの発現を可能にするプロモーターに対してアンチセンスの方向に配置されている、該プロモーターを含む発現ベクターを用いて形質転換させることができる。
ｍＲＮＡの翻訳を調節するための様々な発現ベクターは、ポリヌクレオチドに作用できるように連結されたプロモーターを備えうるが、ここで、その配列はプロモーターに対してアンチセンス方向に配置される。アンチセンスＲＮＡポリヌクレオチドの長さは変動させることができ、約１５〜２０個のヌクレオチド、約２０〜３０個のヌクレオチド、約３０〜５０個のヌクレオチド、約５０〜７５個のヌクレオチド、約７５〜１００個のヌクレオチド、約１００〜１５０個のヌクレオチド、約１５０〜２００個のヌクレオチド、および約２００〜３００個のヌクレオチドとしうる。
遺伝子も、トランスポゾン（例えば、ＩＳ要素）を関心の植物体のゲノムに導入することにより、不活性化のための標的にすることができる。これらの可動遺伝要素は、有性の交配によって導入でき、挿入変異をタンパク質活性の損失についてスクリーニングできる。親株内で分裂させた遺伝子は、親株をトランスポゾン誘発突然変異誘発の対象ではない植物体と、例えば、有性交配によって交雑させることで、他の植物体に導入できる。当業者にとって公知の任意の標準的な育種テクニックを利用できる。一つの実施形態で、一つ以上の遺伝子は、一つ以上のトランスポゾンの挿入により不活性化できる。突然変異によって、結果的に、一つ以上の遺伝子の同型接合の分裂、一つ以上の遺伝子の異型接合の分裂、または複数の遺伝子が分裂した場合に同型接合および異型接合の破壊の両方の組み合わせにつながることがある。適切な置き換え可能な要素は、レトロトランスポゾン、レトロポゾン、およびＳＩＮＥ様の要素を含む。こうした方法は、当業者にとって公知である。
別の方法として、遺伝子は、自己切断および複製の能力がある数多くの小さな環状ＲＮＡに由来するリボザイムを植物体に導入することにより、不活性化のための標的にできる。これらのＲＮＡは、単独（ウイロイドＲＮＡ）で、またはヘルパーウイルス（サテライトＲＮＡ）と共に、のいずれかで複製ができる。適切なＲＮＡの例には、アボカドサンブロッチウイロイドに由来するもののほか、たばこ輪点ウイルス、ルーサン一過性条斑ウイルス、ベルベットたばこ斑紋ウイルス、テリミノイヌホオズキ斑紋ウイルス、および地下性クローバ斑点ウイルスに由来するサテライトＲＮＡが含まれる。様々な標的ＲＮＡ特異的リボザイムが、当業者に知られている。
本明細書で考察したとおり、一つ以上のポリペプチドの発言は、非遺伝子組み換え手段（本明細書で考察した通り、一つ以上の遺伝子内に一つ以上の突然変異を作成するなど）により調整されうる。突然変異を遺伝子配列内に無作為に導入する方法には、化学薬品突然変異誘発、ＥＭＳ突然変異誘発および放射線突然変異誘発を含めることができる。一つ以上の標的の突然変異を細胞内に導入する方法には、ゲノム編集技術、特にジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介の突然変異誘発、ゲノム中の標的化誘発局所的損傷（ＴＩＬＬＩＮＧ）、相同的組み換え、オリゴヌクレオチドを標的とした変異誘発、およびメガヌクレアーゼ媒介の突然変異誘発が含まれるが、これに限定されない。一実施形態において、ＴＩＬＬＩＮＧが使用される。これは、発現および／または活性が修飾されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの生成および／または特定に使用できる突然変異誘発技術である。ＴＩＬＬＩＮＧでは、こうした突然変異体を持つ植物体の選択も許容される。ＴＩＬＬＩＮＧは、高密度の突然変異誘発を、高スループットのスクリーニング方法と組み合わせている。ＴＩＬＬＩＮＧの方法は、当業界で周知である（ＭｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．， （２０００） Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １８： ４５５−４５７およびＳｔｅｍｐｌｅ （２００４） Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ ５（２）： １４５−５０を参照）。
突然変異のいくつかの非限定的な例としては、少なくとも一つのヌクレオチド欠失、挿入およびミスセンス突然変異、単一のヌクレオチド多型および単純な配列繰り返しがある。突然変異の後、早熟の終止コドンまたはそれ以外での非機能的な遺伝子を生成した突然変異を特定するためにスクリーニングを実施できる。突然変異の後、高いレベルで発現される能力を持つ機能的な遺伝子を生成した突然変異を特定するためにスクリーニングを実施できる。突然変異体のスクリーニングは、配列決定により、または遺伝子またはタンパク質に対して特異的な一つ以上のプローブまたはプライマーを使用することにより実施できる。遺伝子発現の調節、ｍＲＮＡの安定性の調節、またはタンパク質の安定性の調節をもたらすことができる、ポリヌクレオチド内での特定の突然変異も生成できる。こうした植物体は、本明細書では、「非天然の」または「突然変異体」植物体と呼ぶ。一般に、突然変異体または非天然の植物体には、操作される前には植物体内に存在しなかった、外来性または合成的な、または人造の核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の少なくとも一部が含まれるようになる。外来性の核酸は、単一のヌクレオチド、二つ以上のヌクレオチド、二つ以上の連続するヌクレオチドまたは二つ以上の非連続的なヌクレオチド、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００または１５００個またはそれ以上の連続的または非連続的なヌクレオチドなどとしうる。
突然変異体または非天然の植物体または植物体細胞は、結果的にタンパク質レベルが調節される一つ以上の遺伝子における一つ以上の突然変異の任意の組み合わせを持つことができる。例えば、突然変異体または非天然の植物体または植物体細胞は、単一の遺伝子内での単一の突然変異、単一の遺伝子内での複数の突然変異、二つ以上、三つ以上または四つ以上の遺伝子内での単一の突然変異、または二つ以上、三つ以上または四つ以上の遺伝子内での複数の突然変異を持ちうる。こうした突然変異の例が本明細書に記載されている。さらなる例として、突然変異体または非天然の植物体または植物体細胞は、タンパク質またはその一部分の活性部位をコードする遺伝子の一領域内でなど、遺伝子の特定の部分内での一つ以上の突然変異を持ちうる。さらなる例として、突然変異体または非天然の植物体または植物体細胞は、遺伝子の活性または発現を調節する場合に、それが調節する遺伝子の上流または下流の一領域内などの一つ以上の遺伝子の外側の一領域に、一つ以上の突然変異を持ちうる。上流要素には、プロモーター、エンハンサーまたは転写因子を含めることができる。一部の要素（エンハンサーなど）は、調整する遺伝子の上流または下流に位置することができる。一部の要素は、それが調節する遺伝子の数十万塩基対だけ上流または下流に位置することがこれまでに判明しているため、要素はそれが調節する遺伝子の近くに位置する必要はない。突然変異体または非天然の植物体または植物体細胞は、遺伝子の最初のヌクレオチド１００個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド２００個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド３００個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド４００個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド５００個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド６００個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド７００個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド８００個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド９００個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド１０００個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド１１００個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド１２００個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド１３００個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド１４００個以内または遺伝子の最初のヌクレオチド１５００個以内に位置する、一つ以上の突然変異を持ちうる。突然変異体または非天然の植物体または植物体細胞は、遺伝子の１００個のヌクレオチドの第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４または第１５番目の組内またはその組み合わせに位置する一つ以上の突然変異を持ちうる。突然変異ポリペプチド変異体を含む突然変異体または非天然の植物体または植物体細胞（例えば、本明細書で説明した通り、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組み換えの植物体または植物体細胞およびこれに類するもの）が開示されている。
一つの実施形態で、植物体からの種子は突然変異誘発された後、第一世代突然変異体の植物体に栽培される。次に、第一世代の植物体は、自家受粉がなされ、第一世代植物体からの種子が第二世代の植物体に栽培され、次にこれがその座位で突然変異についてスクリーニングされる。突然変異について突然変異を誘発する植物材料をスクリーニングすることはできるが、第二世代の植物体をスクリーニングすることの利点は、細胞体のすべての突然変異が生殖細胞系列変異に対応することである。当業者であれば、突然変異体である植物体を生成するために、種子、花粉、植物体組織または植物体細胞を含むがこれに限定されない様々な植物材料が突然変異誘発しうることを理解することになる。ただし、突然変異誘発した植物材料のタイプは、植物体の核酸がいつ突然変異についてスクリーニングを受けるかに影響しうる。例えば、非突然変異誘発性植物体の受粉前に花粉が突然変異誘発の対象となるとき、その受粉の結果生じる種子は第一世代植物体に栽培される。第一世代の植物体の各細胞は、花粉内で生成された突然変異を含むことになり、こうしてこれらの第一世代の植物体はその後、第二世代まで待たずに突然変異についてスクリーニングを受けうる。
主に点突然変異および短い欠失、挿入、塩基転換、および／又は遷移を生成する突然変異原は、化学的突然変異原または放射線を含めて、突然変異を生成するために使用しうる。突然変異原は、エチルメタンスルホン酸塩、メチルメタンスルホン酸塩、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア、トリエチルメラミン、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソウレア、プロカルバジン、クロランブシル、シクロホスファミド、ジエチル硫酸塩、アクリルアミドモノマー、メルファラン、ナイトロジェン・マスタードカラシナ、ビンクリスチン、ジメチルニトロソアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−ニトロソグアニジン、ニトロソグアニジン、２−アミノプリン、７，１２ジメチル−ベンズ（ａ）アントラセン、酸化エチレン酸化物、ヘキサメチルホスホルアミド、ビスルファン、ジエポキシアルカン（ジエポキシオクタン、ジエポキシブタン、およびこれに類するもの）、２−メトキシ−６−クロロ−９［３−（エチル−２−クロロ−エチル）アミノプロピルアミノ］アクリジン二塩酸塩およびホルムアルデヒドを含むが、これに限定されない。
突然変異原が直接原因ではなかったかもしれない座での天然の突然変異も、それらが結果的に望ましい表現型をもたらす場合には意図されている。適切な変異原性物質には、例えば、イオン化放射線（Ｘ線、γ線、速中性子照射およびＵＶ放射放射線など）も含めることができる。突然変異スクリーニングのための植物体核酸を準備するために、当業者にとって公知の植物体の核酸を準備する任意の方法を使用しうる。
個体植物体、植物体細胞、または植物材料から準備した核酸は、随意に、突然変異誘発性の植物体組織、細胞または材料を起源とする植物体の母集団内で、突然変異についてのスクリーニングを促進させるためにプールすることができる。植物体、植物体細胞または植物材料のその後の一世代以上の世代をスクリーニングできる。随意にプールされる群のサイズは、使用するスクリーニング方法の感受性に依存する。
核酸試料が随意にプールされた後、それらを、ポリメラーゼ連鎖反応などのポリヌクレオチド特異的増幅テクニックの対象とすることができる。遺伝子のすぐ隣にある遺伝子または配列に特異的な一つ以上の任意のプライマーまたはプローブは、随意にプールされた核酸試料内で配列を増幅するために利用しうる。オリゴヌクレオチドプライマーの例が、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、および配列番号１６に記載されている。好適には、配列番号１３、および配列番号１４が、ＮｔＡｓｎ−１を検出するために組み合わせて使用される。好適には、配列番号１５、および配列番号１６が、ＮｔＡｓｎ−５を検出するために組み合わせて使用される。一つ以上のプライマーまたはプローブは、有用な突然変異が最も発生する可能性の高い座の領域を増幅するよう設計されていることが適切である。プライマーは、ポリヌクレオチドの領域内での突然変異を検出するように設計されることが最も好ましい。さらに、プライマーおよびプローブは、点突然変異についてのスクリーニングを容易にするために、既知の多型の部位を避けることが好ましい。増幅生成物の検出を促進するために、一つ以上のプライマーまたはプローブを従来的な任意の標識付け方法を使用して標識付けしうる。プライマーまたはプローブは、当業界でよく理解されている方法を使用して、本明細書で説明した配列に基づき設計できる。
増幅生成物の検出を促進するために、プライマーまたはプローブを従来的な任意の標識付け方法を使用して標識付けしうる。これらは、当業界でよく理解されている方法を使用して、本明細書で説明した配列に基づき設計できる。多型は、当業界において公知の手段により識別しうるが、いくつかがこれまでに文献に記載されている。
さらなる態様で、突然変異体である植物体を準備する方法が提供されている。方法には、本明細書で説明した機能的ポリヌクレオチド（または本明細書で説明した通りその任意の組み合わせ）をコードする遺伝子を含む、植物体の少なくとも一つの細胞の提供が関与する。次に、植物体の少なくとも一つの細胞が、本明細書で説明したポリヌクレオチドの活性を調節するのに効果的な条件下で処理される。次に、少なくとも一つの突然変異体である植物体細胞は、突然変異体である植物体内に増殖させられるが、そこで突然変異体である植物体は、対照植物体のそれと比較して調節された説明したポリペプチド（または本明細書で説明した通りその任意の組み合わせ）のレベルを持つ。突然変異体である植物体を作成するこの方法の一つの実施形態において、処理手順には、上述の通り、および少なくとも一つの突然変異体である植物体細胞を得るのに効果的な条件下で、少なくとも一つの細胞を化学的突然変異誘発物質に晒す段階が関与する。この方法の別の実施形態で、処理手順には、少なくとも一つの細胞を少なくとも一つの突然変異体である植物体細胞を得るのに効果的な条件下で線源に晒す段階が関与する。「突然変異体である植物体」という用語は、対照植物体と比較して遺伝子型が修飾され、それが遺伝子工学または遺伝的修飾以外の手段によることが適切である、突然変異体である植物体が含まれる。
ある一定の実施形態で、突然変異体である植物体、突然変異体である植物体細胞、または突然変異体である植物材料は、別の植物体、植物体細胞または植物材料で自然に発生し、望ましい特性を与える一つ以上の突然変異を備えうる。この突然変異は、別の植物体、植物体細胞、または植物材料（例えば、突然変異が誘導された植物体とは異なる遺伝的背景を持つ植物体、植物体細胞または植物材料）に組み込まれて（例えば、遺伝子移入されて）、その植物体に非天然である突然変異を生成し、かつその植物体に対して特性を与えることができる。こうして一例として、第一の植物体で自然に発生した突然変異が第二の植物体（第一の植物体とは異なる遺伝的背景を持つ第二の植物体など）に導入されうる。従って当業者は、本明細書で説明した望ましい特性を与える遺伝子の一つ以上の突然変異体対立形質をそのゲノム内に自然に持つ植物体を、検索し特定することができる。自然に発生する突然変異体対立遺伝子は、本明細書で説明した遺伝子で一つ以上の突然変異を持つ系統、品種または混成体を生成するために、育種、戻し交配および遺伝子移入を含む様々な方法により、第二の植物体に移動させることができる。望ましい特性を示す植物体は、突然変異体である植物体のプールからスクリーニングして除外しうる。選択は、本明細書で説明したヌクレオチド配列の知識を利用して実施されることが適切である。従って、対照と比較した遺伝的特性についてのスクリーニングが可能である。こうしたスクリーニングのアプローチには、本明細書で説明した通り従来的な核酸増幅および／またはハイブリッド形成テクニックの適用が関与しうる。こうして、さらなる態様は、突然変異体である植物体を識別するための方法に関連するが、この方法は、（ａ）植物体に由来する核酸を含む試料を提供する工程と、（ｂ）ポリヌクレオチドの核酸配列を決定する工程とを含み、ここで対照植物体のポリヌクレオチド配列と比較したポリヌクレオチドの配列の差異は、前述の植物体が突然変異体である植物体であることを示す。別の態様において、対照植物体と比較して、アスパラギンの蓄積レベルが低減した突然変異体である植物体を識別するための方法が提供されており、この方法は、（ａ）スクリーニングの対象となる植物体に由来する試料を提供する工程と、（ｂ）該試料が本明細書で説明した一つ以上のポリヌクレオチド内で一つ以上の突然変異を含むかどうかを判定する工程と、（ｃ）該植物体の少なくともアスパラギンの含有量を決定する工程とを含む。
別の態様において、対照植物体と比較して、アスパラギンのレベルが低減した突然変異体である植物体を調製するための方法が提供されており、この方法は、（ａ）第一の植物体に由来する試料を提供する工程と、（ｂ）前述の試料が、結果的にアスパラギンのレベルを低減させた本明細書に記載のポリヌクレオチドのうちの一つ以上において、一つ以上の突然変異を含むかどうかを判定する工程と、（ｃ）一つ以上の突然変異を第二の植物体に移入させる工程とを含む。突然変異は、遺伝子組み換え、遺伝子操作、遺伝子移入、植物体育種、戻し交配、およびこれに類するものによるなど、当業界において公知の様々な方法を使用して、第二の植物体に移動できる。一つの実施形態で、第一の植物体は、天然の植物体である。一つの実施形態で、第二の植物体は、第一の植物体とは異なる遺伝的背景を持つ。
別の態様において、対照植物体と比較して、アスパラギンのレベルが低減した突然変異体である植物体を調製するための方法が提供されており、この方法は、（ａ）第一の植物体に由来する試料を提供する工程と、（ｂ）該試料が、結果的にアスパラギンのレベルを低減させた本明細書に記載のポリヌクレオチドのうちの一つ以上において、一つ以上の突然変異を含むかどうかを判定する工程と、（ｃ）第一の植物体に由来する一つ以上の突然変異を第二の植物体に遺伝子移入する工程とを含む。一つの実施形態で、遺伝子移入の工程は、植物体育種を含み、随意に、戻し交配およびこれに類するものを含む。一つの実施形態で、第一の植物体は、天然の植物体である。一つの実施形態で、第二の植物体は、第一の植物体とは異なる遺伝的背景を持つ。一つの実施形態で、第一の植物体は、栽培品種または優良栽培品種ではない。一つの実施形態で、第二の植物体は、栽培品種または優良栽培品種である。
さらなる態様が、本明細書に記載した方法によって獲得されたか、または獲得可能な突然変異体である植物体（栽培品種または優良栽培品種の突然変異である植物体を含む）に関連する。ある一定の実施形態で、「突然変異体である植物体」は、本明細書で説明した一つ以上のポリヌクレオチドの配列内など、植物体の特定の領域にのみ局所化された一つ以上の突然変異を持ちうる。この実施形態によれば、突然変異体である植物体の残りのゲノム配列は、突然変異誘発前の植物体と同一となるかまたは実質的に同一となる。
ある一定の実施形態で、突然変異体である植物体は、一つ以上の本明細書で説明したポリヌクレオチドの配列内およびゲノムの一つ以上のさらなる領域など、植物体の複数の領域に局所化された一つ以上の突然変異を持ちうる。この実施形態によれば、突然変異体である植物体の残りのゲノム配列は、突然変異誘発前の植物体と同一ではなくなるか、または実質的に同一ではなくなる。ある一定の実施形態で、突然変異体である植物体は、本明細書で説明したポリヌクレオチドの一つ以上、二つ以上、三つ以上、四つ以上または五つ以上のエクソンでは一つ以上の突然変異があってはならないか、または本明細書で説明したポリヌクレオチドの一つ以上、二つ以上、三つ以上、四つ以上または五つ以上のイントロンでは一つ以上の突然変異を持ってはならないか、または本明細書で説明したポリヌクレオチドのプロモーターでは、一つ以上の突然変異を持ってはならないか、または本明細書で説明したポリヌクレオチドの３’非翻訳領域では、一つ以上の突然変異を持ってはならないか、または本明細書で説明したポリヌクレオチドの５’非翻訳領域では、一つ以上の突然変異を持ってはならないか、または本明細書で説明したポリヌクレオチドのコード領域では、一つ以上の突然変異を持ってはならないか、または本明細書で説明したポリヌクレオチドの非コード領域またはその二つ以上、三つ以上、四つ以上、五つ以上、または六つ以上のその部分の任意の組み合わせでは、一つ以上の突然変異を持ってはならない。
さらなる態様で、本明細書で説明したポリヌクレオチドをコードする遺伝子内に突然変異を含む植物体、植物体細胞または植物材料を識別する方法が提供されており、この方法が、（ａ）植物体、植物体細胞または植物材料に突然変異誘発を起こさせる工程と、（ｂ）前述の植物体、植物体細胞または植物材料またはその子孫から核酸試料を獲得する工程と、（ｃ）本明細書で説明したポリヌクレオチドまたは変異体またはその断片をコードする遺伝子の核酸配列を決定する工程とを含み、ここで、前述の配列の差異はその中での一つ以上の突然変異を示す。
ジンクフィンガータンパク質も、本明細書で説明した一つ以上のポリヌクレオチドの発現または活性を調節するために使用できる。各種の実施形態で、ポリヌクレオチドのコード配列の一部または全部を含むゲノムＤＮＡ配列が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介の突然変異誘発により修飾される。ゲノムＤＮＡ配列で、ジンクフィンガータンパク質結合のための一意の部位が検索される。別の方法として、ゲノムＤＮＡ配列で、ジンクフィンガータンパク質結合のための二つの一意の部位が検索されるが、ここで、両方の部位は両側の鎖上にあり、例えば、１、２、３、４、５、６またはそれ以上の塩基対だけ離れた互いに近い場所にある。従って、ポリヌクレオチドを結合するジンクフィンガータンパク質が提供されている。
ジンクフィンガータンパク質は、遺伝子内の選択した標的部位を認識するよう設計しうる。ジンクフィンガータンパク質は、ファージディスプレー選択、細菌性ツーハイブリッド選択または細菌性ワンハイブリッド選択などがあるがこれに限定されない選択方法に連結された、切断または拡張または部位特異的突然変異誘発の過程によって、天然のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインと非天然のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインとから得られたモチーフの任意の組み合わせを含むことができる。「非天然のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン」という用語は、標的の核酸内にあり修飾の対象となる核酸を含む細胞または生物体内では発生しない、３塩基対配列を結合するジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを意味する。標的遺伝子に対して一意である特定のヌクレオチド配列を結合するジンクフィンガータンパク質の設計のための方法は、当業界において公知である。
ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ポリヌクレオチドを結合するジンクフィンガータンパク質についてコードする第一のポリヌクレオチドポリヌクレオチドと、Ｔｙｐｅ ＩＩＳエンドヌクレアーゼのものなどを含むがこれに限定されない、非特異的エンドヌクレアーゼについてコードする第二のポリヌクレオチドポリヌクレオチドとの融合をすることにより、構成しうる。ジンクフィンガータンパク質とヌクレアーゼの間の融合タンパク質は、二塩基対から成るスペーサーを含みうるが、または別の方法として、スペーサーは三つ、四つ、五つ、六つ、七つまたはそれ以上の塩基対で構成できる。各種の実施形態で、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、二重鎖切断をポリヌクレオチドのゲノムＤＮＡ配列の制御領域、コード領域、または非コード領域に導入し、ポリヌクレオチドの発現レベルが低減するように、またはそれによってコードされるタンパク質の活性が低下するように導く。ジンクフィンガーヌクレアーゼによる切断によって、結果的に非相同末端結合によるＤＮＡの修復の後、切断部位でＤＮＡの欠失につながることが頻繁にある。
その他の実施形態で、ジンクフィンガータンパク質は、ポリヌクレオチドの制御配列に結合するよう選択しうる。さらに具体的に言えば、制御配列は、転写開始部位、開始コドン、エクソンの領域、エクソン−イントロンの境界、転写終結区、または終止コドンを備えうる。従って、本開示は、本明細書で説明した一つ以上のポリヌクレオチドの近傍またはその内部でジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介の突然変異誘発により生成された突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組み換えの植物体または植物体細胞と、ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介の突然変異誘発により、こうした植物体または植物体細胞を作成するための方法とを提供する。ジンクフィンガータンパク質およびジンクフィンガーヌクレアーゼを植物体に送達するための方法は、メガヌクレアーゼの送達について後述する内容と類似している。
別の態様で、メガヌクレアーゼ（Ｉ−ＣｒｅＩなど）を使用して、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの、または他の方法で遺伝学的変性のある植物体を生成する方法が説明されている。天然のメガヌクレアーゼと組み換え体メガヌクレアーゼは、植物体のゲノムＤＮＡ内の単一の部位で、または比較的少ない部位で、特異的に二本鎖切断を起こし、一つ以上の本明細書で説明したポリヌクレオチドの分裂を許容するために使用できる。メガヌクレアーゼは、ＤＮＡ認識性質が変化した強化メガヌクレアーゼとしうる。メガヌクレアーゼタンパク質は、当該技術分野において公知の様々な異なるメカニズムにより、植物体細胞に送達できる。
本開示は、植物体細胞または植物体内で本明細書で説明したポリヌクレオチド（または本明細書で説明した通りのその任意の組み合わせ）を不活性化するためのメガヌクレアーゼの使用も包含する。特に、本開示は、メガヌクレアーゼを使用して植物体内でのポリヌクレオチドを不活性化するための方法を提供し、この方法は、（ａ）本明細書で説明したポリヌクレオチドを含む植物体細胞を提供する工程と、（ｂ）メガヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼをコードする構築物を前述の植物体細胞内に導入する工程と、（ｃ）メガヌクレアーゼにポリヌクレオチドを実質的に不活性化させる工程とを含む。
メガヌクレアーゼは、ポリヌクレオチドのコード領域内のメガヌクレアーゼ認識部位を切断するために使用できる。こうした切断では、非相同末端結合による変異原性ＤＮＡ修復の後で、結果的にメガヌクレアーゼ認識部位でのＤＮＡの欠失につながることが頻繁にある。遺伝子コード配列内でのこうした突然変異は、一般に遺伝子を不活性化するのに十分である。植物体細胞を修飾するためのこの方法には、まず、適切な形質転換方法を使用したメガヌクレアーゼ発現カセットの植物体細胞への送達が関与する。最高の効率を得るためには、メガヌクレアーゼ発現カセットを選択マーカーに結合し、選択物質の存在下で、首尾よく転換された細胞を選択することが望ましい。このアプローチによって、結果的にメガヌクレアーゼ発現カセットがゲノムに組み込まれるようになるが、これは、植物体が規制当局の許可を要する可能性が高い場合には望ましくないことがある。こうしたケースでは、メガヌクレアーゼ発現カセット（および結合された選択マーカー遺伝子）は、その後の植物体の世代で従来的な育種テクニックを使用して分離しうる。別の方法として、植物体細胞は、選択マーカーを持たないメガヌクレアーゼ発現カセットを用いて当初転換し、選択物質を欠いた培養液で培養しうる。こうした条件下では、処理した細胞の一部はメガヌクレアーゼ発現カセットを獲得し、メガヌクレアーゼ発現カセットをゲノムに組み込むことなく、強化されたメガヌクレアーゼを過渡的に発現する。形質転換の効率は考慮されていないため、この後者の形質転換処置では、望ましいゲノム修飾を獲得するためにより多くの数の処理済み細胞のスクリーニングが要求される。上記のアプローチは、ジンクフィンガータンパク質またはジンクフィンガーヌクレアーゼを使用するとき、植物体細胞を修飾するのにも適用できる。
メガヌクレアーゼ発現カセットを送達した後、植物体細胞は、当初、使用された特定の形質転換処置にとって一般的な条件下で培養される。これは、形質転換した細胞を培養液で、温度２６℃未満で暗所で頻繁に培養することを意味しうる。こうした標準条件は、植物体細胞を形質転換過程から回復させるために、ある期間（１〜４日が好ましい）について使用できる。この当初の回復期間後の任意の時点で、強化メガヌクレアーゼの活性を刺激してメガヌクレアーゼ認識部位を切断し突然変異を起こさせるために、培養温度を上昇させうる。
ある一定の用途では、ポリヌクレオチドを植物体のゲノムから正確に除去することが望ましいことがある。こうした用途は、強化メガヌクレアーゼの対を使用して可能であり、そのそれぞれが意図された欠失のどちらかの側にあるメガヌクレアーゼ認識部位を切断する。遺伝子を認識してそれに結合し、二本鎖切断をゲノムに導入することができるＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）も使用できる。別の態様で、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼを使用して、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの、または他の方法で本明細書で説明した遺伝学的変性のある植物体を生成する方法が意図されている。
タバコ（Ｎｉｃｏｔｉｎｉａ ｔａｂａｃｕｍ）のバーレー品種において、乾燥処理する間にアスパラギンの合成に関与するとして識別された遺伝子は、他の植物体および他の種々の植物体に適用可能である。従って、本開示は、他の植物体で再現可能であり、また変異体系統での育種に適用可能であると考えられる。
本開示での使用に適した植物体は、単子葉および双子葉の植物体ならびに植物体細胞系を含み、以下の科のうちの一つに属する種を含むが、これに限定されない。Acanthaceae、Alliaceae、Alstroemeriaceae、Amaryllidaceae、Apocynaceae、Arecaceae、Asteraceae、Berberidaceae、Bixaceae、Brassicaceae、Bromeliaceae、Cannabaceae、Caryophyllaceae、Cephalotaxaceae、Chenopodiaceae、Colchicaceae、Cucurbitaceae、Dioscoreaceae、Ephedraceae、Erythroxylaceae、Euphorbiaceae、Fabaceae、Lamiaceae、Linaceae、Lycopodiaceae、Malvaceae、Melanthiaceae、Musaceae、Myrtaceae、Nyssaceae、Papaveraceae、Pinaceae、Plantaginaceae、Poaceae、Rosaceae、Rubiaceae、Salicaceae、Sapindaceae、Solanaceae、Taxaceae、Theaceae、またはVitaceae。
適切な種は、Abelmoschus、Abies、Acer、Agrostis、Allium、Alstroemeria、Ananas、Andrographis、Andropogon、Artemisia、Arundo、Atropa、Berberis、Beta、Bixa、Brassica、Calendula、Camellia、Camptotheca、Cannabis、Capsicum、Carthamus、Catharanthus、Cephalotaxus、Chrysanthemum、Cinchona、Citrullus、Coffea、Colchicum、Coleus、Cucumis、Cucurbita、Cynodon、Datura、Dianthus、Digitalis、Dioscorea、Elaeis、Ephedra、Erianthus、Erythroxylum、Eucalyptus、Festuca、Fragaria、Galanthus、Glycine、Gossypium、Helianthus、Hevea、Hordeum、Hyoscyamus、Jatropha、Lactuca、Linum、Lolium、Lupinus、Lycopersicon、Lycopodium、Manihot、Medicago、Mentha、Miscanthus、Musa、Nicotiana、Oryza、Panicum、Papaver、Parthenium、Pennisetum、Petunia、Phalaris、Phleum、Pinus、Poa、Poinsettia、Populus、Rauwolfia、Ricinus、Rosa、Saccharum、Salix、Sanguinaria、Scopolia、Secale、Solanum、Sorghum、Spartina、Spinacea、Tanacetum、Taxus、Theobroma、Triticosecale、Triticum、Uniola、Veratrum、Vinca、Vitis、およびZeaといった属の一つを含みうる。
適切な種は、Panicum属種、Sorghum属種、Miscanthus属種、Saccharum属種、Erianthus属種、Populus属種、Andropogon gerardii（ヒメアブラススキ）、Pennisetum purpureum（オオガマ）、Phalaris arundinacea（クサヨシ）、Cynodon dactylon（ギョウギシバ）、Festuca arundinacea（ヒロハノウシノケグサ）、Spartina pectinata（プレーリーコードグラス）、Medicago sativa（アルファルファ）、Arundo donax（ダンチク）、Secale cereale（ライ麦）、Salix属種 （ヤナギ）、Eucalyptus属種 （ユーカリ）、Triticosecale（コムギタイムライ麦）、竹、Helianthus annuus（ヒマワリ）、Carthamus tinctorius（ベニバナ）、Jatropha curcas（ジャトロファ）、Ricinus communis（トウゴマ）、Elaeis guineensis（ヤシ）、Linum usitatissimum（アマ）、Brassica juncea、Beta vulgaris（テンサイ）、Manihot esculenta（cassaya）、Lycopersicon esculentum（トマト）、Lactuca sativa（レタス）、Musyclise alca（バナナ）、Solanum tuberosum（ジャガイモ）、Brassica oleracea（ブロッコリ、カリフラワー、メキャベツ）、Camellia sinensis（茶）、Fragaria ananassa（イチゴ）、Theobroma cacao（ココア）、Coffea ycliseca（コーヒー）、Vitis vinifera（ブドウ）、Ananas comosus（パイナップル）、Capsicum annum（トウガラシおよびアマトウガラシ）、Allium cepa（タマネギ）、Cucumis melo（メロン）、Cucumis sativus（キュウリ）、Cucurbita maxima（カボチャ）、Cucurbita moschata（カボチャ）、Spinacea oleracea（ホウレンソウ）、Citrullus lanatus（スイカ）、Abelmoschus esculentus（オクラ）、Solanum melongena（ナス）、Rosa属種 （バラ）、Dianthus caryophyllus（カーネーション）、Petunia属種 （ペチュニア）、Poinsettia pulcherrima（ポインセチア）、Lupinus albus（ルピナス）、Uniola paniculata（オートムギ）、ベントグラス（Agrostis属種）、Populus tremuloides（ポプラ）、Pinus属種 （マツ）、Abies属種 （モミ）、Acer属種 （カエデ）、Hordeum vulgare（オオムギ）、Poa pratensis（ブルーグラス）、Lolium属種 （ドクムギ）およびPhleum pratense（チモシー）、Panicum virgatum（スイッチグラス）、SorghuXXXycliseXXXまたは（モロコシ、スーダングラス）、Miscanthus giganteus（ススキ）、Saccharum 属種 （energycane）、Populus balsamifera（ポプラ）、Zea mays（トウモロコシ）、Glycine max（ダイズ）、Brassica napus（キャノーラ）、Triticum aestivum（コムギ）、Gossypium hirsutum（ワタ）、Oryza sativa（イネ）、Helianthus annuus（ヒマワリ）、Medicago sativa（アルファルファ）、Beta vulgaris（テンサイ）、またはPennisetum glaucum（トウジンビエ）を含みうる。
様々な実施形態は、遺伝子発現レベルを調節するために修飾され、それによってポリペプチドの発現レベルが対照植物体と比較して関心の組織内で調節された植物体または植物体細胞（たばこ植物体またはたばこ植物体細胞など）を生成する、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組み換えの植物体または植物体細胞を対象とする。開示された組成および方法は、たばこ属（Nicotiana）に属するN. rusticaおよびN. tabacumを含む任意の種に適用できる（例えば、LA B21、LN KY171、TI 1406、Basma、Galpao、Perique、Beinhart 1000-1、およびPetico）。その他の種は、N.アカウリス（N. acaulis）、N.アクミナタ（N. acuminata）、N.アフリカナ（N. africana）、N.アラタ（N. alata）、N.アメギノイ（N. ameghinoi）、N.アムプレキシカウリス（N. amplexicaulis）、N.アレントシイ（N. arentsii）、N.アッテニュアタ（N. attenuata）、N.アゼンブジェ（N. azambujae）、N.ベナヴィデシイ（N. benavidesii）、N.ベンタミアナ（N. benthamiana）、N.ビゲロビイ（N. bigelovii）、N.ボラリエンシス（N. bonariensis）、N.カヴィコラ（N. cavicola）、N.クレベランヂイ（N. clevelandii）、N.コルジフォリア（N. cordifolia）、N.コリムボサ（N. corymbosa）、N.デブネイ（N. debneyi）、N.エクセルシオル（N. excelsior）、N.フォルゲチアナ（N. forgetiana）、N.フラグランス（N. fragrans）、N.グラウカ（N. glauca）、N.グルチノサ（N. glutinosa）、N.グッドスピーディイ（N. goodspeedii）、N.ゴッセイ（N. gossei）、N.ハイブリッド（N. hybrid）、N.イングルバ（N. ingulba）、N.カワカミイ（N. kawakamii）、N.ナイチアナ（N. knightiana）、N.ラングスドルフィイ（N. langsdorffii）、N.リネアリス（N. linearis）、N.ロンギフロラ（N. longiflora）、N.マリチマ（N. maritima）、N.メガロシフォン（N. megalosiphon）、N.ミエルシイ（N. miersii）、N.ノクチフロラ（N. noctiflora）、N.ヌヂカウリス（N. nudicaulis）、N.オブツシフォリア（N. obtusifolia）、N.オクシデンタリス（N. occidentalis）、N.オクシデンタリス亜種ヘスペリス（N. occidentalis subsp. hesperis）、N.オトフォラ（N. otophora）、N.パニキュラタ（N. paniculata）、N.パウシフロラ（N. pauciflora）、N.ペツニオイデス（N. petunioides）、N.プルムバギニフォリア（N. plumbaginifolia）、N.クアドリヴァルヴィス（N. quadrivalvis）、N.ライモンジイ（N. raimondii）、N.レパンダ（N. repanda）、N.ロスラタ（N. rosulata）、N.ロスラタ亜種イングルバ（N. rosulata subsp. ingulba）、N.ロツンヂフォリア（N. rotundifolia）、N.セッシェリイ（N. setchellii）、N.シムランス（N. simulans）、N.ソラニフォリア（N. solanifolia）、N.スペガッジニイ（N. spegazzinii）、N.ストックトニイ（N. stocktonii）、N.スアヴェオレンス（N. suaveolens）、N.シルヴェストリス（N. sylvestris）、N.サイルシフロラ（N. thyrsiflora）、N.トメトサ（N. tomentosa）、N.トメトシフォルミス（N. tomentosiformis）、N.トリゴノフィラ（N. trigonophylla）、N.ウムブラチカ（N. umbratica）、N.ウンジュラタ（N. undulata）、N.ヴェルチナ（N. velutina）、N.ウィガンディオイデス（N. wigandioides）およびN.キサンデラエ（N. x sanderae）を含む。
たばこ栽培品種および優良たばこ栽培品種の使用も、本明細書で意図されている。従って、遺伝子組み換えであるか、非天然であるか、または突然変異体である植物体は、一つ以上の導入遺伝子、または一つ以上の遺伝子突然変異、またはその組み合わせを含む、たばこ品種または優良たばこ栽培品種としうる。遺伝子突然変異（例えば、一つ以上の多型）は、個別たばこ品種またはたばこ栽培品種（例えば、優良たばこ栽培品種）内に天然には存在しない突然変異とするか、または個別たばこ品種またはたばこ栽培品種（例えば、優良たばこ栽培品種）で天然に発生しないとする場合に、天然に発生する遺伝子突然変異とすることができる。
特に有用なNicotiana tabacum品種には、バーレータイプ、ダークタイプ、熱風送管乾燥処理タイプ、およびオリエンタルタイプのたばこが含まれる。品種または栽培品種の非限定的な例は：BD 64、CC 101、CC 200、CC 27、CC 301、CC 400、CC 500、CC 600、CC 700、CC 800、CC 900、Coker 176、Coker 319、Coker 371 Gold、Coker 48、CD 263、DF911、DT 538 LC Galpao tobacco、GL 26H、GL 350、GL 600、GL 737、GL 939、GL 973、HB 04P、HB 04P LC、HB3307PLC、Hybrid 403LC、Hybrid 404LC、Hybrid 501 LC、K 149、K 326、K 346、K 358、K394、K 399、K 730、KDH 959、KT 200、KT204LC、KY10、KY14、KY 160、KY 17、KY 171、KY 907、KY907LC、KY14xL8 LC、Little Crittenden、McNair 373、McNair 944、msKY 14xL8、Narrow Leaf Madole、Narrow Leaf Madole LC、NBH 98、N-126、N-777LC、N-7371LC、NC 100、NC 102、NC 2000、NC 291、NC 297、NC 299、NC 3、NC 4、NC 5、NC 6、NC7、NC 606、NC 71、NC 72、NC 810、NC BH 129、NC 2002、Neal Smith Madole、OXFORD 207、PD 7302 LC、PD 7309 LC、PD 7312 LC、'Periqe' tobacco、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R 610、R 630、R 7-11、R 7-12、RG 17、RG 81、RG H51、RGH 4、RGH 51、RS 1410、Speight 168、Speight 172、Speight 179、Speight 210、Speight 220、Speight 225、Speight 227、Speight 234、Speight G-28、Speight G-70、Speight H-6、Speight H20、Speight NF3、TI 1406、TI 1269、TN 86、TN86LC、TN 90、TN 97、TN97LC、TN D94、TN D950、TR（Tom Rosson）Madole、VA 309、VA359、AA 37-1、B13P、Xanthi（Mitchell-Mor）、Bel-W3、79-615、Samsun Holmes NN、KTRDC number 2 Hybrid 49、Burley 21、KY8959、KY9、MD 609、PG01、PG04、PO1、PO2、PO3、RG11、RG 8、VA509、AS44、Banket A1、Basma Drama B84/31、Basma I Zichna ZP4/B、Basma Xanthi BX 2A、Batek、Besuki Jember、C104、Coker 347、Criollo Misionero、Delcrest、Djebel 81、DVH 405、Galpao Comum、HB04P、Hicks Broadleaf、Kabakulak Elassona、Kutsage E1、LA BU 21、NC 2326、NC 297、PVH 2110、Red Russian、Samsun、Saplak、Simmaba、Talgar 28、Wislica、Yayaldag、Prilep HC-72、Prilep P23、Prilep PB 156/1、Prilep P12-2/1、Yaka JK-48、Yaka JB 125/3、TI-1068、KDH-960、TI-1070、TW136、Basma、TKF 4028、L8、TKF 2002、GR141、Basma xanthi、GR149、GR153、Petit Havanaである。本明細書で具体的に識別されていない場合であっても、上記の低コンバーター亜種も意図されている。
一実施形態では、タバコ（Nicotiana tabacum）のバーレータイプ品種が使用される。
本開示での使用に適切な他の植物体として、茶（Camellia sinensis）が挙げられるが、これに限定されない。
実施形態は、本明細書で説明したポリヌクレオチド（または本明細書で説明した通りその任意の組み合わせ）の発現または活性を調節するために修飾された、突然変異体である植物体、非天然の植物体、混成体である植物体、または遺伝子組み換え植物体を生成する組成および方法も対象とする。有利なことに、得られた突然変異体である植物体、非天然の植物体、混成体である植物体、または遺伝子組み換えの植物体は、全体的な外観において対照植物体と類似しているか、または実質的に同一でありうる。成熟度、植物体当たりの葉の数、茎の高さ、葉の挿入角度、葉のサイズ（幅および長さ）、節間の距離、および葉身と中央脈の比率など、様々な表現型特性を現場での観察により評価できる。
一つの態様は、本明細書で説明した突然変異体である植物体、非天然の植物体、混成体である植物体、または遺伝子組み換えの植物体の種子に関連する。種子はたばこ種子であることが好ましい。さらなる態様は、本明細書で説明した突然変異体である植物体、非天然の植物体、混成体である植物体、または遺伝子組み換え植物体の花粉または胚珠に関連する。さらに、雄性不稔性を与える核酸をさらに含む、本明細書で説明した突然変異体である植物体、非天然の植物体、混成体である植物体、または遺伝子組み換えの植物体が提供されている。
また、本明細書で説明した突然変異体である植物体、非天然の植物体、混成体である植物体、または遺伝子組み換えの植物体、またはその部分の再生可能な細胞の組織培養も提供されており、培養によって、親のすべての形態学的特性および生理学的特性を発現する能力を持つ植物体が再生される。再生可能な細胞には、葉、花粉、胚、子葉、胚軸、根、根端、葯、花およびその部分、胚珠、苗条、幹、茎、随およびカプセルに由来する細胞、またはカルスまたはそれに由来する原形質体が含まれるが、これに限定されない。
なおさらなる態様は、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組み換えの植物体または細胞から誘導されるかまたは誘導可能な乾燥処理済み植物材料（乾燥処理済みの葉または乾燥処理済みたばこなど）であって、本明細書で説明したポリヌクレオチドのうちの一つ以上の発現またはそれによってコードされるタンパク質の活性が低減し、これが結果的にそこでのアスパラギンレベルの低減をもたらす、該乾燥処理済み植物材料に関連する。
前述の植物体（例えば、葉）の視覚的外観は、実質的に対照植物体と同一であることが適切である。植物体はたばこ植物体であることが適切である。
実施形態は、本明細書で説明したポリヌクレオチドまたはポリペプチドのうちの一つ以上の発現または活性を調節するために修飾された突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組み換えの植物体または植物体細胞を生成する組成および方法も対象とするが、これは、アスパラギンのレベルが低減した植物体、または植物体成分（例えば、葉（乾燥処理または乾燥済みの葉など））、または植物体細胞をもたらしうるものである。
本明細書に記載した方法に従い獲得された突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組み換えの植物体は、視覚的な外観において対照植物体と類似しているかまたは実質的に同一なものとしうる。一つの実施形態で、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体の葉の重量は、実質的に対照植物体と同一である。一つの実施形態で、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体の葉数は、実質的に対照植物体と同一である。一つの実施形態で、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体の葉の重量および葉数は、実質的に対照植物体と同一である。一つの実施形態で、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体の茎の高さは、例えば、野外に移植してから１か月、２か月または３か月以上、または最高の高さまで伸びた後１０日、２０日、３０日または３６日またはそれ以上の日数が経過した時点で実質的に対照植物体と同一である。例えば、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体の茎の高さは、対照植物体の茎の高さよりも低くない。一つの実施形態で、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体のクロロフィル含有量は、実質的に対照植物体と同一である。別の実施形態で、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体の茎の高さは、実質的に対照植物体と同一であり、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体の葉緑素含有量は、実質的に対照植物体と同一である。一つの実施形態で、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体の葉のサイズまたは形態または数または彩色は、実質的に対照植物体と同一である。植物体はたばこ植物体であることが適切である。
別の態様において、アスパラギンの量を少なくとも植物体の一部分（例えば、葉（乾燥処理または乾燥済みの葉など）またはたばこ）において調節（例えば、低減）するための方法が提供され、この方法は、（ｉ）本明細書で説明したポリペプチドのうちの一つ以上の発現または活性を調節（例えば、低減）する工程であって、好適には、該ポリペプチドが、本明細書で説明した対応するポリヌクレオチド配列によりコードされる工程と、（ｉｉ）工程（ｉ）で入手した突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組み換えの植物体の少なくとも一部分（例えば、葉（乾燥処理済みの葉など））内のアスパラギン含有量を測定する工程と、（ｉｉｉ）該アスパラギン含有量が対照植物体と比較して低減した、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組み換えの植物体を識別する工程とを含む。前述の突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体の視覚的外観は、実質的に対照植物体と同一であることが適切である。植物体はたばこ植物体であることが適切である。
別の態様で、アスパラギンの量を、乾燥処理または乾燥済み植物材料（例えば、乾燥処理または乾燥済みの葉など）の少なくとも一部分において低減させるための方法が提供されているが、この方法は、（ｉ）本明細書で説明したポリペプチドのうちの一つ以上の発現または活性を低減させる工程であって、そこで好適には、該ポリペプチドは、本明細書で説明した対応するポリヌクレオチド配列によりコードされる該工程と、（ｉｉ）植物材料（葉のうちの一つ以上など）を収穫し、ある期間の間に乾燥処理または乾燥する工程と、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた乾燥処理または乾燥済み植物材料の少なくとも一部分のアスパラギン含有量を測定する工程と、（ｉｖ）該アスパラギン含有量が、対照植物体と比較して低減した乾燥処理または乾燥済み植物材料を識別する工程とを含む。
対照と比較した発現の減少は、約５％〜約１００％としうるか、または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％の減少であり、これには、転写性の活性またはポリヌクレオチド発現またはポリペプチド発現またはその組み合わせの減少が含まれる。
対照と比較した活性の減少は、約５％〜約１００％としうるか、または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％の低減である。
本明細書で説明したポリヌクレオチドおよび組み換え体構築物は、関心の植物体種（たばこが適切である）での本明細書で説明した酵素の発現の調節に使用できる。
数多くのポリヌクレオチドをベースにした方法を、例えば、植物体および植物体細胞内での遺伝子発現を増大させるために使用できる。一例として、形質転換する植物体との適合性のある構築物、ベクターまたは発現ベクターを準備でき、これは、関心の遺伝子と、植物体または植物体細胞内の遺伝子を過剰発現する能力のある上流プロモーターとを一緒に備える。模範的プロモーターについては、本明細書で説明した。形質転換の後、および適切な条件下で栽培されたとき、植物体中、その特定の組織中のこの酵素のレベルを調節（例えば、低減）するために、プロモーターは発現を駆動することができる。模範的な一つの実施形態で、一つ以上の本明細書で説明したポリヌクレオチド（または本明細書で説明した通りその任意の組み合わせ）を持つベクターは、植物体または植物体細胞内で遺伝子を過剰発現するために生成される。ベクターは、形質転換の上流に適切なプロモーター（カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターなど）を持ち、植物体のすべての組織内でその構成的な発現を駆動する。ベクターはまた、形質転換されたカルスおよび株細胞の選択肢を与えるために、抗生物質耐性の遺伝子を持つ。
様々な実施形態が、本明細書で説明した一つ以上のポリヌクレオチドの発現レベルを、ポリヌクレオチドの複数のコピーを植物体ゲノムに組み込むことで低減させるための方法を対象とするが、これには、本明細書で説明した一つ以上のポリヌクレオチドに作用できるように連結されたプロモーターを含む発現ベクターを用いて植物体細胞宿主を形質転換させる工程が含まれる。組み換え体ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドは、未変性のポリペプチドとすることも、または細胞に対して異質組織とすることもできる。
本明細書で説明した一つ以上のポリヌクレオチド（または本明細書で説明した通りのその任意の組み合わせ）の突然変異体対立遺伝子を持つ植物体は、有用な系統、品種および混成体を生成するための植物体育種プログラムで使用できる。特に、突然変異体対立遺伝子は、上述した商業的に重要な品種に遺伝子移入される。こうして、本明細書で異なる遺伝的同一性を備えた植物体で説明した、突然変異体である植物体、非天然の植物体、または遺伝子組み換えの植物体の交雑を含む、植物体を育種するための方法が提供されている。方法は、さらに子孫植物体と別の植物体との交雑を含めることができ、また随意に、望ましい遺伝的形質または遺伝的背景を持つ子孫が得られるまで交雑が繰り返される。こうした育種方法が果たしている一つの目的は、望ましい遺伝的特性を他の品種、育成系統、混成体または栽培品種、特に商業的利害のあるものに導入することである。別の目的は、異なる遺伝子の遺伝的修飾を単一の植物体品種、系統、混成体または栽培品種へ積み重ねることの促進である。種内および種間の交配が意図されている。こうした交雑から発生した子孫植物体は、育種系統とも言うが、本開示の非天然の植物体の例である。
一つの実施形態で、非天然の植物体を生成するための方法が提供されおり、この方法は、（ａ）突然変異体または遺伝子組み換えの植物体を第二の植物体と交雑して、子孫たばこ種子を得る工程と、（ｂ）子孫たばこ種子を植物体栽培条件下で栽培して、非天然の植物体を得る工程とを含む。この方法はさらに、以下を含みうる：（ｃ）前の世代の非天然の植物体を、それ自体または別の植物体を交雑して、子孫種子を得る工程と、（ｄ）工程（ｃ）の子孫種子を、植物体栽培条件下で栽培して、追加的な非天然の植物体を得る工程と、（ｅ）（ｃ）および（ｄ）の交雑および栽培の工程を複数回繰り返して、非天然の植物体のさらなる世代を生成する工程とを含む。この方法は、随意に、工程（ａ）の前に、特性付けられ、かつ突然変異体または遺伝子組み換えの植物体とは同一ではない遺伝的同一性を備えた親株を提供する工程を含みうる。一部の実施形態で、育種プログラムにもよるが、交雑および栽培の工程は、非天然の植物体の世代を生成するために、０〜２回、０〜３回、０〜４回、０〜５回、０〜６回、０〜７回、０〜８回、０〜９回、または０〜１０回繰り返される。戻し交雑は、こうした方法の一実施例であり、ここで、親のものと近い遺伝的同一性を持つ次世代の子孫植物体を得るために、子孫はその親またはその親と遺伝的に類似した別の植物体との交雑がなされる。植物体育種、特に植物体育種の技法はよく知られており、本開示の方法で使用できる。本開示はさらに、これらの方法により生成された非天然の植物体を提供する。一定の実施形態では、植物体を選択する工程は除外される。
本明細書に記載した方法の一部の実施形態では、標準現場手続きを使用して、変異体遺伝子のための育種およびスクリーニングからもたらされた系統が現場で評価される。最初の変異誘発されていない親を含む対照遺伝子型が含められ、無作為化完全ブロックデザインまたはその他の適切な現場設計で、エントリーが現場で配列される。たばこについては、標準的な農業方法が使用され、例えば、たばこは、収穫され、秤量され、乾燥処理または乾燥の前およびその途中に化学的およびその他の一般的な試験用に標本化される。データの統計分析が実行され、選択した系統の親系統に対する類似性が確認される。選択した植物体の細胞遺伝子学的分析が随意に実施され、染色体補体および染色体対合関係が確認される。
本明細書で説明した通り、遺伝子の突然変異体対立形質を他の植物体に移入または育種するために、マーカー利用選抜（ＭＡＳ）育種プログラムで、ＤＮＡフィンガープリント法、一塩基変異多型、マイクロサテライトマーカー、または類似した技術を使用することができる。例えば、育種家は、農業経済学的に望ましい遺伝子型を備えた突然変異体対立遺伝子を含む遺伝子型をハイブリッド形成したものから、分離母集団を作成できる。Ｆ２または戻し交雑の植物体は、ゲノム配列またはその断片から発育させたマーカーを使用して、本明細書でリストした技術のどれか一つを使用して、スクリーニングすることができる。突然変異体対立遺伝子を所有しているものとして識別された植物体は、戻し交雑または自家受粉をして、スクリーニング対象の第二の母集団を形成できる。期待される継承パターンまたは使用するＭＡＳ技術に応じて、望ましい個体植物体の識別を助けるために、戻し交雑の各サイクルの前に、選択した植物体を自家受粉することが必要なこともある。戻し交雑またはその他の育種手順は、反復親の望ましい表現型が回復されるまで繰り返すことができる。
育種プログラムにおいて、奏功した交配種は稔性のＦ１植物体を産する。選択したＦ１植物体は、親のうちの一つと交配でき、最初の戻し交雑世代の植物体は自家受粉されて、変異体遺伝子発現（例えば、ヌルバージョンの遺伝子）について再びスクリーニングされる母集団が形成される。戻し交雑、自家受粉、およびスクリーニングの過程が、例えば、少なくとも４回、最終的なスクリーニングによって稔性であり、かつ反復親と合理的に類似した植物体が生成されるまで反復される。希望に応じて、この植物体は自家受粉され、その後で子孫が再びスクリーニングされて、植物体が変異体遺伝子発現を示すことが確認される。一部の実施形態で、Ｆ２世代の植物体母集団は、変異体遺伝子発現についてスクリーニングを受け、例えば、植物体は、標準方法（例えば、ＰＣＲ法）に従い、本明細書で説明したポリヌクレオチド（または本明細書で説明した通りその任意の組み合わせ）についてのヌクレオチド配列情報に基づき、プライマーと共に使用して、遺伝子がないためにポリペプチドを発現しないことが識別される。
混成体品種は、第一の品種の雌性の親株（すなわち、種子親）の自家受粉を阻止して、第二の品種の雄性の親株からの花粉が雌性の親株と受粉できるようにし、Ｆ１混成体種子が雌性の植物体上に形成されるようにすることで生成できる。雌性の植物体の自家受粉は、花の発生の初期段階で花の雄しべを除去することで防止できる。別の方法として、花粉形成は、雄性不稔の形成を使用して、雌性の親株で防止することができる。例えば、雄性不稔は、細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）または遺伝子組み換え雄性不稔により生成でき、ここでは、導入遺伝子が小胞子生成および／または花粉生成、または自家不和合性を阻害する。ＣＭＳを含む雌性の親株は、特に有用である。雌性の親株がＣＭＳである実施形態で、花粉が雄性の稔性植物体から収穫され、手作業でＣＭＳ雌性の親株の柱頭に適用され、結果的なＦ１種子が収穫される。
本明細書で説明した品種および系統は、単交雑Ｆ１混成体を形成するために使用できる。こうした実施形態で、親品種の植物体は、実質的に均質な隣接した母集団として栽培でき、雄性の親株から雌性の親株への自然な他家受粉が促進される。雌性の親株に形成されたＦ１種子は、従来的な手段によって選択的に収穫される。２つの親株品種を大量に栽培して、雌性の親に形成されたＦ１混成体種子と、自家受粉の結果として雄性の親に形成された種子の混合物とを収穫することもできる。別の方法として、三原交雑を行うことができ、ここでは単交雑Ｆ１混成体が雌性の親として使用され、異なる雄性の親と交雑される。また別の方法として、二重交雑混成体を作成でき、ここでは異なる２つの端交雑のＦ１子孫自体の間で交雑される。
突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体の母集団は、望ましい特性または表現型を持つ母集団を構成するものについてスクリーニングまたは選抜をすることができる。例えば、単一の形質転換事象の子孫の母集団は、それによってコードされるポリペプチドの望ましいレベルの発現または活性を持つ植物体についてスクリーニングをすることができる。発現または活性のレベルを特定するために、物理的および生化学的な方法を使用できる。これらには、ポリヌクレオチドの検出のためのサザン分析またはＰＣＲ増幅、ＲＮＡ転写物の検出のためのノーザンブロット、Ｓ１ ＲＮａｓｅ保護、プライマー延長、またはＲＴ−ＰＣＲ増幅、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの酵素またはリボザイム活性を検出するための酵素学的アッセイ、ならびにタンパク質ゲル電気泳動法、ウェスタンブロット、免疫沈降、およびポリペプチドを検出するための酵素連鎖イムノアッセイが含まれる。原位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリッド形成、酵素染色、および免疫染色および酵素アッセイなど、その他のテクニックも、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの存在、または発現、または活性を検出するために使用できる。
一つ以上の組み換え体ポリヌクレオチド、一つ以上のポリヌクレオチド構築物、一つ以上の二本鎖ＲＮＡ、一つ以上の共役体または一つ以上のベクター／発現ベクターを含む、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体細胞および植物体が本明細書で説明されている。
限定はされないが、本明細書で説明した植物体は、発現または活性が本開示に従い調節される前かその後かのいずれかに、他の目的で改変されうる。以下の一つ以上の遺伝的修飾が、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組み換えの植物体内に存在できる。一つの実施形態で、窒素性代謝性の中間体の変換に関与する一つ以上の遺伝子が修飾され、結果的に、乾燥処理時に、対照植物体よりも低いレベルの少なくとも一つのタバコ特異的ニトロソアミンが生成される植物体（葉など）となる。修飾されうる遺伝子の非限定的な例は、本明細書に記載する通り、ニコチンからノルニコチンへの変換に係わるＣＹＰ８２Ｅ４、ＣＹＰ８２Ｅ５、およびＣＹＰ８２Ｅ１０などのアスパラギンシンテターゼをコードする遺伝子を含み、国際公開第２００６０９１１９４号、国際公開第２００８０７０２７４号、国際公開第２００９０６４７７１号、および国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２１０８８号に記載されており、また本明細書に記載される通りである。別の実施形態では、重金属摂取または重金属輸送に関与する一つ以上の遺伝子が修飾され、結果的に、修飾のない対照植物体またはその部分よりも低い重金属含有量を持つ植物体または植物体の部分（葉など）となる。非限定的な例には、多剤耐性に関連するタンパク質ファミリー、陽イオン拡散ファシリテーター（ＣＤＦ）ファミリー、Ｚｒｔ−、Ｉｒｔ様タンパク質（ＺＩＰ）ファミリー、陽イオン交換体（ＣＡＸ）ファミリー、銅トランスポーター（ＣＯＰＴ）ファミリー、重金属Ｐ−ｔｙｐｅ ＡＴＰａｓｅｓファミリー（例えば、ＨＭＡ、ＷＯ２００９０７４３２５号に記載のあるもの）、自然耐性に関連するマクロファージタンパク質（ＮＲＡＭＰ）の相同体ファミリー、およびＡＴＰ−結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターファミリー（例えば、ＭＲＰ、ＷＯ２０１２／０２８３０９号に記載のあるもので、重金属（カドミウムなど）の輸送に係わる）に属する遺伝子が含まれる。本明細書で使用されるとき、重金属という用語は遷移金属を含む。その他の修飾の例には除草剤耐性が含まれ、例えば、グリホサートは、広分野での数多くの除草剤の有効成分である。グリホサート耐性遺伝子組み換えの植物体は、ａｒｏＡ遺伝子（ネズミチフス菌および大腸菌に由来するグリホサートＥＰＳＰ合成酵素）の移入により開発されたものである。スルホニル尿素耐性植物体は、アラビドプシス（シロイヌナズナ）に由来する突然変異体ＡＬＳ（アセト乳酸合成酵素）遺伝子の形質転換により作成されたものである。突然変異体Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｈｙｂｒｉｄｕｓに由来する光化学系ＩＩのＯＢタンパク質が植物体に移入され、アトラジン耐性遺伝子組み換えの植物体が作成され、またブロモキシニル耐性遺伝子組み換えの植物体は、バクテリアＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来するｂｘｎ遺伝子を組み入れることにより作成された。別の模範的な修飾によって、昆虫に対する耐性のある植物体がもたらされる。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ （Ｂｔ）毒素は、Ｂｔ−耐性害虫の発生を遅らせる効果的な方法を提供でき、このことは、最近、ブロッコリで明らかになったが、錐体のｃｒｙ１Ａｃおよびｃｒｙ１ＣＢｔ遺伝子が、どちらかの単一のタンパク質に対する耐性を持つコナガ（ｄｉａｍｏｎｄｂａｃｋ ｍｏｔｈ）を駆除し、かつ耐性昆虫の進化を著しく遅らせた。別の模範的な修飾も、病原体（例えば、ウイルス、バクテリア、菌類）によって生じた疾患に対して抵抗性を持つ植物体をもたらした。Ｘａ２１遺伝子（細菌性胴枯れ病に対する耐性）を発現する植物体と、Ｂｔ融合遺伝子およびキチナーゼ遺伝子（イッテンオオメイガへの耐性および葉鞘への耐性）の両方を発現する植物体が作り出された。別の模範的な修飾によって、生殖能力（雄性不稔など）が変更された。別の模範的な修飾によって、非生物的ストレス（例えば、乾燥、温度、塩分）に対する耐性のある植物体がもたらされ、また耐性の遺伝子組み換え植物体がアラビドプシス（シロイヌナズナ）に由来するアシルグリセロールリン酸塩酵素を移入することにより作り出され、またマンニトールおよびソルビトールの合成に関与するマンニトール脱水素酵素およびソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子が、乾燥への耐性を改善する。その他の模範的な修飾によって、タンパク質および油の貯蔵能力が改善された植物体、光合成効率が高められた植物体、有効期間が延長された植物体、炭水化物含有量が増えた植物体、および菌類への耐性のある植物体、アルカロイドの生合成に関与する酵素をコードする植物体をもたらすことができる。Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）および／またはシスタチオニンγ−合成酵素（ＣＧＳ）の発現が調節された遺伝子組み換えの植物体も意図されている。
一つ以上のこうした形質は、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組み換えの植物体に別の栽培品種から遺伝子移入されうるか、または直接それに形質転換されうる。突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組み換えのたばこ植物体への特性の遺伝子移入は、当業界において公知の任意の植物体育種方法により達成することができるが、これには例えば、系統育種法、戻し交雑、倍化した染色体を半数用いる育種、およびこれに類するものがある（Ｗｅｒｎｓｍａｎ， Ｅ． Ａ， ａｎｄ Ｒｕｆｔｙ， Ｒ． Ｃ． １９８７． Ｃｈａｐｔｅｒ Ｓｅｖｅｎｔｅｅｎ． Ｔｏｂａｃｃｏ． Ｐａｇｅｓ ６６９−６９８ Ｉｎ： Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｃｒｏｐ Ｓｐｅｃｉｅｓ． Ｗ． Ｈ． Ｆｅｈｒ （ｅｄ．）， ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ ７６１ ｐｐ．を参照）。上記で説明した分子生物学ベースの技術、特にＲＦＬＰおよびマイクロサテライトマーカーは、反復親との最高度の遺伝的同一性を持つ子孫を識別するのに戻し交雑で使用できる。これにより、反復親との間に少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％の遺伝的同一性を持つ、なおさらに好ましくは反復親に対して遺伝的に同一で、ドナー親から遺伝子移入された特性をさらに備えた品種の生成が加速されるようになる。こうした遺伝的同一性の決定は、当業界において公知の分子マーカーに基づいてできる。
最後の戻し交雑世代は、移入されつつある核酸に純粋な育種子孫を与えるために自家受粉できる。結果的に得られる植物体は通常、移入された特性（例えば、一つ以上の単一の遺伝子形質）に加えて、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組み換えの植物体の本質的にすべての形態学的特性および生理学的特性を持つ。正確な戻し交雑プロトコルは、適切な試験プロトコルを決定するために変更されつつある特性に依存する。戻し交雑方法は、移入する特性が優性対立遺伝子であるときには簡略化されるが、劣性対立遺伝子もまた移入しうる。この例で、望ましい特性が首尾よく移入されたかどうかを判断するために、子孫の試験を導入する必要があることもある。
様々な実施形態が、突然変異体である植物体、非天然の植物体、または遺伝子組み換えの植物体のほか、ポリヌクレオチド（または本明細書で説明した通りのその任意の組み合わせ）の発現レベルを低減させて、その中のアスパラギン含有量を低減させるバイオマスを提供している。
こうした植物体、具体的にはたばこ植物体の部分は、またさらに具体的にはたばこ植物体の葉身および中央脈は、様々な消費可能製品に組み入れたり、その製造に使用したりでき、これにはエアロゾル形成材料、エアロゾル形成装置、喫煙物品、喫煙可能物品、無煙製品、およびたばこ製品が含まれるが、これに限定されない。エアロゾル形成材料の例には、たばこ組成物、たばこ、たばこ抽出物、刻みたばこ、刻み充填剤、乾燥処理または乾燥済みのたばこ、拡張したたばこ、均質化したたばこ、再構成たばこ、およびパイプたばこが含まれるが、これらに限定されない。喫煙物品および喫煙可能物品は、エアロゾル形成装置の種類である。喫煙物品または喫煙可能物品の例には、紙巻たばこ、シガリロ、および葉巻たばこが含まれるが、これに限定されない。無煙製品の例は、噛みたばこ、および嗅ぎたばこを含む。特定のエアロゾル形成装置では、燃焼（または発火）ではなく、例えば一つ以上の電気発熱体要素または炭素熱源によって、たばこ組成物または別のエアロゾル形成材料が加熱されてエアロゾルを生成する。典型的には、こうした加熱式喫煙物品において、エアロゾルは、熱源の内部、周りまたは下流に位置しうる、物理的に離れたエアロゾル形成基体または材料への熱源からの熱伝達によって生成される。喫煙中、揮発性化合物は、熱源からの熱伝達によってエアロゾル形成基体から放出され、喫煙物品を介して引き出される空気中に一緒に運ばれる。放出された化合物が冷えるにつれて、これらは、凝縮してユーザーによって吸入されるエアロゾルを形成する。こうした装置として、例えば、電気加熱式エアロゾル発生装置が挙げられ、該装置では，このエアロゾル発生装置から加熱式喫煙物品のエアロゾル形成基体への熱伝達によってエアロゾルを発生させる。好適には、エアロゾル形成基体の加熱中には、たばこの燃焼も発火も生じない。適切なエアロゾル形成物品は、国際公開第２０１３／０９８４０５号に記載されており、エアロゾル発生装置の内部発熱体によって加熱したときに、吸入可能なエアロゾルを発生させるためのエアロゾル形成基体を含んでいる。エアロゾル形成物品は、内部発熱体を備えた電気加熱式エアロゾル発生装置を含みうる。エアロゾル発生物品は、直線的かつ連続的に配置され、エアロゾル形成基体と、エアロゾル形成基体のすぐ下流に位置する支持要素と、支持要素の下流に位置するエアロゾル冷却要素と、該エアロゾル形成基体、該支持要素、および該エアロゾル冷却要素を囲む外側ラッパーとをさらに含みうる。支持要素は、エアロゾル形成基体に隣接しうる。エアロゾル形成基体は、エアロゾル発生装置の発熱体により貫通されうる。
本明細書で使用されるとき、「燃焼」という用語は、反応分子（すなわち、燃料および酸化剤）が、混合および再構成して、熱の同時放出を伴って生成物分子となる酸化還元化学反応を意味する。ガス状生成物中の窒素酸化物であって、元の反応基体に存する硝酸塩の分解から形成されたものではない窒素酸化物の妥当な量の存在により、また同時的な全発熱過程の確たる証拠により、燃焼されたことが示されうる。燃焼としてガス状生成物中に窒素酸化物の妥当な量が放出されたかどうかは、対象の条件（例えば、空気中）で形成される窒素酸化物の全量と、同一条件ではあるが酸素のない状態（例えば、純窒素または純ヘリウム雰囲気中）で形成される窒素酸化物の全量とを比較することによって判定することができる。別のタイプのエアロゾル形成装置では、エアロゾルは、可燃性燃料要素または熱源から、熱源の内部、周囲、または下流に位置しうる物理的に分離されたエアロゾル形成材料に熱を移動することにより生成される。無煙のたばこ製品および様々なたばこ含有エアロゾル形成材料は、薄片、フィルム、タブ、発泡体、またはビーズなど任意の形式の他の成分に蒸着したか、それに混合したか、それによって囲んだか、またはそれと組み合わせた、乾燥済みの粒子、断片、顆粒、粉末、またはスラリーを含めた任意の形態のたばこを含みうる。本明細書で使用されるとき、「煙」という用語は、可燃性紙巻たばこなどの喫煙物品によって、またはエアロゾル形成材料を燃焼することによって生成されるエアロゾルの一タイプを描写するために使用される。
特定の実施形態では、植物材料を燃焼または発火させることなく加熱することが好ましい。
一つの実施形態で、本明細書で説明した突然変異体、遺伝子組み換え、および非天然のたばこ植物体に由来する乾燥処理済み植物材料も提供されている。たばこ緑葉を乾燥処理する工程は、当業者にとって公知であり、空気乾燥処理、火力乾燥処理、熱風送管乾燥処理、および日光乾燥処理が含まれるがこれらに限定されない。たばこ緑葉を乾燥処理する工程は、収穫されたたばこの種類に依存する。例えば、バーレーおよびある種のダークストレインは通常空気乾燥処理され、パイプたばこ、噛みたばこ、および嗅ぎたばこは通常火力乾燥処理される。
別の実施形態で、本明細書で説明した突然変異体である植物体、遺伝子組み換えの植物体、および非天然の植物体に由来する乾燥済みの植物材料も提供されている。葉を乾燥する工程は、当業者に既知であり、空気乾燥処理と日光乾燥処理とが含まれるがこれらに限定されない。葉を乾燥する厳密な工程は、収穫した植物体のタイプによって決まる。好適には、植物材料は、収穫の後に乾燥される。従って、乾燥済みの材料および収穫後の乾燥済みの材料の使用が、本明細書で意図される。乾燥工程は、一つ以上の老化関連遺伝子を活性化しうる。本明細書で説明した遺伝子およびタンパク質の活性の発現は、乾燥処理または乾燥中にモニターされうる。同様に、アスパラギン、ニコチン、グルタミン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸のレベルは、乾燥処理または乾燥中にモニターされうる。一例として、測定は、乾燥処理または乾燥の０時間、１０時間、２０時間、３０時間、４０時間、５０時間、６０時間、７０時間、８０時間、９０時間、または１００時間後に行われうる。さらなる一例として、測定は、０日、１日、２日、３日、４日、５日、もしくは１０日後、またはそれ以上の後に行われうる。
別の実施形態で、たばこ含有エアロゾル形成材料を含むたばこ製品は、本明細書で説明した突然変異体であるたばこ植物体、遺伝子組み換えのたばこ植物体、または非天然のたばこ植物体に由来する植物材料（葉、好ましくは乾燥処理または乾燥済みの葉など）を含むものとして描写されている。本明細書で説明したたばこ製品は、ブレンドしたたばこ製品とすることができ、未変性のたばこをさらに備えうる。
乾燥処理または乾燥（例えば、３日の乾燥処理または乾燥）後の、本明細書で説明した植物体、植物体の部分、植物材料、植物産物、またはたばこ製品におけるアスパラギン量は、対照植物体と比較して、約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および１００％少ない（約２００％または３００％少ないなど）。好適には、乾燥処理または乾燥（例えば、３日の乾燥処理または乾燥）後の、本明細書で説明した植物体、植物体の部分、植物材料、植物産物、またはたばこ製品におけるアスパラギン量は、対照と比較して、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および１００％少なく（約２００％または３００％少ないなど）、より好適には、対照と比較して、少なくとも約８０％少なく、または少なくとも約９０％少ない。
乾燥処理または乾燥（例えば、３日の乾燥処理または乾燥）後の、本明細書で説明した植物体、植物体の部分、植物材料、植物産物、またはたばこ製品における、アスパラギン量は、１ｇの葉の乾燥重量あたり約４０ｍｇ以下、より好適には１ｇの葉の乾燥重量あたり約３５ｍｇ以下、より好適には１ｇの葉の乾燥重量あたり約３０ｍｇ以下、より好適には１ｇの葉の乾燥重量あたり約２５ｍｇ以下、より好適には１ｇの葉の乾燥重量あたり約２０ｍｇ以下、より好適には１ｇの葉の乾燥重量あたり約１５ｍｇ以下、より好適には１ｇの葉の乾燥重量あたり約１２ｍｇ乾燥重量、より好適には１ｇの葉の乾燥重量あたり約１０ｍｇ以下、またはより好適には１ｇの葉の乾燥重量あたり約５ｍｇ以下である。好適には、葉は、植物体の下中間部の茎位置から収穫される。
乾燥処理または乾燥後の植物体、植物体の部分、植物材料、植物産物、またはたばこ製品に由来するエアロゾルにおける、加熱によって得られたアクリルアミド量は、対照と比較して、少なくとも約７０％少ない。一例として、乾燥処理または乾燥後のたばこ製品に由来するエアロゾルにおける、加熱によって得られたアクリルアミド量は、一本の紙巻たばこあたり約１．５μｇである。
乾燥処理または乾燥後の植物体、植物体の部分、植物材料、植物産物、またはたばこ製品に由来するエアロゾルにおける、燃焼によって得られたアクリルアミド量は、対照と比較して、少なくとも約５５％少ない。一例として、乾燥処理または乾燥後のたばこ製品に由来するエアロゾルにおける、燃焼によって得られたアクリルアミド量は、一本の紙巻たばこあたり約２．５μｇである。
乾燥処理または乾燥後の植物体、植物体の部分、植物材料、植物産物、またはたばこ製品に由来するエアロゾルにおける、燃焼または加熱によって得られたアクリルアミド量は、対照と比較して、少なくとも約５５％〜約７０％少ない。一例として、乾燥処理または乾燥後のたばこ製品に由来するエアロゾルにおける、燃焼または加熱によって得られたアクリルアミド量は、一本の紙巻たばこあたり約１．５μｇ〜約２．５μｇである。
植物体、植物体の部分、植物材料、植物産物、たばこ製品、またはエアロゾルにおけるニコチン量は、対照植物体由来の植物体、植物体の部分、植物材料、喫煙可能物品、無煙製品、およびエアロゾルからのニコチン量と実質的に同じでありうる。例えば、ニコチンの量は、対照植物体内に存在するニコチン量の約２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％以下の範囲内でありうる。好適には、ニコチンの量は、対照植物体内に存在するニコチン量の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％以下の範囲内である。ニコチンの量は、１ｇの葉の乾燥重量バイオマスあたり約１５ｍｇ〜２０ｍｇであるのが典型的である。
一実施形態では、乾燥処理後の植物体、植物体の部分、植物材料、植物産物、またはたばこ製品（例えば、乾燥処理済みキャストリーフ）におけるアスパラギンの量は、対照よりも少なくとも約２０％少なく（例えば少なくとも約２２％少なく）、乾燥処理後の植物体、植物体の部分、植物材料、植物産物、またはたばこ製品（例えば、乾燥処理済みキャストリーフ）由来のエアロゾルにおけるアクリルアミドの量は、対照よりも少なくとも約２５％少ない（例えば、少なくとも約２４％以下である）。別の実施形態では、乾燥処理後の植物体、植物体の部分、植物材料、植物産物、またはたばこ製品（例えば、乾燥処理済みキャストリーフ）におけるアスパラギンの量は、１ｇの乾燥重量あたり約１２ ｍｇ以下であり、乾燥処理後の植物体、植物体の部分、植物材料、植物産物、またはたばこ製品（例えば、乾燥処理済みキャストリーフ）由来のエアロゾルにおけるアクリルアミドの量は、一本の紙巻たばこあたり約２．５μｇ以下である。好適には、ニコチンのレベルは、対照におけるニコチンのレベルと実質的に同じである。
別の実施形態では、乾燥処理後の植物体、植物体の部分、植物材料、植物産物、またはたばこ製品（例えば、乾燥処理済みキャストリーフ）におけるアスパラギンの量は、対照よりも少なくとも約７０％少なく（例えば少なくとも約６６％少なく）、乾燥処理後の植物体、植物体の部分、植物材料、植物産物、またはたばこ製品由来のエアロゾルにおけるアクリルアミドの量は、対照よりも少なくとも約４５％少ない（例えば、少なくとも約４４％少ない）。別の実施形態では、乾燥処理後の植物体、植物体の部分、植物材料、植物産物、またはたばこ製品（例えば、乾燥処理済みキャストリーフ）におけるアスパラギンの量は、１ｇの乾燥重量あたり約１２ｍｇ以下であり、乾燥処理後の植物体、植物体の部分、植物材料、植物産物、またはたばこ製品由来のエアロゾルにおけるアクリルアミドの量は、一本の紙巻たばこあたり約３μｇ以下である。好適には、ニコチンのレベルは、対照におけるニコチンのレベルと実質的に同じである。
別の実施形態では、乾燥処理後の植物体、植物体の部分、植物材料、植物産物、またはたばこ製品（例えば、乾燥処理済みキャストリーフ）におけるアスパラギンの量は、対照よりも少なくとも約９０％少なく（例えば少なくとも約８８％以下）、乾燥処理後の植物体、植物体の部分、植物材料、植物産物、またはたばこ製品由来のエアロゾルにおけるアクリルアミドの量は、対照よりも少なくとも約７０％少ない。別の実施形態では、乾燥処理後の植物体、植物体の部分、植物材料、植物産物、またはたばこ製品（例えば、乾燥処理済みキャストリーフ）におけるアスパラギンの量は、１ｇの乾燥重量あたり約５ｍｇ以下であり、乾燥処理後の植物体、植物体の部分、植物材料、植物産物、またはたばこ製品由来のエアロゾルにおけるアクリルアミドの量は、一本の紙巻たばこあたり約１．５μｇ以下である。好適には、ニコチンのレベルは、対照におけるニコチンのレベルと実質的に同じである。
別の実施形態では、ＲＮＡｉを介したＮｔＡＳＮ１の発現の調節により：（ｉ）乾燥処理または乾燥後の植物体、植物体の部分、植物材料、植物産物、またはたばこ製品（例えば、乾燥処理済みキャストリーフ）におけるアスパラギンの量が、２４％〜約８９％（例えば約５ｍｇ／ｇ〜約３５ｍｇ／ｇに）減少し；（ｉｉ）ニコチンのレベルが、対照植物体に存在するニコチンの量（例えば、１ｇの葉の乾燥重量バイオマスあたり約１５ｍｇおよび２０ｍｇ）の約２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％以下に維持され；（ｉｉｉ）エアロゾルにおけるアクリルアミドのレベルが、少なくとも約７０％から一本の紙巻たばこあたり１．５ ３μｇ以下まで低減されうる。葉のバイオマス量は、約３００ｇ〜４００ｇであるのが一般的である。
別の実施形態では、ＲＮＡｉを介したＮｔＡＳＮ５の発現の調節により：（ｉ）乾燥処理または乾燥後の植物体、植物体の部分、植物材料、植物産物、またはたばこ製品（例えば、乾燥処理済みキャストリーフ）におけるアスパラギンの量が、約３５％〜約６６％（例えば約１８ｍｇ／ｇ〜約３１ｍｇ／ｇに）減少し；（ｉｉ）ニコチンのレベルが、対照植物体に存在するニコチンの量（例えば、１ｇの葉の乾燥重量バイオマスあたり約１５ｍｇおよび２０ｍｇ）の約２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％以下に維持され；（ｉｉｉ）エアロゾルにおけるアクリルアミドのレベルが、少なくとも約４４％から一本の紙巻たばこあたり３μｇ以下まで低減されうる。葉のバイオマス量は、約３００ｇ〜４００ｇであるのが一般的である。
別の実施形態では、突然変異誘発を介したＮｔＡＳＮ１の発現の調節により：（ｉ）乾燥処理または乾燥後の植物体、植物体の部分、植物材料、植物産物、またはたばこ製品（例えば、乾燥処理済みキャストリーフ）におけるアスパラギンの量が、１７％〜約８３％（例えば約４．７ｍｇ／ｇ〜約１９．４ｍｇ／ｇに）減少し；（ｉｉｉ）エアロゾルにおけるアクリルアミドのレベルが、少なくとも約２４％から一本の紙巻たばこあたり２．５μｇ以下まで低減されうる。
別の実施形態では、突然変異誘発を介したＮｔＡＳＮ５の発現の調節により、乾燥処理または乾燥後の植物体、植物体の部分、植物材料、植物産物、またはたばこ製品（例えば、乾燥処理済みキャストリーフ）におけるアスパラギンの量が、約４４％（例えば約１４．５ ｍｇ／ｇに）減少しうる。突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組み換えの植物体は、例えば農業において、他の用途を持ちうる。例えば、本明細書で説明した突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組み換えの植物体は、動物の飼料およびヒトの食品を製造するために使用できる。
本開示はまた、本明細書で説明した突然変異体である植物体、非天然の植物体、または遺伝子組み換えの植物体の栽培、および栽培植物体からの種子の収集を含めた、種子を生産する方法を提供する。本明細書で説明した植物体からの種子は、当業界において公知の手段によって調整され、包装材料内に袋詰めして、製造物品を形成できる。紙および布などの包装材料は、当業界で周知である。種子のパッケージは、標識、例えば、包装材料に固定されたタグまたは標識、その中に入っている種子の性質を描写するパッケージに印刷された標識などを持つことができる。
識別、選択、または育種のために植物体の遺伝子型判別をするための組成、方法およびキットは、ポリヌクレオチドの試料中のポリヌクレオチド（または本明細書で説明した通りその任意の組み合わせ）の存在を検出する手段を含むことができる。従って、組成は、増幅または検出を行うための一つ以上のポリヌクレオチド、および随意に一つ以上のプローブ、および随意に一つ以上の試薬の少なくとも一部分を特異的に増幅するための一つ以上のプライマーを含むものとして描写されている。
従って、本明細書で説明したポリヌクレオチドに対応する約１０個以上連続するポリヌクレオチドを含む、遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブが開示されている。該プライマーまたはプローブは、本明細書で説明したポリヌクレオチドにハイブリッド形成（例えば、特異的にハイブリッド形成）する約１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、４５個または５０個超の連続するポリヌクレオチドを含むか、またはそれから成りうる。一部の実施形態で、プライマーまたはプローブは、配列に依存した遺伝子識別の方法（例えば、サザンハイブリッド形成）または単離（例えば、細菌性コロニーまたはバクテリオファージプラークのｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成）または遺伝子検出（例えば、核酸の増幅または検出での一つ以上の増幅プライマーとして）において使用しうる、約１０〜５０個の連続するヌクレオチド、約１０〜４０個の連続するヌクレオチド、約１０〜３０個の連続するヌクレオチドまたは約１５〜３０個の連続するヌクレオチドを含むか、またはそれによって構成される。一つ以上の特定のプライマーまたはプローブは、一部分または全部のポリヌクレオチドを増幅または検出するために設計して使用することができる。特定の例として、ポリメラーゼ連鎖反応プロトコルで核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）をコードする核酸断片を増幅するために２つのプライマーを使用しうる。ポリメラーゼ連鎖反応は、核酸配列に由来する一つのプライマーと、その核酸配列の上流または下流の配列（プロモーター配列、ｍＲＮＡ前駆体の３’端またはベクターに由来する配列など）にハイブリッド形成する第二のプライマーとを使用しても実施しうる。ポリヌクレオチドの生体外増幅に有用な温度および等温テクニックの例は、当業界で周知である。試料は、植物体、植物体細胞または植物材料、または本明細書で説明した植物体、植物体細胞または植物材料から製造されたか、もしくはそれに由来するたばこ製品としうるか、またはそれらに由来するものとしうる。
さらなる態様において、試料中の本明細書に説明されているポリヌクレオチド（または、本明細書に説明されているようにその任意の組み合わせ）を検出する方法も提供され、この方法は、（ａ）ポリヌクレオチドを含むか、またはそれを含むとみられている試料を提供する工程と、（ｂ）ポリヌクレオチドの少なくとも一部分を特異的に検出するために、前述の試料を一つ以上のプライマーまたは一つ以上のプローブと接触させる工程と、（ｃ）増幅生成物の存在を検出する工程とを含み、ここで、増幅生成物の存在は、試料中のポリヌクレオチドの存在を示すものである。さらなる態様で、ポリヌクレオチドの少なくとも一部分を特異的に検出するための一つ以上のプライマーまたはプローブの用途も提供されている。ポリヌクレオチドの少なくとも一部分を検出するためのキットも提供されており、これは、ポリヌクレオチドの少なくとも一部分を特異的に検出するための一つ以上のプライマーまたはプローブを備える。キットは、ポリヌクレオチド増幅（ＰＣＲなど）のための試薬、またはプローブハイブリッド形成−検出技術（サザンブロット、ノーザンブロット、ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリッド形成、またはマイクロアレイなど）のための試薬を備えうる。キットは、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＳＥＬＤＩ質量分析法または試験片などの抗体結合検出技術のための試薬を備えうる。キットは、ＤＮＡ配列決定のための試薬を備えうる。キットは、植物材料、乾燥処理もしくは乾燥済み植物材料、または乾燥処理もしくは乾燥済みの葉中の、少なくともアスパラギン含有量、および／またはアクリルアミドエアロゾル含有量の算出のための試薬および説明書を備えうる。
一部の実施形態で、キットは、説明した一つ以上の方法についての説明書を備えうる。説明したキットは、遺伝的同一性の決定、系統学的研究、遺伝子型判別、ハプロタイプ、系図分析または植物体育種用に、特に共優性評価で有用なものでありうる。
本開示は、本明細書で説明したポリヌクレオチドを含む植物体、植物体細胞、または植物材料の遺伝子型判別をする方法も提供する。遺伝子型判別は、染色体対の相同体を区別する手段を提供するもので、植物体母集団内の分離個体を差別化するために使用できる。分子マーカー法は、系統学的研究、作物品種間の遺伝的関係の特徴付け、交雑種または体細胞混成体の識別、単一遺伝形質に影響する染色体のセグメントの局所化、マップベースのクローン化、および定量的継承の研究のために使用できる。遺伝子型判別の具体的な方法では、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）を含む、任意の数の分子マーカー分析テクニックを採用しうる。ＡＦＬＰは、ヌクレオチド配列の可変性に起因する増幅断片間の対立形質の差異によるものである。こうして、本開示はさらに、一つ以上の遺伝子または核酸の分離や、これらの遺伝子または核酸に遺伝的に関連した染色体の配列を、ＡＦＬＰ分析などの技術を使用して追跡する手段を提供する。
一つの実施形態で、本明細書で説明した突然変異体である植物体、遺伝子組み換えの植物体、および非天然の植物体に由来する乾燥処理または乾燥済みの植物材料も提供されている。例えば、たばこ葉を乾燥処理または乾燥する工程は、当業者にとって公知であり、空気乾燥処理、火力乾燥処理、熱風送管乾燥処理および日光乾燥処理を含むがこれらに限定はされない。たばこ緑葉を乾燥処理する工程は、本明細書で説明したように、収穫されたたばこの種類に依存する。
別の実施形態で、本明細書で説明した、または本明細書に記載した方法で製造された、突然変異体である植物体、遺伝子組み換えの植物体、および非天然の植物体に由来する植物材料（葉などであって、乾燥処理または乾燥済みの葉などの乾燥処理済み植物材料であることが適切である）を含むたばこ製品を含めた、たばこ製品が説明されている。本明細書で説明したたばこ製品は、未変性のたばこをさらに備えうる。
別の実施形態で、たばこ製品は、本明細書に記載した突然変異体である植物体、遺伝子組み換えの植物体、および非天然の植物体に由来する植物材料（乾燥処理または乾燥済みの葉などの葉であることが好ましい）を含むものとして描写されている。例えば、植物材料をたばこ製品の内部または外部に加えて、燃焼時に望ましい芳香を放出させうる。この実施形態によるたばこ製品は、さらには未変性のたばこまたは変性たばこともしうる。この実施形態によるたばこ製品は、さらには、本明細書で開示された遺伝子以外の一つ以上の遺伝子に修飾がある、突然変異体、遺伝子組み換え、または非天然の植物体に由来するものとしうる。
本発明について、下記の例でさらに説明するが、これらの例では発明をさらに詳細に説明している。これらの例は、本発明を実施するために現時点で意図されている好ましい様式を規定したもので、本発明を例証するものであって、限定するものではない。
実施例１−乾燥処理済みのたばこ葉におけるアスパラギンの合成
たばこ葉、特にバーレー栽培品種の葉を乾燥処理する間に、アスパラギンが活発に生成され、乾燥処理済みの葉に存在する全アミノ酸の約５０％を占めるようになる。図１では、同一の圃場および処理室で並行して栽培および空気乾燥処理された３種のバーレーたばこ栽培品種の乾燥処理済みの葉に、アスパラギンおよび全遊離アミノ酸の増加が示されているが、これは、主としてアスパラギンが増加したためである。驚くべきことに、アスパラギンは、乾燥処理中に著しく蓄積される唯一のアミノ酸である。アスパラギンが初期の乾燥処理段階で合成されることを考慮すると、その反応は、グルタミンとアスパラギン酸とを基質として用いるアスパラギンシンテターゼ活性に依存する。一方、図１では、ＡｓｐおよびＧｌｎは、アスパラギンと比較してわずかな増加のみを示し、従って、ＧｌｎとＡｓｐのプールは、長期にわたる空気乾燥処理工程（２か月超）の間では変動する可能性があることが示唆される。グルタミン酸のプールの変動は観察されなかった（データ非表示）。
図２は、Ｇｌｎが乾燥処理の最初の４日間（９６時間）の間に増加した後、アスパラギンの蓄積が開始すると減少することを示している。対照的に、アスパラギン酸のプールは、多少のゆらぎが観察されうるものの、ほとんど変化がないままである。いかなる特定の理論に束縛されることも望まないが、観察されたグルタミンのプールは、乾燥処理の最初の４〜５日間の間にアスパラギンシンテターゼの基質として機能して、アスパラギンを生成すると考えられる（図３を参照）。
上述したように、乾燥処理中に見られるアスパラギンの蓄積は、老化誘導アスパラギンシンテターゼの特異的活性の結果であると考えられる。アスパラギンおよび還元糖は、一端加熱または燃焼すると、メイラード反応を介してエアロゾル中にアクリルアミドを発生させる可能性がある。乾燥処理済みのたばこ葉またはたばこブレンドに蓄積されたアスパラギンと、エアロゾル中で測定されるアクリルアミドとの間には良好な相関がある（図４を参照）。いかなる特定の理論に束縛されることも望まないが、このことは、エアロゾル中のアクリルアミドの増加が、アスパラギンの存在に強く依存していることを示唆するものである。さらに、図５に示すように、葉組織内のアスパラギンの存在は、使用された乾燥処理プロセスとも関連している。
実施例２−たばこにおけるアスパラギンシンテターゼ遺伝子
六つの完全長アスパラギンシンテターゼ遺伝子がたばこにおいて特定され、ＮｔＡＳＮ１−Ｓ、ＮｔＡＳＮ１−Ｔ、ＮｔＡＳＮ３−Ｓ、ＮｔＡＳＮ３−Ｔ、ＮｔＡＳＮ５−Ｓ、およびＮｔＡＳＮ５−Ｔと称される。興味深いことに、アラビドプシスは、アスパラギンシンテターゼに関連する三つの遺伝子ＡｔＡＳＮ１、ＡｔＡＳＮ２、およびＡｔＡＳＮ３を有し、トマトは、二つの完全長遺伝子（Ｓｏｌｙｃ０６ｇ００７１８０およびＳｏｌｙｃ０４ｇ０５５２００）のみを有する。たばこゲノムから抽出されたゲノム配列由来の推定タンパク質配列を用いた系統学的分析によると（Ｓｉｅｒｒｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）、進化の中で、アスパラギンシンテターゼの二つの群が分岐したことが示唆されている（図６を参照）。実際、Ｓｏｌｙｃ０４ｇ０５５２００、ＡｔＡＳＮ２、およびＡｔＡＳＮ３を含む一方の群は、ＮｔＡＳＮ３−ＳとＮｔＡＳＮ３−Ｔとに類似している。この群に属するＡｔＡＳＮ２の遺伝子産物は、師部に局在しており、緑色組織における窒素同化、分配、および再移動に必須であると考えられている（Ｇａｕｆｉｃｈｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１３ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｆｅｂ；３６（２）：３２８−４２．）。この群は、クラスＩＩの双子葉植物下位クラスに属する。Ｓｏｌｙｃ０６ｇ００７１８０、ＡｔＡＳＮ１、ＮｔＡＳＮ１−Ｓ、ＮｔＡＳＮ１−Ｔ、ＮｔＡＳＮ５−Ｓ、およびＮｔＡＳＮ５−Ｔを含む第二の群は、クラスＩの双子葉植物下位クラスに属する（Ｇａｕｆｉｃｈｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１０ Ａｎｎ Ｂｏｔ． ２０１０ Ｊｕｎ；１０５（７）：１１４１−５７．）。ＡｔＡＳＮ１の過剰発現が、花および発育中の長角果におけるアスパラギン含有量の増加と、種子タンパク質含有量の上昇とを招き、その結果として、アスパラギンのその源からシンク組織への移動が促進されることの証拠となっている。このことは、ＡｔＡＳＮ１の群が、窒素源の種子への移行に一層当てられて、適切な種子の発芽と、実生の窒素制限基質への高い耐性とを可能にすることを示唆する（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．， ２００３ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２００３ Ｊｕｎ；１３２（２）：９２６−３５）。
遺伝子産物間の同一性のパーセント値により、ＮｔＡＳＮ３−ＳとＮｔＡＳＮ３−Ｔとは同一であり、Ｓｏｌｙｃ０４ｇ０５５２００とＡｔＡＳＮ３とに極めて類似性が高い（８５％の同一性）ことが明らかになったが、これによって、この遺伝子クラスターは、進化の中で相対的によく保存されて、栄養組織における窒素同化を維持した可能性が高いことが示唆される（上記参照）。興味深いことに、Ｎ．シルヴェストリス（Ｎ． ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）およびＮ．トメトシフォルミス（Ｎ． ｔｏｍｅｍｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ）それぞれのＮｔＡＳＮ１−Ｓ／ＮｔＡＳＮ１−ＴおよびＮｔＡＳＮ５−Ｓ／ＮｔＡＳＮ５−Ｔの推定タンパク質のコピーは、双方９８％に近い高い同一性のパーセント値を共有している。これは、ＡＳＮ１とＡＳＮ５のコピー双方の遺伝子機能が、各たばこ祖先間で保存されている可能性が高く、トマトやアラビドプシスで見出されたように単一の共通祖先に由来する可能性が高いことを示唆する。さらに、ＮｔＡＳＮ５−Ｓは、同様の機能を示すと考えられるＳｏｌｙｃ０６ｇ００７１８０と９５％の同一性を共有する。
アスパラギンがバーレーたばこの空気乾燥処理工程の間に急速に増加することがわかっているので、乾燥処理の初期段階におけるアスパラギンの生成（図１および図２を参照）は、タンパク質またはポリペプチドのタンパク質分解に直接起因するのではなく、乾燥処理中の新規な（ｄｅｎｏｖｏ）合成に起因しうる。その場合、上述したように、アスパラギン合成は、活性アスパラギンシンテターゼにのみ由来しうる。
乾燥処理の間のアスパラギンシンテターゼ遺伝子の発現を測定するために、Ｔｏｂａｒｒａｙ Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップを用いたマイクロアレイ分析（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ． ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２０１２， １３：６７４）から収集されたデータを解析する。葉のＲＮＡを、乾燥処理の最初の９６時間の間、経時的に単離する。六つのＡＳＮコード配列（ＡＳＮ１−Ｔに対してはＮｔＰＭＩａ１ｇ４７３７５ｅ１＿ｓｔ、ＡＳＮ１−Ｓに対してはＮｔＰＭＩａ１ｇ３１３９５ｅ１＿ｓｔ、ＡＳＮ５−Ｔに対してはＮｔＰＭＩａ１ｇ２５２５５ｅ１＿ｓｔ、ＡＳＮ５−Ｓに対してはＮｔＰＭＩａ１ｇ５７３３７ｅ１＿ｓｔ、ＡＳＮ３−Ｔに対してはＮｔＰＭＩａ１ｇ１５２３４８ｅ１＿ｓｔ、およびＡＳＮ３−Ｓに対してはＮｔＰＭＩａ１ｇ１２１５８２ｅ１＿ｓｔ）とマッチングする特異的プローブ（１００％同一性）を特定する。ＲＮＡの調製のため、葉をＳｔｅｌｌａ（スイスバーレー）の中間部の茎位置で圃場にて直接収集し（約４時間）、時間０を、その葉が空気乾燥処理室に吊された時とする。ＡＳＮ３−ＳおよびＡＳＮ３−Ｔは、空気乾燥処理中、バーレー葉内でわずかに発現されたのみである。対照的に、ＡＳＮ１−Ｓ、ＡＳＮ１−Ｔ、およびＡＳＮ５−Ｓは、乾燥処理の初期（老化、黄変段階）に高発現する一方で、ＡＳＮ５−Ｔは、収穫直後のみ発現上昇した後、乾燥処理の初期９６時間の間中減り続ける（図７）。
マイクロアレイ分析において、高い配列相同性を共有する遺伝子に特に見られうる交差ハイブリッド形成を調査するために、ＡＳＮ１−Ｓ／ＴおよびＡＳＮ５−Ｓ／Ｔの発現をＲＮＡｓｅｑ技術を用いて分析する。そのデータを図８に示す。スイスバーレー「Ｓｔｅｌｌａ」（図８Ａ）において、ＡＳＮ５−Ｔは、乾燥処理の間、他の三つのＡＳＮ１／５コピーよりも誘導されず（図７を参照）、ＡＳＮ１−Ｔは、初期の空気乾燥２日後、最も高発現した遺伝子であるということが、ＲＮＡ−ｓｅｑデータから確認された。こうしたＡＳＮ遺伝子活性は、伝統的な方法でオーブンで乾燥処理したスイスブライトバージニア「ＩＴＢ ６８３」においては、同様の強度を伴って生じることはない。かかるたばこでは、ＡＳＮ１−Ｓ／ＴおよびＡＳＮ５−Ｓ／Ｔの発現は、４８時間の乾燥処理後も低いままである。この両方のたばこにおいて、ＡＳＮ３Ｓ／Ｔの発現は乾燥処理によって誘導されず（図８ＣおよびＤ）、従って、これは図７に示したＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのデータを裏付けるものである。
バーレー乾燥処理の初期段階の間におけるＡＳＮ遺伝子誘導のロバスト性を評価するために、スイス圃場で同時期（２０１３年）に栽培された４種の異なるバーレー登録品種（ＢＵ１−４：Ｓａｐｌａｃｋ、ＢａｎｋｅｔＡ１、Ｓｔｅｌｌａ、およびＴＮ９０）から、処理室での６０時間乾燥処理前と処理後に葉のＲＮＡを単離する。ＲＮＡを単離する時点が６０時間まで延長されたのは、スイスではＴＮ９０が黄変し始めるのに時間がかかるためである。発現データ（図９Ａ）には、すべてのバーレー葉において、ＡＳＮ１−ＴおよびＡＳＮ５−Ｔが、空気乾燥処理の間、それぞれ最も高発現および最も低発現のＡＳＮ遺伝子である（ＢＵ２におけるＡＳＮ１−Ｔを除く）ことが先と同様に示されており、従って、これは図８に示したデータを裏付けるものである。転写物ＡＳＮ１−ＳおよびＡＳＮ５−Ｓは、異なるバーレー登録品種の葉において、乾燥処理の初期段階の間に連続して堅調に発現される。図９Ｂには、Ｎ．トメトシフォルミス（Ｎ． ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ）とＮ．シルヴェストリス（Ｎ． ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）とに由来する二つのＡＳＮ３コピーの両方が、乾燥処理の間に誘導されず、それにより、ＡｔＡＳＮ２に類似したこれらの二つのコピーは（図６を参照）、栄養植物体の組織にアスパラギンの生理学的プールを維持するためのより基本的な機能を有する可能性が高いことが間接的に確認される。
開花段階であり、かつ圃場で栽培されたＴＮ９０植物体から採取された８つの組織における対応する転写物の分析により、ＡＳＮ５−Ｔが、葉よりも花においてより活性が高く、ＡＳＮ５−ＴＲＮＡコピーが、未成熟花、花弁、および咢片で特に見られることが示唆されている（図１０、左パネル参照）。ＡＳＮ１−ＴおよびＡＳＮ１−Ｓは、葉において発現するのに加えて、花弁においても高発現して、硝酸塩を同化させる可能性があるが、これはオーソロガス遺伝子ＡｔＡＳＮ１（図６を参照）に関してアラビドプシスで既に説明された作用のことである（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．， ２００３ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２００３ Ｊｕｎ；１３２（２）：９２６−３５）。ＡＳＮ３−Ｓ／Ｔは、これらの８つの組織のすべてにおいて低い基礎発現を有する（図１０、右パネル）。
実施例３−ＡＳＮ１およびＡＳＮ５のＲＮＡｉ ＴＮ９０ｅ３系統
バーレーたばこ植物体におけるＡＳＮ１−Ｓ／ＡＳＮ１−ＴコピーおよびＡＳＮ５−Ｓ／ＡＳＮ５−Ｔコピーのサイレンシングを調べて、それが乾燥処理済みバーレー葉におけるアスパラギン低減に寄与するかを判定する。特定のＤＮＡ断片を、強力な構成的ＭＭＶ（ミラビリスモザイクウイルス）プロモーターまたは老化プロモーターＥ４（アスパラギンシンテターゼ）の間にクローニングする。ＡＳＮ遺伝子断片は、ＭＭＶまたはＥ４と、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのノパリン合成酵素遺伝子の３’ＮＯＳターミネータ配列との間に隣接する（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００３ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｐｌａｎｔ， ３９ ５９５ ６０４）。この研究で使用した構築物の略図を図２２に示す。バーレーたばこ系統ＴＮ９０ｅ４ｅ５ｅ１０（Ｚｙｖｅｒｔ）を、標準アグロバクテリウム媒介形質転換プロトコルを使用して、五つの各構築物で個別に形質転換する。ＴＮ９０ｅ４ｅ５ｅ１０（Ｚｙｖｅｒｔ）は、ノルニコチン生成を抑制するために、たばこの主要アスパラギンシンテターゼ遺伝子であるＣＹＰ８２Ｅ４、ＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２、およびＣＹＰ８２Ｅ１０（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０）においてノックアウト変異を含む、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）変異誘発させたバーレー集団からの選抜を表す。こうしたバックグラウンド系統を用いることで、今後得られるＴＳＮＡデータを解釈する際に、複雑化の可能性を回避することができる。
それぞれの導入遺伝子を高レベルで発現する植物体の選別を可能にするために、各構築物に対して少なくとも１０個の独立したＴ０植物をｑＰＣＲ法でアッセイする。最大レベルのＡＳＮサイレンシング事象を示した各構築物のうちの三つのＴ０系統から種子を収穫する。ＲＮＡｉ遺伝子断片を遺伝によって受け継いだＴ１子孫が効果的な遺伝子サイレンシングを行うか否かを評価するために、選択された個々の形質転換事象のうちの４個の植物体からＲＮＡが抽出されて、その後の実地試験に利用可能なＴ２種子を得る（２０１６）。ＴＮ９０ｅ４ｅ５ｅ１０（Ｚｙｖｅｒｔ）対照系統は、バックグラウンドとして使用して、形質転換効率を比較する。
三つの独立した形質転換事象を、Ｔ０のＡＳＮ１−ＲＮＡｉ植物体およびＡＳＮ５−ＲＮＡｉ植物体において、ＡＳＮ１転写物およびＡＳＮ５転写物のレベルに基づいて選択する。ＡＳＮ１−ＲＮＡｉ植物体は、ＭＭＶプロモーターまたはＥ４プロモーターのいずれかの制御下、ＡＳＮ１−ＴコピーとＡＳＮ１−Ｓコピーの両方をサイレンシングするように生成され、ＡＳＮ５−ＲＮＡｉ植物体は、ＭＭＶプロモーターまたはＥ４プロモーターのいずれかの制御下、ＡＳＮ５−ＴコピーとＡＳＮ５−Ｓコピーの両方をサイレンシングするように生成される。１５個の植物体を、各形質転換事象に対してカナマイシンに基づいて選択し、温室で栽培する。成熟すると、各植物体から中間下部位置で四つの葉を採取し、７週間空気乾燥処理を行う。
アミノ酸およびニコチンの濃度を、ＨＰＬＣ−ＭＳにより算出する：挽いたたばこの一定分量（約３０ ｍｇ）を、エタノール−水（１：１、６ｍＬ）を用いて５０℃にて４５分間抽出した。遠心分離した抽出物を１０倍希釈する。液体クロマトグラフィー分離を、２ ｍＭギ酸アンモニウム水溶液＋０．２５％ギ酸（溶離液Ａ）、およびアセトニトリル＋０．１％ギ酸（溶離液Ｂ）のグラジエントを用いて４５℃にて溶離するアミドカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨアミド、２．１×１５０ｍｍ、１．７μｍ）で、溶離液グラジエント（０分−１０％ Ａ、０．５分−１０％ Ａ、４分−６０％ Ａ、４．５分−６０％ Ａ、４．６分−１０％ Ａ、６．８分−１０％ Ａ；流量０．５ｍｌ／ｍｉｎ）を適用して行う。アミノ酸の質量分析検出用に、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、フルスキャン質量スペクトルを取得するポジティブエレクトロスプレーモードで使用する。抽出物中のニコチン濃度を、フォトダイオードＵＶ／ＶＩＳ検出器の２６０ｎｍトレースにおけるピーク面積から計算する。
アスパラギンは、乾燥処理済みの葉身で測定する。黄変段階の間に３日間乾燥処理を行った後、葉身の穿孔を抽出し、ＲＮＡを各植物体から単離し、ｑＰＣＲを行う。図１１Ａでは、ＭＭＶプロモーターとＥ４プロモーターとの両方の制御下、ＡＳＮ１ＲＮＡｉ遺伝子断片が、乾燥処理済みの葉試料におけるアスパラギンのレベルに影響を及ぼし、アスパラギンの量は、それぞれの形質転換事象で異なることが示されている。並行して栽培したバックグラウンド植物体のＴＮ９０ｅ４ｅ５ｅ１０（Ｚｙｖｅｒｔ）と比較して、Ｅ２８４−４はアスパラギンの２４％低減を示す一方、Ｅ２８４−６はアスパラギンの８９％低減を示した。ＭＭＶまたはＥ４の両プロモーターに関して、アスパラギン含有量は、３日間の乾燥処理後に測定されたＡＳＮ１ＲＮＡのレベルと相関し（図１１Ｂ）、これは、アスパラギンが乾燥処理の間に合成され、ＡＳＮ１−Ｔコピーおよび／またはＡＳＮ１−Ｓコピーが乾燥処理の初期段階の間にアスパラギン生成に関与していることを裏付けるものである。ＭＭＶなどの構成的プロモーターおよびＥ４などの老化プロモーターの両方が、ＡＳＮ１をサイレンシングする活性がある。Ｅ４プロモーターの効率から、ＡＳＮ１遺伝子の活性が主にあるのは、恐らくソース葉から種子へ窒素を再分配するために、乾燥処理済みの葉においてアスパラギンを生成させる老化（黄変）の間であることが証明される。３日間の乾燥処理の後、転写分析と並行してアスパラギンも測定され、六つの評価系統について同様のアスパラギン低減プロファイルを既に示したが、このアミノ酸のうちの約三分の一がこの乾燥処理期間の後に合成されており（対照ＴＮ９０ｅ４ｅ５ｅ１０（Ｚｙｖｅｒｔ）において１６．４ｍｇ／ｇ、データ非表示）、アスパラギンのピークは、葉収穫の後の９日〜１０日間空気乾燥処理後に最大となる（図２を参照）。
アスパラギンシンテターゼは、グルタミン（Ｇｌｎ）（葉に蓄積された硝酸塩から同化した窒素形態として、アンモニアを固定する第一アミノ酸）からのアミン基を、アスパラギン酸（Ａｓｐ）に移行させるものである。ＡＴＰを用いるこの活性から、アスパラギン（Ａｓｎ）およびグルタミン酸（Ｇｌｕ、図３参照）が形成される。その結果として、ＡＳＮ１をサイレンシングすることにより、ＧｌｎおよびＡｓｐが増加し、ならびにＧｌｕが減少すると推測することができる。
従って、同一試料で、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、およびニコチンの量も同様に分析した。アスパラギンの大幅低減を呈示した試料（すなわち、Ｅ２８１−６およびＥ２８２−１）において、Ｇｌｎの随伴的増加が見られるが、逆に、アスパラギンがあまり低減しなかった試料（すなわちＥ２８２−７）においては、少ないＧｌｎ量である（図１２Ａ）。Ｇｌｎとアスパラギンの両方について、ＡＳＮ１遺伝子をサイレンシングすることから生じるアミノ酸バランスは、乾燥処理済みの葉内で対照的な方向に調整されることになる。同様の影響は、ＡｓｐおよびＧｌｕにも見られるが、Ｇｌｎよりも顕著ではない。同様のＧｌｎプロファイルを示す全ての形質転換系統において、ＡｓｐとＧｌｕとの両方が増加（約１．５〜３倍）している（ただし、Ｅ２８２−７のＡｓｐは除く）。アスパラギンシンテターゼ活性に鑑みて（図３を参照）、Ｇｌｕの増加を予想していなかった。
ニコチン含有量は、ＭＭＶ構築物においてもＥ４構築物においても、ＡＳＮ１のサイレンシングによって影響されず、これは、ＡＳＮ１−Ｓおよび／またはＡＳＮ１−Ｔの活性が、ニコチン合成経路に関連しておらず、初期老化プログラム中の収穫後の葉成熟に限定されていることを裏付けるものである。
同様の実験が行われて、ＲＮＡｉ形質転換系統を用いてＡＳＮ５−ＳとＡＳＮ５−Ｔとをサイレンシングする。示したデータによると、アスパラギンは、ＡＳＮ５ＲＮＡｉ断片が構成的プロモーターＭＭＶの制御下で発現する場合に、特に二つの系統で効率的に低減されたが、Ｅ４プロモーターの制御下では、低減されないか、またはわずかに低減されるのみである（図１３Ａ）。興味深いことに、このデータは、３日間の乾燥処理後のｑＰＣＲにより概算されたＡＳＮ５ｍＲＮＡのレベルと部分的にのみ相関している（図１３Ｂ）。第一に、Ｅ４プロモーター制御下の形質転換事象では、ＭＭＶの制御下よりも多くのＡＳＮ５ｍＲＮＡが示され、これは、ＡＳＮ５のサイレンシングに対して、Ｅ４プロモーターがＭＭＶプロモーターよりも効果的ではないことを明らかにし、可能性として、ＡＳＮ５タンパク質合成プログラムが、葉収穫後、ＡＳＮ１タンパク質の生成よりも迅速かつ早期に動き出すことを示している（図７）。特定の系統（例えばＥ３０３−１４とＥ３０３−１６、またはＥ３０５−５とＥ３０５−１５とを比較した場合）では、アスパラギンの割合はｍＲＮＡのレベルと相関が見られない。このことは、乾燥処理済みの葉には存在しないか、またはわずかに存在するのみであるが（図９）、むしろ花成組織内に存在する（図１０）活性に、ＡＳＮ５−Ｔコピーが関与しているという事実による可能性がある。３日間の乾燥処理の後、アスパラギンも測定され、六つの系統でＡＳＮ１形質転換系統（上述本文参照）と同様のアスパラギンの低減プロファイルが見られている。
Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、およびニコチンの量も、ＡＳＮ５−ＲＮＡｉ系統で測定する（図１４）。ＡＳＮ１−ＲＮＡｉ系統では、アスパラギンの大幅低減を呈示した試料（すなわち、Ｅ３０３−１およびＥ３０３−１６）でＧｌｎの随伴的増加が見られるが、逆に、高いアスパラギン含有量を呈示した試料（すなわちＥ３０３−１４およびＥ−３０５−１６）で少ないＧｌｎ量が見られている。Ｅ３０５−５は、対照ならびに姉妹系統のＥ−３０５−１５およびＥ３０５−１６と比較して、１０％未満のアスパラギン低減、ならびにＧｌｎ、Ａｓｐ、およびＧｌｕの増加を示すが、これは、特定の場合にＥ４プロモーターがＡＳＮ５コピーを部分的にサイレンシングすることができることを示唆する。系統Ｅ３０３−１は、対照と比較して、最も高いｍＲＮＡの低減（図１３Ｂ）、大幅なアスパラギンの低減（６６％、図１３Ａ）、ならびにＧｌｎ（１４倍）、Ａｓｐ（３倍）、およびＧｌｕ（３倍）の妥当な増加を示している（図１４Ａ、Ｂ、およびＣ）。従って、ＡＳＮ１−ＲＮＡｉ植物体についてと同様に、ＡＳＮ５をサイレンシングすることにより、アスパラギンの顕著な低減と、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、およびＧｌｕの増加とをもたらす。ニコチンレベルは、ＡＳＮ１−ＲＮＡｉ系統で見られるのと同じように、ＡＳＮ５−ＲＮＡｉ植物体において変動することはなく（図１４Ｄ）、この反応がニコチン経路とは切り離されていることを示唆する。
各形質転換事象および対照系統における中間部の茎位置の葉を秤量する。データによると、ＡＳＮ１−ＲＮＡｉ植物体およびＡＳＮ５−ＲＮＡｉ植物体を温室などの制御された環境で栽培した場合、葉バイオマスには顕著な変動はないことが示されている（図１５）。
結論として、ＡＳＮ１とＡＳＮ５の遺伝子ファミリーの両方が、対応するＭＭＶのＲＮＡｉ系統でサイレンシングされ、それにより、ＡＳＮ１とＡＳＮ５の遺伝子コピーの両方が、バーレー乾燥処理の間のアスパラギン合成に関与していることを示している。
ＡＳＮ１とＡＳＮ５の転写ファミリーの両方が、ＭＭＶプロモーター下で制御された対応するＡＳＮ１−ＲＮＡｉ植物体およびＡＳＮ５−ＲＮＡｉ植物体においてサイレンシングされるか否かを判定するために、交差ｑＰＣＲ（Ｃｒｏｓｓ−ｑＰＣＲ）分析を行う。表２のデータには、ＡＳＮ５−ＲＮＡｉ植物体においてＡＳＮ１とＡＳＮ５の転写物の両方がサイレンシングされているが、ＡＳＮ１−ＲＮＡｉ植物体においては、特に系統ＡＳＮ１−１およびＡＳＮ１−２についてあまり明確ではないことが示されている。この測定結果は、ＡＳＮ５とＡＳＮ１（Ｓ＆Ｔ）の遺伝子の両方が非常に類似しており、同一の遺伝子クラスターに属するという事実に起因すると考えられる（図６）。一方で、これは、乾燥処理済みの葉におけるアスパラギン合成を改変するには、ＡＳＮ１遺伝子クラスターを不活性化するだけで十分であることも示している。
バーレー乾燥処理の間のＣＹＰ８２Ｅ４発現分析により、Ｅ４プロモーターは、４８時間の乾燥処理の後のみに完全に活性を有するようになることが示され、これにより、Ｅ４プロモーター制御下のすべての導入遺伝子構築物または遺伝子断片は、初期の乾燥処理段階（４８時間超）の後半に発現することが示唆される。従って、図１１および図１３に示すデータに基づけば、ＡＳＮ１サイレンシングはＭＭＶプロモーターおよびＥ４プロモーターによって同じ程度に駆動されうるため、ＡＳＮ１−ＴおよびＡＳＮ１−Ｓは、乾燥処理工程の初期段階のうちの後半に活性化されていることが予測される。Ｅ４プロモーターは、ＡＳＮ５のサイレンシングを弱く制御するが、これは、ＡＳＮ１遺伝子が、誘導された葉の老化プログラムに関連する事象の配列によって制御されることを示唆するものである。
実施例４−ＡＳＮ変異体（ＥＭＳ突然変異体）系統
ＡＳＮ１−ＳとＡＳＮ１−Ｔの二つのコピーと、ＡＳＮ５−ＳとＡＳＮ５−Ｔの二つのコピーのＡＳＮ ＥＭＳ−突然変異体を識別する。特定の突然変異を、予測エクソン配列におけるゲノムＤＮＡでスクリーニングする。三つの停止変異が、ＡＳＮ１−Ｓ（ＡＳＮ１−Ｓ＿Ｗ１５６＊）、ＡＳＮ１−Ｔ（ＡＳＮ１−Ｔ＿Ｗ１５６＊）、およびＡＳＮ５−Ｓ（ＡＳＮ５−Ｓ＿Ｑ６６＊）のコピーにおいて確認されているが、ＡＳＮ５−Ｔコピーにおいては確認されていない。ＡＳＮ５−Ｔでは停止変異が確認されていないので、終止コドン（ＡＳＮ５−Ｔ＿Ｇ５９Ｄ）を置き換えることができる潜在的な候補として、ＳＩＦＴスコア０．０００４を呈示するノンストップ変異を選択する。
突然変異（変異体）を保有するか、または選択遺伝子（野生型ｏｕｔ−ｓｅｇｒｅｇａｎｔ）において非変異である子孫種子を、Ｍ２親から遺伝子型同定し、識別し、圃場に植え付ける。各選択変異体の１０個の植物体を、個々のプロットにて、対応する野生型ｏｕｔ−ｓｅｇｒｅｇａｎｔの１０個の植物体の脇で栽培して、圃場変動（すなわち、不均質な硝酸塩施肥および土壌変動）の影響を受けないようにする。四つの中間下部の茎の葉を収穫時に採取し、空気乾燥処理室に２か月間糸で吊した。葉を剥ぎ、葉身を粉砕して細粉にする。アスパラギン（ｍｇ／ｇ）を各葉のプールにおいて測定する。いくらかの変動がプロット毎の変動に起因して観察されうるが、ＡＳＮ１−Ｓ＿Ｗ１５６＊、ＡＳＮ１−Ｔ＿Ｗ１５６＊、およびＡＳＮ５−Ｓ＿Ｑ６６＊には、対応する野生型分離個体（ｓｅｇｒｅｇａｎｔ）と比べてアスパラギンが低減する顕著な傾向が見られる一方、ＡＳＮ５−Ｔ＿Ｇ５９Ｄには見られない（表３を参照）。
図１７には、アスパラギンの低減率を示す。最も高い低減率はＡＳＮ１−Ｔ＿Ｗ１５６＊（８３％）で見られ、次いでＡＳＮ５−Ｓ＿Ｑ６６＊（４４％）、ＡＳＮ１−Ｓ＿Ｗ１５６＊（１７％）の順となる。系統ＡＳＮ５−Ｔ＿Ｇ５９Ｄでは、アスパラギンのわずかな増加が見られた。ＡＳＮ変異体におけるアスパラギンの含有量は、乾燥処理中の遺伝子活性化のレベルと相関がある。実際、ＡＳＮ１−Ｔは、４８時間および６０時間の乾燥処理の後のＡＳＮ５−ＳやＡＳＮ１−Ｓよりも、乾燥処理の間に高発現する（図８および図９を参照）。しかしながら、この測定結果には注意が必要であり、その理由は、ＡＳＮ１−Ｔ＿Ｗ１５６＊のデータは圃場における一つのプロットのみから得ており、この圃場の実験において、ＡＳＮ１−Ｔ＿Ｗ１５６＊と該系統の野生型ｏｕｔ−ｓｅｇｒｅｇａｎｔ植物体の両方が、バイオマスの大幅な減少を呈したからである（図１８を参照）。
ＡＳＮ１−Ｔ＿Ｗ１５６＊、および対応する野生型ｏｕｔ−ｓｅｇｒｅｇａｎｔ ＡＳＮ１−Ｔ＿ＷＴ＊の両方におけるバイオマスの減少は、双方の変異体系統にさらに存在する別の突然変異の結果である可能性がある。確かに、ＡＳＮ１／５−ＲＮＡｉ系統を用いた形質転換実験では、ＡＳＮ１−Ｔ、および任意の他のＡＳＮ１とＡＳＮ５のコピーは、植物体の高さやバイオマス表現型に影響を及ぼさないことが示される傾向にある（図１５を参照）。バックグラウンド品種ＡＡ３７の交雑と、それに続く植物体の自家受粉とにより、ＡＳＮ１−Ｔ停止変異の植物体サイズへの任意の影響について結論を出すことができるであろう。また、図１８には、ＡＳＮ１−ＳおよびＡＳＮ５−Ｓにおける停止変異が、植物体バイオマスに影響を及ぼさないことが示されている。このことは、発現データ（図７および図８）によれば、他の組織（花など）に優先的に関与すると考えられる（図１０を参照）ＡＳＮ５−ＴにおけるＧ５９Ｄ点突然変異に対しても当てはまる。
第二の実地試験を、ＡＳＮ１−Ｔ（１０個のｏｕｔ−ｓｅｇｒｅｇａｎｔ植物体と１０個の停止変異体の植物体とを含む６プロット）、ＡＳＮ１−Ｓ（１０個のｏｕｔ−ｓｅｇｒｅｇａｎｔ植物体と１０個の停止変異体の植物体とを含む６プロット）、およびＡＳＮ５−Ｓ（１０個のｏｕｔ−ｓｅｇｒｅｇａｎｔ植物体と１０個の停止変異体の植物体とを含む９プロット）について類似の停止変異体を用いて行う。葉（中間部の茎位置の六つの葉）の乾燥処理後、ＡＳＮ１−Ｔ停止変異体の植物体は、葉身においてｏｕｔ−ｓｅｇｒｅｇａｎｔと比較して１９％のアスパラギン低減を示し、ＡＳＮ１−Ｓ停止変異体の植物体は、葉身においてｏｕｔ−ｓｅｇｒｅｇａｎｔと比較して２３％のアスパラギン低減を示し、ＡＳＮ５−Ｓ停止変異体の植物体は、葉身においてｏｕｔ−ｓｅｇｒｅｇａｎｔと比較して約１０％のアスパラギン低減を示している。これらの結果は、表３に示した先の結果を追認し、選択した停止変異体が、乾燥処理済みの葉においてアスパラギンを低減させるのに効果的であることを証明している。ＡＳＮ−ＲＮＡｉ系統のアスパラギンに関するデータを比較すると、三つの停止変異体であるＡＳＮ１−Ｔ＿Ｗ１５６＊と、ＡＳＮ１−Ｓ＿Ｗ１５６＊と、ＡＳＮ５−Ｓ＿Ｑ６６＊との組み合わせは、乾燥処理済みの葉の葉身において、同様のアスパラギンの低減をもたらすはずである。
これらのデータから、ＡＳＮ１−Ｓ、ＡＳＮ１−Ｔ、およびＡＳＮ５−Ｓは、バーレーたばこの葉の空気乾燥処理中におけるアスパラギン形成に関与すると結論付けられる。
実施例５−ＡＳＮ形質転換系統におけるアスパラギン低減のアクリルアミド形成への影響
製造仕様書に従って、形質転換系統のＭＭＶ−ＡＳＮ１−ＲＮＡｉ（系統Ｅ２８１−６およびその各対照、図１１を参照）およびＭＭＶ−ＡＳＮ５−ＲＮＡｉ（系統Ｅ３０３−１およびその各対照、図１３を参照）の葉由来の葉身粉末を、５０％バージニアたばこ粉末とブレンドして、スラリーとキャストリーフ材料とを作製する。エアロゾル形成物品を製造し、それを加熱することによって発生するエアロゾルを分析（カナダ保健省の方式）して、アクリルアミドを測定した。そのデータを図１９に示す。ＡＳＮ１−ＲＮＡｉ系統におけるアスパラギンの８８％低減が、対応するたばこ対照と比べてアクリルアミドの７０％低減をもたらした。同様なデータが第二の形質転換系統で得られ、ＡＳＮ５−ＲＮＡｉ系統の葉におけるアスパラギンの６６％低減が、たばこ対照と比べてエアロゾル中のアクリルアミドの４０％低減をもたらしている。
アクリルアミドは、喫煙者の生物学的マーカー（Ｎａｕｆａｌ ｅｔ ａｌ．， ２０１１）である。また、アクリルアミドの生成は、可燃性紙巻たばこの煙で分析される（図２０）。可燃性紙巻たばこは、以下の手順を用いて、ＡＳＮ１−ＲＮＡｉ植物体の乾燥処理済みの中間部の茎の葉から調製される。たばこ葉を、２２℃にて６０％周囲湿度で調整する。中央脈を取り外した後に、カットフィラーを葉身から調製する。紙巻たばこは手製であり、標準の紙巻たばこチューブを用いて電動紙巻たばこインジェクタ機「Ｐｏｗｅｒｍａｔｉｃ ２」で充填される。紙巻たばこに挿入されるカットフィラーの重量は、１２０ ｍｍ〜１４０ｍｍ水位に相当する引き出し抵抗を得るように変動する（８００ ｍｇ前後）。続いて、各紙巻たばこの堅さ（硬さ）を手で制御する。一組のカットフィラーに対してパラメータが定まると、一連の作製された各紙巻たばこスティック（一試料あたり２００本）に対してそのパラメータが保持される。
対照の植物体では、たばこカットフィラー内のアスパラギン含有量（図２０）は、キャストリーフのブレンド粉末で測定されたアスパラギン含有量に匹敵し（図１９を参照）、図１１で測定された量と比較して約１０％少なかった。こうした差異は、収穫時の葉の茎位置に起因しており、バーレー乾燥処理後、アスパラギンは上部の茎の葉よりも下部の茎の葉により多くなっている。一方で、野生型植物体と比較した際のＡＳＮ−ＲＮＡｉにおけるアスパラギンの低減は、図１１および図１９に示すデータと類似した。興味深いことに、アクリルアミドの低減効率は、エアロゾル発生物品のエアロゾル（７０％）よりも可燃性紙巻たばこの煙（５７％）の方が低かったが、このことは、燃焼式または可燃式たばこ製品よりも加熱式たばこ製品で、アスパラギンを形成させるメイラード反応の効率が高いことを示している可能性がある。
また、アクリルアミドは、ＡＳＮ１−Ｓ停止変異体由来の葉身で作製されたエアロゾル形成物品からのエアロゾル中でも効率的に低減される（図２１）。しかしながら、この場合、乾燥処理済みの葉におけるアスパラギン合成への寄与体として唯一であるＡＳＮ１−Ｓの影響が、例えばＡＳＮ１−Ｔと比較して限られているため（図１７に示すデータに基づく）、この低減は限定的である。ＡＳＮ−ＲＮＡｉ形質転換系統およびＡＳＮ突然変異体系統の両方において、乾燥処理済みの葉身におけるアスパラギンの低減は、それに続く可燃性紙巻たばこの煙中および加熱によって発生するエアロゾル中のアクリルアミドの低減を伴うことが、データにより示されている。言い換えると、ＡＳＮ１とＡＳＮ５の遺伝子コピーをノックアウトすることにより、たばこ基質内のアスパラギンを減少させ、かつ可燃性紙巻たばこの煙中および加熱によって発生するエアロゾル中のアクリルアミドの形成を低減させる。
参考文献
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さらなる態様は、アスパラギンシンテターゼの発現または活性を低減させた、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体、またはその部分であって、該アスパラギンシンテターゼが、（ｉ）配列番号１、もしくは配列番号３、もしくは配列番号５、もしくは配列番号７に対して少なくとも７２％の配列同一性を持つ配列を含むか、それから成るか、もしくはそれから実質的に成るポリヌクレオチド配列；または（ｉｉ）（ｉ）に記載したポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド；または（ｉｉｉ）配列番号２、もしくは配列番号４、もしくは配列番号６、もしくは配列番号８に対して少なくとも７８％の配列同一性を持つポリペプチドを、含むか、それから成るか、もしくはそれから実質的に成り；（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）に記載した該アスパラギンシンテターゼの発現または活性が、対照植物体と比較して低減された、該突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体、またはその部分に関する。
さらなる態様は、植物材料であって、対照植物体由来の植物材料と比べて、アスパラギンのレベルが低減し、かつ該植物材料由来のエアロゾル中のアクリルアミドのレベルが低減した該植物材料の調製方法であって、該方法が、（ａ）アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号１、または配列番号３、または配列番号５、または配列番号７に対して少なくとも７２％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリヌクレオチドを含む、植物体またはその部分を提供する工程と；（ｂ）該植物体またはその部分において、ポリヌクレオチドの発現、またはそれによってコードされるタンパク質の活性を低減させる工程と；（ｃ）該植物体またはその部分由来の植物材料を収穫する工程と；（ｄ）該植物材料を乾燥または乾燥処理する工程と；（ｅ）任意選択的に、該植物体もしくはその部分におけるアスパラギンのレベルを測定する、および／または該植物体もしくはその部分由来のエアロゾル中のアクリルアミドのレベルを測定する工程と；（ｆ）乾燥処理または乾燥済みの植物材料であって、アスパラギンのレベルが低減し、かつ該植物材料由来のエアロゾル中のアクリルアミドのレベルが低減した、該乾燥処理または乾燥済みの植物材料を取得する工程と、を含み、好適には、ニコチンのレベルが、対照植物体におけるニコチンのレベルと実質的に同じであり；好適には、グルタミン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸が、対照植物体の乾燥処理または乾燥済みの葉と比べてより多く形成される、該方法に関する。
本明細書で引用または記述されたあらゆる刊行物は、本出願の出願日以前に開示された関連情報を提供する。本明細書における記載は、発明者がこのような開示に先だって権利を与えられないことの承認としては解釈されない。上記の明細書で言及したすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。発明についての様々な改良や変形が、本発明の範囲および精神を逸脱することなく、当業者にとって明らかとなる。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して記述してきたが、当然のことながら、本発明は主張の通り、こうした特定の実施形態に不当に限定されるべきではない。実際に、本発明を実施するための記述された方法について、細胞生物学、分子生物学および植物体生物学の分野または関連する分野の当業者にとって明らかである様々な改良は、以下の特許請求の範囲の範囲内に収まるものであることが意図される。
表１ たばこ、トマト、およびアラビドプシスアスパラギンシンテターゼ（ＡＳＮ）の遺伝子産物間のギャップなしアライメント領域における同一残基の割合
表２ ＡＳＮ１−ＲＮＡｉ（ＡＳＮ１−１、ＡＳＮ１−２、およびＡＳＮ１−３）ならびにＡＳＮ５−ＲＮＡｉ（ＡＳＮ５−１、ＡＳＮ５−２、およびＡＳＮ５−３）の形質転換系統におけるＡＳＮ１とＡＳＮ５の転写物の両方を、特異的プライマーＡＳＮ１ｐおよびＡＳＮ５ｐを用いてサイレンシングする度合いを算出するｑＰＣＲ分析（相対的遺伝子発現単位）
表３ 以下の四つのＡＳＮ変異体における、下部／中間部の茎位置で収穫された空気乾燥処理済みの葉中のアスパラギン（ｍｇ／ｇ）分析：ＡＳＮ１−Ｓ＿Ｗ１５６＊およびその対応する野生型ｏｕｔ−ｓｅｇｒｅｇａｎｔのＡＳＮ１−Ｓ＿ＷＴ＊、ＡＳＮ１−Ｔ＿Ｗ１５６＊ およびその対応する野生型ｏｕｔ−ｓｅｇｒｅｇａｎｔのＡＳＮ１−Ｔ＿ＷＴ＊、ＡＳＮ５−Ｓ＿Ｑ６６＊およびその対応する野生型ｏｕｔ−ｓｅｇｒｅｇａｎｔのＡＳＮ５−Ｓ＿ＷＴ＊、ならびにＡＳＮ５−Ｔ＿Ｇ５９Ｄおよびその対応する野生型ｏｕｔ−ｓｅｇｒｅｇａｎｔのＡＳＮ５−Ｔ＿ＷＴ＊。変異体と野生型ｏｕｔ−ｓｅｇｒｅｇａｎｔの各々は、いかなる望ましくない圃場の影響（すなわち硝酸塩および土壌の変動）をも受けないように、個々のプロットで隣り合わせに栽培された。
配列
配列番号１−ＮｔＡＳＮ１−Ｓ、ゲノムＤＮＡ配列
atgtgcgggatcttggctgttttgggttgttctgatgattctcaggccaaaagggttcgtgttctcgagctctctcgcaggtaaattatatttcccttcttttctgtattgttaatgttattgtgttgcgttattatattgattctttttatgagaaagtagtttcctgaacgtttgcattttagaataaaagaagactaaagcttaagatagattatatatttagatattcttgacgtggacctatatcttagattcacaatataattttctcggaccaactgttttagcatgacttgtaaatgatgttgatatgaaaagctgtgatttaattagtaggagtaattcatttccatgttacaattacttatctttctcctccttgtgttcttgccactgctagaggcagatctataattcctacttagagtattgaacacattgtacttttgaaattgtaagtgtgcagtttaatatttgttaaaattttgaaggtttttttaattacatgtatatcgtgacgttatatagcctctctacccgcataaggtaggggtaatgtctgcgtacaaataggctgatttcactctgtgttcagttgaatcaatatatgcggcatccaccactgtttgcaaatgcatgggaatggaaaagtcatgcctcatcactgtcacacatgatttttatttatttatttattatatatgattctttaaatctattagtgggtactgaatcttgctaactgatcgattgatgaaacaggttgaagcatcgtggaccagattggagtgggctgtatcaacatggggactgttacttggcacatcagcgtctagctattgttgatcctgcttccggtgatcaacctctgtttaacgaagataagacgattgttgttacggtgggtgcttttaatttcatgtttactctcatttcttgctcagtttactgatgaaaacgaaactaatgctgataactatcaaccaatcaaccacatacaagtaggggtcgactatatgattcattatatcctttcctctattcaaatagttgatgattaatttcatgccaaaaatttcaggtaaatggagagatctacaatcacgagcaacttcgtaagcaaatgcctaatcataagttccggactggcagtgactgtgatgtcattgcacacctagtgagtactcatcttccaacttaggaaacatgtatgtatatgtaaaattattccctgattatattatgtacattaatcagtatgaagaacatggagaagattttgtggacatgctggatgggatcttcgcttttgtgttattggatactcgagataacagctttcttgttgctcgtgatgccattggaattacttccctttatattggttggggacttgatggtaagattccatatgattttctcacttagattttgttattgcaaatgaatatgttgaatccttatatgtactaattgttgtaattctgttccttctcagggtctgtatggatatcatctgagcttaagggcttgaatgatgactgcgaacattttgaagttttcccaccagggcacttgtactctagcaagaatggcggctttaggaggtggtacaatcctccttggttctctgaggccattccttccactcgttatgatcccttagttctcaggcgtgcctttgaaaatgtgagttaatattgttgttgttgaaatggatccaacatgttggttttaaggctatatatcattttgcaggctgttatcaaaaggttgatgactgatgtcccctttggtgttctcctctccgggggactcgattcatccttggttgcttcgattactgctcgctacttggctggtacaaaggctgccaagcagtggggagcacagcttcattccttctgtgttggccttgaggtcagataatcttgagacttgtgtgattacaacattaataacgacaacacctcattcacaagctagtaaggtcagctatatgaaatctgataccgatttgcttgctttcaccgaacagggctcaccggatctcaaggctgcaagagaagttgctgactacttgggaaccgttcaccacgagtttcacttcaccgttcaggttttgatggagcaactctattttcacttgatctatcatcctcttcgtttctcctttgtttacctgatggcaaatgacatgtgttgtatttgcaggatggaattgatgcaattgaagatgttatttaccatattgagacatacgatgtaacgacaatcagagcaagcactcctatgttccttatgtcgcgtaagattaagtcactaggagtgaagatggtcatatctggggaaggatctgatgaagtgtttggtggctacttgtactttcacaaggctcccaacaaggaagagttccacaaggaaacatgtcgcaaggtataagaaagtgcttccagttcctagtttaaataggacaaggagttgagaaaatgttgattttttccctatgcagattaaagcgcttcaccaatatgactgcttaagagcaaataagtcaacatctgcatggggtttagaagctagagtccctttcctagataaggagttcatcaatgttgccatgagtattgatccagagtggaagttggtaagtagttgacccccaattgttgatcgaataaacaatcaactgtccctaaaactatgtatttattcatttcagattaaaccagagcaaaggaggattgaaaagtgggctctaaggagggcctttgatgatgaggagcatccttatctcccaaaggtgtactaaatcgccattttcaaactgatttgcaaatgattttgaatgttatattattaatcaaactaacaatttactcattacattccttgcagcacatcctgtataggcaaaaagaacaattcagtgatggcgtgggctatagttggatagatggactcaaagcacatgctgaacaacatgtgcgtttcaatgactaatcaacgactttctactgctcttatttatcttccaatgcttgtttgttttaaagctgaccgaggaaacaaattttttcctttaataggtgaccaataggatgatgtttaatgcttcacatatattccctcataacacacccattacaaaggaagcatactactataggatgattttcgagcgctttttcccacaggtaatttgttcagataatagtgagaatttatgataaatggactaatttacgtttgttgtcgattttgcaaccttccaacagtgtgagcaagctcacataatcggaattttttgttcaaataataatgcattggaaatcataatgctaaattgagatttacttttaaccatgttcctctaccatttttggttctgcagaattcagctgggctaaccgttcctggaggagcaagtgtggcgtgtagcacagctaaagctgtagagtgggatgcttcttggtcaaagaaccttgatccttcaggcagggctgctattggtgtacataactcggcttatgagaatcatgtacctgctatggctaatgggaatttgaccaaaaaaatcattggtcgtgtgccttctatggtagaagttggtgctgctcccgagctcacaataaagagttag
配列番号２−ＮｔＡＳＮ１−Ｓ、推定アミノ酸配列
MCGILAVLGCSDDSQAKRVRVLELSRRLKHRGPDWSGLYQHGDCYLAHQRLAIVDPASGDQPLFNEDKTIVVTVNGEIYNHEQLRKQMPNHKFRTGSDCDVIAHLYEEHGEDFVDMLDGIFAFVLLDTRDNSFLVARDAIGITSLYIGWGLDGSVWISSELKGLNDDCEHFEVFPPGHLYSSKNGGFRRWYNPPWFSEAIPSTRYDPLVLRRAFENAVIKRLMTDVPFGVLLSGGLDSSLVASITARYLAGTKAAKQWGAQLHSFCVGLEGSPDLKAAREVADYLGTVHHEFHFTVQDGIDAIEDVIYHIETYDVTTIRASTPMFLMSRKIKSLGVKMVISGEGSDEVFGGYLYFHKAPNKEEFHKETCRKIKALHQYDCLRANKSTSAWGLEARVPFLDKEFINVAMSIDPEWKLIKPEQRRIEKWALRRAFDDEEHPYLPKHILYRQKEQFSDGVGYSWIDGLKAHAEQHVTNRMMFNASHIFPHNTPITKEAYYYRMIFERFFPQNSAGLTVPGGASVACSTAKAVEWDASWSKNLDPSGRAAIGVHNSAYENHVPAMANGNLTKKIIGRVPSMVEVGAAPELTIKS
配列番号３−ＮｔＡＳＮ１−Ｔ、ゲノムＤＮＡ配列
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配列番号4−NtASN1-T、推定アミノ酸配列
MCGILAVLGCSDDSQAKRVRVLELSRRLKHRGPDWSGLYQHGDCYLAHQRLAIVDPASGDQPLFNEDKTIVVTVNGEIYNHEQLRKQMPDHKFRTGSDCDVIAHLYEEHGEDFVDMLDGIFAFVLLDTRDNSFLVARDAIGITSLYIGWGLDGSVWISSELKGLNDDCEHFEVFPPGHLYSSKNGGFRRWYNPLWFSEAIPSTPYDPLVLRRAFENAVIKRLMTDVPFGVLLSGGLDSSLVASITARYLAGTKAAKQWGAQLHSFCVGLEGSPDLKAAREVADYLGTVHHEFHFTVQDGIDAIEDVIYHIETYDVTTIRASTPMFLMSRKIKSLGVKMVISGEGSDEVFGGYLYFHKAPNKEEFHKETCRKIKALHQYDCLRANKSTSAWGLEARVPFLDKEFINVAMSIDPEWKLIKPEQRRIEKWALRRAFDDEEHPYLPKHILYRQKEQFSDGVGYSWIDGLKAHAEQHVTNRMMLNASHIFPHNTPITKEAYYYRMIFERFFPQNSAGLTVPGGASVACSTAKAVEWDASWSKNLDPSGRAAIGVHNSAYENHEPAMANGNLATKIIGRAPSMVEVGAAHELTIRS
配列番号５−ＮｔＡＳＮ５−Ｓ、ゲノムＤＮＡ配列
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配列番号６−ＮｔＡＳＮ５−ｓ、推定アミノ酸配列
MCGILALLGCSDDSQAKRVRVLELSRRLKHRGPDWSGIYQHGDFYLAHQRLAIIDPASGDQPLFNQDKTIVVTVNGEIYNHEKLRNLMPNHKFRTGSDCDVIAHLYEEYGENFVDMLDGVFSFVLLDTRDNSFLAARDAIGITPLYIGWGLDGSVWISSELKGLNGDCEHFEVFPPGHLYSSKNGGFRRWYNPQWFSEAIPSNPYDPLVLRRAFENAVIKRLMTDVPFGVLLSGGLDSSLVASVTARYLAGTKAAKQWGAQLHSFCVGLEGSPDLKAAREVADYLGTVHHEFTFTVQDGIDAIEDVIYHIETYDVTTIRASTPMFLMSRKIKSLGVKMVISGEGSDELFGGYLYFHKAPNKEEFHVETCHKIKALHQYDCLRANKATSAWGLEARVPFLDKEFINVAMSIDPEWKMIKHDHGRIEKWVLRKAFDDEEQPYLPKHILYRQKEQFSDGVGYSWIDGLKAHAEQHVTDRMMLNAAHIFPHNTPTTKEAYYYRMIFERFFPQNSARLTVPGGPSIACSTAKAIEWDASWSNNLDPSGRAAIGVHNSAYDDHLPDVGNGNLDTTIIDNVPRMVGVGAAAELTIRS
配列番号７−ＮｔＡＳＮ５−Ｔ、ゲノムＤＮＡ配列
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配列番号８−ＮｔＡＳＮ５−Ｔ、推定アミノ酸配列
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配列番号９−ＮｔＡＳＮ３−Ｓ、ゲノムＤＮＡ配列
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配列番号１０−ＮｔＡＳＮ３−Ｓ、推定アミノ酸配列
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配列番号１１−ＮｔＡＳＮ３−Ｔ、ゲノムＤＮＡ配列
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tggagcagaatgctgcgagggaaacagttccaggtggtccaagtgtggcatgcagcactg
caaaagcagtagaatgggacgcagcttggtccaagaatctagatccatctggtcgagctg
cactcggtgttcatgcagctgcttatgaggatgcatcagaggttaaaaccacagtcgcga
cagatactgctcagaaacttgacgttgataaagctgcagtagctgtttga
配列番号１２−ＮｔＡＳＮ３−Ｔ、推定アミノ酸配列
MCGILAVFGCIDNSQAKRSRIIELSRRLRHRGPDWSGLHSHDDCYLAHQRLAIVDPTSGDQPLYNEDKTIVVAVNGEIYNHRDLREKLKSHQFRTGSDCEVIAHLYEDYGEDFVHMLDGMFSFVLLDTRDKSFIAARDAIGITPLYMGWGLDGSVWFSSEMKALSDDCERFVSFLPGHIYSSKNGGLRRWYNPPWYSETIPSTPYDHLVLRKAFEKAVVKRLMTDVPFGVLLSGGLDSSLVAAVANRYLADTEAARQWGSQLHTFCVGLKGSPDLKAAREVADYLGTRHHEFHFTVQEGIDALDEVIYHVETYDVTTIRASTPMFLMSRKIKSLGVKMVLSGEGSDEIFGGYLYFHKAPNKEEFHQETCRKIKALHLYDCLRANKSTSAWGVEARVPFLDKEFVNVAMNMDPESKMIRPDLGRIEKWVLRNAFDDDQNPYLPKHILYRQKEQFSDGVGYSWIDGLKDHASRLVSDSMLANASFVYPHNTPTTKEGYYYRTIFERYFPKNAARETVPGGPSVACSTAKAVEWDAAWSKNLDPSGRAALGVHAAAYEDASEVKTTVATDTPQKLEVDKAAVAV
配列番号 １３−ＮｔＡＳＮ１プライマーのＤＮＡ配列、ＡＳＮ１−ｆ
tcacatatattccctcataacacac
配列番号 １４−ＮｔＡＳＮ１プライマーのＤＮＡ配列、ＡＳＮ１−ｒ
aagaagcatcccactctacagctt
配列番号 １５−ＮｔＡＳＮ５プライマーのＤＮＡ配列、ＡＳＮ５−ｆ
atatcttccctcacaacactccaact
配列番号 １６−ＮｔＡＳＮ５プライマーのＤＮＡ配列、ＡＳＮ５−ｒ
Ctaccggaaggatcaaggttgt
配列番号 １７−ＮｔＡＳＮ１−ＳコピーとＮｔＡＳＮ１−Ｔコピーの両方をサイレンシングするのに使用するＮｔＡＳＮ１−Ｓ由来のＤＮＡコード配列
tcacatatattccctcataacacacccattacaaaggaagcatactactataggatgattttcgagcgctttttcccacagaattcagctgggctaaccgttcctggaggagcaagtgtggcgtgtagcacagctaaagctgtagagtgggatgcttcttggtcaaagaaccttgatccttcaggcagggctgctattggtgtacataactcggcttatgagaatcatgtacctgctatggctaatgggaatttgaccaaaaaaatcattggtcgtgtgccttctatggtagaagttggtgctgctcccgagctcacaataaagagttag
配列番号 １８−ＮｔＡＳＮ５−ＳコピーとＮｔＡＳＮ５−Ｔコピーの両方をサイレンシングするのに使用するＮｔＡＳＮ５−Ｔ由来のＤＮＡコード配列
gaccagattggagtgggatatatcaacatggtgatttttacttagcacatcaacgtttagcaattatcgatcctacttctggtgatcagcctctgtttaatcaagataagactattgttgttacagtcaatggagaaatttacaatcatgagaaacttcgtaatcttatgcctaatcacaagttcagaaccggaagtgattgtgatgttattgcacatctttatgaagaatatggagaaaattttgtggacatgttggatggggtgttctcttttgtattgttggatacgcgcgataacagctttcttgctgctcgtgatgcgattggaattactcccctctatattggttggggacttgatgg
配列番号 １９−ＡＳＮ１−Ｓ停止変異体のＤＮＡ配列：ＡＳＮ１−Ｓ＿Ｗ１５６＊
atgtgcgggatcttggctgttttgggttgttctgatgattctcaggccaaaagggttcgtgttctcgagctctctcgcaggtaggttgaagcatcgtggaccagattggagtgggctgtatcaacatggggactgttacttggcacatcagcgtctagctattgttgatcctgcttccggtgatcaacctctgtttaacgaagataagacgattgttgttacggtaggtaaatggagagatctacaatcacgagcaacttcgtaagcaaatgcctaatcataagttccggactggcagtgactgtgatgtcattgcacacctagtagtatgaagaacatggagaagattttgtggacatgctggatgggatcttcgcttttgtgttattggatactcgagataacagctttcttgttgctcgtgatgccattggaattacttccctttatattggttggggacttgatggtagggtctgtatgaatatcatctgagcttaagggcttgaatgatgactgcgaacattttgaagttttcccaccagggcacttgtactctagcaagaatggcggctttaggaggtggtacaatcctccttggttctctgaggccattccttccactcgttatgatcccttagttctcaggcgtgcctttgaaaatgtaggctgttatcaaaaggttgatgactgatgtcccctttggtgttctcctctccgggggactcgattcatccttggttgcttcgattactgctcgctacttggctggtacaaaggctgccaagcagtggggagcacagcttcattccttctgtgttggccttgaggtagggctcaccggatctcaaggctgcaagagaagttgctgactacttgggaaccgttcaccacgagtttcacttcaccgttcaggtaggatggaattgatgcaattgaagatgttatttaccatattgagacatacgatgtaacgacaatcagagcaagcactcctatgttccttatgtcgcgtaagattaagtcactaggagtgaagatggtcatatctggggaaggatctgatgaagtgtttggtggctacttgtactttcacaaggctcccaacaaggaagagttccacaaggaaacatgtcgcaaggtagattaaagcgcttcaccaatatgactgcttaagagcaaataagtcaacatctgcatggggtttagaagctagagtccctttcctagataaggagttcatcaatgttgccatgagtattgatccagagtggaagttgagattaaaccagagcaaaggaggattgaaaagtgggctctaaggagggcctttgatgatgaggagcatccttatctcccaaaggtagcacatcctgtataggcaaaaagaacaattcagtgatggcgtgggcatagttggatagatggactcaaagcacatgctgaacaacatgtaggtgaccaataggatgatgtttaatgcttcacatatattccctcataacacacccattacaaaggaagcatactactataggatgattttcgagcgctttttcccacaggtagaattcagctgggctaaccgttcctggaggagcaagtgtggcgtgtagcacagctaaagctgtagagtgggatgcttcttggtcaaagaaccttgatccttcaggcagggctgctattggtgtacataactcggcttatgagaatcatgtacctgctatggctaatgggaatttgaccaaaaaaatcattggtcgtgtgccttctatggtagaagttggtgctgctcccgagctcacaataaagagt
配列番号 ２０−ＡＳＮ１−Ｓ停止変異体のアミノ酸配列：ＡＳＮ１−Ｓ＿Ｗ１５６＊
MetCysGlyIleLeuAlaValLeuGlyCysSerAspAspSerGlnAlaLysArgValArgValLeuGluLeuSerArgArgLeuLysHisArgGlyProAspTrpSerGlyLeuTyrGlnHisGlyAspCysTyrLeuAlaHisGlnArgLeuAlaIleValAspProAlaSerGlyAspGlnProLeuPheAsnGluAspLysThrIleValValThrValAsnGlyGluIleTyrAsnHisGluGlnLeuArgLysGlnMetProAsnHisLysPheArgThrGlySerAspCysAspValIleAlaHisLeuTyrGluGluHisGlyGluAspPheValAspMetLeuAspGlyIlePheAlaPheValLeuLeuAspThrArgAspAsnSerPheLeuValAlaArgAspAlaIleGlyIleThrSerLeuTyrIleGlyTrpGlyLeuAspGlySerValSTOP
配列番号 ２１−ＡＳＮ１−Ｔ停止変異体のＤＮＡ配列：ＡＳＮ１−Ｔ＿Ｗ１５６＊
atgtgcgggatcttggctgttttgggttgttctgatgattctcaggccaaaagggttcgtgttctcgagctctctcgcaggtaggttgaagcatcgtggaccagattggagtgggctgtatcaacatggggactgttacttggcacatcagcgtctagctattgttgatcctgcttccggtgatcaacctctgtttaacgaagataagacgattgttgttacggtaggtaaatggagagatctacaatcacgagcaacttcgcaagcaaatgcctgatcataagttccggactggaagtgactgtgatgtcattgcacacctagtagtatgaagaacatggagaagattttgtggacatgctggatgggatcttcgcttttgtgttactggatactcgagataacagctttcttgttgctcgtgatgccattggaattacttccctttatattggttggggacttgatggtagggtctgtatgaatatcatctgagcttaagggcttgaatgatgactgcgaacattttgaagttttcccaccaggacacttgtactctagcaagaatggcggctttaggaggtggtacaatcctctttggttctctgaggctattccttccactccttatgatcccttagttctcaggcgcgcctttgaaaatgtaggctgttatcaaaaggttgatgactgatgtcccttttggtgttctgctctccgggggactcgattcatccttggttgcttcgattactgcccgctacttggctggcacaaaggctgccaagcagtggggagcacagcttcattccttctgtgttggccttgaggtagggatcaccggatctcaaggctgcaagagaagttgctgactacttgggaaccgttcaccacgagtttcacttcaccgttcaggtaggatggaattgatgcaattgaagatgttatttaccatattgagacatacgatgtaacgacaatcagagcaagcactcctatgttccttatgtcgcgtaagattaagtcactaggagtgaagatggttatatctggggaaggctctgatgaagtgtttggtggctacttgtactttcacaaggctcccaacaaggaagagttccacaaggaaacatgtcgcaaggtagattaaagcacttcaccaatatgactgtttaagagcaaataagtcaacatctgcatggggcttagaagctagagtgcctttcctagataaggagttcatcaatgttgccatgagtattgatccagagtggaagttggtagattaaaccagagcaaaggaggattgagaagtgggctctaaggagggcctttgatgatgaggagcatccctatctcccaaaggtagcacatcctatacaggcagaaagaacaattcagtgatggcgtaggctatagttggatagatggactcaaagcacatgctgaacaacatgtaggtgaccaataggatgatgcttaatgcttcacatatattccctcataacacaccgattacaaaggaagcatactattataggatgattttcgagcgctttttcccacaggtagaattcagctgggctaaccgttcctggaggagcgagtgtggcgtgtagcacagctaaagctgtagagtgggatgcttcttggtcaaagaaccttgatccttcaggaagggctgctattggtgtacataactcagcttatgagaatcatgaacctgctatggctaatgggaatttggccacaaaaatcattggccgtgcgccgtctatggtagaagttggtgctgctcatgagctcacaataaggagt
配列番号 ２２−ＡＳＮ１−Ｔ停止変異体のアミノ酸配列：ＡＳＮ１−Ｔ＿Ｗ１５６＊
MetCysGlyIleLeuAlaValLeuGlyCysSerAspAspSerGlnAlaLysArgValArgValLeuGluLeuSerArgArgLeuLysHisArgGlyProAspTrpSerGlyLeuTyrGlnHisGlyAspCysTyrLeuAlaHisGlnArgLeu
AlaIleValAspProAlaSerGlyAspGlnProLeuPheAsnGluAspLysThrIleValValThrValAsnGlyGluIleTyrAsnHisGluGlnLeuArgLysGlnMetProAspHisLysPheArgThrGlySerAspCysAspValIleAlaHisLeuTyrGluGluHisGlyGluAspPheValAspMetLeuAspGlyIlePheAlaPheValLeuLeuAspThrArgAspAsnSerPheLeuValAlaArgAspAlaIleGlyIleThrSerLeuTyrIleGlyTrpGlyLeuAspGlySerValSTOP
配列番号 ２３−ＡＳＮ５−Ｓ停止変異体のＤＮＡ配列：ＡＳＮ５−Ｓ＿Ｑ６６＊
atgtgtggaatcttggctttgttgggttgttcagatgattctcaggccaaaagggttcgagttcttgagctctctcgcaggcaggttgaagcatcgtggaccagattggagtgggatatatcaacatggtgatttttacttagcacatcaacgtttagcaattatcgatcctgcttctggtgatcagcctctgtttaattaagataagacgattgttgttacagtaggtcaatggagagatttacaatcatgagaaacttcgtaatcttatgcctaatcacaagttcagaactggaagtgattgtgatgttattgcacatcttgtagtatgaagaatatggagaaaattttgtggacatgttggatggggtgttctcttttgtattgttggatacgcgcgataacagctttcttgctgctcgtgatgcaattggaattactcccctatatattggttggggacttgatggtaggctctgtgtggatttcatctgagctaaaaggattaaatggtgactgtgaacattttgaagttttccctcccggtcacttgtactcgagcaagaatggcgggtttaggagatggtacaatcctcaatggttctctgaggctattccatcaaatccttacgaccccttagttttgagacgtgccttcgaaaatgtaggctgttatcaaacgattgatgaccgatgtcccctttggtgttctgctctccgggggacttgattcgtctttggttgcttctgtcactgctcgctacttggctggaacaaaagctgctaagcaatggggagcacagcttcattccttctgtgttggtctcgaggtagggctcaccagatctcaaggctgcaagagaagttgctgactatttgggaaccgttcaccacgagttcaccttcacagttcaggtaggatggaattgatgctattgaagatgttatttaccatatcgagacatacgatgtaacaacgatcagagcaagcactcctatgttccttatgtcgcgtaagattaaatcactgggagttaagatggtcatatcaggggaaggctcagatgaactgtttggcggctatttgtacttccacaaggctccgaacaaggaagaattccatgtggagacatgtcacaaggtagataaaagcgcttcaccaatacgactgtttgagagcaaataaggcaacatcagcatggggcttagaagctagagtaccatttctggataaagagttcatcaacgttgctatgagtatcgatcctgaatggaagatggtagattaaacacgatcatggtaggatcgagaagtgggttcttaggaaggcttttgatgatgaggagcaaccctatctcccaaaggtagcatattctgtaccggcagaaagaacaattcagtgatggcgtaggctatagttggatcgatggactcaaagcacatgctgaacaacatgtaggtgactgataggatgatgcttaatgctgcacatatcttccctcacaacactccaactacaaaggaagcatactattacaggatgattttcgagaggttcttcccacaggtagaattcagcaaggctaactgttcctggaggaccgagtatagcttgcagcacagctaaagctattgagtgggatgcttcgtggtcgaacaaccttgatccttccggtagggctgcaatcggtgtacataactcggcttatgacgatcatctccccgatgttggtaatgggaatttggacacaacgatcatcgataatgtgccgaggatggtaggagtgggtgctgctgcagagctcacaataaggagc
配列番号 ２４−ＡＳＮ５−Ｓ停止変異体のアミノ酸配列：ＡＳＮ５−Ｓ＿Ｑ６６＊
MetCysGlyIleLeuAlaLeuLeuGlyCysSerAspAspSerGlnAlaLysArgValArgValLeuGluLeuSerArgArgLeuLysHisArgGlyProAspTrpSerGlyIleTyrGlnHisGlyAspPheTyrLeuAlaHisGlnArgLeuAlaIleIleAspProAlaSerGlyAspGlnProLeuPheAsnSTOP

Claims (15)

  1. アスパラギンシンテターゼの発現または活性を低減させた、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体、またはその部分であって、前記アスパラギンシンテターゼが、
    （ｉ） 配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性、または配列番号３、もしくは配列番号５、もしくは配列番号７に対して少なくとも７２％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリヌクレオチド配列、または
    （ｉｉ） （ｉ）に記載したポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、または
    （ｉｉｉ） 配列番号２、もしくは配列番号４、もしくは配列番号６、もしくは配列番号８に対して少なくとも７８％の配列同一性を持つポリペプチドを、含むか、それから成るか、もしくはそれから実質的に成り、
    （ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）に記載したアスパラギンシンテターゼの前記発現または活性が、対照植物体と比べて低減された、前記突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体、またはその部分。
  2. 前記植物体が、制御領域に、または前記アスパラギンシンテターゼをコードするポリヌクレオチドのコード配列に、少なくとも一つの遺伝子改変を含む、請求項１に記載の突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体、またはその部分。
  3. 前記アスパラギンシンテターゼの前記低減された発現または活性が、前記突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体、またはその部分由来の乾燥処理または乾燥済みの葉におけるアスパラギンのレベルを、前記対照植物体由来の乾燥処理または乾燥済みの葉におけるアスパラギンのレベルと比べて低減させ、そこで好適には、前記アスパラギンのレベルを、前記対照植物体と比べて少なくとも約１７％低減させ、および／または
    前記アスパラギンシンテターゼの前記低減された発現または活性が、前記突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体、またはその部分由来の乾燥処理または乾燥済みの葉を加熱または燃焼させる際に生成するエアロゾル中のアクリルアミドのレベルを、前記対照植物体由来の乾燥処理または乾燥済みの葉と比べて低減させ、そこで好適には、エアロゾル中の前記アクリルアミドのレベルを、前記対照植物体の乾燥処理または乾燥済みの葉と比べて少なくとも２０％低減させ、および／または
    前記突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体、またはその部分由来の乾燥処理または乾燥済みの葉における前記アスパラギンのレベルが、前記対照植物体の乾燥処理または乾燥済みの葉よりも少なくとも約２２％少なく、前記突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体、またはその部分由来の乾燥処理または乾燥済みの葉を加熱または燃焼させる際に生成するエアロゾル中の前記アクリルアミドの量が、前記対照植物体のエアロゾルよりも少なくとも２４％少なく；そこで好適には、前記突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体、またはその部分由来の乾燥処理または乾燥済みの葉における前記アスパラギンのレベルが、前記対照植物体の乾燥処理または乾燥済みの葉と比べて少なくとも約４４％少なく、前記突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体、またはその部分由来の乾燥処理または乾燥済みの葉を加熱または燃焼させる際に生成するエアロゾル中の前記アクリルアミドの量が、前記対照植物体のエアロゾルと比べて少なくとも６６％少なく；そこで好適には、前記突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体、またはその部分由来の乾燥処理または乾燥済みの葉における前記アスパラギンのレベルが、前記対照植物体の乾燥処理または乾燥済みの葉と比べて少なくとも約７０％少なく、前記突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体、またはその部分由来の乾燥処理または乾燥済みの葉を加熱または燃焼させる際に生成するエアロゾル中の前記アクリルアミドの量が、前記対照植物体のエアロゾルと比べて少なくとも約８８％少ない、請求項１または２に記載の突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体、またはその部分。
  4. 前記突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体、またはその部分由来の乾燥処理または乾燥済みの葉におけるニコチンのレベルが、前記対照植物体の乾燥処理または乾燥済みの葉におけるニコチンのレベルと実質的に同じであり、および／または
    グルタミン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸が、前記突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体、またはその部分由来の乾燥処理または乾燥済みの葉において、前記対照植物体の乾燥処理または乾燥済みの葉と比べてより多く形成され、および／または
    前記植物体が、好ましくは、たばこまたは茶から成る群から選択され、
    前記たばこ植物体が、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）のたばこ植物体であり、好ましくはバーレータイプのタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）のたばこ植物体である、請求項１〜３のいずれかに記載の突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体、またはその部分。
  5. 前記植物体が、（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）に記載した前記アスパラギンシンテターゼをコードするポリヌクレオチド配列の各コピーにおいて、少なくともの一つの突然変異、好適には、前記アスパラギンシンテターゼをコードするＲＮＡ転写物の翻訳を妨げる停止変異および／または遺伝子断片を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体、またはその部分。
  6. 前記アスパラギンシンテターゼヌクレオチド配列が、停止変異をコードするヌクレオチド配列を、配列番号１９、配列番号２１、および配列番号２３における前記停止変異をコードするヌクレオチド配列の位置に相当する位置で含むか、または前記アスパラギンシンテターゼが、終止コドンをコードするヌクレオチド配列を、配列番号２０、配列番号２２、および配列番号２４における前記終止コドンの位置に相当する位置で含む、請求項１〜５のいずれかに記載の突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体、またはその部分。
  7. 前記アスパラギンシンテターゼが、配列番号１９、配列番号２１、および配列番号２３から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含むか、または配列番号１９、配列番号２１、および配列番号２３から成る群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるか、または配列番号２０、配列番号２２、および配列番号２４に記載したポリペプチド配列を含むか、それから成るか、もしくはそれから実質的に成り、および／または
    前記突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体、またはその部分の植物体由来の葉のバイオマス量が、前記対照植物体由来の葉のバイオマス量と実質的に同じである、請求項１〜６のいずれかに記載の突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体、またはその部分。
  8. 前記葉が空気乾燥処理され、そこで好適には、前記空気乾燥処理済みの葉は、日光乾燥処理もしくは火力乾燥処理されているか；または前記葉が空気乾燥され、そこで好適には、前記空気乾燥済みの葉は、日光乾燥もしくは火力乾燥されている、請求項３〜７のいずれかに記載の突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体、またはその部分。
  9. 請求項１〜８のいずれかに記載の植物体由来の植物材料、または乾燥処理もしくは乾燥済みの植物材料。
  10. 請求項１〜８のいずれかに記載の植物体または請求項９に記載の植物材料の少なくとも一部分を含む、植物産物。
  11. 植物材料であって、対照植物体由来の植物材料と比べて、アスパラギンのレベルが低減し、かつ前記植物材料由来のエアロゾル中のアクリルアミドのレベルが低減した前記植物材料の調製方法であって、前記方法が、
    （ａ） アスパラギンシンテターゼをコードし、かつ配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性、または配列番号３、もしくは配列番号５、もしくは配列番号７に対して少なくとも７２％の配列同一性を持つ配列を、含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリヌクレオチドを含む、植物体またはその部分を提供する工程と、
    （ｂ） 前記植物体またはその部分において、前記ポリヌクレオチドの発現、またはそれによってコードされるタンパク質の活性を低減させる工程と、
    （ｃ） 前記植物体またはその部分由来の植物材料を収穫する工程と、
    （ｄ） 前記植物材料を乾燥または乾燥処理する工程と、
    （ｅ） 任意選択的に、前記植物体もしくはその部分における前記アスパラギンのレベルを測定する、および／または前記植物体もしくはその部分由来のエアロゾル中の前記アクリルアミドのレベルを測定する工程と、
    （ｆ） 乾燥処理または乾燥済みの植物材料であって、アスパラギンのレベルが低減し、かつ前記植物材料由来のエアロゾル中のアクリルアミドのレベルが低減した、前記乾燥処理または乾燥済みの植物材料を取得する工程と、を含み、好適には、ニコチンのレベルが、前記対照植物体におけるニコチンのレベルと実質的に同じであり；好適には、グルタミン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸が、前記対照植物体の乾燥処理または乾燥済みの葉と比べてより多く形成される、前記方法。
  12. 前記植物材料が、収穫後、少なくとも約３日間の間、乾燥処理もしくは乾燥され、および／または
    前記植物材料が空気乾燥処理され、好適には、前記空気乾燥処理済みの葉が日光乾燥処理もしくは火力乾燥処理されるか、または前記植物材料が空気乾燥もしくは日光乾燥もしくは火力乾燥される、請求項１１に記載の方法。
  13. 請求項１１または１２に記載の方法によって得られるか、または得ることが可能な植物材料。
  14. 対照植物体と比べて、アスパラギンのレベルが低減し、かつ乾燥処理または乾燥済み植物材料由来のエアロゾル中のアクリルアミドのレベルが低減した植物材料の生成方法であって、前記方法が、
    （ａ） 請求項１〜８のいずれかに記載の植物体、または請求項９に記載の植物材料を提供する工程と、
    （ｂ） 前記植物体由来の植物材料を収穫する工程と、
    （ｃ） 前記植物材料をある期間の間、乾燥処理または乾燥する工程と、
    （ｄ） 乾燥処理または乾燥済み植物材料であって、アスパラギンのレベルが低減し、かつ前記乾燥処理または乾燥済み植物材料由来のエアロゾル中のアクリルアミドのレベルが低減した、前記乾燥処理または乾燥済み植物材料を得る工程と、を含み、好適には、ニコチンのレベルが、前記対照植物体におけるニコチンのレベルと実質的に同じであり；好適には、グルタミン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸が、前記対照植物体と比べてより多く形成される、前記方法。
  15. 請求項９または１３に記載の植物材料を含むたばこ製品または喫煙物品。
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