JP2018186820A - ニコチアナ・タバカムからのイソプロピルリンゴ酸シンターゼならびにその方法および使用 - Google Patents

ニコチアナ・タバカムからのイソプロピルリンゴ酸シンターゼならびにその方法および使用 Download PDF

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Abstract

【課題】ショ糖エステル組成物が調節され、植物への望ましくない影響が最小限にされた植物の提供。
【解決手段】変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物細胞であって、(i)イソプロピルリンゴ酸シンターゼをコードするポリヌクレオチド；または(ii)前記ポリヌクレオチド(単数または複数)によってコードされるポリペプチド;または(iii)特定の配列もしくはその配列に少なくとも60%の配列同一性を有するポリペプチド；または(iv)前記ポリヌクレオチド配列(単数または複数)を含む構築物、ベクターもしくは発現ベクターであって、場合により、特定の配列もしくはそれに少なくとも約60%の同一性を示すそのバリアントを含むか、それからなるか、または本質的にそれからなるプロモーターまたはトリコームプロモーターをさらに含む前記構築物、ベクターもしくは発現ベクターを含む前記細胞。
【選択図】図４

Description

本発明は、ニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum)からのイソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子ならびにそのバリアント、ホモログおよび断片を開示する。特に、植物、例えばタバコ植物においてショ糖エステル組成物を改変するための、この遺伝子の発現またはそれによってコードされるタンパク質の活性の改変が開示される。
ショ糖エステルは、植物において殺虫特性を有することが広く認められており、アブラムシ、ダニ、フタホシナシキジラミおよび白ハエを含む軟体昆虫に対して毒性を示すばかりでなく、抗菌活性も示す。ショ糖エステルはまた、フレーバー前駆体としても考えられ、植物の生存中に葉の表面に蓄積される。ショ糖エステルは安定な化合物であり、乾燥材料および喫煙材料において同定することができる。エステル化された低分子カルボン酸は、加熱によってショ糖エステルから放出される。これらの低分子カルボン酸は強力なフレーバー分子であり、タバコのオリエンタルフレーバーの原因の一部であると考えられている。ショ糖エステルは、植物の腺毛状突起細胞において産生される。腺毛状突起細胞はまた、他の葉浸出物、例えばタンパク質(フィロプラニン)およびジテルペン化合物(センブレノイドおよびラブデノイド(labdenoid))の合成の場所でもある。ショ糖エステルのもととなるショ糖およびそのショ糖にエステル化される低分子カルボン酸は2つの異なる代謝区画によって産生される。
タバコ変種は、その葉の表面に存在するショ糖エステルの量と質が異なる。一般則として、鉄管乾燥バーレー種およびMaryland種は炭素鎖長5までのアシル基を有する少量のショ糖エステルを蓄積するが、大部分のオリエンタル種および多くの葉巻タバコタイプは、炭素鎖長6までのアシル基を有する大量のショ糖エステルを蓄積し、より低い程度で炭素鎖長7のアシル基を有するエステルを観察することができる。タバコ変種間で産生されるショ糖エステルにおいて観察される二叉分枝は、その機能性対立遺伝子に関してBMVSE(β-メチルバレリル含有ショ糖エステル)、その非機能性対立遺伝子に関してbmvseと呼ばれる単一の優勢遺伝子座に関連づけられる。BMVSEゲノム遺伝子座は、タバコの染色体Aに位置している。
Kroumova and Wagner (2009) General and Applied Plant Physiology 35, 3-4, p95-110 は、二本鎖干渉RNAを用いてイソプロピルリンゴ酸シンターゼ発現をノックダウンする逆遺伝学アプローチを用いる、種々の植物におけるショ糖エステルアシル基含量を変化させる試みを記載している。この研究において、cDNAからの遺伝子の一部を増幅するために、ソラナム・ペンネリ(Solanum pennellii)からのイソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子が用いられた。次いで、それらは、センスおよびアンチセンス配向で二本鎖干渉RNA構築物に導入され、ニコチアナ・タバカムT.I. 1068、ニコチアナ・グルチノサ(Nicotiana glutinosa)cv. 24aおよびS.ペンネリ(S.pennellii)にアグロバクテリウム(Agrobacterium)によって形質転換された。N.タバカム(N.tabacum)植物を用いて得られた結果により、非形質転換対照と比較して、β-メチルバレリル-アシル化の低下および2-メチルブチリル-アシル化の増加による糖エステルのアシル基存在量における少しの変化が示された。しかしながら、得られたN.タバカム植物は表現型に障害を受けていた。なぜなら、それらは白化しており、一部は巻き上がった葉を有していたからである。同様に、形質転換したN.グルチノサ(N.グルチノサ)およびS.ペンネリ植物は表現型に障害を受けていた。該著者らは、イソプロピルリンゴ酸シンターゼは重要な酵素であり、その欠陥は恐らく病的な植物をもたらすであろうと結論している。
ショ糖エステルの組成物が調節されると同時に、植物への望ましくない影響が最小限にされた植物が当該技術分野で求められている。この必要性を満たすことが本発明の目的である。
本発明は、少なくとも一部分において、ニコチアナ・タバカムからのイソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子の活性または発現の調節が、ショ糖エステル組成物に変化をもたらすが、植物の全体的な代謝に望ましくない影響を及ぼさないという驚くべき発見に基づく。影響のほとんどが、植物のトリコームおよび二次代謝に集中している。従って、ニコチアナ・タバカムからのイソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子の活性または発現の調節は、対照植物と比較して、植物の視覚的外観の改変を実質的にもたらさない。このことは、好都合である。なぜなら、植物は種々の製品の商業生産に利用されることができるが、視覚的外観の改変が、その産業に許容されないと考えられるか、または容認できない収穫量の低下をもたらす恐れがあるからである。好都合には、タバコから生じるエアゾールのフレーバープロフィールは、新規なフレーバープロフィールを生み出すことができるように改変されることができる。さらに、ショ糖エステルプロフィールが改変された植物の害虫抵抗性は改変されることができる。薬物、食品添加剤、喫煙風味剤などにおける種々の目的のために、また有機農薬の成分として、ショ糖エステル組成物を植物から抽出することができる。
本発明の側面および実施形態
本発明の側面および実施形態は、添付の特許請求の範囲に記載されている。
第1の側面において、イソプロピルリンゴ酸シンターゼをコードし、かつ配列番号1もしくは配列番号10もしくは配列番号12もしくは配列番号14に少なくとも60%の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる、単離されたポリヌクレオチドが提供される。
他の側面において、前記ポリヌクレオチドによってコードされる単離されたポリペプチドが提供される。
他の側面において、配列番号2もしくは配列番号11もしくは配列番号13もしくは配列番号15に少なくとも60%の配列同一性を有する単離されたポリペプチドが提供される。
単離されたポリヌクレオチド配列を含む構築物、ベクターもしくは発現ベクターであって、場合により、配列番号8に示す配列もしくはそれに少なくとも約60%の同一性を示すそのバリアントを含むか、それからなるか、または本質的にそれからなるプロモーターまたはトリコームプロモーターまたは天然に存在するイソプロピルリンゴ酸シンターゼプロモーターをさらに含む前記構築物、ベクターもしくは発現ベクター。
他の側面において、配列番号8またはそれに少なくとも約60%の同一性を示すそのバリアントを含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる単離されたポリヌクレオチドが提供される。
他の側面において、変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物細胞であって、前記ポリヌクレオチドの少なくとも1つ、前記ポリペプチドの少なくとも1つまたは本発明の構築物、ベクターもしくは発現ベクターを含む前記細胞が提供される。
他の側面において、本発明の植物細胞を含む変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物が提供される。
他の側面において、植物の一部分においてショ糖エステルの量を調節する方法であって、(i)植物においてイソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性を調節する段階であって、好ましくは、イソプロピルリンゴ酸シンターゼが本明細書に記載のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を含む前記段階；(ii)段階(i)で得られた変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物の少なくとも一部分においてショ糖エステルの量を測定する段階；および(iii)変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物を同定する段階であって、前記植物中のショ糖エステルの量が、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性が調節されていない対照植物と比較して変化しており、好ましくは、前記変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物の視覚的外観が対照植物と実質的に同じである前記段階を含む前記方法が提供される。
他の側面において、本方法によって得られるか、または得ることができる変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物が提供される。
他の側面において、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性が調節されていない対照植物と比較して、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現またはそれによってコードされるタンパク質の活性が調節され、植物の少なくとも一部分がショ糖エステル組成物の変化を有する変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物であって、前記植物の視覚的外観が対照植物と実質的に同じである前記変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物が提供される。
他の側面において、植物からの細胞または組織を含むバイオマス、種子または葉を含む植物材料が提供される。
他の側面において、本発明に記載の植物または植物材料の一部分を含むタバコ製品が提供される。
他の側面において、ショ糖エステル組成物を製造する方法であって、(i)本発明の変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物の少なくとも一部分、植物材料またはタバコ製品を提供する段階；(ii)それらから(例えば1以上の)ショ糖エステルを抽出する段階；および(iii)場合により、抽出されたショ糖エステルを精製する段階を含む前記方法が提供される。
前記方法によって得られるか、または得ることができるショ糖エステル組成物もまた提供される。
適切には、1以上のショ糖エステルは図5に示す構造(式中R3はアセチルもしくは水素であり、好ましくはアセチルであり；R1、R2およびR4の1以上は6炭素を有する少なくとも1つのアシル鎖を含み、好ましくはβ-メチルバレリルを含み；R5はアセチルもしくは水素であり、好ましくは水素である)を有する。
適切には、1以上のショ糖エステルは、図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はプロピオニルもしくはその異性体であり、R2はプロピオニルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである);または図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はプロピオニルもしくはその異性体であり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はバレリルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである);または図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はブチリルであり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである)(C2C14:0);図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はプロピオニルもしくはその異性体であり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである);または図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はバレリルもしくはその異性体であり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はバレリルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである);または図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はブチリル(butyrl)であり、R2はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである)(C2C15:0);図5に示す一般構造を有するショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はバレリルもしくはその異性体であり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素原子もしくはアセチル部分のいずれかである)(C2C16:0);または図5に示す一般構造を有するショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はプロピオニルもしくはその異性体であり、R2はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素原子もしくはアセチル部分のいずれかである)(C2C16:0);図5に示す一般構造を有するショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はバレリルもしくはその異性体であり、R2はヘキサノイルであり、R4はヘキサノイルであり、R5は水素原子もしくはアセチル部分のいずれかである)(C2C17:0);または図5に示す一般構造を有するショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はヘキサノイルであり、R2はヘキサノイルであり、R4はヘキサノイルであり、R5は水素原子もしくはアセチル部分のいずれかである)(C2C18:0)またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。
適切には、1以上のショ糖エステルは、図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はプロピオニルもしくはその異性体であり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである);または図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はバレリルもしくはその異性体であり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はバレリルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである);または図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はブチリルであり、R2はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである)(C2C15:0);図5に示す一般構造を有するショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はバレリルもしくはその異性体であり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素原子もしくはアセチル部分のいずれかである)(C2C16:0);または図5に示す一般構造を有するショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はプロピオニルもしくはその異性体であり、R2はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素原子もしくはアセチル部分のいずれかである)(C2C16:0);図5に示す一般構造を有するショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はバレリルもしくはその異性体であり、R2はヘキサノイルであり、R4はヘキサノイルであり、R5は水素原子もしくはアセチル部分のいずれかである)(C2C17:0);または図5に示す一般構造を有するショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はヘキサノイルであり、R2はヘキサノイルであり、R4はヘキサノイルであり、R5は水素原子もしくはアセチル部分のいずれかである)(C2C18:0)またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。
他の側面において、タバコまたはタバコ製品のフレーバーを調節する方法であって、(i)タバコもしくはタバコ製品に、本明細書に記載の変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物からの植物の一部分、好ましくは葉または植物材料であって、好ましくはニコチニア属に属する前記変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物または植物材料を加えること；または(ii)タバコもしくはタバコ製品に、本明細書に記載の方法によって得られるか、または得ることができるβ-メチルバレリル含有ショ糖エステルを含む組成物を加えることを含む前記方法が提供される。
他の側面において、β-メチル吉草酸を製造する方法であって、(i)変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物の少なくとも一部分、植物材料またはタバコ製品を提供する段階；(ii)段階(i)で提供される材料またはその抽出物を加水分解する段階；および(iii)場合によりβ-メチル吉草酸を単離または精製する段階を含む前記方法が提供される。適切には、前記植物はタバコ植物であり、例えばニコチアナ(Nicotiana)属またはニコチアナ・タバカム種の植物である。
適切には、植物の視覚的外観は対照植物と実質的に同じである。適切には、畑移植3ヶ月後または摘心36日後に、植物の視覚的外観は対照植物と実質的に同じであり、好ましくは、畑移植3ヶ月後または摘心36日後に、変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物の幹の高さは対照植物の幹の高さと実質的に同じであり、かつ／または、畑移植3ヶ月後または摘心36日後に、変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物のクロロフィル含量は対照植物のクロロフィル含量と実質的に同じである。他の実施形態において、以下の特性：変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物の成熟度、植物あたりの葉の数、幹の高さ、葉の着生角度、葉のサイズ(幅および長さ)、節間距離、葉身中肋比および葉の色、のいずれか1つ以上が畑移植3ヶ月後または摘心36日後に、対照植物と実質的に同じである。
さらなる側面は、植物(単数または複数)からの細胞または組織を含むバイオマス、種子または葉に関する。本明細書においては、これらは植物の一部分またはバイオマス、種子もしくは葉を含むタバコ製品として記載される。
本方法によって同定されるかまたは同定されることができるタバコ材料は、本開示の他の側面においても提供される。
植物の害虫抵抗性は調節することができる。
本発明のさらなる側面を以下に述べる。
1以上の調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含むキメラ遺伝子。
少なくとも15〜30ヌクレオチド、30〜50ヌクレオチド、50〜100ヌクレオチド、100〜150ヌクレオチド、150〜200ヌクレオチド、200〜300ヌクレオチド、300〜400ヌクレオチド、400〜500ヌクレオチド、500〜600ヌクレオチド、600〜700ヌクレオチド、700〜1000ヌクレオチド、1000〜1300ヌクレオチド、1300〜1500ヌクレオチドまたは1500〜1900ヌクレオチドを含むか、それからなるか、または本質的にそれからなるイソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチド構築物。
本発明に記載の植物材料、バイオマス、種子または葉を組み込むかまたは用いる消費財。
本発明に記載の単離されたポリヌクレオチド、キメラ遺伝子、ポリヌクレオチド構築物、二本鎖RNA、コンジュゲートまたは発現ベクターなどを含む細胞または細胞株。
細胞において、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現またはそれによってコードされるタンパク質の活性を調節する方法であって、本明細書に記載のキメラ遺伝子、ポリヌクレオチド構築物、二本鎖RNA、コンジュゲートまたは発現ベクターを投与することを含む前記方法。
イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドを単離するか、増幅するか、または解析する方法であって、ポリヌクレオチドを含む試料を提供する段階および、本発明に記載の単離されたヌクレオチド配列からの少なくとも10連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子に前記ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる段階を含む前記方法。
植物の少なくとも一部分、例えば葉において、ショ糖エステル含量を調節するための、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現またはそれによってコードされるタンパク質の活性を調節する薬剤の使用。
一実施形態において、薬剤は、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ核酸、キメライソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子、イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド構築物、アンチセンスRNA、二本鎖RNA、cDNA、イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドとそれに共有結合した少なくとも1つの非ヌクレオチドもしくは非ポリヌクレオチド部分を含むコンジュゲート、リボザイム、突然変異原、ジンクフィンガー、小分子またはメガヌクレアーゼであるか、またはそれ由来である。
他の実施形態において、ポリヌクレオチド断片(単数または複数)は、アンチセンス核酸、リボザイム、スプライソソーム媒介トランススプライシングを行うRNA、干渉RNA(RNAi)、ガイドRNAまたは他の非翻訳RNAなどをコードする。他の実施形態において、ポリヌクレオチド断片(単数または複数)はRNAiをコードする。
他の側面は、タバコ製品を製造する方法であって、(a)本明細書に記載の変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物から種子を得る段階；(b)種子をまき、植物に成長させる段階；(c)植物を収穫する段階；および(d)採取した植物からタバコ製品を製造する段階を含む前記方法に関する。
前述の側面のそれぞれの実施形態として前記の実施形態が開示される。
葉浸出物に関して測定されたショ糖エステル異性体の概算値を示す図である。bmvseタバコ変種Hicks Broadleaf(HBL)およびBMVSEタバコ変種Red Russian(RR)からの緑葉ディスクのアセトン/メタノール洗浄液において測定を行う。外部標準としてオクタアセチルショ糖を添加して量を推定する。各変種に対してn=4である。C2C12:0は図5に示す(飽和)ショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はブチリルであり、R2はプロピオニルもしくはその異性体であり、R4はバレリルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである);または図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はアセチル、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はバレリルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである)を含む。C2C13:0は図5に示す(飽和)ショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はブチリルであり、R2はブチリルであり、R4はバレリルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである);または図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はブチリルであり、R2はプロピオニルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである);または図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はブチリルであり、R2はプロピオニルもしくはその異性体であり、R4はバレリルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである)を含む。C2C14:0は、図5に示す(飽和)ショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はプロピオニルもしくはその異性体であり、R2はプロピオニルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである);または図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はプロピオニルもしくはその異性体であり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はバレリルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである);または図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はブチリルであり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである)を含む。C2C15:0は図5に示す(飽和)ショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はプロピオニルもしくはその異性体であり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである);または図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はバレリルもしくはその異性体であり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はバレリルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである);または図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はブチリルであり、R2はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである)を含む。C2C16:0は、図5に示す一般構造を有する(飽和)ショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はバレリルもしくはその異性体であり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素原子もしくはアセチル部分のいずれかである);または図5に示す一般構造を有するショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はプロピオニルもしくはその異性体であり、R2はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素原子もしくはアセチル部分のいずれかである)を含む。C2C17:0は、図5に示す(飽和)ショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はバレリルもしくはその異性体であり、R2はヘキサノイルであり、R4はヘキサノイルであり、R5は水素原子もしくはアセチル部分のいずれかである)を含む。C2C18:0は、図5に示す(飽和)ショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はヘキサノイルであり、R2はヘキサノイルであり、R4はヘキサノイルであり、R5は水素原子もしくはアセチル部分のいずれかである)を含む。 分子量で選別した主要なショ糖エステル異性体と、ショ糖エステル含有β-メチルバレリルエステルを産生するかまたは産生しないタバコ変種におけるそれらの存在を示す図である。それぞれC5およびC6として示した2および3-メチルブチリルまたは3および4メチルバレリルエステルの間に違いはない。アシル組成物を定義するために、以下の命名法を用いる。例えば、C2C4C4C5とは、それぞれ、R3、R1、R2およびR4におけるアシル基の炭素数のことをいう。C2はアセチルであることができる;C3はブチリルであることができる;C4はプロピオニルもしくはその異性体またはイソブチリル(isobutyrl)であることができる；C5はバレリル(ペンタノイル)もしくはその異性体または2-メチルブチリルまたはイソバレリルまたはイソペンテノイルまたはペンテノイルであることができる;C6はヘキサノイルもしくはその異性体または2-メチルバレリルまたはβ-メチルバレリルまたは4-メチルバレリルであることができる。アセチルまたは水素、適切には水素は、R5に存在することができる(図示せず)。 分枝鎖アミノ酸合成経路と、ショ糖にエステル化されるアシル鎖の形成を示す図である。枠で囲った段階は、炭素鎖が、縮合異性化および脱炭酸の各サイクルについて炭素一個分伸びるコア分枝鎖アミノ酸合成経路を表す。1:アセト乳酸合成酵素[2.2.1.6];2:アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ[1.1.1.86];3:3,4-ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ[4.2.1.9];4:分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ[2.6.1.42];5:分岐鎖ケト酸脱水素酵素複合体(BCKD)([1.2.4.4][2.3.1.168][1.8.1.4]);6:イソプロピルリンゴ酸シンターゼ[2.3.3.13];7:イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ[4.2.1.33];8:イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ[1.1.1.85];9:トレオニンデアミナーゼ[4.3.1.19].C4:イソブタノイルエステル;iC5:3-メチル-ブチリルエステル(イソバレリルエステル);aiC5:2-メチルブチリルエステル(アンテイソバレリルエステル);iC6:4-メチルバレリルエステル(イソカプロイルエステル);aiC6:3-メチル-バレリルエステル(アンテイソカプロイルエステル)、β-メチルバレリルエステル、BMV)。カルボン酸は中性型で示すが、名称は可溶型も反映する。提案されたIPMS2によって触媒される段階は円で囲まれている。 分枝鎖アミノ酸合成経路と、ショ糖にエステル化されるアシル鎖の形成を示す図である。枠で囲った段階は、炭素鎖が、縮合異性化および脱炭酸の各サイクルについて炭素一個分伸びるコア分枝鎖アミノ酸合成経路を表す。1:アセト乳酸合成酵素[2.2.1.6];2:アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ[1.1.1.86];3:3,4-ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ[4.2.1.9];4:分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ[2.6.1.42];5:分岐鎖ケト酸脱水素酵素複合体(BCKD)([1.2.4.4][2.3.1.168][1.8.1.4]);6:イソプロピルリンゴ酸シンターゼ[2.3.3.13];7:イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ[4.2.1.33];8:イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ[1.1.1.85];9:トレオニンデアミナーゼ[4.3.1.19].C4:イソブタノイルエステル;iC5:3-メチル-ブチリルエステル(イソバレリルエステル);aiC5:2-メチルブチリルエステル(アンテイソバレリルエステル);iC6:4-メチルバレリルエステル(イソカプロイルエステル);aiC6:3-メチル-バレリルエステル(アンテイソカプロイルエステル)、β-メチルバレリルエステル、BMV)。カルボン酸は中性型で示すが、名称は可溶型も反映する。提案されたIPMS2によって触媒される段階は円で囲まれている。 分枝鎖アミノ酸合成経路と、ショ糖にエステル化されるアシル鎖の形成を示す図である。枠で囲った段階は、炭素鎖が、縮合異性化および脱炭酸の各サイクルについて炭素一個分伸びるコア分枝鎖アミノ酸合成経路を表す。1:アセト乳酸合成酵素[2.2.1.6];2:アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ[1.1.1.86];3:3,4-ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ[4.2.1.9];4:分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ[2.6.1.42];5:分岐鎖ケト酸脱水素酵素複合体(BCKD)([1.2.4.4][2.3.1.168][1.8.1.4]);6:イソプロピルリンゴ酸シンターゼ[2.3.3.13];7:イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ[4.2.1.33];8:イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ[1.1.1.85];9:トレオニンデアミナーゼ[4.3.1.19].C4:イソブタノイルエステル;iC5:3-メチル-ブチリルエステル(イソバレリルエステル);aiC5:2-メチルブチリルエステル(アンテイソバレリルエステル);iC6:4-メチルバレリルエステル(イソカプロイルエステル);aiC6:3-メチル-バレリルエステル(アンテイソカプロイルエステル)、β-メチルバレリルエステル、BMV)。カルボン酸は中性型で示すが、名称は可溶型も反映する。提案されたIPMS2によって触媒される段階は円で囲まれている。 形質転換細胞植物の表面葉浸出物におけるショ糖テトラエステル存在量の概算値を示す図である。独立した形質転換事象から得られる1か月齢の再生植物から葉を採取する。2.5ng/mg新鮮重の割合で内部標準(オクタアセチルショ糖)を加える。各ショ糖エステルに特異的なイオンに関して記録した面積を内部標準面積との比でプロットする。内部標準シグナルの面積に対する比は、葉の新鮮重に対するシグナルの正規化を可能にする。本明細書で呈示するショ糖エステル命名法を図2に示す。A:親変種K326の葉浸出物組成物(鉄管乾燥、n=3)およびトリコーム特異的プロモーター制御下で配列番号1を発現する形質転換細胞；B:親変種K326の葉浸出物組成物およびウイルスプロモーター制御下で配列番号1を発現する形質転換細胞；C:親変種Basmaの葉浸出物組成物(Oriental、n=4)およびトリコーム特異的プロモーター制御下で配列番号9RNAi構築物を発現する形質転換細胞;ならびに、D:親変種Basmaの葉浸出物組成物およびウイルスプロモーター制御下で配列番号9RNAi構築物を発現する形質転換細胞である。C2C14:0は、図5に示す(飽和)ショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はプロピオニルもしくはその異性体であり、R2はプロピオニルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである);または図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はプロピオニルもしくはその異性体であり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はバレリルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである);または図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はブチリルであり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである)を含む。C2C15:0は図5に示す(飽和)ショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はプロピオニルもしくはその異性体であり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである);または図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はバレリルもしくはその異性体であり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はバレリルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである);または図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はブチリルであり、R2はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである)を含む。C2C16:0は、図5に示す一般構造を有する(飽和)ショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はバレリルもしくはその異性体であり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素原子もしくはアセチル部分のいずれかである);または図5に示す一般構造を有するショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はプロピオニルもしくはその異性体であり、R2はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素原子もしくはアセチル部分のいずれかである)を含む。C2C17:0は、図5に示す(飽和)ショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はバレリルもしくはその異性体であり、R2はヘキサノイルであり、R4はヘキサノイルであり、R5は水素原子もしくはアセチル部分のいずれかである)を含む。C2C18:0は、図5に示す(飽和)ショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はヘキサノイルであり、R2はヘキサノイルであり、R4はヘキサノイルであり、R5は水素原子もしくはアセチル部分のいずれかである)を含む。 ショ糖エステル足場の構造を示す図である。R1〜R5は、水素原子かまたはエステル結合に結合したアシル部分のいずれかである。 ショ糖エステルにエステル化されたアシル鎖を示す図である。R’はショ糖分子を表す。1.アセチル、2.ブチリル、3.プロピオニル、4.イソブチリル、5.バレリル(ペンタノイル)、6.2-メチル-ブチリル、7.イソバレリル、8.イソペンテノイル、9.ペンテノイル、10.ヘキサノイルもしくはその異性体11.2-メチルバレリル、12、β-メチルバレリル、13.4-メチルバレリル。これらの異性体および誘導体もまた考えられる。従って、例として、異性体は、プロピオニルの異性体、例えばイソブチリルであることができる。さらなる例として、異性体は、バレリル(ペンタノイル)の異性体、例えば2-メチルブチリルまたはイソバレリルであることができ、二重結合を有するバレリル(ペンタノイル)の異性体、例えばイソペンテノイルまたはペンテノイルであることができる。さらなる例として、異性体はヘキサノイルの異性体、例えば2-メチルバレリル、β-メチルバレリルまたは4-メチルバレリルであることができる。異性体は、1以上の二重結合を含むこともできるし、含まないこともできる。
定義
本願の範囲内で用いられる技術用語および表現には、一般に、植物および分子生物学の関連技術において一般に用いられている意味と同じ意味がそれらに付与されるものとする。以下の用語の定義のすべては、本願の全内容に適用される。語”含んでいる(comprising)”は、他の要素または段階を排除せず、不定冠詞”ある(a)”または”ある(an)”は、複数であることを排除しない。個々の段階は、特許請求の範囲に記載のいくつかの特徴の機能を満たすことができる。所定の数値または数値範囲との関係において、用語”約”、”本質的に”および”おおよそ”は、所定の数値または範囲の20%以内、10%以内、または5%、4%、3%、2%もしくは1%以内である数値または範囲のことを言う。
用語”単離された”は、その天然の環境から取り出された任意の実体のことを言うが、この用語は精製度のことを意味するものではない。
”ベクター”は、核酸、核酸構築物および核酸コンジュゲートなどの輸送を可能にするための核酸成分の組み合わせを含む核酸ビヒクルのことを言う。適切なベクターは、染色体外複製が可能なエピゾーム、例えば環状二本鎖核酸プラスミド;線状化二本鎖核酸プラスミド;および任意の起源の他のベクターを含む。
”発現ベクター”は、核酸、核酸構築物および核酸コンジュゲートなどの発現を可能にするための核酸成分の組み合わせを含む核酸ビヒクルである。適切な発現ベクターは、染色体外複製が可能なエピゾーム、例えば環状二本鎖核酸プラスミド;線状化二本鎖核酸プラスミド;および任意の起源の他の機能的に同等な発現ベクターを含む。発現ベクターは、少なくとも、下記で定義する、核酸、核酸構築物または核酸コンジュゲートの上流に位置し、それに作動可能に連結されたプロモーターを含む。
用語”構築物”とは、1以上のポリヌクレオチドを含む二本鎖組換え核酸断片のことを言う。構築物は、相補的”センス鎖またはコード鎖”と塩基対を形成する”鋳型鎖”を含む。所定の構築物は、ベクター内、例えば発現ベクター内に位置するプロモーターの配向に対して2つの可能な配向、同じ(もしくはセンス)配向または逆(もしくはアンチセンス)配向のいずれかでベクターに挿入されることができる。例示的な構築物を配列番号9に示す。
”プロモーター”とは、一般的に二本鎖核酸断片の上流に位置し、それに作動可能に連結された核酸エレメント/配列のことを言う。プロモーターは、天然の目的遺伝子に隣接する領域に完全に由来することもできるし、異なる天然プロモーターまたは合成核酸セグメント由来の異なるエレメントで構成されることもできる。例示的なプロモーターを配列番号8に示す。
用語”相同性、同一性または類似性”は、配列のアラインメントによって比較された、2つのポリペプチド間または2つの核酸分子間の配列類似度を指す。比較される2つの別々の核酸配列間の相同性は、相当する位置における同一のまたはマッチングするヌクレオチド数の関数である。同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算によって計算できる。あるいはまた、2つの核酸配列の同一性パーセントは、コンピュータプログラム、例えばClustalW、ClustalX、BLAST、FASTAまたはSmith-Watermanを用い、配列情報を比較することによって決定することもできる。
用語”植物”とは、その生活環または発生の任意の段階における任意の植物およびその子孫のことを言う。一実施形態において、植物は、ニコチアナ(Nicotiana)属に属する植物であるタバコ植物である。タバコ植物の好ましい種、栽培品種、雑種および変種は本明細書に記載されている。
”植物細胞”とは、植物の構造的および生理学的単位のことを言う。該植物細胞は、細胞壁のないプロトプラスト、単離された単一細胞または培養された細胞の形態であることもできるし、限定するものではないが、植物組織、植物器官または全植物などの高度に組織化された単位の一部であることもできる。
用語”植物材料”とは、バイオマス、葉、葉身、中骨、茎、根、花もしくは花部、果実、花粉、卵細胞、接合子、種子、挿し木、分泌物、抽出物、細胞もしくは組織培養物または植物の任意の他の部分もしくは産物を含む、植物から入手される任意の固体、液体もしくは気体組成物またはそれらの組み合わせのことを言う。一実施形態において、植物材料は、バイオマス、種子または葉を含むかまたはそれからなる。他の実施形態において、植物材料は、葉を含むかまたはそれからなる。
用語”変種”は、同じ種の他の植物とを隔てる共通の特性を有する植物の集団のことを言う。1以上の特有の形質を有すると同時に、変種はさらに、その変種内の個体間の大変小さな全般的な変異を特徴とする。変種は、多くの場合市販されている。
本明細書において、用語”系統”または”育種系統”とは、植物育種を通じて用いられる一群の植物を意味する。系統は、他の形質に関して個体間で何らかの変異を示す場合があるが、対象とする1以上の形質に関して個体間でほとんど変異を示さないため、変種とは区別できる。
用語”調節する”とは、ポリペプチドの活性を低下させるか、抑制するか、増加させるか、または別なふうに影響を与えることを指すことができる。この用語はまた、ポリペプチドをコードする遺伝子の活性を低下させるか、抑制するか、増加させるか、または別なふうに影響を与えることを指すことができ、この用語は、限定するものではないが、転写活性を調節することを含むことができる。
本明細書において、用語”低下する”または”低下した”は、ある量またはある活性、例えば限定するものではないが、ポリペプチド活性、転写活性、および／またはタンパク質発現の約10%〜約99%の低下または少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%もしくは少なくとも100%以上の低下のことを言う。
本明細書において、用語”抑制する”または”抑制した”は、ある量またはある活性、例えば限定するものではないが、ポリペプチド活性、転写活性および／もしくはタンパク質発現の約98%〜約100%の低下または少なくとも98%、少なくとも99%の低下、特に100%の低下のことを言う。
本明細書において、用語”増加する”または”増加した”は、ある量またはある活性、例えば限定するものではないがポリペプチド活性、転写活性および／もしくはタンパク質発現の約10%〜約99%の増加または少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも100%、少なくとも150%または少なくとも200%以上の増加のことを言う。
対照植物または対照植物細胞という文脈において、用語”対照”は、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性が改変されていない(例えば増加または低下されていない)植物または植物細胞を意味し、従って、対照は、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性が改変された植物との比較を提供することができる。対照植物は空ベクターを含むことができる。対照植物は野生型植物に一致することができる。
発明の詳細な説明
一側面において、ポリヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなり、配列表に示したポリヌクレオチドのいずれかを含む本明細書に記載の配列のいずれかに少なくとも60%の配列同一性を有する単離されたポリヌクレオチドが提供される。適切には、単離されたポリヌクレオチドは、それに少なくとも60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95% 96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。
一側面において、イソプロピルリンゴ酸シンターゼをコードし、かつ配列番号1に少なくとも60%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる、単離されたポリヌクレオチドが提供される。適切には、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号1に少なくとも60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95% 96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。
他の側面において、イソプロピルリンゴ酸シンターゼをコードし、かつ配列番号10に少なくとも60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95% 96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる、単離されたポリヌクレオチドが提供される。
他の側面において、イソプロピルリンゴ酸シンターゼをコードし、かつ配列番号12に少なくとも60%、61%、62%、63%、64%、65%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95% 96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる、単離されたポリヌクレオチドが提供される。
他の側面において、イソプロピルリンゴ酸シンターゼをコードし、配列番号14に少なくとも60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95% 96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる、単離されたポリヌクレオチドが提供される。
他の側面において、配列番号8に少なくとも60%、61%、62%、63%、64%、65%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95% 96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる単離されたポリヌクレオチドが提供される。配列番号8は好ましいプロモーターをコードする。
用語”ポリヌクレオチド”は、未改変または改変デオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)であることができるヌクレオチドのポリマーのことを言う。従って、ポリヌクレオチドは、限定するものではないが、ゲノムDNA、相補的DNA(cDNA)、mRNAもしくはアンチセンスRNAまたはそれらの断片(単数または複数)であることができる。さらに、ポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖DNA、一本鎖領域と二本鎖領域の混合物である核酸、DNAおよびRNAを含むハイブリッド分子または一本鎖領域と二本鎖領域を混合して有するハイブリッド分子もしくはそれらの断片(単数または複数)であることができる。さらに、ポリヌクレオチドは、DNA、RNAもしくは両方またはそれらの断片(単数または複数)を含む三本鎖領域から構成されることができる。ポリヌクレオチドはホスホチオアートなどの1以上の修飾塩基を含むことができ、ペプチド核酸(PNA)であることができる。一般に、ポリヌクレオチドは、単離もしくはクローニングされたcDNA断片、ゲノムDNA、オリゴヌクレオチドもしくはヌクレオチドまたはそれらの組み合わせからアセンブルされることができる。本明細書に記載のポリヌクレオチド配列はDNA配列で示されているが、該配列は、それらの対応するRNA配列および、それらの逆相補鎖を含むそれらの相補的(例えば完全に相補的な)DNAまたはRNA配列を含む。
用語”イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチド”は、ニコチアナ・タバカムからのイソプロピルリンゴ酸シンターゼ(IMPS)をコードするポリヌクレオチドを含み、配列番号1、配列番号10、配列番号12または配列番号14に実質的相同性(すなわち配列類似性)または実質的同一性を有するポリヌクレオチドを含むか、それからなるか、または本質的にそれからなるポリヌクレオチド；配列番号1、配列番号10、配列番号12または配列番号14の配列に少なくとも約60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95% 96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するポリヌクレオチドバリアント；配列番号1、配列番号10、配列番号12または配列番号14の断片を含むポリヌクレオチドの断片；および配列番号1、配列番号10、配列番号12または配列番号14の断片であって、それらに実質的相同性(すなわち配列類似性)または実質的同一性を有し、配列番号1、配列番号10、配列番号12または配列番号14の対応する断片に少なくとも約60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95% 96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する前記断片を含む。イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドはまた、イソプロピルリンゴ酸シンターゼとして機能するポリペプチドをコードする配列番号1、配列番号10、配列番号12または配列番号14に十分なまたは実質的な程度の同一性または類似性を含む配列を含む。一実施形態において、用語”イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチド”は、本明細書において配列番号1、配列番号10、配列番号12または配列番号14で示すポリヌクレオチドを含むか、それからなるか、または本質的にそれからなるヌクレオチドのポリマーのことを言う。
本明細書に記載のポリヌクレオチドは、一般にホスホジエステル結合を含むが、場合によっては、例えばホスホルアミダート、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアートまたはO-メチルホスホロアミダイト結合を含む代わりの主鎖；ならびにペプチドポリヌクレオチド主鎖および結合を有するポリヌクレオチドアナログが含まれる。他のアナログポリヌクレオチドは、陽性主鎖;非イオン性主鎖および非リボース主鎖を有するものを含む。リボース-リン酸骨格の改変は、種々の理由によって、例えば、生理学的環境におけるこのような分子の安定性および半減期を増すために、あるいはバイオチップ上のプローブとして行うことができる。天然に存在するポリヌクレオチドとアナログの混合物を作成することができる。あるいはまた、種々のポリヌクレオチドアナログの混合物ならびに天然に存在するポリヌクレオチドとアナログの混合物を作成することができる。
種々のポリヌクレオチドアナログ、例えば、ホスホルアミダート、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、O-メチルホスホロアミダイト結合を含むアナログならびにペプチドポリヌクレオチド主鎖および結合を含むアナログが既知である。他のアナログポリヌクレオチドは、陽性主鎖、非イオン性主鎖および非リボース主鎖を有するものを含む。1以上の炭素環式糖を含むポリヌクレオチドもまた含まれる。
他のアナログは、ペプチドポリヌクレオチドアナログであるペプチド核酸を含む。これらの主鎖は、天然に存在するポリヌクレオチドの高度に荷電したホスホジエステル主鎖とは対照的に、中性条件下では実質的に非イオン性である。これによって利点をもたらすことができる。第1に、ペプチドポリヌクレオチド主鎖は、改善されたハイブリダイゼーションキネティクスを示すことができる。ペプチド核酸は、ミスマッチ塩基対に対する完全にマッチした塩基対に関して融解温度においてより大きな変化を示す。DNAとRNAは、一般的には、内部ミスマッチ1つに対して融解温度の2〜4℃の低下を示す。非イオン性ポリヌクレオチド主鎖に関しては、この低下は7〜9℃に近い。同様に、それらの非イオン性の性質のため、これらの主鎖に結合した塩基のハイブリダイゼーションは、塩濃度に比較的非感受性である。さらに、ペプチド核酸は、細胞酵素によって分解されないか、またはより低い程度でしか分解されず、従ってより安定であることができる。
開示されたポリヌクレオチドおよびそれらの断片の組み合わせの使用には、核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおけるプローブまたは核酸増幅アッセイにおけるプライマーとしての断片の使用がある。このような断片は、一般に、少なくとも約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20以上のDNA配列の連続ヌクレオチドを含む。他の実施形態において、DNA断片は、少なくとも約10、15、20、30、40、50または60以上のDNA配列の連続ヌクレオチドを含む。これらの技術はまたBMVSEおよびbmvse植物を同定するためにも用いることができる。なぜなら、本明細書において、ショ糖エステルの産生には機能性イソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子が必要であることが示されているからである。イソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子の遺伝子マーカーおよび対立遺伝子の検出は、植物によるショ糖エステル産生の予測変数として用いることができる。このような試験は、植物変種を追跡するためか、または喫煙品質もしくはバッチタイプ均一性を予測するために用いることができる。従って、一側面において、本明細書に記載のイソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドを検出する方法であって、前記ポリヌクレオチドを特異的に検出または特異的に増幅することができるか、または増幅された前記ポリヌクレオチドを特異的に検出または特異的に増幅することができるプローブまたはプライマーの使用を含む前記方法が提供される。他の側面において、ショ糖エステルを産生することができる植物を同定する方法であって、(a)目的植物からの核酸を含む試料を提供する段階；および(b)本明細書に記載のイソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドの存在を測定する段階であって、前記植物における前記ポリヌクレオチドの存在が、前記植物がショ糖エステルを産生することができることを示す前記段階を含む前記方法が提供される。イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドの少なくとも一部を特異的に検出するための1以上のプライマーまたはプローブを含む、イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドの少なくとも一部分を検出するためのキットもまた提供される。該キットは、ポリヌクレオチドの増幅、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のための試薬または核酸プローブハイブリダイゼーション検出技術、例えばサザンブロット、ノーザンブロット、in situハイブリダイゼーションまたはマイクロアレイのための試薬を含むことができる。該キットは、抗体結合検出技術、例えばウェスタンブロット、ELISA、SELDI質量分析法またはテストストリップなどの試薬を含むことができる。該キットは、DNA配列決定のための試薬を含むことができる。該キットは、ショ糖エステル含量を測定するための試薬および／または使用説明書を含むことができる。いくつかの実施形態において、キットは、開示された方法の1以上のための使用説明書を含むことができる。開示されたキットは、遺伝的同一性の決定、系統発生の研究、遺伝子型決定、ハプロタイプ解析、系統解析または植物育種、特に共優性スコアリングを有する植物育種に有用であることができる。本方法およびキットは、BMVSE変種とbmvse変種との間の交雑による育種アプローチおよび子孫における植物に基づく選択に有用であることができる。一般的には、BMVSE産生変種に存在した機能性イソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子領域を示す植物またはbmvse非産生変種に存在した機能不全イソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子領域を示す植物が選択される。
ハイブリダイゼーション条件の選択に影響をおよぼす基本的パラメータおよび適切な条件を工夫するための手引きは、Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)に記載されている。遺伝コードの知識を本明細書に記載のアミノ酸配列と組み合わせて用い、縮重オリゴヌクレオチドのセットを作成することができる。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、それによってDNA断片が単離され増幅されるPCRにおけるプライマーとして有用である。特定の実施形態において、遺伝子ライブラリーのためのプローブとして縮重プライマーを用いることができる。このようなライブラリーは、限定するものではないが、cDNAライブラリー、ゲノムライブラリーを含み、電子化した発現配列タグまたはDNAライブラリーさえも含む。次いで、この方法によって同定された相同配列は、本明細書において同定された配列のホモログを同定するためのプローブとして用いられる。
本明細書に記載のポリヌクレオチド(単数または複数)に、低ストリンジェントな条件下で、一般的には中程度のストリンジェントな条件下で、通常は高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド(例えばプライマーまたはプローブ)の潜在的使用もまた存在する。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響をおよぼす基本的パラメータおよび適切な条件を工夫するための手引きは、Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)に記載されており、当業者は、例えば、ポリヌクレオチドの長さまたは塩基組成に基づいて、容易に決定することができる。
中程度のストリンジェントな条件を達成するための1つの方法は、5xクエン酸緩衝液(Standard Sodium Citrate)、0.5%ドデシル硫酸ナトリウム、1.0mMエチレンジアミン四酢酸(pH8.0)を含有する予洗液、約50%ホルムアミド、6xクエン酸緩衝液のハイブリダイゼーション緩衝液を用い、ハイブリダイゼーション温度は約55℃(または他の同様なハイブリダイゼーション溶液、例えば約50%ホルムアミドを含有する溶液、約42℃のハイブリダイゼーション温度)、洗浄条件は、約60℃で0.5xクエン酸緩衝液、0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを用いることを含む。一般に、高ストリンジェントな条件は、上記と同じハイブリダイゼーション条件で、おおよそ68℃で0.2xクエン酸緩衝液、0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを用いて洗浄することと定義される。ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄用緩衝液において、クエン酸緩衝液(1xクエン酸緩衝液は0.15M塩化ナトリウムおよび15mMクエン酸ナトリウムである)の代わりにSSPE(1x SSPEは0.15M塩化ナトリウム、10mMリン酸ナトリウムおよび1.25mMエチレンジアミン四酢酸(pH7.4)である)を用いることができる；ハイブリダイゼーション完了後、洗浄は15分間行われる。当業者に公知のように、さらに下記に記載されるように(例えば、Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. を参照のこと)、ハイブリダイゼーション反応および二本鎖の安定性を支配する基本原理を適用することによって、所望のストリンジェンシーの程度を達成するために、必要に応じて洗浄温度および洗浄塩濃度を調整することができることが理解されるべきである。未知の配列の標的ポリヌクレオチドにポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる場合、ハイブリッド長さは、ハイブリダイズするポリヌクレオチドの長さと仮定される。既知の配列のポリヌクレオチドがハイブリダイズされる場合、ポリヌクレオチドの配列をアラインメントし、最適の配列相補性の領域(単数または複数)を同定することによってハイブリッド長さを決定することができる。長さ50塩基対未満と予想されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、そのハイブリッドの融解温度よりも5〜10℃低くする必要がある。融解温度は、下記方程式に従って決定される。長さ18塩基対未満のハイブリッドに関しては、融解温度(℃)=2(A+T塩基数)+4(G+C塩基数)である。長さ18塩基対以上のハイブリッドに関しては、Tm(℃)=81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(%G+C)-(600/N)である(式中、Nはハイブリッドの塩基数であり、[Na+]は、ハイブリダイゼーション緩衝液(1xクエン酸緩衝液に関して[Na+]=0.165M)のナトリウムイオン濃度である)。一般的には、このようなハイブリダイズするポリヌクレオチドのそれぞれは、それがハイブリダイズするポリヌクレオチドの長さの少なくとも25%(一般に少なくとも50%、60%、または70%であり、通常は少なくとも80%である)の長さを有し、それがハイブリダイズするポリヌクレオチドに少なくとも60%(例えば、少なくとも65％、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%)の配列同一性を有する。
当業者には当然のことながら、線状DNAは2つの可能な配向を有する。5'から3'の方向および3'から5'の方向である。例えば、同じポリヌクレオチド分子/鎖内で参照配列が5’から3’の方向に配置され、第2配列が5’から3’の方向に配置される場合、参照配列と第2配列は同じ方向に配向しているか、または同じ配向を有する。一般的には、所定のプロモーターの制御下にあるプロモーター配列および目的遺伝子は、同じ配向で配置される。しかしながら、同じポリヌクレオチド分子/鎖内で、参照配列が5’から3’の方向に配置され、第2配列が3'から5'の方向に配置される場合、参照配列と第2配列はアンチセンス方向に配向しているか、またはアンチセンス配向を有する。参照配列(5'から3'の方向)と参照配列(5'から3'に配置される参照配列)の逆相補配列が同じポリヌクレオチド分子/鎖内に配置される場合、互いにアンチセンス配向を有する2つの配列は、同じ配向であるか、あるいは同じ配向を有すると記載されることができる。本明細書に記載の配列は、5’から3’の方向に示されている。
本明細書で提供される組換え構築物は、イソプロピルリンゴ酸シンターゼタンパク質発現レベルを調節するために、植物または植物細胞を形質転換するのに用いることができる。組換えポリヌクレオチド構築物は、植物または細胞内でイソプロピルリンゴ酸シンターゼポリペプチドを発現するのに適した調節領域に作動可能に連結された本明細書に記載のイソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。従って、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のイソプロピルリンゴ酸シンターゼポリペプチドをコードするコード配列を含むことができる。
組換えポリヌクレオチドによってコードされるイソプロピルリンゴ酸シンターゼポリペプチドは、天然イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリペプチドであることもできるし、その細胞に対して異種であることもできる。場合によっては、組換え構築物は、調節領域に作動可能に連結されたイソプロピルリンゴ酸シンターゼ調節ポリペプチドの発現を低下させるかまたは抑制するポリヌクレオチドを含む。適切な調節領域の例は本明細書に記載されている。
組換えポリヌクレオチド構築物、例えば本明細書に記載の組換えポリヌクレオチド構築物を含むベクターもまた提供される。適切なベクターバックボーンは、例えば、当該技術分野でルーチンに用いられるベクターバックボーン、例えばプラスミド、ウイルス、人工染色体、BAC、YACまたはPACを含む。適切な発現ベクターは、限定するものではないが、例えば、バクテリオファージ、バキュロウイルスおよびレトロウイルス由来のプラスミドベクターおよびウイルスベクターを含む。多数のベクターおよび発現系が市販されている。
また、ベクターは、例えば、複製起点、足場付着領域またはマーカーを含むこともできる。マーカー遺伝子は植物細胞に選択表現型を付与することができる。例えば、マーカーは、殺生物剤耐性、例えば抗生物質(例えば、カナマイシン、G418、ブレオマイシンもしくはハイグロマイシン)または除草剤(例えば、グリホサート、クロルスルフロンもしくはホスフィノスリシン)への耐性を付与することができる。さらに、発現ベクターは、発現されたポリペプチドの操作または検出(例えば精製または位置決め)を容易にするように設計されたタグ配列を含むことができる。タグ配列、例えばルシフェラーゼ、β-グルクロニダーゼ(GUS)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)、ポリヒスチジン、c-mycまたは赤血球凝集素配列は、一般的には、コードされるポリペプチドとの融合体として発現される。このようなタグは、カルボキシル末端またはアミノ末端のいずれかを含むポリペプチド内の任意の位置に挿入されることができる。
植物または植物細胞は、安定的に形質転換されるようにそのゲノムに組み込まれた組換えポリヌクレオチドを有することによって形質転換されることができる。安定的に形質転換された細胞は、一般的には、各細胞分裂に際して導入されたポリヌクレオチドを保持する。また、植物または植物細胞は、組換えポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれないで一過性に形質転換されることができる。一過性に形質転換された細胞は、一般的には、各細胞分裂に際して、導入された組換えポリヌクレオチドの全部または一部を失うため、十分な細胞分裂回数後には、導入された組換えポリヌクレオチドは娘細胞において検出することができない。
植物細胞を形質転換するために、粒子銃、遺伝子銃技術、アグロバクテリウムによる形質転換、ウイルスベクターを用いた形質転換およびエレクトロポレーションを含む多くの方法が当該技術分野で利用でき、それらはすべて本明細書に組み込まれる。植物染色体への異種DNAの組み込みのためのアグロバクテリウム(Agrobacterium)系は、植物遺伝子工学のために、大規模に研究され、改変され、活用されている。センス配向またはアンチセンス配向で、調節配列に作動可能に連結された、目的精製タバコタンパク質に対応する核酸配列を含むネイキッド(naked)組換え核酸分子は、慣用法によって、適切なT-DNA配列に結合される。これらは、ポリエチレングリコール技術またはエレクトロポレーション技術(これらはいずれも標準技術である)によってタバコプロトプラストに導入される。あるいはまた、目的精製タンパク質をコードする組換え核酸分子を含むこのようなベクターは、生きたアグロバクテリウム細胞に導入され、次いでそれはその植物細胞に該核酸を導入する。T-DNAベクター配列を伴わないネイキッドDNAによる形質転換は、エレクトロポレーションによって、タバコプロトプラストと核酸含有リポソームとの融合によって達成されることができる。T-DNAベクター配列を伴わないネイキッドDNAはまた、不活性高速マイクロプロジェクタイルによってタバコ細胞を形質転換するために用いることもできる。
形質転換のためのレシピエント組織として細胞または培養組織が用いられる場合、必要に応じて、当業者に公知の技術によって、形質転換培養物から植物が再生されることができる。
組換え構築物に含まれる調節領域の選択は、限定するものではないが、効率、選択可能性、誘導能、所望の発現レベルおよび細胞または組織選択的発現を含むいくつかの要素に左右される。コード配列に対して調節領域を適切に選択し、配置することによってコード配列の発現を調節することは、当業者にはルーチン化した事柄である。ポリヌクレオチドの転写も同様にして調節することができる。一部の適切な調節領域は、特定の細胞型において、転写のみを、または主に転写を開始する。植物ゲノムDNAにおける調節領域を同定し特徴付ける方法は当該技術分野で公知である。
適切なプロモーターは、種々の組織もしくは細胞型(例えば、根特異的プロモーター、苗条特異的プロモーター、木部特異的プロモーター)において存在するか、または種々の発生段階において存在するか、または種々の環境条件に応じて存在する組織特異的因子によって認識される組織特異的プロモーターを含む。適切なプロモーターは、特定の誘導因子を必要としないで大部分の細胞型において活性化されることができる構成的プロモーターを含む。イソプロピルリンゴ酸シンターゼRNAiポリペプチド産生を調節するための適切なプロモーターの例は、カリフラワーモザイクウイルス35S(CaMV/35S)、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、nos、ユビキチンまたはファゼオリンプロモーターを含む。当業者は、組換えプロモーターの複数の変異を作成することができる。
組織特異的プロモーターは、栄養組織または生殖組織などにおいて植物の発生の特定の時期に特定の細胞または組織にのみ活性な転写調節エレメントである。組織特異的発現は、例えば、特定の組織におけるポリヌクレオチドの発現が好ましい場合に好都合であることができる。発生制御下での組織特異的プロモーターの例は、特定の組織、例えば栄養組織(例えば根もしくは葉)、または生殖組織、例えば果実、胚珠、種子、花粉、雌蕊、花もしくは任意の胚組織のみにおいて(または主としてそれのみにおいて)転写を開始することができるプロモーターを含む。生殖組織特異的プロモーターは、例えば、葯特異的、胚珠特異的、胚特異的、胚乳特異的、珠皮特異的、種子および種皮特異的、花粉特異的、花弁特異的、萼片特異的またはそれらの組み合わせであることができる。
適切な葉特異的プロモーターは、C4植物(トウモロコシ)からのピルビン酸正リン酸ジキナーゼ(PPDK)プロモーター、トウモロコシからのcab-m1Ca+2プロモーター、アラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)myb関連遺伝子プロモーター(Atmyb5)、リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ(RBCS)プロモーター(例えば、トマトRBCS1、RBCS2およびRBCS3A遺伝子は葉および光照射下種苗において発現され、RBCS1およびRBCS2は発育中のトマト果実において発現され、あるいはリブロースビスリン酸カルボキシラーゼプロモーターは、葉身および葉鞘における葉肉細胞にほぼ限定的に高レベルで発現される)を含む。
適切な老化特異的プロモーターは、果実成熟、葉の老化および離脱に際して活性なトマトプロモーター、システインプロテアーゼをコードする遺伝子のトウモロコシプロモーターを含む。適切な葯特異的プロモーターを用いることができる。当業者に公知の適切な根優先的プロモーターを選択することができる。適切な種子選択的プロモーターは、種子特異的プロモーター(種子貯蔵タンパク質のプロモーターなどの、種子形成中に活性なプロモーター)および種子発芽プロモーター(種子発芽中に活性なプロモーター)の両方を含む。このような種子優先的プロモーターは、限定するものではないが、Cim1(サイトカイニン誘導性メッセージ);cZ19B1(トウモロコシ19kDaゼイン)；milps(ミオイノシトール-1-リン酸シンターゼ);mZE40-2(別名Zm-40);nuclc;およびcelA(セルロースシンターゼ)を含む。γ-ゼインは胚乳特異的プロモーターである。Glob-1は胚特異的プロモーターである。双子葉植物に関しては、種子特異的プロモーターは、限定するものではないが、マメβ-ファセオリン、ナピン、β-コングリシニン、ダイズレクチン、クルシフェリンなどを含む。単子葉植物に関しては、種子特異的プロモーターは、限定するものではないが、トウモロコシ15kDaゼインプロモーター、22kDaゼインプロモーター、27kDaゼインプロモーター、ガンマ-ゼインプロモーター、27kDa γ-ゼインプロモーター(例えばgzw64Aプロモーター、Genbankアクセッション番号S78780参照)、waxyプロモーター、shrunken 1プロモーター、shrunken 2プロモーター、グロブリン1プロモーター(Genbankアクセッション番号L22344参照)、Itp2プロモーター、cim1プロモーター、トウモロコシend1およびend2プロモーター、nuc1プロモーター、Zm40プロモーター、eep1およびeep2;lec1、チオレドキシンHプロモーター;mlip15プロモーター、PCNA2プロモーター;ならびにshrunken-2プロモーターを含む。
誘導性プロモーターの例は、病原菌攻撃、嫌気性条件、高温、光、干ばつ、冷温または高塩濃度に感受性のあるプロモーターを含む。病原体誘導性プロモーターは、病原体による感染後に誘導される病因関連タンパク質(PRタンパク質)に由来するもの(例えば、PRタンパク質、SARタンパク質、β-1,3-グルカナーゼ、キチナーゼ)を含む。
植物プロモーターに加えて、他の適切なプロモーターは、細菌起源、例えばオクトピンシンターゼプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーターおよびTiプラスミド由来の他のプロモーター由来であることもできるし、ウイルスプロモーター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35Sおよび19S RNAプロモーター、タバコモザイクウイルスの構成的プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)19Sおよび35Sプロモーターまたはゴマノハグサモザイクウイルス35Sプロモーター)由来であることもできる。
用語”イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリペプチド”は、ニコチアナ・タバカムからのイソプロピルリンゴ酸シンターゼ(IPMS)をコードするポリペプチドのことを言い、配列番号2、配列番号11、配列番号13または配列番号15に少なくとも約60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95% 96%、97%、98%、または99%の配列同一性を有するポリヌクレオチドバリアントによってコードされるアミノ酸配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなるポリペプチドバリアント；イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリペプチド(単数または複数)の断片；ならびに配列番号2、配列番号11、配列番号13および配列番号15の対応する断片に少なくとも約60%、65%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95% 96%、97%、98%、99%または100%配列同一性を有する配列番号2、配列番号11、配列番号13または配列番号15の断片を含む。イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリペプチドはまた、イソプロピルリンゴ酸シンターゼとして機能する配列番号2、配列番号11、配列番号13および配列番号15に十分なまたは実質的な程度の同一性または類似性を含む配列を含む。イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリペプチドの断片は、一般的には、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性を保持する。イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリペプチドはまた、任意のタイプの改変(例えば、アミノ酸の挿入、欠失または置換;グリコシル化状態の変化;リフォールディングもしくは異性化、三次元構造または自己会合状態に影響を及ぼす変化)を導入することによって作成されるバリアントおよび変異体を含むが、それらは、なおイソプロピルリンゴ酸シンターゼとして機能する限り、故意に操作されることも、天然から単離されることもできる。イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリペプチドは線状形であることもできるし、公知の方法を用いて環化することもできる。用語”イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリペプチド”は、それに60%、65%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95% 96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する配列番号1、配列番号10、配列番号12もしくは配列番号14によってコードされるポリペプチドまたは、それに100%の配列同一性を有する配列番号2、配列番号11、配列番号13または配列番号15に示す配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなるポリペプチドを指すこともできる。
他の側面において、配列表に示したポリペプチドのいずれかを含む本明細書に記載の配列のいずれかに少なくとも60%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる単離されたポリペプチドが提供される。適切には、単離されたポリペプチドは、それに少なくとも60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。
ポリペプチドは、任意のタイプの改変(例えば、アミノ酸の挿入、欠失または置換;グリコシル化状態の変化;リフォールディングもしくは異性化、三次元構造または自己会合状態に影響を及ぼす変化)を含むが、それらは故意に操作されることも、天然から単離されることもできる。該バリアントは、サイレント変異を生じ機能的に同等なタンパク質をもたらす改変を有することができる。その物質の二次結合活性が保持されている限り、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および両親媒性における類似性に基づいて人工的なアミノ酸置換を行うことができる。例えば、負に荷電したアミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を含み、正に荷電したアミノ酸はリジンおよびアルギニンを含み、非荷電極性頭部基を有し類似した親水性値を有するアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンを含む。例えば以下の表に従って保存的置換を行うことができる。第2列における同じブロックのアミノ酸、好ましくは第3列における同じラインにおけるアミノ酸を、互いに置換することができる。
Figure 2018186820
ポリペプチドは、成熟タンパク質または未成熟タンパク質または未成熟タンパク質由来のタンパク質であることができる。ポリペプチドは線状形であることもできるし、公知の方法を用いて環化することもできる。ポリペプチドは、一般的には、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30または少なくとも40連続アミノ酸を含む。
他の側面において、イソプロピルリンゴ酸シンターゼをコードし、配列番号2に少なくとも約60%、65%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95% 96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる単離されたイソプロピルリンゴ酸シンターゼポリペプチドが提供される。
他の側面において、イソプロピルリンゴ酸シンターゼをコードし、配列番号11に少なくとも約60%、65%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95% 96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる単離されたイソプロピルリンゴ酸シンターゼポリペプチドが提供される。
他の側面において、イソプロピルリンゴ酸シンターゼをコードし、配列番号13に少なくとも約60%、65%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95% 96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる単離されたイソプロピルリンゴ酸シンターゼポリペプチドが提供される。
他の側面において、イソプロピルリンゴ酸シンターゼをコードし、配列番号15に少なくとも約60%、65%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95% 96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる単離されたイソプロピルリンゴ酸シンターゼポリペプチドが提供される。
ポリペプチド配列の断片、適切には完全長配列の活性を保持する断片もまた本明細書に開示される。
変異ポリペプチドを含む変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物を作成するために変異ポリペプチドを用いることができる。適切には、変異ポリペプチドは未変異ポリペプチドの活性を保持する。変異ポリペプチドの活性は、未変異ポリペプチドよりも高いこともできるし、低いこともできるし、同じであることもできる。
ポリペプチドを発現するのに適切な培養条件下で形質転換細胞または組換え宿主細胞を培養することによってポリペプチドを製造することができる。次いで、公知の精製プロセスを用いて、このような培養物から、その結果発現されたポリペプチドを精製することができる。ポリペプチドの精製は、このポリペプチドに結合する薬剤を含有するアフィニティカラム；このようなアフィニティ樹脂に関する1以上のカラム段階；疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む1以上の段階；またはイムノアフィニティクロマトグラフィーを含むことができる。あるいはまた、ポリペプチドは、精製が容易な形態で発現されることができる。例えば、ポリペプチドは融合ポリペプチド、例えばマルトース結合ポリペプチド、グルタチオン-5-トランスフェラーゼまたはチオレドキシンの融合ポリペプチドとして発現されることができる。融合ポリペプチドの発現および精製のためのキットは市販されている。ポリペプチドは、エピトープでタグをつけ、続いて、このようなエピトープに対する特異的抗体を用いて精製されることができる。ポリペプチドをさらに精製するために、1以上の液体クロマトグラフィー段階、例えば逆相高速液体クロマトグラフィーを用いることができる。実質的に均一な組換えポリペプチドを提供するために、種々の組み合わせでの前述の精製段階の一部または全部を用いることができる。従って、精製されたポリペプチドは、他のポリペプチドを実質的に含まないことができ、本明細書においては、”実質的に精製されたポリペプチド”と定義される。このような精製されたポリペプチドは、ポリペプチド、断片、バリアントなどを含む。ポリペプチドおよび断片の発現、単離および精製は、本明細書に記載の方法を含むがこれに限定されない任意の適切な技術によって達成されることができる。
発現されたポリペプチドをアフィニティ精製するために、アフィニティカラム、例えばポリペプチドに対して作成されたモノクローナル抗体を用いることもできる。これらのポリペプチドは、慣用法を用いて、例えばアフィニティカラムから高塩溶出緩衝液に溶出し、次いで、使用のために低塩緩衝液に透析するか、または使用するアフィニティマトリックスに応じてpHを変えるか、もしくは他の成分に交換するか、または天然に存在する親和性部分の基質を用いて競合的に溶出することができる。
ポリペプチドは、従来の既知の化学合成によっても製造することができる。ポリペプチドまたはその断片を合成手段によって構築する方法は当業者に公知である。合成的に構築されたポリペプチド配列は、天然ポリペプチドと一次構造、二次構造もしくは三次構造特性またはコンホメーション特性を共有することによって、生物活性を含む生物学的特性をそれらと共有することができる。
本明細書において、用語'天然に存在しない'は、天然では生じない、または天然には存在しない実体(例えば、ポリヌクレオチド、遺伝的変異、ポリペプチド、植物、植物細胞および植物材料)を説明する。このような天然に存在しない実体または人工の実体は、本明細書に記載の方法または当該技術分野で公知の方法によって製造され、合成され、開始され、改変され、介在され、または操作されることができる。従って、例として、旧来の植物育種技術(例えば戻し交雑)または遺伝子操作技術(例えばアンチセンスRNA、干渉RNA、メガヌクレアーゼ)などを用いて天然に存在しない植物、天然に存在しない植物細胞または天然に存在しない植物材料を作成することができる。さらなる例として、得られた植物、植物細胞もしくは植物材料またはそれらの子孫が、天然では生じない、または天然には存在しない遺伝子構成(例えばゲノム、染色体またはそれらのセグメント)を含むように、第1植物もしくは植物細胞から第2植物もしくは植物細胞(それ自体が天然に存在することができる)に1以上の遺伝子突然変異(例えば1以上の多型)を遺伝子移入または導入することによって、天然に存在しない植物、天然に存在しない植物細胞または天然に存在しない植物材料を作成することができる。得られた植物、植物細胞または植物材料は、従って、人工の、または天然に存在しないものである。従って、第2植物または植物細胞が第1植物または植物細胞とは異なる遺伝的背景を含む限り、第1の人工のまたは天然に存在する植物または植物細胞の遺伝子配列を改変して、(i)人工の;または(ii)第2植物または植物細胞に天然に存在する、改変遺伝子配列をもたらすことによって、人工のまたは天然に存在しない植物または植物細胞を作成することができる。植物または植物細胞の遺伝的背景における違いは、表現型の違いまたは当該技術分野で公知の分子生物学技術、例えば核酸配列決定、遺伝子マーカー(例えば、マイクロサテライトRNAマーカー)の存否によって検出することができる。
植物において遺伝子発現を増加させるために、ポリヌクレオチドに基づく多くの方法を用いることができる。例えば、植物において遺伝子を過剰発現させることができる上流プロモーターと共に目的遺伝子を含む、形質転換される植物と適合する構築物、ベクターまたは発現ベクターを作成することができる。例示的なプロモーターは本明細書に記載されている。形質転換後に、適切な条件下に成長した場合、プロモーターは、この植物またはその特定の組織内でこの酵素のレベルを調節する(例えば増加させる)ために発現を促進することができる。例示的な一実施形態において、植物において遺伝子を過剰発現させるために、イソプロピルリンゴ酸シンターゼを含むベクターが作成される。該ベクターは、植物のすべての組織においてその発現を促進するために、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子の上流に適切なプロモーターを含む。該ベクターは、形質転換カルスおよび細胞株の選択を付与するために、抗生物質耐性遺伝子を含むこともできる。一実施形態において、該プロモーターは、植物のトリコームにおける転写活性を促進する。一実施形態において、該プロモーターは植物のトリコームにおける転写活性を有する。他の実施形態において、該プロモーターは、植物のトリコームにおいて特異的に転写活性を有するが、植物の任意の他の部分においては、活性を有さないか、または実質的に活性を有さない。適切には、該プロモーターは、配列番号8に示す配列またはトリコームプロモーターまたは天然イソプロピルリンゴ酸シンターゼプロモーターを含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。天然イソプロピルリンゴ酸シンターゼプロモーターは、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子の5’末端に配置される。例えば、配列番号6において、内因性イソプロピルリンゴ酸シンターゼプロモーターはヌクレオチド2826の前に配置される。従って、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子は、植物のトリコームにおいて過剰発現されることができる。驚くべきことに、本発明者らは、トリコーム特異的発現を用いて達成されたレベルと比較して、構成発現はショ糖エステルの高い蓄積をもたらさないことを見出した(図4およびその説明を参照のこと)。
一実施形態によれば、すでにβ-メチルバレリル含有ショ糖エステルを産生することができる植物において、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性が増加され、それによって、その中にイソプロピルリンゴ酸シンターゼの蓄積が増加され、従ってβ-メチルバレリル含有ショ糖エステルの産生が増加される。他の実施形態によれば、すでにβ-メチルバレリル含有ショ糖エステルを産生することができるわけではない植物において、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性が増加され、それによって、その中にイソプロピルリンゴ酸シンターゼが蓄積され、従って、β-メチルバレリル含有ショ糖エステルが産生される。
植物において遺伝子発現を調節するために、アンチセンスRNA、リボザイム指向性RNA切断、転写後遺伝子サイレンシング、例えば、RNA干渉および転写遺伝子サイレンシングを含む、ポリヌクレオチドに基づく多くの方法を使用することができる。このようなアプローチは、古典的には遺伝子発現を低下または抑制するために用いられたが、それらは、発現されるタンパク質の細胞生産性および品質を高めることによって遺伝子発現を増加させるために用いることもできる。このようなアプローチは、アポトーシス関連遺伝子発現、タンパク質グリコシル化関連遺伝子発現、細胞代謝に関与する乳酸脱水素酵素および遺伝子増幅に用いられるジヒドロ葉酸還元酵素のサイレンシングを含むことができる。植物細胞における遺伝子制御を変化させるために、種々の細胞経路に関与する複数の標的を低下させるかまたは抑制するための他のアプローチを行うことができる。
いくつかの実施形態において、完全長ポリヌクレオチドまたはその断片の相補鎖を用いることができる。一般的には、断片は、少なくとも10連続ヌクレオチドであり、例えば、少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、30、35、40、50、80、100、200、500連続ヌクレオチド以上である。一実施形態において、ポリヌクレオチド断片(単数または複数)は発現または活性を低下させることができ、例えば、本明細書に記載のアンチセンス核酸、リボザイム、スプライソソーム媒介トランススプライシングを行うRNA、干渉RNA、ガイドRNAまたは他の非翻訳RNAなどをコードすることができる。他の実施形態において、ポリヌクレオチド断片(単数または複数)は干渉RNAをコードする。
イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性を低下させることができる組成物は、限定するものではないが、1以上の内因性イソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子(単数または複数)の転写に干渉することができる配列特異的ポリヌクレオチド;イソプロピルリンゴ酸シンターゼRNA転写物の翻訳に干渉することができる配列特異的ポリヌクレオチド(例えば、二本鎖RNA、siRNA、リボザイム);イソプロピルリンゴ酸シンターゼタンパク質の安定性に干渉することができる配列特異的ポリペプチド；基質または制御タンパク質に対するイソプロピルリンゴ酸シンターゼタンパク質の酵素活性またはイソプロピルリンゴ酸シンターゼタンパク質の結合活性に干渉することができる配列特異的ポリヌクレオチド；イソプロピルリンゴ酸シンターゼタンパク質に特異性を示す抗体；イソプロピルリンゴ酸シンターゼタンパク質の安定性またはイソプロピルリンゴ酸シンターゼタンパク質の酵素活性またはイソプロピルリンゴ酸シンターゼタンパク質の結合活性に干渉することができる小分子化合物；イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドに結合するジンクフィンガータンパク質；およびイソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドに対する活性を有するメガヌクレアーゼを含む。
アンチセンス技術は、ポリペプチドの発現を調節する(例えば低下させるかまたは抑制する)ために用いることができる公知の方法の1つである。抑制されるポリヌクレオチドがクローニングされ、RNAのアンチセンス鎖が転写されるように調節領域および転写終結配列に作動可能に連結される。次いで、この組換え構築物を植物に形質転換し、RNAのアンチセンス鎖を産生させる。このポリヌクレオチドは、抑制される遺伝子の全配列である必要はないが、一般的には、抑制される遺伝子のセンス鎖の少なくとも一部に実質的に相補的である。
ポリヌクレオチドは、mRNAの発現に影響を及ぼすリボザイムまたは触媒性RNAに転写されることができる。リボザイムは、事実上任意の標的RNAに特異的に対合し、特定の位置でホスホジエステル主鎖を切断し、それによって標的RNAを機能的に不活化するように設計されることができる。異種ポリヌクレオチドは、特定のmRNA転写物を切断するように設計された、従ってポリペプチドの発現を抑制するように設計されたリボザイムをコードすることができる。ハンマーヘッド型リボザイムは特定のmRNAを破壊するのに有用であるが、部位特異的認識配列でmRNAを切断する種々のリボザイムもまた使用することができる。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的mRNAと相補的塩基対を形成する隣接領域によって指定される位置でmRNAを切断する。唯一の必要条件は、標的RNAが5'-UG-3'ヌクレオチド配列を含むことである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および産生は当該技術分野で公知である。in vivoでの切断効率を上げるために、安定なRNA、例えば転移RNAにハンマーヘッド型リボザイム配列を組み込むことができる。
一実施形態において、RNA転写物の翻訳に干渉することができる配列特異的ポリヌクレオチドは干渉RNAである。RNA干渉またはRNAサイレンシングは、特定のmRNAが酵素分解の標的となることができる進化的に保存されたプロセスである。干渉RNA経路を開始するためには、細胞(例えば、二本鎖RNAウイルスまたは干渉RNAポリヌクレオチド)によって、二本鎖RNAが導入されるか、または産生されなければならない。二本鎖RNAは、二本鎖RNA特異的エンドヌクレアーゼであるRNアーゼIIIによって長さ21〜23bpの複数の低分子干渉二本鎖RNAに変換されることができる。続いて、ATP依存プロセスによって低分子干渉RNAの巻き戻しを促進するRNA誘導サイレンシング複合体によって低分子干渉RNAを認識することができる。低分子干渉RNAの巻き戻されたアンチセンス鎖は、低分子干渉RNAアンチセンス鎖に相補的な配列を含む標的mRNAに活性化RNA誘導サイレンシング複合体を導く。標的mRNAとアンチセンス鎖はαへリックスを形成することができ、αへリックスの主溝は活性化RNA誘導サイレンシング複合体によって認識されることができる。標的mRNAは、センス鎖の5’末端の結合部位によって指定される単一部位で活性化RNA誘導サイレンシング複合体によって切断されることができる。活性化RNA誘導サイレンシング複合体は、他の切断事象を触媒するために再使用されることができる。
干渉RNA発現ベクターは、mRNA、プレmRNAまたは関連RNAバリアントの発現レベルを低下させることによってRNA干渉活性を示す干渉RNAポリヌクレオチドをコードする干渉RNA構築物を含むことができる。この発現ベクターは、本明細書でさらに詳細に説明されるように、上流に位置し、干渉RNA構築物に作動可能に連結されたプロモーターを含むことができる。干渉RNA発現ベクターは、適切な最小限のコアプロモーター、対象とする干渉RNA構築物、上流(5')調節領域、下流(3')調節領域(転写終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルを含む)ならびに当業者に公知の他の配列、例えば種々の選択マーカーを含むことができる。
ポリヌクレオチドは、二本鎖構造(すなわちアンチセンス鎖および相補的センス鎖を含む二本鎖RNA分子)、二本鎖ヘアピン様構造または一本鎖構造(すなわち、アンチセンス鎖そのものを含む一本鎖RNA分子)などを含む種々の形態で製造することができる。該構造は、自己相補的センス鎖およびアンチセンス鎖を有する二本鎖、非対称二本鎖、ヘアピンまたは非対称ヘアピン二次構造を含むことができる。二本鎖干渉RNAは、二本鎖低分子干渉RNAに酵素的に変換されることができる。低分子干渉二本鎖RNAの鎖の1つは、標的mRNAおよび関連RNAバリアント内の相補配列にアニーリングすることができる。低分子干渉RNA/mRNA二本鎖は、配列依存的に複数の部位でRNAを切断することができるRNA誘導サイレンシング複合体によって認識され、標的mRNAおよび関連RNAバリアントの分解がもたらされる。
二本鎖RNA分子は、ステムループ構造の単一オリゴヌクレオチドからアセンブルされた低分子干渉RNA分子であって、低分子干渉RNA分子の自己相補的センス領域とアンチセンス領域がポリヌクレオチドベースまたは非ポリヌクレオチドベースリンカー(単数または複数)によって連結された前記低分子干渉RNA分子ばかりでなく、自己相補的センス鎖およびアンチセンス鎖を含む、2以上のループ構造および1つのステムを有する環状一本鎖RNAであって、in vivoまたはin vitroのいずれかでプロセシングされて、干渉RNAを媒介することができる低分子干渉RNA分子を生じることができる前記環状RNAを含むことができる。
本明細書において、低分子ヘアピン型RNA分子の使用もまた考えられる。この分子は、逆相補鎖(センス)配列に加えて、一般的にはスペーサーまたはループ配列によって隔てられた、特定のアンチセンス配列を含む。スペーサーまたはループの切断によって一本鎖RNA分子およびその逆相補鎖が生じ、それらがアニーリングして二本鎖RNA分子を形成する(場合により、一方または両方の鎖の3'末端または5’末端から1、2、3以上のヌクレオチドの添加または除去をもたらす追加の処理段階を含む)。スペーサーは、スペーサーの切断(および、場合により、一方または両方の鎖の3'末端または5’末端から1、2、3、4以上のヌクレオチドの添加または除去をもたらす追加の処理段階)の前に、アンチセンス配列とセンス配列がアニーリングして、二本鎖構造(またはステム)を形成することを可能にする十分な長さのものであることができる。スペーサー配列は、一般的には、二本鎖ポリヌクレオチドにアニーリングさせたときに低分子ヘアピン型RNAを形成する2つの相補的ヌクレオチド配列領域間に位置する類縁性のないヌクレオチド配列である。スペーサー配列は、一般に、約3〜約100ヌクレオチドを含む。
ヘアピン二本鎖を作成するために、適切な配列組成、ループサイズおよびステム長さを選択することによって、任意の目的RNAポリヌクレオチドを作成することができる。ヘアピン二本鎖のステム長さの設計の適切な範囲は、少なくとも約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20ヌクレオチド、例えば約14〜30ヌクレオチド、約30〜50ヌクレオチド、約50〜100ヌクレオチド、約100〜150ヌクレオチド、約150〜200ヌクレオチド、約200〜300ヌクレオチド、約300〜400ヌクレオチド、約400〜500ヌクレオチド、約500〜600ヌクレオチドおよび約600〜700ヌクレオチドのステム長さを含む。ヘアピン二本鎖のループ長さの設計の適切な範囲は、ヘア二本鎖のステム長さがかなりの長さである場合、約4〜25ヌクレオチド、約25〜50ヌクレオチド以上のループ長さを含む。二本鎖RNAまたは一本鎖RNA分子は約15〜約40ヌクレオチド長である。低分子干渉RNA分子は約15〜約35ヌクレオチド長の二本鎖RNAまたは一本鎖RNA分子であることができる。低分子干渉RNA分子は約17〜約30ヌクレオチド長の二本鎖RNAまたは一本鎖RNA分子であることができる。低分子干渉RNA分子は、約19〜約25ヌクレオチド長の二本鎖RNAまたは一本鎖RNA分子であることができる。低分子干渉RNA分子は約21〜約23ヌクレオチド長の二本鎖RNAまたは一本鎖RNA分子であることができる。21ヌクレオチドよりも長い二本鎖領域を有するヘアピン構造は、ループ配列および長さにかかわらず、有効な低分子干渉RNA指向性サイレンシングを促進することができる。
標的mRNA配列は、一般的には、約14〜約50ヌクレオチド長であることができる。従って、標的mRNAは、好ましくは、標的配列のための以下の基準の1以上を満たす約14〜約50ヌクレオチド長の領域をスキャンすることができる：約2:1〜約1:2のA+T/G+C比；標的配列の5’末端におけるAAジヌクレオチドまたはCAジヌクレオチド；標的mRNAに特有な少なくとも10連続ヌクレオチド配列(すなわち、該配列は、同じ植物からの他のmRNA配列に存在しない)；および、3を超える連続グアニン(G)ヌクレオチドまたは3を超える連続シトシン(C)ヌクレオチドの”並び(run)”がないこと。これらの基準は、当該技術分野で公知の種々の技術を用いて評価することができる。例えばBLASTなどのコンピュータプログラムは、選択された標的配列が標的mRNAに特有であるかどうかを決定するために、公に入手可能なデータベースを検索するのに用いることができる。あるいはまた、市販されているコンピュータソフトウェア(例えば、市販のOligoEngine、Target Finderおよびsmall interfering RNA Design Tool)を用いて標的配列(および設計された低分子干渉RNA配列)を選択することができる。
上記基準の1以上を満たす約14〜約30ヌクレオチド長の標的mRNA配列が選択されることができる。あるいは、上記基準の1以上を満たす約16〜約30ヌクレオチド長の標的配列が選択されることができる。上記基準の1以上を満たす約19〜約30ヌクレオチド長の標的配列が選択されることができる。上記基準の1以上を満たす約19〜約25ヌクレオチド長の標的配列が選択されることができる。
低分子干渉RNA分子は、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列のいずれか1つの少なくとも12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30以上の連続ヌクレオチドに相補的な特定のアンチセンス配列を含むことができる。
低分子干渉RNAに含まれる特定のアンチセンス配列は、標的配列の相補鎖と同一であるか、または実質的に同一であることができる。低分子干渉RNA分子に含まれる特定のアンチセンス配列は、標的mRNA配列の相補鎖と少なくとも約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であることができる。配列同一性を決定する方法は当該技術分野で公知であり、例えば、University of Wisconsin Computer Group(GCG)ソフトウェアのBLASTNプログラムか、またはNCBIウェブサイトで提供されているものを用いて決定することができる。
低分子干渉RNA分子の特定のアンチセンス配列は、標的mRNAの配列からの1、2、3、または4以上のヌクレオチドにおいて異なる(例えば、トランジションまたはトランスバージョンを含むヌクレオチド置換によって)ことによって変異性を示すことができる。二本鎖RNA分子のアンチセンス鎖にこのようなヌクレオチド置換が存在する場合、一般的には置換ヌクレオチドが水素結合による塩基対形成を形成する、センス鎖における相補的ヌクレオチドは、相応じて置換されることもできるし、置換されないこともできる。センス配列に1以上のヌクレオチド置換が存在するが、アンチセンス鎖には存在しない二本鎖RNA分子もまた考えられる。前述のように、低分子干渉RNA分子のアンチセンス配列が、低分子干渉RNAのヌクレオチド配列と標的ヌクレオチド配列との間に1以上のミスマッチを含む場合、該ミスマッチは、アンチセンス配列の3'末端、5'末端または中央部分において見出すことができる。
低分子干渉RNA分子は、ストリンジェントな条件下で、天然に存在する標的遺伝子または標的mRNAの一部分に選択的にハイブリダイズすることができる特定のアンチセンス配列を含むことができる。当業者に公知のように、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーの変化は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄段階に用いる溶液の時間、温度または濃度を変えることによって達成することができる。適切な条件は、一部分において、用いられる特定のヌクレオチド配列、例えば標的mRNAまたは遺伝子の配列にも左右される場合がある。
]二本鎖RNAによるサイレンシングを植物に誘導する方法の1つは、ヘアピンRNAを生じる遺伝子構築物での形質転換である(Smith et al. (2000) Nature, 407, 319-320 参照)。このような構築物は、適切なスペーサーによって隔てられた標的遺伝子配列の逆位領域を含む。スペーサー断片としての機能性植物イントロン領域の挿入は、イントロンが挿入されたヘアピンRNAの生成によって、遺伝子サイレンシング誘導の効率をさらに増加させる(Wesley et al. (2001) Plant J., 27, 581-590)。適切には、ステム長さは、約50ヌクレオチド〜長さ約1キロベースである。イントロンが挿入されたヘアピンRNAの作成方法は、当該技術分野で公知である(例えば、Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry (2008) 72, 2, 615-617 参照)。
二本鎖または二本鎖構造、例えば二本鎖RNAまたは低分子ヘアピン型RNAを有する干渉RNA分子は、平滑末端を有することもできるし、3'または5'オーバーハングを有することもできる。本明細書において、”オーバーハング”とは、1つのRNA鎖の3'末端が他の鎖の5'末端を超えて伸びる場合(3'オーバーハング)、またはその逆の場合(5'オーバーハング)の、二本鎖構造から突出する不対ヌクレオチド(単数または複数)のことを言う。オーバーハングを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはそれらの改変バージョンであることができる。一実施形態において、干渉RNA分子の少なくとも1つの鎖は、約1〜約6ヌクレオチド長の3'オーバーハングを有する。他の実施形態において、3'オーバーハングは、約1〜約5ヌクレオチド、約1〜約3ヌクレオチドおよび約2〜約4ヌクレオチド長である。
干渉RNA分子が分子の一端に3'オーバーハングを含む場合、他の末端は平滑末端であることもできるし、オーバーハング(5'または3')を有することもできる。干渉RNA分子が、分子の両末端にオーバーハングを含む場合、そのオーバーハングの長さは同一であることも異なることもできる。一実施形態において、干渉RNA分子は、分子の両末端に約1〜約3ヌクレオチドの3'オーバーハングを含む。他の実施形態において、干渉RNA分子は、分子の両末端に2ヌクレオチドの3'オーバーハングを有する二本鎖RNAである。さらに他の実施形態において、干渉RNAのオーバーハングを含むヌクレオチドはTTジヌクレオチドまたはUUジヌクレオチドである。
標的mRNA配列に対する、1以上のオーバーハングを含む干渉RNA分子のパーセンテージ同一性を決定する場合、オーバーハング(単数または複数)を考慮に入れることもできるし、入れないこともできる。例えば、3'オーバーハングからのヌクレオチドおよび二本鎖の5'または3'末端からの2ヌクレオチドまでは、低分子干渉RNA分子の活性を著しく失なわずに改変されることができる。
干渉RNA分子は1以上の5'または3'キャップ構造を含むことができる。干渉RNA分子は、干渉RNA分子のセンス鎖、アンチセンス鎖もしくはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方の3'末端またはセンス鎖、アンチセンス鎖もしくはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方の5’末端にキャップ構造を含むことができる。あるいはまた、干渉RNA分子は、干渉RNA分子の3'末端および5’末端の両方にキャップ構造を含むことができる。用語”キャップ構造”とは、分子をエキソヌクレアーゼ分解から保護し、細胞内への送達または局在化を容易にすることもできる、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端に組み込まれた化学修飾のことを言う。
干渉RNA分子に適用可能なもう1つの改変は、干渉RNA分子の活性、細胞分布、細胞取り込み、バイオアベイラビリティーまたは安定性を高める1以上の部分またはコンジュゲートの干渉RNA分子への化学結合である。ポリヌクレオチドは、当該技術分野で確立された方法によって合成または改変されることができる。化学改変は、限定するものではないが、2'改変、非天然塩基の導入、リガンドへの共有結合および、リン酸結合のチオリン酸結合への置換を含むことができる。この実施形態において、二本鎖構造の完全性は、少なくとも1つの化学結合、一般的には2つの化学結合によって強化される。化学結合は、種々の公知の技術のいずれか、例えば共役結合、イオン結合または水素結合の導入；疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用またはまたはスタッキング相互作用；金属イオン配位によって、あるいはプリンアナログの使用によって化学結合を達成することができる。
さらに他の実施形態において、2つの一本鎖の1つまたは両方のヌクレオチドは、細胞酵素、例えば限定するものではないが特定のヌクレアーゼの活性化を低下させるかまたは抑制するために改変されることができる。細胞酵素の活性化を低下させるかまたは抑制する技術は、当該技術分野で公知でああり、限定するものではないが、2'-アミノ改変、2'-フルオロ改変、2'-アルキル改変、非荷電主鎖改変、モルホリノ改変、2'-O-メチル改変およびホスホルアミダートを含む。従って、二本鎖RNA上のヌクレオチドの少なくとも1つの2'-ヒドロキシル基は化学基によって置換される。また、少なくとも1つのヌクレオチドは、固定された(locked)ヌクレオチドを形成するように改変されることができる。このような固定されたヌクレオチドは、リボースの2'酸素とリボースの4'炭素とを連結するメチレンまたはエチレン架橋を含む。固定されたヌクレオチドのオリゴヌクレオチドへの導入は、相補配列の親和性を改善し、融解温度を数℃上昇させる。
例えば、その細胞吸収を高めるために、干渉RNA分子にリガンドを結合させることができる。特定の実施形態において、細胞膜への直接浸透を容易にするために、分子に疎水性リガンドが結合される。これらのアプローチは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞への浸透を容易にするために用いられている。特定の例において、オリゴヌクレオチドへのカチオンリガンドの結合は、多くの場合、ヌクレアーゼへの耐性改善がもたらされる。カチオンリガンドの代表例は、プロピルアンモニウムおよびジメチルプロピルアンモニウムを含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドを通じてカチオンリガンドが分散される場合に、mRNAへのその高い結合親和性を保持することができる。
一実施形態によれば、すでにβ-メチルバレリル含有ショ糖エステルを産生することができる植物において、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性が低下され、それによって、その中にイソプロピルリンゴ酸シンターゼが低下され、従って、β-メチルバレリル含有ショ糖エステル産生が低下される。
本明細書に記載の分子およびヌクレオチドは、固相合成に関する公知の技術を用いて製造することができる。当該技術分野で公知のこのような合成のための任意の他の手段は、これに加えて、あるいはこれに代えて用いることができる。
種々の実施形態は、本明細書に記載の1以上のポリヌクレオチドまたは1以上のポリヌクレオチドを含む干渉RNA構築物を含む発現ベクターに関する。
種々の実施形態は、本明細書に記載の1以上のポリヌクレオチドまたは1以上の干渉RNA構築物を含む発現ベクターに関する。
種々の実施形態は、自己アニーリングしてヘアピン構造を形成することができる1以上の干渉RNAポリヌクレオチドをコードする1以上のポリヌクレオチドまたは1以上の干渉RNA構築物であって、(a)本明細書に記載の1以上;(b)イントロンを含むスペーサーエレメントをコードする第2配列であって、スプライスされるとき、ヘアピン構造のループを形成する前記第2配列；ならびに、(c)第1配列と同じ配向で配置される、第1配列の逆相補配列を含む第3配列であって、第2配列が第1配列と第3配列の間に位置し、第2配列が第1配列および第3配列に作動可能に連結されている前記第3配列；を含む前記構築物を含む発現ベクターに関する。
開示された配列は、ヘアピン構造を形成しない種々のポリヌクレオチドを構築するために用いることができる。例えば、二本鎖RNAは、1)第1プロモーターに作動可能に連結するによってDNAの第1鎖を転写し、(2)第2プロモーターに作動可能に連結するによってDNA断片の第1鎖の逆相補配列を転写する、ことによって作成されることができる。ポリヌクレオチドの各鎖は、同じ発現ベクターから転写されることもできるし、異なる発現ベクターから転写されることもできる。RNA干渉活性を有する二本鎖RNAは、RNAレベルを低下させるために、低分子干渉RNAに酵素的に変換されることができる。
従って、種々の実施形態は、自己アニーリングすることができる干渉RNAポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドまたは干渉RNA構築物であって、(a)本明細書に記載のポリヌクレオチドの1以上；および(b)第1配列と同じ配向で配置される第1配列の相補的(例えば逆相補的)配列を含む第2配列；を含む前記構築物を含む発現ベクターに関する。
イソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子発現の共抑制を促進することによって、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの内因性発現レベルを低下させる種々の組成物および方法が提供される。共抑制の現象は、植物細胞宿主への導入遺伝子の複数コピーの導入の結果として生じる。複数コピーの導入遺伝子の組み込みによって、導入遺伝子および標的内在性遺伝子の発現低下をもたらすことができる。共抑制の程度は、導入遺伝子と標的内在性遺伝子間の配列同一性に左右される。内在性遺伝子および導入遺伝子の両方のサイレンシングは、転写を妨げる、サイレンシングされた遺伝子座(すなわち、内因性プロモーターおよび内因性目的遺伝子)の十分なメチル化によって起こすことができる。あるいはまた、場合によっては、内在性遺伝子および導入遺伝子の共抑制は、転写物は生じることができるが、分解速度の増加が転写物の蓄積を妨げる転写後遺伝子サイレンシングによって起こすことができる。RNAはこれらのプロセスにおける重要な開始剤および標的の両方であると考えられ、少なくとも一部分において同じ分子機構で、多分、RNAにガイドされるmRNAの分解によって媒介されることができるという点で、転写後遺伝子サイレンシングによる共抑制の機構は、RNA干渉に類似すると考えられる。
核酸の共抑制は、目的植物のゲノムに、導入遺伝子として、核酸またはその断片の複数コピーを組み込むことによって達成することができる。宿主植物は、核酸またはその断片に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクターによって形質転換されることができる。種々の実施形態は、ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含むの内在性遺伝子の共抑制を促進する発現ベクターに関する。
保存的変異ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを得る方法もまた開示される。植物細胞または植物材料を含む任意の目的植物は、部位特異的変異誘発、オリゴヌクレオチド指定変異誘発、化学的に誘導された変異誘発、照射誘起変異誘発、修飾塩基を用いる変異誘発、ギャップ付き二本鎖DNAを用いる変異誘発、二本鎖切断変異誘発、修復欠損宿主株を用いる変異誘発、遺伝子の全合成による変異誘発DNAシャフリングおよび他の等価な方法を含む変異誘発を誘導することが知られている種々の方法によって遺伝子改変されることができる。
あるいはまた、目的植物のゲノムにトランスポゾン(例えば、ISエレメント)を導入することによって、遺伝子を不活化の標的とすることができる。これらの可動遺伝因子は交雑受精によって導入することができ、タンパク質活性の喪失に関して挿入変異体をスクリーニングすることができる。親植物における破壊された遺伝子は、例えば交雑受精によって、トランスポゾンによる変異誘発に供されなかった植物と親植物との交雑によって他の植物に導入されることができる。当業者に公知の任意の標準的育種技術を用いることができる。一実施形態において、1以上の遺伝子は1以上のトランスポゾンの挿入によって不活化されることができる。変異は、1以上の遺伝子のホモ接合型破壊、1以上の遺伝子のヘテロ接合型破壊または2以上の遺伝子が破壊される場合のホモ接合型およびヘテロ接合型破壊の両方の組み合わせをもたらすことができる。適切な転移因子は、レトロトランスポゾン、レトロポゾンおよびSINE様因子を含む。このような方法は当業者に公知である。
あるいはまた、自己切断および複製が可能な、多くの小さな環状RNA由来のリボザイムを植物に導入することによって、遺伝子を不活化の標的とすることができる。これらのRNAは、単独で(ウイロイドRNA)、あるいはヘルパーウイルスの存在下で(サテライトRNA)複製することができる。適切なRNAの例は、アボカドサンブロッチウイロイド由来のRNAならびにタバコリングスポットウイルス、ルセルントランシエントストリークウイルス、ベルベットタバコモトルウイルス、ソラナムノジフロラムモトルウイルスおよびスブテラネアンクロバーモトルウイルス由来のサテライトRNAを含む。種々の標的RNA特異的リボザイムが当業者に公知である。
いくつかの実施形態において、非トランスジェニック手段、例えば遺伝子に変異を起こさせることによって、イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリペプチドの発現を低下させることができる。遺伝子配列にランダムに変異を導入する方法は、化学的変異誘発、EMS変異誘発および放射線変異誘発を含むことができる。細胞に1以上の標的変異を導入する方法は、限定するものではないが、ゲノムエディティング技術、特にジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介変異誘発、tilling法(ゲノムに誘導した局所的損傷部位のターゲティング)、相同組換え、オリゴヌクレオチド指定変異誘発およびメガヌクレアーゼ媒介変異誘発を含む。
限定するものではない変異のいくつかの例には、少なくとも1つのヌクレオチドの欠失、挿入およびミスセンス変異、一塩基多型ならびに単純反復配列がある。変異後、未成熟終止コドンまたは他の非機能性遺伝子を生じる変異を同定するためにスクリーニングを行うことができる。変異後、上昇したレベルで発現されることができる機能性遺伝子を生じる変異を同定するためにスクリーニングを行うことができる。変異体のスクリーニングは、配列決定によって行うか、あるいは遺伝子またはタンパク質に特異的なプローブまたはプライマーの使用によって行うことができる。遺伝子発現の低下もしくは増加、mRNAの安定性の低下もしくは増加またはタンパク質の安定性の低下もしくは増加をもたらしうるポリヌクレオチドにおける特定の変異もまた起こすことができる。本明細書においては、このような植物を変異植物と呼ぶ。
変異植物は、調節されたポリペプチドレベルをもたらす1以上の変異の任意の組み合わせを有することができる。例えば、変異植物は、単一の遺伝子において単一の変異を有することもできるし、単一の遺伝子において複数の変異を有することもできるし、2以上または3以上の遺伝子において単一の変異を有することもできるし、2以上または3以上の遺伝子において複数の変異を有することもできる。従って、変異ポリペプチドバリアントを含む変異植物が開示される。
一実施形態において、植物からの種子を変異させ、次いで第一世代変異植物に成長させる。次いで、この第一世代植物を自家受粉させ、第一世代植物からの種子を第二世代植物に成長させ、次いでこれをその遺伝子座における変異に関してスクリーニングする。変異させた植物材料を変異に関してスクリーニングすることもできるが、第二世代植物をスクリーニングする利点は、すべての体細胞変異が生殖系列変異に対応していることである。種子、花粉、植物組織または植物細胞を含むがこれに限定されない種々の植物材料を、変異植物を作成するために変異させることができることは、当業者には明らかであろう。しかしながら、変異に関して植物核酸をスクリーニングする場合、変異させた植物材料のタイプは影響を及ぼすことができる。例えば、変異させてない植物の受粉の前に花粉を変異誘発に供した場合、その受粉から得られた種子は第一世代植物に成長する。第一世代植物のすべての細胞は、花粉で生じた変異を含む。従って、第二世代まで待つ代わりに、これらの第一世代植物を、次に、変異に関してスクリーニングすることができる。
変異を引き起こすために、化学的変異誘発剤または放射線を含む、点突然変異、短い欠失、挿入、トランスバージョンまたは遷移を引き起こす突然変異原を用いることができる。突然変異原は、限定するものではないが、メタンスルホン酸エチル、メタンスルホン酸メチル、N-エチル-N-ニトロソウレア、トリエチルメラミン、N-メチル-N-ニトロソウレア、プロカルバジン、クロラムブシル、シクロホスファミド、硫酸ジエチル、アクリルアミドモノマー、メルファラン、ナイトロジェンマスタード、ビンクリスチン、ジメチルニトロソアミン、N-メチル-N'-ニトロ-ニトロソグアニジン、ニトロソグアニジン、2-アミノプリン、7,12ジメチル-ベンゾ(a)アントラセン、エチレンオキシド、ヘキサメチルホスホルアミド、ビスルファン、ジエポキシアルカン(ジエポキシオクタン、ジエポキシブタンなど)、2-メトキシ-6-クロロ-9[3-(エチル-2-クロロ-エチル)アミノプロピルアミノ]アクリジン二塩酸塩およびホルムアルデヒドを含む。突然変異原によって直接に引き起こされたものではない遺伝子座における自然変異もまた、それらが所望の表現型をもたらすものである限り、考えられる。適切な変異誘発剤は、例えば電離放射線、例えばX線、ガンマ線、高速中性子照射およびUV放射線もまた含む。
変異スクリーニング用の植物核酸を調製するために、当業者に公知の、任意の植物核酸調製方法を用いることができる。
個々の植物、植物細胞または植物材料から調製された核酸は、場合により、変異させた植物組織、細胞または材料由来の植物集団のイソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子における変異のスクリーニングをはかどらせるためにプールすることができる。植物、植物細胞または植物材料の1以上のその後の世代をスクリーニングすることができる。場合によりプールした群のサイズは、用いられるスクリーニング方法の感度に左右される。
場合により核酸試料をプールした後、それらをポリヌクレオチド特異的増幅技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に供することができる。場合によりプールした核酸試料中のイソプロピルリンゴ酸シンターゼ配列を増幅するために、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子またはそれらに直接隣接した配列に特異的なプライマーまたはプローブをいずれか1つ以上用いることができる。有用な変異が最も起こりそうなイソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子座の領域を増幅するために、好ましくは1以上のプライマーが設計される。最も好ましくは、プライマーは、イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドの領域内の変異を検出するために設計される。さらに、点突然変異のスクリーニングを容易にするために、既知の多型性部位を避けるプライマー(単数または複数)が好ましい。増幅産物の検出を容易にするために、任意の従来の標識法を用いて、1以上のプライマーまたはプローブを標識することができる。プライマー(単数または複数)またはプローブは、当業者に公知の方法を用いて、本明細書に記載の配列に基づいて設計することができる。多型は、当該技術分野で公知の手段で同定することができる。他の側面において、変異植物の製造方法が提供される。本方法は、機能性イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリペプチドをコードする遺伝子を含む植物の少なくとも1つの細胞を提供することを含む。次いで、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子の活性を調節するのに有効な条件下でこの植物の少なくとも1つの細胞が処理される。次いで、少なくとも1つの変異植物細胞を変異植物に増殖させ、ここで変異植物は、対照植物と比較して調節されたレベルのイソプロピルリンゴ酸シンターゼポリペプチドを有する。変異植物を製造する本方法の一実施形態において、処理段階は、上記のように、少なくとも1つの変異植物細胞を生じるのに有効な条件下で、少なくとも1つの細胞を化学的変異誘発剤にかけることを含む。本方法の他の実施形態において、処理段階は、少なくとも1つの変異植物細胞を生じるのに有効な条件下で、少なくとも1つの細胞を放射線源にかけることを含む。用語”変異植物”は、適切には遺伝子工学または遺伝子改変以外の手段で、対照植物と比較して遺伝子型が改変されている変異植物を含む。
特定の実施形態において、変異植物、変異植物細胞または変異植物材料は、他の植物、植物細胞または植物材料に天然に存在する1以上の変異を含み、所望の形質を付与することができる。この変異は、他の植物、植物細胞または植物材料(例えば、変異が誘導された植物とは遺伝的背景が異なる植物、植物細胞または植物材料)に組み込まれ(例えば遺伝子移入され)、それに形質を付与することができる。従って、例として、第1植物に天然に存在する変異は、第2植物、例えば第1植物とは遺伝的背景が異なる第2植物に導入されることができる。従って、当業者は、所望の形質を付与するイソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子の1以上の変異対立遺伝子をそのゲノム中に天然に含む植物を調べ同定することができる。天然に存在する変異対立遺伝子(単数または複数)は、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子中に1以上の変異を有する系統、変種または雑種を製造するための育種、戻し交雑および遺伝子移入を含む種々の方法によって第2植物に導入することができる。変異植物のプールの中から所望の形質を示す植物をスクリーニングすることができる。適切には、本明細書に記載のイソプロピルリンゴ酸シンターゼヌクレオチド配列の知識を用いて選択が行われる。その結果として、対照と比較してショ糖エステル組成物の変化を示す遺伝形質をスクリーニングすることが可能である。このようなスクリーニングアプローチは、本明細書に記載の従来の核酸増幅および／またはハイブリダイゼーション技術の適用を含むことができる。従って、本発明のさらなる側面は、変異植物を同定する方法であって、(a)植物からイソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドを含む試料を提供する段階；および(b)イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドの核酸配列を決定する段階であって、対照植物のイソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドと前記イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドの配列の違いが、前記植物がイソプロピルリンゴ酸シンターゼ変異植物であることを示す前記段階を含む前記方法に関する。他の側面において、対照植物と比較してショ糖エステル組成物の変化を有する変異植物を同定する方法であって、(a)スクリーニングされる植物からの試料を提供する段階；(b)前記試料がイソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチド中に1以上の変異を含むかどうかを決定する段階；および(c)前記植物のショ糖エステル組成物を測定する段階；を含む前記方法において、前記試料が、対照植物と比較して、コードされるタンパク質の発現または活性を調節するイソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドにおける1以上の変異を含み、植物の一部分が対照植物と比較してショ糖エステル組成物の変化を有し、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性が低下していないかどうかが、ショ糖エステル組成物の変化を有する変異植物であることを示す前記方法が提供される。他の側面において、対照植物と比較してショ糖エステル組成物の変化を有する変異植物を製造する方法であって、(a)第1植物からの試料を調製する段階；(b)前記試料が、その中にショ糖エステル組成物の変化をもたらす、イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドにおける1以上の変異を含むかどうかを決定する段階；および(c)第2植物に1以上の変異を導入する段階；を含む前記方法が提供される。変異(単数または複数)は、当該技術分野で公知の種々の方法、例えば遺伝子工学、遺伝子操作、遺伝子移入、植物育種、戻し交雑などによって第2植物に導入されることができる。一実施形態において、第1植物は天然に存在する植物である。一実施形態において、第2植物は第1植物とは異なる遺伝的背景を有する。他の側面において、対照植物と比較ショ糖エステル組成物の変化を有する変異植物を製造する方法であって、(a)第1植物から試料を提供する段階；(b)前記試料が、その中に、ショ糖エステル組成物の変化をもたらすイソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドにおける1以上の変異を含むかどうかを決定する段階；および(c)第1植物からの1以上の変異を第2植物に遺伝子移入する段階；を含む前記方法が提供される。一実施形態において、遺伝子移入する段階は、場合により戻し交雑などを含む植物育種を含む。一実施形態において、第1植物は天然に存在する植物である。一実施形態において、第2植物は第1植物とは異なる遺伝的背景を有する。一実施形態において、第1植物は栽培品種または優良栽培品種ではない。一実施形態において、第2植物は栽培品種または優良栽培品種である。さらなる側面は、本明細書に記載の方法によって得られるか、または得ることができる変異植物(栽培品種または優良栽培品種変異植物を含む)に関する。特定の実施形態において、変異植物は、植物の特定の領域にのみ局在化した、例えばイソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドの配列内の1以上の変異を有することができる。この実施形態によれば、変異植物の残りのゲノム配列は、変異誘発前の植物と同じかまたは実質的に同じである。
特定の実施形態において、変異植物は、その植物の2以上の領域に、例えばイソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドの配列およびゲノムの1以上のさらなる領域に局在化した1以上の変異を有することができる。この実施形態によれば、変異植物の残りのゲノム配列は、変異誘発前の植物と同じではないか、または実質的に同じではない。特定の実施形態において、変異植物は、イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドの1以上、2以上、3以上、4以上または5以上のエクソンにおいて1以上の変異を有さず、イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドの1以上、2以上、3以上、4以上または5以上のイントロンにおいて1以上の変異を有さず、イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドのプロモーターにおいて1以上の変異を有さず；イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドの3'非翻訳領域において1以上の変異を有さず；イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドの5'非翻訳領域において1以上の変異を有さず；イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドのコード領域において1以上の変異を有さず；イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドの非コード領域において1以上の変異を有さず；あるいはそれらの部分の2以上、3以上、4以上、5以上または6以上の任意の組み合わせを有さない。さらなる側面において、イソプロピルリンゴ酸シンターゼをコードする遺伝子における変異を含む植物、植物細胞または植物材料を同定する方法であって、(a)植物、植物細胞または植物材料を変異誘発にかけ；(b)前記植物、植物細胞もしくは植物材料またはそれらの子孫から核酸試料を入手し；(c)イソプロピルリンゴ酸シンターゼまたはそのバリアントもしくは断片をコードする遺伝子の核酸配列を決定し、ここで前記配列における違いがその中の1以上の変異を示すことを含む前記方法が提供される。
イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性を調節するために、ジンクフィンガータンパク質を用いることができる。種々の実施形態において、ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介変異誘発によって、ポリヌクレオチドのコード配列の一部またはすべてを含むゲノムDNA配列が改変される。ジンクフィンガータンパク質結合の特異部位に関してゲノムDNA配列が調べられる。あるいはまた、ゲノムDNA配列は、ジンクフィンガータンパク質結合の2つの特異部位であって、逆鎖上で近接して、例えば、1、2、3、4、5、6塩基対またはそれ以上離れて存在する前記2つの特異部位に関して調べられる。それによって、本明細書に記載のポリヌクレオチドに結合するジンクフィンガータンパク質が提供される。
イソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子における選択された標的部位を認識するために、ジンクフィンガータンパク質が操作されることができる。ジンクフィンガータンパク質は、選択法、例えば限定するものではないが、ファージディスプレイ選択、細菌2ハイブリッド選択または細菌1ハイブリッド選択と結びつけた短縮化、伸張または部位特異的変異誘発プロセスによって、天然のジンクフィンガーDNA結合ドメインおよび非天然ジンクフィンガーDNA結合ドメイン由来のモチーフの任意の組み合わせを含むことができる。用語”非天然ジンクフィンガーDNA結合ドメイン”とは、標的DNA中の3塩基対配列に結合し、改変されるDNAを含む細胞または生物体内に存在しないジンクフィンガーDNA結合ドメインのことを言う。標的遺伝子に特有な特定のヌクレオチド配列に結合するジンクフィンガータンパク質の設計の方法は当該技術分野で公知である。
ポリヌクレオチドに結合するジンクフィンガータンパク質をコードする第1ポリヌクレオチドと、非特異的エンドヌクレアーゼをコードする第2ポリヌクレオチド、例えば限定するものではないが、IIS型エンドヌクレアーゼをコードする第2ポリヌクレオチドとの融合体を製造することによってジンクフィンガーヌクレアーゼを構築することができる。ジンクフィンガータンパク質と該ヌクレアーゼとの融合タンパク質は、2つの塩基対からなるスペーサーを含むこともできるし、あるいはまた該スペーサーは、3、4、5、6または7以上の塩基対からなることもできる。種々の実施形態において、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ポリヌクレオチドのゲノムDNA配列の調節領域、コード領域または非コード領域に二本鎖切断を導入し、ポリヌクレオチドの発現レベルの低下またはそれによってコードされるタンパク質の活性の低下をもたらす。ジンクフィンガーヌクレアーゼによる切断は、しばしば、非相同末端結合によるDNA修復に続く切断部位におけるDNAの欠失をもたらす。
他の実施形態において、ジンクフィンガータンパク質は、イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドの調節配列に結合するように選択されることができる。より具体的には、調節配列は、転写開始点、開始コドン、エクソンの領域、エクソン-イントロンの境界、ターミネーターまたは終止コドンを含むことができる。従って、本開示は、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子の近くまたはイソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子内のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介変異誘発によって製造された変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物または植物細胞および、ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介変異誘発によるこのような植物または植物細胞の製造方法を提供する。ジンクフィンガータンパク質およびジンクフィンガーヌクレアーゼの植物への送達方法は、メガヌクレアーゼ送達のための下記の方法と同様である。
他の側面において、メガヌクレアーゼ、例えばメガヌクレアーゼI-CreIを用いて、変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物または他の遺伝子改変植物を製造する方法が提供される。イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドの破壊を可能にするために、植物のゲノムDNAの単一部位または比較的少ない部位で二本鎖切断を特異的に引き起こすために、天然に存在するメガヌクレアーゼだけでなく、組換えメガヌクレアーゼもまた使用することができる。メガヌクレアーゼは、改変されたDNA認識特性を有する操作されたメガヌクレアーゼであることができる。メガヌクレアーゼタンパク質は、当該技術分野で公知の種々の異なる機構によって植物細胞に送達することができる。
本開示は、植物細胞または植物において本明細書に記載のポリヌクレオチドの1以上を不活化するためのメガヌクレアーゼの使用を含む。特に、側面はまた、メガヌクレアーゼを用いて植物におけるポリヌクレオチドを不活化する方法であって、(a)本明細書に記載の1以上のポリヌクレオチドを含む植物細胞を提供し；(b)前記植物細胞内にメガヌクレアーゼをコードする構築物を導入し；(c)メガヌクレアーゼに前記ポリヌクレオチドを実質的に不活化させること；を含む前記方法に関する。
ポリヌクレオチドのコード領域内のメガヌクレアーゼ認識部位を切断するためにメガヌクレアーゼを用いることができる。このような切断は、非相同末端結合による変異DNA修復に続いて、しばしば、メガヌクレアーゼ認識部位におけるDNAの欠失をもたらす。遺伝子コード配列におけるこのような変異は、一般的には、遺伝子を不活化するのに十分である。植物細胞を改変するこの方法は、第1に、適切な形質転換方法を用いて植物細胞にメガヌクレアーゼ発現カセットを送達することを含む。効率を最大にするために、メガヌクレアーゼ発現カセットに選択マーカーを連結させ、形質転換に成功した細胞を選択剤の存在下で選択することが望ましい。このアプローチは、メガヌクレアーゼ発現カセットのゲノムへの組み込みをもたらす。しかしながら、この植物が規制当局の認可を必要とすると思われる場合は、このアプローチは望ましくない。このような場合には、メガヌクレアーゼ発現カセット(および連結された選択マーカー遺伝子)は、従来の育種技術を用いて、その後の植物の世代において離脱させることができる。あるいはまた、植物細胞は、初めに、選択マーカーを欠くメガヌクレアーゼ発現カセットで形質転換することができ、選択剤を欠く培地で増殖させることができる。このような条件下では、処理される細胞の分画は、メガヌクレアーゼ発現カセットを必要とし、ゲノムにメガヌクレアーゼ発現カセットが組み込まれることなしに、操作されたメガヌクレアーゼを一過性に発現する。このような条件は形質転換効率を考慮に入れてないので、この後者の形質転換過程は、所望のゲノム改変を得るために、多数の処理細胞をスクリーニングすることを必要とする。上記のアプローチはまた、ジンクフィンガータンパク質またはジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて植物細胞を改変するのにも用いることができる。
メガヌクレアーゼ発現カセットの送達に続いて、最初に、用いられた特定の形質転換過程に典型的な条件下で植物細胞が増殖される。これは、しばしば暗所で、26℃以下の温度の培地で形質転換細胞を増殖させることを意味することができる。植物細胞を形質転換プロセスから回復させるために、ある期間、好ましくは1〜4日間、このような標準条件を用いることができる。この最初の回復期間に続く任意の時点で、増殖温度を上げて、操作されたメガヌクレアーゼの活性を刺激し、メガヌクレアーゼ認識部位を切断し、変異させることができる。
特定の用途に関して、植物のゲノムからポリヌクレオチドを正確に除去することが望ましい場合がある。このような用途には、そのそれぞれが対象とする欠失のいずれかの側でメガヌクレアーゼ認識部位を切断する一対の操作されたメガヌクレアーゼを用いることが可能である。
植物細胞に含まれるDNAと標的DNAとの間の異種組換えを引き起こすためにメガヌクレアーゼおよび他のDNA修復戦略を用いることができる。標的DNAは、一般的には、植物細胞に含まれるDNAに相同な少なくとも1つの、好ましくは2つの領域を含む。細胞によるDNA修復に続いて、相同な末端が結合され、細胞への標的DNAの導入が引き起こされる。
他の実施形態において、植物におけるイソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現レベルは、葉緑体ゲノムに直接にその遺伝子を挿入することによって増加させることができる。なぜなら、イソプロピルリンゴ酸シンターゼは、植物の細胞核においてコードされる葉緑体のタンパク質だからである。同様に、葉緑体へのイソプロピルリンゴ酸シンターゼタンパク質の輸送またはインポートの増加によって活性パターンを調節することができる。
目的の1つは、対照植物と比較して調節されたショ糖エステルレベルを示すにもかかわらず、実質的に同じ視覚的外観を維持する変異植物、トランスジェニック植物または天然に存在しない植物を提供することである。従って、対照細胞または対照植物と比較してショ糖エステルレベルが調節された変異植物、トランスジェニック植物または天然に存在しない植物もしくは細胞が本明細書に開示される。本明細書に記載のポリヌクレオチド配列をコードする1以上のポリペプチドの発現を調節することによって、本明細書に記載のイソプロピルリンゴ酸シンターゼの合成または活性を調節するために、変異植物、トランスジェニック植物または天然に存在しない植物もしくは細胞が改変された。
さらなる側面は、変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物もしくは細胞であって、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性が調節され、植物の一部分が、前記酵素の発現または活性が調節されていない対照植物と比較して少なくとも5%のショ糖エステルレベルの増加または低下を有する前記変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物もしくは細胞に関する。よりさらなる側面は、変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物もしくは細胞であって、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現はまたはそれによってコードされるタンパク質が調節され、エアゾールにおけるショ糖エステルレベルが、対照植物からのエアゾールと比較して少なくとも5%増加または低下している前記変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物もしくは細胞に関する。
対照植物と比較したショ糖エステル含量の変化は、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または約100%以上であることができる。
エアゾールを放出させるために、該植物は、100℃以上、例えば少なくとも125℃、少なくとも150℃、少なくとも175℃または少なくとも200℃に加熱することができる。
遺伝子改変に使用するのに適した植物は、以下の科の1つからの種を含む単子葉植物および双子葉植物の植物および植物細胞系を含む：キツネノマゴ科(Acanthaceae)、ネギ科(Alliaceae)、ユリズイセン科(Alstroemeriaceae)、ヒガンバナ科(Amaryllidaceae)、キョウチクトウ科(Apocynaceae)、ヤシ科(Arecaceae)、キク科(Asteraceae)、メギ科(Berberidaceae)、ベニノキ科(Bixaceae)、アブラナ科(Brassicaceae)、パイナップル科(Bromeliaceae)、アサ科(Cannabaceae)、ナデシコ科(Caryophyllaceae)、イヌガヤ科(Cephalotaxaceae)、アカザ科(Chenopodiaceae)、イヌサフラン科(Colchicaceae)、ウリ科(Cucurbitaceae)、ヤマノイモ科(Dioscoreaceae)、マオウ科(Ephedraceae)、コカノキ科(Erythroxylaceae)、トウダイグサ科(Euphorbiaceae)、マメ科(Fabaceae)、シソ科(Lamiaceae)、アマ科(Linaceae)、ヒカゲノカズラ科(Lycopodiaceae)、アオイ科(Malvaceae)、メランチウム科(Melanthiaceae)、バショウ科(Musaceae)、フトモモ科(Myrtaceae)、ヌマミズキ科(Nyssaceae)、ケシ科(Papaveraceae)、マツ科(Pinaceae)、オオバコ科(Plantaginaceae)、イネ科(Poaceae)、バラ科(Rosaceae)、アカネ科(Rubiaceae)、ヤナギ科(Salicaceae)、ムクロジ科(Sapindaceae)、ナス科(Solanaceae)、イチイ科(Taxaceae)、ツバキ科(Theaceae)またはブドウ科(Vitaceae)。
適切な種は、アベルモスクス属(Abelmoschus)、アビエス属(Abies)、アセル属(Acer)、アグロスチス属(Agrostis)、アリウム属(Allium)、アルストロメリア属(Alstroemeria)、アナナス属(Ananas)、アンドログラフィス属(Andrographis)、アンドロポゴン属(Andropogon)、アルテミシア属(Artemisia)、アルンド属(Arundo)、アトローパ属(Atropa)、ベルベリス属(Berberis)、ベタ属(Beta)、ビクサ属(Bixa)、ブラシカ属(Brassica)、カレンデュラ属(Calendula)、カメリア属(Camellia)、カンプトテカ属(Camptotheca)、カンナビス属(Cannabis)、カプシクム属(Capsicum)、カルタムス属(Carthamus)、カタランサス属(Catharanthus)、ケファロタクスス属(Cephalotaxus)、クリサンセマム属(Chrysanthemum)、シンコナ属(Cinchona)、キトルルス属(Citrullus)、コフィア属(Coffea)、コルチカム属(Colchicum)、コリウス属(Coleus)、ククミス属(Cucumis)、ククルビタ属(Cucurbita)、キノドン属(Cynodon)、ダツラ属(Datura)、ダイアンサス属(Dianthus)、ジギタリス属(digitalis)、ディオスコレア属(Dioscorea)、エラエイス属(Elaeis)、エフェドラ属(Ephedra)、エリアンサス属(Erianthus)、エリスロキシルム属(Erythroxylum)、ユーカリプタス属(Eucalyptus)、フェスツカ属(Festuca)、フラガリア属(Fragaria)、ガランツス属(Galanthus)、グリシン属(Glycine)、ゴシピウム属(Gossypium)、ヘリアンサス属(Helianthus)、ヘベア属(Hevea)、ホルデウム属(Hordeum)、ヒヨスチアムス属(Hyoscyamus)、ジャトロファ属(Jatropha)、ラクツカ属(Lactuca)、リナム属(Linum)、ロリウム属(Lolium)、ルピナス属(Lupinus)、リコペルシコン属(Lycopersicon)、リコポディウム属(Lycopodium)、マニホット属(Manihot)、メディカゴ属(Medicago)、メンタ属(Mentha)、ミスカンツス属(Miscanthus)、ムサ属(Musa)、ニコチアナ属(Nicotiana)、オリザ属(Oryza)、パニクム属(Panicum)、パパベル属(Papaver)、パルテニウム属(Parthenium)、ペンニセツム属(Pennisetum)、ペチュニア属(Petunia)、ファラリス属(Phalaris)、フレウム属(Phleum)、ピヌス属(Pinus)、ポア属(Poa)、ポインセチア属(Poinsettia)、ポプルス属(Populus)、ラウオルフィア属(Rauwolfia)、リシヌス属(Ricinus)、ロサ属(Rosa)、サッカルム属(Saccharum)、サリクス属(Salix)、サンギナリア属(Sanguinaria)、スコポリア属(Scopolia)、セカレ属(Secale)、ソラナム属(Solanum)、ソルガム属(Sorghum)、スパルティナ属(Spartina)、スピナキア属(Spinacea)、タナセタム属(Tanacetum)、タクサス属(Taxus)、テオブロマ属(Theobroma)、トリチコセカレ属(Triticosecale)、トリチクム属(Triticum)、ウニオラ属(Uniola)、ベラトルム属(Veratrum)、ビンカ属(Vinca)、ヴィティス属(Vitis)およびゼア属(Zea)のメンバーを含むことができる。
適切な種は、パニクム種(Panicum spp.)、ソルガム種(Sorghum spp.)、ミスカンサス種(Miscanthus spp.)、サッカルム種(Saccharum spp.)、エリアンサス種(Erianthus spp.)、ポプルス種(Populus spp.)、アンドロポゴン・ゲラルディイ(Andropogon gerardii)(ビッグブルーステム)、ペンニセツム・プルプレウム(Pennisetum purpureum)(力芝)、ファラリス・アルンディナケア(Phalaris arundinacea)(クサヨシ)、キノドン・ダクティロン(Cynodon dactylon)(バミューダグラス)、フェスツカ・アルンディナケア(Festuca arundinacea)(鬼牛の毛草)、スパルティナ・ペクティナタ(Spartina pectinata)(プレーリーコード草)、メディカゴ・サティウァ(Medicago sativa)(アルファルファ)、アルンド・ドナックス(Arundo donax)(ジャイアントリード)、セカレ・ケレアレ(Secale cereale)(ライ麦)、サリクス種(Salix spp.)(ヤナギ)、ユーカリプタス種(Eucalyptus spp.)(ユーカリノキ)、トリチコセカレ(Triticosecale)、タケ、ヘリアンサス・アンヌス(Helianthus annuus)(ヒマワリ)、カルタムス・ティンクトリウス(Carthamus tinctorius)(ベニバナ)、ジャトロファ・クルカス(Jatropha curcas)(ジャトロファ)、リキヌス・コムムニス(Ricinus communis)(ヒマシ)、エラエイス・ギネエンシス(Elaeis guineensis)(ヤシ)、リヌム・ウシタティッシムム(Linum usitatissimum)亜麻仁油(アマ)、ブラッシカ・ユンケア(Brassica juncea)、ベタ・ブルガリス(Beta vulgaris)(テンサイ)、マニホット・エスクレンタ(Manihot esculenta)(キャッサバ)、リコペルシコン・エクスレンタム(Lycopersicon esculentum)(トマト)、ラクツカ・サティバ(Lactuca sativa)(レタス)、ムサ・パラディシアカ(Musa paradisiaca)(バナナ)、ソラナム・ツベロスム(Solanum tuberosum)(ジャガイモ)、ブラシカ・オレラシア(Brassica oleracea)(ブロッコリー、カリフラワー、芽キャベツ)、カメリア・シネンシス(Camellia sinensis)(チャノキ)、フラガリア・アナナッサ(Fragaria ananassa)(イチゴ)、テオブロマ・カカオ(Theobroma cacao)(カカオノキ)、コフィア・アラビカ(Coffea arabica)(コーヒーノキ)、ヴィティス・ヴィニフェラ(Vitis vinifera)(ブドウ)、アナナス・コモサス(Ananas comosus)(パイナップル)、カプシクム・アンヌウム(Capsicum annum)(唐辛子およびシシトウ)、アリウム・セパ(Allium cepa)(タマネギ)、ククミス・メロ(Cucumis melo)(メロン)、ククミス・サティウス(Cucumis sativus)(キュウリ)、ククルビタ・マクシマ(Cucurbita maxima)(スカッシュ)、ククルビタ・モスカータ(Cucurbita moschata)(スカッシュ)、スピナキア・オレラケア(Spinacea oleracea)(ホウレンソウ)、シトルルス・ラナタス(Citrullus lanatus)(スイカ)、アベルモスクス・エスクレンツス(Abelmoschus esculentus)(オクラ)、Solanum melongena(ソラナム・メロンゲーナ)(ナス)、ロサ種(Rosa spp.)(バラ)、ディアンツス・カリオフィルス(Dianthus caryophyllus)(カーネーション)、ペチュニア種(Petunia spp.)(ペチュニア)、ポインセチア・プルケリマ(Poinsettia pulcherrima)(ポインセチア)、ルピナス・アルブス(Lupinus albus)(ルピナス)、ウニオラ・パニクラータ(Uniola paniculata)(オートムギ)、ベントグラス(アグロスチス種(Agrostis spp.))、ポプルス・トレムロイデス(Populus tremuloides)(アスペン)、ピヌス種(Pinus spp.)(マツ)、アビエス種(Abies spp.)(モミ)、アセル種(Acer spp.)(カエデ)、ホルデウム・ウルガレ(Hordeum vulgare)(大麦)、ポア・プラテンシス(Poa pratensis)(ケンタッキーブルーグラス)、ロリウム種(Lolium spp.)(ライグラス)およびフレウム・プラテンセ(Phleum pratense)(オオアワガエリ)、パニクム・ウィルガツム(Panicum virgatum)(スイッチグラス)、ソルガム・ビカラー(Sorghum bicolor)(ソルガム、スーダングラス)、ミスカンサス・ギガンテウス(Miscanthus giganteus)(ミスカンサス)、サッカルム種(Saccharum sp.)(エネルギーケイン)、ポプルス・バルサミフェラ(Populus balsamifera)(ポプラ)、ゼア・マイス(Zea mays)(コーン)、グリシン・マックス(Glycine max)(ダイズ)、ブラッシカ・ナプス(Brassica napus)(カノーラ)、トリチクム・アエスチウム(Triticum aestivum)(小麦)、ゴシピウム・ヒルスツム(Gossypium hirsutum)(綿)、オリザ・サティバ(Oryza sativa)(米)、ヘリアンサス・アンヌス(Helianthus annuus)(ヒマワリ)、メディカゴ・サティウァ(Medicago sativa)(アルファルファ)、ベタ・ブルガリス(Beta vulgaris)(テンサイ)またはペンニセツム・グラウクム(Pennisetum glaucum)(トウジンビエ)を含むことができる。
種々の実施形態は、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子の発現レベルを低下させるように改変した変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物に関し、それによって、対照植物と比較して目的植物組織内のイソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現レベルが低下した植物、例えばタバコ植物が製造される。開示された組成物および方法は、N.ルスチカ(N. rustica)およびN.タバカムを含むニコチアナ属の任意の種(例えばLA B21、LN KY171、TI 1406、Basma、Galpao、Perique、Beinhart 1000-1、K326、Hicks BroadleafおよびPetico)に用いることができる。他の種は、N.アカウリス(N. acaulis)、N.アクミナタ(N. acuminata)、N.アクミナタ・変種マルチフロラ(N. acuminata var. multiflora)、N.アフリカナ(N. africana)、N.アラタ(N. alata)、N.アムプレキシカウリス(N. amplexicaulis)、N.アレントシ(N. arentsii)、N.アテヌアタ(N. attenuata)、N.ベナビデシ(N. benavidesii)、N.ベンサミアナ(N. benthamiana)、N.ビゲロビ(N. bigelovii)、N.ボナリエンシス(N. bonariensis)、N.カビコラ(N. cavicola)、N.クレベランジ(N. clevelandii)、N.コルジフォリア(N. cordifolia)、N.コリンボサ(N. corymbosa)、N.デブネイ(N. debneyi)、N.エクセルシオル(N. excelsior)、N.フォルゲチア(N. forgetiana)、N.フラグランス(N. fragrans)、N.グラウカ(N. glauca)、N.グルチノサ(N. glutinosa)、N.グッドスピーディ(N. goodspeedii)、N.ゴセイ(N. gossei)、N.ハイブリッド(N. hybrid)、N.イングルバ(N. ingulba)、N.カワカミ(N. kawakamii)、N.ナイチアナ(N. knightiana)、N.ラングスドルフィ(N. langsdorffii)、N.リネアリス(N. linearis)、N.ロンギフロラ(N. longiflora)、N.マリチマ(N. maritima)、N.メガロシホン(N. megalosiphon)、N.ミエルシ(N. miersii)、N.ノクチフロラ(N. noctiflora)、N.ヌジカウリス(N. nudicaulis)、N.オブツシフォリア(N. obtusifolia)、N.オシデンタリス(N. occidentalis)、N.オシデンタリス・亜種ヘスペリス(N. occidentalis subsp. hesperis)、N.オトホラ(N. otophora)、N.パニクラータ(N. paniculata)、N.パウシフロラ(N. pauciflora)、N.ペツニオイデス(N. petunioides)、N.プルムバギニフォリア(N. plumbaginifolia)、N.クアドリバルビス(N. quadrivalvis)、N.ライモンジ(N. raimondii)、N.レパンダ(N. repanda)、N.ロスラタ(N. rosulata)、N.ロスラタ・亜種イングルバ(N. rosulata subsp. ingulba)、N.ロツンジホリア(N. rotundifolia)、N.セトケリ(N. setchellii)、N.シムランス(N. simulans)、N.ソラニフォリア(N. solanifolia)、N.スペガジニ(N. spegazzinii)、N.ストクトニ(N. stocktonii)、N.スアベオレンス(N. suaveolens)、N.シルベストリス(N. sylvestris)、N.チルシフロラ(N. thyrsiflora)、N.トメントサ(N. tomentosa)、N.トメントシホルミス(N. tomentosiformis)、N.トリゴノフィラ(N. trigonophylla)、N.アンブラチカ(N. umbratica)、N.アンドゥラタ(N. undulata)、N.ベルチナ(N. velutina)、N.ウィガンジオイデス(N. wigandioides)およびN. xサンデラエ(N. x sanderae)を含む。特に好ましい実施形態において、植物は、タバコ植物、例えばニコチアナ属またはニコチアナ・タバカム種の植物である。
タバコ栽培品種および優良タバコ栽培品種の使用もまた本明細書において考えられる。従って、トランスジェニック植物、天然に存在しない植物または変異植物は、1以上の導入遺伝子、1以上の遺伝子突然変異またはそれらの組み合わせを含むタバコ変種または優良タバコ栽培品種であることができる。遺伝的変異(単数または複数)(例えば1以上の多型)は、個々のタバコ変種またはタバコ栽培品種(例えば優良タバコ栽培品種)に天然に存在しない変異であることもできるし、その変異が、個々のタバコ変種またはタバコ栽培品種(例えば、優良タバコ栽培品種)には天然に存在しない限りは、天然に存在する遺伝的変異(単数または複数)であることもできる。特に有用なニコチアナ・タバカム変種は、バーレータイプ、ダークタイプ、鉄管乾燥タイプおよびオリエンタルタイプのタバコを含む。限定するものではない変種または栽培品種の例は、BD 64、CC 101、CC 200、CC 27、CC 301、CC 400、CC 500、CC 600、CC 700、CC 800、CC 900、Coker 176、Coker 319、Coker 371 Gold、Coker 48、CD 263、DF911、DT 538 LC Galpaoタバコ、GL 26H、GL 350、GL 600、GL 737、GL 939、GL 973、HB 04P、HB 04P LC、HB3307PLC、Hybrid 403LC、Hybrid 404LC、Hybrid 501 LC、K 149、K 326、K 346、K 358、K394、K 399、K 730、KDH 959、KT 200、KT204LC、KY10、KY14、KY 160、KY 17、KY 171、KY 907、KY907LC、KTY14xL8 LC、Little Crittenden、McNair 373、McNair 944、msKY 14xL8、Narrow Leaf Madole、Narrow Leaf Madole LC、NBH 98、N-126、N-777LC、N-7371LC、NC 100、NC 102、NC 2000、NC 291、NC 297、NC 299、NC 3、NC 4、NC 5、NC 6、NC7、NC 606、NC 71、NC 72、NC 810、NC BH 129、NC 2002、Neal Smith Madole、OXFORD 207、PD 7302 LC、PD 7309 LC、PD 7312 LC、'Perique'タバコ、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R 610、R 630、R 7-11、R 7-12、RG 17、RG 81、RG H51、RGH 4、RGH 51、RS 1410、Speight 168、Speight 172、Speight 179、Speight 210、Speight 220、Speight 225、Speight 227、Speight 234、Speight G-28、Speight G-70、Speight H-6、Speight H20、Speight NF3、TI 1406、TI 1269、TN 86、TN86LC、TN 90、TN 97、TN97LC、TN D94、TN D950、TR (Tom Rosson) Madole、VA 309、VA359、AA 37-1、B 13P、Xanthi (Mitchell-Mor)、Bel-W3、79-615、Samsun Holmes NN、KTRDC number 2 Hybrid 49、バーレー 21、KY 8959、KY 9、MD 609、PG 01、PG 04、PO1、PO2、PO3、RG 11、RG 8、VA 509、AS44、Banket A1、Basma Drama B84/31、Basma I Zichna ZP4/B、Basma Xanthi BX 2A、Batek、Besuki Jember、C104、Coker 347、Criollo Misionero、Delcrest、Djebel 81、DVH 405、Galpao Comum、HB04P、Hicks Broadleaf、Kabakulak Elassona、Kutsage E1、LA BU 21、NC 2326、NC 297、PVH 2110、Red Russian、Samsun、Saplak、Simmaba、Talgar 28、Wislica、Yayaldag、Prilep HC-72、Prilep P23、Prilep PB 156/1、Prilep P12-2/1、Yaka JK-48、Yaka JB 125/3、TI-1068、KDH-960、TI-1070、TW136、Basma、TKF 4028、L8、TKF 2002、GR141、Basma xanthi、GR149、GR153、Petit Havanaである。上記の低変換体亜変種もまた、たとえそれらが本明細書に具体的に記載されていなくても、考えることができる。特定の実施形態において、栽培品種および優良栽培品種が好ましい。他の特定の実施形態において、ニコチアナ・タバカム種を用いることができる。ニコチアナ・タバカムバーレータイプを用いることができる。
実施形態はまた、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性を調節するように改変された変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物を製造するための組成物および方法であって、対照と比較してショ糖エステルレベルが調節された植物または植物成分をもたらすことができる前記組成物および方法に関する。植物におけるショ糖エステルレベルの調節は、それから生じるエアゾールのフレーバープロフィールが改変された植物を製造するために用いることができる。従って、本発明は、望ましいタバコ風味剤を製造するための新規な混合機会を提供することができる。従って、例として植物のショ糖エステル含量は、オリエンタルタバコにより類似した、高いレベルのフレーバー分子を放出することができる植物をもたらすことができる、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性の増加によって増加させることができる。従って、さらなる例として、植物のショ糖エステル含量は、鉄管乾燥タバコにより類似した、低いレベルのフレーバー分子を放出することができる植物をもたらすことができる、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性の低下によって低下させることができる。
他の側面において、タバコをブレンドする方法であって、本明細書に記載のイソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性を調節する(好ましくは増加させる)ことによって植物のショ糖エステル含量が調節された(例えば増加または低下された)トランスジェニック植物、変異植物または天然に存在しない植物由来のタバコ(例えば、タバコ葉またはタバコ葉から誘導されるか、もしくは誘導可能な組成物)をタバコブレンド中のタバコの1以上のタイプに置換するかまたはそれに加える段階を含む前記方法が提供される。他の側面において、タバコをブレンドする方法であって、タバコブレンド中のオリエンタルタイプタバコを置き換えるか、減少させるかまたは削除し、本明細書に記載のイソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性を調節する(好ましくは増加させる)ことによって植物のショ糖エステル含量が調節された(好ましくは増加された)トランスジェニック植物、変異植物または天然に存在しない植物由来のタバコ(例えば、タバコ葉またはタバコ葉から誘導されるか、もしくは誘導可能な組成物)を加える前記方法が提供される。タバコ、例えばオリエンタルタバコの置換、減少または添加は、置換、減少または添加されるタバコの約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%または100%に相当することができる。
さらなる側面は、タバコまたはタバコ製品のフレーバーを調節する方法であって、本明細書に記載されるように植物のショ糖エステル含量が調節されたトランスジェニック植物、変異植物または天然に存在しない植物から誘導されるか、または誘導されることができるタバコをタバコ(例えば、タバコ葉またはタバコ葉から誘導されるか、もしくは誘導可能な組成物)またはタバコ製品に加えることを含む前記方法に関する。
さらなる側面は、タバコまたはタバコ製品のフレーバーを調節するための、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性を調節する薬剤の使用に関する。
植物におけるショ糖エステルレベルの調節は、植物の害虫抵抗性が改変された植物を製造するためにも用いることができる。植物の害虫抵抗性は、本明細書に記載されるようにショ糖エステルレベル産生を増加させることによって増加されることができる。植物の害虫抵抗性は、本明細書に記載されるように、ショ糖エステルレベル産生を低下させることによって低下させることができる。
本明細書に記載の植物において産生されるショ糖エステル組成物は、抽出されることができ、場合により、種々のさらなる使用のために、例えば薬物、食品添加剤、喫煙風味剤などにおける種々の目的のために、また有機農薬の成分として、それらから精製されることができる。一実施形態において、ショ糖エステルは葉または葉の表面から抽出される。従って、ショ糖エステルを含む製品、例えば薬物、食品添加剤、喫煙風味剤および有機農薬は、本開示のさらなる側面である。
本開示のショ糖エステルは、図5に示す一般構造(式中、R1、R2、R3、R4およびR5は水素原子またはアシル鎖のいずれかである)を有する。ショ糖エステルにおいて、エステル化されることができるアシル鎖を図6に示す。特定のショ糖エステルの一部の例を表1および図2に示す。
1以上のショ糖エステルのそれぞれにおけるR1、R2およびR4におけるアシル鎖の炭素総数は、例えば、12、13、14、15、16、17または18であり;適切には、14、15、16、17または18であり;適切には、16、17または18であり;あるいは適切には14または15であることができる。この炭素総数がショ糖エステルのそれぞれに存在する限り、構成アシル鎖は図6に示すもののいずれかから選択されることができる。適切には、ショ糖エステルはR3にアセチルを有し、R5にアセチルまたは水素を有する。適切には、ショ糖エステルはR3にアセチルを有し、R5に水素を有する。特に、6炭素アシル鎖が存在する場合、適切には、1以上、2以上または3以上のアシル鎖はβ-メチルバレリルである。
一実施形態において、ショ糖エステルは、R3およびR5にアセチルまたは水素を有し、位置R1、R2およびR4のいずれかに3、4、5または6炭素アシル鎖を有するショ糖エステルである。適切には、ショ糖エステルはR3にアセチルを有し、R5にアセチルまたは水素を有する。適切には、ショ糖エステルはR3にアセチルを有し、R5に水素を有する。他の実施形態において、ショ糖エステルは、R3およびR5にアセチルまたは水素を有し、位置R1、R2およびR4のいずれかに4、5または6炭素アシル鎖を有する。適切には、ショ糖エステルはR3にアセチルを有し、R5にアセチルまたは水素を有する。適切には、ショ糖エステルはR3にアセチルを有し、R5に水素を有する。他の実施形態において、ショ糖エステルは、R3およびR5にアセチルまたは水素を有し、位置R1、R2およびR4のいずれかに5または6炭素アシル鎖を有する。適切には、ショ糖エステルはR3にアセチルを有し、R5にアセチルまたは水素を有する。適切には、ショ糖エステルはR3にアセチルを有し、R5に水素を有する。他の実施形態において、ショ糖エステルはR3およびR5にアセチルまたは水素を有し、位置R1、R2およびR4に6炭素アシル鎖を有する。適切には、ショ糖エステルはR3にアセチルを有し、R5にアセチルまたは水素を有する。適切には、ショ糖エステルはR3にアセチルを有し、R5に水素を有する。
一実施形態において、ショ糖エステルは、R3およびR5にアセチルまたは水素を有し、位置R1に3、4、5または6炭素アシル鎖を有し、位置R2に3、4、5または6炭素アシル鎖を有し、位置R4に3、4、5または6炭素アシル鎖を有する。適切には、ショ糖エステルはR3にアセチルを有し、R5にアセチルまたは水素を有する。適切には、ショ糖エステルはR3にアセチルを有し、R5に水素を有する。他の実施形態において、ショ糖エステルはR3およびR5にアセチルまたは水素を有し、位置R1に4、5または6炭素アシル鎖を有し、位置R2に4、5または6炭素アシル鎖を有し、位置R4に4、5または6炭素アシル鎖を有する。適切には、ショ糖エステルはR3にアセチルを有し、R5にアセチルまたは水素を有する。適切には、ショ糖エステルはR3にアセチルを有し、R5に水素を有する。他の実施形態において、ショ糖エステルはR3およびR5にアセチルまたは水素を有し、位置R1に5または6炭素アシル鎖を有し、位置R2に5または6炭素アシル鎖を有し、位置R4に5または6炭素アシル鎖を有する。適切には、ショ糖エステルはR3にアセチルを有し、R5にアセチルまたは水素を有する。適切には、ショ糖エステルはR3にアセチルを有し、R5に水素を有する。
一実施形態において、ショ糖エステルはR3およびR5にアセチルまたは水素を有し、位置R1、R2およびR4の少なくとも1つに6炭素アシル鎖を有する。適切には、ショ糖エステルはR3にアセチルを有し、R5にアセチルまたは水素を有する。適切には、ショ糖エステルはR3にアセチルを有し、R5に水素を有する。
一実施形態において、ショ糖エステルはR3およびR5にアセチルまたは水素を有し、位置R1に6炭素アシル鎖を有し、位置R2に6炭素アシル鎖を有し、位置R4に6炭素アシル鎖を有する。適切には、ショ糖エステルはR3にアセチルを有し、R5にアセチルまたは水素を有する。適切には、ショ糖エステルはR3にアセチルを有し、R5に水素を有する。
一実施形態において、ショ糖エステルは(分枝鎖)β-メチルバレリル含有ショ糖エステルである。
一実施形態において、ショ糖エステルは図5に示す一般構造(式中、R1〜R5のそれぞれは、アセチル、ブチリル、プロピオニルもしくはその異性体、イソブチリル、バレリル(ペンタノイル)、2-メチル-ブチリル、イソバレリル、イソペンテノイル、ペンテノイル、ヘキサノイルもしくはその異性体2-メチルバレリル、β-メチルバレリルおよび4-メチルバレリルからなる群から選択されるアシル鎖のいずれか1つである)を有する。他の実施形態において、ショ糖エステルは、図5に示す一般構造(式中、R3はアセチルであり、R1、R2、R4およびR5のそれぞれは、アセチル、ブチリル、プロピオニルもしくはその異性体、イソブチリル、バレリル(ペンタノイル)、2-メチル-ブチリル、イソバレリル、イソペンテノイル、ペンテノイル、ヘキサノイルもしくはその異性体2-メチルバレリル、β-メチルバレリルおよび4-メチルバレリルからなる群から選択されるアシル鎖のいずれか1つである)を有する。一実施形態において、6炭素アシル鎖は分枝鎖であることが好ましい。他の実施形態において、6炭素アシル鎖はβ-メチルバレリルであることが好ましい。
他の実施形態において、ショ糖エステルは図5に示す一般構造(式中、R3は水素またはアセチルであり、R5は水素もしくはアセチルであり、R1、R2およびR4のそれぞれはアセチル、ブチリル、プロピオニルもしくはその異性体、イソブチリル、バレリル(ペンタノイル)もしくはその異性体、2-メチル-ブチリル、イソバレリル、イソペンテノイル、ペンテノイル、ヘキサノイルもしくはその異性体2-メチルバレリル、β-メチルバレリルおよび4-メチルバレリルからなる群から選択されるアシル鎖のいずれか1つである)を有する。個々のショ糖エステルは表1および図2に開示されている。
他の実施形態において、ショ糖エステルは図5に示す一般構造(式中、R3はアセチルであり、R5は水素もしくはアセチルであり、R1、R2およびR4のそれぞれはアセチル、ブチリル、プロピオニルもしくはその異性体、イソブチリル、バレリル(ペンタノイル)もしくはその異性体、2-メチル-ブチリル、イソバレリル、イソペンテノイル、ペンテノイル、ヘキサノイルもしくはその異性体2-メチルバレリル、β-メチルバレリルおよび4-メチルバレリルからなる群から選択されるアシル鎖のいずれか1つである)を有する。
他の実施形態において、ショ糖エステルは、図5に示す一般構造(式中、R3はアセチルであり、R5は水素もしくはアセチルであり;R1はブチリル、プロピオニルもしくはその異性体、バレリル(ペンタノイル)もしくはその異性体またはヘキサノイルもしくはその異性体であり;R2はプロピオニルもしくはその異性体、バレリル(ペンタノイル)もしくはその異性体またはヘキサノイルもしくはその異性体であり;R4はバレリル(ペンタノイル)もしくはその異性体またはヘキサノイルもしくはその異性体である)を有する。
他の実施形態において、ショ糖エステルは図5に示す一般構造(式中、R3はアセチルであり、R5は水素もしくはアセチルであり;R1はプロピオニルもしくはその異性体、バレリル(ペンタノイル)もしくはその異性体またはヘキサノイルもしくはその異性体であり;R2はバレリル(ペンタノイル)もしくはその異性体またはヘキサノイルもしくはその異性体であり;R4はヘキサノイルもしくはその異性体である)を有する。
一実施形態において、調節されたショ糖エステルは、図5に示す一般構造(式中、R3はアセチルであり、R1はプロピオニルもしくはその異性体であり、R2はプロピオニルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである);または図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はプロピオニルもしくはその異性体であり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はバレリルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである);または図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はブチリルであり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである)(C2C14:0))を有する。
一実施形態において、ショ糖エステルは図5に示す一般構造(式中、R3はアセチルであり、R1はプロピオニルもしくはその異性体であり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである);または図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はバレリルもしくはその異性体であり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はバレリルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである);または図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はブチリルであり、R2はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである)(C12C15:0))を有する。
一実施形態において、ショ糖エステルは図5に示す一般構造(式中、R3はアセチルであり、R1はバレリルもしくはその異性体であり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素原子もしくはアセチル部分のいずれかである)(C2C16:0))を有する。
一実施形態において、調節されたショ糖エステルは、図5に示す一般構造(式中、R3はアセチルであり、R1はプロピオニルもしくはその異性体であり、R2はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素原子もしくはアセチル部分のいずれかである)(C2C16:0))を有する。
一実施形態において、ショ糖エステルは図5に示す一般構造(式中、R3はアセチルであり、R1はバレリルもしくはその異性体であり、R2はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素原子もしくはアセチル部分のいずれかである)(C2C17:0))を有する。
一実施形態において、調節されたショ糖エステルは図5に示す一般構造(式中、R3はアセチルであり、R1はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R2はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素原子もしくはアセチル部分のいずれかである)(C2C18:0))を有する。
他の実施形態においてショ糖エステルは約594ダルトン〜692ダルトンの分子量を有する。一実施形態において、ショ糖エステルは約608ダルトン〜692ダルトンの分子量を有する。一実施形態において、ショ糖エステルは約622ダルトン〜692ダルトンの分子量を有する。一実施形態において、ショ糖エステルは約636ダルトン〜692ダルトンの分子量を有する。一実施形態において、ショ糖エステルは約650ダルトン〜692ダルトンの分子量を有する。一実施形態において、ショ糖エステルは約650ダルトン〜678ダルトンの分子量を有する。他の実施形態において、ショ糖エステルは約594ダルトン〜678ダルトンの分子量を有する。一実施形態において、ショ糖エステルは約608ダルトン〜678ダルトンの分子量を有する。一実施形態において、ショ糖エステルは約622ダルトン〜678ダルトンの分子量を有する。一実施形態において、ショ糖エステルは約636ダルトン〜678ダルトンの分子量を有する。一実施形態において、ショ糖エステルは約650ダルトン〜678ダルトンの分子量を有する。一実施形態において、ショ糖エステルは約664ダルトン〜678ダルトンの分子量を有する。
さらなる側面は、タバコまたはタバコ製品のフレーバーを調節する方法であって、それに本明細書に記載のショ糖エステル組成物を添加することを含む前記方法に関する。
他の実施形態において、植物におけるショ糖エステルの濃度、レベルまたは産生が増加される。他の実施形態において、植物におけるショ糖エステルの濃度、レベルまたは産生が低下される。
特定の一実施形態において、ショ糖エステルの濃度、レベルまたは産生が増加された植物または植物材料をもたらすことができる、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性が増加されるように改変された変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物を製造するための組成物および方法が提供される。特に本明細書に記載のショ糖エステルのレベルまたは産生が増加される、または低下される。
他の特定の実施形態において、ショ糖エステルの濃度、レベルまたは産生が低下した植物または植物材料をもたらすことができる、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性が低下または抑制されるように改変された変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物を製造するための組成物および方法が提供される。特に、本明細書に記載のショ糖エステルのレベルは低下されるかまたは障害される。
好都合には、本明細書に記載の方法によって得られる変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物は、視覚的外観が対照植物と同様であるか、または実質的に同じである。一実施形態において、変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物の幹の高さは、例えば、畑移植1か月、2か月もしくは3か月後または摘心10日、20日、30日もしくは36日後に、対照植物と実質的に同じである。例えば、変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物の幹の高さは、対照植物の幹の高さよりも低くない。他の実施形態において、変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物のクロロフィル含量は対照植物と実質的に同じである。他の実施形態において、変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物の幹の高さは、対照植物と実質的に同じであり、変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物のクロロフィル含量は対照植物と実質的に同じである。他の実施形態において、変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物の葉のサイズまたは形または数または色は対照植物と実質的に同じである。適切には、植物はタバコ植物である。
他の側面において、植物の少なくとも一部分においてショ糖エステル含量、例えばβ-メチルバレリルショ糖エステル含量を調節する方法であって、(i)植物においてイソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性を調節する段階であって、好ましくは、イソプロピルリンゴ酸シンターゼが本明細書に記載のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を含む前記段階；(ii)場合により段階(i)で得られた変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物の少なくとも一部分においてショ糖エステル含量を測定する段階；および(iii)変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物を同定する段階であって、前記植物中のショ糖エステル含量が、対照植物と比較して調節されている前記段階を含む前記方法が提供される。適切には、前記変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物の視覚的外観は、対照植物と実質的に同じである。適切には、植物はタバコ植物である。
他の側面において、植物の少なくとも一部分(例えば葉)におけるショ糖エステル含量、例えばβ-メチルバレリルショ糖エステル含量を増加させる方法であって、(i)植物におけるイソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性を増加させる段階であって、好ましくは、イソプロピルリンゴ酸シンターゼが本明細書に記載のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を含む前記段階；(ii)場合により段階(i)で得られた変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物の少なくとも一部分においてショ糖エステル含量を測定する段階；および(iii)変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物を同定する段階であって、前記植物中のショ糖エステル含量が、対照植物と比較して増加されている前記段階を含む前記方法が提供される。
他の側面において、植物の少なくとも一部分(例えば葉)におけるショ糖エステル含量、例えばβ-メチルバレリルショ糖エステル含量を減少させる方法であって、(i)植物におけるイソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性を低下させる段階であって、好ましくは、イソプロピルリンゴ酸シンターゼが本明細書に記載のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を含む前記段階；(ii)場合により段階(i)で得られた変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物の少なくとも一部分においてショ糖エステル含量を測定する段階；および(iii)変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物を同定する段階であって、前記植物中のショ糖エステル含量が、対照植物と比較して低下されている前記段階を含む前記方法が提供される。
好都合には、本明細書に記載の方法は、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性を増加させるさせることによってオリエンタル形質を有する植物を製造するために用いることもできる。従って、この実施形態によれば、非オリエンタル植物種、例えば鉄管乾燥種またはバーレー種植物は、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性がその中で増加されるように操作されることができる。それによって、植物に、好都合なオリエンタル形質を付与することができる。なぜなら、これによって、そのオリエンタルフレーバーを変化させる(例えば増加させるかまたは増強させる)ことができ、それによって、新規な芳香性の植物系統、変種または雑種を製造することができるからである。
本明細書に記載の方法は、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性を低下させることによって、オリエンタル形質が低下、抑制または障害される植物を製造するためにも用いることができる。従って、この実施形態によれば、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性がその中で低下されるようにオリエンタル植物種が操作されることができる。植物におけるオリエンタル形質の低下または障害は好都合であることができる。なぜなら、これによって、その中のオリエンタルフレーバーを変化または低下させることができ、それによって新規な芳香性の芳香族植物系統、変種または雑種を製造することができるからである。
対照植物と比較したイソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現の増加は、約5%〜約100%以上であることができ、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、100%、150%または200%以上の増加であることもでき、転写活性もしくはタンパク質発現またはその両方における増加を含む。
対照植物と比較してのイソプロピルリンゴ酸シンターゼの活性の増加は、約5%〜約100%以上であることもできるし、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、100%、150%または200%以上以上の増加であることもできる。
対照植物と比較してのイソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現の低下は、約5%〜約100%であることもできるし、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または100%の低下であることもでき、これは転写活性もしくはタンパク質発現またはその両方の低下を含む。
対照植物と比較してのイソプロピルリンゴ酸シンターゼの活性の低下は、約5%〜約100%の低下であることもでき、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または100%以上の低下であることもできる。
対照植物と比較してのショ糖エステル含量の増加は、約5%〜約100%であることもできるし、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または100%までの増加であることもできる。
対照植物と比較してのショ糖エステル含量の減少は、約5%〜約100%であることもできるし、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または100%までの減少であることもできる。
本明細書に記載のポリヌクレオチドおよび組換え構築物は、目的植物種、適切にはタバコにおいて、本明細書に記載のイソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現を調節するために用いることができる。
一側面は、本開示の変異植物、天然に存在しない植物、雑種植物、トランスジェニック植物の種子である。好ましくは、種子はタバコ種子である。さらなる側面は、本開示の変異植物、天然に存在しない植物、雑種植物、トランスジェニック植物の花粉または胚珠である。さらに、本発明は、雄性不稔を付与する核酸をさらに含む、本明細書に記載の変異植物、天然に存在しない植物、雑種植物、トランスジェニック植物を提供する。
本開示はまた、変異植物、天然に存在しない植物、雑種植物もしくはトランスジェニック植物またはその一部分の再生可能な細胞の組織培養物であって、その親のすべての形態学的および生理学的特性を発現することができる植物を再生する前記培養物を提供する。再生可能な細胞は、限定するものではないが、葉、花粉、胚、子葉、胚軸、根、根冠、葯、花およびその部分、胚珠、苗条、茎、幹、髄ならびにさく（capsules、鞘）またはそれらに由来するカルスもしくはプロトプラストからの細胞を含む。
本開示によれば、有用な系統、変種および雑種をつくるための植物育種プログラムに、変異イソプロピルリンゴ酸シンターゼ対立遺伝子を含む植物を用いることができる。特に、変異イソプロピルリンゴ酸シンターゼ対立遺伝子は、前述の商業的に重要な変種に遺伝子移入されることができる。従って、本明細書に記載の変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物を、他の植物、例えば異なる遺伝的同一性、異なる遺伝的背景、異なる変種、異なる系統、または異なる雑種を有する植物と交雑、育種または遺伝子移入することを含む植物の育種方法が提供される。一方法は、本明細書に記載の変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物と、栽培品種もしくは優良栽培品種もしくはニコチアナ属の植物、例えばニコチアナ・タバカム(例えば、バーレータイプ)とを交雑、育種または遺伝子移入することを含む。本方法は、さらに、子孫植物と他の植物とを交雑させ、場合により、望ましい遺伝形質または遺伝的背景を有する子孫が得られるまで交雑を繰り返すことを含むことができる。本方法はさらに、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性が調節された植物を同定する段階を含むことができる。本方法はさらに、対照植物と比較してイソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性が調節された植物を選択する段階を含むことができる。このような育種方法によって提供される目的の1つは、他の変種、育種系統、雑種または栽培品種、特に商業的利益のあるものに望ましい遺伝形質を導入することである。他の目的は、単一の植物変種、系統、雑種または栽培品種における異なる遺伝子の遺伝子改変のスタッキングを容易にすることである。種内交配ばかりでなく種間交配もまた考えられる。このような交雑に起因する子孫植物は、育種系統とも呼ばれ、本開示の天然に存在しない植物の例である。
一実施形態において、天然に存在しない植物を製造する方法であって、(a)変異植物またはトランスジェニック植物と第2植物とを交雑させて子孫のタバコ種子を得；(b)植物成長条件下で子孫のタバコ種子を成長させて天然に存在しない植物を得ることを含む前記方法が提供される。本方法はさらに、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性が調節された植物を同定する任意の段階を含むことができる。本方法は、さらに、(c)天然に存在しない植物の前世代と、それ自身または他の植物とを交雑させて子孫のタバコ種子を得；(d)植物成長条件下で段階(c)の子孫のタバコ種子を成長させて追加の天然に存在しない植物を得；(e)(c)および(d)の交雑および成長段階を複数回繰り返して天然に存在しない植物のさらなる世代を作ることを含むことができる。本方法は、場合により、段階(a)の前に、特性決定され、変異植物またはトランスジェニック植物とは同一ではない遺伝的同一性を含む親植物を提供する段階を含むことができる。いくつかの実施形態において、育種プログラムに応じて、天然に存在しない植物の世代をつくるために、0〜2回、0〜3回、0〜4回、0〜5回、0〜6回、0〜7回、0〜8回、0〜9回または0〜10回交雑および成長段階が繰り返される。親の1つの遺伝的同一性に近い遺伝的同一性を有する次世代における子孫植物を得るために、子孫が、その親の1つとその親に遺伝的に類似した他の植物と交配される戻し交雑は、このような方法の一例である。植物育種、特にタバコ植物育種の技術は公知であり、本開示の方法に用いることができる。本開示はさらに、これらの方法によって製造されるか、得られるか、または得ることができる天然に存在しない植物を提供する。
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、バリアントイソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子の育種およびスクリーニングから得られた系統は、標準的な畑手順を用いて畑で評価される。元の未変異親を含む対照遺伝子型も含まれ、記載事項はランダム化完全ブロックデザイン(randomized complete block design)または他の適切な畑設計で計画される。タバコについては、標準的作物学技法(standard agronomic practice)が用いられる。例えば、タバコは採取され、計量され、乾燥(curing)中および乾燥後に化学試験または他の通常の試験のためにサンプリングされる。選択された系統の親系統への類似性を確認するために、データの統計解析を行う。場合により、染色体相補対と染色体の対合関係を確認するために、選択された植物の細胞遺伝学解析が行われる。
一実施形態において、前述の育種、交雑または遺伝子移入方法によって得られるか、または得ることができる植物は、cisアビエノールを産生しないか、実質的にcisアビエノールを産生しないか、または検出可能レベルのcisアビエノールを産生しない。他の実施形態において、ショ糖エステル組成物および本明細書に記載の方法によって得られるか、または得ることができるショ糖エステル組成物は、cisアビエノールを含まないもしくは含有しないか、実質的レベルのcisアビエノールを含まないもしくは含有しないか、または検出可能レベルのcisアビエノールを含まないもしくは含有しない。従って、cisアビエノール形質は存在することもできるし、存在しないこともできる。
本明細書に記載の、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子の変異対立遺伝子の他のタバコへの導入または育種のためのマーカー支援選択(MAS)育種プログラムに、DNAフィンガープリンティング、一塩基多型、マイクロサテライトマーカーまたは類似の技術を用いることができる。例えば、ブリーダーは、農学的に望ましい遺伝子型を有する変異対立遺伝子を含む遺伝子型の雑種形成から分離集団を作り出すことができる。本明細書に記載の技術の1つを用いて、イソプロピルリンゴ酸シンターゼゲノム配列またはその断片から開発されたマーカーを用いてF2または戻し交雑世代の植物をスクリーニングすることができる。変異対立遺伝子を有することが明らかにされた植物は、スクリーニングされる第2集団を作り出すために、戻し交雑されるか、または自家受粉されることができる。予想される遺伝パターンまたは用いられるMAS技術に応じて、所望の個々の植物の同定の助けとするために、戻し交雑の各サイクルの前に、選択された植物を自家受粉することが必要な場合がある。反復親の所望の表現型が回復されるまで、戻し交雑または他の育種手順を繰り返すことができる。
本開示に従って、育種プログラムにおいて、交雑の成功によって、受精能力のあるF1植物が得られる。選択されたF1植物は、親の1つと交配されることができ、この第1戻し交雑世代植物は、自家受粉されて集団を生じ、これは再度、バリアントイソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子発現に関してスクリーニングされる(例えば、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子のヌルバージョン)。最終スクリーニングによって、受精能力があり、反復親とかなり類似している植物が提出されるまで、戻し交雑、自家受粉およびスクリーニングのプロセスが、例えば少なくとも4回繰り返される。必要に応じて、この植物は自家受粉され、続いて、その植物がバリアントイソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子発現を示すことを確認するために、その子孫を再度スクリーニングする。いくつかの実施形態において、F2世代における植物集団は、バリアントイソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子発現に関してスクリーニングされる。例えば、標準法、例えば、本明細書に記載のイソプロピルリンゴ酸シンターゼのヌクレオチド配列情報に基づくプライマーを用いるPCR法を用いる標準法に従って、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子の非存在によってイソプロピルリンゴ酸シンターゼを発現することができない植物が同定される。
第1変種の雌性親植物(すなわち種子親)の自家受粉を妨げ、第2変種の雄性親植物からの花粉を雌性親植物に受精させ、雌性植物にF1雑種種子を形成させることによって雑種タバコ変種を製造することができる。花の発達の初期において花を除雄することによって、雌性植物の自家受粉を防ぐことができる。あるいはまた、雄性不稔形を用いることによって、雌性親植物における花粉形成を防ぐことができる。例えば、細胞質雄性不稔(CMS)または、導入遺伝子が小胞子形成および／もしくは花粉形成を抑制するトランスジェニック雄性不稔または自家不和合性によって雄性不稔が生じる。CMSを含む雌性親植物が特に有用である。雌性親植物がCMSである実施形態において、雄性の受精能力のある植物から花粉が採取され、CMS雌性親植物の柱頭に人の手によって付けられ、得られたF1種子が採取される。
本明細書に記載の変種および系統は、単交雑タバコ一代雑種を形成させるために使用することができる。このような実施形態において、雄性親植物から雌性親植物への天然の異花受粉を容易にするために、親変種植物は、実質的に均一な自生集団として栽培することができる。慣用法によって、雌性親植物に形成されたF1種子が選択的に採取される。あるいはまた、2つの親植物変種をばらで栽培し、雌性親に形成された一代雑種種子と、自家受粉の結果として雄性親に形成された種子との混合物を採取することもできる。あるいはまた、雌性親として単交雑一代雑種が用いられ、異なる雄性親と交配される三系交雑を行うこともできる。他の選択肢として、2つの異なる単交雑のF1子孫をそれらで交配させた複交雑雑種を作ることができる。
所望の形質または表現型を有する集団のメンバーに関して、変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物の集団をスクリーニングまたは選択することができる。例えば、所望の発現レベルのポリペプチドまたはポリヌクレオチドを有する植物に関して、単一形質転換事象の子孫の集団をスクリーニングすることができる。発現レベルを同定するために、物理的および生化学的方法を用いることができる。これらには、ポリヌクレオチドの検出のためのサザン分析またはPCR増幅；RNA転写物を検出するためのノーザンブロット、S1 RNアーゼプロテクション法、プライマー伸長法またはRT-PCR増幅；ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの酵素またはリボザイム活性を検出するための酵素アッセイ；ならびに、ポリペプチドを検出するためのタンパク質ゲル電気泳動、ウェスタンブロット、免疫沈降および酵素免疫測定法が含まれる。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの存在または発現を検出するために、in situハイブリダイゼーション、酵素染色および免疫染色などの他の技術もまた使用することができる。
1以上の組換えポリヌクレオチド、例えば1以上の単離された本明細書に記載のポリヌクレオチド、1以上のポリヌクレオチド構築物、1以上の二本鎖RNA、1以上のコンジュゲートまたは1以上のベクター/発現ベクターを含む変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物細胞および植物が本明細書に記載される。
遺伝子発現は、例えば、RT-PCR、ノーザンブロット、RNアーゼプロテクション法、プライマー伸長法、ウェスタンブロット、タンパク質ゲル電気泳動、免疫沈降、酵素免疫測定法、チップアッセイおよび質量分析法を含む方法を用いて評価することができる。ポリペプチドが組織選択的プロモーターまたは広域発現プロモーターの制御下に発現される場合、発現は植物全体で評価されることもできるし、選択された組織で評価されることもできることに留意すべきである。同様に、ポリペプチドが特定の期間、例えば発達または誘導における特定の期間に発現される場合、発現は、所望の期間に選択的に評価されることができる。
限定するものではないが、本明細書に記載の植物は、発現または活性が調節される前または後に、他の目的のために改変されることができる。本開示の変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物において、以下の追加の遺伝子改変の1以上が存在することができる。一実施形態において、改変(単数または複数)のない対照植物またはその部分よりも、重金属含量の低い植物または植物の部分(例えば葉)を得るために、重金属の取り込みまたは重金属の輸送に関与する1以上の遺伝子が改変される。限定するものではない例は、カドミウムなどの重金属の輸送に関与する重金属排出輸送体(CDF)ファミリー、Zrt-、Irt様タンパク質(ZIP)ファミリー、カチオン交換体(CAX)ファミリー、銅トランスポーター(COPT)ファミリー、重金属P型ATPアーゼ(HMA、WO2009074325の記載による)ファミリー、自然耐性関連マクロファージタンパク質(NRAMP)のホモログのファミリーおよびATP結合カセット(ABC)トランスポーターファミリーにおける遺伝子を含む。本明細書において、用語重金属は遷移金属を含む。他の実施形態において、加熱されたとき、対照植物またはその部分よりも低いレベルの少なくとも1つのタバコ特異的ニトロソアミン(例えば、4-(メチルニトロソアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタノン、N-ニトロソノルニコチン、N-ニトロソアナタビンおよびN-ニトロソアナバシン)を生じる植物または植物の部分(例えば葉)を得るために、窒素代謝中間体の変換に関与する1以上の遺伝子が改変される。改変されることができる遺伝子の限定するものではない例は、ニコチンのノルニコチンへの変換に関与し、WO2006091194、WO2008070274、WO2009064771およびPCT/US2011/021088に記載されている、ニコチンデメチラーゼをコードする遺伝子、例えばCYP82E4、CYP82E5およびCYP82E10を含む。
他の改変の例は、除草剤耐性を含む。例えば、グリホサートは、多くの広域スペクトル除草剤の活性成分である。aroA遺伝子(サルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella thyphimurium)およびE.コリ(E. coli)からのグリホサートEPSP合成酵素)を導入することによって、グリホサート抵抗性トランスジェニック植物が開発された。アラビドプシスからの変異ALS(アセト乳酸合成酵素)遺伝子を形質転換することによって、スルホニル尿素抵抗性植物が作られた。アトラジン抵抗性トランスジェニック植物を作るために、変異体アマランサス・ヒブリダス(Amaranthus hybridus)からの光化学系IIのOBタンパク質が植物に導入され；細菌クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)からのbxn遺伝子を組み込むことによって、ブロモキシニル抵抗性トランスジェニック植物が作られた。他の例示的な改変は、昆虫に抵抗性を示す植物をもたらす。バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)(Bt)毒素は、ブロッコリーにおいて最近明らかにされたBt抵抗性害虫の出現を遅らせる効果的な方法を提供することができる。組み入れたcry1Acおよびcry1C Bt遺伝子は、いずれか1つのタンパク質に抵抗性を示すコナガの広がりを食い止め、抵抗性昆虫の発生を顕著に遅らせた。他の例示的な改変は、病原体(例えばウイルス、細菌、真菌)によって引き起こされる疾患に耐性を示す植物をもたらす。Xa21遺伝子(白葉枯病に対する耐性)を発現する植物と、Bt融合遺伝子およびキチナーゼ遺伝子の両方(サンカメイガに対する抵抗性およびシースに対する抵抗性)を発現する植物が操作された。他の例示的な改変は、改変された生殖能力、例えば雄性不稔をもたらす。他の例示的な改変は、非生物的ストレス(例えば渇水、温度、塩分)に耐性のある植物をもたらす。耐性のあるトランスジェニック植物は、アラビドプシスからのアシルグリセロールリン酸酵素を導入することによって作られた。マンニトールおよびソルビトールの合成に関与するマンニトール脱水素酵素およびソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子は渇水耐性を改善する。他の例示的な改変は、ヒトでの使用に好ましい免疫原性を有するタンパク質を産生する植物をもたらす。例えば、そのN-グリカンにおいて、α-1,3-結合型フコース残基、β-1,2-結合型キシロース残基またはその両方を実質的に欠くタンパク質を産生することができる植物を使用することができる。他の例示的な改変は、タンパク質およびオイルの貯蔵が改善された植物、光合成効率が増強された植物、長期の保存期限を有する植物、炭水化物含量が改善された植物および真菌に耐性を示す植物ならびにアルカロイドの生合成に関与する酵素をコードする植物をもたらすことができる。S-アデノシル-L-メチオニン(SAM)および／またはシスタチオニンγ合成酵素(CGS)の発現が調節されたトランスジェニック植物もまた考えられる。
1以上のこのような形質は、他の植物またはタバコ栽培品種から変異タバコ植物、天然に存在しないタバコ植物またはトランスジェニックタバコ植物に遺伝子移入されることもできるし、またはそれに直接に形質転換されることもできる。本開示の変異タバコ植物、天然に存在しないタバコ植物またはトランスジェニックタバコ植物への形質(単数または複数)の遺伝子移入は、当該技術分野で公知の植物育種の任意の方法、例えば、系統育種、戻し交雑、倍加半数体育種などによって達成されることができる(Wernsman, E. A, and Rufty, R. C. 1987. Chapter Seventeen. Tobacco. Pages 669-698 In: Cultivar Development. Crop Species. W. H. Fehr (ed.), MacMillan Publishing Co, Inc., New York, N.Y 761 pp. 参照)。前述の分子生物学ベースの技術、特にRFLPおよびマイクロサテライトマーカーは、反復親と最も高い程度の遺伝的同一性を有する子孫を同定する戻し交雑において用いることができる。これによって、反復親と少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも99%遺伝的同一性を有し、より好ましくは、反復親と遺伝的に同一であり、ドナー親から遺伝子移入された形質(単数または複数)をさらに含むタバコ変種の産生を速めることが可能になる。遺伝的同一性のこのような決定は、当該技術分野で公知の分子マーカーに基づくことができる。
導入される核酸(単数または複数)のための純粋な育種子孫を得るために、最後の戻し交雑世代を自殖することができる。得られた植物は、一般に、導入された形質(単数または複数)(例えば、1以上の単一遺伝子形質)に加えて、本開示の変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物の本質的にすべての形態学的および生理学的特性を有する。適切な試験プロトコルを決定するためには、正確な戻し交雑プロトコルは、改変される形質に左右される。導入される形質が優位な対立遺伝子である場合は、戻し交雑方法は簡単であるが、劣性対立遺伝子もまた導入することができる。この場合は、所望の形質の導入に成功したかどうかを決定するために、子孫の検査を取り入れることが必要である場合がある。
組換えポリヌクレオチドをそのゲノムに組み込み、安定的に形質転換させることによって、植物または植物細胞を形質転換することができる。安定的に形質転換された細胞は、一般的には、各細胞分裂において、導入されたポリヌクレオチドを保持する。植物または植物細胞は、組換えポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれないように、一過性に形質転換されることもできる。一過性に形質転換された細胞は、一般的には、各細胞分裂において、導入された組換えポリヌクレオチドの全部または一部を失い、十分な細胞分裂回数後には、娘細胞において、導入された組換えポリヌクレオチドを検出することができない。
高分子化合物、例えばタンパク質(例えば抗体)、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマー(例えばポリエチレングリコール)またはそれらの組み合わせを含むコンジュゲートされる部分が開示される。オリゴヌクレオチドの細胞内取り込みを増加させる部分にオリゴヌクレオチドをコンジュゲートすることができる。部分の限定するものではない例は、限定するものではないが、抗体、ポリペプチド、コレステロール部分などの脂質部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル-s-トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、オクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分を含む。部分は正に荷電したポリマー、例えば正に荷電したペプチド、すなわち例えば、長さ約1〜50アミノ酸残基のポリアルキレンオキシド、例えばポリエチレングリコール(PEG)またはポリプロピレングリコールであることができる。適切には、正に荷電したポリマー、例えばポリアルキレンオキシドば、リンカー、例えば放出可能なリンカーによってオリゴマーに結合されることができる。
ポリペプチドの発現が測定される場合、細胞内でのポリペプチドをコードするmRNAの量の検出は、例えば、PCRまたはノーザンブロットによって定量することができる。試料中のポリペプチド量の変化が測定される場合、細胞内のポリペプチド量を定量するために、公知の技術を用い、抗体を使用してそれを検出することができる。あるいはまた、酵素の生物活性は、当該分野で公知の方法を用いて測定することができる。
他の実施形態において、ポリペプチドに免疫反応性を有する抗体が本明細書で提供される。本明細書に記載のポリペプチド、断片、バリアント、融合ポリペプチドなどは、それに対して免疫反応性を有する抗体の産生において”免疫原”として用いることができる。このような抗体は、その抗体の抗原結合部位を介してポリペプチドに特異的に結合することができる。特異的に結合する抗体は、ポリペプチド、ホモログおよびバリアントを特異的に認識し、それに結合するが、他の分子にはそうではない抗体である。一実施形態において、抗体は、本明細書に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的であり、他のポリペプチドとは交差反応しない。
より具体的には、ポリペプチド、断片、バリアント、融合ポリペプチドなどは、抗体の形成を誘導する抗原決定基またはエピトープを含む。これらの抗原決定基またはエピトープは、線状または立体配座(不連続)のいずれかであることができる。線状エピトープはポリペプチドのアミノ酸の単一部分で構成されるが、立体配座または不連続エピトープは、ポリペプチドのフォールディングによって近接近に導かれた異なる領域のアミノ酸部分で構成される。エピトープは、当該技術分野で公知の方法のいずれかによって同定されることができる。さらに、ポリペプチドからのエピトープは、アッセイにおいて研究試薬として用いることもでき、ポリクローナル血清または培養ハイブリドーマ上清などの物質から特定の結合性抗体を精製するために用いることもできる。このようなエピトープまたはそのバリアントは、ポリペプチドの固相合成、化学的切断または酵素切断などの当該技術分野で公知の技術を用いて作成することもできるし、組換えDNA技術を用いて作成することもできる。
ポリペプチドに対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、共に、慣用法によって製造することができる。ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株もまた、本明細書において考えられる。このようなハイブリドーマは、慣用法によって作成され、同定されることができる。抗体の産生のために、ポリペプチド、断片、バリアントまたはそれらの変異体を用いる注射によって種々の宿主動物を免疫することができる。このような宿主動物は、いくつか例をあげれば、限定するものではないが、ウサギ、マウスおよびラットを含むことができる。免疫応答を増強させるために、種々のアジュバントを用いることができる。宿主種に応じて、このようなアジュバントは、限定するものではないが、フロイントアジュバント(完全および不完全)、無機ゲル、例えば水酸化アルミニウム、界面活性剤、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールならびに潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばBCG(カルメット・ゲラン菌(bacille Calmette-Guerin))およびコリネバクテリウム・パルバム(Corynebacterium parvum)を含む。モノクローナル抗体は、慣用法によって回収することができる。このようなモノクローナル抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDおよびそれらの任意のサブクラスを含む任意の免疫グロブリンクラスのものであることができる。
抗体は、in vitroまたはin vivoのいずれかで、ポリペプチドまたは断片の存在を検出するためのアッセイにも用いることができる。抗体は、イムノアフィニティクロマトグラフィーによるポリペプチドまたは断片の精製に用いることもできる。
種々の実施形態は、イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドの発現レベルが調節された変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物ばかりでなく、バイオマスもまた提供する。
このような植物、特にタバコ植物の一部、より具体的には、タバコ植物の葉身および中骨は、エアゾール形成材料、エアゾール形成装置、喫煙物品、喫煙用物品、無煙製品およびタバコ製品を含むがこれに限定されない種々の消費財の製造に組み込まれることもできるし、使用されることもできる。エアゾール形成材料の例は、限定するものではないが、タバコ組成物、タバコ、タバコ抽出物、刻みタバコ、カットフィラー、乾燥タバコ、膨張タバコ、破砕タバコ、再構成タバコおよびパイプタバコを含む。喫煙物品および喫煙用物品はエアゾール形成装置のタイプである。喫煙物品または喫煙用物品の例は、限定するものではないが、紙巻きタバコ、シガリロおよび葉巻を含む。無煙製品の例は、噛みタバコおよびかぎタバコを含む。特定のエアゾール形成装置において、タバコ組成物または他のエアゾール形成材料は、燃焼よりはむしろ、エアゾールを形成させる1以上の電熱線によって加熱される。他のタイプの加熱エアゾール形成装置において、物理的にエアゾール形成材料を分けるために、熱源内、熱源の周り、または熱源の下流に位置する燃焼性燃料体からの熱を伝えることによってエアゾールが形成される。無煙タバコ製品および種々のタバコ含有エアゾール形成材料は、任意の形式で、他の成分、例えば薄片、フィルム、錠剤、フォームまたはビーズに沈着された、混合された、囲まれた、または他の風に混合された、乾燥粒子、破片、顆粒、粉末またはスラリーを含む任意の形態のタバコを含むことができる。本明細書において、用語‘煙’は、喫煙物品、例えば紙巻きタバコによって生じるか、またはエアゾール形成材料を燃焼させることによって生じるエアゾールのタイプを説明するために用いられる。
一実施形態において、本明細書に記載の変異体、トランスジェニックおよび天然に存在しない植物からの乾燥材料もまた提供される。緑色タバコ葉を乾燥させるプロセスは、当業者には公知であり、限定するものではないが、空気乾燥、火力乾燥、鉄管乾燥および天日乾燥を含む。緑色タバコ葉を乾燥するプロセスは、採取したタバコのタイプに左右される。例えば、Virginia flue(bright)タバコは一般的には鉄管乾燥され、バーレーおよび特定のダーク株は通例空気乾燥され、パイプタバコ、噛みタバコおよびかぎタバコは通例火力乾燥される。
他の実施形態において、本明細書に記載の変異タバコ植物、トランスジェニックタバコ植物または天然に存在しないタバコ植物からの葉、好ましくは乾燥葉を含むタバコ含有エアゾール形成材料を含むタバコ製品が開示される。本明細書に記載のタバコ製品は、未改変タバコをさらに含むことができるブレンドタバコ製品であることができる。
これらのエアゾール形成材料またはタバコ組成物におけるショ糖エステルの%は、非変異植物、天然に存在しない植物または非トランスジェニックカウンターパート植物由来のエアゾール形成材料またはタバコ組成物と比較して少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%および100%であることもでき、150%、または200%以上であることもできる。
これらのエアゾール形成材料またはタバコ組成物におけるショ糖エステルの%は、非変異植物、天然に存在しない植物または非トランスジェニックカウンターパート植物由来のエアゾール形成材料またはタバコ組成物と比較して、少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%および100%以下であることができる。
変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物は、他の用途、例えば農業における用途を有することができる。例えば、本明細書に記載の変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物は、動物飼料およびヒト食品を製造するために用いることができる。
本開示はまた、種子を製造する方法であって、本明細書に記載の変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物を栽培し、栽培した植物から種子を採取することを含む前記方法を提供する。本明細書に記載の植物からの種子は、コンディショニングし、当該技術分野で公知の手段によって包装材料に入れて製品を作ることができる。紙および布などの包装材料は当該分野で公知である。種子の包装は、その中の種子の性質を説明するラベル、例えば、包装材料に固定したタグもしくはラベル、包装材料上に印刷したラベルまたは、包装内に挿入したラベルを有することができる。
さらなる側面は、ショ糖エステルを製造する方法であって、(a)変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物の一部分;バイオマス、種子または葉;または本明細書に記載のタバコ製品を提供する段階；および(b)それらからショ糖エステルを抽出する段階；および場合によりショ糖エステルを精製する段階を含む前記方法に関する。
さらなる側面は、β-メチル吉草酸を製造する方法であって、(a)変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物の一部分；バイオマスもしくは葉；または本明細書に記載のエアゾール形成材料を提供する段階；(b)段階(a)で得られた材料もしくはまたはその抽出物を加水分解する段階；および(c)場合によりβ-メチル吉草酸を回収する段階を含む前記方法に関する。β-メチル吉草酸は、プラスチック、有益な特性を含む材料を与えることができるポリヒドロキシアルカノエートなどの産生に用いることができる。製造することができるプラスチックは生分解性であり、従ってバイオプラスチックの製造に用いることができる。本明細書に記載のイソプロピルリンゴ酸シンターゼを発現させるために、E.コリまたはシュードモナス(Pseudomonas)などの細菌を操作することができる。適切には、用いられる細菌は、ポリヒドロキシアルカノエートもまた産生するように操作されることができる。微生物系を用いるポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、例えば、米国特許第5,750,848号および米国特許第6,492,134号に記載されている。従って、一側面は、イソプロピルリンゴ酸シンターゼおよび、場合によりポリヒドロキシアルカノエートを製造するための1以上の遺伝子を含む細菌に関する。さらなる側面は、細菌の使用を含むポリヒドロキシアルカノエートの製造方法に関する。
一実施形態において、本明細書に記載の変異体、トランスジェニックおよび天然に存在しない植物からの乾燥材料もまた提供される。例えば緑色タバコ葉を乾燥させるプロセスは、当業者には公知であり、限定するものではないが、空気乾燥、火力乾燥、鉄管乾燥および天日乾燥を含む。緑色タバコ葉を乾燥するプロセスは、採取したタバコのタイプに左右される。例えば、Virginia flue(bright)タバコは一般的には鉄管乾燥され、バーレーおよび特定のダーク株は通例空気乾燥され、パイプタバコ、噛みタバコおよびかぎタバコは通例火力乾燥される。
他の実施形態において、本明細書に記載の変異植物、トランスジェニック植物および天然に存在しない植物からの葉、例えば乾燥葉を含むタバコ製品または本明細書に記載の方法によって製造されるタバコ製品を含むタバコ製品が開示される。本明細書に記載のタバコ製品は、さらに、未改変タバコを含むことができる。
他の実施形態において、本明細書に記載の変異植物、トランスジェニック植物および天然に存在しない植物からの葉、例えば乾燥葉を含む植物材料を含むタバコ製品が開示される。例えば、植物材料は、タバコ製品の内側または外側に添加されることができ、それによって燃焼時に望ましい香りが放出される。この実施形態によるタバコ製品は、未改変タバコであることさえもできるし、改変タバコであることもできる。この実施形態によるタバコ製品は、本明細書に開示された遺伝子以外の1以上の遺伝子における改変を含む、変異植物、トランスジェニック植物または天然に存在しない植物由来のものであることさえもできる。
さらなる側面は、本明細書に記載のショ糖エステルの1以上を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる(単離された)ショ糖エステル組成物に関する。ショ糖エステルは、R1、R2およびR4におけるアシル鎖の炭素総数が14であるショ糖エステル；R1、R2およびR4におけるアシル鎖の炭素総数が15であるショ糖エステル；R1、R2およびR4におけるアシル鎖の炭素総数が16であるショ糖エステル；R1、R2およびR4におけるアシル鎖の炭素総数が17であるショ糖エステル；ならびにR1、R2およびR4におけるアシル鎖の炭素総数が18であるショ糖エステルであることができる。この炭素総数が存在する限り、構成アシル鎖は図6に示すもののいずれかから選択されることができる。適切には、ショ糖エステルはR3にアセチルを有し、R5にアセチルまたは水素を有する。適切には、ショ糖エステルはR3にアセチルを有し、R5に水素を有する。適切には、1以上、2以上または3以上のアシル鎖はβ-メチルバレリルである。従って、例として、ショ糖エステルは図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はプロピオニルもしくはその異性体であり、R2はプロピオニルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである);または図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はプロピオニルもしくはその異性体であり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はバレリルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである);または図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はブチリルであり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである)(C2C14:0);図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はプロピオニルもしくはその異性体であり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである);または図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はバレリルもしくはその異性体であり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はバレリルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである);または図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はブチリルであり、R2はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである)(C2C15:0);図5に示す一般構造を有するショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はバレリルもしくはその異性体であり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素原子もしくはアセチル部分のいずれかである)(C2C16:0);または図5に示す一般構造を有するショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はプロピオニルもしくはその異性体であり、R2はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素原子もしくはアセチル部分のいずれかである)(C2C16:0);図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はバレリルもしくはその異性体であり、R2はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素原子もしくはアセチル部分のいずれかである)(C2C17:0);および図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はヘキサノイルでありもしくはその異性体、R2はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素原子もしくはアセチル部分のいずれかである)(C2C18:0)であることができる。
あるいはまた、ショ糖エステルは、R1、R2およびR4におけるアシル鎖の炭素総数が14であるショ糖エステル；R1、R2およびR4におけるアシル鎖の炭素総数が15であるショ糖エステル；R1、R2およびR4におけるアシル鎖の炭素総数が16であるショ糖エステル；R1、R2およびR4におけるアシル鎖の炭素総数が17であるショ糖エステル；であることができ、R1、R2およびR4におけるアシル鎖の炭素総数が18であるショ糖エステルが存在しないか、実質的に存在しないか、または検出可能レベルで存在しない(C2C18:0)。この炭素総数が存在する限り、構成アシル鎖は図6に示すもののいずれかから選択されることができる。適切には、ショ糖エステルはR3にアセチルを有し、R5にアセチルまたは水素を有する。適切には、ショ糖エステルはR3にアセチルを有し、R5に水素を有する。適切には、1以上、2以上または3以上のアシル鎖はβ-メチルバレリルである。従って、例として、ショ糖エステルは図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はプロピオニルもしくはその異性体であり、R2はプロピオニルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである);または図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はプロピオニルもしくはその異性体であり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はバレリルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである);または図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はブチリルであり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである)(C2C14:0);図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はプロピオニルもしくはその異性体であり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである);または図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はバレリルもしくはその異性体であり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はバレリルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである);または図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はブチリルであり、R2はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである)(C2C15:0);図5に示す一般構造を有するショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はバレリルもしくはその異性体であり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素原子もしくはアセチル部分のいずれかである)(C2C16:0);または図5に示す一般構造を有するショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はプロピオニルもしくはその異性体であり、R2はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素原子もしくはアセチル部分のいずれかである)(C2C16:0);図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はバレリルもしくはその異性体であり、R2はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素原子もしくはアセチル部分のいずれかである)(C2C17:0);であることができ、図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R2はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素原子もしくはアセチル部分のいずれかである)が存在しないか、実質的に存在しないか、または検出可能レベルで存在しない(C2C18:0)。
あるいはまた、ショ糖エステルは、R1、R2およびR4におけるアシル鎖の炭素総数が14であるショ糖エステル；R1、R2およびR4におけるアシル鎖の炭素総数が15であるショ糖エステル；R1、R2およびR4におけるアシル鎖の炭素総数が16であるショ糖エステル；であることができ、R1、R2およびR4におけるアシル鎖の炭素総数が17であるショ糖エステルは存在しないか、実質的に存在しないか、または検出可能レベルで存在せず；R1、R2およびR4におけるアシル鎖の炭素総数が18であるショ糖エステルは、存在しないか、実質的に存在しないか、または検出可能レベルで存在しない。この炭素総数が存在する限り、構成アシル鎖は図6に示すもののいずれかから選択されることができる。適切には、ショ糖エステルはR3にアセチルを有し、R5にアセチルまたは水素を有する。適切には、ショ糖エステルはR3にアセチルを有し、R5に水素を有する。適切には、1以上、2以上または3以上のアシル鎖はβ-メチルバレリルである。従って、例として、ショ糖エステルは、図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はプロピオニルもしくはその異性体であり、R2はプロピオニルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである);または図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はプロピオニルもしくはその異性体であり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はバレリルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである);または図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はブチリルであり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである)(C2C14:0);図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はプロピオニルもしくはその異性体であり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである);または図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はバレリルもしくはその異性体であり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はバレリルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである);または図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はブチリルであり、R2はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである)(C2C15:0);a図5に示す一般構造を有するショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はバレリルもしくはその異性体であり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素原子もしくはアセチル部分のいずれかである)(C2C16:0);または図5に示す一般構造ショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はプロピオニルもしくはその異性体であり、R2はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素原子もしくはアセチル部分のいずれかである)(C2C16:0);であることができ、図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はバレリルもしくはその異性体であり、R2はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素原子もしくはアセチル部分のいずれかである)は存在しないか、実質的に存在しないか、または検出可能レベルで存在せず(C2C17:0);図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R2はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素原子もしくはアセチル部分のいずれかである)は存在しないか、実質的に存在しないか、または検出可能レベルで存在しない(C2C18:0)。
あるいはまた、ショ糖エステルは、R1、R2およびR4におけるアシル鎖の炭素総数が14であるショ糖エステル；R1、R2およびR4におけるアシル鎖の炭素総数が15であるショ糖エステル；であることができ、R1、R2およびR4におけるアシル鎖の炭素総数が16であるショ糖エステルは存在しないか、実質的に存在しないか、または検出可能レベルで存在せず；R1、R2およびR4におけるアシル鎖の炭素総数が17であるショ糖エステルは存在しないか、実質的に存在しないか、または検出可能レベルで存在せず；R1、R2およびR4におけるアシル鎖の炭素総数が18であるショ糖エステルは存在しないか、実質的に存在しないか、または検出可能レベルで存在しない。この炭素総数が存在する限り、構成アシル鎖は図6に示すもののいずれかから選択されることができる。適切には、ショ糖エステルはR3にアセチルを有し、R5にアセチルまたは水素を有する。適切には、ショ糖エステルはR3にアセチルを有し、R5に水素を有する。適切には、1以上、2以上または3以上のアシル鎖はβ-メチルバレリルである。従って、例として、ショ糖エステルは、図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はプロピオニルもしくはその異性体であり、R2はプロピオニルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである);または図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はプロピオニルもしくはその異性体であり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はバレリルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである);または図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はブチリルであり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである)(C2C14:0);図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はプロピオニルもしくはその異性体であり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである);または図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はバレリルもしくはその異性体であり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はバレリルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである);または図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はブチリルであり、R2はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素もしくはアセチルである)(C2C15:0);であることができ、図5に示す一般構造を有するショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はバレリルもしくはその異性体であり、R2はバレリルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素原子もしくはアセチル部分のいずれかである)は存在しないか、実質的に存在しないか、または検出可能レベルで存在せず(C2C16:0);図5に示す一般構造を有するショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はプロピオニルもしくはその異性体であり、R2はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素原子もしくはアセチル部分のいずれかである)は存在しないか、実質的に存在しないか、または検出可能レベルで存在せず(C2C16:0);図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はバレリルもしくはその異性体であり、R2はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素原子もしくはアセチル部分のいずれかである)は存在しないか、実質的に存在しないか、または検出可能レベルで存在せず(C2C17:0);図5に示すショ糖エステル(式中、R3はアセチルであり、R1はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R2はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R4はヘキサノイルもしくはその異性体であり、R5は水素原子もしくはアセチル部分のいずれかである)は存在しないか、実質的に存在しないか、または検出可能レベルで存在しない(C2C18:0)。
さらなる側面は、本明細書に記載のイソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現またはそれによってコードされるタンパク質の活性が、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現またはそれによってコードされるタンパク質の活性が増加されていない対照植物と比較して増加された変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物(適切にはタバコ植物)であって、前記対照植物よりも高いレベルでβ-メチルバレリル含有ショ糖エステルを産生する前記植物に関する。さらなる側面は、本明細書に記載のイソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現またはそれによってコードされるタンパク質の活性が、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現またはそれによってコードされるタンパク質の活性が低下された対照植物と比較して低下された変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物(適切にはタバコ植物)であって、β-メチルバレリル含有ショ糖エステルの産生が前記対照植物よりも低い前記植物に関する。
さらなる側面は、本明細書に記載のイソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現またはそれによってコードされるタンパク質の活性が、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現またはそれによってコードされるタンパク質の活性が増加されていない対照植物と比較して増加された変異鉄管乾燥タバコ植物、天然に存在しない鉄管乾燥タバコ植物もしくはトランスジェニック鉄管乾燥タバコ植物であって、β-メチルバレリル含有ショ糖エステルの産生が前記対照植物よりも高い前記植物に関する。
さらなる側面は、本明細書に記載のイソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現またはそれによってコードされるタンパク質の活性が、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現またはそれによってコードされるタンパク質の活性が低下されていない対照植物と比較して低下される変異オリエンタルタバコ植物、天然に存在しないオリエンタルタバコ植物もしくはトランスジェニックオリエンタルタバコ植物であって、β-メチルバレリル含有ショ糖エステルの産生が前記対照植物よりも低い前記植物に関する。
本明細書に記載の変異タバコ植物、天然に存在しないタバコ植物またはトランスジェニックタバコ植物を採取し、それから得られるタバコを選択されたタバコタイプに関して知られる技法を用いて処理または乾燥することができる。葉の表面化合物は、例えば水または有機溶媒による洗浄を用いて採取し、続いて完全に乾燥することができる。次いで、得られた粉末を、喫煙材料のフレーバー特性を高めるため用いることができる。洗浄後に残ったタバコ材料は、次に、例えば膨張タバコの材料として用いることができる。
他の側面において、植物の少なくとも一部分において害虫抵抗性を調節する方法であって、(i)植物におけるイソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性を調節する段階であって、好ましくは、イソプロピルリンゴ酸シンターゼが本明細書に記載のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を含む前記段階；(ii)場合により、段階(i)において得られた変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物の少なくとも一部分においてβ-メチルバレリルショ糖エステルの量を測定する段階；(iii)その中のβ-メチルバレリル含有ショ糖エステルの量が、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性が調節されていない対照植物と比較して変化している変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物を同定する段階であって、好ましくは、前記変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物の視覚的外観が対照植物と実質的に同じである前記段階；および(iv)その害虫抵抗性が調節された植物を得る段階を含む前記方法が提供される。
適切には、植物少なくとも一部分において害虫抵抗性を増加させる方法であって、(i)植物においてイソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性を増加させる段階であって、好ましくは、イソプロピルリンゴ酸シンターゼが本明細書に記載のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を含む前記段階；(ii)場合により、段階(i)において得られた変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物の少なくとも一部分においてβ-メチルバレリルショ糖エステルの量を測定する段階；(iii)その中のβ-メチルバレリル含有ショ糖エステルの量が、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性が増加されていない対照植物と比較して増加している変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物を同定する段階であって、好ましくは、前記変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物の視覚的外観が対照植物と実質的に同じである前記段階；および(iv)その害虫抵抗性が増加された植物を得る段階を含む前記方法が提供される。
前記方法によって得られるか、または得ることができる植物または植物材料もまた提供される。
さらなる側面は、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現またはそれによってコードされるタンパク質の活性が、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性が調節されていない対照植物と比較して調節され、植物の少なくともの一部分がβ-メチルバレリル含有ショ糖エステル組成物の変化を有する変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物であって、前記植物の視覚的外観が対照植物と実質的に同じであり、その害虫抵抗性もまた調節された前記植物に関する。
適切には、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現またはそれによってコードされるタンパク質の活性が、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性が増加されていない対照植物と比較して増加され、植物の少なくともの一部分がβ-メチルバレリル含有ショ糖エステル(単数または複数)組成物の変化を有する変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物であって、前記植物の視覚的外観が対照植物と実質的に同じであり、その害虫抵抗性もまた増加された前記植物が提供される。
同定、選択または育種のために植物を遺伝子型決定するための組成物、方法およびキットが含まれ、試料中のイソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドの存在を検出する手段を含むことができる。従って、イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドの少なくとも一部を特異的に増幅するための1以上のプライマーを含み、場合により1以上のプローブを含み、場合により増幅または検出を行うための1以上の試薬を含む組成物が開示される。イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドに対応する約10以上の連続ポリヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブが開示される。前記プライマーまたはプローブは、イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドにハイブリダイズする(例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズする)約15、20、25、30、40、45または50以上の連続ポリヌクレオチドを含むか、またはそれらからなることができる。いくつかの実施形態において、プライマーまたはプローブは、遺伝子同定の配列依存的方法(例えば、サザンハイブリダイゼーション)または単離(例えば、細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのin situハイブリダイゼーション)または遺伝子検出(例えば、核酸増幅または検出における1以上の増幅として)に用いることができる約10〜50連続ヌクレオチド、約10〜40連続ヌクレオチド、約10〜30連続ヌクレオチドまたは約15〜30連続ヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。1以上の特異的プライマーまたはプローブは、イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドの一部または全部を増幅または検出するために設計または使用することができる。具体例として、DNAまたはRNAなどのイソプロピルリンゴ酸シンターゼ核酸をコードする核酸フラグメントを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応プロトコルにおいて2つのプライマーを用いることができる。また、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ核酸配列由来の1つのプライマーと、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ核酸配列の上流または下流の配列、例えばイソプロピルリンゴ酸シンターゼプロモーター配列、mRNA前駆体の3'末端またはベクター由来の配列などにハイブリダイズするもう1つのプライマーとを用いるポリメラーゼ連鎖反応を行うこともできる。ポリヌクレオチドのin vitro増幅に有用な加熱および等温技術の例は当該分野で公知である。試料は、本明細書に記載の植物、植物細胞もしくは植物材料または該植物、植物細胞もしくは植物材料から製造されたか、もしくはそれら由来のタバコ製品であるか、またはそれら由来であることができる。
従って、他の側面において、試料中のイソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドを検出する方法であって、(a)ポリヌクレオチドを含むか、またはそれを含むことが疑われる試料を提供する段階；(b)イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドの少なくとも一部を特異的に検出するための1以上のプライマーまたは1以上のプローブと前記試料を接触させる段階；および(c)増幅産物の存在を検出する段階であって、ここで増幅産物の存法もまた提供される。他の側面において、イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドの少なくとも一部を特異的に検出するための1以上のプライマーまたはプローブの使用もまた提供される。イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドの少なくとも一部を特異的に検出するための1以上のプライマーまたはプローブを含む、イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドの少なくとも一部を検出するためのキットもまた提供される。該キットは、ポリヌクレオチドの増幅、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のための試薬を含むこともできるし、核酸プローブハイブリダイゼーション検出技術、例えばサザンブロット、ノーザンブロット、in situハイブリダイゼーションまたはマイクロアレイのための試薬を含むこともできる。該キットは、抗体結合検出技術、例えばウェスタ在が、その試料中のイソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドの存在を示す前記段階を含む前記方ンブロット、ELISA、SELDI質量分析法またはテストストリップのための試薬を含むことができる。該キットは、核酸配列決定のための試薬を含むことができる。該キットは、ショ糖エステル含量を測定するための試薬および／または使用説明書を含むことができる。いくつかの実施形態において、キットは、開示された方法の1以上のための使用説明書を含むことができる。開示されたキットは、遺伝的同一性の決定、系統発生の研究、遺伝子型決定、ハプロタイプ解析、系統解析または植物育種、特に共優性スコアリングを有する植物育種に有用であることができる。
本発明はまた、イソプロピルリンゴ酸シンターゼポリヌクレオチドを含む植物、植物細胞または植物材料の遺伝子型決定の方法を提供する。遺伝子型決定は、染色体対のホモログを識別する手段を提供し、植物集団における分離個体を識別するために用いることができる。分子マーカー法は、系統学的研究、作物の変種間の遺伝的関係の特徴付け、交雑種または体細胞雑種の同定、単一遺伝子形質に影響を及ぼす染色体部分の限定、マップベースクローニングおよび量的遺伝研究に用いることができる。特定の遺伝子型決定方法には、増幅断片長多型(AFLP)を含む任意の数の分子マーカー解析技術を用いることができる。AFLPは、ヌクレオチド配列変異性によって引き起こされる増幅断片間の対立遺伝子の相違の結果である。従って、本発明はさらに、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子または核酸の分離ばかりでなく、AFLP解析のような技術を用いるこれらの遺伝子または核酸に遺伝的に連結した染色体配列を追跡する手段を提供する。
以下の実施例において本開示をさらに説明するが、これらは本開示をさらに詳細に説明するために提供される。これらの実施例は、本開示を実施するために現在考えられる好ましい方法を述べたものであって、本開示を限定するものではない。
ニコチニア・タバカム(Nicotinia tabacum)の変種である鉄管乾燥Hicks Broadleaf(HBL)およびprimitive Red Russian(RR)におけるショ糖エステル分析
タバコにおけるショ糖エステル合成を研究するために、2つのモデル変種を選択する。鉄管乾燥Hicks Broadleaf (HBL) および primitive Red Russian (RR)である。National Genetic Resources Program (Germplasm Resources Information Network - (GRIN), National Germplasm Resources Laboratory, Beltsville, Maryland)カタログから入手できる初めのデータは、これらの2つの系統間のβ-メチルバレリル含有ショ糖エステル含量において異なった含量を示唆している。
HBLおよびRR葉浸出物のショ糖エステル組成物を分析し、図1にその結果を示す。RRショ糖エステル組成物は、HBLショ糖エステル組成物とは異なる。HBLにおいては、ショ糖エステルは、主にC2C15:0で構成されるが、RRにおいては、C2C16:0、C2C17:0およびC2C18:0などの高分子量種の存在が観察される。図2に示すように、RRとHBLとの違いは、その分子におけるメチルバレリルエステルの存否によって説明される。従って、RRはBMVSE変種であり、HBLはbmvse変種であることが結論される。
量的形質遺伝子座解析
葉浸出物におけるショ糖エステル組成物を、HBLおよびRR親の交雑によって得られた自殖した136のF2遺伝子型植物からそれぞれ遺伝した8のF3植物の136集団において分析する。マイクロサテライトマーカーとβ-メチルバレリル含有ショ糖エステル表現型とを関連づけるために、量的形質遺伝子座研究を行う。量的形質遺伝子座cartographerを用いてデータを解析する。β-メチルバレリル含有ショ糖エステル形質は、タバコゲノムにおける単一の遺伝子座に関連づけられる。この遺伝子座は、タバコの連鎖群15(染色体A)に位置する。
β-メチルバレリル含有ショ糖エステル関連遺伝子の同定
図3に記載された機能をコードするすべての潜在的遺伝子の中の選択的遺伝子標的を選択するために、トリコームにおけるタバコエクソンの転写レベルを研究する。マイクロアレイを用い、β-メチルバレリル含有ショ糖エステル産生プロフィールに関して選択されたいくつかの変種においてその発現を研究した。
結果によって、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ関連エクソンプローブが同定される。なぜなら、それらの発現は、各変種の抽出物のそれぞれにおいて測定されるβ-メチルバレリル含有ショ糖エステルの概算値と関連しているからである(R>0.95)。
トマトイソプロピルリンゴ酸シンターゼIPMSAおよびIPMSBのホモログをコードする4つのタバコ配列が同定される。それらはNtIPMS1A(配列番号10)、NtIPMS1Bv1(配列番号12)、NtIPMS1Bv2(配列番号14)およびNtIPMS2(配列番号1)と名付けられる。ESTデータベースに従って、配列番号1を選択候補とした。なぜなら、その発現の大部分がトリコームにおいて観察できるからである。
N.タバカムvar. HBLから構築されたBACライブラリーを、PCR baitとしてNtIPMS2cDNAを用いてスクリーニングし、PISOGEと名付けるBACを同定する。このBACをショットガン配列決定した。アセンブリによっていくつかのコンティグが生成され、その中でpisoge1およびpisoge2がNtIPMS2に関連する配列を含む。
タバコおよびトマトからのイソプロピルリンゴ酸シンターゼの中にイントロン-エクソン構造が保存されている。NtIPMS1Bv1、NtIPMS1Bv2、SlIPMSBおよびSlIPMSAに関して、遺伝子は12のエクソンに分離されていることが観察される。NtIPMS2もまた12のエクソンで構成されていることが予想されるが、SlIPMSAエクソン1はpisoge1上の2つのエクソンに対応するため、NtIPMS2は13のエクソンを含むと仮定される。
PCRによって、ゲノム配列予測の信頼性が試験される。Hicks BroadleafまたはRed Russian植物のいずれかから単離された精製されたPISOGE BACまたはゲノムDNAを用いて、全体的に、pisogeアセンブリからの予測配列が立証される。NtIPMS2に対応する完全長ゲノム構造の1つが同定される。さらに、他の2つの遺伝子様構造が観察され、2つ偽遺伝子を表すと推定される。PISOGE BACによて提案される構造は部分的に立証されるが、BAC構造とHBLゲノムDNAの食い違いが少し観察される。
NtIPMS2のRRおよびHBL対立遺伝子を識別するために、遺伝子マーカーとしてPCRを用いる。量的形質遺伝子座マッピングにおいて用いるF2植物のすべてのゲノムDNAに関するPCR増幅にIPMS2マーカーを用いる。ショ糖エステル量的形質遺伝子座を、この追加のマーカーを用いて再計算する。量的形質遺伝子座ピークは、形質とマーカーの結合の確立が最大である位置を同定する。IPMS2マーカーは、単純反復配列マーカーPT30172と共に、β-メチルバレリル含有ショ糖エステル形質に対する効果の確率が最大であるマーカーである。
β-メチルバレリル含有ショ糖エステルの合成における鍵因子としてのNtIPMS2の活性の証明
NtIPMS2に対応する発現配列タグは、GT09L09(起源:Galpao[TI1068]トリコーム)およびOT05C20(起源Orinocco[TI81]トリコーム)の形のトリコームESTライブラリーから単離される。両方の分子はヌクレオチド配列が同一であり、従って、発現実験にはOT05C20 cDNAのみを用いる。コンセンサス配列に基づくNtIPMS2の第1エクソンおよび第1イントロンを用いてRNAi構築物が作られる。両方の構築物は、トリコームに特異的なCPS2pプロモーター(CPS2はのみに存在するcisアビエノール合成に関与するコパリルシンターゼ2である)またはMMVpウイルスプロモーター(MMVはミラビリスモザイクウイルスである)のいずれかを含むバイナリーベクターに導入される。それぞれのバイナリーベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファキエンスAGL1を用いる恒久的形質転換を、オリエンタルタバコ変種Basma xanthiおよび鉄管乾燥変種K326において行う。
独立した形質転換事象から得られる1か月齢の再生植物から葉を採取する。2.5ng/mg新鮮重の割合で内部標準(オクタアセチルショ糖)を加える。各ショ糖エステルに特異的なイオンに関して記録した面積を内部標準面積との比でプロットする。シグナル応答は分子間で異なり、比較は各分子間でのみ正しい。内部標準シグナルの面積に対する比は、葉の新鮮重に対するシグナルの正規化を可能にする。図2は、本明細書で呈示するショ糖エステル命名法を説明する。図4について言えば:(A)親変種K326の葉浸出物組成物(鉄管乾燥、n=3)およびトリコーム特異的プロモーター制御下でNtIPMS2を発現する形質転換細胞；(B)親変種K326の葉浸出物組成物およびウイルスプロモーター制御下でNtIPMS2を発現する形質転換細胞；(C)親変種Basmaの葉浸出物組成物(Oriental、n=4)およびトリコーム特異的プロモーター制御下でNtIPMS2-RNAi構築物を発現する形質転換細胞;(D)親変種Basmaの葉浸出物組成物およびウイルスプロモーター制御下でNtIPMS2-RNAi構築物を発現する形質転換細胞である。
呈示したデータは、NtIPMS2が、βメチル吉草酸含有ショ糖エステル産生の鍵遺伝子であることを示すのに十分である。βメチル吉草酸含有ショ糖エステル変種(オリエンタル)におけるIPMS2の抑制は、βメチル吉草酸含有ショ糖エステルの産生を減少または障害する(CおよびD参照)。従って、IPMS2は生合成経路の主要な成分であることを証明する。RNA干渉構築物の構成的およびトリコーム特異的発現は、βメチル吉草酸を含むことができるエステルであるショ糖エステルC2C16:0、C2C17:0およびC2C18:0の蓄積の損失をもたらす。
bmvse変種(鉄管乾燥)におけるNtIPMS2の導入は、ショ糖エステルの産生を誘導することができる(AおよびB参照)。このことは、ショ糖エステルの産生を復帰させるのに、NtIPMS2cDNA単独の発現で十分であることを証明している。ここでは、NtIPMS2 cDNAの構成的およびトリコーム特異的発現が、βメチル吉草酸を含むことができるエステルであるショ糖エステルC2C16:0、C2C17:0およびC2C18:0のデノボ蓄積をもたらす。興味深いことに、cDNAの構成発現(B)はショ糖エステルの高い蓄積をもたらさなかったのに対し、トリコーム特異的発現は、例えば、βメチル吉草酸含有ショ糖エステル変種において観察することができるものに相当するレベルまでショ糖エステルの蓄積をもたらした。
ジンクフィンガーヌクレアーゼ標的部位の選択のための検索プロトコル
この実施例は、遺伝子の発現を改変するためのツールを開発するための所定のゲノムデータベースと比較して、所定の遺伝子配列内の唯一の標的部位の存在をスクリーニングするためのイソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子の検索法を例示する。本開示の方法によって同定される標的部位、配列モチーフ、植物、例えばタバコにおける対応する遺伝子配列の改変における部位またはモチーフのいずれかの使用は本開示に含まれる。
検索アルゴリズム。DNAデータベース内の接尾辞配列を用いて所定のスペーサーサイズによって分離された2つの固定された長さの部分文字列DNAモチーフの存在に関して入力クエリ(標的)ヌクレオチド配列をスクリーニングすることを可能にするコンピュータプログラムが開発される。接尾辞配列構築および検索は、任意の入力文字列をBurrows-Wheeler変換文字列に直接に変換するオープンソースlibdivsufsortライブラリー-2.0.0(http://code.google.com/p/libdivsufsort/)を用いる。このプログラムは完全入力(標的)ヌクレオチド配列をスキャンし、選択されたDNAデータベースにおいて選択された回数未満で存在するすべての部分文字列の組み合わせを報告する。
クエリー配列のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介変異誘発のための標的部位の選択
ジンクフィンガーDNA結合ドメインは、3塩基対ヌクレオチド配列を認識する。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、1、2、3、4、5、6以上のジンクフィンガーDNA結合ドメインおよびIIS型制限酵素の非特異的ヌクレアーゼを含むジンクフィンガータンパク質を含む。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、標的配列に二本鎖切断を導入するために用いることができる。二本鎖切断を導入するためには、一対のジンクフィンガーヌクレアーゼであって、1つが標的配列のプラス(上)鎖に結合し、もう一つが0、1、2、3、4、5、6以上ヌクレオチド離れた同じ標的配列のマイナス(下)鎖に結合する前記ジンクフィンガーヌクレアーゼが必要である。2つの固定した長さの部分文字列DNAモチーフのそれぞれに関して、3の複数用いることによって、所定のスペーサー長さによって離された2つのジンクフィンガータンパク質標的部位を同定するために、このプログラムを用いることができる。
プログラム入力:
1．標的クエリDNA配列
2．検索されるDNAデータベース
3．最初の部分文字列DNAモチーフの固定サイズ
4．スペーサーの固定サイズ
5．第2部分文字列DNAモチーフの固定サイズ
6．プログラム入力2の選択されたDNAデータベースにおいてプログラム入力4によって離されたプログラム入力3および5の組み合わせの閾値出現回数
プログラム出力:プログラム入力6の最大の閾値でDNAデータベースに出現する配列の回数に関するヌクレオチド配列のリスト。
本明細書に引用または記載された刊行物は、いずれも、本願の出願日前に開示された関連情報を提供するものである。本明細書に記載の何物も、本発明者が、このような開示に先行することの資格を与えられないことの承認として解釈してはならない。上記明細書に記載のすべての刊行物は参照により本願に組み込まれる。本発明の趣旨と範囲から逸脱することなく、本開示の種々の改変および変更をなしうることは、当業者に明らかであろう。特定の好ましい実施形態と関連して本発明を説明してきたが、特許請求される本発明が、このような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことが理解されなければならない。実際、細胞生物学、分子生物学および植物生物学または関連分野における当業者には明らかな、本発明を実施するために記載された方法の種々の改変は、以下の特許請求の範囲に含まれるものとする。
配列
配列番号1(NtIPMS2ヌクレオチド配列)
Figure 2018186820
配列番号2(NtIPMS2アミノ酸配列)
Figure 2018186820
配列番号3(相補性に用いられるNtIPMS2cDNA配列)
Figure 2018186820
配列番号4(Red Russianにおいて観察される、エクソンXI、XIIおよびXIIIを含むNtIPMS2領域のゲノムDNA配列。cDNAマッチング領域には下線が引かれている。太字は、Red RussianおよびHicks Broadleaf DNA配列間で保存されたDNA領域を示す。)
Figure 2018186820
配列番号5(Hicks Broadleafにおいて観察されるエクソンXIおよびXIIIを含むNtIPMS2領域のゲノムDNA配列。cDNAマッチング領域には下線が引かれている。太字は、Red RussianおよびHicks Broadleaf DNA配列間で保存されたDNA領域を示す。)
Figure 2018186820
配列番号6(NtIPMS2に対応するBACコンティグ配列(BACの全長は76832bpである。14232bpのみが示されている。)
Figure 2018186820

Figure 2018186820

Figure 2018186820

Figure 2018186820

Figure 2018186820

Figure 2018186820
配列番号7(NtIPMS2に対応するBACコンティグ配列(BACの全長は10082bpである。))
Figure 2018186820

Figure 2018186820

Figure 2018186820

Figure 2018186820

Figure 2018186820
配列番号8(トリコーム特異的発現を促進するためのプロモーター配列。このプロモーターはニコチニア・タバカムから単離され、cisアビエノールの合成に関与するコパリルシンターゼをコードする遺伝子の1.5kb上流に位置する。)
Figure 2018186820
配列番号9(RNAi機構によってNtIPMS2遺伝子発現の抑制を引き起こすために用いられる合成構築物。NtIPMS2第1イントロンおよび第1エクソンの断片で構成される。第1イントロンの断片はエクソンの後に逆反復している。この構築物の翻訳およびスプライシングは、理論上は、ヘアピン構造の二本鎖RNAをもたらす。)
Figure 2018186820
太字および下線部:エクソン1,21-229
太字：スプライシング境界
イタリック体:スプライシング部位
イタリック体および下線部:第1イントロン
配列番号10(NtIPMS1Aヌクレオチド配列)
Figure 2018186820
配列番号11(NtIPMS1Aアミノ酸配列)
Figure 2018186820
配列番号12(NtIPMS1Bv1ヌクレオチド配列)
Figure 2018186820
配列番号13(NtIPMS1Bv1アミノ酸配列)
Figure 2018186820
配列番号14(NtIPMS1Bv2ヌクレオチド配列)
Figure 2018186820
配列番号15(NtIPMS1Bv2アミノ酸配列)
Figure 2018186820
表1
ショ糖エステルの構造。ショ糖エステルの一般構造を図5に示す。R1、R2、R3、R4およびR5基の種々の組み合わせが記載されている。
Figure 2018186820
Figure 2018186820

Figure 2018186820

Figure 2018186820

Figure 2018186820

Figure 2018186820

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C2はアセチルを意味する;C3はブチリルを意味する;C4はプロピオニルを意味する;C4iはイソブチリルを意味する;C5はバレリル(ペンタノイル)を意味する;C5aiは2-メチル-ブチリルを意味する;C5iはイソバレリルを意味する;C5:1iはイソペンテノイルを意味する;C5:1はペンテノイルを意味する;C6はヘキサノイルを意味する;C6(2)は2-メチルバレリルを意味する;C6aiはβ-メチルバレリルを意味する;C6iは4-メチルバレリルを意味する;-は、一般的には水素である。

Claims (15)

  1. 変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物細胞であって、
    (i)イソプロピルリンゴ酸シンターゼをコードし、かつ配列番号1もしくは配列番号10もしくは配列番号12もしくは配列番号14に少なくとも60%の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる、少なくとも1つのポリヌクレオチド；または
    (ii)前記ポリヌクレオチド(単数または複数)によってコードされるポリペプチド;または(iii)配列番号2もしくは配列番号11もしくは配列番号13もしくは配列番号15に少なくとも60%の配列同一性を有するポリペプチド；または
    (iv)前記ポリヌクレオチド配列(単数または複数)を含む構築物、ベクターもしくは発現ベクターであって、場合により、配列番号8に示す配列もしくはそれに少なくとも約60%の同一性を示すそのバリアントを含むか、それからなるか、または本質的にそれからなるプロモーターまたはトリコームプロモーターまたは天然に存在するイソプロピルリンゴ酸シンターゼプロモーターをさらに含む前記構築物、ベクターもしくは発現ベクター
    を含む前記細胞。
  2. 請求項1に記載の植物細胞を含む変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物。
  3. 植物の少なくとも一部分においてショ糖エステルの量またはタイプを調節する方法であって、
    (i)植物においてイソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性を調節する段階であって、好ましくは、イソプロピルリンゴ酸シンターゼが、イソプロピルリンゴ酸シンターゼをコードし、かつ配列番号1もしくは配列番号10もしくは配列番号12もしくは配列番号14に少なくとも60%の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなるポリヌクレオチド；または前記ポリヌクレオチド(単数または複数)によってコードされるポリペプチド;を含むかまたはイソプロピルリンゴ酸シンターゼが、配列番号2もしくは配列番号11もしくは配列番号13もしくは配列番号15に少なくとも60%の配列同一性を有するポリペプチドによってコードされる前記段階；
    (ii)場合により、段階(i)で得られた変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物の少なくとも一部分において1以上のショ糖エステルの量を測定するかまたはそのタイプを決定する段階；および
    (iii)変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物を同定する段階であって、前記植物中の1以上のショ糖エステルの量またはタイプが、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性が調節されていない対照植物と比較して変化しており、好ましくは、前記変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物の視覚的外観が対照植物と実質的に同じである前記段階
    を含む前記方法。
  4. 請求項3に記載の方法によって得られるか、または得ることができる変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物。
  5. イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または活性が調節されていない対照植物と比較して、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現またはそれによってコードされるタンパク質の活性が調節され、植物の少なくとも一部分が1以上のショ糖エステル組成物の変化を有する変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物であって、前記植物の視覚的外観が対照植物と実質的に同じである前記変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物。
  6. 請求項4または請求項5に記載の植物からの細胞または組織を含むバイオマス、種子または葉を含む植物材料。
  7. 請求項4もしくは請求項5に記載の植物または請求項6に記載の植物材料の一部分を含むタバコ製品。
  8. 1以上のショ糖エステルを含む組成物を製造する方法であって、
    (i)請求項4もしくは請求項5に記載の変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物の少なくとも一部分、請求項6に記載の植物材料または請求項7に記載のタバコ製品を提供する段階；
    (ii)それらからショ糖エステル(単数または複数)を抽出する段階；および
    (iii)場合により、抽出されたショ糖エステル(単数または複数)を単離または精製する段階
    を含む前記方法。
  9. 1以上のショ糖エステルが図5に示す構造(式中R3はアセチルもしくは水素であり、好ましくはアセチルであり；R1、R2およびR4の1以上は6炭素を有するアシル鎖を含み、好ましくはβ-メチルバレリルを含み；R5はアセチルもしくは水素であり、好ましくは水素である)を有する、請求項3もしくは請求項8に記載の方法または請求項4もしくは5に記載の変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物。
  10. タバコまたはタバコ製品のフレーバーを調節する方法であって、(i)タバコもしくはタバコ製品に、請求項2、4もしくは5のいずれかに記載の変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物からの植物の一部分、好ましくは葉または請求項6に記載の植物材料を加えること；または(ii)タバコもしくはタバコ製品に、請求項8もしくは9の方法によって得られるか、または得ることができるショ糖エステルを含む組成物を加えることを含む前記方法。
  11. β-メチル吉草酸を製造する方法であって、
    (i)請求項2、4もしくは5のいずれかに記載の変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物の少なくとも一部分、請求項6に記載の植物材料または請求項7に記載のタバコ製品を提供する段階；
    (ii)段階(i)で提供される材料またはその抽出物を加水分解する段階；および
    (iii)場合によりβ-メチル吉草酸を単離または精製する段階
    を含む前記方法。
  12. イソプロピルリンゴ酸シンターゼをコードし、かつ配列番号1または配列番号10または配列番号12または配列番号14に少なくとも60%の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる、単離されたポリヌクレオチド。
  13. 請求項12に記載のポリヌクレオチドによってコードされる単離されたポリペプチド。
  14. 配列番号2または配列番号11または配列番号13または配列番号15に少なくとも60%の配列同一性を有する単離されたポリペプチド。
  15. 請求項12に記載の単離されたポリヌクレオチド配列を含む構築物、ベクターまたは発現ベクターであって、場合により、配列番号9に記載の配列もしくはそれに少なくとも約60%の同一性を有するそのバリアントを含むか、それからなるか、もしくは本質的にそれからなるプロモーターまたはトリコームプロモーターまたは天然イソプロピルリンゴ酸シンターゼプロモーターをさらに含む前記構築物、ベクターまたは発現ベクター。
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