KR20210109578A - 니트레이트 환원효소의 돌연변이를 통한 식물 내 니트레이트 수준 조절 - Google Patents

Abstract

식물 세포로서: (a) 서열번호 5 또는 서열번호 7의 연속 폴리펩타이드 서열을 포함하는 니트레이트 환원효소 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열로서, 여기서 메티오닌은 대조군 식물 세포와 비교하여 식물 세포 내 니트레이트 환원효소 활성을 감소시키는 아미노산으로 치환되는, 폴리뉴클레오타이드 서열; (b) (a)에 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드 서열; 또는 (c) (b)에 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 작제물, 벡터 또는 발현 벡터를 포함하는, 식물 세포.

Description

니트레이트 환원효소의 돌연변이를 통한 식물 내 니트레이트 수준 조절

본 발명은 니트레이트 수준이 감소된 식물, 식물로부터 유래된 식물 세포, 식물로부터 생성된 생성물, 및 니트레이트 환원효소 효소를 돌연변이시킴으로써 식물 내 니트레이트 수준을 조절하는 방법에 관한 것이다.

담배 식물과 같은- 특정 식물들은 이들의 잎에 유리(free) 니트레이트가 높은 수준으로 축적되며, 이는, 이러한 축적이 높은 수준의 니트레이트가 담배-특이적인 니트로소아민(TSNA)으로 지칭되는 발암성 화합물의 형성과 연관이 있기 때문에 바람직하지 않다. TSNA는 주로 담배 잎의 경화 동안 생성되는 화합물의 부류이긴 하지만, 부가적인 형성은 후속적인 잎의 가공 및 보관 시 발생할 수 있고, 가능하게는 연소 동안 열합성(pyrosynthesis)을 통해 발생할 수 있다. 경화된 잎에서 발견되는 TSNA 중 2가지인 N-니트로소노르니코틴(NNN) 및 4-(메틸니트로소아미노)-1-(3-피리딜)-1-부타논(NNK)은 국제 암 연구 기관에 의해 그룹 I 발암원(최고 지정(designation))으로 분류된다. 이들 화합물이 다양한 담배-연관 암들과 연루되어 있다는 증거가 상당하기 때문에, 세계 보건 기구는, 향후 담배 제품들은 이들 독물(toxicant)의 수준을 감소시켰음을 보장하기 위한 지시들이 시행될 것을 권고하였다. TSNA는 담배 알칼로이드의 니트로소화 생성물을 나타낸다. 음건된(air-cured) 담배에서, 니트라이트가 TSNA 형성에 직접 책임이 있는 작용제라는 일반적인 견해가 존재한다. 그러나, 니트라이트의 세포 독성으로 인해, 내인성 니트라이트 수준은 전형적으로 식물 조직에서 매우 낮다. 대신에, TSNA 형성에 관여하는 니트라이트의 대부분은, 잎 니트레이트 풀(pool)의 일부를 니트라이트로 전환시키는 6주 내지 10주의 경화 과정 동안, 이러한 기간 동안 세포막 및 세포 기관이 분해됨에 따라, 잎 표면 상에 거주하는 미생물의 니트레이트 환원효소(NR) 활성으로부터 유래되는 것으로 여겨진다.

TSNA는 주로 잎의 경화 과정 동안에 형성되고, 담배 알칼로이드의 니트로소화를 수반한다. 경화된 잎에서 TSNA 함량 및 수준을 낮추기 위한 유전학적 전략은 (1) 알칼로이드 전구체(들); 또는 (2) 관여된 니트로소화제(들)를 표적으로 하는 것에 초점을 맞추었다. 담배의 유전적 특성을 변경시키는 수준에서 TSNA를 감소시키려는 대부분의 노력은 TSNA로의 알칼로이드 전구체를 표적으로 하였다. 이러한 전략은 NNN의 알칼로이드 전구체인 노르니코틴의 합성에 책임이 있는 유전자 패밀리의 하향조절을 통해 NNN의 상당한 감소를 제공한다.

감소된 니트레이트 수준을 갖는 변형된 담배 식물은 WO2016/046288에서 본 출원에 의해 기술된다. 본원에 기술된 바와 같이, 니트레이트 환원효소 효소의 발현 또는 활성은 탈조절된다. 탈조절화된 니트레이트 환원효소 효소는 니트레이트 환원효소를 암호화하는 폴리펩타이드의 위치 523에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 가진다. 돌연변이는 S523D로 지칭된다. 돌연변이 니트레이트 환원효소 효소의 과발현은 니트레이트 동화의 극적인 증가를 주어, 낮은 니트레이트/TSNA 함량 및 더 높은 아미노산 수준을 초래하였다. 식물은 대조군에 비해 90% 적은 니트레이트를 나타냈다.

니트레이트 축적을 줄이기 위해 비유전적으로 변형된 유기체(비-GMO) 접근법을 개발하는 것이 바람직할 수 있다. 유럽을 포함하는 국가들에서, 유전자 변형 작물을 재배 및 상업화하기 어렵기 때문에, 유전자 조작 기술을 사용을 통해 수득된 돌연변이체보다 단일 뉴클레오타이드 다형성을 특징으로 하는 돌연변이체로 작업하는 것이 바람직할 수 있다.

따라서, 식물에서 니트레이트 수준을, 특히 비유전자이식 접근법을 통해 감소시키는 것에 대한 지속적인 필요성이 당업계에 남아 있다.

본 발명은, 적어도 부분적으로, 비유전자이식 접근법을 통해 니코티아나 타바쿰 니트레이트 환원효소(NIA2)를 돌연변이시키는 것이, 대조군 식물로부터 유래된 경화된 잎에 비해 그것의 경화된 잎이 조절된(예를 들어, 감소된) 수준의 니트레이트를 함유하는 식물 또는 식물 재료를 초래할 수 있다는 발견에 기초한다. 본원에 기술된 하나의 이러한 돌연변이는 니코티아나 타바쿰 니트레이트 환원효소의 힌지 1 도메인 내의 니트레이트 환원효소 키나아제 인식 부위에 위치되어 있다.

Hardin 등의. (2009) Biochem. J. 422:305-312는 아라비돕시스 탈리아나의 NIA2 단백질 중 위치 538에서 메티오닌의 산화가 NIA 단백질의 인산화를 억제하는 메커니즘임을 교시한다. 산화는, 과산화수소, 히드록실 라디칼과 같은 반응성 산소 종(ROS)에 노출될 때, 니트레이트 환원효소에 대한 14-3-3 결합을 방지하고 니트레이트 환원효소의 불활성화를 방지한다. 니트레이트 환원효소는 니트레이트를 니트레이트로 전환시켜 암모니아 및 아미노산의 생산을 유도하므로, WO2016/046288에 입증된 바와 같이, 니트레이트 환원효소의 더 높은 활성화는 니트레이트 수준을 낮출 것으로 예상된다. 따라서, 아라비돕시스 탈리아나의 NIA2 단백질에서 M538의 메티오닌 설폭시드로의 산화는 니트레이트 수준을 낮출 것으로 예상된다. 니코티아나 타바쿰 NIA2 단백질 중 M527은 아라비돕시스 탈리아나 NIA2 중 M538에 상응한다. 본원에 기술된 돌연변이체 니코티아나 타바쿰 식물의 특성은 예상하지 못한 것이다. 니코티아나 타바쿰 NIA2 돌연변이체 M527I(당 기술분야에서 잘 이해되는 바와 같이, M527I는 위치 527에서의 메티오닌(M)이 이소류신(I)으로 치환된다는 것을 의미함)는 위치 537에서의 메티오닌을 산화시킬 수 없는 이소류신으로 치환하는 것을 포함한다. 메티오닌은 황 잔기 상에서 메티오닌 설폭시드로 산화되는 것으로 알려져 있는 반면, 이소류신은 그의 구조에 황 잔기를 갖지 않는다. 이러한 차이에 기초하여, 니코티아나 타바쿰 NIA2 돌연변이체 M527I는 ROS에 노출 시 니트레이트 환원효소 활성화를 자극할 것으로 예상되지 않을 것이고, 결과적으로, 식물에서 니트레이트 수준을 감소시키기 위한 메커니즘이 제거된다. 그러나, 놀랍게도, 메티오닌의 치환에도 불구하고, 본 개시의 돌연변이체 식물은 니트레이트 수준의 감소를 나타낸다는 것이 밝혀졌다.

본 개시에 따라 식물을 생성하는 것은 다수의 다른 장점들을 제공한다. 예를 들어, 본원에 기술된 식물은 유전적으로 변형된 농작물을 재배하고 상업화하는 데 있어서의 어려움을 극복하는 비유전적으로 변형된 식물일 수 있다. 또 다른 예로서, 식물 총 수확 바이오매스, 및 니코틴, 총 알칼로이드, 암모니아에 영향을 미치거나 또는 또는 잎에서 당 함량을 감소시키지 않고 니트레이트 수준의 감소가 달성될 수 있다. 이는 식물, 식물 재료 또는 식물 제품의 상업적 수용을 개선할 수 있다.

일 측면에서, 식물 세포로서, (a) 서열번호 5 또는 서열번호 7의 연속 폴리펩타이드 서열을 포함하는 니트레이트 환원효소 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열로서, 여기서 메티오닌은 대조군 식물 세포와 비교하여 상기 식물 세포 내 니트레이트 환원효소 활성을 감소시키는 아미노산으로 치환되는, 폴리뉴클레오타이드 서열;(b) (a)에 제시된 상기 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드 서열; 또는(c) (b)에 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 작제물, 벡터 또는 발현 벡터를 포함하는, 식물 세포뉴클레오타이드뉴클레오타이드가 개시되어 있다.

적절하게는, 메티오닌은 상이한 아미노산으로 치환되고, 보다 적절하게는, 치환된 아미노산은 이소류신이며, 보다 적절하게는, 여기서 폴리펩타이드는 서열번호 6 또는 서열번호 8의 연속 폴리펩타이드 서열을 포함한다.

적절하게는, 상기 니트레이트 환원효소 폴리펩타이드는 서열번호 1과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 서열의 위치 527에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다.

적절하게는, 니트레이트 환원효소 폴리펩타이드는 서열번호 3에 제시된 폴리펩타이드 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 이로 필수적으로 구성되어 있다.

적절하게는, 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 이로 필수적으로 구성되어 있다.

적절하게는, 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4에 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 이로 필수적으로 구성된다.

적절하게는, 식물 세포는 니코티아나 타바쿰 식물 세포이다.

적절하게는, 식물 세포는 니코티아나 타바쿰 AA37 재배종 유래의 식물 세포이다.

또 다른 측면에서, 이전의 항들 중 어느 한 항에 따른 식물 세포를 포함하는 식물 또는 이의 일부로서; 적절하게는, 상기 식물 또는 이의 일부의 경화된 잎은 대조군 식물 또는 이의 일부에 비해 더 낮은 수준의 니트레이트를 함유하고, 적절하게는, 상기 니트레이트의 수준은 대조군 식물 또는 이의 일부에 비해 약 37% 이상만큼 감소되는, 식물 또는 이의 일부가 개시되어 있다.

다른 측면에서, 본원에 기술된 식물 또는 이의 일부로부터 유래된 식물 재료, 경화된 식물 재료, 또는 균질화된 식물 재료가 기재되어 있되, 적절하게는, 여기서 경화된 식물 재료는 음건식 또는 양건식 또는 열건식 식물 재료이고; 적절하게는, 식물 재료, 경화된 식물 재료, 또는 균질화된 식물 재료는 식물 또는 그의 일부로부터의 바이오매스, 종자, 줄기, 꽃, 또는 잎을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본원에 기재된 식물 세포, 본원에 기재된 식물의 일부 또는 본원에 기재된 식물 재료를 포함하는 담배 제품이 기재되어 있다.

또 다른 측면에서, 본원에 기술된 식물을 생산하기 위한 방법이 개시되어 있으며, 상기 방법은 (a) 본원에 기술된 식물 세포를 제공하는 단계; 및 (b) 식물 세포를 식물로 번식시키는 단계를 포함한다.

또 다른 측면에서, 대조군 식물 재료에 비해 니트레이트의 변경된 양을 갖는 경화된 식물 재료를 생산하기 위한 방법이 기재되어 있으며, 상기 방법은 (a) 본원에 기재된 식물 또는 이의 일부 또는 본원에 기재된 식물 재료를 제공하는 단계; (b) 선택적으로 식물 또는 이의 일부로부터 식물 재료를 수확하는 단계; 및 (c) 상기 식물 재료를 경화시키는 단계를 포함하고 있다.

적절하게는, 식물 재료는 경화된 잎을 포함한다.

적절하게는, 경화 방법은 음건, 화건, 훈연 경화 및 열건으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

도 1은 NtNIA2 단백질 서열의 도메인 및 공통 서열을 도시한다. (A) 니코티아나 타바쿰 니트레이트 환원효소 NIA2 단백질의 주요 도메인(유전자은행: X14059). (B) NtNIA2의 힌지 1 내의 니트레이트 환원효소 키나아제 인식 부위(LKKSISTPFM) 및 14-3-3 인식 부위. WO2016/046288로부터의 S523D 돌연변이 및 본원에 기술된 M527I 돌연변이의 위치가 표시되어 있다.
도 2는 제2 수확물 및 총 생잎 바이오매스로부터의 경화된 잎의 화학적 프로파일링을 도시하는 일련의 막대 그래프이다. (A) 식물 당 그램으로 표현된 총 수확 잎의 생중량(FW); (B) 경화된 물질의 그램 당 마이크로그램으로 표현된 경화된 잎의 니코틴 함량; (C) 경화된 물질의 건조 중량의 백분율로 표현된 총 알칼로이드 함량; (D) 경화된 물질의 건조 중량의 백분율로 표현된 암모니아 함량; (E) 경화된 물질의 건조 중량의 백분율로 표현된 환원당 함량; 및 (F) 경화된 물질의 건조 중량의 백분율로 표현된 니트레이트 함량. AA37 대조군은 EMS 치료를 받지 않은 선을 나타낸다(n=6 플롯); NIA2_M527I_WT는 AA37 분리성 야생형 선을 나타냈다(n=15 플롯); NIA2_M527I_HOMO는 NtNIA2 M527I 동형접합성 선을 나타낸다(n=11 플롯). 오차 막대는 t 스튜던트 테스트를 사용하여 계산된 95%에서의 신뢰 구간을 나타낸다.

정의

다르게 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적인 용어 및 과학적인 용어들은 당업자가 보편적으로 의미하는 것과 동일한 의미를 가진다. 상충하는 경우, 정의를 비롯한 본 문헌이 좌우할 것이다. 바람직한 방법 및 재료는 하기에 기술되어 있으며, 그렇더라도 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 본원에 개시된 재료, 방법 및 예들은 단지 예시적일 뿐, 제한하려는 것이 아니다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하다(포함한다)," "수반하다(수반한다)," "가진," "가진다," "할 수 있다," "함유하다(함유한다)" 및 이들의 변형된 표현들은 부가적인 작용 또는 구조의 가능성을 배제하지 않는 개방형의 연결(transitional) 구어, 용어 또는 단어이고자 한다.

단수형("a," "an" 및 "the")은 문맥상 명확하게 다르게 지시하지 않는 한, 복수형을 포함한다.

용어 "및/또는"은 (a) 또는 (b) 또는 (a) 및 (b) 둘 모두를 의미한다.

본 개시내용은 본원에 제시된 구현예 또는 요소를 "포함하는," "구성되는" 및 "필수적으로 구성되는" 다른 구현예들이 명쾌하게 나타나 있거나 나타나 있지 않든지 간에 이러한 다른 구현예들을 고려한다.

본원에서 수치 범위의 언급을 위해, 이들 사이의 각각의 중간 수(intervening number)는 동일한 정밀도를 가지고 있으며 명백하게 고려된다. 예를 들어, 6 내지 9의 범위에 있어서, 6 및 9 외에도 수 7 및 8이 고려되고, 6.0 내지 7.0의 범위에 있어서, 수 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 및 7.0이 명백하게 고려된다.

명세서 및 청구항 전체에서 사용되는 바와 같이, 하기 용어들은 하기 의미들을 가진다:

"코딩 서열" 또는 "암호화하는 폴리뉴클레오타이드"는 폴리펩타이드를 암호화하는(encode) 폴리뉴클레오타이드를 포함하고 있는 뉴클레오타이드(RNA 또는 DNA 분자)를 의미한다. 코딩 서열은, 폴리뉴클레오타이드가 투여되는 개체 또는 포유류의 세포에서 발현을 지시할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 비롯한 조절 요소에 작동적으로 연결된 개시 신호 및 종결 신호를 추가로 포함할 수 있다. 코딩 서열은 코돈 최적화될 수 있다.

"상보체" 또는 "상보적"은 왓슨-크릭(예를 들어, A-T/U 및 C-G) 또는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 간의 Hoogsteen 염기 쌍을 의미할 수 있다. "상보성"은, 2개의 폴리뉴클레오타이드들이 서로 역평행하게 정렬된 경우, 각각의 위치의 뉴클레오타이드 염기들이 상보적이 되도록, 2개의 폴리뉴클레오타이드들이 사이에 공유된 특성을 지칭한다.

"작제물(construct)"은 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 이중가닥, 재조합 폴리뉴클레오타이드 단편을 지칭한다. 작제물은 상보적인 "센스 또는 코딩 가닥"으로 염기쌍을 이룬 "주형 가닥(template strand)"을 포함한다. 주어진 작제물은 2개의 가능한 배향으로, 벡터 - 예컨대 발현 벡터 내에 위치한 프로모터의 배향에 대하여 동일한(또는 센스) 배향 또는 반대의(또는 안티-센스) 배향으로 벡터 내에 삽입될 수 있다.

대조군 식물 또는 대조군 식물 세포의 맥락에서 용어 "대조군"은, 하나 이상의 유전자 또는 폴리펩타이드의 발현, 기능 또는 활성이 변형(예, 증가 또는 감소)되지 않은 식물 또는 식물 세포를 의미하고, 따라서 대조군은 동일한 하나 이상의 유전자 또는 폴리펩타이드의 발현, 기능 또는 활성이 변형된 식물과의 비교를 제공할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "대조군 식물"은, 시험 파라미터를 제외한 모든 파라미터에서 시험 식물 또는 변형된 식물과 실질적으로 동등한 식물이다. 예를 들어, 돌연변이가 도입된 식물을 지칭할 때, 대조군 식물은 이러한 돌연변이가 도입되지 않은 동등한 식물이다. 대조군 식물은 분리성 대조군 식물일 수 있다.

"발현"은 기능성 생성물의 생산을 지칭한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 단편의 발현은 폴리뉴클레오타이드 단편의 전사(예, mRNA 또는 기능성 RNA를 초래하는 전사) 및/또는 전구체 또는 성숙 폴리펩타이드로의 mRNA의 번역을 지칭할 수 있다.

"기능성" 및 "전체-기능성"은 생물학적 기능 또는 활성을 갖는 폴리펩타이드를 설명한다. "기능성 유전자"는 mRNA로 전사되어, 기능성 또는 활성 폴리펩타이드로 번역되는 유전자를 지칭한다.

"유전학적 작제물"은 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 지칭한다. 코딩 서열은, 발현을 지시할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 비롯한 조절 요소에 작동적으로 연결된 개시 신호 및 종결 신호를 포함할 수 있다.

용어 "상동성(homology)" 또는 "유사성(similarity)"은 서열 정렬(sequence alignment)에 의해서 비교되는 두 개의 폴리펩타이드 사이 또는 두 개의 폴리뉴클레오타이드 사이의 서열 유사성의 정도를 지칭한다. 비교되는 두 개의 별개의 폴리뉴클레오타이드 사이의 상동성 정도는 비슷한 위치에서 동일하거나, 매칭되는 뉴클레오타이드의 수의 함수이다.

2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 맥락에서 "동일한(identical)" 또는 "동일성(identity)"은 서열이 명시된 영역에 걸쳐 동일한 잔기들을 명시된 백분율로 가짐을 의미한다. 백분율은, 2개의 서열을 최적으로 정렬하고, 2개의 서열을 명시된 영역에 걸쳐 비교한 다음, 2개의 서열에서 동일한 잔기가 나타나는 위치의 수를 확인하여 매칭된 위치의 수를 수득하고, 매칭된 위치의 수를 명시된 영역 내의 위치의 총수로 나눈 다음, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득함으로써 계산될 수 있다. 2개의 서열의 길이가 상이하거나, 정렬로 인해 하나 이상의 스태거드 말단(staggered end)이 생성되고 비교되는 명시된 영역이 오로지 단일 서열만 포함하는 경우, 단일 서열의 잔기는 계산식의 분자(numerator)가 아니라 분모(denominator)에 포함된다. DNA와 RNA를 비교할 때, 티미딘(T) 및 우라실(U)은 동등한 것으로 간주될 수 있다. 동일성은 수동적으로 결정되거나, ClustalW, ClustalX, BLAST, FASTA 또는 Smith-Waterman와 같은 컴퓨터 서열 알고리즘을 사용함으로써 결정될 수 있다. 대중적인 다수의 정렬 프로그램 ClustalW(Nucleic Acids Research (Nucleic Acids Research (1994) 22, 4673-4680; Nucleic Acids Research (1997), 24, 4876-4882)은 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 다수의 정렬을 생성하기 위한 적합한 방법이다. ClustalW에 대한 적합한 매개변수는 다음과 같을 것이다: 폴리뉴클레오타이드 정렬에 대하여: 갭 오픈 페널티 = 15.0, 갭 연장 페널티 = 6.66 및 매트릭스 = Identity. 폴리펩타이드 정렬에 대하여: 갭 오픈 페널티 = 10. o, 갭 연장 페널티 = 0.2 및 매트릭스 = Gonnet. DNA 및 단백질 정렬에 대하여: ENDGAP = -1 및 GAPDIST = 4. 당업자는 최적의 서열 정렬을 위해 이들 및 다른 매개변수를 다르게 하는 것이 필요할 수 있음을 인식할 것이다. 적절하게는, 백분율 동일성의 계산이 이와 같은 정렬로부터 (N/T)로서 계산되며, 여기서 N은 동일한 잔기를 공유하는 서열이 위치한 위치의 수이고, T는 갭을 포함하지만 돌출부를 배제한 비교된 위치의 총 수이다.

용어 "단리된" 또는 "정제된"은, 물질을 이의 고유한 상태로 발견되는 바와 같이 통상적으로 수반하는 구성성분들을 실질적으로 또는 본질적으로 포함하지 않는 물질을 지칭한다. 순도 및 균질성은 전형적으로, 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 분석 화학 기술을 사용하여 확인된다. 조제물에 존재하는 우세 종인 폴리펩타이드는 실질적으로 정제된다. 특히, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 원하는 유전자를 측면에 위치시키고 원하는 폴리펩타이드 이외의 폴리펩타이드를 암호화하는 개방 해독 틀로부터 분리된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "정제된"은, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 전기영동 겔에서 본질적으로 하나의 밴드를 발생시킴을 가리킨다. 특히, 이는, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 적어도 85% 순수, 보다 바람직하게는 적어도 95% 순수, 가장 바람직하게는 적어도 99% 순수함을 의미한다. 단리된 폴리뉴클레오타이드는, 이들 폴리뉴클레오타이드가 천연적으로 발생하는 숙주 세포로부터 정제될 수 있다. 당업자에게 알려진 종래의 폴리뉴클레오타이드 정제 방법이 사용되어, 단리된 폴리뉴클레오타이드를 수득할 수 있다. 또한, 이러한 용어는 재조합 폴리뉴클레오타이드 및 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.

"조절하다" 또는 "조절하는"은 관심 있는 공정, 경로, 기능 또는 활성의 정성적 또는 정량적 변화, 변경 또는 변형을 야기하거나 촉진하는 것을 의미한다. 제한 없이, 이러한 변화, 변경 또는 변형은 관심 있는 상대적 공정, 경로, 기능 또는 활성의 증가 또는 감소일 수 있다. 예를 들어, 유전자 발현 또는 폴리펩타이드 발현 또는 폴리펩타이드 기능 또는 활성이 조절될 수 있다. 일반적으로, 상대적인 변화, 변경 또는 변형은 대조군과 비교하여 결정될 것이다.

용어 '비-자연발생(non-naturally occurring)'은 자연적으로 형성되지 않거나 또는 자연에 존재하지 않는 실체- 예컨대, 폴리뉴클레오타이드, 유전자 돌연변이, 폴리펩타이드, 식물, 식물 세포 및 식물 물질-를 기재한 것이다. 이러한 비-자연발생 실체 또는 인위적인 실체는 본원에 기재된 방법 또는 본 기술분야에 공지된 방법에 의해서 제조, 합성, 개시, 변형, 개입, 또는 조작될 수 있다. 이러한 비-자연발생 실체 또는 인위적인 실체는 사람에 의해서 제조, 합성, 개시, 변형, 개입, 또는 조작될 수 있다. 예로서, 비-자연발생 실체는 부위-특이적 돌연변이 유발, 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이 유발, 화학적-유도 돌연변이 유발, 방사-유도 돌연변이 유발, 변형된 염기를 이용하는 돌연변이 유발, 간격 이중체 DNA(gapped duplex DNA)를 이용하는 돌연변이 유발, 이중가닥 파괴 돌연변이 유발, 복구 결함성 숙주 변형을 이용하는 돌연변이 유발, 총 유전자 합성에 의한 돌연변이 유발, DNA 셔플링(shuffling) 및 기타 동등한 방법들을 포함하는, 돌연변이 유발을 유도하기 위해서 공지된 다양한 방법에 의해 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, 화학적 돌연변이유발은 돌연변이를 유도하기 위해 외생적으로 부가된 화학물질들 - 예컨대 돌연변이원성, 기형발생성 또는 발암성 유기 화합물들-의 사용을 포함한다. 그런 다음, 유리한 특성을 갖는 돌연변이체를 선택하고 식별할 수 있다.

"올리고뉴클레오타이드" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 함께 공유 연결된 적어도 2개의 뉴클레오타이드를 의미한다. 단일 가닥의 묘사는 또한, 상보적 가닥의 서열을 규정한다. 따라서, 폴리뉴클레오타이드는 또한, 묘사된 단일 가닥의 상보적 가닥을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드의 많은 변이체들은 주어진 폴리뉴클레오타이드와 동일한 목적을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 폴리뉴클레오타이드는 또한, 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오타이드 및 이의 상보체를 포함한다. 단일 가닥은 엄격한 혼성화 조건 하에 주어진 서열에 혼성화할 수 있는 프로브를 제공한다. 따라서, 폴리뉴클레오타이드는 또한, 엄격한 혼성화 조건 하에 혼성화하는 프로브를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있거나, 이중 가닥 서열 및 단일 가닥 서열 둘 다의 일부를 함유할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 DNA, 게놈 DNA 및 cDNA 둘 다, RNA 또는 혼성체일 수 있으며, 여기서 폴리뉴클레오타이드는 데옥시리보- 및 리보-뉴클레오타이드의 조합, 및 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 크산틴, 하이포크산틴, 이소시토신 및 이소구아닌을 비롯한 염기들의 조합을 함유할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법에 의해 수득될 수 있다.

상보적 단편에 혼성화하는 단일-가닥 DNA의 특이성은 반응 조건의 "엄격성"에 의해 결정된다(Sambrook 외, Molecular Cloning and Laboratory Manual, Second Ed., Cold Spring Harbor (1989)). DNA 듀플렉스를 형성하는 경향이 감소함에 따라 혼성화 엄격성은 증가한다. 폴리뉴클레오타이드 혼성화 반응에서, 엄격성은 특이적인 혼성화(높은 엄격성)를 선호하기 위해 선택될 수 있으며, 이는 예를 들어, 라이브러리로부터 전장 클론을 동정하는 데 사용될 수 있다. 덜-특이적인 혼성화(낮은 엄격성)는 관련이 있으나 정확하지 않은(상동성이지만 동일하지 않은) DNA 분자 또는 분절을 동정하는 데 사용될 수 있다. DNA 듀플렉스는 (1) 상보적 염기쌍의 수; (2) 염기쌍의 유형; (3) 반응 혼합물의 염 농도(이온 강도); (4) 반응 온도; 및 (5) DNA 듀플렉스 안정성을 감소시키는 특정한 유기 용매, 예컨대 포름아미드의 존재에 의해 안정화된다. 일반적으로, 프로브가 길수록, 적절한 어닐링에 필요한 온도는 더 높아진다. 보편적인 접근법은 온도를 다양하게 하는 것이며; 더 높은 상대 온도는 보다 엄격한 반응 조건을 초래한다. "엄격한 조건" 하에 혼성화하기 위해, 서로 적어도 60% 상동성인 폴리뉴클레오타이드가 혼성화된 채로 남아 있는 혼성화 프로토콜이 기술된다. 일반적으로, 엄격한 조건은, 규정된 이온 강도 및 pH에서 특이적인 서열에 대한 열적 용융점(Tm)보다 약 5℃ 더 낮도록 선택된다. Tm은, 주어진 서열에 상보적인 프로브의 50%가 (규정된 이온 강도, pH 및 폴리뉴클레오타이드 농도 하에) 주어진 서열에 평형 상태에서 혼성화하는 온도이다. 주어진 서열이 일반적으로 과량으로 존재하기 때문에, Tm에서, 프로브의 50%는 평형 상태에서 점유된다.

"엄격한 혼성화 조건"은 프로브, 프라이머 또는 올리고뉴클레오타이드가 이의 특정 서열에만 혼성화할 수 있는 조건이다. 엄격한 조건은 서열-의존적이고, 상이할 것이다. 엄격한 조건은 통상적으로, (1) 낮은 이온 강도 및 고온 세척, 예를 들어 15 mM 소듐 클로라이드, 1.5 mM 소듐 시트레이트, 0.1% 소듐 도데실 설페이트, 50℃ (2) 혼성화 동안의 변성화제, 예를 들어, 50%(v/v) 포름아미드, 0.1% 소 혈청 알부민, 0.1% Ficoll, 0.1% 폴리비닐피롤리돈, 50 mM 소듐 포스페이트 완충제(750 mM 소듐 클로라이드, 75 mM 소듐 시트레이트; pH 6.5), 42℃; 또는 (3) 50% 포름아미드를 포함한다. 세척은 통상적으로 또한, 42℃에서 5xSSC(0.75M NaCl, 75 mM 소듐 시트레이트), 50mM 소듐 포스페이트(pH 6.8), 0.1% 소듐 파이로포스페이트, 5x 덴하르트 용액(Denhardt's solution), 초음파처리된 연어 정자 DNA(50㎍/mL), 0.1% SDS 및 10% 덱스트란 설페이트에 의한 세척, 42℃에서 0.2xSSC(소듐 클로라이드/소듐 시트레이트) 및 55℃에서 50% 포름아미드 중에서의 세척, 후속해서 55℃에서 EDTA를 함유하는 0.1xSSC로 이루어진 높은 엄격성의 세척을 포함한다. 바람직하게는, 조건은, 서로 적어도 약 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 상동성인 서열들이 통상적으로 서로 혼성화된 채로 남아 있도록 하는 조건이다.

"엄격성이 중간인 조건"은 덜 엄격하여, 폴리뉴클레오타이드가 폴리뉴클레오타이드의 전체, 단편, 유도체 또는 유사체에 혼성화할 세척 용액 및 혼성화 조건을 사용한다. 일례는 55℃에서 6xSSC, 5x덴하르트 용액, 0.5% SDS 및 100 ㎍/mL 변성된 연어 정자 DNA에서 혼성화한 다음, 37℃에서 1xSSC, 0.1% SDS에서 1회 이상 세척하는 것을 포함한다. 온도, 이온 강도 등은 프로브 길이와 같은 실험 인자에 맞춰서 조정될 수 있다. 다른 엄격성이 중간인 조건은 기술되어 있다(Ausubel 외, Current Protocols in Molecular Biology, Volumes 1-3, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, N.J. (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, Stockton Press, New York, N.Y. (1990); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, 2nd edition, John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1988) 참조).

"엄격성이 낮은 조건"은 엄격성이 중간인 조건보다 덜 엄격하여, 폴리뉴클레오타이드가 폴리뉴클레오타이드의 전체, 단편, 유도체 또는 유사체에 혼성화할 세척 용액 및 혼성화 조건을 사용한다. 엄격성이 낮은 혼성화 조건의 비제한적인 예는 40℃에서 35% 포름아미드, 5xSSC, 50 mM Tris HCl(pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.2% BSA, 100 ㎍/mL 변성된 연어 정자 DNA, 10%(wt/vol) 덱스트란 설페이트에서 혼성화한 다음, 50℃에서 2xSSC, 25 mM Tris HCl(pH 7.4), 5 mM EDTA 및 0.1% SDS에서 1회 이상 세척하는 것을 포함한다.

용어 "식물"은 수명 주기 또는 발생(development) 중 임의의 단계의 임의의 식물, 및 그의 자손을 의미한다. 한 구현예에서, 식물은 "담배 식물"로서, 니코티아나(Nicotiana) 속에 속하는 식물을 의미한다. 상기 용어는 전체 식물, 식물 기관, 식물 조직, 식물 주아(propagule), 식물 종자, 식물 세포 및 이들의 자손의 지칭을 포함한다. 식물 세포로는, 종자, 현탁 배양물, 배아, 분열 조직 영역, 유합 조직, 잎, 뿌리, 싹, 배우체, 포자체, 꽃가루 및 소포자가 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 담배 식물의 적절한 종, 재배종, 혼성체 및 품종은 본원에 기술되어 있다.

"폴리뉴클레오타이드", "폴리뉴클레오타이드 서열" 또는 "폴리뉴클레오타이드 단편"은, 선택적으로 합성, 비-천연 또는 변경된 뉴클레오타이드 염기를 함유하는, 단일-가닥 또는 이중-가닥인 RNA 또는 DNA의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호호환적으로 사용된다. 뉴클레오타이드(통상 이의 5'-모노포스페이트 형태로 발견됨)는 하기와 같이 이의 단일 문자로 지칭되는데: "A"는 (각각 RNA 또는 DNA에 대하여) 아데닐레이트 또는 데옥시아데닐레이트, "C"는 시티딜레이트 또는 데옥시시티딜레이트, "G"는 구아닐레이트 또는 데옥시구아닐레이트, "U"는 우리딜레이트, "T"는 데옥시티미딜레이트, "R"은 퓨린(A 또는 G), "Y"는 피리미딘(C 또는 T), "K"는 G 또는 T, "H"는 A 또는 C 또는 T, "I"는 이노신을 지칭하고, "N"은 임의의 뉴클레오타이드를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 제한 없이, 게놈 DNA, 상보적 DNA(cDNA), mRNA 또는 안티센스 RNA 또는 이들의 단편(들)일 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오타이드는 단일-가닥 또는 이중-가닥, 단일-가닥 및 이중-가닥 영역들의 혼합물, DNA 및 RNA를 포함하는 혼성 분자, 또는 단일-가닥 및 이중-가닥 영역들의 혼합물을 가지는 혼성 분자 또는 이들의 단편(들)일 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오타이드는 DNA, RNA, 또는 둘 다 또는 이들의 단편(들)을 포함하는 삼중-가닥 영역들로 구성될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 변형된 염기, 예컨대 포스포티오에이트를 함유할 수 있고, 펩타이드 핵산(PNA)일 수 있다. 일반적으로, 폴리뉴클레오타이드는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드, 또는 개별 뉴클레오타이드의 단리된 혹은 클로닝된 단편, 또는 전술한 것들의 조합으로부터 조립될 수 있다. 비록 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드가 DNA 서열로 보이지만, 상기 폴리뉴클레오타이드는 그의 대응하는 RNA 서열, 및 그의 역보체를 포함해서, 그의 상보성(예를 들어, 완전히 상보적인) DNA 또는 RNA 서열을 포함한다. 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드는 첨부된 서열 목록에 제시된다.

"폴리펩타이드" 또는 "폴리펩타이드 서열"은, 자연적으로 발생하는 아미노산 중합체뿐만 아니라, 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연적으로 발생하는 아미노산의 인공적인 화학적 유사체인 아미노산 중합체를 지칭한다. 상기 용어들은 또한, 글리코실화, 지질 부착, 설페이트화, 글루탐산 잔기의 감마-카르복실화, 하이드록실화 및 ADP-리보실화를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 변형을 포함한다. 본 개시내용의 폴리펩타이드는 첨부된 서열 목록에 제시된다.

본원에 사용된 바와 같이, "재조합"은, 예를 들어 화학적 합성에 의해, 또는 유전자 조작 기술에 의한 폴리뉴클레오타이드의 단리된 단편들의 조작(manipulation)에 의해, 서열의 2개의 다르게 분리된 단편들의 인공적인 조합을 지칭한다. 상기 용어는 또한, 이종성 폴리뉴클레오타이드의 도입에 의해 변형된 세포 또는 벡터, 또는 그렇게 변형된 세포로부터 유래되는 세포를 지칭하는 것을 포함하나, 자연적으로 발생하는 사건(예, 자발적인 돌연변이, 자연적인 형질전환 또는 형질도입 또는 전위), 예컨대 정교한 인간 개입 없이 발생하는 것들에 의한 세포 또는 벡터의 변경은 포함하지 않는다.

용어 "담배"는 종합해서, 본원에 기술된 바와 같이 제조 및/또는 수득되는 담배 작물(예, 경지(field)에서 생장되는 복수의 담배 식물, 즉 수경 재배에 의해 생장되지 않는 담배), 담배 식물, 및 비제한적으로 뿌리, 줄기, 잎, 꽃 및 종자를 포함하는 이의 일부를 지칭하는 데 사용된다. "담배"는 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 식물 및 이의 산물을 지칭하는 것으로 이해된다.

용어 "담배 제품"은 비제한적으로 흡연 재료(예, 궐련, 엽궐련 및 파이프 담배), 코담배, 씹는 담배, 검 및 로젠지를 포함한 소비자용 담배 제품, 뿐만 아니라 소비자용 담배 제품의 제조를 위한 구성성분, 재료 및 성분을 지칭한다. 적절하게는, 이들 담배 제품은 담배로부터 수확된 다음, 담배 제조의 종래의 기술에 따라 절단, 건조, 경화 및/또는 발효된 담배 잎 및 줄기로부터 제조된다.

펩타이드 또는 폴리펩타이드와 관련하여 "변이체"는 아미노산의 삽입, 결실 또는 보존적 치환에 의해 서열이 상이하지만, 적어도 하나의 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 변이체는 또한 적어도 하나의 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩타이드를 의미할 수 있다. 아미노산의 보존적 치환, 즉, 아미노산을 유사한 특성(예, 친수성, 하전된 영역의 정도 및 분포)을 가진 상이한 아미노산으로 대체하는 것은 당업계에서 전형적으로 최소의 변화를 수반하는 것으로 인지된다.

용어 "품종(variety)"은 동일한 종의 다른 식물로부터 구분되는 일정한 특징을 공유하는 식물의 집단을 의미한다. 하나 이상의 뚜렷한 형질을 가지면서, 품종은 이러한 품종 내의 개체들 사이에서 전체적인 변이가 매우 작은 것을 더욱 특징으로 한다. 품종은 종종 상업적으로 판매된다.

"벡터"는 폴리뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 작제물 및 폴리뉴클레오타이드 컨쥬게이트 등을 수송할 수 있게 하기 위한 폴리뉴클레오타이드 성분들의 조합을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 비히클을 지칭한다. 벡터는 바이러스 벡터, 박테리오파지, 박테리아 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 DNA 벡터 또는 RNA 벡터일 수 있다. 적합한 벡터는 원형의, 이중-가닥 뉴클레오타이드 플라스미드; 선형의 이중-가닥 뉴클레오타이드 플라스미드; 및 임의의 기원의 다른 벡터와 같은 염색체-외 복제가 가능한 에피솜을 포함한다.

본원에 사용된 "발현 벡터"는 폴리뉴클레오타이드(들), 폴리뉴클레오타이드 작제물 및 폴리뉴클레오타이드 컨쥬게이트 등의 발현을 가능하게 하기 위한 폴리뉴클레오타이드 성분들의 조합을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 비히클이다. 적절한 발현 벡터는 원형의, 이중-가닥 뉴클레오타이드 플라스미드; 선형의 이중-가닥 뉴클레오타이드 플라스미드; 및 임의의 기원의 다른 기능적으로 동등한 발현 벡터와 같은 염색체-외 복제가 가능한 에피솜(episome)을 포함한다. 발현 벡터는 이하에서 정의된 바와 같이 적어도 폴리뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 작제물 또는 폴리뉴클레오타이드 컨쥬게이트(conjugate) 상류에 위치한 프로모터(promoter)를 포함한다.

본원에서 다르게 정의되지 않는 한, 본 개시내용과 연결하여 사용된 과학적 용어 및 기술적 용어는 당업자에 의해 보편적으로 이해되는 의미를 가져야 한다. 예를 들어, 본원에 기술된 세포 및 조직 배양 기술, 분자생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드 화학 및 혼성화와 연결하여 사용된 임의의 명명법은 당업계에 잘 알려져 있으며 보편적으로 사용되는 것들이다. 용어의 의미 및 범위는 분명해야 하지만; 임의의 잠재적 다의성이 존재하는 경우, 본원에서 제공된 정의가 임의의 사전적 정의 또는 외적 정의를 능가하여 우세하다. 나아가, 문맥상 다르게 필요하지 않는 한, 단수형은 복수형을 포함해야 하고, 복수형은 단수형을 포함해야 한다.

"게놈 편집"은, 내인성 폴리펩타이드를 암호화하는 내인성 유전자를 변화시켜, 절단된 내인성 폴리펩타이드 또는 아미노산 변형-예컨대 치환-을 가진 내인성 폴리펩타이드의 폴리펩타이드 발현이 수득되도록 하는 것을 지칭한다. 게놈 편집은, 표적화된 내인성 유전자의 영역을 대체하거나, 전체 내인성 유전자를 상동성-유도 복구(HDR)와 같은 복구 메커니즘을 이용하여 절단 또는 아미노산 치환을 가진 유전자의 복사본으로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 게놈 편집은 또한, 내인성 유전자에 이중 가닥 절단부를 발생시킨 다음, NHEJ을 사용하여 복구시킴으로써, 내인성 유전자에 아미노산 치환을 발생시키는 것을 포함할 수 있다. NHEJ는 아미노산 치환을 발생시킬 수 있는 복구 동안에 적어도 하나의 염기쌍을 첨가하거나 결실시킬 수 있다. 게놈 편집은 또한, 2개의 뉴클레아제 표적 부위들 사이에서 절단을 형성하기 위해 동일한 DNA 가닥 상에서 2개의 뉴클레아제를 동시에 작동시킴으로써 유전자 분절을 결실시키고, DNA 절단부를 NHEJ에 의해 복구시키는 것을 포함할 수 있다.

"상동성-지정 복구" 또는 "HDR"은, DNA의 상동성 조각이 핵에서, 대체로 세포 주기 중 G2기 및 S기에 존재할 때, 이중 가닥 DNA 병변을 복구시키기 위한 세포에서의 메커니즘을 지칭한다. HDR은 복구를 가이드하기 위해 공여자 DNA 또는 공여자 주형을 사용하고, 전체 유전자의 표적화된 첨가를 비롯한 특이적인 서열 변화를 게놈에 형성하는 데 사용될 수 있다. 공여자 주형이 부위 특이적인 뉴클레아제와 함께 제공된다면, 세포 머시너리(cellular machinery)는 절단부를 상동성 재조합에 의해 복구시킬 것이며, 이는 DNA 절단의 존재 시 수 자릿수(several orders of magnitude) 증강된다. 상동성 DNA 조각이 부재하는 경우, NHEJ이 대신 발생할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "비-상동성 말단 접합(NHEJ) 경로"는 상동성 주형의 필요 없이도, 절단부 말단들을 직접 연결함으로써 DNA에서 이중-가닥 절단부를 복구하는 경로를 지칭한다. NHEJ에 의한 DNA 말단들의 주형-독립적 재-연결은, DNA 절단부 지점에 랜덤 미세-삽입 및 미세-결실(indel)을 도입하는 확률적인 오류-유발(error-prone) 복구 과정이다. 이러한 방법은 표적화된 유전자 서열의 해독 틀을 의도적으로 방해하거나, 결실시키거나 변경하는 데 사용될 수 있다. NHEJ는 전형적으로, 복구를 가이드하기 위해 미세상동성(microhomology)이라고 하는 짧은 상동성 DNA 서열을 사용한다. 이들 미세상동성은 종종 이중-가닥 절단부의 말단 상의 단일-가닥 돌출부에 존재한다. 돌출부가 완벽하게 융화성(compatible)인 경우, NHEJ는 통상 절단부를 정확하게 복구하지만, 뉴클레오타이드의 상실을 초래하는 부정확한 복구 또한 아직 발생할 수 있는데, 그러나, 이러한 부정확한 복구는 돌출부가 융화성이 아닐 때에는 훨씬 더 보편적이다.

"부위-특이적 뉴클레아제"는 DNA 서열을 특이적으로 인지하고 절단할 수 있는 효소를 지칭한다. 부위-특이적 뉴클레아제는 조작될 수 있다. 조작된 부위-특이적 뉴클레아제의 예로는, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), TAL 효과기 뉴클레아제(TALEN), CRISPR/Cas9-기재 시스템 및 메가뉴클레아제가 있다.

"전사 활성화제-유사 효과기" 또는 "TALE"는 특정 DNA 서열을 인지하고 결합하는 폴리펩타이드 구조를 지칭한다. "TALE DNA-결합 도메인"은 RVD 모듈로도 알려져 있는 탠덤 33개 내지 35개 아미노산 반복부의 어레이를 포함하는 DNA-결합 도메인을 지칭하며, 이러한 RVD 모듈은 각각 DNA의 단일 염기쌍을 특이적으로 인지한다. RVD 모듈은 규정된 서열을 인지하는 어레이를 어셈블리하기 위해 임의의 순서로 배열될 수 있다. TALE DNA-결합 도메인의 결합 특이성은 RVD 어레이 및 후속해서 20개 아미노산의 단일 절단 반복부에 의해 결정된다. TALE DNA-결합 도메인은 12개 내지 27개의 RVD 모듈을 가질 수 있으며, 이러한 RVD 모듈은 각각 RVD를 함유하고 DNA의 단일 염기쌍을 인지한다. 4개의 가능한 DNA 뉴클레오타이드(A, T, C 및 G)를 각각 인지하는 특이적인 RVD가 동정되어 있다. TALE DNA-결합 도메인이 모듈형(modular)이기 때문에, 4개의 상이한 DNA 뉴클레오타이드를 인지하는 반복부는 함께 연결되어, 임의의 특정한 DNA 서열을 인지할 수 있다. 그런 다음, 이들 표적화된 DNA-결합 도메인은 촉매성 도메인과 조합되어, 인공 전사 인자, 메틸트랜스퍼라제, 인테그라제, 뉴클레아제 및 리컴비나제를 비롯한 기능성 효소를 생성할 수 있다.

본원에서 상호호환적으로 사용되는 바와 같이, "전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제" 또는 "TALEN"은 뉴클레아제, 예컨대 엔도뉴클레아제 FokI의 촉매성 도메인과, 통상의 DNA 서열에 표적화될 수 있는 디자인된 TALE DNA-결합 도메인의 조작된 융합 폴리펩타이드를 지칭한다.

"TALEN 단량체"는 촉매성 뉴클레아제 도메인 및 디자인된 TALE DNA-결합 도메인을 포함하는 조작된 융합 폴리펩타이드를 지칭한다. 2개의 TALEN 단량체는 TALEN 표적 영역을 표적화하고 절단하도록 디자인된다.

"아연 핑거"는 DNA 서열을 인지하고 결합하는 폴리펩타이드 구조를 지칭한다. 아연 핑거 도메인은 인간 프로테옴에서 가장 보편적인 DNA-결합 모티프이다. 단일 아연 핑거는 대략 30개의 아미노산을 함유하고, 이러한 도메인은 전형적으로, 1개 염기쌍 당 단일 아미노산 측쇄의 상호작용을 통해 DNA의 3개의 연속 염기쌍에 결함함으로써 작용한다.

"아연 핑거 뉴클레아제" 또는 "ZFN"은, 완전히 조립되었을 때 DNA를 절단할 수 있는 적어도 하나의 뉴클레아제 또는 뉴클레아제의 일부에 효과적으로 연결된 적어도 하나의 아연 핑거 DNA 결합 도메인을 포함하는 키메라 폴리펩타이드 분자를 지칭한다.

발명의 상세한 설명

일 측면에서, 서열번호 5의 연속 폴리펩타이드 서열을 포함하는 니트레이트 환원효소 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열이 제공되며, 여기서 메티오닌은 대조군 식물 세포와 비교하여 니트레이트 환원효소 활성을 감소시키는 아미노산으로 치환된다.

적절하게는, 니트레이트 환원효소 폴리펩타이드는 서열번호 7의 연속 폴리펩타이드 서열을 가지되, 여기서 메티오닌은 대조군 식물 세포와 비교하여 니트레이트 환원효소 활성을 감소시키는 아미노산으로 치환된다.

적절하게는, 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열은, 메티오닌이 상이한 아미노산, 바람직하게는 지방족 비극성 아미노산, 보다 바람직하게는 이소류신으로 치환되는 니트레이트 환원효소 폴리펩타이드를 암호화한다.

적절하게는, 지방족 비극성 아미노산은 글리신, 알라닌, 프롤린, 이소류신, 류신 또는 발린으로 이루어진 아미노산의 군으로부터 선택된다.

적절하게는, 지방족 비극성 아미노산은 이소류신이다. 본 구현예에 따르면, 니트레이트 환원효소는 서열번호 6 또는 서열번호 8의 치환된 연속 폴리펩타이드 서열을 갖는다.

적절하게는, 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 서열의 위치 527에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 이로 구성되는 니트레이트 환원효소 폴리펩타이드를 암호화한다.

적절하게는, 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3에 제시된 폴리펩타이드 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 이로 구성되어 있다.

적절하게는, 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 2와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 이로 구성되어 있다.

적절하게는, 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4에 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 이로 필수적으로 구성되어 있다.

본 개시에 따른 예시적인 치환 돌연변이는 표 1에 제시되어 있다.

특정 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 서열은, 서열목록에 보이는 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함해서, 본원에 기재된 임의의 서열에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 가지는, 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 이로 필수적으로 구성되어 있다. 적절하게는, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 이와 적어도 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 이로 필수적으로 구성되어 있다.

적절하게는, 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드(들)는 서열목록에 나타낸 폴리펩타이드(들)의 기능 또는 활성의 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 갖는 활성 니트레이트 환원효소 폴리펩타이드를 암호화한다.

또 다른 구현예에서, 서열번호 4의 상응하는 단편에 적어도 약 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 서열 동일성을 가지는, 실질적 상동성(즉, 서열 유사성) 또는 이와 실질적 동일성을 갖는 M527I 돌연변이를 포함하는 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 서열번호 4의 폴리뉴클레오타이드 단편이 제공되어 있다.

본원에 기술된 돌연변이(들)를 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 단편이 또한 개시되어 있다. 폴리뉴클레오타이드 단편은 일반적으로 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 100개 또는 적어도 200개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.

본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 비변형되었거나 변형된 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)일 수도 있는, 뉴클레오타이드의 중합체를 포함할 수 있다. 따라서, 폴리뉴클레오타이드는 제한없이, 게놈 DNA, 상보성 DNA(cDNA), mRNA, 또는 안티센스 RNA 또는 이들의 단편(들) 또는 절단(들)일 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오타이드는 단일가닥 또는 이중가닥 DNA, 단일가닥 및 이중가닥 영역들의 혼합물인 DNA, DNA 및 RNA를 포함하는 혼성 분자, 또는 단일가닥 및 이중가닥 영역들의 혼합물을 가지는 혼성 분자 또는 이들의 단편(들)일 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오타이드는 DNA, RNA, 또는 둘 다 또는 이들의 단편(들)을 포함하는 삼중-가닥 영역들로 구성될 수 있다. 일반적으로, 폴리뉴클레오타이드는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드, 또는 개별 뉴클레오타이드의 단리된 혹은 클로닝된 단편, 또는 전술한 것들의 조합으로부터 조립될 수 있다. 비록 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드가 DNA 서열로 보여지지만, 이는 그의 대응하는 RNA 서열, 및 그의 역보체를 포함해서, 그의 상보성(예를 들어, 완전히 상보적인) DNA 또는 RNA 서열을 포함한다.

본원에 기술된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드는 일반적으로 포스포디에스테르 결합을 함유할 것이다. 다른 유사체 폴리뉴클레오타이드로는 양성 골격; 비이온성 골격, 및 비-리보오스 골격을 가지는 것을 포함한다. 리보오스-인산 골격의 변형은 다양한 이유 때문에 생길 수 있는데, 예를 들면, 생리학적 환경 또는 바이오칩 상 프로브로서의 분자들의 안정성 및 반감기를 증대시키기 위한 이유이다. 자연발생 폴리뉴클레오타이드 및 유사체의 혼합이 생길 수 있다; 대안적으로, 상이한 폴리뉴클레오타이드 유사체들의 혼합, 및 자연발생 폴리뉴클레오타이드 및 유사체의 혼합이 생길 수 있다.

유사체 폴리뉴클레오타이드로는 양성 골격, 비이온성 골격, 및 비-리보오스 골격을 가지는 것을 포함할 수 있다. 하나 이상의 카보사이클릭 당을 함유하는 폴리뉴클레오타이드가 또한 포함된다.

다른 유사체로는 펩티드 폴리뉴클레오타이드 유사체인 펩티드 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 이러한 골격은 자연발생 폴리뉴클레오타이드의 고 전하의 포스포디에스테르 골격과 대조적으로, 중성 조건 하에서 실질적으로 비이온성이다. 이것은 이점을 야기할 수도 있다. 첫째, 펩티드 폴리뉴클레오타이드 골격은 개선된 혼성화 동역학(hybridization kinetics)을 보여줄 수도 있다. 펩티드 폴리뉴클레오타이드는 불일치 대비 완전 일치 염기쌍을 위해 더 큰 용융점 변화를 가진다. DNA 및 RNA는 일반적으로 간격 불일치의 경우에 2-4℃의 용융점 강하를 보여준다. 비이온성 펩티드 폴리뉴클레오타이드 골격의 경우, 상기 강하는 7-9℃에 더 가깝다. 마찬가지로, 그의 비이온성 성질 때문에, 이 골격들에 부착된 염기의 혼성화는 염 농도에 상대적으로 민감하지 않다. 또한, 펩티드 폴리뉴클레오타이드는 세포 효소에 의해 변성되지 않을 수도 있고 더 적은 범위로 변성될 수도 있으므로, 더 안정적일 수도 있다.

개시된 폴리뉴클레오타이드, 및 그 단편의 용도 중에는 혼성화 분석에서 프로브로서 또는 증폭 분석에 사용하기 위한 프라이머로서 용도가 있다. 이러한 단편은 일반적으로 적어도 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 또는 그 이상의 연결된 뉴클레오타이드의 DNA 서열을 포함하고 있다. 다른 구현예들에서, DNA 단편은 적어도 약 10, 15, 20, 30, 40, 50 또는 60 또는 그 이상의 연결된 뉴클레오타이드의 DNA 서열을 포함하고 있다. 따라서, 한 측면에서, 프로브 또는 프라이머 또는 둘 다 사용하는 것을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 검출하기 위한 방법이 또한 제공되어 있다. 예시적인 프라이머는 본원에 기재되어 있다.

혼성화 조건의 선택 및 적절한 조건을 고안하기 위한 지침에 영향을 미치는 기본적인 매개변수는 Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)에 의해 기재되어 있다. 본원에 기재된 폴리펩타이드 서열과 유전 암호의 지식의 조합을 이용해서, 축퇴성 올리고뉴클레오타이드의 세트가 생성될 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 예를 들어 DNA 단편이 단리되고 증폭되는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에서 프라이머로서 유용하다. 소정의 구현예들에서, 축퇴성 프라이머는 유전자 라이브러리를 위한 프로브로서 사용될 수 있다. 이러한 라이브러리는 cDNA 라이브러리, 게놈 라이브러리, 및 심지어 전자 발현 서열 태그 또는 DNA 라이브러리를 포함한다. 이러한 방법에 의해서 식별되는 상동성 서열은 본원에서 인식되는 서열의 상동성을 인식하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다.

또한 감소된 엄격성 조건, 전형적으로 중간 엄격성 조건, 및 일반적으로 높은 엄격성 조건 하에서 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드(들)와 혼성화되는 폴리뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 프라이머 또는 프로브)가 잠재적으로 사용될 수 있다. 혼성화 조건의 선택 및 적절한 조건을 고안하기 위한 지침에 영향을 미치는 기본 매개변수는 Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)에 의해 기재되어 있고 그리고 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드의 길이 또는 염기 조성을 기초로 하여 본 기술분야의 숙련자들에 의해서 쉽게 결정될 수 있다.

중간 엄격성 및 높은 엄격성 조건을 달성하는 한 가지 방식이 본원에서 정의되어 있다. 세척 온도 및 세척 염 농도는, 당업자에게 공지되어 있고 이하에서 더 설명되는 바와 같이(예를 들어, Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y) 참조), 혼성화 반응 및 이중 안정성을 규율하는 기본 원리를 적용하여 원하는 정도의 엄중도를 달성하기 위해 필요에 따라 조정될 수 있음을 이해해야 한다. 폴리뉴클레오타이드를 알려지지 않은 서열의 폴리뉴클레오타이드에 혼성화할 때, 혼성 길이는 혼성화 폴리뉴클레오타이드의 길이인 것으로 가정된다. 공지된 서열의 폴리뉴클레오타이드가 혼성화될 때, 혼성 길이는 폴리뉴클레오타이드의 서열을 정렬하고 최적의 서열 상보성의 영역 또는 영역들을 식별함으로써 결정될 수 있다. 길이가 50 염기쌍 미만으로 예상되는 하이브리드에 대한 혼성화 온도는 하이브리드의 용융 온도보다 5℃ 내지 10℃ 낮아야 하며, 이때 용융 온도는 다음 식에 따라 결정된다. 길이가 18 염기쌍 미만인 하이브리드의 경우, 용융 온도(℃)=2(A+T 염기의 수)+4(G+C 염기의 수). 길이가 18 염기쌍을 초과하는 하이브리드의 경우, 용융 온도(℃)=81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(% G+C)-(600/N)이며, 여기서 N은 하이브리드 중의 염기 수이고, [Na+]는 하이브리드화 완충제 중의 나트륨 이온의 농도(1x 표준 소듐 시트레이트의 경우 [Na+]=0.165M)이다. 통상적으로, 각각의 이러한 혼성화 폴리뉴클레오타이드는 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드의 길이의 적어도 25%(일반적으로 적어도 50%, 60%, 또는 70%, 및 가장 일반적으로 적어도 80%)인 길이를 가지며, 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드와 적어도 60%의 서열 동일성(예를 들어, 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)을 갖는다.

당업자에 의해서 이해되는 것처럼, 선형 DNA는 두 가지 가능한 배향: 5'에서 3' 방향과 3'에서 5' 방향을 가진다. 예를 들어, 첫번째 서열이 5'에서 3' 방향에 위치하고, 두번째 서열이 동일한 폴리뉴클레오타이드 분자/가닥 내에서 5'에서 3' 방향에 위치하면, 이때 첫번째 서열 및 두번째 서열은 동일한 방향으로 배향되거나, 또는 동일한 배향을 가진다. 전형적으로, 주어진 프로모터의 조절 하에 관심 있는 프로모터 서열 및 유전자는 동일한 배향으로 위치한다. 그러나, 5'에서 3' 방향으로 위치하는 첫번째 서열과 관련해서는, 두 번째 서열이 동일한 폴리뉴클레오타이드 분자/가닥 내에서 3'에서 5' 방향으로 위치하면, 이때 첫번째 서열 및 두번째 서열은 안티센스 방향으로 배향되거나, 안티센스 배향을 가진다. 서로에 대하여 안티센스 배향을 가지는 두 가지 서열은, 첫번째 서열(5'에서 3' 방향) 및 첫번째 서열의 역상보성 서열(5'에서 3' 방향으로 위치하는 첫번째 서열)이 동일한 폴리뉴클레오타이드 분자/가닥 내에 위치한다면, 동일한 배향을 가지는 것으로 대안적으로 설명될 수 있다. 본원에 기재된 서열은 5'에서 3' 방향으로 도시되어 있다.

본원에 기재된 바와 같은 재조합 폴리뉴클레오타이드 작제물을 함유하는 벡터가 또한 제공된다. 적절한 벡터 골격은 예를 들어 플라스미드, 바이러스, 인공 염색체, 세균 인공 염색체, 효모 인공 염색체, 또는 박테리오파지 인공 염색체와 같이 본 기술분야에 일상적으로 사용되는 것들을 포함한다. 적절한 발현 벡터는 제한 없이, 예를 들어 박테리오파지, 배큘로바이러스(baculoviruse), 및 레트로바이러스로부터 유래되는 플라스미드 및 바이러스 벡터를 포함한다. 수많은 벡터 및 발현 시스템이 시판 중이다.

일 측면에서, 서열목록에 보이는 임의의 폴리펩타이드를 포함해서, 본원에 기재된 임의의 폴리펩타이드에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 가지는, 폴리펩타이드를 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 이로 구성되는 단리된 폴리펩타이드가 제공되어 있다. 적절하게는, 단리된 폴리펩타이드는 적어도 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 이로 필수적으로 구성되어 있다.

추가 측면에서, 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드 서열이 개시되어 있다.

또 다른 측면에서, 서열번호 5의 연속 폴리펩타이드 서열을 포함하는 니트레이트 환원효소 폴리펩타이드가 개시되어 있으며, 여기서 메티오닌은 대조군 식물 세포와 비교하여 니트레이트 환원효소 활성을 감소시키는 아미노산으로 치환된다. 서열 서열번호 5는 NtNIA2 아미노산 S523의 인산화를 담당하는 니트레이트 환원효소 키나아제의 결합에 대한 인식 부위로서 작용한다.

적절하게는, 니트레이트 환원효소는 서열번호 7의 연속 폴리펩타이드 서열을 포함하되, 메티오닌은 대조군 식물 세포와 비교하여 니트레이트 환원효소 활성을 감소시키는 아미노산으로 치환된다.

적절하게는, 메티오닌은 글리신, 알라닌, 프롤린, 이소류신, 류신 또는 발린으로 이루어진 아미노산의 군으로부터 선택될 수 있는 지방족 비극성 아미노산과 같은 상이한 아미노산으로 치환된다.

적절하게는, 지방족 비극성 아미노산은 I이다. 본 구현예에 따르면, 니트레이트 환원효소는 서열번호 6 또는 서열번호 8의 연속 폴리펩타이드 서열을 포함한다.

적절하게는, 니트레이트 환원효소 폴리펩타이드는 서열번호 1과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 서열의 위치 527에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 이로 구성되어 있다.

적절하게는, 니트레이트 환원효소 폴리펩타이드는 서열번호 1과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 서열에서 아미노산 치환 M527I를 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 이로 구성되어 있다.

적절하게는, 니트레이트 환원효소 폴리펩타이드는 서열번호 3에 제시된 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 이로 구성되어 있다.

본원에 기술된 돌연변이(들)를 포함하는 폴리펩타이드의 단편도 개시되어 있다. 폴리펩타이드(들)의 단편은 통상적으로 전장 서열의 기능 또는 활성의 일부 또는 전부를 보유한다. 폴리펩타이드 단편은 전형적으로 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 100개 또는 적어도 200개의 연속 아미노산을 포함한다. 본원에 개시된 폴리펩타이드는 자연적으로 단리될 수 있는 임의의 유형의 하나 이상의 변경을 도입함으로써 생성된 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 적절하게는, 돌연변이(들)가 도입되는 니트레이트 환원효소 폴리펩타이드의 기능 또는 활성은 돌연변이의 도입에 의해 조절된다(예를 들어, 감소된다). 적절하게는, 돌연변이는 치환이다. 치환이란 니트레이트 환원효소 폴리펩타이드의 적어도 하나의 아미노산을 유사한 성질(예컨대 유사한 소수성, 친수성, 항원성, α-나선 구조 또는 β-시트 구조 등을 형성 또는 파괴하려는 경향성)을 가지는 다른 아미노산들로 교체하는 것을 지칭한다.

적절하게는, 돌연변이는, 치환을 보유하는 식물이 대조군 식물과 비교하여 니트레이트 환원효소 활성을 감소시키는 아미노산으로 메티오닌이 치환되는 서열번호 5 또는 서열번호 7의 연속 폴리펩타이드 서열에서 메티오닌의 치환이다. 한 구현예에서, 메티오닌은 지방족 비극성 아미노산 -예컨대 글리신, 알라닌, 프롤린, 이소류신, 류신 또는 발린으로 치환된다. 한 구현예에서, 지방족 비극성 아미노산은 이소류신이고, 적절하게는 연속 폴리펩타이드 서열은 이어서 서열번호 6 또는 서열번호 8이다. 한 구현예에서, 치환은 M527I이다. M527I 돌연변이를 보유하는 예시적인 니트레이트 환원효소 폴리펩타이드 서열은 서열번호 3이다.

본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 중 하나 이상에서 돌연변이를 포함하거나 또는 보유하는 식물 또는 식물 세포가 개시되어 있으며, 여기서 상기 돌연변이는 니트레이트 환원효소의 조절된 기능 또는 활성을 초래한다. 본원에 기술된 돌연변이는 인공 돌연변이 또는 합성 돌연변이를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드에서의 돌연변이는 시험관 내 또는 생체 내 조작 단계를 포함하는 공정을 통해서 수득되거나 또는 수득가능한 돌연변이일 수 있다. 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드에서의 돌연변이는 인간에 의한 개입을 포함하는 공정을 통해서 수득되거나 또는 수득가능한 돌연변이일 수 있다. (경화된) 식물 또는 (경화된) 식물 재료에서 폴리펩타이드의 수준을 조절하는 방법이 제공되어 있으며, 상기 방법은, 적어도 하나의 유전자의 발현을 조절하는 하나 이상의 돌연변이를 상기 식물의 게놈 내에 도입하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 적어도 하나의 유전자는 본 개시내용에 따른 서열 -예컨대 M527I로부터 선택된다. 적절하게는, 상기 유전자는 본원에 기술된 바와 같은 니코티아나 타바쿰 니트레이트 환원효소 폴리펩타이드를 암호화한다.

또한, 본 개시에 따른 하나 이상의 돌연변이에 대해 이형접합성 또는 동형접합성인 식물 또는 식물 세포가 개시되어 있으며, 여기서 상기 돌연변이는 유전자의 발현 또는 그에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 기능 또는 활성의 조절을 초래한다.

식물에서 본 개시내용에 따른 하나 이상의 폴리펩타이드의 기능 또는 활성은, 폴리펩타이드 기능 또는 활성이 그 폴리펩타이드의 기능 또는 활성을 억제하도록 변형되지 않았으며 동일한 프로토콜을 사용하여 경작되고 수확되고 경화된 식물에서 동일한 폴리펩타이드(들)의 기능 또는 활성보다 낮은 경우에 증가되거나 감소된다.

본원에 기재된 바와 같은 돌연변이체 폴리뉴클레오타이드와 폴리펩타이드를 수득하기 위한 방법이 또한 개시되어 있다. 식물 세포 또는 식물 재료를 포함하는, 담배와 같은, 관심있는 식물은 부위-특이적 돌연변이 유발, 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이 유발, 화학적-유도 돌연변이 유발, 방사-유도 돌연변이 유발, 변형된 염기를 이용하는 돌연변이 유발, 간격 이중체 DNA(gapped duplex DNA)를 이용하는 돌연변이 유발, 이중가닥 파괴 돌연변이 유발, 복구 결함성 숙주 변형을 이용하는 돌연변이 유발, 총 유전자 합성에 의한 돌연변이 유발, DNA 셔플링(shuffling) 및 이하에서 논의되는 바와 같은 기타 동등한 방법들을 포함하는, 돌연변이 유발을 유도하기 위해서 공지된 다양한 방법에 의해 유전적으로 변형될 수 있다.

폴리뉴클레오타이드에서 무작위로 돌연변이를 도입하는 방법은 화학적 돌연변이유발 및 방사선 돌연변이유발을 포함할 수 있다. 화학적 돌연변이유발은 돌연변이를 유도하기 위해 외생적으로 부가된 화학물질들 - 예컨대 돌연변이원성, 기형발생성 또는 발암성 유기 화합물들-의 사용을 포함한다. 화학적 돌연변이원 또는 방사선을 포함해서, 점 돌연변이 및 짧은 결실, 삽입, 미스센스 돌연변이, 단순 서열 반복, 전좌, 및/또는 전이를 일차적으로 생성하는 돌연변이원이 돌연변이를 형성하는 데에 사용될 수도 있다. 돌연변이원은, 에틸 메탄술포네이트, 메틸메탄 술포네이트, N-에틸-N-니트로소우레아, 트리에틸멜라민, N-메틸-N-니트로소우레아, 프로카르바진, 클로람부실, 시클로포스파미드, 디에틸 설페이트, 아크릴아미드 모노머, 멜파란, 질소 머스타드(mustard), 빈크리스틴, 디메틸니트로사민, N-메틸-N'-니트로-니트로소구아니딘, 니트로소구아니딘, 2-아미노퓨린, 7,12 디메틸-벤즈(자)안트라센, 에틸렌 산화물, 헥사메틸포스포아미드, 바이술판, 디에폭시알칸(디에폭시옥탄, 디에폭시부탄, 기타 등등), 2-메톡시-6-클로로-9[3-(에틸-2-클로로-에틸)아미노프로필아미노]아크리딘 디하이드로클로라이드 및 포름알데히드를 포함한다.

하나 이상의 표적화된 돌연변이를 폴리뉴클레오타이드 서열로 도입하는 방법은 이들에만 한정하는 것은 아니지만, 유전체 편집 기술, 특히 아연 핑거 뉴클레아제-매개 돌연변이 유발, 틸링(게놈에서 유도된 국소 병변의 표적화), 상동성 재조합, 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이 유발, 및 메가뉴클레아제-매개 돌연변이 유발을 포함한다.　

아연 핑거 폴리펩타이드는 폴리뉴클레오타이드 서열 내로 하나 이상의 표적화된 돌연변이를 도입하는 데 사용될 수 있다. 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드의 코딩 서열의 부분 또는 전부를 포함하는 게놈 DNA 서열은 아연 집게 뉴클레아제 매개 돌연변이 유발에 의해 변형된다. 게놈 DNA 서열은 아연 핑거 폴리펩타이드 결합을 위한 특이한 부위로 검색된다. 대안적으로, 게놈 DNA 서열은 아연 핑거 폴리펩타이드 결합을 위한 두 개의 특이한 부위로 검색되며, 여기서 상기 두 부위는 모두 대향하는 가닥에 위치해 있으며 함께 인접해 있는데, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 염기쌍 만큼 떨어져 있다. 따라서, 폴리뉴클레오타이드에 결합하는 아연 핑거 폴리펩타이드가 제공된다. 아연 핑거 폴리펩타이드는 유전자에서 선택된 표적 부위를 인식하기 위해 조작될 수도 있다. 아연 핑거 폴리펩타이드는 자연적인 아연 핑거 DNA-결합 도메인 및 비-자연적인 아연 핑거 DNA-결합 도메인으로부터 절단(truncation) 또는 확장 또는 선별 방법, 예를 들어, 이에 한정하는 것은 아니지만, 파지 표시 선별, 세균 2-혼성 선별 또는 세균 1-혼성 선별과 연결된 부위-특이적 돌연변이유발 공정에 의하여 유도되는 모티프(motif)의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 용어 "비-자연적인 아연 핑거 DNA-결합 도메인"은 표적 폴리뉴클레오타이드 내의 3-염기쌍 서열을 결합하고, 변형될 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포 또는 유기체에서 발생하지 않는, 아연 핑거 DNA-결합 도메인을 나타낸다. 표적 유전자에 고유한 특이적 폴리뉴클레오타이드를 결합하는 아연 핑거 폴리펩타이드를 고안하기 위한 방법은 본 기술분야에 공지되어 있다. 아연 핑거 폴리펩타이드와 아연 핑거 뉴클레아제를 식물로 전달하기 위한 방법은 메가뉴클레아제의 전달을 위해 이하에 기재된 것들과 유사하다.

I-CreI와 같은 메가뉴클레아제는 폴리뉴클레오타이드 서열 내로 하나 이상의 표적화된 돌연변이를 도입하는 데 사용될 수 있다. 자연발생 메가뉴클레아제뿐만 아니라 재조합 메가뉴클레아제는 식물의 게놈 DNA 내의 단일 자리 또는 상대적으로 적은 자리에 구체적으로 이중가닥 파손을 야기하여 본원에 기재된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 파괴하는 데에 사용될 수 있다. 메가뉴클레아제는 변경된 DNA-인식 성능을 가지는 조작된 메가뉴클레아제일 수도 있다. 메가뉴클레아제 폴리펩타이드는 본 기술분야에 공지된 다양한 상이한 메커니즘에 의해 식물 세포로 전달될 수 있다. 메가뉴클레아제는 폴리뉴클레오타이드의 암호화 영역 내에 메가뉴클레아제 인식 부위를 절단하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 절단은 종종 비-상동 말단 결합에 의한 돌연변이 DNA 수선을 따르는 메가뉴클레아제 인식 부위에서 DNA가 결실되는 결과를 가져온다. 유전자 암호화 서열에서의 이러한 돌연변이는 전형적으로 유전자를 불활성화하기에 충분하다. 식물 세포를 변형시키기 위한 이러한 방법은 첫째로 적절한 형질전환 방법을 사용하여 식물 세포로 메가뉴클레아제 발현 카세트를 전달하는 것을 포함한다. 최대 효율을 위해, 메가뉴클레아제 발현 카세트를 선택성(selectable) 마커에 연결시키고 선택제의 존재 하에 성공적으로 형질전환된 세포를 선택하는 것이 바람직하다. 이 접근법은 메가뉴클레아제 발현 카세트를 게놈 내로 통합시키는 결과를 가져올 것이지만, 식물에 조절 승인이 요구되는 경우에는 바람직하지 않을 수도 있다. 이러한 경우에, 메가뉴클레아제 발현 카세트(및 연결된 선택성 마커 유전자)가 통상적인 육종 기술을 사용해서 후속 식물 세대에서 떨어져 나갈 수도 있다. 메가뉴클레아제 발현 카세트의 전달 이후, 식물 세포는, 처음에는, 사용된 구체적인 형질전환 절차에 대해 전형적인 조건 하에서 생장한다. 이것은 종종 어둠에서 26℃ 미만의 온도에서 배지 위에서 생장하는 형질전환된 세포를 의미할 수도 있다. 이러한 표준 조건은 기간, 바람직하게는 1-4일 동안 사용되어서 식물 세포가 형질전환 공정으로부터 복구될 수 있도록 할 수 있다. 이러한 초기의 복구 기간을 따르는 임의의 지점에서, 생장온도를 올려서, 상기 조작된 메가뉴클레아제의 기능을 자극해서 메가뉴클레아제 인식 부위를 절단하고 돌연변이시킬 수도 있다.

한 가지 유전자 편집 방법은 세포가 수선 메커니즘에 반응할 수 있는 이중가닥 파단을 유도하는 전사 활성제-유사 효과기 뉴클레아제(transcription activator-like effector nuclease; TALEN)를 사용하는 것을 포함한다. NHEJ은 어닐링을 위한 서열 중첩이 거의 없거나 전무한 경우에 이중-가닥 파단의 각 측으로부터 DNA를 다시 연결한다. 이러한 수선 메커니즘은 삽입 또는 결실, 또는 염색체 재배열을 통해 게놈의 오류를 유발한다. 그러한 임의의 오류는 비-기능성 위치에서 암호화되는 유전자 산물을 제공할 수도 있다. 소정의 적용분야의 경우, 폴리뉴클레오타이드를 식물의 게놈으로부터 정확하게 제거시키는 것이 바람직할 수도 있다. 이러한 적용분야는 한 쌍의 조작된 메가뉴클레아제를 이용할 수 있는데, 이들 각각은 의도된 결실의 양쪽 면 위에서 메가뉴클레아제 인식 자리를 절단한다. 유전자를 인식하고 그것에 결합하며 게놈 내로 이중-가닥 파단을 도입할 수 있는 TALEN도 사용될 수 있다.

또 다른 유전자 편집 방법은 세균 CRISPR/Cas 시스템의 사용을 포함한다. 세균과 고세균은 바이러스 및 플라스미드 DNA를 침입하는 것에 대항하는 적응성 면역 시스템의 일부인 CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)이라고 불리는 염색체 요소를 보여주고 있다. II 유형 CRISPR 시스템에서, CRISPR RNA(crRNA)는 trans-activating crRNA (tracrRNA) 및 CRISPR-associated (Cas) 폴리펩타이드로 기능해서 표적 DNA의 이중-가닥 파단을 도입한다. Cas9에 의한 표적 절단은 crRNA과 tracrRNA 사이의 염기 쌍 뿐만 아니라 crRNA와 표적 DNA 사이의 염기 쌍이 필요하다. 표적 인식은 NGG 서열을 따르는 protospacer-adjacent motif (PAM)라고 불리는 짧은 모티브의 존재에 의해 촉진된다. 이 시스템은 게놈 편집을 위해 이용될 수 있다. Cas9는 보통 crRNA 및 tracrRNA로 이루어진 이중 RNA에 의해 프로그래밍된다. 그러나, 이들 RNA의 코어 성분은 Cas9 표적화를 위한 단일 혼성체 '가이드 RNA'에 결합될 수 있다. 자리 특이적 절단을 위한 표적 DNA에 대해 비-암호화 RNA 가이드를 사용하면 TALEN 같은 기존의 기술보다 훨씬 더 간단하다는 것을 약속한다. CRISPR/Cas 전략을 사용하여, 뉴클레아제 복합체를 재표적화하는 것은 단지 새로운 RNA 서열의 도입만을 필요로 하며, 폴리펩타이드 전사 인자의 특이성을 재조작할 필요가 없다. CRISPR/Cas 기술은 국제 출원 WO 2015/189693의 방법에서 식물에서 구현되었으며, 이는 식물 종에 걸쳐 광범위하게 적용 가능한 바이러스-매개 게놈 편집 플랫폼을 개시하고 있다. 담배 뿌리 바이러스(TRV)의 RNA2 게놈을 조작해서, 가이드 RNA를 Cas9 엔도뉴클레아제를 과발현하는 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 식물 내로 운반하고 전달하였다. 본 개시내용의 맥락에서, 가이드 RNA는 본원에 개시된 임의의 서열 및 식물 세포의 게놈을 편집하고 원하는 돌연변이체 식물을 얻기 위해 적용되는 WO2015/189693의 교시로부터 유래할 수 있다. 기술 개발의 빠른 속도는 식물계에서 광범위한 적용가능성을 갖는 매우 다양한 프로토콜을 생성시켰으며, 이들은 많은 최근의 과학적 검토 논문들(예를 들어, Plant Methods (2016) 12:8; 및 Front Plant Sci. (2016) 7:506)에서 목록으로 잘 나타나 있다. 구체적인 적용분야에 중점을 둔 CRISPR/Cas 시스템의 검토는 Biotechnology Advances (2015) 33, 1, 41-52에 기재되어 있다. 식물 게놈을 조작하기 위한 CRISPR/Cas 사용에 있어서의 보다 최근의 개발은 Acta Pharmaceutica Sinica B (2017) 7, 3, 292-302 및 Curr. Op. in Plant Biol. (2017) 36, 1-8에서 논의되고 있다. 식물에서 사용하기 위한 CRISPR/Cas9 플라스미드는 비-영리 플라스미드 저장소(addgene.org)인, "addgene"에 나열되어 있으며, CRISPR/Cas 플라스미드는 상업적으로 이용 가능하다.

본원에 기술된 돌연변이와 같은 하나 이상의 도입된 돌연변이는 당업자에게 공지된 방법 -예컨대 서던 블롯 분석, DNA 시퀀싱, PCR 분석, 또는 표현형 분석을 사용하여 식별되거나 선택될 수 있다. 유전자 발현에 영향을 주는 돌연변이 또는 암호화된 폴리펩타이드의 기능을 방해하는 돌연변이는 본 기술분야에 주지된 방법을 사용하여 결정될 수 있다.

본 개시에 따른 식물 또는 식물 세포는 기술된 돌연변이 및 선택적으로 하나 이상의 유전자에서 하나 이상의 추가 돌연변이의 임의의 조합을 포함한다. 예를 들어, 식물 또는 식물 세포는 단일 유전자에서의 단일 돌연변이; 단일 유전자에서의 다수 돌연변이; 2개 이상의 또는 3개 이상의 또는 4개 이상의 유전자에서의 단일 돌연변이; 또는 2개 이상의 또는 3개 이상의 또는 4개 이상의 유전자에서의 다수 돌연변이를 가질 수 있다. 하나의 이러한 돌연변이의 실시예들이 본원에 기재되어 있다.

한 구현예에서, 식물의 종자가 돌연변이되고 나서 1세대 돌연변이 식물로 성장한다. 그런 다음 1세대 식물은 자가-수분되고 1세대 식물의 종자는 2세대 식물로 성장하는데, 그런 다음 이는 그들의 좌위(loci)에서의 돌연변이-예컨대 본원에 기재된 돌연변이-를 위해 스크리닝된다. 돌연변이된 식물 재료는 돌연변이를 위해서 스크리닝될 수 있지만, 2세대 식물을 스크리닝하는 이점은 모든 체세포 돌연변이가 생식 돌연변이에 해당한다는 것이다. 당업자라면 이들에만 한정하는 것은 아니지만, 종자, 꽃가루, 식물 조직 또는 식물 세포를 포함하는, 다양한 식물 재료가 돌연변이체 식물을 형성하기 위해 돌연변이될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 그러나 돌연변이 유발된 식물 물질의 유형은 식물 폴리뉴클레오타이드가 돌연변이를 위해 스크리닝될 때 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 비-돌연변이된 식물이 수분되기 전에, 꽃가루가 돌연변이 유발을 거친 경우, 이러한 수분으로부터 발생하는 종자는 1세대 식물로 재배한다. 1세대 식물의 모든 세포는 꽃가루에서 형성되는 돌연변이를 함유할 것이고; 따라서 이러한 1세대 식물은 2세대까지 기다리는 대신에 돌연변이를 위해 스크리닝될 것이다.

각각의 식물, 식물 세포 또는 식물 재료로부터 준비되는 폴리뉴클레오타이드는 돌연변이 유발된 식물 조직, 세포 또는 물질에서 기원하는 식물 집단에서 적어도 본원에 기재된 돌연변이를 위한 스크리닝을 신속히 처리하기 위하여 선택적으로 풀링(pooling)할 수 있다. 하나 이상의 식물, 식물 세포 또는 식물 물질의 후속 세대가 스크리닝될 수 있다. 선택적으로 풀링된 그룹의 크기는 사용되는 스크리닝 방법의 민감도에 따라 달라진다.

시료들이 선택적으로 풀링된 후에, 그들은 PCR과 같은 폴리뉴클레오타이드-특이적 증폭 기술을 거칠 수 있다. 유전자 또는 유전자에 바로 인접한 서열에 특이적인 임의의 하나 이상의 프라이머 또는 프로브는 선택적으로 풀링된 시료 내에 서열을 증폭시키는 데에 이용될 수 있다. 적합하게는, 하나 이상의 프라이머 또는 프로브는 유용한 돌연변이가 가장 발생하기 쉬운 좌위(locus)의 영역을 증폭시키도록 고안되어 있다. 가장 바람직하게는, 프라이머는 폴리뉴클레오타이드의 영역 내에서 돌연변이를 감지하도록 고안되어 있다. 추가적으로, 점 돌연변이를 위한 스크리닝을 쉽게 하기 위해서, 프라이머(들) 및 프로브(들)가 공지의 다형성 자리를 피하는 것이 바람직하다. 증폭 산물의 검출을 용이하게 하기 위해서, 하나 이상의 프라이머 또는 프로브는 임의의 종래의 표지 방법을 이용해서 표지될 수 있다. 프라이머(들) 또는 프로브(들)는 본 기술분야에서 잘 이해되고 있는 방법을 사용해서 본원에서 기술된 서열을 기초로 고안될 수 있다.

증폭 산물의 검출을 용이하게 하기 위해서, 프라이머(들) 또는 프로브(들)가 임의의 종래의 표지 방법을 사용해서 표지될 수도 있다. 이들은 본 기술분야에서 잘 이해되고 있는 방법을 사용해서 본원에서 기재되어 있는 서열을 기초로 해서 고안될 수 있다.

다형성은 본 기술분야에 공지된 방법에 의해서 식별될 수 있고 일부가 본 문헌에 기재되어 있다.

이에 따라, 추가적인 측면에서 본원에 기재된 돌연변이를 포함하는 식물을 제조하기 위한 방법이 제공되어 있다. 상기 방법은 기능성 니트레이트 환원효소 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 유전자를 포함하는 식물의 적어도 하나의 세포를 제공하는 단계를 포함한다. 다음에, 식물의 적어도 하나의 세포는 폴리뉴클레오타이드의 기능을 조절하기에 효율적인 조건 하에서 처리된다. 그런 다음 적어도 하나의 돌연변이체 식물 세포는 돌연변이체 식물로 번식되며, 여기서 돌연변이체 식물은 대조군 식물의 그것과 비교해서 조절된 수준의 니트레이트 환원효소 폴리펩타이드를 가진다. 한 구현예에서, 처리 단계는 적어도 하나의 세포를, 본원에 기재된 바와 같은 그리고 적어도 하나의 돌연변이체 식물 세포를 생성하기에 효과적인 조건 하에서 적어도 하나의 세포를 화학적 돌연변이 유발제로 거치게 하는 것을 포함한다. 이러한 방법의 또 다른 구현예에서, 처리 단계는 하나 이상의 돌연변이 식물 세포를 수득하기에 효과적인 조건 하에서 하나 이상의 세포를 방사선원을 거치게 하는 것을 포함한다. 용어 "돌연변이 식물"은, 적합하게는 유전자 조작 또는 유전자 변형 이외의 수단에 의해서, 대조군 식물과 비교할 때 유전자형이 변형되는 돌연변이 식물을 포함한다.

소정의 구현예들에서, 돌연변이 식물, 돌연변이 식물 세포 또는 돌연변이 식물 물질은 또 다른 식물, 식물 세포 또는 식물 물질에서 자연적으로 발생하였으며 원하는 형질을 부여하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 이러한 돌연변이는 특성을 부여할 다른 식물, 식물 세포 또는 식물 물질(예를 들어, 돌연변이가 유도되는 식물에 대한 상이한 유전적 배경을 가지는 식물, 식물 세포 또는 식물 물질)에 통합(예를 들어, 침투)될 수 있다. 따라서 실시예에 의해서, 첫번째 식물에 자연적으로 발생하는 돌연변이는 첫번째 식물에 대해 상이한 유전적 배경을 가지는 두번째 식물과 같은 두번째 식물에 도입될 수도 있다. 그러므로 숙련자는 원하는 형질을 부여하는 본원에 기술된 유전자의 하나 이상의 돌연변이체 대립유전자를 게놈에 천연적으로 보유하는 식물을 검색하고 식별할 수 있다. 천연적으로 발생하는 돌연변이체 대립유전자(들)는 육종, 역교배 및 유전자이입을 포함하는 다양한 방법에 의해서 제2 식물로 전달되어서, 본원에 기술된 유전자에서 하나 이상의 돌연변이를 가지는 계통, 돌연변이체 또는 혼성체를 생성할 수 있다. 동일한 기술이 또한 제1 식물로부터 제2 식물로의 하나 이상의 비-자연발생 돌연변이(들)의 유전자이입에 적용될 수 있다. 원하는 형질을 보여주는 식물은 돌연변이 식물의 푸울(pool)로부터 스크리닝될 수 있다. 적합하게는, 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드의 지식을 이용하여 선별이 수행된다. 결과적으로 대조군과 비교할 때 유전자 형질을 스크리닝할 수 있다. 이러한 스크리닝 접근은 본원에서 논의된 바와 같은 통상적인 증폭 및/또는 혼성화 기술의 적용을 포함할 수 있다. 이에, 본 개시내용의 추가 측면은 돌연변이 식물을 동정하기 위한 방법에 관한 것으로, (a) 식물로부터 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 시료를 제공하는 단계; 및 (b) 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정하는 단계를 포함하고 있고, 여기서 대조군 식물의 폴리뉴클레오타이드에 비해 상기 폴리뉴클레오타이드의 서열에서의 차이는 상기 식물이 돌연변이 식물인 것을 표시한다. 또 다른 측면에서, 대조군 식물에 비해 감소된 수준의 니트레이트를 축적하는 돌연변이체 식물을 동정하기 위한 방법이 제공되어 있으며, (a) 스크리닝될 식물로부터 시료를 제공하는 단계; (b) 상기 시료가 니트레이트 환원효소 폴리뉴클레오타이드에서 본원에 기재된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는지 결정하는 단계; 및 (c) 상기 식물의 니트레이트의 수준을 결정하는 단계를 포함하고 있다. 적절하게는, 니트레이트의 수준은 경화된 잎에서 결정된다. 또 다른 측면에서, 대조군 식물에 비해 감소된 수준의 니트레이트를 갖는 돌연변이체 식물을 제조하기 위한 방법이 제공되어 있으며, (a) 제1 식물로부터 시료를 제공하는 단계; (b) 상기 시료가 니트레이트의 감소된 수준을 초래하는 니트레이트 환원효소 폴리뉴클레오타이드에서 본원에 기재된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는지 결정하는 단계; 및 (c) 상기 하나 이상의 돌연변이를 제2 식물로 전달하는 단계를 포함하고 있다. 적절하게는, 니트레이트의 수준은 경화된 잎에서 결정된다. 돌연변이(들)는 당업계에 알려진 다양한 방법 - 예컨대, 유전 공학, 유전자 조작, 유전자이입, 식물 육종, 역교배 등을 사용해 제2 식물 내로 전달될 수 있다. 한 구현예에서, 제1 식물은 자연발생 식물이다. 한 구현예에서, 제2 식물은 제1 식물에 대해 상이한 유전적 배경을 가진다. 또 다른 측면에서, 대조군 식물에 비해 감소된 수준의 니트레이트를 갖는 돌연변이체 식물을 제조하기 위한 방법이 제공되어 있으며, (a) 제1 식물로부터 시료를 제공하는 단계; (b) 상기 시료가 니트레이트의 감소된 수준을 초래하는 니트레이트 환원효소 폴리뉴클레오타이드에서 본원에 기재된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는지 결정하는 단계; 및 (c) 상기 하나 이상의 돌연변이를 상기 제1 식물로부터 제2 식물로 유전자이입하는 단계를 포함하고 있다. 적절하게는, 니트레이트의 수준은 경화된 잎에서 결정된다. 한 구현예에서, 유전자이입하는 단계는 선택적으로 역교배하는 등을 포함하는, 식물의 육종 단계를 포함한다. 한 구현예에서, 제1 식물은 자연발생 식물이다. 한 구현예에서, 제2 식물은 제1 식물에 대해 상이한 유전적 배경을 가진다. 한 구현예에서, 제1 식물은 재배종 또는 엘리트 재배종이 아니다. 한 구현예에서, 제2 식물은 재배종 또는 엘리트 재배종이다. 추가적인 측면은 본원에 기재된 방법에 의해서 얻어지거나 또는 얻을 수 있는 (재배종 또는 엘리트 재배종 돌연변이 식물을 포함하는) 돌연변이 식물에 관한 것이다. 소정의 구현예들에서, "돌연변이 식물"은 본원에 기재된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드(들)의 서열 내에서와 같은, 식물의 특정한 영역에만 국소화되는 하나 이상의 돌연변이를 가질 수도 있다. 이와 같은 구현예에 따르면, 돌연변이 식물의 남은 게놈의 서열은 돌연변이 유발 전의 식물과 동일하거나 또는 실질적으로 동일할 것이다.

추가 측면에서, 니트레이트 환원효소 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 유전자에서 돌연변이를 포함하는 식물, 식물 세포 또는 식물 재료를 동정하기 위한 방법이 제공되어 있으며, (a) 식물, 식물 세포 또는 식물 재료가 돌연변이 유발을 거치게 하는 단계; (b) 상기 식물, 식물 세포 또는 식물 재료 또는 그의 자손으로부터 시료를 얻는 단계; 및 (c) 본원에 기재된 돌연변이를 보유하는 돌연변이된 폴리뉴클레오타이드 서열의 존재를 결정하는 단계를 포함하고 있다.

개시된 조성물 및 방법은 N. 루스티카(N. rustica) 및 N. 타바쿰(N. tabacum)(예를 들어, LA B21, LN KY171, TI 1406, Basma, Galpao, Perique, Beinhart 1000-1 및 Petico)을 포함해서, 니코티아나(Nicotiana) 속의 임의의 종에 적용될 수 있다. 다른 종은 N. acaulis, N. acuminata, N. africana, N. alata, N. ameghinoi, N. amplexicaulis, N. arentsii, N. attenuata, N. azambujae, N. benavidesii, N. benthamiana, N. bigelovii, N. bonariensis, N. cavicola, N. clevelandii, N. cordifolia, N. corymbosa, N. debneyi, N. excelsior, N. forgetiana, N. fragrans, N. glauca, N. glutinosa, N. goodspeedii, N. gossei, N. hybrid, N. ingulba, N. kawakamii, N. knightiana, N. langsdorffii, N. linearis, N. longiflora, N. maritima, N. megalosiphon, N. miersii, N. noctiflora, N. nudicaulis, N. obtusifolia, N. occidentalis, N. occidentalis subsp. hesperis, N. otophora, N. paniculata, N. pauciflora, N. petunioides, N. plumbaginifolia, N. quadrivalvis, N. raimondii, N. repanda, N. rosulata, N. rosulata subsp. ingulba, N. rotundifolia, N. setchellii, N. simulans, N. solanifolia, N. spegazzinii, N. stocktonii, N. suaveolens, N. sylvestris, N. thyrsiflora, N. tomentosa, N. tomentosiformis, N. trigonophylla, N. umbratica, N. undulata, N. velutina, N. wigandioides, 및 N. x sanderae을 포함하고 있다.

한 구현예에서, 상기 식물은 N. 타바쿰(N. tabacum)이다.

또한 담배 재배품종 및 엘리트(elite) 담배 재배품종의 용도도 본원에서 고려된다. 따라서 식물은 하나 이상의 유전자 돌연변이를 포함하는, 담배 품종 또는 엘리트 담배 재배종일 수 있다. 개별 담배 품종 또는 담배 재배종(예를 들어, 엘리트 담배 재배종)에서 이 돌연변이가 천연적으로 발생하지 않는다는 가정 하에, 유전자 돌연변이(들)(예를 들어, 하나 이상의 다형성)는 각각의 담배 품종 또는 담배 재배종(예를 들어, 엘리트 담배 재배종)에서 천연적으로 존재하지 않는 돌연변이일 수 있거나 또는 자연발생 유전자 돌연변이(들)일 수 있다.

니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 품종은 버얼리종, 다크종(dark type), 열건형, 및 오리엔탈형 담배를 포함한다. 품종 또는 재배종의 비-제한적인 예로는 다음과 같다: AA37, BD 64, CC 101, CC 200, CC 27, CC 301, CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 800, CC 900, Coker 176, Coker 319, Coker 371 Gold, Coker 48, CD 263, DF911, DT 538 LC Galpao tobacco, GL 26H, GL 350, GL 600, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, HB 04P LC, HB3307PLC, Hybrid 403LC, Hybrid 404LC, Hybrid 501 LC, K 149, K 326, K 346, K 358, K394, K 399, K 730, KDH 959, KT 200, KT204LC, KY10, KY14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, KY907LC, KY14xL8 LC, Little Crittenden, McNair 373, McNair 944, msKY 14xL8, Narrow Leaf Madole, Narrow Leaf Madole LC, NBH 98, N-126, N-777LC, N-7371LC, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC7, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, NC 2002, Neal Smith Madole, OXFORD 207, PD 7302 LC, PD 7309 LC, PD 7312 LC, 'Perique' tobacco, PVH03, PVH09, PVH19, PVH50, PVH51, R 610, R 630, R 7-11, R 7-12, RG 17, RG 81, RG H51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, Speight 168, Speight 172, Speight 179, Speight 210, Speight 220, Speight 225, Speight 227, Speight 234, Speight G-28, Speight G-70, Speight H-6, Speight H20, Speight NF3, TI 1406, TI 1269, TN 86, TN86LC, TN 90, TN 97, TN97LC, TN D94, TN D950, TR (Tom Rosson) Madole, VA 309, VA359, AA 37-1, B13P, Xanthi (Mitchell-Mor), Bel-W3, 79-615, Samsun Holmes NN, KTRDC number 2 Hybrid 49, Burley 21, KY8959, KY9, MD 609, PG01, PG04, PO1, PO2, PO3, RG11, RG 8, VA509, AS44, Banket A1, Basma Drama B84/31, Basma I Zichna ZP4/B, Basma Xanthi BX 2A, Batek, Besuki Jember, C104, Coker 347, Criollo Misionero, Delcrest, Djebel 81, DVH 405, Galpγo Comum, HB04P, Hicks Broadleaf, Kabakulak Elassona, Kutsage E1, LA BU 21, NC 2326, NC 297, PVH 2110, Red Russian, Samsun, Saplak, Simmaba, Talgar 28, Wislica, Yayaldag, Prilep HC-72, Prilep P23, Prilep PB 156/1, Prilep P12-2/1, Yaka JK-48, Yaka JB 125/3, TI-1068, KDH-960, TI-1070, TW136, Basma, TKF 4028, L8, TKF 2002, GR141, Basma xanthi, GR149, GR153, Petit Havana. 본원에서 특정하게 식별되지 않는다고 하더라도 상기한 것들의 로우 컨버터 아변종도 또한 고려된다.

한 구현예에서, 상기 재배종은 일반적으로 남아메리카 다크 담배와 아메리칸 버얼리종 생식질 사이의 교배체인 것으로 이해되는 AA37이다.

구현예들은 또한 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드(들)(또는 본원에 기술된 그의 임의의 조합)의 발현 또는 기능을 조절하기 위해서 변형된 식물을 생산하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 유리하게는, 얻어진 식물은 대조군 식물에 대한 전반적인 외관과 유사하거나 또는 실질적으로 동일할 수 있다. 성숙도, 식물 당 잎의 수, 줄기 높이, 잎 삽입각, 잎 크기(폭 및 길이), 마디 거리, 및 잎몸-주맥 비율과 같은 다양한 표현형 특성은 경지 관찰에 의해서 평가될 수 있다.

일 측면은 본원에 기술된 식물의 종자에 관한 것이다. 바람직하게는, 종자는 담배 종자이다. 추가 측면은 본원에 기재되어 있는 식물의 꽃가루 또는 밑씨에 관련된다. 또한, 웅성 불임성을 부여하는 폴리뉴클레오타이드를 더 포함하는, 본원에 기술된 식물이 제공된다.

본원에 기술된 식물의 재생가능한 세포의 조직 배양물이 또한 제공되며, 배양은 부모의 모든 형태학적 및 생리학적 특성을 발현할 수 있는 식물을 재생가능하다. 재생가능한 세포는, 잎, 꽃가루, 배아, 자엽, 배축, 뿌리, 뿌리 끝, 꽃밥, 꽃 및 그의 일부, 밑씨, 순, 자루, 줄기, 중과피 및 포자낭 또는 그로부터 유래되는 캘러스 또는 원형질체를 포함한다.

한 가지 목적은 식물 재료, 예를 들어, 경화된 잎에서, 조절된 수준의 니트레이트를 보여주는 식물 또는 이의 일부를 제공하는 것이다. 적절하게는, 식물 또는 이의 일부는 대조군 식물과 비교하여 조절된 수준의 니트레이트를 나타낸다.

적절하게는, 식물 또는 이의 일부는 대조군 식물과 실질적으로 동일한 총 수확 바이오매스(식물당 생잎 바이오매스로 표시됨)를 갖는다.

적절하게는, 식물 또는 이의 일부는 대조군 식물과 실질적으로 동일한 수준의 니코틴 잎 함량을 갖는다.

적절하게는, 식물 또는 이의 일부는 대조군 식물과 실질적으로 동일한 수준의 총 알칼로이드 잎 함량을 갖는다.

적절하게는, 식물 또는 이의 일부는 대조군 식물과 실질적으로 동일한 수준의 암모니아 잎 함량을 갖는다.

적절하게는, 식물 또는 이의 일부는 대조군 식물과 실질적으로 동일한 수준의 환원당 잎 함량을 갖는다.

따라서, 대조군 세포 또는 대조군 식물에 비해 조절된 수준의 니트레이트를 갖는 식물 또는 이의 일부 또는 식물 세포가 본원에 기재되어 있다. 식물 또는 식물 세포는 본원에 기재된 대응하는 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상의 발현을 조절하여 본원에 기재된 폴리펩타이드 중 하나 이상의 합성 또는 기능을 조절하도록 변형되었다. 적절하게는, 조절된 수준의 니트레이트는 경화된 잎에서 관찰된다. 소정의 구현예들에서, 경화된 잎 또는 경화된 담배와 같은 식물 속의 니트레이트 수준은 감소된다.

또 다른 측면은, 돌연변이, 식물 또는 세포에 관한 것이며, 본원에 기재된 하나 이상의 폴리펩타이드의 발현 또는 기능이 조절되고, 식물의 부분(예를 들어, 경화된 잎 또는 경화된 담배)은 상기 폴리펩타이드(들)의 발현 또는 기능이 조절되지 않은 대조군 식물에 비해 그 안에 적어도 약 37%의 니트레이트의 수준이 감소된다. 소정의 구현예에서, 식물 -예컨대 경화된 잎 또는 경화된 담배- 내의 니트레이트의 수준은 예를 들어, 적어도 약 30% 이상, 또는 약 35% 이상, 또는 약 37% 이상, 또는 약 40% 이상만큼 감소될 수 있다.

또 다른 측면은, 본원에 기재된 바와 같은 식물 또는 식물 세포로부터 유도되거나 유도가능한 -경화된 잎 또는 경화된 담배와 같은- 경화된 식물 재료에 관한 것이며, 여기서 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상의 발현 또는 그에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 기능이 조절되고, 니트레이트의 수준은 대조군 식물에 비해 적어도 약 37% 만큼, 예를 들어, 적어도 약 30% 이상, 또는 약 35% 이상, 또는 약 40% 이상만큼 조절된다.

또한, 구현예들은, 조절된 니트레이트 함량을 갖는 식물 또는 식물 성분(예를 들어, 잎 -예컨대, 경화된 잎- 또는 담배) 또는 식물 세포를 초래할 수 있는 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 중 하나 이상의 발현 또는 기능을 조절하기 위해 변형된 식물 또는 식물 세포를 생산하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

대조군과 비교하여 기능 또는 활성의 증가는 약 5% 내지 약 100%, 또는 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 100% 또는 그 이상의 증가 - 예컨대, 200%, 300%, 500%, 1000% 또는 그 이상일 수 있다.

대조군과 비교하여 기능 또는 활성의 감소는 약 5% 내지 약 100%, 또는 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 100%의 감소일 수 있다.

니트레이트 환원효소 폴리뉴클레오타이드 내의 본원에 기재된 돌연변이를 보유하는 식물은 유용한 계통, 변이체 및 혼성체를 생성하기 위하여 식물 육종 프로그램에 사용될 수 있다. 특히, 돌연변이체는 상술한 상업적으로 중요한 변이체로 침투(introgress)될 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 식물을 상이한 유전자 동일성을 포함하는 식물과 교배하는 단계를 포함하는 식물 육종 방법이 제공된다. 방법은 추가로 바람직한 유전적 형질 또는 유전적 배경을 가지는 자손이 얻어질 때까지 후손 식물을 다른 식물과 교배시키는 단계 및 선택적으로 반복 교배하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 육종 방법에 의해 작용하는 한가지 목적은 바람직한 유전적 형질을 특히 상업적으로 관심이 있는 다른 품종, 육종 계통, 혼성체 또는 재배종에 도입시키기 위한 것이다. 또 다른 목적은 단일 식물 품종, 계통, 혼성체 또는 재배종에서의 상이한 유전자의 유전자 변형의 적층(stacking)을 용이하게 하기 위한 것이다. 종내 교배뿐만 아니라 종간의 교배가 고려된다. 이러한 교배로부터 발생하는 후손 식물은 또한 육종 계통으로도 지칭되며, 이 개시의 식물의 예이다.

한 구현예에서, (a) 후손 담배 종자를 얻기 위해서 본 개시의 식물을 제2 식물과 교배시키는 단계; (b) 비-자연발생 식물을 얻기 위해서 식물 생장 조건 하에서, 후손 담배 종자를 생장시키는 단계를 포함하는, 식물을 생산하기 위한 방법이 제공되어 있다. 상기 방법은 (c) 후손 담배 종자를 얻기 위해서 비-자연발생 식물의 이전 세대를 그 자체 또는 또 다른 식물과 교배시키는 단계; (d) 추가적인 비-자연발생 식물을 얻기 위해서 식물 생장 조건 하에서 단계 (c)의 후손 담배 종자를 생장시키는 단계; 및 (e) 비-자연발생 식물의 추가 세대를 발생시키기 위해서 (c)와 (d)의 교배 및 생장 단계를 여러번 반복시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 방법은 선택적으로 단계 (a) 이전에, 특이적이고 본 개시의 식물과 동일하지 않은 유전적 동일성을 포함하는 부모 식물을 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 육종 프로그램에 따라서, 비-자연발생 식물의 세대를 생성하기 위해 교배 및 재배 단계를 0회 내지 2회, 0회 내지 3회, 0회 내지 4회, 0회 내지 5회, 0회 내지 6회, 0회 내지 7회, 0회 내지 8회, 0회 내지 9회, 또는 0회 내지 10회 반복한다. 역교배는 부모 중 하나와 가까운 유전적 동일성을 가지는 다음 세대에서의 후손 식물을 얻기 위해, 후손이 그의 부모 또는 그의 부모와 유전적으로 동일한 또 다른 식물과 교배되는 방법의 예시이다. 식물 육종, 특히 식물 육종을 위한 기술은 주지되어 있고 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 소정의 구현예들은 식물을 선별하는 단계를 배제한다.

본 기재에 따라, 육종 프로그램에서, 성공적인 교배는 수정된 F1 식물을 생산한다. 선택된 F1 식물은 부모 중 하나와 교배될 수 있고, 첫번째 역교배 세대 식물은 변이체 유전자 발현(예를 들어, 유전자의 null 버전)을 위한 재검증된 개체군을 생산하기 위해서 자가수분된다. 역교배, 자가수분 및 스크리닝의 과정은 예를 들어, 마지막 스크리닝이 반복친에 생식력이 있고, 합리적으로 유사한 식물을 생산할 때까지 적어도 4번 반복된다. 요망되는 경우, 식물은 자가수분되고 자손은 변이체 유전자 발현을 나타내는 식물을 확인하기 위해서 그 이후에 다시 스크리닝된다. 일부 구현예에서, F2 세대의 식물 개체군은 변이체 유전자 발현을 위해 스크리닝되고, 예를 들어, 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드(들)(또는 본원에 기술된 그의 임의의 조합)에 대한 폴리뉴클레오타이드 서열 정보를 기초로 하여 프라이머를 가지는 PCR 방법을 사용해서, 표준 방법에 따라서 유전자의 부재로 인해, 예를 들면, 식물은 폴리펩타이드를 발현하는 것이 실패하는 것으로 확인된다.

본원에 기재된 돌연변이 외에, 본원에 기재된 식물 또는 식물 세포는 본원에 기재된 것과 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드에서 또는 게놈 내의 하나 이상의 다른 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드에서 하나 이상의 추가 돌연변이를 가질 수 있다.

제한 없이, 본원에 기재된 식물 또는 그 일부는 본 개시내용에 따라서 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드의 발현, 기능 또는 활성이 조절되기 전후에 변형될 수 있다.

다음의 추가 유전적 변형(예를 들어, 돌연변이) 중 하나 이상이 식물 또는 이의 일부에 존재할 수 있다.

질소 대사 중간체의 변환에 관여하는 하나 이상의 유전자는 조절되어(예를 들어, 돌연변이되어) 적어도 하나의 담배 특이 니트로사민(TSNA)의 수준을 더 낮출 수 있다. 이러한 유전자의 비제한적인 예는 니코틴 탈메틸효소 - 예컨대 WO2006/091194, WO2008/070274, WO2009/064771 및 WO2011/088180에 기재된 CYP82E4, CYP82E5 및 CYP82E10 - 및 WO2016046288에 기재된 니트레이트 환원효소를 암호화하는 것들을 포함한다.

중금속 흡수 또는 중금속 수송에 관여하는 하나 이상의 유전자가 조절되어 중금속 함량을 더 낮출 수 있다. 비-제한적인 예로는 다중약물 내성 연관 폴리펩타이드 계열, 양이온 확산 촉진자(CDF) 계열, Zrt- Irt-유사 폴리펩타이드(ZIP) 계열, 양이온 교환체(CAX) 계열, 구리 운반자(CORT) 계열, 중금속 ATPase 계열 (예를 들어, WO2009/074325 및 WO2017/129739에 기재된 HMAs) 계열, 자연적 저항성 관련 대식세포 폴리펩타이드(NRAMP)의 동족체의 계열, 및 카드뮴 같은 중금속의 수송에 참여하는, WO2012/028309에 기재된, ATP-결합 카세트(ABC) 수송체 계열의 다른 일원(예를 들어, MRP) 내의 유전자를 포함한다.

다른 예시적인 변형(예를 들어, 돌연변이)은 향미 프로파일을 변경시키는데 사용될 수 있는 수크로오스 에스테르 조성물의 변화를 야기하는 이소프로필말레이트 신타아제(isopropylmalate synthase)의 조절된 발현 또는 기능을 갖는 식물을 초래할 수 있다 (WO2013029799 참조).

다른 예시적인 변형(예를 들어, 돌연변이)은 메티오날의 수준이 조절될 수 있는 트레오닌 신타아제(threonine synthase)의 조절된 발현 또는 기능을 갖는 식물을 초래할 수 있다 (WO2013029800 참조).

다른 예시적인 변형(예를 들어, 돌연변이)은 베타-다마스세논 함량을 조절하여 향미 프로파일을 변경하기 위해 네옥산신 신타아제(neoxanthin synthase), 리코펜 베타 사이클리아제(lycopene beta cyclase) 및 9-시스-에폭시카로티노이드 디옥시게나제(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase) 중 하나 이상의 조절된 발현 또는 기능을 갖는 식물을 초래할 수 있다 (WO2013064499 참조).

다른 예시적인 변형(예를 들어, 돌연변이)은 그 안에 니트레이트 수준을 조절하기 위해 염화물 채널들 중 CLC 계열의 일원들의 조절된 발현 또는 기능을 갖는 식물을 초래할 수 있다 (WO2014096283 및 WO2015197727 참조).

다른 예시적인 변형(예를 들어, 돌연변이)은 잎에서의 아스파라긴의 수준을 조절하기 위한 하나 이상의 아스파라긴 합성효소의 조절된 발현 또는 기능 및 잎을 가열하거나 연소할 때 생산된 에어로졸에서의 조절된 아크릴아미드 수준을 갖는 식물을 초래할 수 있다 (WO2017042162 참조). 　

다른 변형(예를 들어, 돌연변이)의 예는 제초제 내성을 조절하는 단계를 포함하며, 예를 들면, 글리포세이트는 많은 광범위한 스펙트럼의 제초제의 활성 성분이다.

또 다른 예시적인 변형(예를 들어, 돌연변이)에 의하여 곤충에 저항성인 식물이 생성된다. 바실러스 튜링겐시스(Bacillus thuringiensis) (Bt) 독소는, 피라미드식 cry1Ac 및 cry1C Bt 유전자가 각각 단일 폴리펩타이드에 저항성 있는 배추좀나방을 조절하여 저항성 곤충의 진화를 명백히 지연시키는 브로콜리에서 최근에 기술된 바와 같이, Bt 저항성 해충의 출현을 지연시키는 효과적인 방법을 제공할 수 있다.

또 다른 예시적인 변형은 병원체(예를 들어, 바이러스, 세균, 곰팡이)로 인한 질병에 저항성인 식물이 생성된다. Xa21 유전자(세균성 마름병에 저항성)를 발현하는 식물과 Bt 융합 유전자 및 키티나제 유전자(노란 줄기 나무좀에 저항성 및 다발에 내성) 둘 모두를 발현하는 식물이 조작된 바 있다.

또 다른 예시적인 변형(예를 들어, 돌연변이)은 웅성 불임성과 같은 변경된 생식 능력을 초래한다.

또 다른 예시적인 변형(예를 들어, 돌연변이)은 비생물적 스트레스(예를 들어, 가뭄, 온도, 염도)에 내성이 있는 식물을 초래한다.

또 다른 예시적인 변형(예를 들어, 돌연변이)은 N-아세틸글루코사미닐전이효소, β(1,2)-자일로실전이효소 및 α(1,3)-푸코실-전이효소와 같은, 하나 이상의 글리코실전이효소의 활성이 조절되는 식물을 야기한다 (WO/2011/117249 참조).

또 다른 예시적인 변형(예를 들어, 돌연변이)은 경화 동안 형성되는 노르니코틴과 노르니코틴 대사산물의 수준이 조절될 수 있도록, 하나 이상의 니코틴 N-탈메틸효소의 활성이 조절되는 식물을 야기한다 (WO2015169927 참조).

다른 예시적인 변형(예를 들어, 돌연변이)은 저장 폴리펩타이드와 오일이 개선된 식물, 광합성 효율이 향상된 식물, 저장수명이 늘어난 식물, 탄수화물 함량이 향상된 식물, 및 균류에 저항성인 식물을 야기할 수 있다.

니코틴 합성 경로에 관여하는 하나 이상의 유전자가 조절(예를 들어, 돌연변이)되어서, 경화될 때, 조절된 니코틴 수준을 생산하는 식물 또는 식물의 일부를 야기할 수 있다. 니코틴 합성 유전자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다: A622, BBLa, BBLb, JRE5L1, JRE5L2, MATE1, MATE 2, MPO1, MPO2, MYC2a, MYC2b, NBB1, nic1, nic2, NUP1, NUP2, PMT1, PMT2, PMT3, PMT4 및 QPT 또는 그의 하나 이상의 조합.

하나 이상의 알칼로이드의 양을 제어하는 데 관여하는 하나 이상의 유전자가 조절되어서, 알칼로이드의 조절된 수준을 생산하는 식물 또는 식물의 일부를 야기할 수 있다. 알칼로이드 수준 제어 유전자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다; BBLa, BBLb, JRE5L1, JRE5L2, MATE1, MATE 2, MYC2a, MYC2b, nic1, nic2, NUP1 및 NUP2 또는 이들의 둘 이상의 조합.

본원에 기재된 식물들의 일부, 특히 그러한 식물들의 잎몸(leaf lamina) 및 주맥(midrib)이 에어로졸 형성 물질, 에어로졸 형성 장치, 흡연 물품, 흡연가능한 물품, 무연(smokeless) 제품, 의료용 또는 화장용 제품, 정맥 주사 제제, 정제, 분말 및 담배 제품을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 소비성 제품의 제조에 도입되거나 사용될 수 있다. 에어로졸 형성 물질의 예는 담배 조성물, 담배, 담배 추출물, 대담배(cut tobacco), 각초(cut filler), 경화된 담배, 팽화 담배(expanded tobacco), 균질화된 담배, 재구성 담배, 및 파이프 담배를 포함한다. 흡연 물품 및 흡연가능한 물품은 에어로졸 형성 장치의 유형이다. 흡연 물품 또는 흡연가능한 물품의 예는 궐련(cigarette), 엽궐련(cigarillos), 및 시가(cigar)를 포함한다. 무연 제품의 예는 씹는 담배류 및 코담배류를 포함한다. 소정의 에어로졸 형성 장치에서, 연소 대신에, 담배 조성물 또는 다른 에어로졸 형성 물질이 하나 이상의 전기 가열 요소에 의해 가열되어 에어로졸을 생성한다. 또 다른 유형의 가열식 에어로졸 형성 장치에서, 가연성 연료 요소 또는 열원으로부터 열원의 내부, 그 주위 또는 그 하류에 위치될 수 있는, 물리적으로 분리된 에어로졸 형성 물질로의 열 전달에 의해 에어로졸이 생성된다. 무연 담배 제품 및 다양한 담배-함유 에어로졸 형성 물질들은 건조 입자, 세절, 과립, 분말 또는 슬러리의, 다른 물질 상에 증착된, 다른 물질과 혼합된, 다른 물질에 둘러싸인 또는 박편, 필름, 탭, 거품, 또는 구슬과 같은 모든 형상의 다른 물질들과 결합된 담배를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 '연기'는 흡연 물품, 예컨대 궐련에 의해서, 또는 에어로졸 형성 물질을 연소시켜 생성되는 에어로졸의 유형을 설명하는 데 사용된다.

한 구현예에서, 본원에 기술된 식물들로부터 경화된 식물 재료가 또한 제공되어 있다. 녹색 담뱃잎들을 경화시키는 공정은 음건(air-curing), 화건(fire-curing), 열건(flue-curing) 및 양건(sun-curing)을 비제한적으로 포함하는 당업자에게 공지된 기술이다.

또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 담배 식물로부터 식물 재료 -예컨대 잎, 바람직하게는 경화된 잎-을 포함하는 담배-함유 에어로졸 형성 물질을 포함하는 담배 제품이 기술되어 있다. 본원에 기술된 담배 제품은 변형되지 않은 담배를 추가로 포함할 수 있는 혼합 담배 제품일 수 있다.

작물 관리 및 농업용 제품 및 방법

식물은 예를 들어 농업에서 다른 용도를 가질 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 식물들은 동물 사료 또는 인간 음식 제품을 만들기 위해 사용될 수 있다.

본 개시는 또한 본원에 기재된 식물을 재배하고, 재배된 식물들로부터 종자를 채취하는 단계를 포함하는 종자의 생산 방법들을 제공한다. 본원에 기술된 식물의 종자는 본 기술분야에 공지된 수단들에 의하여 조절되고 포장 물질에 포장되어 제조품을 형성할 수 있다. 종이 및 천과 같은 포장 물질들은 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 종자의 포장은 라벨, 예를 들어, 내부의 종자의 유형을 기재한 포장 물질에 고정된 태그 또는 라벨, 포장 위에 프린트된 라벨을 가질 수 있다.

동정, 선발, 또는 교배를 위한 식물의 유전자형 검사(genotyping)를 위한 조성물, 방법 및 키트는 폴리뉴클레오타이드 샘플 내 폴리뉴클레오타이드(또는 본원에 기재된 그의 임의의 조합)의 존재를 검출하는 수단을 포함할 수 있다. 따라서, 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오타이드들의 적어도 일부를 특이적으로 증폭하기 위한 하나 이상의 프라이머들과 선택적으로 하나 이상의 프로브들 및 선택적으로 증폭 또는 검출을 수행하기 위한 하나 이상의 시약을 포함하는 조성물이 기재되어 있다.

따라서, 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드(들)에 대응하는 약 10 이상의 인접 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유전자 특이적 올리고뉴클레오타이드 프라이머들 또는 프로브들이 개시되어 있다. 상기 프라이머들 또는 프로브들은 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드(들)에 혼성화(예를 들어, 특이적으로 혼성화)하는 약 15, 20, 25, 30, 40, 45 또는 50 이상의 인접 뉴클레오타이드들을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다.

일부 구현예들에서, 프라이머들 또는 프로브들은 유전자 동정(예를 들어, 서던(Southern) 혼성화) 또는 단리(예를 들어, 세균 콜로니 또는 박테리오파지 플라크들의 원위치 혼성화) 또는 유전자 검출(예를 들어, 증폭 또는 검출에서의 하나 이상의 증폭 프라이머들로서)의 서열-의존성 방법들에 사용될 수 있는 약 10 내지 50 인접 뉴클레오타이드들, 약 10 내지 40 인접 뉴클레오타이드들, 약 10 내지 30 인접 뉴클레오타이드들 또는 약 15 내지 30 인접 뉴클레오타이드들을 포함할 수 있다. 하나 이상의 특이적 프라이머들 또는 프로브들은 폴리뉴클레오타이드(들)의 일부 또는 전체를 증폭하거나 검출하기 위하여 디자인되고 사용될 수 있다. 특정한 예로서, 2개의 프라이머를 PCR 프로토콜에 사용하여 폴리뉴클레오타이드 단편을 증폭시킬 수 있다. PCR은 또한 폴리뉴클레오타이드 서열에서 유래된 하나의 프라이머 및 폴리뉴클레오타이드 서열의 상류 또는 하류의 서열- 예를 들어 프로모터 서열, mRNA 전구체의 3' 말단 또는 벡터로부터 유래된 서열에 혼성화하는 제2 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 시험관 내(in vitro) 증폭에 유용한 열적 및 등온 검사법(thermal and isothermal technique)의 예는 본 기술분야에 주지되어 있다. 시료는 본원에 기재된 식물, 식물 세포 또는 식물 물질 또는 식물, 식물 세포 또는 식물 물질로부터 유래된 담배 제품 또는 이들로부터 유래된 것일 수 있다.

추가적인 측면에서, 또한 시료에서 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드(들)(또는 본원에 기재된 그의 임의의 조합)을 검출하는 방법이 제공되어 있으며, 상기 방법은 (a) 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 이를 포함하는 것으로 간주되는 시료를 제공하는 단계; (b) 폴리뉴클레오타이드(들)의 적어도 일부를 특이적으로 검출하기 위한 하나 이상의 프라이머들 또는 하나 이상의 프로브들과 상기 시료를 접촉시키는 단계; 및 (c) 증폭 산물의 존재를 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 산물의 존재는 시료 내의 폴리뉴클레오타이드(들)의 존재를 표시하는 것이다. 추가적인 측면에서, 폴리뉴클레오타이드(들)의 적어도 일부를 특이적으로 검출하기 위한 하나 이상의 프라이머들 또는 프로브들의 용도가 또한 제공되어 있다. 폴리뉴클레오타이드(들)의 적어도 일부를 특이적으로 검출하기 위한 하나 이상의 프라이머들 또는 프로브들을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드(들)의 적어도 일부를 검출하기 위한 키트가 또한 제공되어 있다. 키트는 폴리뉴클레오타이드 증폭-예를 들어 중합효소 연쇄반응-을 위한 시약 또는 프로브 혼성-검출 기술-예를 들어 서던 블롯, 노던 블롯, 원위치 혼성화, 또는 마이크로어레이를 위한 시약을 포함할 수 있다. 키트는 항체 결합-검출 기술, 예를 들어, 웨스턴 블롯, ELISA, SELDI 질량 분석기 또는 테스트 스트립을 위한 시약을 포함할 수 있다. 키트는 DNA 서열 분석을 위한 시약을 포함할 수 있다. 키트는 시약 및 키트를 사용하기 위한 지침을 포함할 수 있다.

일부 구현예들에서, 키트는 기술된 방법들 하나 이상을 위한 설명을 포함할 수 있다. 기술된 키트는 유전적 동일성 측정, 계통발생학적 연구, 유전자형 검사, 하플로타이핑(haplotyping), 계통 분석 또는 식물 교배에서 특히 공우성 스코어링(co-dominant scoring)과 함께 유용할 수 있다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 식물, 식물 세포 또는 식물 물질의 유전자형 검사 방법을 제공한다. 유전자형 검사는 염색체 쌍의 상동체들을 구분하는 수단을 제공하며 식물 개체들 내에서 분리 개체(segregant)들을 구분하는데 사용될 수 있다. 분자 마커 방법들은 계통발생학적 연구, 작물의 변이체들 간의 유전적 연관성 분석, 체세포 교잡종 또는 잡종(cross)의 판별, 단일 유전자 특질들에 영향을 미치는 염색체 분절들의 위치 판별, 맵(map)-기반 클로닝, 및 양적 유전 연구에 사용될 수 있다. 유전자형 분석의 구체적인 방법은 증폭산물 길이 다형성(AFLP)을 포함한 모든 분자 마커 분석 기술들이 사용될 수 있다. AFLP는 폴리뉴클레오타이드 다양성에 의해 유발되는 증폭 단편들 사이의 대립유전자 차이의 산물이다. 따라서, 본 개시내용은 AFLP 분석과 같은 기술들을 이용하여 하나 이상의 유전자들 또는 폴리뉴클레오타이드들의 분리(segregation) 및 이들 유전자들 또는 폴리뉴클레오타이드들과 유전적으로 연결된 염색체 서열들의 분리를 따르는 수단을 추가로 제공하고 있다.

본 발명은 발명을 더 상세히 설명하기 위하여 제공되는 하기 실시예에서 추가적으로 설명된다. 본 발명을 수행하기 위하여 현재 고려되는 바람직한 형태를 제공하는 이들 실시예는 본 발명을 제한하는 것이 아니라 예시하도록 의도된 것이다.

실시예

무작위 점 돌연변이를 가진 식물 집단을 생성하기 위해서, 니코티아나 타바쿰 AA37의 M0 종자를 상이한 농도와 노출 시간에 에틸-메탄술포네이트(EMS)로 처리한다. 사멸 곡선을 각각의 처리에 대해 M1 세대에서 치사율, 수정율 및 키메라증 비율과 함께 추정한다. M1 식물은 자가 수정해서, M2 군의 종자를 생성하고, 열성 대립 유전자가 동형 접합체로 복구될 수 있게 하고 치사 대립 유전자가 이형접합체로 복구될 수 있게 한다. EMS 돌연변이유발 집단의 각 계열마다 8개의 M2 식물로부터 유전체 DNA를 추출하고 돌연변이를 스크리닝하는 한편, M2 식물 재료와 M3 종자를 채취하고 및 향후 분석을 위해 보관한다. 돌연변이 변종을 식별하고 특징짓기 위해, M2 식물로부터의 유전체 DNA 샘플을 그룹으로 모으고 표적 유전자 단편의 서열결정에 의해 스크리닝한다. 표적 유전자 단편을 표 2에 보이는 담배 NIA2 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 증폭시킨다. 표적 유전자 내 돌연변이를 각각의 DNA 단편의 서열결정에 의해 검색한다. 담배 NIA2 돌연변이 M527I는 표 1에 기술되어 있다. 돌연변이체 식물은 이형접합성인 AA37 야생형 및 자가이식 F1과 교배된다. F2 분리 개체를 정량적 핵산 증폭 방법(TaqMan)에 의해 분석한다.

현장 실험에서, 3개의 NIA2 M527I 동형접합성 돌연변이 라인을 EMS 치료를 받지 않은 5개의 분리성 동형접합성 야생형 라인 및 1개의 AA37 대조군 라인에 대해 시험한다. 현장 설계는, 필드 불균질성으로 인한 위치 효과를 최소화하기 위해 무작위로 분포된 20개의 식물 플롯에서 식물을 표시하였다. 식물은 버얼리종 담배에 대한 스위스 표준 농산물 우수 관리 제도(GAP)에 따라 생장된다. 수확 시, 총 생잎 바이오매스를 측정한다. 잎 식물 바이오매스 측정은 수확 시 잎을 절단하고 그의 생중량을 기록함으로써 실행된다.

그런 다음, 제2 수확물(중간 줄기 위치)로부터의 잎을 공기 경화시키고, 표준 스칼라 방법을 통해 화학적 프로파일링용 시료를 분석한다.

결과는 도 2에 보고되었다. 돌연변이체 식물 계통 NtNIA2 M527I는 현장 시험에서, 분리성 야생형 대조군 식물과 비교하여 경화된 잎에서 니트레이트 수준의 37% 감소를 입증한다. 식물 총 수확 바이오매스(식물당 생잎 바이오매스로서 표시됨) 및 니코틴, 총 알칼로이드, 암모니아 및 환원당류 잎 함량에 대한 효과는 관찰되지 않는다.

본원에 인용되거나 기재된 임의의 간행물은 본 출원의 출원일에 앞서 개시된 관련 정보를 제공한다. 본원에서 언급된 것은, 본 발명자들이 이러한 개시문헌들을 선행할 권리가 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 상기 명세서에서 언급된 모든 공개문헌은 본원에 참조로 인용된다. 본 발명의 다양한 수정 및 변형은 본 발명의 범위 및 사상에서 벗어남이 없이 숙련자에게 명백할 것이다. 본 발명이 특정 바람직한 구현예와 관련하여 설명되었지만, 청구범위에 기재된 발명은 이러한 특정 구현예에 지나치게 한정되지 않아야 한다는 것을 이해해야 한다. 실제로, 세포, 분자 및 식물 생물학 또는 관련 분야의 당업자에게 명백한, 본 발명을 실시하기 위하여 기술된 모드들의 다양한 변형들이 이하의 청구범위 내에 있는 것으로 의도된다.

서열 목록

서열번호: 1 니트레이트 환원효소에 대한 니코티아나 타바쿰 NIA2 유전자의 야생형 폴리펩타이드 서열, 유전자은행 수탁 번호(GenBank Accession number) X14059. NtNIA2 아미노산 S523의 인산화를 담당하는 니트레이트 환원효소 키나아제의 결합을 위한 인식 부위로서 작용하는 서열은 굵은 글씨체로 강조되어 있고 밑줄이 그어져 있다.

MAASVENRQFSHLEAGLSRSFKPRSDSPVRGCNFPSPNSTNFQKKPNSTIYLDYSSSEDDDDDDEKNEYLQMIKKGNSELEPSVHDTRDEGTADNWIERNFSMIRLTGKHPFNSEPPLNRLMHHGFITPVPLHYVRNHGPVPKGTWDDWTVEVTGLVKRPMKFTMDQLVNEFPCRELPVTLVCAGNRRKEQNMVKQTIGFNWGAAAVSTTIWRGVPLRALLKRCGVFSKNKGALNVCFEGADVLPGGGGSKYGTSIKKEFAMDPARDIIVAYMQNGEKLAPDHGFPVRMIIPGFIGGRMVKWIKRIIVTTQESDSYYHFKDNRVLPPHVDAELANTEAWWYKPEYIINELNINSVITTPCHEEILPINAWTTQRPYTLRGYSYSGGGKKVTRVEVTLDGGETWQVSTLDHPEKPTKYGKYWCWCFWSLEVEVLDLLSAKEIAVRAWDETLNTQPEKLIWNVMGMMNNCWFRVKMNVCKPHKGEIGIVFEHPTQPGNQSGGWMAKERHLEISAEAPQT LKKSISTPFM NTASKMYSMSEVRKHSSADSAWIIVHGHIYDATRFLKDHPGGTDSILINAGTDCTEEFDAIHSDKAKKLLEDFRIGELITTGYTSDSPGNSVHGSSSFSSFLAPIKELVPAQRSVALIPREKIPCKLIDKQSISHDVRKFRFALPSEDQVLGLPVGKHIFLCAVIDDKLCMRAYTPTSTIDEVGYFELVVKIYFKGIHPKFPNGGQMSQYLDSMPLGSFLDVKGPLGHIEYQGKGNFLVHGKQKFAKKLAMIAGGTGITPVYQVMQAILKDPEDDTEMYVVYANRTEDDILLKEELDSWAEKIPERVKVWYVVQDSIKEGWKYSIGFITEAILREHIPEPSHTTLALACGPPPMIQFAVNPNLEKMGYDIKDSLLVF

서열번호: 2 니트레이트 환원효소에 대한 니코티아나 타바쿰 NIA2 유전자의 야생형 폴리뉴클레오타이드 서열, 유전자은행 수탁 번호(GenBank Accession number) X14059. NtNIA2 아미노산 S523의 인산화를 담당하는 니트레이트 환원효소 키나아제의 결합을 위한 인식 부위로서 작용하는 서열은 굵은 글씨체로 강조되어 있고 밑줄이 그어져 있다.

1 tacatacaag ggcgcgaata aacttttttt aaagtaaatg tatatgaact tgcaatgaaa

61 gaggacctta acttgtttgt ctttgttgct ttctgcaaat ttcaccttaa cagcccattt

121 gagattgatt tagttagtta taacaattag ttaaatgctt gtgtaatttg aagaaaatat

181 ttggacgtgc tcgctgaaaa cattatactc ctatataata gaaatacttt ctgaaaagtt

241 ggtcttgttc aaaaacgtat aagagagttg gtcttctcat aaatagtcac tagctttctg

301 attttttttc actttctata tcacgtaaat aggtactcaa atttgatatt tacaccaaac

361 aaatgaaaat aggatatgtg tttttcatac gtatatttat ctatcgtact taatgataca

421 tacatataca tataacctta ctttttgatt actaaaaatt taattatatt taatttgggt

481 aaatatcaga tgccacaaaa catttaccta gccactgttt ttgactacta aaaatttaat

541 tatgtttagc ttgggtaaat atcagatgtc actaaacatt ttacctagcc attcctccga

601 aaagaaattg agaaggaaat tagagttagt ggagccataa taatgtttaa tgtgaccata

661 actcggtgaa aaccacggca agaataagaa acagctgtta aggctaacca acagctgcat

721 atctttaagc catttgctat taccccaaca tcgcatcttc ctctgatccc gaccctacgg

781 gcgtaaaaag tgtaaatcgt tagaattgtt ttatttattt tatgatgtca ctatttttta

841 aaatcaaaat taaattgggg tgtcgatttt tttgggtcct gcttatgtat agtatggcgc

901 tatggaggca ctgagagagt ccgaaacgtt tctatataag gccaccccac gcattcacaa

961 acttcgttcc caaacagaac aagaaaatca aatctcggag agagagagag agaaatattt

1021 tgagagagaa atacagaaaa tctctcttcc ttctttcctt tttttttcaa tccccattca

1081 tattcttttt ttagaataat ctatggcggc atctgtcgaa aacaggcagt tcagtcacct

1141 agaagccggt ttatcccggt ctttcaagcc ccggtctgat tccccggttc gtggctgcaa

1201 cttcccttcg cccaacagta ctaatttcca aaagaaacca aattccacca tttaccttga

1261 ttactcgtcg agtgaagacg acgatgatga tgacgaaaaa aatgagtacc ttcaaatgat

1321 taaaaaaggg aattcagagt tagagccatc tgttcatgac actagggacg aaggtaccgc

1381 tgataattgg attgaacgca acttttccat gattcgtctc accggaaagc atccatttaa

1441 ctccgaacca ccgttgaacc ggctcatgca ccacggcttt atcacaccgg tcccacttca

1501 ttacgttcgt aaccatggac cggttcccaa gggcacgtgg gatgactgga ccgtggaagt

1561 cacgggacta gtgaagcgtc ctatgaaatt cacaatggac cagttggtta acgaattccc

1621 ttgtagagaa ttgcccgtta cgcttgtttg tgctggcaat cgaaggaaag aacagaacat

1681 ggttaaacaa accattggtt tcaactgggg cgccgctgcc gtttcaacaa cgatatggcg

1741 cggggtaccc ctccgcgctt tgctaaaacg gtgcggtgtt tttagcaaga ataaaggggc

1801 gcttaatgtt tgcttcgaag gagctgatgt gttgcccgga ggtggtggtt caaagtatgg

1861 aaccagcatt aagaaggaat ttgcaatgga tccagcacga gatatcatcg tagcctacat

1921 gcagaacgga gaaaaattgg cacccgacca cgggtttcca gtacgaatga taattccagg

1981 attcattgga ggaagaatgg tgaaatggat aaagaggatt atagtcacca cccaagaatc

2041 agacagctat tatcatttca aggacaatag agttcttcct ccccatgttg atgctgaact

2101 tgcaaatacc gaaggtacgt accgtaacta tttcaattta ttactccatt tgttccaatt

2161 tatgtgaacc tatttccttt ttggtccgtt caaaaaagaa tgaacccttt ctaaatttgg

2221 taacaattta gcttaaactt acaacttcac ccttaatgag aaacttttat aaccacacaa

2281 ataccctggg gcccatttgg acttgtttag gtcgacaaat tccaaaagtt ttattttttt

2341 cttaaacttc gtgctcagtc aaacaggttc acgtaaattg aaacggagag agtatcattt

2401 ttattaaggg gtataaatat attttaatta gttgagactt gcacatacaa gtaaaatatt

2461 tcttagaata caaaatcaac tgaaagctta cttctaatta tatggttttg aattttcctt

2521 tcaatgaagt aaataaaaag gaaacaatta tattcaacgc atgtaggtat atggtcctgt

2581 cattatctca aatcaaatgg tttaaagaca aaggactttg gaaacataga attgtcagct

2641 ttatagttat ggagtactat attagttagc tgtttgcatc tattcataat tggtctatct

2701 gtgtgcagca tggtggtaca agccagagta tatcatcaat gagcttaata ttaactctgt

2761 cattacgacg ccgtgtcatg aagaaatttt gccaattaac gcctggacga ctcagcgacc

2821 ttacacgttg aggggctatt cttattctgg ttagtatttt tatattttcc gattttgctg

2881 agaatatcat atttcttagt tttgtcgata catcgtatcc tctaactctg acgttttact

2941 tcgtccttat gcacccactt acgtccttac tttctcagac agtttattga tgaaaactac

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3061 tattctctcc cgtctatttt aattaatttt tggctgtttt tatacgtggg aatctatttt

3121 taacattaat taatatagaa atgaaccata ttaatattat taatttcttc attgaaaata

3181 caacaaatac tcttcggctc ttactacaat gacaattttg aagaaaaata attaattcct

3241 tcctaatatc tgaaaaatca aatattgtgg accataaaaa aaggtcaaaa aattaattaa

3301 aatgaactgg agagagtaaa ttagaaaata taattatagc actagtaatt aaagttatta

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3421 taatacttag aaagtgtcaa taattggtag acaatttaaa ctatatacta gttaaaaagt

3481 ctgtcaatac aactattagt attggggatt agagagaata gtagtaaaat ggagtaattg

3541 gacgcatgag cttgggcatg ctgattgctg tcagcttgtt tgctaatgtg aaaaagaaaa

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3721 taccaagtga atattaaatt caattgtcta aagcacggaa tctttttgac tactttagtt

3781 cctgcatctt gggttgcctc aacaacaccc tttattgaat tattatagta atgttcaata

3841 taatatacaa ttagaaaaca ctctaagtgg tcactttata tggatctagt caatactatt

3901 tcttctaaac aacgtgccta attacttccc actttccagt acatgaccac cattaagttt

3961 aatttttgtc aattccttgt gcaattggcc cttcaaatga gcagaagtgt tacgtaggaa

4021 aactaacttc agctactatt ataggagtaa acctgttagg aaaagatgct cgaggaactg

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5521 attgcactga ggaatttgat gcaattcatt ctgataaggc taagaagctc ttggaggatt

5581 tcaggattgg tgaactcata actactggtt acacctctga ctctcctggc aactccgtgc

5641 acggatcttc ttccttcagc agctttctag cacctattaa ggaacttgtt ccagcgcaga

5701 ggagtgtggc cctaattcca agagagaaaa tcccatgcaa actcatcgac aagcaatcca

5761 tctcccatga tgttaggaaa tttcgatttg cattgccctc tgaggatcaa gtcttgggct

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6001 ctatgccgtt agggtcattt ctcgacgtga aaggtccatt aggtcacatt gaataccaag

6061 gaaagggaaa tttcttagtt catggcaaac agaagtttgc caagaagttg gccatgatag

6121 caggtggaac aggaataact ccagtgtatc aagtcatgca ggcaattctg aaagatccag

6181 aagatgacac agaaatgtat gtggtgtatg ctaacagaac agaggatgat attttactta

6241 aggaagagct tgattcatgg gctgagaaaa ttccagagag ggttaaagtt tggtatgtgg

6301 ttcaggattc tattaaagaa ggatggaagt acagcattgg ttttattaca gaagccattt

6361 tgagagaaca tatccctgag ccatctcaca caacactggc tttggcttgt ggaccacctc

6421 ctatgattca atttgctgtt aatccaaact tggagaagat gggctatgac attaaggatt

6481 ccttattggt gttctaattt taaaaacaaa acaatatctg caggaataaa tttttttttt

6541 ccccctatca gttgtacata ttgtatttgg tttatcaccc ccatgtacta cgtagtgttt

6601 gtagttctta catttttatt ttttagaatt tttttaaacc ttaggatata aaggttttct

6661 cttccaacaa agtgattctt tagggaagaa atgtactgta ctgtactagt atgtctaagc

6721 cgaaagttgt aatgtttacc atgacaaatt gtattcaatt cctcatggaa tagtaacatt

6781 gtgttcatgt gtcttcctgt aagcgatctt caaaatatca atgtatatat atagtaattg

6841 caaaccattg ttccttttcc cgatgtagtt aactactctt tctttagctt ctagtctctg

6901 gtgaatattt ttttttctat aactctttaa ttaatacggc cttaaataag agaaaagttt

6961 aaaccacgaa tatcattatg cagacgtata ggtaattaat ctactttttg aaaaaaaatc

7021 tattttcttt atgtggtcct tcaaaataat attctagaac cttttgtata ttccctttta

7081 acttctattt agtttt

서열번호: 3 니트레이트 환원효소에 대한 니코티아나 타바쿰 NIA2 유전자의 돌연변이체 폴리펩타이드 서열. 니트레이트 환원효소 키나아제의 결합을 위한 인식 부위에서의 돌연변이된 폴리펩타이드는 굵은 글씨체로 강조되어 있고 밑줄이 그어져 있다.

MAASVENRQFSHLEAGLSRSFKPRSDSPVRGCNFPSPNSTNFQKKPNSTIYLDYSSSEDDDDDDEKNEYLQMIKKGNSELEPSVHDTRDEGTADNWIERNFSMIRLTGKHPFNSEPPLNRLMHHGFITPVPLHYVRNHGPVPKGTWDDWTVEVTGLVKRPMKFTMDQLVNEFPCRELPVTLVCAGNRRKEQNMVKQTIGFNWGAAAVSTTIWRGVPLRALLKRCGVFSKNKGALNVCFEGADVLPGGGGSKYGTSIKKEFAMDPARDIIVAYMQNGEKLAPDHGFPVRMIIPGFIGGRMVKWIKRIIVTTQESDSYYHFKDNRVLPPHVDAELANTEAWWYKPEYIINELNINSVITTPCHEEILPINAWTTQRPYTLRGYSYSGGGKKVTRVEVTLDGGETWQVSTLDHPEKPTKYGKYWCWCFWSLEVEVLDLLSAKEIAVRAWDETLNTQPEKLIWNVMGMMNNCWFRVKMNVCKPHKGEIGIVFEHPTQPGNQSGGWMAKERHLEISAEAPQTLKKSISTPF I NTASKMYSMSEVRKHSSADSAWIIVHGHIYDATRFLKDHPGGTDSILINAGTDCTEEFDAIHSDKAKKLLEDFRIGELITTGYTSDSPGNSVHGSSSFSSFLAPIKELVPAQRSVALIPREKIPCKLIDKQSISHDVRKFRFALPSEDQVLGLPVGKHIFLCAVIDDKLCMRAYTPTSTIDEVGYFELVVKIYFKGIHPKFPNGGQMSQYLDSMPLGSFLDVKGPLGHIEYQGKGNFLVHGKQKFAKKLAMIAGGTGITPVYQVMQAILKDPEDDTEMYVVYANRTEDDILLKEELDSWAEKIPERVKVWYVVQDSIKEGWKYSIGFITEAILREHIPEPSHTTLALACGPPPMIQFAVNPNLEKMGYDIKDSLLVF

서열번호: 4 니트레이트 환원효소에 대한 니코티아나 타바쿰 NIA2 유전자의 돌연변이체 폴리뉴클레오타이드 서열. NtNIA2 아미노산 S523의 인산화를 담당하는 니트레이트 환원효소 키나아제의 결합을 위한 인식 부위로서 작용하는 서열은 굵은 글씨체로 강조된다. 돌연변이에 대한 g는 밑줄이 그어져 있다.

1 tacatacaag ggcgcgaata aacttttttt aaagtaaatg tatatgaact tgcaatgaaa

61 gaggacctta acttgtttgt ctttgttgct ttctgcaaat ttcaccttaa cagcccattt

121 gagattgatt tagttagtta taacaattag ttaaatgctt gtgtaatttg aagaaaatat

181 ttggacgtgc tcgctgaaaa cattatactc ctatataata gaaatacttt ctgaaaagtt

241 ggtcttgttc aaaaacgtat aagagagttg gtcttctcat aaatagtcac tagctttctg

301 attttttttc actttctata tcacgtaaat aggtactcaa atttgatatt tacaccaaac

361 aaatgaaaat aggatatgtg tttttcatac gtatatttat ctatcgtact taatgataca

421 tacatataca tataacctta ctttttgatt actaaaaatt taattatatt taatttgggt

481 aaatatcaga tgccacaaaa catttaccta gccactgttt ttgactacta aaaatttaat

541 tatgtttagc ttgggtaaat atcagatgtc actaaacatt ttacctagcc attcctccga

601 aaagaaattg agaaggaaat tagagttagt ggagccataa taatgtttaa tgtgaccata

661 actcggtgaa aaccacggca agaataagaa acagctgtta aggctaacca acagctgcat

721 atctttaagc catttgctat taccccaaca tcgcatcttc ctctgatccc gaccctacgg

781 gcgtaaaaag tgtaaatcgt tagaattgtt ttatttattt tatgatgtca ctatttttta

841 aaatcaaaat taaattgggg tgtcgatttt tttgggtcct gcttatgtat agtatggcgc

901 tatggaggca ctgagagagt ccgaaacgtt tctatataag gccaccccac gcattcacaa

961 acttcgttcc caaacagaac aagaaaatca aatctcggag agagagagag agaaatattt

1021 tgagagagaa atacagaaaa tctctcttcc ttctttcctt tttttttcaa tccccattca

1081 tattcttttt ttagaataat ctatggcggc atctgtcgaa aacaggcagt tcagtcacct

1141 agaagccggt ttatcccggt ctttcaagcc ccggtctgat tccccggttc gtggctgcaa

1201 cttcccttcg cccaacagta ctaatttcca aaagaaacca aattccacca tttaccttga

1261 ttactcgtcg agtgaagacg acgatgatga tgacgaaaaa aatgagtacc ttcaaatgat

1321 taaaaaaggg aattcagagt tagagccatc tgttcatgac actagggacg aaggtaccgc

1381 tgataattgg attgaacgca acttttccat gattcgtctc accggaaagc atccatttaa

1441 ctccgaacca ccgttgaacc ggctcatgca ccacggcttt atcacaccgg tcccacttca

1501 ttacgttcgt aaccatggac cggttcccaa gggcacgtgg gatgactgga ccgtggaagt

1561 cacgggacta gtgaagcgtc ctatgaaatt cacaatggac cagttggtta acgaattccc

1621 ttgtagagaa ttgcccgtta cgcttgtttg tgctggcaat cgaaggaaag aacagaacat

1681 ggttaaacaa accattggtt tcaactgggg cgccgctgcc gtttcaacaa cgatatggcg

1741 cggggtaccc ctccgcgctt tgctaaaacg gtgcggtgtt tttagcaaga ataaaggggc

1801 gcttaatgtt tgcttcgaag gagctgatgt gttgcccgga ggtggtggtt caaagtatgg

1861 aaccagcatt aagaaggaat ttgcaatgga tccagcacga gatatcatcg tagcctacat

1921 gcagaacgga gaaaaattgg cacccgacca cgggtttcca gtacgaatga taattccagg

1981 attcattgga ggaagaatgg tgaaatggat aaagaggatt atagtcacca cccaagaatc

2041 agacagctat tatcatttca aggacaatag agttcttcct ccccatgttg atgctgaact

2101 tgcaaatacc gaaggtacgt accgtaacta tttcaattta ttactccatt tgttccaatt

2161 tatgtgaacc tatttccttt ttggtccgtt caaaaaagaa tgaacccttt ctaaatttgg

2221 taacaattta gcttaaactt acaacttcac ccttaatgag aaacttttat aaccacacaa

2281 ataccctggg gcccatttgg acttgtttag gtcgacaaat tccaaaagtt ttattttttt

2341 cttaaacttc gtgctcagtc aaacaggttc acgtaaattg aaacggagag agtatcattt

2401 ttattaaggg gtataaatat attttaatta gttgagactt gcacatacaa gtaaaatatt

2461 tcttagaata caaaatcaac tgaaagctta cttctaatta tatggttttg aattttcctt

2521 tcaatgaagt aaataaaaag gaaacaatta tattcaacgc atgtaggtat atggtcctgt

2581 cattatctca aatcaaatgg tttaaagaca aaggactttg gaaacataga attgtcagct

2641 ttatagttat ggagtactat attagttagc tgtttgcatc tattcataat tggtctatct

2701 gtgtgcagca tggtggtaca agccagagta tatcatcaat gagcttaata ttaactctgt

2761 cattacgacg ccgtgtcatg aagaaatttt gccaattaac gcctggacga ctcagcgacc

2821 ttacacgttg aggggctatt cttattctgg ttagtatttt tatattttcc gattttgctg

2881 agaatatcat atttcttagt tttgtcgata catcgtatcc tctaactctg acgttttact

2941 tcgtccttat gcacccactt acgtccttac tttctcagac agtttattga tgaaaactac

3001 ttactatttt cgacccgata gcctcagcgt ccttaattaa atgtgatgtt ttgaaagaga

3061 tattctctcc cgtctatttt aattaatttt tggctgtttt tatacgtggg aatctatttt

3121 taacattaat taatatagaa atgaaccata ttaatattat taatttcttc attgaaaata

3181 caacaaatac tcttcggctc ttactacaat gacaattttg aagaaaaata attaattcct

3241 tcctaatatc tgaaaaatca aatattgtgg accataaaaa aaggtcaaaa aattaattaa

3301 aatgaactgg agagagtaaa ttagaaaata taattatagc actagtaatt aaagttatta

3361 gatgtcttct ttaaaaagcg tgtgaaaact ttaaagacga aatataatat gaatattatc

3421 taatacttag aaagtgtcaa taattggtag acaatttaaa ctatatacta gttaaaaagt

3481 ctgtcaatac aactattagt attggggatt agagagaata gtagtaaaat ggagtaattg

3541 gacgcatgag cttgggcatg ctgattgctg tcagcttgtt tgctaatgtg aaaaagaaaa

3601 tagtaagaaa aggccaacat ggttttgttt attttattat gtggtagtac acaaaaacct

3661 ggggagcttt cctagttctg aagagtcggt ctttggtagc acaaaattaa tagtatagta

3721 taccaagtga atattaaatt caattgtcta aagcacggaa tctttttgac tactttagtt

3781 cctgcatctt gggttgcctc aacaacaccc tttattgaat tattatagta atgttcaata

3841 taatatacaa ttagaaaaca ctctaagtgg tcactttata tggatctagt caatactatt

3901 tcttctaaac aacgtgccta attacttccc actttccagt acatgaccac cattaagttt

3961 aatttttgtc aattccttgt gcaattggcc cttcaaatga gcagaagtgt tacgtaggaa

4021 aactaacttc agctactatt ataggagtaa acctgttagg aaaagatgct cgaggaactg

4081 acaaaacttg tagaataatt agccattgta ttgattgaaa tactgattgt gaacgtgtaa

4141 caaacaggcg gagggaaaaa agtaacgcga gtagaagtga cgttggatgg aggagaaaca

4201 tggcaagtta gcacactaga tcacccagag aagcccacca aatatggcaa gtactggtgt

4261 tggtgctttt ggtcactcga ggttgaggtg ttagacttgc tcagtgctaa agaaattgct

4321 gttcgagctt gggatgagac cctcaatact caacccgaga agcttatttg gaacgtcatg

4381 gtacgttcac ttcttctttt acctttattt cttttaactt ctatatacta gcggtgtaaa

4441 gttattttac accataagtt aacttacaaa aatatgtaac tatttatact acgagtgatg

4501 agggcaagaa ggggtttaag tatttgacaa taaatgtaaa ccctgcaatt ttgttcctaa

4561 ttttttatcc tttcaactct ttgtgattgc ttcattatct agattcacag agcacatgtg

4621 ttcacatgcc aaaacaaaaa actacaaaca aaaaaacttt tcactagctt tagtctaaga

4681 ttcccctttt tttttttggg aggtgtgtgg tccatactcc atagatcaat tccagccact

4741 gacgtaccaa accctgaaaa ttcctagtag ttatagcgac gtacaatcat ttcatattat

4801 gtaagcagag acgtgatcac atgaactaga tgtgaatacc acttgcccag tccaccaggt

4861 caattcatct agatgtgtaa atcttgacac cagcactggg tcacttttat aacactagca

4921 tttaacaaca tttcatcctt gaacattact tgggctaatt aataagtatt tttttttata

4981 tactctaaaa attgtaatta cataaatgaa tttaacttat acacgctgac aatgttacta

5041 attccacttt ttacggacgg ttatctatag aaatcattta ggtgaaacaa ttctcttaca

5101 ctatgatcag tgttagtaca taatggttat tacattttct aaatattgtg ctatgttgca

5161 atgttcaggg aatgatgaat aattgctggt tccgagtaaa gatgaatgtg tgcaagcctc

5221 acaagggaga gattggaata gtgtttgagc atccgactca acctggaaac caatcaggtg

5281 gatggatggc gaaggagaga catttggaga tatcagcaga ggcacctcaa acactaaaga

5341 agagtatctc aactccattcat a aacacagcttccaagat gtactccatg tccgaggtca

5401 ggaaacacag ctctgctgac tctgcttgga tcatagtcca tggtcatatc tatgacgcca

5461 cgcgtttctt gaaagatcac cctggtggga ctgacagcat tctcatcaat gctggcactg

5521 attgcactga ggaatttgat gcaattcatt ctgataaggc taagaagctc ttggaggatt

5581 tcaggattgg tgaactcata actactggtt acacctctga ctctcctggc aactccgtgc

5641 acggatcttc ttccttcagc agctttctag cacctattaa ggaacttgtt ccagcgcaga

5701 ggagtgtggc cctaattcca agagagaaaa tcccatgcaa actcatcgac aagcaatcca

5761 tctcccatga tgttaggaaa tttcgatttg cattgccctc tgaggatcaa gtcttgggct

5821 tgcctgttgg aaaacatatc ttcctctgtg ccgttattga cgataagctc tgcatgcgcg

5881 cttacacgcc tactagcacg atcgatgagg tggggtactt cgagttggtt gtcaagatat

5941 acttcaaagg aattcaccct aaattcccca atggagggca aatgtcacag tatcttgatt

6001 ctatgccgtt agggtcattt ctcgacgtga aaggtccatt aggtcacatt gaataccaag

6061 gaaagggaaa tttcttagtt catggcaaac agaagtttgc caagaagttg gccatgatag

6121 caggtggaac aggaataact ccagtgtatc aagtcatgca ggcaattctg aaagatccag

6181 aagatgacac agaaatgtat gtggtgtatg ctaacagaac agaggatgat attttactta

6241 aggaagagct tgattcatgg gctgagaaaa ttccagagag ggttaaagtt tggtatgtgg

6301 ttcaggattc tattaaagaa ggatggaagt acagcattgg ttttattaca gaagccattt

6361 tgagagaaca tatccctgag ccatctcaca caacactggc tttggcttgt ggaccacctc

6421 ctatgattca atttgctgtt aatccaaact tggagaagat gggctatgac attaaggatt

6481 ccttattggt gttctaattt taaaaacaaa acaatatctg caggaataaa tttttttttt

6541 ccccctatca gttgtacata ttgtatttgg tttatcaccc ccatgtacta cgtagtgttt

6601 gtagttctta catttttatt ttttagaatt tttttaaacc ttaggatata aaggttttct

6661 cttccaacaa agtgattctt tagggaagaa atgtactgta ctgtactagt atgtctaagc

6721 cgaaagttgt aatgtttacc atgacaaatt gtattcaatt cctcatggaa tagtaacatt

6781 gtgttcatgt gtcttcctgt aagcgatctt caaaatatca atgtatatat atagtaattg

6841 caaaccattg ttccttttcc cgatgtagtt aactactctt tctttagctt ctagtctctg

6901 gtgaatattt ttttttctat aactctttaa ttaatacggc cttaaataag agaaaagttt

6961 aaaccacgaa tatcattatg cagacgtata ggtaattaat ctactttttg aaaaaaaatc

7021 tattttcttt atgtggtcct tcaaaataat attctagaac cttttgtata ttccctttta

7081 acttctattt agtttt

서열번호: 5 니트레이트 환원효소에 대한 니코티아나 타바쿰 NIA2 유전자의 야생형 폴리펩타이드 서열로부터 NtNIA2 아미노산 S523의 인산화를 담당하는 니트레이트 환원효소 키나아제의 결합에 대한 인식 부위로서 작용하는 폴리펩타이드 서열, 유전자은행 수탁 번호(GenBank Accession number) X14059.

LK(K 또는 R)(S 또는 T)(I 또는 V 또는 A)S(T 또는 S)PFM

서열번호: 6 서열번호 5의 돌연변이체 폴리펩타이드 서열.

LK(K 또는 R)(S 또는 T)(I 또는 V 또는 A)S(T 또는 S)PFI

서열번호: 7 니트레이트 환원효소에 대한 니코티아나 타바쿰 NIA2 유전자의 야생형 폴리펩타이드 서열로부터 NtNIA2 아미노산 S523의 인산화를 담당하는 니트레이트 환원효소 키나아제의 결합에 대한 인식 부위로서 작용하는 야생형 폴리펩타이드 서열, 유전자은행 수탁 번호(GenBank Accession number) X14059.

LKKSISTPFM

서열번호: 8 (서열번호 7의 돌연변이체 폴리펩타이드 서열).

LKKSISTPFI

표 1

NtNIA2 M527I 돌연변이 세부 사항

돌연변이 NtNIA2 M527I의 서열 정보가 도시되어 있다. 제2 및 제3 컬럼은 돌연변이된 뉴클레오타이드 바로 앞에 있는 10개의 뉴클레오타이드 및 돌연변이된 뉴클레오타이드 뒤에 있는 10개의 뉴클레오타이드를 보여준다. 제4 및 제5 컬럼은 야생형 서열에서와 같이 (각각) 원래 코돈 및 아미노산을 보고한다. 마지막 2개의 컬럼은 돌연변이된 서열에서 (각각) 코돈 및 아미노산을 보고한다. 굵은 글씨체와 밑줄이 G 대 A 돌연변이이다.

표 2

NtNIA2 특이적 프라이머 세부 사항

보고된 것은 NtNIA2 특이적 프라이머의 서열 세부 사항이다. 제2 컬럼은 프라이머의 DNA 서열을 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> Philip Morris Products S.A. <120> MODULATION OF NITRATE LEVELS IN PLANTS VIA MUTATION OF NITRATE REDUCTASE <130> P10597EP <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 904 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 1 Met Ala Ala Ser Val Glu Asn Arg Gln Phe Ser His Leu Glu Ala Gly 1 5 10 15 Leu Ser Arg Ser Phe Lys Pro Arg Ser Asp Ser Pro Val Arg Gly Cys 20 25 30 Asn Phe Pro Ser Pro Asn Ser Thr Asn Phe Gln Lys Lys Pro Asn Ser 35 40 45 Thr Ile Tyr Leu Asp Tyr Ser Ser Ser Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp 50 55 60 Glu Lys Asn Glu Tyr Leu Gln Met Ile Lys Lys Gly Asn Ser Glu Leu 65 70 75 80 Glu Pro Ser Val His Asp Thr Arg Asp Glu Gly Thr Ala Asp Asn Trp 85 90 95 Ile Glu Arg Asn Phe Ser Met Ile Arg Leu Thr Gly Lys His Pro Phe 100 105 110 Asn Ser Glu Pro Pro Leu Asn Arg Leu Met His His Gly Phe Ile Thr 115 120 125 Pro Val Pro Leu His Tyr Val Arg Asn His Gly Pro Val Pro Lys Gly 130 135 140 Thr Trp Asp Asp Trp Thr Val Glu Val Thr Gly Leu Val Lys Arg Pro 145 150 155 160 Met Lys Phe Thr Met Asp Gln Leu Val Asn Glu Phe Pro Cys Arg Glu 165 170 175 Leu Pro Val Thr Leu Val Cys Ala Gly Asn Arg Arg Lys Glu Gln Asn 180 185 190 Met Val Lys Gln Thr Ile Gly Phe Asn Trp Gly Ala Ala Ala Val Ser 195 200 205 Thr Thr Ile Trp Arg Gly Val Pro Leu Arg Ala Leu Leu Lys Arg Cys 210 215 220 Gly Val Phe Ser Lys Asn Lys Gly Ala Leu Asn Val Cys Phe Glu Gly 225 230 235 240 Ala Asp Val Leu Pro Gly Gly Gly Gly Ser Lys Tyr Gly Thr Ser Ile 245 250 255 Lys Lys Glu Phe Ala Met Asp Pro Ala Arg Asp Ile Ile Val Ala Tyr 260 265 270 Met Gln Asn Gly Glu Lys Leu Ala Pro Asp His Gly Phe Pro Val Arg 275 280 285 Met Ile Ile Pro Gly Phe Ile Gly Gly Arg Met Val Lys Trp Ile Lys 290 295 300 Arg Ile Ile Val Thr Thr Gln Glu Ser Asp Ser Tyr Tyr His Phe Lys 305 310 315 320 Asp Asn Arg Val Leu Pro Pro His Val Asp Ala Glu Leu Ala Asn Thr 325 330 335 Glu Ala Trp Trp Tyr Lys Pro Glu Tyr Ile Ile Asn Glu Leu Asn Ile 340 345 350 Asn Ser Val Ile Thr Thr Pro Cys His Glu Glu Ile Leu Pro Ile Asn 355 360 365 Ala Trp Thr Thr Gln Arg Pro Tyr Thr Leu Arg Gly Tyr Ser Tyr Ser 370 375 380 Gly Gly Gly Lys Lys Val Thr Arg Val Glu Val Thr Leu Asp Gly Gly 385 390 395 400 Glu Thr Trp Gln Val Ser Thr Leu Asp His Pro Glu Lys Pro Thr Lys 405 410 415 Tyr Gly Lys Tyr Trp Cys Trp Cys Phe Trp Ser Leu Glu Val Glu Val 420 425 430 Leu Asp Leu Leu Ser Ala Lys Glu Ile Ala Val Arg Ala Trp Asp Glu 435 440 445 Thr Leu Asn Thr Gln Pro Glu Lys Leu Ile Trp Asn Val Met Gly Met 450 455 460 Met Asn Asn Cys Trp Phe Arg Val Lys Met Asn Val Cys Lys Pro His 465 470 475 480 Lys Gly Glu Ile Gly Ile Val Phe Glu His Pro Thr Gln Pro Gly Asn 485 490 495 Gln Ser Gly Gly Trp Met Ala Lys Glu Arg His Leu Glu Ile Ser Ala 500 505 510 Glu Ala Pro Gln Thr Leu Lys Lys Ser Ile Ser Thr Pro Phe Met Asn 515 520 525 Thr Ala Ser Lys Met Tyr Ser Met Ser Glu Val Arg Lys His Ser Ser 530 535 540 Ala Asp Ser Ala Trp Ile Ile Val His Gly His Ile Tyr Asp Ala Thr 545 550 555 560 Arg Phe Leu Lys Asp His Pro Gly Gly Thr Asp Ser Ile Leu Ile Asn 565 570 575 Ala Gly Thr Asp Cys Thr Glu Glu Phe Asp Ala Ile His Ser Asp Lys 580 585 590 Ala Lys Lys Leu Leu Glu Asp Phe Arg Ile Gly Glu Leu Ile Thr Thr 595 600 605 Gly Tyr Thr Ser Asp Ser Pro Gly Asn Ser Val His Gly Ser Ser Ser 610 615 620 Phe Ser Ser Phe Leu Ala Pro Ile Lys Glu Leu Val Pro Ala Gln Arg 625 630 635 640 Ser Val Ala Leu Ile Pro Arg Glu Lys Ile Pro Cys Lys Leu Ile Asp 645 650 655 Lys Gln Ser Ile Ser His Asp Val Arg Lys Phe Arg Phe Ala Leu Pro 660 665 670 Ser Glu Asp Gln Val Leu Gly Leu Pro Val Gly Lys His Ile Phe Leu 675 680 685 Cys Ala Val Ile Asp Asp Lys Leu Cys Met Arg Ala Tyr Thr Pro Thr 690 695 700 Ser Thr Ile Asp Glu Val Gly Tyr Phe Glu Leu Val Val Lys Ile Tyr 705 710 715 720 Phe Lys Gly Ile His Pro Lys Phe Pro Asn Gly Gly Gln Met Ser Gln 725 730 735 Tyr Leu Asp Ser Met Pro Leu Gly Ser Phe Leu Asp Val Lys Gly Pro 740 745 750 Leu Gly His Ile Glu Tyr Gln Gly Lys Gly Asn Phe Leu Val His Gly 755 760 765 Lys Gln Lys Phe Ala Lys Lys Leu Ala Met Ile Ala Gly Gly Thr Gly 770 775 780 Ile Thr Pro Val Tyr Gln Val Met Gln Ala Ile Leu Lys Asp Pro Glu 785 790 795 800 Asp Asp Thr Glu Met Tyr Val Val Tyr Ala Asn Arg Thr Glu Asp Asp 805 810 815 Ile Leu Leu Lys Glu Glu Leu Asp Ser Trp Ala Glu Lys Ile Pro Glu 820 825 830 Arg Val Lys Val Trp Tyr Val Val Gln Asp Ser Ile Lys Glu Gly Trp 835 840 845 Lys Tyr Ser Ile Gly Phe Ile Thr Glu Ala Ile Leu Arg Glu His Ile 850 855 860 Pro Glu Pro Ser His Thr Thr Leu Ala Leu Ala Cys Gly Pro Pro Pro 865 870 875 880 Met Ile Gln Phe Ala Val Asn Pro Asn Leu Glu Lys Met Gly Tyr Asp 885 890 895 Ile Lys Asp Ser Leu Leu Val Phe 900 <210> 2 <211> 7096 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 2 tacatacaag ggcgcgaata aacttttttt aaagtaaatg tatatgaact tgcaatgaaa 60 gaggacctta acttgtttgt ctttgttgct ttctgcaaat ttcaccttaa cagcccattt 120 gagattgatt tagttagtta taacaattag ttaaatgctt gtgtaatttg aagaaaatat 180 ttggacgtgc tcgctgaaaa cattatactc ctatataata gaaatacttt ctgaaaagtt 240 ggtcttgttc aaaaacgtat aagagagttg gtcttctcat aaatagtcac tagctttctg 300 attttttttc actttctata tcacgtaaat aggtactcaa atttgatatt tacaccaaac 360 aaatgaaaat aggatatgtg tttttcatac gtatatttat ctatcgtact taatgataca 420 tacatataca tataacctta ctttttgatt actaaaaatt taattatatt taatttgggt 480 aaatatcaga tgccacaaaa catttaccta gccactgttt ttgactacta aaaatttaat 540 tatgtttagc ttgggtaaat atcagatgtc actaaacatt ttacctagcc attcctccga 600 aaagaaattg agaaggaaat tagagttagt ggagccataa taatgtttaa tgtgaccata 660 actcggtgaa aaccacggca agaataagaa acagctgtta aggctaacca acagctgcat 720 atctttaagc catttgctat taccccaaca tcgcatcttc ctctgatccc gaccctacgg 780 gcgtaaaaag tgtaaatcgt tagaattgtt ttatttattt tatgatgtca ctatttttta 840 aaatcaaaat taaattgggg tgtcgatttt tttgggtcct gcttatgtat agtatggcgc 900 tatggaggca ctgagagagt ccgaaacgtt tctatataag gccaccccac gcattcacaa 960 acttcgttcc caaacagaac aagaaaatca aatctcggag agagagagag agaaatattt 1020 tgagagagaa atacagaaaa tctctcttcc ttctttcctt tttttttcaa tccccattca 1080 tattcttttt ttagaataat ctatggcggc atctgtcgaa aacaggcagt tcagtcacct 1140 agaagccggt ttatcccggt ctttcaagcc ccggtctgat tccccggttc gtggctgcaa 1200 cttcccttcg cccaacagta ctaatttcca aaagaaacca aattccacca tttaccttga 1260 ttactcgtcg agtgaagacg acgatgatga tgacgaaaaa aatgagtacc ttcaaatgat 1320 taaaaaaggg aattcagagt tagagccatc tgttcatgac actagggacg aaggtaccgc 1380 tgataattgg attgaacgca acttttccat gattcgtctc accggaaagc atccatttaa 1440 ctccgaacca ccgttgaacc ggctcatgca ccacggcttt atcacaccgg tcccacttca 1500 ttacgttcgt aaccatggac cggttcccaa gggcacgtgg gatgactgga ccgtggaagt 1560 cacgggacta gtgaagcgtc ctatgaaatt cacaatggac cagttggtta acgaattccc 1620 ttgtagagaa ttgcccgtta cgcttgtttg tgctggcaat cgaaggaaag aacagaacat 1680 ggttaaacaa accattggtt tcaactgggg cgccgctgcc gtttcaacaa cgatatggcg 1740 cggggtaccc ctccgcgctt tgctaaaacg gtgcggtgtt tttagcaaga ataaaggggc 1800 gcttaatgtt tgcttcgaag gagctgatgt gttgcccgga ggtggtggtt caaagtatgg 1860 aaccagcatt aagaaggaat ttgcaatgga tccagcacga gatatcatcg tagcctacat 1920 gcagaacgga gaaaaattgg cacccgacca cgggtttcca gtacgaatga taattccagg 1980 attcattgga ggaagaatgg tgaaatggat 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<222> (3)..(3) <223> Lys or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Ser or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Ile or Val or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr or Ser <400> 5 Leu Lys Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Pro Phe Met 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Lys or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Ser or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Ile or Val or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr or Ser <400> 6 Leu Lys Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Pro Phe Ile 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 7 Leu Lys Lys Ser Ile Ser Thr Pro Phe Met 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 8 Leu Lys Lys Ser Ile Ser Thr Pro Phe Ile 1 5 10 <210> 9 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 9 ctccattcat 10 <210> 10 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 10 aacacagctt 10 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 ccacttttta cggacggtta tct 23 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 gcaaatcgaa atttcctaac atcat 25 <210> 13 <211> 6 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 13 Lys Ser Ile Ser Thr Pro 1 5

Claims (15)

1. 식물 세포로서,
   (a) 서열번호 5 또는 서열번호 7의 연속 폴리펩타이드 서열을 포함하는 니트레이트 환원효소 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열로서, 여기서 메티오닌은 대조군 식물 세포와 비교하여 상기 식물 세포 내 니트레이트 환원효소 활성을 감소시키는 아미노산으로 치환되는, 폴리뉴클레오타이드 서열;
   (b) (a)에 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드 서열; 또는
   (c) (b)에 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 작제물, 벡터 또는 발현 벡터를 포함하는, 식물 세포.
2. 제1항에 있어서, 메티오닌은 상이한 아미노산으로 치환되고, 적절하게는, 여기서 상기 치환된 아미노산은 이소류신이며, 적절하게는, 여기서 상기 폴리펩타이드는 서열번호 6 또는 서열번호 8의 연속 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 식물 세포.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 니트레이트 환원효소 폴리펩타이드는 서열번호 1과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 서열의 위치 527에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하는, 식물 세포.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 니트레이트 환원효소 폴리펩타이드는 서열번호 3에 제시된 폴리펩타이드 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 이로 필수적으로 구성되는, 식물 세포.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 이로 필수적으로 구성되는, 식물 세포.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4에 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 이로 필수적으로 구성되는, 식물 세포.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물 세포는 니코티아나 타바쿰 식물 세포인, 식물 세포.
8. 제7항에 있어서, 상기 식물 세포는 니코티아나 타바쿰 AA37 재배종 유래의 식물 세포인, 식물 세포.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 식물 세포를 포함하는 식물 또는 이의 일부로서; 적절하게는, 상기 식물 또는 이의 일부의 경화된 잎은 대조군 식물 또는 이의 일부에 비해 더 낮은 수준의 니트레이트를 함유하고, 적절하게는, 여기서 상기 니트레이트의 수준은 상기 대조군 식물 또는 이의 일부에 비해 감소되는, 식물 또는 이의 일부.
10. 제9항의 식물 또는 그의 일부로부터 유래된, 식물 재료, 경화된 식물 재료, 또는 균질화된 식물 재료로서, 적절하게는, 상기 경화된 식물 재료는 음건식 또는 양건식 또는 열건식 식물 재료이고; 적절하게는, 상기 식물 재료, 경화된 식물 재료, 또는 균질화된 식물 재료는 제9항의 식물 또는 이의 일부로부터의 바이오매스, 종자, 줄기, 꽃, 또는 잎을 포함하는, 식물 재료, 경화된 식물 재료, 또는 균질화된 식물 재료.
11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 식물 세포, 제9항의 식물의 일부 또는 제10항에 따른 식물 재료를 포함하는 담배 제품.
12. 제9항의 식물을 생산하기 위한 방법으로,
    (a) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 식물 세포를 제공하는 단계;
    (b) 상기 식물 세포를 식물 내로 번식시키는 단계를 포함하는, 방법.
13. 대조군 식물 재료에 비해 니트레이트의 변경된 양을 갖는 경화된 식물 재료를 생산하기 위한 방법으로,
    (a) 제9항에 따른 식물 또는 이의 일부 또는 제10항에 따른 식물 재료를 제공하는 단계;
    (b) 선택적으로 상기 식물 또는 이의 일부로부터 상기 식물 재료를 수확하는 단계; 및
    (c) 상기 식물 재료를 경화시키는 단계를 포함하는, 방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 식물 재료는 경화된 잎을 포함하는, 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 경화 방법은 음건, 화건, 훈연 경화 및 열건으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
    

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