RU2815762C2 - Модулирование уровней нитратов в растениях посредством мутации нитратредуктазы - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биохимии, в частности к клетке табачного растения, характеризующейся уменьшенными уровнями нитратов в высушенных листьях табачного растения, содержащего упомянутую клетку табачного растения. Также раскрыты табачное растение, часть табачного растения, табачный растительный материал, табачный продукт, содержащие указанную клетку табачного растения. Раскрыт способ получения указанного табачного растения. Изобретение позволяет эффективно получать растения табака с низким уровнем нитратов в высушенных листьях. 9 н. и 8 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 1 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к растениям, характеризующимся уменьшенными уровнями нитратов, растительным клеткам, полученным из растений, продуктам, полученным из растений, и способам модулирования уровней нитратов в растениях посредством осуществления мутации фермента нитратредуктазы.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Некоторые растения, такие как растения табака, накапливают в своих листьях высокие уровни свободных нитратов, что является нежелательным, поскольку было установлено, что высокие уровни нитратов связаны с образованием канцерогенных соединений, называемых табакоспецифическими нитрозаминами (TSNA). TSNA представляют собой класс соединений, которые вырабатываются главным образом в процессе сушки листьев табака, хотя дополнительное образование может происходить при последующей переработке и хранении листьев, а также, возможно, путем пиросинтеза во время сгорания. Два из TSNA, обнаруживаемых в высушенных листьях - N-нитрозонорникотин (NNN) и 4-(метилнитрозамино)-1-(3-пиридил)-1-бутанон (NNK) - классифицируются Международным агентством по изучению рака как канцерогенные вещества группы I (обозначение высшего уровня). Ввиду значительного объема свидетельств причастности этих соединений к развитию различных форм рака, ассоциированных с употреблением табака, Всемирной организацией здравоохранения было рекомендовано реализовать предписания, направленные на обеспечение того, чтобы в будущих табачных продуктах уровни таких токсичных веществ были уменьшены. TSNA представляют собой продукты нитрозирования алкалоидов табака. В отношении разновидностей табака воздушной сушки существует общее мнение, что нитрит является средством, непосредственно отвечающим за образование TSNA. Однако по причине своей клеточной токсичности уровни эндогенных нитритов в растительных тканях, как правило, очень низки. Полагают, что вместо этого подавляющее большинство нитритов, участвующих в образовании TSNA, образуется в результате активности нитратредуктаз микробов, находящихся на поверхности листа в течение 6-10 недель процесса сушки, посредством которой часть пула нитратов листа преобразуется в нитриты по мере распада клеточных мембран и органелл в течение этого периода.

TSNA образуются главным образом во время процесса сушки листьев, что предусматривает нитрозирование алкалоидов табака. Генетические стратегии снижения содержания и уровней TSNA в высушенных листьях были сосредоточены на целенаправленном воздействии на: (1) алкалоидный(алкалоидные) предшественник(предшественники) либо (2) участвующее(участвующие) нитрозирующее(нитрозирующие) средство(средства). Большинство усилий по уменьшению содержания TSNA на уровне изменения генетических характеристик табака были нацелены на превращение алкалоидных предшественников в TSNA. Такие стратегии обеспечивают существенное уменьшение уровней NNN вследствие снижения экспрессии семейства генов, отвечающих за синтез его алкалоидного предшественника норникотина.

Модифицированные растения табака, характеризующиеся уменьшенными уровнями нитратов, описаны заявителем, подающим настоящую заявку, в WO2016/046288. Согласно описанию в этом документе экспрессия или активность фермента нитратредуктазы является дерегулированной. Дерегулированный фермент нитратредуктаза содержит аминокислотную замену в положении, соответствующем положению 523 в полипептиде, кодирующем нитратредуктазу. Данную мутацию называют S523D. Сверхэкспрессия мутантного фермента нитратредуктазы обеспечивала существенное увеличение ассимиляции нитратов, что приводило к низкому содержанию нитратов/TSNA и более высоким уровням аминокислот. Растения демонстрировали на 90% меньшее содержание нитратов по сравнению с контролем.

Желательной может являться разработка подходов с использованием организмов, не являющихся генетически модифицированными (не являющихся GMO), для уменьшения накопления нитратов. Из-за трудностей, связанных с выращиванием и коммерческим использованием генетически модифицированных сельскохозяйственных культур в некоторых странах, включая европейские, преимущественной может быть работа с мутантными формами, имеющими однонуклеотидные полиморфизмы, а не с мутантными формами, полученными посредством применения методик генной инженерии.

Соответственно, в данной области техники остается постоянная потребность в уменьшении уровней нитратов в растениях, особенно посредством нетрансгенных подходов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение по меньшей мере частично основано на обнаружении того факта, что осуществление мутации нитратредуктазы (NIA2) Nicotiana tabacum посредством нетрансгенного подхода может приводить к получению растений или растительного материала, в которых их высушенные листья содержат модулированные (например, уменьшенные) уровни нитратов по сравнению с высушенными листьями, полученными из контрольного растения. Одна такая мутация, описанная в данном документе, локализована в сайте распознавания киназой нитратредуктазы в пределах шарнирного домена 1 нитратредуктазы Nicotiana tabacum.

В Hardin et al. (2009) Biochem. J. 422:305-312 содержатся сведения о том, что окисление метионина в положении 538 белка NIA2 Arabidopsis thaliana представляет собой механизм подавления фосфорилирования белка NIA. Окисление предотвращает связывание 14-3-3 с нитратредуктазой и предотвращает инактивацию нитратредуктазы при воздействии активных форм кислорода (ROS), таких как пероксид водорода, гидроксильные радикалы. Поскольку нитратредуктаза превращает нитрат в нитрит, что приводит к получению аммиака и аминокислот, ожидается, что повышение активации нитратредуктазы будет приводить к снижению уровня нитратов, как продемонстрировано в WO2016/046288. Следовательно, ожидается, что окисление M538 в белке NIA2 Arabidopsis thaliana до метионинсульфоксида будет приводить к снижению уровней нитратов. M527 в белке NIA2 Nicotiana tabacum соответствует M538 в NIA2 Arabidopsis thaliana. Свойства мутантных растений Nicotiana tabacum, описанных в данном документе, являются неожиданными. NIA2 Nicotiana tabacum с мутацией M527I (как хорошо понятно в данной области техники, M527I означает, что метионин (M) в положении 527 заменен изолейцином (I)) содержит замену метионина в положении 537 изолейцином, который не может быть окислен. Известно, что метионин окисляется по остатку серы до метионинсульфоксида, тогда как изолейцин не содержит какого-либо остатка серы в своей структуре. Исходя из этого отличия, ожидается, что NIA2 Nicotiana tabacum с мутацией M527I не будет стимулировать активацию нитратредуктазы при воздействии ROS, и в результате этого механизм уменьшения уровней нитратов в растении будет устраняться. Однако было неожиданно обнаружено, что, несмотря на замену метионина, мутантное растение по настоящему изобретению демонстрирует уменьшение уровней нитратов.

Получение растений согласно настоящему изобретению обеспечивает ряд других преимуществ. Например, растения, описанные в данном документе, могут представлять собой растения, не являющиеся генетически модифицированными, что позволяет преодолеть трудности, связанные с выращиванием и коммерческим использованием генетически модифицированных сельскохозяйственных культур. В качестве дополнительного примера, уменьшение уровней нитратов может достигаться без влияния на общую биомассу урожая растения, а также на содержание никотина, общее содержание алкалоидов, содержание аммиака или восстанавливающих сахаров в листьях. Это может улучшать коммерческую приемлемость растений, растительного материала или растительных продуктов.

В одном аспекте раскрыта растительная клетка, содержащая: (a) полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид нитратредуктазу, содержащий непрерывную полипептидную последовательность под SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7, где метионин заменен аминокислотой, которая уменьшает активность нитратредуктазы в растительной клетке по сравнению с контрольной растительной клеткой; (b) полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью, представленной в (a); или (c) конструкцию, вектор или вектор экспрессии, содержащие полинуклеотидную последовательность, представленную в (b).

Метионин предпочтительно заменен другой аминокислотой, заменяющая аминокислота более предпочтительно представляет собой изолейцин, при этом полипептид более предпочтительно содержит непрерывную полипептидную последовательность под SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8.

Полипептид нитратредуктаза предпочтительно содержит аминокислотную замену в положении, соответствующем положению 527 в последовательности, характеризующейся по меньшей мере 80% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1.

Полипептид нитратредуктаза предпочтительно содержит полипептидную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 3, состоит из нее или по сути состоит из нее.

Полинуклеотидная последовательность предпочтительно содержит полинуклеотидную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 80% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 4, состоит из нее или по сути состоит из нее.

Полинуклеотидная последовательность предпочтительно содержит полинуклеотидную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 4, состоит из нее или по сути состоит из нее.

Растительная клетка предпочтительно представляет собой клетку растения Nicotiana tabacum.

Растительная клетка предпочтительно представляет собой клетку растения Nicotiana tabacum культивара AA37.

В другом аспекте раскрыты растение или его часть, содержащие растительную клетку согласно любому из предыдущих пунктов; при этом предпочтительно высушенные листья растения или его части содержат более низкие уровни нитратов по сравнению с контрольным растением или его частью, при этом предпочтительно уровень нитратов уменьшен на приблизительно 37% или больше по сравнению с контрольным растением или его частью.

В другом аспекте раскрыт растительный материал, высушенный растительный материал или гомогенизированный растительный материал, полученный из растения или его части, описанных в данном документе, при этом высушенный растительный материал предпочтительно представляет собой растительный материал воздушной сушки, или солнечной сушки, или трубоогневой сушки; при этом растительный материал, высушенный растительный материал или гомогенизированный растительный материал предпочтительно содержит биомассу, семя, стебель, цветки или листья растения или его части.

В другом аспекте раскрыт табачный продукт, содержащий растительную клетку, описанную в данном документе, часть растения, описанную в данном документе, или растительный материал, описанный в данном документе.

В другом аспекте раскрыт способ получения растения, описанного в данном документе, включающий стадии: (a) получения растительной клетки, описанной в данном документе; и (b) размножения растительной клетки с получением растения.

В другом аспекте раскрыт способ получения высушенного растительного материала с измененным количеством нитратов по сравнению с контрольным растительным материалом, включающий стадии: (a) получения растения или его части, описанных в данном документе, или растительного материала, описанного в данном документе; (b) необязательно сбора растительного материала с растения или его части и (c) сушки растительного материала.

Растительный материал предпочтительно содержит высушенные листья.

Способ сушки предпочтительно выбран из группы, состоящей из воздушной сушки, огневой сушки, дымовой сушки и трубоогневой сушки.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На фигуре 1 проиллюстрированы домены и консенсусные последовательности в последовательности белка NtNIA2. (A) Основные домены белка нитратредуктазы NIA2 Nicotiana tabacum (GenBank: X14059). (B) Сайт распознавания киназой нитратредуктазы (LKKSISTPFM) и сайт распознавания 14-3-3 в пределах шарнирного домена 1 NtNIA2. Указаны положения мутации S523D из WO2016/046288 и мутации M527I, описанной в данном документе.

Фигура 2 представляет собой серию столбчатых диаграмм, иллюстрирующих составление химического профиля высушенных листьев второго сбора и общей биомассы свежих листьев. (A) Сырой вес (FW) всех собранных листьев, выраженный в граммах на растение; (B) содержание никотина в высушенных листьях, выраженное в микрограммах на грамм высушенного материала; (C) общее содержание алкалоидов, выраженное в процентах от сухого веса высушенного материала; (D) содержание аммиака, выраженное в процентах от сухого веса высушенного материала; (E) содержание восстанавливающих сахаров, выраженное в процентах от сухого веса высушенного материала; и (F) содержание нитратов, выраженное в процентах от сухого веса высушенного материала. Контроль AA37 указывает на линии, которые не подвергались обработке с помощью EMS (n=6 опытных участков); NIA2_M527I_WT указывает на несегрегирующие линии AA37 дикого типа (n=15 опытных участков); NIA2_M527I_HOMO указывает на линии, гомозиготные по NtNIA2 M527I (n=11 опытных участков). Планками погрешностей указан доверительный интервал на уровне 95%, рассчитанный с помощью t-критерия Стьюдента.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Если не определено иное, то все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое же значение, какое обычно понимает специалист средней квалификации в данной области. В случае противоречий данный документ, включая определения, будет иметь преимущественную силу. Предпочтительные способы и материалы описаны ниже, хотя способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в данном документе, могут быть применены при осуществлении настоящего изобретения на практике или его тестировании. Материалы, способы и примеры, раскрытые в данном документе, являются лишь иллюстративными и не предусматриваются как ограничивающие.

Подразумевается, что термины «включают(включает)», «включают(включает) в себя», «имеющий», «имеет», «может», «содержат(содержит)» и их варианты, используемые в данном документе, являются открытыми переходными фразами, терминами или словами, которые не исключают возможность наличия дополнительных действий или структур.

Формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если из контекста явно не следует иное.

Термин «и/или» означает (а) или (b) или как (а), так и (b).

В настоящем изобретении предусмотрены другие варианты осуществления, «содержащие» варианты осуществления или элементы, представленные в данном документе, «состоящие из» них и «по сути состоящие из» них, независимо от того, указано это явно или нет.

В случае изложения в данном документе числовых диапазонов каждое промежуточное число в них предусматривается в явной форме с той же степенью точности. Например, в случае с диапазоном 6-9 в дополнение к 6 и 9 предусматриваются числа 7 и 8, а в случае с диапазоном 6,0-7,0 в явной форме предусматриваются числа 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 и 7,0.

Следующие термины, используемые во всем данном описании и формуле изобретения, имеют следующие значения.

Термины «кодирующая последовательность» или «полинуклеотид, кодирующий» означают нуклеотиды (молекулы РНК или ДНК), которые составляют полинуклеотид, который кодирует полипептид. Кодирующая последовательность может дополнительно содержать сигналы инициации и терминации, функционально связанные с регуляторными элементами, в том числе c промотором и сигналом полиаденилирования, способными управлять экспрессией в клетках индивидуума или млекопитающего, которому вводят полинуклеотид. Кодирующая последовательность может быть кодон-оптимизированной.

Термины «комплементарная последовательность» или «комплементарный» могут означать образование уотсон-криковских (например, A-T/U и C-G) или хугстиновских пар оснований между нуклеотидами или аналогами нуклеотидов. «Комплементарность» относится к свойству, общему для двух полинуклеотидов, заключающемуся в том, что при их антипараллельном выравнивании друг относительно друга нуклеотидные основания в каждом положении комплементарны друг другу.

Термин «конструкция» относится к двухнитевому рекомбинантному полинуклеотидному фрагменту, содержащему один или более полинуклеотидов. Конструкция содержит «матричную нить», основания которой спарены с комплементарной «смысловой или кодирующей нитью». Указанная конструкция может быть вставлена в вектор в двух возможных ориентациях: либо в той же (или смысловой) ориентации, либо в противоположной (или антисмысловой) ориентации по отношению к ориентации промотора, расположенного в векторе, таком как вектор экспрессии.

Термин «контроль» применительно к контрольному растению или контрольной растительной клетке означает растение или растительную клетку, в которых экспрессия, функция или активность одного или более генов или полипептидов не была модифицирована (например, увеличена или снижена), и поэтому они могут обеспечивать возможность сравнения с растением, в котором экспрессия, функция или активность тех же одного или более генов или полипептидов была модифицирована. Используемый в данном документе термин «контрольное растение» означает растение, которое является по существу эквивалентным тестируемому растению или модифицированному растению по всем параметрам, за исключением тестируемых параметров. Например, если речь идет о растении, в которое была введена мутация, контрольное растение представляет собой эквивалентное растение, в которое данная мутация не была введена. Контрольное растение может представлять собой несегрегирующее контрольное растение.

Термин «экспрессия» относится к выработке функционального продукта. Например, экспрессия полинуклеотидного фрагмента может относиться к транскрипции полинуклеотидного фрагмента (например, транскрипции, приводящей к получению мРНК или функциональной РНК) и/или трансляции мРНК с получением полипептида-предшественника или зрелого полипептида.

Термины «функциональный» и «полностью функциональный» описывают полипептид, который обладает биологической функцией или активностью. Термин «функциональный ген» относится к гену, транскрибируемому с образованием мРНК, которая транслируется с образованием функционального или активного полипептида.

Термин «генная конструкция» относится к молекулам ДНК или РНК, которые содержат полинуклеотид, кодирующий полипептид. Кодирующая последовательность может содержать сигналы инициации и терминации, функционально связанные с регуляторными элементами, в том числе c промотором и сигналом полиаденилирования, способными управлять экспрессией.

Термины «гомология» или «сходство» относятся к степени сходства последовательностей двух полипептидов или двух молекул полинуклеотидов, сравниваемых путем выравнивания последовательностей. Степень гомологии между двумя отдельными сравниваемыми полинуклеотидами зависит от числа идентичных или совпадающих нуклеотидов в сопоставляемых положениях.

Термины «идентичный» или «идентичность» применительно к двум или более полинуклеотидам или полипептидам означают, что последовательности имеют определенную процентную долю остатков, которые являются одинаковыми в пределах определенного участка. Процентную долю можно рассчитать путем оптимального выравнивания двух последовательностей, сравнения двух последовательностей в пределах определенного участка, определения числа положений, в которых в обеих последовательностях находятся идентичные остатки, с получением числа совпадающих положений, деления числа совпадающих положений на общее число положений в определенном участке и умножения результата на 100 с получением процентного значения идентичности последовательностей. В тех случаях, когда эти две последовательности имеют разную длину или при выравнивании создается один или более несимметрично расположенных концов, и определенный участок сравнения включает только одну последовательность, то при расчете остатки одиночной последовательности включаются в знаменатель, а не в числитель. При сравнении ДНК и РНК тимин (Т) и урацил (U) можно считать эквивалентными. Идентичность можно определять вручную или с помощью компьютерного алгоритма для работы с последовательностями, такого как ClustalW, ClustalX, BLAST, FASTA или алгоритм Смита-Уотермана. Популярная программа множественного выравнивания ClustalW (Nucleic Acids Research (1994) 22, 4673-4680; Nucleic Acids Research (1997), 24, 4876-4882) представляет собой подходящий способ получения множественных выравниваний полипептидов или полинуклеотидов. Подходящие параметры для ClustalW могут являться следующими. Для выравниваний полинуклеотидов: штраф за открытие гэпа = 15,0, штраф за продолжение гэпа = 6,66 и матрица = идентичность. Для выравниваний полипептидов: штраф за открытие гэпа = 10,0, штраф за продолжение гэпа = 0,2 и матрица = Gonnet. Для выравниваний ДНК и белка: ENDGAP = -1 и GAPDIST=4. Специалистам в данной области будет понятно, что может быть необходимым изменять эти и другие параметры для оптимального выравнивания последовательностей. Затем предпочтительно проводят расчет процентных значений идентичности на основании такого выравнивания в виде (N/T), где N представляет собой число положений, в которых в последовательностях присутствует общий идентичный остаток, и T представляет собой общее число сравниваемых положений с учетом гэпов, но без учета выступов.

Термины «выделенный» или «очищенный» относятся к материалу, который по существу или по сути не содержит компоненты, которые обычно сопутствуют ему, как обнаруживается в его нативном состоянии. Как правило, чистоту и однородность определяют с помощью методик аналитической химии, таких как электрофорез в полиакриламидном геле или высокоэффективная жидкостная хроматография. Полипептид, который является преобладающей молекулой, присутствующей в препарате, является по существу очищенным. В частности, выделенный полинуклеотид отделен от открытых рамок считывания, которые фланкируют требуемый ген и кодируют полипептиды, отличные от необходимого полипептида. Термин «очищенный», используемый в данном документе, обозначает, что полинуклеотид или полипептид дает по сути одну полосу в электрофоретическом геле. В частности, это означает, что полинуклеотид или полипептид является на по меньшей мере 85% чистым, более предпочтительно на по меньшей мере 95% чистым и наиболее предпочтительно на по меньшей мере 99% чистым. Выделенные полинуклеотиды могут быть очищены из клетки-хозяина, в которой они встречаются в природе. Для получения выделенных полинуклеотидов можно применять общепринятые способы очистки полинуклеотидов, известные специалистам в данной области. Данный термин также охватывает рекомбинантные полинуклеотиды и химически синтезируемые полинуклеотиды.

Термины «модулировать» или «модулирование» относятся к обеспечению или облегчению качественного или количественного изменения, видоизменения или модификации процесса, пути, функции или активности, представляющих интерес. Без ограничения такие изменение, видоизменение или модификация могут представлять собой увеличение или снижение уровня соответствующего процесса, пути, функции или активности, представляющих интерес. Например, можно модулировать экспрессию гена, или экспрессию полипептида, или функцию или активность полипептида. Как правило, относительное изменение, видоизменение или модификацию определяют посредством сравнения с контролем.

Термин «не встречающийся в природе» описывает объект, такой как полинуклеотид, генетическую мутацию, полипептид, растение, растительную клетку и растительный материал, который не образован естественным путем или не существует в природе. Такие не встречающиеся в природе объекты или искусственные объекты можно создать, синтезировать, произвести, модифицировать, подвергнуть вмешательству или манипуляции способами, которые описаны в данном документе или которые известны из уровня техники. Такие не встречающиеся в природе объекты или искусственные объекты могут быть созданы, синтезированы, произведены, модифицированы, подвергнуты вмешательству или манипуляции человеком. В качестве примера, не встречающийся в природе объект может представлять собой объект, который был подвергнут мутации с помощью способов, которые, как известно, индуцируют мутагенез, включающих сайт-направленный мутагенез, олигонуклеотид-направленный мутагенез, мутагенез, индуцируемый химическими соединениями, мутагенез, индуцируемый облучением, мутагенез с использованием модифицированных оснований, мутагенез с использованием ДНК-дуплекса с гэпами, мутагенез, индуцируемый двухнитевыми разрывами, мутагенез с использованием штаммов-хозяев с дефектом репарации, мутагенез посредством полного синтеза гена, перетасовку ДНК и другие эквивалентные способы. Например, можно применять химический мутагенез, который предусматривает применение добавляемых экзогенно химических веществ, таких как мутагенные, тератогенные или канцерогенные органические соединения, для индуцирования мутаций. Мутантные формы с предпочтительными свойствами могут затем быть выбраны и идентифицированы.

Термины «олигонуклеотид» или «полинуклеотид» означают по меньшей мере два нуклеотида, ковалентно связанных друг с другом. Описание отдельной нити также определяет последовательность комплементарной нити. Таким образом, полинуклеотид также охватывает нить, комплементарную описанной отдельной нити. Многие варианты полинуклеотида можно применять для той же цели, что и указанный полинуклеотид. Таким образом, полинуклеотид также охватывает по существу идентичные полинуклеотиды и комплементарные им последовательности. Отдельная нить представляет собой зонд, который может гибридизироваться с указанной последовательностью в жестких условиях гибридизации. Таким образом, полинуклеотид также охватывает зонд, который гибридизируется в жестких условиях гибридизации. Полинуклеотиды могут быть однонитевыми или двухнитевыми или могут содержать части как двухнитевой, так и однонитевой последовательности. Полинуклеотид может представлять собой ДНК - как геномную, так и кДНК, РНК или гибридную молекулу, где полинуклеотид может содержать комбинации дезоксирибо- и рибонуклеотидов, а также комбинации оснований, в том числе урацила, аденина, тимина, цитозина, гуанина, инозина, ксантина, гипоксантина, изоцитозина и изогуанина. Полинуклеотиды можно получать с помощью способов химического синтеза или с помощью рекомбинантных способов.

Специфичность однонитевой ДНК в отношении гибридизации с комплементарными фрагментами определяется «жесткостью» условий реакции (Sambrook et al., Molecular Cloning and Laboratory Manual, Second Ed., Cold Spring Harbor (1989)). Жесткость гибридизации увеличивается по мере снижения склонности к образованию ДНК-дуплексов. В реакциях гибридизации полинуклеотидов жесткость можно выбирать таким образом, чтобы содействовать специфичным реакциям гибридизации (высокая жесткость), которые можно применять для идентификации, например, полноразмерных клонов из библиотеки. Менее специфичные реакции гибридизации (низкая жесткость) можно применять для идентификации родственных, но не точно соответствующих (гомологичных, но не идентичных) молекул или сегментов ДНК. На стабилизацию ДНК-дуплексов влияют (1) число комплементарных пар оснований; (2) тип пар оснований; (3) концентрация солей (ионная сила) в реакционной смеси; (4) температура реакции и (5) присутствие определенных органических растворителей, таких как формамид, которые снижают стабильность ДНК-дуплекса. Обычно чем длиннее зонд, тем выше температура, необходимая для надлежащего отжига. Общепринятый подход заключается в изменении температуры; более высокие относительные температуры приводят к более жестким условиям реакции. Для гибридизации в «жестких условиях» описаны протоколы гибридизации, в которых полинуклеотиды, на по меньшей мере 60% гомологичные друг другу, остаются гибридизированными. Обычно жесткие условия выбирают таким образом, чтобы температура была приблизительно на 5°C ниже, чем температура точки плавления (Tm) для конкретной последовательности при определенных значениях ионной силы и рН. Tm представляет собой температуру (при определенных значениях ионной силы, рН и концентрации полинуклеотида), при которой 50% зондов, комплементарных указанной последовательности, гибридизируются с указанной последовательностью в равновесном состоянии. Поскольку указанные последовательности обычно присутствуют в избытке, то при Tm 50% зондов заняты в равновесном состоянии.

«Жесткие условия гибридизации» представляют собой условия, которые позволяют зонду, праймеру или олигонуклеотиду гибридизироваться только со своей специфичной последовательностью. Жесткие условия зависят от последовательности и будут различаться. Жесткие условия, как правило, включают: (1) низкую ионную силу и промывки при высокой температуре, например 15 мМ хлорида натрия, 1,5 мМ цитрата натрия, 0,1% додецилсульфата натрия при 50°C; (2) присутствие денатурирующего средства во время гибридизации, например 50% (об./об.) формамида, 0,1% бычьего сывороточного альбумина, 0,1% фиколла, 0,1% поливинилпирролидона, 50 мМ натрий-фосфатного буфера (750 мМ хлорида натрия, 75 мМ цитрата натрия; pH 6,5) при 42°C или (3) 50% формамид. Как правило, промывки также предусматривают 5 x SSC (0,75 M NaCl, 75 мМ цитрата натрия), 50 мМ фосфат натрия (pH 6,8), 0,1% пирофосфат натрия, 5 x раствор Денхардта, ДНК из молок лососевых рыб, подвергнутую ультразвуковой обработке (50 мкг/мл), 0,1% SDS и 10% сульфат декстрана при 42°C с промывкой при 42°C в 0,2 x SSC (хлорид натрия/цитрат натрия) и 50% формамиде при 55°C и последующей промывкой в условиях высокой жесткости, предусматривающей 0,1 x SSC, содержащий EDTA, при 55°C. Условия предпочтительно являются такими, что последовательности, гомологичные друг другу на по меньшей мере приблизительно 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99%, обычно остаются гибридизированными друг с другом.

В «условиях умеренной жесткости» используют растворы для промывки и условия гибридизации, которые являются менее жесткими, так что полинуклеотид гибридизируется со всем полинуклеотидом, его фрагментами, производными или аналогами. Один пример предусматривает гибридизацию в 6 x SSC, 5 x растворе Денхардта, 0,5% SDS и 100 мкг/мл денатурированной ДНК из молок лососевых рыб при 55°C с последующими одной или более промывками в 1 × SSC, 0,1% SDS при 37°C. Температуру, ионную силу и т.д. можно регулировать для обеспечения соответствия экспериментальным факторам, таким как длина зонда. Были описаны другие условия умеренной жесткости (см. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volumes 1-3, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, N.J. (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, Stockton Press, New York, N.Y. (1990); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, 2nd edition, John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1988)).

В «условиях низкой жесткости» используют растворы для промывки и условия гибридизации, которые являются менее жесткими, чем в случае умеренной жесткости, так что полинуклеотид гибридизируется со всем полинуклеотидом, его фрагментами, производными или аналогами. Неограничивающий пример условий гибридизации низкой жесткости предусматривает гибридизацию в 35% формамиде, 5 x SSC, 50 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 5 мМ EDTA, 0,02% PVP, 0,02% фиколле, 0,2% BSA, 100 мкг/мл денатурированной ДНК из молок лососевых рыб, 10% (вес/об.) сульфате декстрана при 40°C с последующими одной или более промывками в 2 x SSC, 25 мМ Tris-HCl (pH 7,4), 5 мМ EDTA и 0,1% SDS при 50°C.

Термин «растение» относится к любому растению на любой стадии его жизненного цикла или развития и его потомкам. В одном варианте осуществления растение представляет собой растение табака, которое относится к растению, принадлежащему к роду Nicotiana. Данный термин включает ссылку на целые растения, органы растений, растительные ткани, ростки растений, семена растений, растительные клетки и их потомство. Растительные клетки включают без ограничения клетки из семян, суспензионных культур, зародышей, участков меристемы, каллюсной ткани, листьев, корней, побегов, гаметофитов, спорофитов, пыльцы и микроспор. Подходящие виды, культивары, гибриды и сорта растений табака описаны в данном документе.

Термины «полинуклеотид», «полинуклеотидная последовательность» или «полинуклеотидный фрагмент» используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к полимеру из РНК или ДНК, который является одно- или двухнитевым и необязательно содержит синтетические, неприродные или измененные нуклеотидные основания. Нуклеотиды (обычно находящиеся в форме их 5'-монофосфата) называют с помощью их однобуквенных обозначений следующим образом: «А» для аденилата или дезоксиаденилата (соответственно для РНК или ДНК), «C» для цитидилата или дезоксицитидилата, «G» для гуанилата или дезоксигуанилата, «U» для уридилата, «T» для дезокситимидилата, «R» для пуринов (A или G), «Y» для пиримидинов (C или T), «K» для G или T, «H» для A, или С, или Т, «I» для инозина и «N» для любого нуклеотида. Полинуклеотид может представлять собой без ограничения геномную ДНК, комплементарную ДНК (кДНК), мРНК или антисмысловую РНК или их фрагмент(фрагменты). Кроме того, полинуклеотид может быть однонитевым или двухнитевым, смесью однонитевых и двухнитевых участков, гибридной молекулой, содержащей ДНК и РНК, или гибридной молекулой со смесью однонитевых и двухнитевых участков или их фрагментом(фрагментами). В дополнение, полинуклеотид может состоять из трехнитевых участков, содержащих ДНК, РНК или их обе или их фрагмент(фрагменты). Полинуклеотид может содержать одно или более модифицированных оснований, таких как фосфотиоаты, и может представлять собой пептидную нуклеиновую кислоту (PNA). Как правило, полинуклеотиды могут быть собраны из выделенных или клонированных фрагментов кДНК, геномной ДНК, олигонуклеотидов или отдельных нуклеотидов или комбинации вышеперечисленного. Хотя полинуклеотиды, описанные в данном документе, показаны в виде последовательностей ДНК, полинуклеотиды включают в себя их соответствующие последовательности РНК и комплементарные им (например, полностью комплементарные) последовательности ДНК или РНК, в том числе последовательности, обратно комплементарные им. Полинуклеотиды по настоящему изобретению представлены в прилагаемом перечне последовательностей.

Термины «полипептид» или «полипептидная последовательность» относятся к полимеру из аминокислот, в котором один или более аминокислотных остатков представляют собой искусственный химический аналог соответствующей встречающейся в природе аминокислоты, а также к встречающимся в природе полимерам из аминокислот. Данные термины также включают модификации, в том числе без ограничения гликозилирование, присоединение липидов, сульфатирование, гамма-карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты, гидроксилирование и ADP-рибозилирование. Полипептиды по настоящему изобретению представлены в прилагаемом перечне последовательностей.

Термин «рекомбинантный», используемый в данном документе, относится к искусственной комбинации из двух в иных случаях разделенных сегментов последовательности, полученной, например, посредством химического синтеза или посредством манипуляции с выделенными сегментами полинуклеотидов с помощью методик генной инженерии. Данный термин также включает ссылку на клетку или вектор, которые были модифицированы путем введения гетерологичного полинуклеотида, или клетку, полученную из модифицированной таким образом клетки, но не охватывает изменение клетки или вектора в результате встречающихся в природе событий (например, в результате спонтанной мутации, естественной трансформации, или трансдукции, или транспозиции), таких как те, которые происходят без преднамеренного вмешательства человека.

Термин «табак» используется в собирательном смысле для обозначения сельскохозяйственных культур табака (например, множества растений табака, выращиваемых в поле, и табака, выращиваемого не методом гидропоники), растений табака и их частей, в том числе без ограничения корней, стеблей, листьев, цветков и семян, подготовленных и/или полученных так, как описано в данном документе. Понятно, что термин «табак» относится к растениям Nicotiana tabacum и продуктам, получаемым из них.

Термин «табачные продукты» относится к потребительским табачным продуктам, в том числе без ограничения к курительным материалам (например, сигаретам, сигарам и трубочному табаку), нюхательному табаку, жевательному табаку, жевательной резинке и леденцам, а также компонентам, материалам и ингредиентам для производства потребительских табачных продуктов. Данные табачные продукты предпочтительно производят из листьев и стеблей табака, собранных с табака и нарезанных, завяленных, высушенных и/или ферментированных в соответствии с общепринятыми методиками получения табака.

Термин «вариант» по отношению к пептиду или полипептиду означает пептид или полипептид, который отличается по последовательности благодаря вставке, делеции или консервативной замене аминокислот, но сохраняет по меньшей мере одну биологическую функцию или форму активности. Вариант также может означать полипептид, который сохраняет по меньшей мере одну биологическую функцию или форму активности. Консервативную замену аминокислоты, т.е. замещение аминокислоты другой аминокислотой со сходными свойствами (например, степенью гидрофильности и распределением заряженных участков), понимают в данной области техники как обычно предусматривающую незначительное изменение.

Термин «сорт» относится к популяции растений, которые обладают постоянными характеристиками, отделяющими их от других растений того же вида. Хотя сорт обладает одним или более отличительными признаками, он дополнительно характеризуется очень небольшой общей изменчивостью между особями в пределах этого сорта. Сорт часто продается на коммерческой основе.

Термин «вектор» относится к полинуклеотидному средству доставки, которое содержит комбинацию компонентов полинуклеотида для обеспечения транспорта полинуклеотидов, полинуклеотидных конструкций и конъюгатов полинуклеотидов и т.п. Вектор может представлять собой вирусный вектор, бактериофаг, искусственную бактериальную хромосому или искусственную хромосому дрожжей. Вектор может представлять собой ДНК- или РНК-вектор. Подходящие векторы включают эписомы, способные к внехромосомной репликации, такие как кольцевые плазмиды из двухнитевой нуклеотидной последовательности; линеаризованные плазмиды из двухнитевой нуклеотидной последовательности и другие векторы любого происхождения.

«Вектор экспрессии», как используется в данном документе, представляет собой полинуклеотидное средство доставки, которое содержит комбинацию компонентов полинуклеотида для обеспечения экспрессии полинуклеотида(полинуклеотидов), полинуклеотидных конструкций и конъюгатов полинуклеотидов и т.п. Подходящие векторы экспрессии включают эписомы, способные к внехромосомной репликации, такие как кольцевые плазмиды из двухнитевой нуклеотидной последовательности; линеаризованные плазмиды из двухнитевой нуклеотидной последовательности и другие функционально эквивалентные векторы экспрессии любого происхождения. Вектор экспрессии содержит по меньшей мере промотор, расположенный выше полинуклеотида, полинуклеотидных конструкций или конъюгата полинуклеотида, определенных ниже, и функционально связанный с ними.

Если в данном документе не определено иное, то научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, будут иметь значения, которые обычно понятны специалистам средней квалификации в данной области. Например, любые системы номенклатуры и методики, используемые в связи с культурами клеток или тканей, молекулярной биологией, иммунологией, микробиологией, генетикой, а также химией и гибридизацией полипептидов и полинуклеотидов, которые описаны в данном документе, хорошо известны и широко применяются в данной области техники. Значение и объем терминов должны быть ясны; однако в случае какой-либо скрытой двусмысленности определения, приведенные в данном документе, имеют преимущественную силу по сравнению с любым словарным или не относящимся к данному документу определением. Кроме того, если иное не требуется по контексту, термины в единственном числе будут включать множественное число, и термины во множественном числе будут включать единственное число.

Термин «редактирование генома» относится к такому изменению эндогенного гена, который кодирует эндогенный полипептид, при котором достигается экспрессия полипептида, представляющего собой усеченный эндогенный полипептид или эндогенный полипептид, имеющий модификацию аминокислоты, такую как замена. Редактирование генома может включать замещение участка эндогенного гена, подлежащего нацеливанию, или замещение всего эндогенного гена копией гена, которая характеризуется наличием усечения или аминокислотной замены, с помощью механизма репарации, такого как репарация, направляемая гомологией. Редактирование генома также может включать создание аминокислотной замены в эндогенном гене посредством создания двухнитевого разрыва в эндогенном гене, который затем репарируется с помощью NHEJ. С помощью NHEJ можно осуществлять добавление или делецию по меньшей мере одной пары оснований в ходе репарации, благодаря чему можно создать аминокислотную замену. Редактирование генома также может включать делецию сегмента гена посредством одновременного действия двух нуклеаз на одну и ту же нить ДНК для осуществления усечения между двумя сайтами-мишенями для нуклеаз и репарации разрыва ДНК с помощью NHEJ.

Термины «репарация, направляемая гомологией» или «HDR» относятся к механизму репарации двухнитевых повреждений ДНК в клетках в случае присутствия в ядре гомологичного фрагмента ДНК, главным образом в G2- и S-фазе клеточного цикла. В ходе HDR используется донорная ДНК или донорная матрица для направления репарации, и ее можно применять для создания конкретных изменений последовательностей в геноме, в том числе для целенаправленного добавления целых генов. Если донорная матрица предоставляется вместе с сайт-специфичной нуклеазой, то клеточный аппарат будет репарировать разрыв с помощью гомологичной рекомбинации, которая усиливается по величине на несколько порядков при наличии расщепления ДНК. Если гомологичный фрагмент ДНК отсутствует, то вместо этого может происходить NHEJ.

Термин «путь негомологичного соединения концов (NHEJ)», используемый в данном документе, относится к пути, посредством которого происходит репарация двухнитевых разрывов в ДНК путем прямого лигирования концов разрывов без необходимости в гомологичной матрице. Независимое от матрицы повторное лигирование концов ДНК посредством NHEJ является стохастическим, подверженным ошибкам процессом репарации, в ходе которого в точку разрыва ДНК вводятся случайные микровставки и микроделеции (вставки/делеции). Данный способ можно применять для преднамеренного разрушения, делеции или изменения рамки считывания в последовательностях генов-мишеней. Как правило, в ходе NHEJ используются короткие гомологичные последовательности ДНК, называемые микрогомологами, для направления репарации. Эти микрогомологи часто присутствуют в однонитевых выступах на концах двухнитевых разрывов. Если выступы полностью совместимы, то в ходе NHEJ обычно происходит точная репарация разрыва, хотя может иметь место также неточная репарация, приводящая к потере нуклеотидов, однако гораздо более распространены случаи, когда выступы несовместимы.

Термин «сайт-специфичная нуклеаза» относится к ферменту, способному к специфичному распознаванию и расщеплению последовательностей ДНК. Сайт-специфичная нуклеаза может быть сконструированной. Примеры сконструированных сайт-специфичных нуклеаз включают нуклеазы с «цинковыми пальцами» (ZFN), TAL-эффекторные нуклеазы (TALEN), системы на основе CRISPR/Cas9 и мегануклеазы.

Термин «эффектор, подобный активаторам транскрипции» или «TALE» относится к полипептидной структуре, которая распознает определенную последовательность ДНК и связывается с ней. Термин «ДНК-связывающий домен TALE» относится к ДНК-связывающему домену, который содержит массив тандемных повторов из 33-35 аминокислот, также известных как RVD-модули, каждый из которых специфично распознает одну пару оснований ДНК. RVD-модули могут располагаться в любом порядке, собираясь в массив, который распознает определенную последовательность. Специфичность связывания ДНК-связывающего домена TALE определяется массивом RVD, за которым расположен один усеченный повтор из 20 аминокислот. ДНК-связывающий домен TALE может иметь от 12 до 27 RVD-модулей, каждый из которых содержит RVD и распознает одну пару оснований ДНК. Были идентифицированы специфичные RVD, которые распознают каждый из четырех возможных нуклеотидов ДНК (А, Т, С и G). Поскольку ДНК-связывающие домены TALE являются модульными, то повторы, которые распознают четыре разных нуклеотида ДНК, можно связать друг с другом для распознавания любой конкретной последовательности ДНК. Эти нацеленные ДНК-связывающие домены можно затем объединить с каталитическими доменами для создания функциональных ферментов, в том числе искусственных факторов транскрипции, метилтрансфераз, интеграз, нуклеаз и рекомбиназ.

Термины «эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции» или «TALEN», используемые в данном документе взаимозаменяемо, относятся к сконструированным слитым полипептидам на основе каталитического домена нуклеазы, такой как эндонуклеаза FokI, и разработанного ДНК-связывающего домена TALE, который может быть нацелен на специально синтезированную ДНК-последовательность.

Термин «мономер TALEN» относится к сконструированному слитому полипептиду с каталитическим доменом нуклеазы и разработанным ДНК-связывающим доменом TALE. Два мономера TALEN могут быть разработаны таким образом, чтобы они нацеливались на участок, являющийся мишенью для TALEN, и расщепляли его.

Термин «цинковый палец» относится к полипептидной структуре, которая распознает последовательности ДНК и связывается с ними. Домен типа «цинкового пальца» является наиболее распространенным ДНК-связывающим мотивом в протеоме человека. Один домен типа «цинкового пальца» содержит примерно 30 аминокислот и обычно функционирует путем связывания с 3 последовательными парами оснований ДНК посредством взаимодействий одной боковой цепи аминокислоты с каждой парой оснований.

Термин «нуклеаза с «цинковыми пальцами»» или «ZFN» относится к химерной молекуле полипептида, содержащей по меньшей мере один ДНК-связывающий домен типа «цинкового пальца», эффективно связанный с по меньшей мере одной нуклеазой или частью нуклеазы, способной в полностью собранном виде расщеплять ДНК.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

В одном аспекте предусмотрена выделенная полинуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид нитратредуктазу, содержащий непрерывную полипептидную последовательность под SEQ ID NO: 5, где метионин заменен аминокислотой, которая уменьшает активность нитратредуктазы по сравнению с контрольной растительной клеткой.

Полипептид нитратредуктаза предпочтительно содержит непрерывную полипептидную последовательность под SEQ ID NO: 7, где метионин заменен аминокислотой, которая уменьшает активность нитратредуктазы по сравнению с контрольной растительной клеткой.

Выделенная полинуклеотидная последовательность предпочтительно кодирует полипептид нитратредуктазу, в котором метионин заменен другой аминокислотой, предпочтительно алифатической неполярной аминокислотой, более предпочтительно изолейцином.

Алифатическая неполярная аминокислота предпочтительно выбрана из группы аминокислот, состоящей из глицина, аланина, пролина, изолейцина, лейцина или валина.

Алифатическая неполярная аминокислота предпочтительно представляет собой изолейцин. Согласно данному варианту осуществления нитратредуктаза содержит непрерывную полипептидную последовательность с заменой под SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8.

Выделенная полинуклеотидная последовательность предпочтительно кодирует полипептид нитратредуктазу, содержащий последовательность с аминокислотной заменой в положении, соответствующем положению 527 в последовательности, характеризующейся по меньшей мере 80% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1, состоящий из нее или по сути состоящий из нее.

Выделенная полинуклеотидная последовательность предпочтительно кодирует полипептид нитратредуктазу, содержащий последовательность, представленную под SEQ ID NO: 3, состоящий из нее или по сути состоящий из нее.

Выделенная полинуклеотидная последовательность предпочтительно содержит последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 80% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2, состоит из нее или по сути состоит из нее.

Полинуклеотидная последовательность предпочтительно содержит полинуклеотидную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 4, состоит из нее или по сути состоит из нее.

Иллюстративная мутация по типу замены согласно настоящему изобретению представлена в таблице 1.

В определенных вариантах осуществления полинуклеотидная последовательность содержит последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 80% идентичностью последовательности с любой из последовательностей, описанных в данном документе, включая любой из полинуклеотидов, показанных в перечне последовательностей, состоит из нее или по сути состоит из нее. Выделенный полинуклеотид предпочтительно содержит последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности с ними, состоит из нее или по сути состоит из нее.

Полинуклеотид(полинуклеотиды), описанный(описанные) в данном документе, предпочтительно кодирует(кодируют) активный полипептид нитратредуктазу, который характеризуется по меньшей мере приблизительно 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% уровнем функции или активности по сравнению с полипептидом(полипептидами), показанным(показанными) в перечне последовательностей.

В другом варианте осуществления предусмотрены полинуклеотидные фрагменты под SEQ ID NO: 4, кодирующие полипептидную последовательность, содержащую мутацию M527I, с существенной степенью гомологии (т. е. сходством последовательности) или существенной степенью идентичности с ними, которые характеризуются по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% или 100% идентичностью последовательности с соответствующими фрагментами под SEQ ID NO: 4.

Также раскрыты фрагменты полинуклеотидов, в которые внедрена(внедрены) мутация(мутации), описанная(описанные) в данном документе. Полинуклеотидные фрагменты, как правило, содержат по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 50, по меньшей мере 100 или по меньшей мере 200 смежных нуклеотидов.

Полинуклеотид, описанный в данном документе, может включать в себя полимер из нуклеотидов, который может представлять собой немодифицированную или модифицированную дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) или рибонуклеиновую кислоту (РНК). Соответственно, полинуклеотид может представлять собой без ограничения геномную ДНК, комплементарную ДНК (кДНК), мРНК или антисмысловую РНК или их фрагмент(фрагменты) или усеченную(усеченные) форму(формы). Кроме того, полинуклеотид может представлять собой однонитевую или двухнитевую ДНК, ДНК, которая является смесью однонитевых и двухнитевых участков, гибридную молекулу, содержащую ДНК и РНК, или гибридную молекулу со смесью однонитевых и двухнитевых участков или их фрагмент(фрагменты). В дополнение, полинуклеотид может состоять из трехнитевых участков, содержащих ДНК, РНК или их обе или их фрагмент(фрагменты). Как правило, полинуклеотиды могут быть собраны из выделенных или клонированных фрагментов кДНК, геномной ДНК, олигонуклеотидов или отдельных нуклеотидов или комбинации вышеперечисленного. Хотя полинуклеотиды, описанные в данном документе, показаны в виде последовательностей ДНК, они включают в себя их соответствующие последовательности РНК и комплементарные им (например, полностью комплементарные) последовательности ДНК или РНК, в том числе последовательности, обратно комплементарные им.

Полинуклеотид, описанный в данном документе, обычно содержит фосфодиэфирные связи. Другие аналоги полинуклеотидов включают полинуклеотиды с положительно заряженными остовами, неионогенными остовами и безрибозными остовами. Модификации рибозофосфатного остова можно осуществлять по целому ряду причин, например, для увеличения стабильности и периода полужизни таких молекул в физиологических средах или в качестве зондов на биочипе. Можно получать смеси встречающихся в природе полинуклеотидов и их аналогов; в качестве альтернативы, можно получать смеси разных аналогов полинуклеотидов и смеси встречающихся в природе полинуклеотидов и их аналогов.

Аналоги полинуклеотидов могут включать в себя аналоги с положительно заряженными остовами, неионогенными остовами и безрибозными остовами. Полинуклеотиды, содержащие один или более карбоциклических сахаров, также включены.

Другие аналоги включают в себя пептидные полинуклеотиды, которые являются пептидными аналогами полинуклеотидов. Их остовы являются по существу неионогенными в нейтральных условиях в отличие от высокозаряженного фосфодиэфирного остова встречающихся в природе полинуклеотидов. Это может давать преимущества. Во-первых, пептидный остов полинуклеотида может демонстрировать улучшенные кинетические характеристики гибридизации. Пептидные полинуклеотиды характеризуются более значительными изменениями температуры плавления в случае наличия несовпадающих пар оснований по сравнению с абсолютно совпадающими парами оснований. ДНК и РНК, как правило, демонстрируют понижение температуры плавления на 2-4 C при наличии внутреннего несовпадения. В случае с неионогенным пептидным остовом полинуклеотида понижение является более близким к 7-9°C. Аналогичным образом, гибридизация оснований, присоединенных к этим остовам, вследствие их неионогенной природы является относительно нечувствительной к концентрации солей. В дополнение, пептидные полинуклеотиды могут не разрушаться или разрушаться в меньшей степени клеточными ферментами и, таким образом, могут быть более стабильными.

В числе путей применения раскрытых полинуклеотидов и их фрагментов находится применение фрагментов в качестве зондов в анализах гибридизации или в качестве праймеров для применения в анализах амплификации. Такие фрагменты обычно содержат по меньшей мере приблизительно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 или больше смежных нуклеотидов в последовательности ДНК. В других вариантах осуществления фрагмент ДНК содержит по меньшей мере приблизительно 10, 15, 20, 30, 40, 50 или 60 или больше смежных нуклеотидов в последовательности ДНК. Таким образом, в одном аспекте также предусмотрен способ выявления полинуклеотида, включающий применение зондов или праймеров или того и другого. Иллюстративные праймеры описаны в данном документе.

Основные параметры, влияющие на выбор условий гибридизации, и руководство для разработки подходящих условий описаны в Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Используя сведения о генетическом коде в сочетании с полипептидными последовательностями, описанными в данном документе, можно получить наборы вырожденных олигонуклеотидов. Такие олигонуклеотиды применимы в качестве праймеров, например, в полимеразных цепных реакциях (ПЦР), с помощью которых выделяют и амплифицируют фрагменты ДНК. В определенных вариантах осуществления вырожденные праймеры можно применять в качестве зондов для генетических библиотек. Такие библиотеки включают библиотеки кДНК, геномные библиотеки и даже электронные библиотеки экспрессируемых меток последовательностей или ДНК. Гомологичные последовательности, идентифицированные этим способом, могут затем быть использованы в качестве зондов для идентификации гомологов последовательностей, указанных в данном документе.

Также потенциально применимыми являются полинуклеотиды и олигонуклеотиды (например, праймеры или зонды), которые гибридизируются в условиях сниженной жесткости, как правило, в условиях умеренной жесткости и обычно в условиях высокой жесткости с полинуклеотидом(полинуклеотидами), описанным(описанными) в данном документе. Основные параметры, влияющие на выбор условий гибридизации, и руководство для разработки подходящих условий изложены в Sambrook J., E.F. Fritsch and T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) и могут быть легко определены специалистами средней квалификации в данной области, исходя из, например, длины или состава оснований полинуклеотида.

В данном документе определен один способ достижения условий умеренной и высокой жесткости. Следует понимать, что температуру промывки и концентрацию солей при промывке при необходимости можно корректировать для достижения необходимой степени жесткости посредством применения основных принципов, которые управляют реакциями гибридизации и стабильностью дуплексов, как это известно специалистам в данной области и дополнительно описано ниже (см., например, Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y)). При гибридизации полинуклеотида с полинуклеотидом с неизвестной последовательностью предполагается, что длина гибрида будет такой, как у гибридизирующегося полинуклеотида. При гибридизации полинуклеотидов с известными последовательностями длина гибрида может быть определена путем выравнивания последовательностей полинуклеотидов и идентификации участка или участков с оптимальной комплементарностью последовательности. Температура гибридизации для гибридов, длина которых предположительно составляет менее 50 пар оснований, должна быть на 5-10 C меньше, чем температура плавления гибрида, где температуру плавления определяют в соответствии со следующими уравнениями. Для гибридов, длина которых составляет менее 18 пар оснований, температура плавления (°С) = 2(число оснований А+Т)+4(число оснований G+C). Для гибридов, длина которых составляет более 18 пар оснований, температура плавления (°C) = 81,5+16,6(log10 [Na+])+0,41(% G+C)-(600/N), где N представляет собой число оснований в гибриде, и [Na+] представляет собой концентрацию ионов натрия в буфере для гибридизации ([Na+] для 1x стандартного цитрата натрия = 0,165 M). Как правило, каждый такой гибридизирующийся полинуклеотид имеет длину, которая составляет по меньшей мере 25% (обычно по меньшей мере 50%, 60% или 70% и наиболее часто по меньшей мере 80%) от длины полинуклеотида, с которым он гибридизируется, и характеризуется по меньшей мере 60% идентичностью последовательности (например, по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) с полинуклеотидом, с которым он гибридизируется.

Как будет понятно специалисту в данной области, линейная ДНК имеет две возможные ориентации: направление 5'-3' и направление 3'-5'. Например, если первая последовательность расположена в направлении 5'-3', и если вторая последовательность расположена в направлении 5'-3' в одной и той же молекуле/нити полинуклеотида, то первая последовательность и вторая последовательность ориентированы в одном направлении или имеют одинаковую ориентацию. Как правило, последовательность промотора и ген, представляющий интерес, находящийся под контролем данного промотора, расположены в одинаковой ориентации. Однако если по отношению к первой последовательности, расположенной в направлении 5'-3', вторая последовательность расположена в направлении 3'-5' в одной и той же молекуле/нити полинуклеотида, то первая последовательность и вторая последовательность ориентированы в антисмысловом направлении или имеют антисмысловую ориентацию. Две последовательности, имеющие антисмысловые ориентации по отношению друг к другу, могут быть в качестве альтернативы описаны как имеющие одинаковую ориентацию, если первая последовательность (направление 5'-3') и последовательность, обратно комплементарная первой последовательности (первой последовательности, расположенной в 5'-3'), расположены в одной и той же молекуле/нити полинуклеотида. Последовательности, представленные в данном документе, показаны в направлении 5'-3'.

Также представлены векторы, содержащие рекомбинантные полинуклеотидные конструкции, такие как описанные в данном документе. Подходящие остовы векторов включают, например, те, которые обычно используются в данной области техники, такие как плазмиды, вирусы, искусственные хромосомы, искусственные бактериальные хромосомы, искусственные хромосомы дрожжей или искусственные хромосомы бактериофагов. Подходящие векторы экспрессии включают без ограничения плазмиды и вирусные векторы, полученные из, например, бактериофага, бакуловирусов и ретровирусов. Многочисленные векторы и системы экспрессии являются коммерчески доступными.

В одном аспекте предусмотрен выделенный полипептид, содержащий полипептид, характеризующийся по меньшей мере 80% идентичностью последовательности с любым из полипептидов, описанных в данном документе, в том числе с любым из полипептидов, показанных в перечне последовательностей, состоящий из него или по сути состоящий из него. Выделенный полипептид предпочтительно содержит последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% или 100% идентичностью последовательности с ними, состоит из нее или по сути состоит из нее.

В другом аспекте раскрыта полипептидная последовательность, кодируемая полинуклеотидной последовательностью, описанной в данном документе.

В другом аспекте раскрыт полипептид нитратредуктаза, содержащий непрерывную полипептидную последовательность под SEQ ID NO: 5, где метионин заменен аминокислотой, которая уменьшает активность нитратредуктазы по сравнению с контрольной растительной клеткой. Последовательность SEQ ID NO: 5 выступает в качестве сайта распознавания для связывания киназы нитратредуктазы, отвечающей за фосфорилирование аминокислоты S523 в NtNIA2.

Нитратредуктаза предпочтительно содержит непрерывную полипептидную последовательность под SEQ ID NO: 7, где метионин заменен аминокислотой, которая уменьшает активность нитратредуктазы по сравнению с контрольной растительной клеткой.

Метионин предпочтительно заменен другой аминокислотой, такой как алифатическая неполярная аминокислота, которая может быть выбрана из группы аминокислот, состоящей из глицина, аланина, пролина, изолейцина, лейцина или валина.

Алифатическая неполярная аминокислота предпочтительно представляет собой I. Согласно данному варианту осуществления нитратредуктаза содержит непрерывную полипептидную последовательность под SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8.

Полипептид нитратредуктаза предпочтительно содержит последовательность с аминокислотной заменой в положении, соответствующем положению 527 в последовательности, характеризующейся по меньшей мере 80% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1, состоит из нее или по сути состоит из нее.

Полипептид нитратредуктаза предпочтительно содержит последовательность с аминокислотной заменой M527I в последовательности, характеризующейся по меньшей мере 80% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1, состоит из нее или по сути состоит из нее.

Полипептид нитратредуктаза предпочтительно содержит последовательность, представленную под SEQ ID NO: 3, состоит из нее или по сути состоит из нее.

Также раскрыты фрагменты полипептидов, в которые внедрена(внедрены) мутация(мутации), описанная(описанные) в данном документе. Как правило, фрагменты полипептида(полипептидов) в некоторой степени или полностью сохраняют функцию или активность полноразмерной последовательности. Как правило, полипептидные фрагменты содержат по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 50, по меньшей мере 100 или по меньшей мере 200 смежных аминокислот. Полипептиды, раскрытые в данном документе, содержат по меньшей мере одну мутацию, полученную посредством введения одного или более изменений любого типа, которые могут быть выделены естественным образом. Функция или активность полипептида нитратредуктазы, в состав которого включена(включены) мутация(мутации), предпочтительно модулируется (например, уменьшается) благодаря введению мутации. Мутация предпочтительно представляет собой замену. Замена относится к замещению по меньшей мере одной аминокислоты полипептида нитратредуктазы другой аминокислотой, обладающей сходными свойствами (такими как сходная гидрофобность, гидрофильность, антигенность, склонность к образованию или разрушению альфа-спиральных структур или β-складчатых структур и т. п.).

Мутация предпочтительно представляет собой замену метионина в непрерывной полипептидной последовательности SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7, в которой метионин заменен аминокислотой, при этом растение, несущее замену, обладает уменьшенной активностью нитратредуктазы по сравнению с контрольным растением. В одном варианте осуществления метионин заменен алифатической неполярной аминокислотой, такой как глицин, аланин, пролин, изолейцин, лейцин или валин. В одном варианте осуществления алифатическая неполярная аминокислота представляет собой изолейцин, и тогда непрерывная полипептидная последовательность предпочтительно представляет собой SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8. В одном варианте осуществления замена представляет собой M527I. Иллюстративная полипептидная последовательность нитратредуктазы, несущая мутацию M527I, представляет собой SEQ ID NO: 3.

Раскрыты растение или растительная клетка, содержащие или несущие мутацию в одном или более полинуклеотидах или полипептидах, описанных в данном документе, где указанная мутация приводит к модулированию функции или активности нитратредуктазы. Мутации, описанные в данном документе, могут включать мутации, внесенные человеком, или синтетические мутации. Мутации в полинуклеотидах и полипептидах, описанных в данном документе, могут представлять собой мутации, полученные или получаемые посредством способа, включающего стадию манипуляции in vitro или in vivo. Мутации в полинуклеотидах и полипептидах, описанных в данном документе, могут представлять собой мутации, полученные или получаемые посредством способа, включающего вмешательство человека. Предусмотрен способ модулирования уровня полипептида в (высушенном) растении или в (высушенном) растительном материале, при этом указанный способ включает введение в геном указанного растения одной или более мутаций, которые модулируют экспрессию по меньшей мере одного гена, где указанная по меньшей мере одна мутация выбрана из мутаций в последовательностях согласно настоящему изобретению, как, например, M527I. Ген предпочтительно кодирует полипептид нитратредуктазу Nicotiana tabacum, описанный в данном документе.

Также раскрыты растение или растительная клетка, которые являются гетерозиготными или гомозиготными по одной или более мутациям согласно настоящему изобретению, при этом указанная мутация приводит к модулированию экспрессии гена или функции или активности полипептида, кодируемого им.

Функция или активность одного или более полипептидов по настоящему изобретению в растении является увеличенной или сниженной, если функция или активность является более низкой или более высокой, чем функция или активность того(тех) же полипептида(полипептидов) в растении, которое не было модифицировано для подавления функции или активности этого полипептида и которое было культивировано, собрано и высушено с использованием тех же протоколов.

Также раскрыты способы получения мутантных полинуклеотидов и полипептидов, описанных в данном документе. Растение, представляющее интерес, такое как табак, в том числе растительную клетку или растительный материал, можно генетически модифицировать с помощью различных способов, которые, как известно, индуцируют мутагенез, включающих сайт-направленный мутагенез, олигонуклеотид-направленный мутагенез, мутагенез, индуцируемый химическими соединениями, мутагенез, индуцируемый облучением, мутагенез с использованием модифицированных оснований, мутагенез с использованием ДНК-дуплекса с гэпами, мутагенез, индуцируемый двухнитевыми разрывами, мутагенез с использованием штаммов-хозяев с дефектом репарации, мутагенез посредством полного синтеза гена, перетасовку ДНК и другие способы, обсуждаемые ниже.

Способы, с помощью которых вводят мутации в полинуклеотид случайным образом, могут включать химический мутагенез и радиационный мутагенез. Химический мутагенез предусматривает применение добавляемых экзогенно химических веществ, таких как мутагенные, тератогенные или канцерогенные органические соединения, для индуцирования мутаций. Для создания мутаций можно применять мутагены, которые создают главным образом точечные мутации и короткие делеции, вставки, миссенс-мутации, простые повторяющиеся последовательности, трансверсии и/или транзиции, в том числе химические мутагены или излучение. Мутагены включают этилметансульфонат, метилметансульфонат, N-этил-N-нитрозомочевину, триэтилмеламин, N-метил-N-нитрозомочевину, прокарбазин, хлорамбуцил, циклофосфамид, диэтилсульфат, акриламидный мономер, мелфалан, азотистый иприт, винкристин, диметилнитрозамин, N-метил-N'-нитронитрозогуанидин, нитрозогуанидин, 2-аминопурин, 7,12-диметилбенз(a)антрацен, этиленоксид, гексаметилфосфорамид, бисульфан, диэпоксиалканы (диэпоксиоктан, диэпоксибутан и т.п.), 2-метокси-6-хлор-9[3-(этил-2-хлорэтил)аминопропиламино]акридина дигидрохлорид и формальдегид.

Способы, с помощью которых вводят одну или более целенаправленных мутаций в полинуклеотидную последовательность, включают без ограничения технологию редактирования генома, в частности, мутагенез, опосредованный нуклеазой с «цинковыми пальцами», TILLING (целенаправленный поиск индуцированных локальных повреждений в геномах), гомологичную рекомбинацию, олигонуклеотид-направленный мутагенез и мутагенез, опосредованный мегануклеазой.

Полипептиды с «цинковыми пальцами» можно применять для введения одной или более целенаправленных мутаций в полинуклеотидную последовательность. В различных вариантах осуществления последовательность геномной ДНК, содержащую часть кодирующей последовательности полинуклеотида или ее всю, модифицируют путем мутагенеза, опосредованного нуклеазой с «цинковыми пальцами». В последовательности геномной ДНК осуществляют поиск уникального сайта для связывания полипептида с «цинковыми пальцами». В качестве альтернативы, в последовательности геномной ДНК осуществляют поиск двух уникальных сайтов для связывания полипептида с «цинковыми пальцами», при этом оба сайта находятся на противоположных нитях и близко друг к другу, например, на расстоянии 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более пар оснований друг от друга. Соответственно, предусмотрены полипептиды с «цинковыми пальцами», которые связываются с полинуклеотидами. Полипептид с «цинковыми пальцами» можно сконструировать для распознавания выбранного сайта-мишени в гене. Полипептид с «цинковыми пальцами» может содержать любую комбинацию мотивов, полученных из природных ДНК-связывающих доменов типа «цинковых пальцев» и неприродных ДНК-связывающих доменов типа «цинковых пальцев» посредством усечения, или удлинения, или способа сайт-направленного мутагенеза в сочетании со способом отбора, таким как без ограничения отбор с помощью фагового дисплея, отбор с помощью бактериальной двугибридной системы или отбор с помощью бактериальной одногибридной системы. Термин «неприродный ДНК-связывающий домен типа «цинкового пальца»» относится к ДНК-связывающему домену типа «цинкового пальца», который связывает последовательность из трех пар оснований в полинуклеотиде-мишени и который не встречается в клетке или организме, содержащих полинуклеотид, который подлежит модификации. Способы разработки полипептида с «цинковыми пальцами», который связывает специфические полинуклеотиды, являющиеся уникальными для гена-мишени, известны из уровня техники. Способы доставки полипептида с «цинковыми пальцами» и нуклеазы с «цинковыми пальцами» в растение аналогичны способам, описанным ниже для доставки мегануклеазы.

Мегануклеазы, такие как I-CreI, можно применять для введения одной или более целенаправленных мутаций в полинуклеотидную последовательность. Встречающиеся в природе мегануклеазы, а также рекомбинантные мегануклеазы можно применять для специфичного осуществления двухнитевого разрыва в одном сайте или в относительно небольшом количестве сайтов в геномной ДНК растения для обеспечения разрушения одного или более полинуклеотидов, описанных в данном документе. Мегануклеаза может представлять собой сконструированную мегануклеазу с измененными свойствами распознавания ДНК. Полипептиды мегануклеазы можно доставлять в растительные клетки с помощью ряда разных механизмов, известных из уровня техники. Мегануклеазы можно применять для расщепления по сайтам распознавания мегануклеазами в кодирующих участках полинуклеотида. Такое расщепление часто приводит к делеции ДНК в сайте распознавания мегануклеазой с последующей мутагенной репарацией ДНК путем негомологичного соединения концов. Такие мутации в кодирующей последовательности гена являются, как правило, достаточными для инактивации гена. Этот способ модификации растительной клетки предусматривает, во-первых, доставку кассеты экспрессии мегануклеазы в растительную клетку с помощью подходящего способа трансформации. Для достижения наиболее высокой эффективности необходимо связать кассету экспрессии мегануклеазы с селектируемым маркером и отобрать успешно трансформированные клетки в присутствии селективного средства. Этот подход приводит к интеграции кассеты экспрессии мегануклеазы в геном, что, однако, может быть нежелательным, если для растения, вероятно, будет требоваться разрешение контролирующего органа. В таких случаях кассету экспрессии мегануклеазы (и связанный селектируемый маркерный ген) можно устранить путем сегрегации в последующих поколениях растений с помощью общепринятых методик селекции. После доставки кассеты экспрессии мегануклеазы растительные клетки выращивают изначально в условиях, которые являются типичными для конкретной процедуры трансформации, которую применяли. Это может означать выращивание трансформированных клеток на среде при температуре ниже 26°C, зачастую в темноте. Такие стандартные условия можно применять в течение некоторого периода времени, предпочтительно 1-4 дней, для обеспечения восстановления растительной клетки после процесса трансформации. В любой момент после этого начального периода восстановления температуру роста можно повысить, чтобы стимулировать функцию сконструированной мегануклеазы, заключающуюся в расщеплении и осуществлении мутации по сайту распознавания мегануклеазой.

Один способ редактирования генома предусматривает применение эффекторных нуклеаз, подобных активаторам транскрипции (TALEN), которые индуцируют образование двухнитевых разрывов, на которые клетка может отвечать посредством механизмов репарации. NHEJ обеспечивает воссоединение ДНК по обе стороны от двухнитевого разрыва, где перекрывание последовательностей для отжига является очень небольшим или вовсе отсутствует. Этот механизм репарации индуцирует ошибки в геноме посредством вставки, или делеции, или хромосомной перестройки. Любые такие ошибки могут сделать продукты гена, закодированные в этом местоположении, нефункциональными. Для определенных путей применения может быть необходимым точное удаление полинуклеотида из генома растения. Такие пути применения возможны при использовании пары сконструированных мегануклеаз, каждая из которых расщепляет сайт распознавания мегануклеазой по обе стороны от предполагаемой делеции. Также можно применять TALEN, которые способны распознавать ген и связываться с ним и вводить двухнитевой разрыв в геном.

Другой способ редактирования генома предусматривает применение бактериальной системы CRISPR/Cas. Бактерии и археи характеризуются наличием хромосомных элементов, называемых короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами (CRISPR), которые являются частью адаптивной иммунной системы, защищающей от проникновения вирусной и плазмидной ДНК. В системах CRISPR II типа CRISPR-РНК (crRNA) функционируют совместно с трансактивирующей crRNA (tracrRNA) и CRISPR-ассоциированными (Cas) полипептидами для введения двухнитевых разрывов в ДНК-мишень. Для расщепления мишени с помощью Cas9 требуется спаривание оснований crRNA и tracrRNA, а также спаривание оснований crRNA и ДНК-мишени. Распознавание мишени облегчается при наличии короткого мотива, называемого мотивом, прилегающим к протоспейсеру (PAM), который соответствует последовательности NGG. Данную систему можно применять для редактирования генома. Cas9 обычно программируется двойной РНК, состоящей из crRNA и tracrRNA. Тем не менее, ключевые компоненты этих РНК могут быть объединены в единую гибридную «направляющую РНК» для нацеливания Cas9. Использование некодирующей направляющей РНК для нацеливания на ДНК с целью сайт-специфического расщепления обещает быть значительно более простым, чем существующие технологии, такие как TALEN. При применении стратегии CRISPR/Cas для перенацеливания нуклеазного комплекса требуется только введение новой последовательности РНК, и нет необходимости в переконструировании специфичности полипептидных факторов транскрипции. Технологию CRISPR/Cas реализовывали в растениях в способе согласно международной заявке WO2015/189693, в которой раскрыта платформа для опосредованного вирусом редактирования генома, которая является широко применимой для различных видов растений. Геномная РНК-2 вируса погремковости табака (TRV) была сконструирована для переноса и доставки направляющей РНК в растения Nicotiana benthamiana, сверхэкспрессирующие эндонуклеазу Cas9. В контексте настоящего изобретения направляющая РНК может быть получена из любой из последовательностей, раскрытых в данном документе, и идей из WO2015/189693, применяемых для редактирования генома растительной клетки и получения необходимого мутантного растения. Высокий темп развития технологии обеспечил появление большого разнообразия протоколов с широкими возможностями применения в растениях, которые были хорошо классифицированы в ряде недавних научных обзорных статей (например, Plant Methods (2016) 12:8 и Front Plant Sci. (2016) 7:506). Обзор систем CRISPR/Cas с особым акцентом на их применении описан в Biotechnology Advances (2015) 33, 1, 41-52. Более поздние разработки в отношении применения CRISPR/Cas для манипуляций с геномами растений обсуждаются в Acta Pharmaceutica Sinica B (2017) 7, 3, 292-302 и Curr. Op. in Plant Biol. (2017) 36, 1-8. Плазмиды CRISPR/Cas9 для применения в растениях перечислены в «Addgene», некоммерческом депозитарии плазмид (addgene.org), и плазмиды CRISPR/Cas являются коммерчески доступными.

Одну или более введенных мутаций, таких как мутация, описанная в данном документе, можно идентифицировать или отбирать с помощью способов, известных специалистам в данной области, таких как Саузерн-блот-анализ, секвенирование ДНК, ПЦР-анализ или фенотипический анализ. Мутации, которые влияют на экспрессию гена или которые препятствуют функции кодируемого полипептида, можно определять с помощью способов, хорошо известных из уровня техники.

Растения или растительные клетки согласно настоящему изобретению содержат описанную мутацию и необязательно любую комбинацию одной или более дополнительных мутаций в одном или более генах. Например, растения или растительные клетки могут содержать одну мутацию в одном гене; несколько мутаций в одном гене; одну мутацию в двух или более, или трех или более, или четырех или более генах; или несколько мутаций в двух или более, или трех или более, или четырех или более генах. Пример одной такой мутации описан в данном документе.

В одном варианте осуществления семена растений подвергают мутагенезу, и затем из них выращивают мутантные растения первого поколения. Затем обеспечивают возможность самоопыления растений первого поколения, и из семян от растения первого поколения выращивают растения второго поколения, которые затем подвергают скринингу в отношении мутаций, таких как мутация, описанная в данном документе, в их локусах. Хотя подвергнутый мутагенезу растительный материал можно подвергнуть скринингу в отношении мутаций, преимуществом скрининга растений второго поколения является то, что все соматические мутации соответствуют герминативным мутациям. Специалисту в данной области будет понятно, что ряд растительных материалов, в том числе без ограничения семена, пыльцу, растительную ткань или растительные клетки, можно подвергнуть мутагенезу для создания мутантных растений. Однако тип растительного материала, подвергнутого мутагенезу, может иметь значение, когда полинуклеотид растения подвергают скринингу в отношении мутаций. Например, если пыльцу подвергают мутагенезу до опыления растения, не подвергнутого мутагенезу, то из семян, полученных в результате этого опыления, выращивают растения первого поколения. Каждая клетка растений первого поколения будет содержать мутации, созданные в пыльце; таким образом, эти растения первого поколения можно затем подвергнуть скринингу в отношении мутаций вместо того, чтобы ждать появления второго поколения.

Полинуклеотиды, полученные из отдельных растений, растительных клеток или растительного материала, можно необязательно объединить, чтобы ускорить скрининг в отношении по меньшей мере мутации, описанной в данном документе, в популяции растений, происходящих из подвергнутых мутагенезу растительных ткани, клеток или материала. Можно подвергнуть скринингу одно или более последующих поколений растений, растительных клеток или растительного материала. Размер необязательно объединенной группы зависит от чувствительности применяемого способа скрининга.

После необязательного объединения образцов, их можно подвергнуть анализу с помощью методик амплификации, специфичной в отношении полинуклеотида, таких как ПЦР. Любые один или более праймеров или зондов, специфичных в отношении гена или последовательностей, непосредственно прилегающих к гену, можно использовать для амплификации последовательностей в необязательно объединенном образце. Для амплификации участков локуса, в которых с наибольшей вероятностью возникают полезные мутации, предпочтительно разрабатывают один или более праймеров или зондов. Праймер наиболее предпочтительно разрабатывают для выявления мутаций в участках полинуклеотида. Дополнительно, для праймера(праймеров) и зонда(зондов) предпочтительным является избегание известных полиморфных сайтов для облегчения скрининга в отношении точечных мутаций. Для облегчения выявления продуктов амплификации один или более праймеров или зондов можно метить с помощью любого общепринятого способа мечения. Праймер(праймеры) или зонд(зонды) можно разрабатывать на основе последовательностей, описанных в данном документе, с помощью способов, хорошо известных из уровня техники.

Для облегчения выявления продуктов амплификации праймер(праймеры) или зонд(зонды) можно метить с помощью любого общепринятого способа мечения. Их можно разрабатывать на основе последовательностей, описанных в данном документе, с помощью способов, хорошо известных из уровня техники.

Полиморфизмы можно идентифицировать с помощью средств, известных из уровня техники, причем некоторые из них были описаны в литературе.

Соответственно, в дополнительном аспекте предусмотрен способ получения растения, содержащего мутацию, описанную в данном документе. Способ предусматривает получение по меньшей мере одной клетки растения, содержащей ген, кодирующий функциональный полинуклеотид нитратредуктазу. Далее по меньшей мере одну клетку растения обрабатывают в условиях, эффективных для модулирования функции полинуклеотида нитратредуктазы. Затем по меньшей мере одну мутантную растительную клетку размножают с получением мутантного растения, при этом мутантное растение характеризуется модулированным уровнем полипептида нитратредуктазы по сравнению с уровнем у контрольного растения. В одном варианте осуществления стадия обработки предусматривает воздействие на по меньшей мере одну клетку химического мутагенного средства, описанного в данном документе, в условиях, эффективных для получения по меньшей мере одной мутантной растительной клетки. В другом варианте осуществления данного способа стадия обработки предусматривает воздействие на по меньшей мере одну клетку источника излучения в условиях, эффективных для получения по меньшей мере одной мутантной растительной клетки. Термин «мутантное растение» включает мутантные растения, у которых генотип является модифицированным по сравнению с генотипом у контрольного растения, предпочтительно с помощью способов, отличных от генной инженерии или генной модификации.

В определенных вариантах осуществления мутантное растение, мутантная растительная клетка или мутантный растительный материал могут содержать одну или более мутаций, которые встречаются в природе в другом растении, растительной клетке или растительном материале и обеспечивают требуемый признак. Эту мутацию можно внедрить (например, путем интрогрессии) в другое растение, растительную клетку или растительный материал (например, растение, растительную клетку или растительный материал с генетическим окружением, отличающимся от генетического окружения растения, из которого происходит мутация) для обеспечения у них данного признака. Таким образом, в качестве примера, мутацию, которая встречается в природе в первом растении, можно ввести во второе растение, такое как второе растение с генетическим окружением, отличающимся от генетического окружения первого растения. Таким образом, специалист в данной области техники может осуществлять поиск и идентификацию растения, несущего в естественных условиях в своем геноме один или более мутантных аллелей генов, описанных в данном документе, которые обеспечивают желаемый признак. Мутантный(мутантные) аллель(аллели), который(которые) встречается(встречаются) в природе, можно перенести во второе растение различными способами, включая селекцию, возвратное скрещивание и интрогрессию с получением линий, сортов или гибридов, которые имеют одну или более мутаций в генах, описанных в данном документе. Та же методика также может быть применена для интрогрессии одной или более мутаций, не встречающихся в природе, из первого растения во второе растение. Растения, демонстрирующие желаемый признак, можно отобрать путем скрининга из пула мутантных растений. Отбор предпочтительно осуществляют с использованием сведений о полинуклеотиде, описанном в данном документе. Следовательно, можно осуществлять скрининг в отношении генетического признака по сравнению с контролем. Такой скрининговый подход может предусматривать применение общепринятых методик амплификации и/или гибридизации, обсуждаемых в данном документе. Таким образом, дополнительный аспект настоящего изобретения относится к способу идентификации мутантного растения, включающему стадии: (a) получения образца, содержащего полинуклеотид, из растения; и (b) определения последовательности полинуклеотида, где отличие в последовательности полинуклеотида по сравнению с полинуклеотидом контрольного растения указывает на то, что указанное растение представляет собой мутантное растение. В другом аспекте предусмотрен способ идентификации мутантного растения, которое накапливает нитраты на сниженных уровнях по сравнению с контрольным растением, включающий стадии: (a) получения образца из растения, подлежащего скринингу; (b) определения того, содержит ли указанный образец одну или более мутаций, описанных в данном документе, в полинуклеотиде, кодирующем нитратредуктазу; и (c) определения уровня нитратов в указанном растении. Уровень нитратов предпочтительно определяют в высушенных листьях. В другом аспекте предусмотрен способ получения мутантного растения, характеризующегося сниженными уровнями нитратов по сравнению с контрольным растением, включающий стадии: (a) получения образца из первого растения; (b) определения того, содержит ли указанный образец одну или более мутаций, описанных в данном документе, которые приводят к снижению уровней нитратов, в полинуклеотиде, кодирующем нитратредуктазу; и (c) переноса одной или более мутаций во второе растение. Уровень нитратов предпочтительно определяют в высушенных листьях. Мутацию(мутации) можно перенести во второе растение с помощью различных способов, известных из уровня техники, как, например, с помощью генной инженерии, манипуляции с генами, интрогрессии, селекции растений, возвратного скрещивания и т. п. В одном варианте осуществления первое растение является встречающимся в природе растением. В одном варианте осуществления второе растение имеет генетическое окружение, отличающееся от генетического окружения первого растения. В другом аспекте предусмотрен способ получения мутантного растения, которое характеризуется сниженными уровнями нитратов по сравнению с контрольным растением, включающий стадии: (a) получения образца из первого растения; (b) определения того, содержит ли указанный образец одну или более мутаций, описанных в данном документе, которые приводят к снижению уровней нитратов, в полинуклеотиде, кодирующем нитратредуктазу; и (c) интрогрессии одной или более мутаций из первого растения во второе растение. Уровень нитратов предпочтительно определяют в высушенных листьях. В одном варианте осуществления стадия интрогрессии включает селекцию растений, необязательно включающую возвратное скрещивание и т.п. В одном варианте осуществления первое растение является встречающимся в природе растением. В одном варианте осуществления второе растение имеет генетическое окружение, отличающееся от генетического окружения первого растения. В одном варианте осуществления первое растение не относится к культивару или элитному культивару. В одном варианте осуществления второе растение относится к культивару или элитному культивару. Дополнительный аспект относится к мутантному растению (в том числе к мутантному растению, относящемуся к культивару или элитному культивару), полученному или получаемому с помощью способов, описанных в данном документе. В определенных вариантах осуществления «мутантные растения» могут иметь одну или более мутаций, локализованных только в конкретном участке растения, как, например, в последовательности одного или более полинуклеотидов, описанных в данном документе. Согласно данному варианту осуществления остальная геномная последовательность мутантного растения будет такой же или по существу такой же, как у растения до мутагенеза.

В дополнительном аспекте предусмотрен способ идентификации растения, растительной клетки или растительного материала, содержащих мутацию в гене, кодирующем полинуклеотид нитратредуктазы, включающий: (a) осуществление мутагенеза в отношении растения, растительной клетки или растительного материала; (b) получение образца из указанных растения, растительной клетки или растительного материала или их потомков и (c) определение присутствия мутантной полинуклеотидной последовательности, несущей мутацию, описанную в данном документе.

Раскрытые композиции и способы можно применять в отношении любого вида из рода Nicotiana, включая N. rustica и N. tabacum (например, LA B21, LN KY171, TI 1406, Basma, Galpao, Perique, Beinhart 1000-1 и Petico). Другие виды включают N. acaulis, N. acuminata, N. africana, N. alata, N. ameghinoi, N. amplexicaulis, N. arentsii, N. attenuata, N. azambujae, N. benavidesii, N. benthamiana, N. bigelovii, N. bonariensis, N. cavicola, N. clevelandii, N. cordifolia, N. corymbosa, N. debneyi, N. excelsior, N. forgetiana, N. fragrans, N. glauca, N. glutinosa, N. goodspeedii, N. gossei, N. hybrida, N. ingulba, N. kawakamii, N. knightiana, N. langsdorffii, N. linearis, N. longiflora, N. maritima, N. megalosiphon, N. miersii, N. noctiflora, N. nudicaulis, N. obtusifolia, N. occidentalis, N. occidentalis subsp. hesperis, N. otophora, N. paniculata, N. pauciflora, N. petunioides, N. plumbaginifolia, N. quadrivalvis, N. raimondii, N. repanda, N. rosulata, N. rosulata subsp. ingulba, N. rotundifolia, N. setchellii, N. simulans, N. solanifolia, N. spegazzinii, N. stocktonii, N. suaveolens, N. sylvestris, N. thyrsiflora, N. tomentosa, N. tomentosiformis, N. trigonophylla, N. umbratica, N. undulata, N. velutina, N. wigandioides и N. × sanderae.

В одном варианте осуществления растение представляет собой N. tabacum.

Применение культиваров табака и элитных культиваров табака также предусмотрено в данном документе. Растение, таким образом, может представлять собой сорт табака или элитный культивар табака, который содержит одну или более генетических мутаций. Генетическая(генетические) мутация(мутации) (например, один или более полиморфизмов) могут представлять собой мутации, которые не существуют в природе в отдельном сорте табака или культиваре табака (например, элитном культиваре табака), или могут представлять собой генетическую(генетические) мутацию(мутации), которая(которые) встречается(встречаются) в природе, при условии, что мутация не встречается в природе в отдельном сорте табака или культиваре табака (например, в элитном культиваре табака).

Сорта Nicotiana tabacum включают разновидности табака типа Берлей, темного типа, типа трубоогневой сушки и восточного типа. Неограничивающими примерами сортов или культиваров являются: AA37, BD 64, CC 101, CC 200, CC 27, CC 301, CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 800, CC 900, Coker 176, Coker 319, Coker 371 Gold, Coker 48, CD 263, DF911, табак DT 538 LC Galpao, GL 26H, GL 350, GL 600, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, HB 04P LC, HB3307PLC, гибрид 403LC, гибрид 404LC, гибрид 501 LC, K 149, K 326, K 346, K 358, K 394, K 399, K 730, KDH 959, KT 200, KT204LC, KY10, KY14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, KY907LC, KY14xL8 LC, Little Crittenden, McNair 373, McNair 944, msKY 14xL8, Narrow Leaf Madole, Narrow Leaf Madole LC, NBH 98, N-126, N-777LC, N-7371LC, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC7, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, NC 2002, Neal Smith Madole, OXFORD 207, PD 7302 LC, PD 7309 LC, PD 7312 LC, табак «Перик», PVH03, PVH09, PVH19, PVH50, PVH51, R 610, R 630, R 7-11, R 7-12, RG 17, RG 81, RG H51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, Speight 168, Speight 172, Speight 179, Speight 210, Speight 220, Speight 225, Speight 227, Speight 234, Speight G-28, Speight G-70, Speight H-6, Speight H20, Speight NF3, TI 1406, TI 1269, TN 86, TN86LC, TN 90, TN 97, TN97LC, TN D94, TN D950, TR (Tom Rosson) Madole, VA 309, VA359, AA 37-1, B13P, Xanthi (Mitchell-Mor), Bel-W3, 79-615, Samsun Holmes NN, KTRDC номер 2 - гибрид 49, Burley 21, KY8959, KY9, MD 609, PG01, PG04, PO1, PO2, PO3, RG11, RG 8, VA509, AS44, Banket A1, Basma Drama B84/31, Basma I Zichna ZP4/B, Basma Xanthi BX 2A, Batek, Besuki Jember, C104, Coker 347, Criollo Misionero, Delcrest, Djebel 81, DVH 405, Galpão Comum, HB04P, Hicks Broadleaf, Kabakulak Elassona, Kutsage E1, LA BU 21, NC 2326, NC 297, PVH 2110, Red Russian, Samsun, Saplak, Simmaba, Talgar 28, Wislica, Yayaldag, Prilep HC-72, Prilep P23, Prilep PB 156/1, Prilep P12-2/1, Yaka JK-48, Yaka JB 125/3, TI-1068, KDH-960, TI-1070, TW136, Basma, TKF 4028, L8, TKF 2002, GR141, Basma xanthi, GR149, GR153, Petit Havana. Также предусмотрены подсорта вышеуказанных с низким уровнем превращения никотина в норникотин, даже если они специально не указаны в данном документе.

В одном варианте осуществления сорт представляет собой AA37, который обычно понимается как продукт скрещивания южноамериканского темного табака и идиоплазмы американского Берлея.

Варианты осуществления также направлены на композиции и способы для получения растений, которые были модифицированы с целью модулирования экспрессии или функции полинуклеотида(полинуклеотидов), описанного(описанных) в данном документе (или любой их комбинации, описанной в данном документе). Полученные растения по общему внешнему виду преимущественно могут быть сходными с контрольными растениями или по существу такими же, как они. Различные фенотипические характеристики, такие как степень зрелости, количество листьев на растении, высота стебля, угол врастания листа, размер листа (ширина и длина), длина междоузлия и соотношение масс листовой пластинки и центральной жилки, можно оценить путем полевых наблюдений.

Один аспект относится к семени растения, описанного в данном документе. Семя предпочтительно представляет собой семя табака. Дополнительный аспект относится к пыльце или семяпочке растения, описанного в данном документе. В дополнение, предусмотрено растение, описанное в данном документе, которое дополнительно содержит полинуклеотид, обеспечивающий мужскую стерильность.

Также предусмотрена культура тканей из регенерируемых клеток растения, описанного в данном документе, при этом из культуры регенерируются растения, способные экспрессировать все морфологические и физиологические характеристики родительской особи. Регенерируемые клетки включают клетки из листьев, пыльцы, зародышей, семядолей, гипокотилей, корней, кончиков корней, пыльников, цветков и их части, семяпочек, побегов, стеблей, черешков, сердцевины и семенных коробочек или каллюсы или протопласты, полученные из них.

Одной целью является получение растений или их частей, которые демонстрируют модулированные уровни нитратов в растительном материале, например, в высушенных листьях. Растения или их части предпочтительно демонстрируют модулированные уровни нитратов по сравнению с контрольным растением.

Растения или их части предпочтительно характеризуются по существу такой же общей биомассой урожая (указанной как биомасса свежих листьев на растение), как и у контрольного растения.

Растения или их части предпочтительно характеризуются по существу таким же уровнем содержания никотина в листьях, как и контрольное растение.

Растения или их части предпочтительно характеризуются по существу таким же уровнем общего содержания алкалоидов в листьях, как и контрольное растение.

Растения или их части предпочтительно характеризуются по существу таким же уровнем содержания аммиака в листьях, как и контрольное растение.

Растения или их части предпочтительно характеризуются по существу таким же уровнем содержания восстанавливающих сахаров в листьях растения, как и контрольное растение.

Соответственно, в данном документе описаны растения или их части или растительные клетки, которые характеризуются модулированными уровнями нитратов по сравнению с контрольными клетками или контрольными растениями. Растения или растительные клетки являются модифицированными для модулирования синтеза или функции одного или более полипептидов, описанных в данном документе, путем модулирования экспрессии одного или более соответствующих полинуклеотидов, описанных в данном документе. Модулированные уровни нитратов предпочтительно наблюдаются в высушенных листьях. В определенных вариантах осуществления уровень нитратов в растении, как, например, в высушенных листьях или высушенном табаке, является уменьшенным.

Дополнительный аспект относится к растению или растительной клетке, где экспрессия или функция одного или более полипептидов, описанных в данном документе, являются модулированными, и часть растения (например, высушенные листья или высушенный табак) характеризуется уровнями нитратов в ней, сниженными на по меньшей мере приблизительно 37% по сравнению с контрольным растением, у которого экспрессия или функция указанного(указанных) полипептида(полипептидов) не были модулированы. В определенных вариантах осуществления уровень нитратов в растении, как, например, в высушенных листьях или высушенном табаке, может быть снижен, например, на по меньшей мере приблизительно 30% или больше, или приблизительно 35% или больше, или приблизительно 37% или больше, или приблизительно 40% или больше.

Еще один дополнительный аспект относится к высушенному растительному материалу, такому как высушенный лист или высушенный табак, полученному или получаемому из растения или растительной клетки, описанных в данном документе, где экспрессия одного или более полинуклеотидов, описанных в данном документе, или функция полипептида, кодируемого ими, являются модулированными, и где уровень нитратов является модулированным на по меньшей мере приблизительно 37% по сравнению с контрольным растением, например, на по меньшей мере приблизительно 30% или больше, или приблизительно 35% или больше, или приблизительно 40% или больше.

Варианты осуществления также направлены на композиции и способы получения растений или растительных клеток, которые были модифицированы для модулирования экспрессии или функции одного или более полинуклеотидов или полипептидов, описанных в данном документе, что может приводить к получению растений, или компонентов растений (например, листьев, таких как высушенные листья, или табака), или растительных клеток с модулированным содержанием нитратов.

Увеличение функции или активности по сравнению с контролем может составлять от приблизительно 5% до приблизительно 100%, или увеличение составляет по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или 100% или больше, как, например, 200%, 300%, 500%, 1000% или больше.

Уменьшение функции или активности по сравнению с контролем может составлять от приблизительно 5% до приблизительно 100%, или уменьшение составляет по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или 100%.

Растение, несущее мутацию, описанную в данном документе, в полинуклеотиде, кодирующем нитратредуктазу, можно применять в программе селекции растений для создания применимых линий, сортов и гибридов. В частности, мутантная форма может быть интрогрессирована в коммерчески значимые сорта, описанные выше. Таким образом, предусмотрены способы селекции растений, которые включают скрещивание растения, описанного в данном документе, с растением, содержащим иные генетические особенности. Способ может дополнительно включать скрещивание растения-потомка с другим растением и необязательно повторение скрещивания до тех пор, пока не будет получен потомок с необходимыми генетическими признаками или генетическим окружением. Одной целью, для которой служат такие способы селекции, является введение необходимого генетического признака в другие сорта, селекционные линии, гибриды или культивары, особенно те, которые представляют коммерческий интерес. Другой целью является облегчение накопления генетических модификаций различных генов в отдельных сортах, линиях, гибридах или культиварах растений. Предусмотрены внутривидовые, а также межвидовые скрещивания. Растения-потомки, появляющиеся в результате таких скрещиваний, также называемые селекционными линиями, являются примерами растений по настоящему изобретению.

В одном варианте осуществления предусмотрен способ получения растения, включающий: (a) скрещивание растения по настоящему изобретению со вторым растением с получением семени табака, являющегося семенем-потомком; (b) выращивание семени табака, являющегося семенем-потомком, в условиях роста растений с получением растения, не встречающегося в природе. Способ может дополнительно включать: (c) скрещивание растения, не встречающегося в природе, из предыдущего поколения с самим собой или с другим растением с получением семени табака, являющегося семенем-потомком; (d) выращивание семени табака, являющегося семенем-потомком, из стадии (c) в условиях роста растений с получением дополнительных растений, не встречающихся в природе; и (e) повторение стадий скрещивания и выращивания (c) и (d) несколько раз с получением следующих поколений растений, не встречающихся в природе. Способ может необязательно включать перед стадией (a) стадию получения родительского растения, содержащего генетические особенности, характеристики которых определены и которые не являются идентичными растению по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления в зависимости от программы селекции стадии скрещивания и выращивания повторяют от 0 до 2 раз, от 0 до 3 раз, от 0 до 4 раз, от 0 до 5 раз, от 0 до 6 раз, от 0 до 7 раз, от 0 до 8 раз, от 0 до 9 раз или от 0 до 10 раз для получения поколений растений, не встречающихся в природе. Возвратное скрещивание является примером такого способа, в котором потомка скрещивают с одной из соответствующих ему родительских форм или с другим растением, генетически сходным с соответствующей ему родительской формой, для получения растения-потомка в следующем поколении, которое имеет генетические особенности, более близкие к особенностям одной из родительских форм. Методики селекции растений, в частности селекция растений, хорошо известны и могут применяться в способах по настоящему изобретению. В определенных вариантах осуществления исключена стадия отбора растения.

Согласно настоящему изобретению в программе селекции в результате успешных скрещиваний образуются растения F1, которые являются фертильными. Отобранные растения F1 можно скрещивать с одной из родительских форм, и растения первого поколения, полученные в результате возвратного скрещивания, подвергают самоопылению с получением популяции, которую снова подвергают скринингу в отношении экспрессии варианта гена (например, нулевой версии гена). Процесс возвратного скрещивания, самоопыления и скрининга повторяют, например, по меньшей мере 4 раза до тех пор, пока при заключительном скрининге не получат растение, которое является фертильным и в достаточной степени сходным с рекуррентной родительской формой. Это растение при необходимости подвергают самоопылению, и потомство затем снова подвергают скринингу, чтобы подтвердить, что растение демонстрирует экспрессию варианта гена. В некоторых вариантах осуществления популяцию растений в поколении F2 подвергают скринингу в отношении экспрессии варианта гена, например, растение, которое не способно экспрессировать полипептид ввиду отсутствия гена, идентифицируют согласно стандартным способам, например, с помощью методики ПЦР с использованием праймеров, разработанных на основании информации о полинуклеотидной последовательности, для полинуклеотида(полинуклеотидов), описанного(описанных) в данном документе (или любой их комбинации, описанной в данном документе).

Помимо мутаций, описанных в данном документе, растения или растительные клетки, описанные в данном документе, могут иметь одну или более дополнительных мутаций в тех же полинуклеотидах или полипептидах, которые описаны в данном документе, либо в одном или более других полинуклеотидах или полипептидах в геноме.

Без ограничения растения и их части, описанные в данном документе, можно модифицировать до либо после модулирования экспрессии, функции или активности одного или более полинуклеотидов и/или полипептидов согласно настоящему изобретению.

Одна или более из следующих дополнительных генетических модификаций (например, мутаций) могут присутствовать в растениях и их частях.

Один или более генов, которые участвуют в превращении промежуточных продуктов азотистого обмена, могут быть модифицированы (например, подвергнуты мутации), что приводит к более низким уровням по меньшей мере одного табакоспецифического нитрозамина (TSNA). Неограничивающие примеры таких генов включают гены, кодирующие никотиндеметилазу, такие как CYP82E4, CYP82E5 и CYP82E10, описанные в WO2006/091194, WO2008/070274, WO2009/064771 и WO2011/088180, и нитратредуктазу, как описано в WO2016046288.

Один или более генов, которые участвуют в поглощении тяжелых металлов или транспорте тяжелых металлов, могут быть модифицированы (например, подвергнуты мутации), что приводит к более низкому содержанию тяжелых металлов. Неограничивающие примеры включают гены, кодирующие семейство полипептидов, ассоциированных с множественной лекарственной устойчивостью, семейство посредников диффузии катионов (CDF), семейство Zrt/Irt-подобных полипептидов (ZIP), семейство катионообменников (CAX), семейство транспортеров меди (COPT), семейство АТРаз, являющихся переносчиками тяжелых металлов (например, HMA, как описано в WO2009/074325 и WO2017/129739), семейство гомологов полипептидов макрофагов, ассоциированных с естественной устойчивостью (NRAMP), и других представителей семейства транспортеров с ATP-связывающей кассетой (ABC) (например, MRP), как описано в WO2012/028309, которые участвуют в транспорте тяжелых металлов, таких как кадмий.

Другие иллюстративные модификации (например, мутации) могут приводить к получению растений с модулированной экспрессией или функцией изопропилмалатсинтазы, что приводит к изменению состава сложных эфиров сахарозы, которое может использоваться для изменения ароматического профиля (см. WO2013029799).

Другие иллюстративные модификации (например, мутации) могут приводить к получению растений с модулированной экспрессией или функцией треонинсинтазы, и в этом случае можно модулировать уровни метионала (см. WO2013029800).

Другие иллюстративные модификации (например, мутации) могут приводить к получению растений с модулированной экспрессией или функцией одной или более из неоксантинсинтазы, ликопин-бета-циклазы и 9-цис-эпоксикаротиноиддиоксигеназы для модулирования содержания бета-дамасценона для изменения ароматического профиля (см. WO2013064499).

Другие иллюстративные модификации (например, мутации) могут приводить к получению растений с модулированной экспрессией или функцией представителей семейства CLC хлоридных каналов для модулирования в них уровней нитратов (см. WO2014096283 и WO2015197727).

Другие иллюстративные модификации (например, мутации) могут приводить к получению растений с модулированной экспрессией или функцией одной или более аспарагинсинтетаз для модулирования уровней аспарагина в листе и достижения модулированных уровней акриламида в аэрозоле, получаемом при нагревании или сгорании листа (см. WO2017042162).

Примеры других модификаций (например, мутаций) включают модулирование выносливости к гербицидам, например, к глифосату, который является активным ингредиентом множества гербицидов широкого спектра действия.

Другие иллюстративные модификации (например, мутации) приводят к получению растений, которые являются устойчивыми к насекомым. Токсины Bacillus thuringiensis (Bt) могут обеспечивать эффективный путь задержки появления вредителей, устойчивых к Bt, как было недавно проиллюстрировано на брокколи, где «пирамидированные» гены Bt cry1Ac и cry1C обеспечивали контроль видов капустной моли, устойчивых к любому отдельному полипептиду, и существенно задерживали эволюцию устойчивых насекомых.

Другая иллюстративная модификация (например, мутация) приводит к получению растений, которые являются устойчивыми к заболеваниям, вызываемым патогенами (например, вирусами, бактериями, грибами). Были разработаны растения, экспрессирующие ген Xa21 (устойчивость к бактериальному некрозу), при этом растения экспрессировали как слитый ген Bt, так и ген хитиназы (устойчивость к желтой огневке-травянке и выносливость к ризоктониозу).

Другая иллюстративная модификация (например, мутация) приводит к изменению репродуктивной способности, например, к мужской стерильности.

Другая иллюстративная модификация (например, мутация) приводит к получению растений, которые являются выносливыми к абиотическому стрессу (например, засухе, температуре, засолению).

Другая иллюстративная модификация (например, мутация) приводит к получению растений, в которых активность одной или более гликозилтрансфераз, таких как N-ацетилглюкозаминилтрансфераза, β(1,2)-ксилозилтрансфераза и a(1,3)-фукозилтрансфераза, является модулированной (см. WO/2011/117249).

Другая иллюстративная модификация (например, мутация) приводит к получению растений, в которых активность одной или более никотин-N-деметилаз модулирована таким образом, что можно модулировать уровни норникотина и метаболитов норникотина, которые образуются во время сушки (см. WO2015169927).

Другие иллюстративные модификации (например, мутации) могут приводить к получению растений с улучшенными запасными полипептидами и маслами, растений с повышенной эффективностью фотосинтеза, растений с длительным сроком хранения, растений с повышенным содержанием углеводов и растений, устойчивых к грибам.

Один или более генов, которые участвуют в пути синтеза никотина, можно модифицировать (например, подвергать мутации) с получением растений или частей растений, в которых при сушке вырабатываются модулированные уровни никотина. Гены, отвечающие за синтез никотина, могут быть выбраны из группы, состоящей из: A622, BBLa, BBLb, JRE5L1, JRE5L2, MATE1, MATE2, MPO1, MPO2, MYC2a, MYC2b, NBB1, nic1, nic2, NUP1, NUP2, PMT1, PMT2, PMT3, PMT4 и QPT или комбинации одного или более из них.

Один или более генов, которые участвуют в контроле количества одного или более алкалоидов, можно модифицировать (например, подвергать мутации) с получением растений или частей растений, в которых вырабатываются модулированные уровни алкалоидов. Гены, контролирующие уровень алкалоидов, могут быть выбраны из группы, состоящей из BBLa, BBLb, JRE5L1, JRE5L2, MATE1, MATE2, MYC2a, MYC2b, nic1, nic2, NUP1 и NUP2 или комбинации двух или более из них.

Части растений, описанных в данном документе, в частности листовую пластинку и центральную жилку данных растений, можно включить в состав различных продуктов потребления, включая без ограничения материалы, образующие аэрозоль, устройства, образующие аэрозоль, курительные изделия, изделия для курения, бездымные продукты, медицинские или косметические продукты, препараты для внутривенного введения, таблетки, порошки и табачные продукты, или применять в их изготовлении. Примеры материалов, образующих аэрозоль, включают табачные композиции, разновидности табака, табачный экстракт, резаный табак, резаный наполнитель, сушеный табак, взорванный табак, гомогенизированный табак, восстановленный табак и разновидности трубочного табака. Курительные изделия и изделия для курения являются типами устройств, образующих аэрозоль. Примеры курительных изделий или изделий для курения включают сигареты, сигариллы и сигары. Примеры бездымных продуктов включают разновидности жевательного табака и нюхательного табака. В определенных устройствах, образующих аэрозоль, вместо сгорания табачная композиция или другой материал, образующий аэрозоль, нагревается с помощью одного или более электрических нагревательных элементов с получением аэрозоля. В другом типе нагреваемого устройства, образующего аэрозоль, аэрозоль получают путем перемещения тепла от сгораемого тепловыделяющего элемента или источника тепла к физически отделенному материалу, образующему аэрозоль, который может быть расположен внутри, вокруг или ниже источника тепла. Бездымные табачные продукты и различные табакосодержащие материалы, образующие аэрозоль, могут содержать табак в любом виде, в том числе в виде высушенных частиц, кусочков, гранул, порошков или суспензии, нанесенных на другие ингредиенты, смешанных с ними, окруженных ими или иным образом объединенных с ними в любом формате, таком как хлопья, пленки, таблетки, пеноматериалы или шарики. Используемый в данном документе термин «дым» используют для описания типа аэрозоля, который образуется курительными изделиями, такими как сигареты, или при сгорании материала, образующего аэрозоль.

В одном варианте осуществления также предусмотрен высушенный растительный материал из растений, описанных в данном документе. Способы сушки зеленых листьев табака известны специалистам в данной области и включают без ограничения воздушную сушку, огневую сушку, трубоогневую сушку и солнечную сушку, как описано в данном документе.

В другом варианте осуществления описаны табачные продукты, в том числе табакосодержащие материалы, образующие аэрозоль, содержащие растительный материал, такой как листья, предпочтительно высушенные листья из растений табака, описанных в данном документе. Табачные продукты, описанные в данном документе, могут представлять собой смешанный табачный продукт, который может дополнительно содержать немодифицированный табак.

Продукты и способы для управления сельскохозяйственными культурами и сельского хозяйства

Для растений могут существовать другие пути применения, например, в сельском хозяйстве. Например, растения, описанные в данном документе, можно применять для изготовления корма для животных и продуктов питания для человека.

В настоящем изобретении также предусмотрены способы получения семян, включающие культивирование растения, описанного в данном документе, и сбор семян культивируемых растений. Семена растений, описанных в данном документе, можно кондиционировать и упаковывать в упаковочный материал с помощью средств, известных в данной области техники, с получением готового изделия. Упаковочный материал, такой как бумага и ткань, хорошо известен в данной области техники. Упаковка семян может иметь этикетку, например маркировку или этикетку, прикрепленную к упаковочному материалу, этикетку, напечатанную на упаковке, которая описывает происхождение содержащихся в ней семян.

Композиции, способы и наборы для генотипирования растений для идентификации, отбора или селекции могут включать средства для выявления присутствия полинуклеотида (или любой их комбинации, описанной в данном документе) в образце полинуклеотида. Соответственно, описана композиция, содержащая один или более праймеров для специфичной амплификации по меньшей мере части одного или более полинуклеотидов, и необязательно один или более зондов, и необязательно один или более реагентов для проведения амплификации или выявления.

Соответственно, раскрыты геноспецифические олигонуклеотидные праймеры или зонды, содержащие приблизительно 10 или более смежных полинуклеотидов, соответствующих полинуклеотиду(полинуклеотидам), описанному(описанным) в данном документе. Указанные праймеры или зонды могут содержать приблизительно 15, 20, 25, 30, 40, 45 или 50 или больше смежных полинуклеотидов, которые гибридизируются (например, специфично гибридизируются) с полинуклеотидом(полинуклеотидами), описанным(описанными) в данном документе, или состоять из них.

В некоторых вариантах осуществления праймеры или зонды могут содержать приблизительно 10-50 смежных нуклеотидов, приблизительно 10-40 смежных нуклеотидов, приблизительно 10-30 смежных нуклеотидов или приблизительно 15-30 смежных нуклеотидов или состоять из них, которые можно применять в зависимых от последовательности способах идентификации (например, Саузерн-блот-гибридизации) или выделения гена (например, гибридизации in situ бактериальных колоний или бляшек бактериофагов) или выявления гена (например, в качестве одного или более праймеров для амплификации при амплификации или выявлении). Один или более специфических праймеров или зондов можно разработать и применять для амплификации или выявления части или всего(всех) полинуклеотида(полинуклеотидов). В качестве конкретного примера, два праймера можно применять в протоколе ПЦР для амплификации полинуклеотидного фрагмента. ПЦР можно также проводить с использованием одного праймера, который получен из полинуклеотидной последовательности, и второго праймера, который гибридизируется с последовательностью выше или ниже полинуклеотидной последовательности, такой как последовательность промотора, 3'-конец мРНК-предшественника или последовательность, полученная из вектора. Примеры термических и изотермических методик, применимых для амплификации полинуклеотидов in vitro, хорошо известны из уровня техники. Образец может представлять собой растение, растительную клетку или растительный материал или табачный продукт, изготовленный или полученный из растения, растительной клетки или растительного материала, описанных в данном документе, или быть получен из них.

В дополнительном аспекте также предусмотрен способ выявления полинуклеотида(полинуклеотидов), описанного(описанных) в данном документе (или любой их комбинации, описанной в данном документе), в образце, включающий стадии: (a) получения образца, содержащего или предположительно содержащего полинуклеотид; (b) приведения указанного образца в контакт с одним или более праймерами или одним или более зондами для специфичного выявления по меньшей мере части полинуклеотида(полинуклеотидов) и (c) выявление присутствия продукта амплификации, где присутствие продукта амплификации свидетельствует о присутствии полинуклеотида(полинуклеотидов) в образце. В дополнительном аспекте также предусмотрено применение одного или более праймеров или зондов для специфичного выявления по меньшей мере части полинуклеотида(полинуклеотидов). Также предусмотрены наборы для выявления по меньшей мере части полинуклеотида(полинуклеотидов), которые содержат один или более праймеров или зондов для специфичного выявления по меньшей мере части полинуклеотида(полинуклеотидов). Набор может содержать реагенты для амплификации полинуклеотидов, например, реагенты для ПЦР, или реагенты для технологии выявления посредством гибридизации с зондом, такой как Саузерн-блоттинг, нозерн-блоттинг, гибридизация in situ или микроматричный анализ. Набор может содержать реагенты для технологии выявления посредством связывания с антителами, такой как вестерн-блоттинг, виды ELISA, SELDI-масс-спектрометрия или анализ с помощью тест-полосок. Набор может содержать реагенты для секвенирования ДНК. Набор может содержать реагенты и инструкции по применению набора.

В некоторых вариантах осуществления набор может содержать инструкции по выполнению одного или более описанных способов. Описанные наборы могут быть применимы для определения генетических особенностей, филогенетических исследований, генотипирования, гаплотипирования, генеалогического анализа или селекции растений, в частности, с количественной оценкой кодоминантных признаков.

В настоящем изобретении также предусмотрен способ генотипирования растения, растительной клетки или растительного материала, содержащих полинуклеотид, описанный в данном документе. Генотипирование обеспечивает средства проведения различий между гомологами в паре хромосом и может применяться для различения сегрегантов в популяции растений. Способы с использованием молекулярных маркеров можно применять для филогенетических исследований, определения характеристик генетического родства между сортами сельскохозяйственных культур, идентификации продуктов скрещивания или соматических гибридов, определения локализации хромосомных сегментов, влияющих на моногенные признаки, клонирования на основе генетических карт и изучения количественного наследования. В определенном способе генотипирования может использоваться любое количество методик анализа молекулярных маркеров, включая полиморфизмы длин амплифицированных фрагментов (AFLP). AFLP является результатом аллельных различий между амплифицированными фрагментами, обусловленных изменчивостью полинуклеотидов. Таким образом, в настоящем изобретении дополнительно предусмотрены способы отслеживания сегрегации одного или более генов или полинуклеотидов, а также хромосомных последовательностей, генетически сцепленных с этими генами или полинуклеотидами, с применением таких методик, как анализ AFLP.

Настоящее изобретение дополнительно описано в примерах ниже, которые представлены для более подробного описания настоящего изобретения. Эти примеры, в которых изложен предпочтительный принцип, предусмотренный в данном документе для осуществления настоящего изобретения, предназначены для иллюстрации, а не для ограничения настоящего изобретения.

ПРИМЕР

Семена M0 Nicotiana tabacum AA37 обрабатывали этилметансульфонатом (EMS) при различных концентрациях и значениях времени воздействия для получения популяции растений со случайными точечными мутациями. Кривую уничтожения оценивали у поколения M1 для каждого вида обработки вместе с летальностью, фертильностью и степенью химеризма. Растения M1 подвергали самооплодотворению с образованием семейств семян M2 для обеспечения возможности выделения рецессивных аллелей в гомозиготном состоянии и выделения летальных аллелей в гетерозиготном состоянии. Геномную ДНК из восьми растений M2 на каждое семейство в популяции, подвергнутой мутагенезу с помощью EMS, экстрагировали и подвергали скринингу в отношении мутантных форм, тогда как растительный материал M2 и семена M3 собирали и сохраняли для будущих анализов. Для идентификации и определения характеристик мутантных вариантов образцы геномной ДНК из растений M2 объединяли в группы и подвергали скринингу путем секвенирования фрагментов гена-мишени. Фрагменты гена-мишени амплифицировали с помощью праймеров, специфичных в отношении гена NIA2 табака, показанных в таблице 2. Поиск мутаций в генах-мишенях производили путем секвенирования отдельных фрагментов ДНК. Мутация M527I в NIA2 табака описана в таблице 1. Мутантное растение скрещивали с AA37 дикого типа и полученным в результате самоопыления F1, которое являлось гетерозиготным. Сегрегантов F2 анализировали с помощью способа количественной амплификации нуклеиновых кислот (TaqMan).

В полевом испытании три мутантные линии, гомозиготные по NIA2 M527I, тестировали в сравнении с 5 несегрегирующими гомозиготными линиями дикого типа и 1 контрольной линией AA37, не подвергавшейся обработке с помощью EMS. Согласно плану полевого испытания растения размещали на 20 опытных участках для растений, распределенных произвольным образом для минимизации эффекта расположения, обусловленного неоднородностью поля. Растения выращивали в соответствии со стандартом надлежащей сельскохозяйственной практики Швейцарии для табака Берлей. При сборе урожая измеряли общую биомассу свежих листьев. Измерения биомассы листьев растения проводили посредством срезания листьев при сборе урожая и записи показателей их сырого веса.

Листья второго сбора (из положения в средней части стебля) затем подвергали воздушной сушке, и образцы анализировали для составления химического профиля с помощью стандартных способов Skalar.

Результаты приведены на фигуре 2. В ходе полевого испытания мутантные линии растений NtNIA2 M527I демонстрировали 37% уменьшение уровней нитратов в высушенных листьях по сравнению с несегрегирующими контрольными растениями дикого типа. Эффект в отношении общей биомассы урожая растения (указанной как биомасса свежих листьев на растение), а также в отношении содержания никотина, общего содержания алкалоидов, содержания аммиака и восстанавливающих сахаров в листьях не наблюдался.

Любая публикация, цитируемая или описанная в данном документе, предоставляет соответствующую информацию, раскрытую до даты подачи настоящей заявки. Заявления, сделанные в данном документе, не должны истолковываться как признание того, что авторы настоящего изобретения не имеют оснований для его противопоставления таким раскрытиям как более ранним. Все публикации, упомянутые в вышеприведенном описании, включены в данный документ посредством ссылки. Различные модификации и варианты настоящего изобретения будут очевидны специалистам в данной области без отступления от объема и сущности настоящего изобретения. Несмотря на то, что настоящее изобретение было описано в связи с конкретными предпочтительными вариантами осуществления, следует понимать, что заявленное изобретение не должно быть неправомерно ограничено такими конкретными вариантами осуществления. В действительности подразумевается, что различные модификации описанных вариантов осуществления изобретения, которые очевидны специалистам в клеточной, молекулярной биологии и биологии растений или в смежных областях, находятся в пределах объема формулы изобретения.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID NO: 1 - полипептидная последовательность дикого типа, кодируемая геном нитратредуктазы NIA2 Nicotiana tabacum, номер доступа в GenBank X14059. Последовательность, которая выступает в качестве сайта распознавания для связывания киназы нитратредуктазы, отвечающей за фосфорилирование аминокислоты S523 в NtNIA2, выделена жирным шрифтом и подчеркиванием.

MAASVENRQFSHLEAGLSRSFKPRSDSPVRGCNFPSPNSTNFQKKPNSTIYLDYSSSEDDDDDDEKNEYLQMIKKGNSELEPSVHDTRDEGTADNWIERNFSMIRLTGKHPFNSEPPLNRLMHHGFITPVPLHYVRNHGPVPKGTWDDWTVEVTGLVKRPMKFTMDQLVNEFPCRELPVTLVCAGNRRKEQNMVKQTIGFNWGAAAVSTTIWRGVPLRALLKRCGVFSKNKGALNVCFEGADVLPGGGGSKYGTSIKKEFAMDPARDIIVAYMQNGEKLAPDHGFPVRMIIPGFIGGRMVKWIKRIIVTTQESDSYYHFKDNRVLPPHVDAELANTEAWWYKPEYIINELNINSVITTPCHEEILPINAWTTQRPYTLRGYSYSGGGKKVTRVEVTLDGGETWQVSTLDHPEKPTKYGKYWCWCFWSLEVEVLDLLSAKEIAVRAWDETLNTQPEKLIWNVMGMMNNCWFRVKMNVCKPHKGEIGIVFEHPTQPGNQSGGWMAKERHLEISAEAPQTLKKSISTPFMNTASKMYSMSEVRKHSSADSAWIIVHGHIYDATRFLKDHPGGTDSILINAGTDCTEEFDAIHSDKAKKLLEDFRIGELITTGYTSDSPGNSVHGSSSFSSFLAPIKELVPAQRSVALIPREKIPCKLIDKQSISHDVRKFRFALPSEDQVLGLPVGKHIFLCAVIDDKLCMRAYTPTSTIDEVGYFELVVKIYFKGIHPKFPNGGQMSQYLDSMPLGSFLDVKGPLGHIEYQGKGNFLVHGKQKFAKKLAMIAGGTGITPVYQVMQAILKDPEDDTEMYVVYANRTEDDILLKEELDSWAEKIPERVKVWYVVQDSIKEGWKYSIGFITEAILREHIPEPSHTTLALACGPPPMIQFAVNPNLEKMGYDIKDSLLVF

SEQ ID NO: 2 - полинуклеотидная последовательность дикого типа гена нитратредуктазы NIA2 Nicotiana tabacum, номер доступа в GenBank X14059. Последовательность, которая выступает в качестве сайта распознавания для связывания киназы нитратредуктазы, отвечающей за фосфорилирование аминокислоты S523 в NtNIA2, выделена жирным шрифтом и подчеркиванием.

1 tacatacaag ggcgcgaata aacttttttt aaagtaaatg tatatgaact tgcaatgaaa

61 gaggacctta acttgtttgt ctttgttgct ttctgcaaat ttcaccttaa cagcccattt

121 gagattgatt tagttagtta taacaattag ttaaatgctt gtgtaatttg aagaaaatat

181 ttggacgtgc tcgctgaaaa cattatactc ctatataata gaaatacttt ctgaaaagtt

241 ggtcttgttc aaaaacgtat aagagagttg gtcttctcat aaatagtcac tagctttctg

301 attttttttc actttctata tcacgtaaat aggtactcaa atttgatatt tacaccaaac

361 aaatgaaaat aggatatgtg tttttcatac gtatatttat ctatcgtact taatgataca

421 tacatataca tataacctta ctttttgatt actaaaaatt taattatatt taatttgggt

481 aaatatcaga tgccacaaaa catttaccta gccactgttt ttgactacta aaaatttaat

541 tatgtttagc ttgggtaaat atcagatgtc actaaacatt ttacctagcc attcctccga

601 aaagaaattg agaaggaaat tagagttagt ggagccataa taatgtttaa tgtgaccata

661 actcggtgaa aaccacggca agaataagaa acagctgtta aggctaacca acagctgcat

721 atctttaagc catttgctat taccccaaca tcgcatcttc ctctgatccc gaccctacgg

781 gcgtaaaaag tgtaaatcgt tagaattgtt ttatttattt tatgatgtca ctatttttta

841 aaatcaaaat taaattgggg tgtcgatttt tttgggtcct gcttatgtat agtatggcgc

901 tatggaggca ctgagagagt ccgaaacgtt tctatataag gccaccccac gcattcacaa

961 acttcgttcc caaacagaac aagaaaatca aatctcggag agagagagag agaaatattt

1021 tgagagagaa atacagaaaa tctctcttcc ttctttcctt tttttttcaa tccccattca

1081 tattcttttt ttagaataat ctatggcggc atctgtcgaa aacaggcagt tcagtcacct

1141 agaagccggt ttatcccggt ctttcaagcc ccggtctgat tccccggttc gtggctgcaa

1201 cttcccttcg cccaacagta ctaatttcca aaagaaacca aattccacca tttaccttga

1261 ttactcgtcg agtgaagacg acgatgatga tgacgaaaaa aatgagtacc ttcaaatgat

1321 taaaaaaggg aattcagagt tagagccatc tgttcatgac actagggacg aaggtaccgc

1381 tgataattgg attgaacgca acttttccat gattcgtctc accggaaagc atccatttaa

1441 ctccgaacca ccgttgaacc ggctcatgca ccacggcttt atcacaccgg tcccacttca

1501 ttacgttcgt aaccatggac cggttcccaa gggcacgtgg gatgactgga ccgtggaagt

1561 cacgggacta gtgaagcgtc ctatgaaatt cacaatggac cagttggtta acgaattccc

1621 ttgtagagaa ttgcccgtta cgcttgtttg tgctggcaat cgaaggaaag aacagaacat

1681 ggttaaacaa accattggtt tcaactgggg cgccgctgcc gtttcaacaa cgatatggcg

1741 cggggtaccc ctccgcgctt tgctaaaacg gtgcggtgtt tttagcaaga ataaaggggc

1801 gcttaatgtt tgcttcgaag gagctgatgt gttgcccgga ggtggtggtt caaagtatgg

1861 aaccagcatt aagaaggaat ttgcaatgga tccagcacga gatatcatcg tagcctacat

1921 gcagaacgga gaaaaattgg cacccgacca cgggtttcca gtacgaatga taattccagg

1981 attcattgga ggaagaatgg tgaaatggat aaagaggatt atagtcacca cccaagaatc

2041 agacagctat tatcatttca aggacaatag agttcttcct ccccatgttg atgctgaact

2101 tgcaaatacc gaaggtacgt accgtaacta tttcaattta ttactccatt tgttccaatt

2161 tatgtgaacc tatttccttt ttggtccgtt caaaaaagaa tgaacccttt ctaaatttgg

2221 taacaattta gcttaaactt acaacttcac ccttaatgag aaacttttat aaccacacaa

2281 ataccctggg gcccatttgg acttgtttag gtcgacaaat tccaaaagtt ttattttttt

2341 cttaaacttc gtgctcagtc aaacaggttc acgtaaattg aaacggagag agtatcattt

2401 ttattaaggg gtataaatat attttaatta gttgagactt gcacatacaa gtaaaatatt

2461 tcttagaata caaaatcaac tgaaagctta cttctaatta tatggttttg aattttcctt

2521 tcaatgaagt aaataaaaag gaaacaatta tattcaacgc atgtaggtat atggtcctgt

2581 cattatctca aatcaaatgg tttaaagaca aaggactttg gaaacataga attgtcagct

2641 ttatagttat ggagtactat attagttagc tgtttgcatc tattcataat tggtctatct

2701 gtgtgcagca tggtggtaca agccagagta tatcatcaat gagcttaata ttaactctgt

2761 cattacgacg ccgtgtcatg aagaaatttt gccaattaac gcctggacga ctcagcgacc

2821 ttacacgttg aggggctatt cttattctgg ttagtatttt tatattttcc gattttgctg

2881 agaatatcat atttcttagt tttgtcgata catcgtatcc tctaactctg acgttttact

2941 tcgtccttat gcacccactt acgtccttac tttctcagac agtttattga tgaaaactac

3001 ttactatttt cgacccgata gcctcagcgt ccttaattaa atgtgatgtt ttgaaagaga

3061 tattctctcc cgtctatttt aattaatttt tggctgtttt tatacgtggg aatctatttt

3121 taacattaat taatatagaa atgaaccata ttaatattat taatttcttc attgaaaata

3181 caacaaatac tcttcggctc ttactacaat gacaattttg aagaaaaata attaattcct

3241 tcctaatatc tgaaaaatca aatattgtgg accataaaaa aaggtcaaaa aattaattaa

3301 aatgaactgg agagagtaaa ttagaaaata taattatagc actagtaatt aaagttatta

3361 gatgtcttct ttaaaaagcg tgtgaaaact ttaaagacga aatataatat gaatattatc

3421 taatacttag aaagtgtcaa taattggtag acaatttaaa ctatatacta gttaaaaagt

3481 ctgtcaatac aactattagt attggggatt agagagaata gtagtaaaat ggagtaattg

3541 gacgcatgag cttgggcatg ctgattgctg tcagcttgtt tgctaatgtg aaaaagaaaa

3601 tagtaagaaa aggccaacat ggttttgttt attttattat gtggtagtac acaaaaacct

3661 ggggagcttt cctagttctg aagagtcggt ctttggtagc acaaaattaa tagtatagta

3721 taccaagtga atattaaatt caattgtcta aagcacggaa tctttttgac tactttagtt

3781 cctgcatctt gggttgcctc aacaacaccc tttattgaat tattatagta atgttcaata

3841 taatatacaa ttagaaaaca ctctaagtgg tcactttata tggatctagt caatactatt

3901 tcttctaaac aacgtgccta attacttccc actttccagt acatgaccac cattaagttt

3961 aatttttgtc aattccttgt gcaattggcc cttcaaatga gcagaagtgt tacgtaggaa

4021 aactaacttc agctactatt ataggagtaa acctgttagg aaaagatgct cgaggaactg

4081 acaaaacttg tagaataatt agccattgta ttgattgaaa tactgattgt gaacgtgtaa

4141 caaacaggcg gagggaaaaa agtaacgcga gtagaagtga cgttggatgg aggagaaaca

4201 tggcaagtta gcacactaga tcacccagag aagcccacca aatatggcaa gtactggtgt

4261 tggtgctttt ggtcactcga ggttgaggtg ttagacttgc tcagtgctaa agaaattgct

4321 gttcgagctt gggatgagac cctcaatact caacccgaga agcttatttg gaacgtcatg

4381 gtacgttcac ttcttctttt acctttattt cttttaactt ctatatacta gcggtgtaaa

4441 gttattttac accataagtt aacttacaaa aatatgtaac tatttatact acgagtgatg

4501 agggcaagaa ggggtttaag tatttgacaa taaatgtaaa ccctgcaatt ttgttcctaa

4561 ttttttatcc tttcaactct ttgtgattgc ttcattatct agattcacag agcacatgtg

4621 ttcacatgcc aaaacaaaaa actacaaaca aaaaaacttt tcactagctt tagtctaaga

4681 ttcccctttt tttttttggg aggtgtgtgg tccatactcc atagatcaat tccagccact

4741 gacgtaccaa accctgaaaa ttcctagtag ttatagcgac gtacaatcat ttcatattat

4801 gtaagcagag acgtgatcac atgaactaga tgtgaatacc acttgcccag tccaccaggt

4861 caattcatct agatgtgtaa atcttgacac cagcactggg tcacttttat aacactagca

4921 tttaacaaca tttcatcctt gaacattact tgggctaatt aataagtatt tttttttata

4981 tactctaaaa attgtaatta cataaatgaa tttaacttat acacgctgac aatgttacta

5041 attccacttt ttacggacgg ttatctatag aaatcattta ggtgaaacaa ttctcttaca

5101 ctatgatcag tgttagtaca taatggttat tacattttct aaatattgtg ctatgttgca

5161 atgttcaggg aatgatgaat aattgctggt tccgagtaaa gatgaatgtg tgcaagcctc

5221 acaagggaga gattggaata gtgtttgagc atccgactca acctggaaac caatcaggtg

5281 gatggatggc gaaggagaga catttggaga tatcagcaga ggcacctcaa acactaaaga

5341 agagtatctc aactccattc atgaacacag cttccaagat gtactccatg tccgaggtca

5401 ggaaacacag ctctgctgac tctgcttgga tcatagtcca tggtcatatc tatgacgcca

5461 cgcgtttctt gaaagatcac cctggtggga ctgacagcat tctcatcaat gctggcactg

5521 attgcactga ggaatttgat gcaattcatt ctgataaggc taagaagctc ttggaggatt

5581 tcaggattgg tgaactcata actactggtt acacctctga ctctcctggc aactccgtgc

5641 acggatcttc ttccttcagc agctttctag cacctattaa ggaacttgtt ccagcgcaga

5701 ggagtgtggc cctaattcca agagagaaaa tcccatgcaa actcatcgac aagcaatcca

5761 tctcccatga tgttaggaaa tttcgatttg cattgccctc tgaggatcaa gtcttgggct

5821 tgcctgttgg aaaacatatc ttcctctgtg ccgttattga cgataagctc tgcatgcgcg

5881 cttacacgcc tactagcacg atcgatgagg tggggtactt cgagttggtt gtcaagatat

5941 acttcaaagg aattcaccct aaattcccca atggagggca aatgtcacag tatcttgatt

6001 ctatgccgtt agggtcattt ctcgacgtga aaggtccatt aggtcacatt gaataccaag

6061 gaaagggaaa tttcttagtt catggcaaac agaagtttgc caagaagttg gccatgatag

6121 caggtggaac aggaataact ccagtgtatc aagtcatgca ggcaattctg aaagatccag

6181 aagatgacac agaaatgtat gtggtgtatg ctaacagaac agaggatgat attttactta

6241 aggaagagct tgattcatgg gctgagaaaa ttccagagag ggttaaagtt tggtatgtgg

6301 ttcaggattc tattaaagaa ggatggaagt acagcattgg ttttattaca gaagccattt

6361 tgagagaaca tatccctgag ccatctcaca caacactggc tttggcttgt ggaccacctc

6421 ctatgattca atttgctgtt aatccaaact tggagaagat gggctatgac attaaggatt

6481 ccttattggt gttctaattt taaaaacaaa acaatatctg caggaataaa tttttttttt

6541 ccccctatca gttgtacata ttgtatttgg tttatcaccc ccatgtacta cgtagtgttt

6601 gtagttctta catttttatt ttttagaatt tttttaaacc ttaggatata aaggttttct

6661 cttccaacaa agtgattctt tagggaagaa atgtactgta ctgtactagt atgtctaagc

6721 cgaaagttgt aatgtttacc atgacaaatt gtattcaatt cctcatggaa tagtaacatt

6781 gtgttcatgt gtcttcctgt aagcgatctt caaaatatca atgtatatat atagtaattg

6841 caaaccattg ttccttttcc cgatgtagtt aactactctt tctttagctt ctagtctctg

6901 gtgaatattt ttttttctat aactctttaa ttaatacggc cttaaataag agaaaagttt

6961 aaaccacgaa tatcattatg cagacgtata ggtaattaat ctactttttg aaaaaaaatc

7021 tattttcttt atgtggtcct tcaaaataat attctagaac cttttgtata ttccctttta

7081 acttctattt agtttt

SEQ ID NO: 3 - мутантная полипептидная последовательность, кодируемая геном нитратредуктазы NIA2 Nicotiana tabacum. Мутантный полипептид в сайте распознавания для связывания киназы нитратредуктазы выделен жирным шрифтом и подчеркиванием.

MAASVENRQFSHLEAGLSRSFKPRSDSPVRGCNFPSPNSTNFQKKPNSTIYLDYSSSEDDDDDDEKNEYLQMIKKGNSELEPSVHDTRDEGTADNWIERNFSMIRLTGKHPFNSEPPLNRLMHHGFITPVPLHYVRNHGPVPKGTWDDWTVEVTGLVKRPMKFTMDQLVNEFPCRELPVTLVCAGNRRKEQNMVKQTIGFNWGAAAVSTTIWRGVPLRALLKRCGVFSKNKGALNVCFEGADVLPGGGGSKYGTSIKKEFAMDPARDIIVAYMQNGEKLAPDHGFPVRMIIPGFIGGRMVKWIKRIIVTTQESDSYYHFKDNRVLPPHVDAELANTEAWWYKPEYIINELNINSVITTPCHEEILPINAWTTQRPYTLRGYSYSGGGKKVTRVEVTLDGGETWQVSTLDHPEKPTKYGKYWCWCFWSLEVEVLDLLSAKEIAVRAWDETLNTQPEKLIWNVMGMMNNCWFRVKMNVCKPHKGEIGIVFEHPTQPGNQSGGWMAKERHLEISAEAPQTLKKSISTPFINTASKMYSMSEVRKHSSADSAWIIVHGHIYDATRFLKDHPGGTDSILINAGTDCTEEFDAIHSDKAKKLLEDFRIGELITTGYTSDSPGNSVHGSSSFSSFLAPIKELVPAQRSVALIPREKIPCKLIDKQSISHDVRKFRFALPSEDQVLGLPVGKHIFLCAVIDDKLCMRAYTPTSTIDEVGYFELVVKIYFKGIHPKFPNGGQMSQYLDSMPLGSFLDVKGPLGHIEYQGKGNFLVHGKQKFAKKLAMIAGGTGITPVYQVMQAILKDPEDDTEMYVVYANRTEDDILLKEELDSWAEKIPERVKVWYVVQDSIKEGWKYSIGFITEAILREHIPEPSHTTLALACGPPPMIQFAVNPNLEKMGYDIKDSLLVF

SEQ ID NO: 4 - мутантная полинуклеотидная последовательность гена нитратредуктазы NIA2 Nicotiana tabacum. Последовательность, которая выступает в качестве сайта распознавания для связывания киназы нитратредуктазы, отвечающей за фосфорилирование аминокислоты S523 NtNIA2, выделена жирным шрифтом. Мутация по типу замены g на a выделена подчеркиванием.

1 tacatacaag ggcgcgaata aacttttttt aaagtaaatg tatatgaact tgcaatgaaa

61 gaggacctta acttgtttgt ctttgttgct ttctgcaaat ttcaccttaa cagcccattt

121 gagattgatt tagttagtta taacaattag ttaaatgctt gtgtaatttg aagaaaatat

181 ttggacgtgc tcgctgaaaa cattatactc ctatataata gaaatacttt ctgaaaagtt

241 ggtcttgttc aaaaacgtat aagagagttg gtcttctcat aaatagtcac tagctttctg

301 attttttttc actttctata tcacgtaaat aggtactcaa atttgatatt tacaccaaac

361 aaatgaaaat aggatatgtg tttttcatac gtatatttat ctatcgtact taatgataca

421 tacatataca tataacctta ctttttgatt actaaaaatt taattatatt taatttgggt

481 aaatatcaga tgccacaaaa catttaccta gccactgttt ttgactacta aaaatttaat

541 tatgtttagc ttgggtaaat atcagatgtc actaaacatt ttacctagcc attcctccga

601 aaagaaattg agaaggaaat tagagttagt ggagccataa taatgtttaa tgtgaccata

661 actcggtgaa aaccacggca agaataagaa acagctgtta aggctaacca acagctgcat

721 atctttaagc catttgctat taccccaaca tcgcatcttc ctctgatccc gaccctacgg

781 gcgtaaaaag tgtaaatcgt tagaattgtt ttatttattt tatgatgtca ctatttttta

841 aaatcaaaat taaattgggg tgtcgatttt tttgggtcct gcttatgtat agtatggcgc

901 tatggaggca ctgagagagt ccgaaacgtt tctatataag gccaccccac gcattcacaa

961 acttcgttcc caaacagaac aagaaaatca aatctcggag agagagagag agaaatattt

1021 tgagagagaa atacagaaaa tctctcttcc ttctttcctt tttttttcaa tccccattca

1081 tattcttttt ttagaataat ctatggcggc atctgtcgaa aacaggcagt tcagtcacct

1141 agaagccggt ttatcccggt ctttcaagcc ccggtctgat tccccggttc gtggctgcaa

1201 cttcccttcg cccaacagta ctaatttcca aaagaaacca aattccacca tttaccttga

1261 ttactcgtcg agtgaagacg acgatgatga tgacgaaaaa aatgagtacc ttcaaatgat

1321 taaaaaaggg aattcagagt tagagccatc tgttcatgac actagggacg aaggtaccgc

1381 tgataattgg attgaacgca acttttccat gattcgtctc accggaaagc atccatttaa

1441 ctccgaacca ccgttgaacc ggctcatgca ccacggcttt atcacaccgg tcccacttca

1501 ttacgttcgt aaccatggac cggttcccaa gggcacgtgg gatgactgga ccgtggaagt

1561 cacgggacta gtgaagcgtc ctatgaaatt cacaatggac cagttggtta acgaattccc

1621 ttgtagagaa ttgcccgtta cgcttgtttg tgctggcaat cgaaggaaag aacagaacat

1681 ggttaaacaa accattggtt tcaactgggg cgccgctgcc gtttcaacaa cgatatggcg

1741 cggggtaccc ctccgcgctt tgctaaaacg gtgcggtgtt tttagcaaga ataaaggggc

1801 gcttaatgtt tgcttcgaag gagctgatgt gttgcccgga ggtggtggtt caaagtatgg

1861 aaccagcatt aagaaggaat ttgcaatgga tccagcacga gatatcatcg tagcctacat

1921 gcagaacgga gaaaaattgg cacccgacca cgggtttcca gtacgaatga taattccagg

1981 attcattgga ggaagaatgg tgaaatggat aaagaggatt atagtcacca cccaagaatc

2041 agacagctat tatcatttca aggacaatag agttcttcct ccccatgttg atgctgaact

2101 tgcaaatacc gaaggtacgt accgtaacta tttcaattta ttactccatt tgttccaatt

2161 tatgtgaacc tatttccttt ttggtccgtt caaaaaagaa tgaacccttt ctaaatttgg

2221 taacaattta gcttaaactt acaacttcac ccttaatgag aaacttttat aaccacacaa

2281 ataccctggg gcccatttgg acttgtttag gtcgacaaat tccaaaagtt ttattttttt

2341 cttaaacttc gtgctcagtc aaacaggttc acgtaaattg aaacggagag agtatcattt

2401 ttattaaggg gtataaatat attttaatta gttgagactt gcacatacaa gtaaaatatt

2461 tcttagaata caaaatcaac tgaaagctta cttctaatta tatggttttg aattttcctt

2521 tcaatgaagt aaataaaaag gaaacaatta tattcaacgc atgtaggtat atggtcctgt

2581 cattatctca aatcaaatgg tttaaagaca aaggactttg gaaacataga attgtcagct

2641 ttatagttat ggagtactat attagttagc tgtttgcatc tattcataat tggtctatct

2701 gtgtgcagca tggtggtaca agccagagta tatcatcaat gagcttaata ttaactctgt

2761 cattacgacg ccgtgtcatg aagaaatttt gccaattaac gcctggacga ctcagcgacc

2821 ttacacgttg aggggctatt cttattctgg ttagtatttt tatattttcc gattttgctg

2881 agaatatcat atttcttagt tttgtcgata catcgtatcc tctaactctg acgttttact

2941 tcgtccttat gcacccactt acgtccttac tttctcagac agtttattga tgaaaactac

3001 ttactatttt cgacccgata gcctcagcgt ccttaattaa atgtgatgtt ttgaaagaga

3061 tattctctcc cgtctatttt aattaatttt tggctgtttt tatacgtggg aatctatttt

3121 taacattaat taatatagaa atgaaccata ttaatattat taatttcttc attgaaaata

3181 caacaaatac tcttcggctc ttactacaat gacaattttg aagaaaaata attaattcct

3241 tcctaatatc tgaaaaatca aatattgtgg accataaaaa aaggtcaaaa aattaattaa

3301 aatgaactgg agagagtaaa ttagaaaata taattatagc actagtaatt aaagttatta

3361 gatgtcttct ttaaaaagcg tgtgaaaact ttaaagacga aatataatat gaatattatc

3421 taatacttag aaagtgtcaa taattggtag acaatttaaa ctatatacta gttaaaaagt

3481 ctgtcaatac aactattagt attggggatt agagagaata gtagtaaaat ggagtaattg

3541 gacgcatgag cttgggcatg ctgattgctg tcagcttgtt tgctaatgtg aaaaagaaaa

3601 tagtaagaaa aggccaacat ggttttgttt attttattat gtggtagtac acaaaaacct

3661 ggggagcttt cctagttctg aagagtcggt ctttggtagc acaaaattaa tagtatagta

3721 taccaagtga atattaaatt caattgtcta aagcacggaa tctttttgac tactttagtt

3781 cctgcatctt gggttgcctc aacaacaccc tttattgaat tattatagta atgttcaata

3841 taatatacaa ttagaaaaca ctctaagtgg tcactttata tggatctagt caatactatt

3901 tcttctaaac aacgtgccta attacttccc actttccagt acatgaccac cattaagttt

3961 aatttttgtc aattccttgt gcaattggcc cttcaaatga gcagaagtgt tacgtaggaa

4021 aactaacttc agctactatt ataggagtaa acctgttagg aaaagatgct cgaggaactg

4081 acaaaacttg tagaataatt agccattgta ttgattgaaa tactgattgt gaacgtgtaa

4141 caaacaggcg gagggaaaaa agtaacgcga gtagaagtga cgttggatgg aggagaaaca

4201 tggcaagtta gcacactaga tcacccagag aagcccacca aatatggcaa gtactggtgt

4261 tggtgctttt ggtcactcga ggttgaggtg ttagacttgc tcagtgctaa agaaattgct

4321 gttcgagctt gggatgagac cctcaatact caacccgaga agcttatttg gaacgtcatg

4381 gtacgttcac ttcttctttt acctttattt cttttaactt ctatatacta gcggtgtaaa

4441 gttattttac accataagtt aacttacaaa aatatgtaac tatttatact acgagtgatg

4501 agggcaagaa ggggtttaag tatttgacaa taaatgtaaa ccctgcaatt ttgttcctaa

4561 ttttttatcc tttcaactct ttgtgattgc ttcattatct agattcacag agcacatgtg

4621 ttcacatgcc aaaacaaaaa actacaaaca aaaaaacttt tcactagctt tagtctaaga

4681 ttcccctttt tttttttggg aggtgtgtgg tccatactcc atagatcaat tccagccact

4741 gacgtaccaa accctgaaaa ttcctagtag ttatagcgac gtacaatcat ttcatattat

4801 gtaagcagag acgtgatcac atgaactaga tgtgaatacc acttgcccag tccaccaggt

4861 caattcatct agatgtgtaa atcttgacac cagcactggg tcacttttat aacactagca

4921 tttaacaaca tttcatcctt gaacattact tgggctaatt aataagtatt tttttttata

4981 tactctaaaa attgtaatta cataaatgaa tttaacttat acacgctgac aatgttacta

5041 attccacttt ttacggacgg ttatctatag aaatcattta ggtgaaacaa ttctcttaca

5101 ctatgatcag tgttagtaca taatggttat tacattttct aaatattgtg ctatgttgca

5161 atgttcaggg aatgatgaat aattgctggt tccgagtaaa gatgaatgtg tgcaagcctc

5221 acaagggaga gattggaata gtgtttgagc atccgactca acctggaaac caatcaggtg

5281 gatggatggc gaaggagaga catttggaga tatcagcaga ggcacctcaa acactaaaga

5341 agagtatctc aactccattc ataaacacag cttccaagat gtactccatg tccgaggtca

5401 ggaaacacag ctctgctgac tctgcttgga tcatagtcca tggtcatatc tatgacgcca

5461 cgcgtttctt gaaagatcac cctggtggga ctgacagcat tctcatcaat gctggcactg

5521 attgcactga ggaatttgat gcaattcatt ctgataaggc taagaagctc ttggaggatt

5581 tcaggattgg tgaactcata actactggtt acacctctga ctctcctggc aactccgtgc

5641 acggatcttc ttccttcagc agctttctag cacctattaa ggaacttgtt ccagcgcaga

5701 ggagtgtggc cctaattcca agagagaaaa tcccatgcaa actcatcgac aagcaatcca

5761 tctcccatga tgttaggaaa tttcgatttg cattgccctc tgaggatcaa gtcttgggct

5821 tgcctgttgg aaaacatatc ttcctctgtg ccgttattga cgataagctc tgcatgcgcg

5881 cttacacgcc tactagcacg atcgatgagg tggggtactt cgagttggtt gtcaagatat

5941 acttcaaagg aattcaccct aaattcccca atggagggca aatgtcacag tatcttgatt

6001 ctatgccgtt agggtcattt ctcgacgtga aaggtccatt aggtcacatt gaataccaag

6061 gaaagggaaa tttcttagtt catggcaaac agaagtttgc caagaagttg gccatgatag

6121 caggtggaac aggaataact ccagtgtatc aagtcatgca ggcaattctg aaagatccag

6181 aagatgacac agaaatgtat gtggtgtatg ctaacagaac agaggatgat attttactta

6241 aggaagagct tgattcatgg gctgagaaaa ttccagagag ggttaaagtt tggtatgtgg

6301 ttcaggattc tattaaagaa ggatggaagt acagcattgg ttttattaca gaagccattt

6361 tgagagaaca tatccctgag ccatctcaca caacactggc tttggcttgt ggaccacctc

6421 ctatgattca atttgctgtt aatccaaact tggagaagat gggctatgac attaaggatt

6481 ccttattggt gttctaattt taaaaacaaa acaatatctg caggaataaa tttttttttt

6541 ccccctatca gttgtacata ttgtatttgg tttatcaccc ccatgtacta cgtagtgttt

6601 gtagttctta catttttatt ttttagaatt tttttaaacc ttaggatata aaggttttct

6661 cttccaacaa agtgattctt tagggaagaa atgtactgta ctgtactagt atgtctaagc

6721 cgaaagttgt aatgtttacc atgacaaatt gtattcaatt cctcatggaa tagtaacatt

6781 gtgttcatgt gtcttcctgt aagcgatctt caaaatatca atgtatatat atagtaattg

6841 caaaccattg ttccttttcc cgatgtagtt aactactctt tctttagctt ctagtctctg

6901 gtgaatattt ttttttctat aactctttaa ttaatacggc cttaaataag agaaaagttt

6961 aaaccacgaa tatcattatg cagacgtata ggtaattaat ctactttttg aaaaaaaatc

7021 tattttcttt atgtggtcct tcaaaataat attctagaac cttttgtata ttccctttta

7081 acttctattt agtttt

SEQ ID NO: 5 - полипептидная последовательность, выступающая в качестве сайта распознавания для связывания киназы нитратредуктазы, отвечающей за фосфорилирование аминокислоты S523 в NtNIA2, из полипептидной последовательности дикого типа, кодируемой геном нитратредуктазы NIA2 Nicotiana tabacum, номер доступа в GenBank X14059.

LK(K или R)(S или T)(I, или V, или A)S(T или S)PFM

SEQ ID NO: 6 - мутантная полипептидная последовательность под SEQ ID NO: 5.

LK(K или R)(S или T)(I, или V, или A)S(T или S)PFI

SEQ ID NO: 7 - полипептидная последовательность дикого типа, выступающая в качестве сайта распознавания для связывания киназы нитратредуктазы, отвечающей за фосфорилирование аминокислоты S523 в NtNIA2, из полипептидной последовательности дикого типа, кодируемой геном нитратредуктазы NIA2 Nicotiana tabacum, номер доступа в GenBank X14059.

LKKSISTPFM

SEQ ID NO: 8 (мутантная полипептидная последовательность под SEQ ID NO: 7)

LKKSISTPFI

ТАБЛИЦА 1

Подробная информация о мутации M527I NtNIA2

Мутация	Последова-тельность перед мутацией	Последова-тельность после мутации	Исходный кодон	Исходная аминокислота	Мутантный кодон	Мутантная аминокислота
M527I	ctccattcat	aacacagctt	atG	Met	atA	Ile

Показана информация о последовательности для мутации M527I NtNIA2. Во втором и третьем столбцах показаны 10 нуклеотидов, непосредственно предшествующих мутантному нуклеотиду, и 10 нуклеотидов, расположенных после мутантного нуклеотида. В четвертом и пятом столбцах приведены исходный кодон и аминокислота (соответственно) в соответствии с последовательностью дикого типа. В последних двух столбцах приведены кодон и аминокислота (соответственно) в мутантной последовательности. Жирным шрифтом и подчеркиванием выделена мутация по типу замены G на A.

ТАБЛИЦА 2

Подробная информация о специфических праймерах для NtNIA2

Праймер	Последовательность от 5' к 3'
Прямой, NIA2	CCACTTTTTACGGACGGTTATCT
Обратный, NIA2	GCAAATCGAAATTTCCTAACATCAT

Приведена подробная информация о последовательностях специфических праймеров для NtNIA2. Во втором столбце указаны последовательности ДНК праймеров.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Филип Моррис Продактс С.А.

<120> МОДУЛИРОВАНИЕ УРОВНЕЙ НИТРАТОВ В РАСТЕНИЯХ ПОСРЕДСТВОМ МУТАЦИИ

НИТРАТРЕДУКТАЗЫ

<130> P10597EP

<160> 13

<170> PatentIn, версия 3.5

<210> 1

<211> 904

<212> БЕЛОК

<213> Nicotiana tabacum

<400> 1

Met Ala Ala Ser Val Glu Asn Arg Gln Phe Ser His Leu Glu Ala Gly

1 5 10 15

Leu Ser Arg Ser Phe Lys Pro Arg Ser Asp Ser Pro Val Arg Gly Cys

20 25 30

Asn Phe Pro Ser Pro Asn Ser Thr Asn Phe Gln Lys Lys Pro Asn Ser

35 40 45

Thr Ile Tyr Leu Asp Tyr Ser Ser Ser Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp

50 55 60

Glu Lys Asn Glu Tyr Leu Gln Met Ile Lys Lys Gly Asn Ser Glu Leu

65 70 75 80

Glu Pro Ser Val His Asp Thr Arg Asp Glu Gly Thr Ala Asp Asn Trp

85 90 95

Ile Glu Arg Asn Phe Ser Met Ile Arg Leu Thr Gly Lys His Pro Phe

100 105 110

Asn Ser Glu Pro Pro Leu Asn Arg Leu Met His His Gly Phe Ile Thr

115 120 125

Pro Val Pro Leu His Tyr Val Arg Asn His Gly Pro Val Pro Lys Gly

130 135 140

Thr Trp Asp Asp Trp Thr Val Glu Val Thr Gly Leu Val Lys Arg Pro

145 150 155 160

Met Lys Phe Thr Met Asp Gln Leu Val Asn Glu Phe Pro Cys Arg Glu

165 170 175

Leu Pro Val Thr Leu Val Cys Ala Gly Asn Arg Arg Lys Glu Gln Asn

180 185 190

Met Val Lys Gln Thr Ile Gly Phe Asn Trp Gly Ala Ala Ala Val Ser

195 200 205

Thr Thr Ile Trp Arg Gly Val Pro Leu Arg Ala Leu Leu Lys Arg Cys

210 215 220

Gly Val Phe Ser Lys Asn Lys Gly Ala Leu Asn Val Cys Phe Glu Gly

225 230 235 240

Ala Asp Val Leu Pro Gly Gly Gly Gly Ser Lys Tyr Gly Thr Ser Ile

245 250 255

Lys Lys Glu Phe Ala Met Asp Pro Ala Arg Asp Ile Ile Val Ala Tyr

260 265 270

Met Gln Asn Gly Glu Lys Leu Ala Pro Asp His Gly Phe Pro Val Arg

275 280 285

Met Ile Ile Pro Gly Phe Ile Gly Gly Arg Met Val Lys Trp Ile Lys

290 295 300

Arg Ile Ile Val Thr Thr Gln Glu Ser Asp Ser Tyr Tyr His Phe Lys

305 310 315 320

Asp Asn Arg Val Leu Pro Pro His Val Asp Ala Glu Leu Ala Asn Thr

325 330 335

Glu Ala Trp Trp Tyr Lys Pro Glu Tyr Ile Ile Asn Glu Leu Asn Ile

340 345 350

Asn Ser Val Ile Thr Thr Pro Cys His Glu Glu Ile Leu Pro Ile Asn

355 360 365

Ala Trp Thr Thr Gln Arg Pro Tyr Thr Leu Arg Gly Tyr Ser Tyr Ser

370 375 380

Gly Gly Gly Lys Lys Val Thr Arg Val Glu Val Thr Leu Asp Gly Gly

385 390 395 400

Glu Thr Trp Gln Val Ser Thr Leu Asp His Pro Glu Lys Pro Thr Lys

405 410 415

Tyr Gly Lys Tyr Trp Cys Trp Cys Phe Trp Ser Leu Glu Val Glu Val

420 425 430

Leu Asp Leu Leu Ser Ala Lys Glu Ile Ala Val Arg Ala Trp Asp Glu

435 440 445

Thr Leu Asn Thr Gln Pro Glu Lys Leu Ile Trp Asn Val Met Gly Met

450 455 460

Met Asn Asn Cys Trp Phe Arg Val Lys Met Asn Val Cys Lys Pro His

465 470 475 480

Lys Gly Glu Ile Gly Ile Val Phe Glu His Pro Thr Gln Pro Gly Asn

485 490 495

Gln Ser Gly Gly Trp Met Ala Lys Glu Arg His Leu Glu Ile Ser Ala

500 505 510

Glu Ala Pro Gln Thr Leu Lys Lys Ser Ile Ser Thr Pro Phe Met Asn

515 520 525

Thr Ala Ser Lys Met Tyr Ser Met Ser Glu Val Arg Lys His Ser Ser

530 535 540

Ala Asp Ser Ala Trp Ile Ile Val His Gly His Ile Tyr Asp Ala Thr

545 550 555 560

Arg Phe Leu Lys Asp His Pro Gly Gly Thr Asp Ser Ile Leu Ile Asn

565 570 575

Ala Gly Thr Asp Cys Thr Glu Glu Phe Asp Ala Ile His Ser Asp Lys

580 585 590

Ala Lys Lys Leu Leu Glu Asp Phe Arg Ile Gly Glu Leu Ile Thr Thr

595 600 605

Gly Tyr Thr Ser Asp Ser Pro Gly Asn Ser Val His Gly Ser Ser Ser

610 615 620

Phe Ser Ser Phe Leu Ala Pro Ile Lys Glu Leu Val Pro Ala Gln Arg

625 630 635 640

Ser Val Ala Leu Ile Pro Arg Glu Lys Ile Pro Cys Lys Leu Ile Asp

645 650 655

Lys Gln Ser Ile Ser His Asp Val Arg Lys Phe Arg Phe Ala Leu Pro

660 665 670

Ser Glu Asp Gln Val Leu Gly Leu Pro Val Gly Lys His Ile Phe Leu

675 680 685

Cys Ala Val Ile Asp Asp Lys Leu Cys Met Arg Ala Tyr Thr Pro Thr

690 695 700

Ser Thr Ile Asp Glu Val Gly Tyr Phe Glu Leu Val Val Lys Ile Tyr

705 710 715 720

Phe Lys Gly Ile His Pro Lys Phe Pro Asn Gly Gly Gln Met Ser Gln

725 730 735

Tyr Leu Asp Ser Met Pro Leu Gly Ser Phe Leu Asp Val Lys Gly Pro

740 745 750

Leu Gly His Ile Glu Tyr Gln Gly Lys Gly Asn Phe Leu Val His Gly

755 760 765

Lys Gln Lys Phe Ala Lys Lys Leu Ala Met Ile Ala Gly Gly Thr Gly

770 775 780

Ile Thr Pro Val Tyr Gln Val Met Gln Ala Ile Leu Lys Asp Pro Glu

785 790 795 800

Asp Asp Thr Glu Met Tyr Val Val Tyr Ala Asn Arg Thr Glu Asp Asp

805 810 815

Ile Leu Leu Lys Glu Glu Leu Asp Ser Trp Ala Glu Lys Ile Pro Glu

820 825 830

Arg Val Lys Val Trp Tyr Val Val Gln Asp Ser Ile Lys Glu Gly Trp

835 840 845

Lys Tyr Ser Ile Gly Phe Ile Thr Glu Ala Ile Leu Arg Glu His Ile

850 855 860

Pro Glu Pro Ser His Thr Thr Leu Ala Leu Ala Cys Gly Pro Pro Pro

865 870 875 880

Met Ile Gln Phe Ala Val Asn Pro Asn Leu Glu Lys Met Gly Tyr Asp

885 890 895

Ile Lys Asp Ser Leu Leu Val Phe

900

<210> 2

<211> 7096

<212> ДНК

<213> Nicotiana tabacum

<400> 2

tacatacaag ggcgcgaata aacttttttt aaagtaaatg tatatgaact tgcaatgaaa

60

gaggacctta acttgtttgt ctttgttgct ttctgcaaat ttcaccttaa cagcccattt

120

gagattgatt tagttagtta taacaattag ttaaatgctt gtgtaatttg aagaaaatat

180

ttggacgtgc tcgctgaaaa cattatactc ctatataata gaaatacttt ctgaaaagtt

240

ggtcttgttc aaaaacgtat aagagagttg gtcttctcat aaatagtcac tagctttctg

300

attttttttc actttctata tcacgtaaat aggtactcaa atttgatatt tacaccaaac

360

aaatgaaaat aggatatgtg tttttcatac gtatatttat ctatcgtact taatgataca

420

tacatataca tataacctta ctttttgatt actaaaaatt taattatatt taatttgggt

480

aaatatcaga tgccacaaaa catttaccta gccactgttt ttgactacta aaaatttaat

540

tatgtttagc ttgggtaaat atcagatgtc actaaacatt ttacctagcc attcctccga

600

aaagaaattg agaaggaaat tagagttagt ggagccataa taatgtttaa tgtgaccata

660

actcggtgaa aaccacggca agaataagaa acagctgtta aggctaacca acagctgcat

720

atctttaagc catttgctat taccccaaca tcgcatcttc ctctgatccc gaccctacgg

780

gcgtaaaaag tgtaaatcgt tagaattgtt ttatttattt tatgatgtca ctatttttta

840

aaatcaaaat taaattgggg tgtcgatttt tttgggtcct gcttatgtat agtatggcgc

900

tatggaggca ctgagagagt ccgaaacgtt tctatataag gccaccccac gcattcacaa

960

acttcgttcc caaacagaac aagaaaatca aatctcggag agagagagag agaaatattt

1020

tgagagagaa atacagaaaa tctctcttcc ttctttcctt tttttttcaa tccccattca

1080

tattcttttt ttagaataat ctatggcggc atctgtcgaa aacaggcagt tcagtcacct

1140

agaagccggt ttatcccggt ctttcaagcc ccggtctgat tccccggttc gtggctgcaa

1200

cttcccttcg cccaacagta ctaatttcca aaagaaacca aattccacca tttaccttga

1260

ttactcgtcg agtgaagacg acgatgatga tgacgaaaaa aatgagtacc ttcaaatgat

1320

taaaaaaggg aattcagagt tagagccatc tgttcatgac actagggacg aaggtaccgc

1380

tgataattgg attgaacgca acttttccat gattcgtctc accggaaagc atccatttaa

1440

ctccgaacca ccgttgaacc ggctcatgca ccacggcttt atcacaccgg tcccacttca

1500

ttacgttcgt aaccatggac cggttcccaa gggcacgtgg gatgactgga ccgtggaagt

1560

cacgggacta gtgaagcgtc ctatgaaatt cacaatggac cagttggtta acgaattccc

1620

ttgtagagaa ttgcccgtta cgcttgtttg tgctggcaat cgaaggaaag aacagaacat

1680

ggttaaacaa accattggtt tcaactgggg cgccgctgcc gtttcaacaa cgatatggcg

1740

cggggtaccc ctccgcgctt tgctaaaacg gtgcggtgtt tttagcaaga ataaaggggc

1800

gcttaatgtt tgcttcgaag gagctgatgt gttgcccgga ggtggtggtt caaagtatgg

1860

aaccagcatt aagaaggaat ttgcaatgga tccagcacga gatatcatcg tagcctacat

1920

gcagaacgga gaaaaattgg cacccgacca cgggtttcca gtacgaatga taattccagg

1980

attcattgga ggaagaatgg tgaaatggat aaagaggatt atagtcacca cccaagaatc

2040

agacagctat tatcatttca aggacaatag agttcttcct ccccatgttg atgctgaact

2100

tgcaaatacc gaaggtacgt accgtaacta tttcaattta ttactccatt tgttccaatt

2160

tatgtgaacc tatttccttt ttggtccgtt caaaaaagaa tgaacccttt ctaaatttgg

2220

taacaattta gcttaaactt acaacttcac ccttaatgag aaacttttat aaccacacaa

2280

ataccctggg gcccatttgg acttgtttag gtcgacaaat tccaaaagtt ttattttttt

2340

cttaaacttc gtgctcagtc aaacaggttc acgtaaattg aaacggagag agtatcattt

2400

ttattaaggg gtataaatat attttaatta gttgagactt gcacatacaa gtaaaatatt

2460

tcttagaata caaaatcaac tgaaagctta cttctaatta tatggttttg aattttcctt

2520

tcaatgaagt aaataaaaag gaaacaatta tattcaacgc atgtaggtat atggtcctgt

2580

cattatctca aatcaaatgg tttaaagaca aaggactttg gaaacataga attgtcagct

2640

ttatagttat ggagtactat attagttagc tgtttgcatc tattcataat tggtctatct

2700

gtgtgcagca tggtggtaca agccagagta tatcatcaat gagcttaata ttaactctgt

2760

cattacgacg ccgtgtcatg aagaaatttt gccaattaac gcctggacga ctcagcgacc

2820

ttacacgttg aggggctatt cttattctgg ttagtatttt tatattttcc gattttgctg

2880

agaatatcat atttcttagt tttgtcgata catcgtatcc tctaactctg acgttttact

2940

tcgtccttat gcacccactt acgtccttac tttctcagac agtttattga tgaaaactac

3000

ttactatttt cgacccgata gcctcagcgt ccttaattaa atgtgatgtt ttgaaagaga

3060

tattctctcc cgtctatttt aattaatttt tggctgtttt tatacgtggg aatctatttt

3120

taacattaat taatatagaa atgaaccata ttaatattat taatttcttc attgaaaata

3180

caacaaatac tcttcggctc ttactacaat gacaattttg aagaaaaata attaattcct

3240

tcctaatatc tgaaaaatca aatattgtgg accataaaaa aaggtcaaaa aattaattaa

3300

aatgaactgg agagagtaaa ttagaaaata taattatagc actagtaatt aaagttatta

3360

gatgtcttct ttaaaaagcg tgtgaaaact ttaaagacga aatataatat gaatattatc

3420

taatacttag aaagtgtcaa taattggtag acaatttaaa ctatatacta gttaaaaagt

3480

ctgtcaatac aactattagt attggggatt agagagaata gtagtaaaat ggagtaattg

3540

gacgcatgag cttgggcatg ctgattgctg tcagcttgtt tgctaatgtg aaaaagaaaa

3600

tagtaagaaa aggccaacat ggttttgttt attttattat gtggtagtac acaaaaacct

3660

ggggagcttt cctagttctg aagagtcggt ctttggtagc acaaaattaa tagtatagta

3720

taccaagtga atattaaatt caattgtcta aagcacggaa tctttttgac tactttagtt

3780

cctgcatctt gggttgcctc aacaacaccc tttattgaat tattatagta atgttcaata

3840

taatatacaa ttagaaaaca ctctaagtgg tcactttata tggatctagt caatactatt

3900

tcttctaaac aacgtgccta attacttccc actttccagt acatgaccac cattaagttt

3960

aatttttgtc aattccttgt gcaattggcc cttcaaatga gcagaagtgt tacgtaggaa

4020

aactaacttc agctactatt ataggagtaa acctgttagg aaaagatgct cgaggaactg

4080

acaaaacttg tagaataatt agccattgta ttgattgaaa tactgattgt gaacgtgtaa

4140

caaacaggcg gagggaaaaa agtaacgcga gtagaagtga cgttggatgg aggagaaaca

4200

tggcaagtta gcacactaga tcacccagag aagcccacca aatatggcaa gtactggtgt

4260

tggtgctttt ggtcactcga ggttgaggtg ttagacttgc tcagtgctaa agaaattgct

4320

gttcgagctt gggatgagac cctcaatact caacccgaga agcttatttg gaacgtcatg

4380

gtacgttcac ttcttctttt acctttattt cttttaactt ctatatacta gcggtgtaaa

4440

gttattttac accataagtt aacttacaaa aatatgtaac tatttatact acgagtgatg

4500

agggcaagaa ggggtttaag tatttgacaa taaatgtaaa ccctgcaatt ttgttcctaa

4560

ttttttatcc tttcaactct ttgtgattgc ttcattatct agattcacag agcacatgtg

4620

ttcacatgcc aaaacaaaaa actacaaaca aaaaaacttt tcactagctt tagtctaaga

4680

ttcccctttt tttttttggg aggtgtgtgg tccatactcc atagatcaat tccagccact

4740

gacgtaccaa accctgaaaa ttcctagtag ttatagcgac gtacaatcat ttcatattat

4800

gtaagcagag acgtgatcac atgaactaga tgtgaatacc acttgcccag tccaccaggt

4860

caattcatct agatgtgtaa atcttgacac cagcactggg tcacttttat aacactagca

4920

tttaacaaca tttcatcctt gaacattact tgggctaatt aataagtatt tttttttata

4980

tactctaaaa attgtaatta cataaatgaa tttaacttat acacgctgac aatgttacta

5040

attccacttt ttacggacgg ttatctatag aaatcattta ggtgaaacaa ttctcttaca

5100

ctatgatcag tgttagtaca taatggttat tacattttct aaatattgtg ctatgttgca

5160

atgttcaggg aatgatgaat aattgctggt tccgagtaaa gatgaatgtg tgcaagcctc

5220

acaagggaga gattggaata gtgtttgagc atccgactca acctggaaac caatcaggtg

5280

gatggatggc gaaggagaga catttggaga tatcagcaga ggcacctcaa acactaaaga

5340

agagtatctc aactccattc atgaacacag cttccaagat gtactccatg tccgaggtca

5400

ggaaacacag ctctgctgac tctgcttgga tcatagtcca tggtcatatc tatgacgcca

5460

cgcgtttctt gaaagatcac cctggtggga ctgacagcat tctcatcaat gctggcactg

5520

attgcactga ggaatttgat gcaattcatt ctgataaggc taagaagctc ttggaggatt

5580

tcaggattgg tgaactcata actactggtt acacctctga ctctcctggc aactccgtgc

5640

acggatcttc ttccttcagc agctttctag cacctattaa ggaacttgtt ccagcgcaga

5700

ggagtgtggc cctaattcca agagagaaaa tcccatgcaa actcatcgac aagcaatcca

5760

tctcccatga tgttaggaaa tttcgatttg cattgccctc tgaggatcaa gtcttgggct

5820

tgcctgttgg aaaacatatc ttcctctgtg ccgttattga cgataagctc tgcatgcgcg

5880

cttacacgcc tactagcacg atcgatgagg tggggtactt cgagttggtt gtcaagatat

5940

acttcaaagg aattcaccct aaattcccca atggagggca aatgtcacag tatcttgatt

6000

ctatgccgtt agggtcattt ctcgacgtga aaggtccatt aggtcacatt gaataccaag

6060

gaaagggaaa tttcttagtt catggcaaac agaagtttgc caagaagttg gccatgatag

6120

caggtggaac aggaataact ccagtgtatc aagtcatgca ggcaattctg aaagatccag

6180

aagatgacac agaaatgtat gtggtgtatg ctaacagaac agaggatgat attttactta

6240

aggaagagct tgattcatgg gctgagaaaa ttccagagag ggttaaagtt tggtatgtgg

6300

ttcaggattc tattaaagaa ggatggaagt acagcattgg ttttattaca gaagccattt

6360

tgagagaaca tatccctgag ccatctcaca caacactggc tttggcttgt ggaccacctc

6420

ctatgattca atttgctgtt aatccaaact tggagaagat gggctatgac attaaggatt

6480

ccttattggt gttctaattt taaaaacaaa acaatatctg caggaataaa tttttttttt

6540

ccccctatca gttgtacata ttgtatttgg tttatcaccc ccatgtacta cgtagtgttt

6600

gtagttctta catttttatt ttttagaatt tttttaaacc ttaggatata aaggttttct

6660

cttccaacaa agtgattctt tagggaagaa atgtactgta ctgtactagt atgtctaagc

6720

cgaaagttgt aatgtttacc atgacaaatt gtattcaatt cctcatggaa tagtaacatt

6780

gtgttcatgt gtcttcctgt aagcgatctt caaaatatca atgtatatat atagtaattg

6840

caaaccattg ttccttttcc cgatgtagtt aactactctt tctttagctt ctagtctctg

6900

gtgaatattt ttttttctat aactctttaa ttaatacggc cttaaataag agaaaagttt

6960

aaaccacgaa tatcattatg cagacgtata ggtaattaat ctactttttg aaaaaaaatc

7020

tattttcttt atgtggtcct tcaaaataat attctagaac cttttgtata ttccctttta

7080

acttctattt agtttt

7096

<210> 3

<211> 904

<212> БЕЛОК

<213> Nicotiana tabacum

<400> 3

Met Ala Ala Ser Val Glu Asn Arg Gln Phe Ser His Leu Glu Ala Gly

1 5 10 15

Leu Ser Arg Ser Phe Lys Pro Arg Ser Asp Ser Pro Val Arg Gly Cys

20 25 30

Asn Phe Pro Ser Pro Asn Ser Thr Asn Phe Gln Lys Lys Pro Asn Ser

35 40 45

Thr Ile Tyr Leu Asp Tyr Ser Ser Ser Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp

50 55 60

Glu Lys Asn Glu Tyr Leu Gln Met Ile Lys Lys Gly Asn Ser Glu Leu

65 70 75 80

Glu Pro Ser Val His Asp Thr Arg Asp Glu Gly Thr Ala Asp Asn Trp

85 90 95

Ile Glu Arg Asn Phe Ser Met Ile Arg Leu Thr Gly Lys His Pro Phe

100 105 110

Asn Ser Glu Pro Pro Leu Asn Arg Leu Met His His Gly Phe Ile Thr

115 120 125

Pro Val Pro Leu His Tyr Val Arg Asn His Gly Pro Val Pro Lys Gly

130 135 140

Thr Trp Asp Asp Trp Thr Val Glu Val Thr Gly Leu Val Lys Arg Pro

145 150 155 160

Met Lys Phe Thr Met Asp Gln Leu Val Asn Glu Phe Pro Cys Arg Glu

165 170 175

Leu Pro Val Thr Leu Val Cys Ala Gly Asn Arg Arg Lys Glu Gln Asn

180 185 190

Met Val Lys Gln Thr Ile Gly Phe Asn Trp Gly Ala Ala Ala Val Ser

195 200 205

Thr Thr Ile Trp Arg Gly Val Pro Leu Arg Ala Leu Leu Lys Arg Cys

210 215 220

Gly Val Phe Ser Lys Asn Lys Gly Ala Leu Asn Val Cys Phe Glu Gly

225 230 235 240

Ala Asp Val Leu Pro Gly Gly Gly Gly Ser Lys Tyr Gly Thr Ser Ile

245 250 255

Lys Lys Glu Phe Ala Met Asp Pro Ala Arg Asp Ile Ile Val Ala Tyr

260 265 270

Met Gln Asn Gly Glu Lys Leu Ala Pro Asp His Gly Phe Pro Val Arg

275 280 285

Met Ile Ile Pro Gly Phe Ile Gly Gly Arg Met Val Lys Trp Ile Lys

290 295 300

Arg Ile Ile Val Thr Thr Gln Glu Ser Asp Ser Tyr Tyr His Phe Lys

305 310 315 320

Asp Asn Arg Val Leu Pro Pro His Val Asp Ala Glu Leu Ala Asn Thr

325 330 335

Glu Ala Trp Trp Tyr Lys Pro Glu Tyr Ile Ile Asn Glu Leu Asn Ile

340 345 350

Asn Ser Val Ile Thr Thr Pro Cys His Glu Glu Ile Leu Pro Ile Asn

355 360 365

Ala Trp Thr Thr Gln Arg Pro Tyr Thr Leu Arg Gly Tyr Ser Tyr Ser

370 375 380

Gly Gly Gly Lys Lys Val Thr Arg Val Glu Val Thr Leu Asp Gly Gly

385 390 395 400

Glu Thr Trp Gln Val Ser Thr Leu Asp His Pro Glu Lys Pro Thr Lys

405 410 415

Tyr Gly Lys Tyr Trp Cys Trp Cys Phe Trp Ser Leu Glu Val Glu Val

420 425 430

Leu Asp Leu Leu Ser Ala Lys Glu Ile Ala Val Arg Ala Trp Asp Glu

435 440 445

Thr Leu Asn Thr Gln Pro Glu Lys Leu Ile Trp Asn Val Met Gly Met

450 455 460

Met Asn Asn Cys Trp Phe Arg Val Lys Met Asn Val Cys Lys Pro His

465 470 475 480

Lys Gly Glu Ile Gly Ile Val Phe Glu His Pro Thr Gln Pro Gly Asn

485 490 495

Gln Ser Gly Gly Trp Met Ala Lys Glu Arg His Leu Glu Ile Ser Ala

500 505 510

Glu Ala Pro Gln Thr Leu Lys Lys Ser Ile Ser Thr Pro Phe Ile Asn

515 520 525

Thr Ala Ser Lys Met Tyr Ser Met Ser Glu Val Arg Lys His Ser Ser

530 535 540

Ala Asp Ser Ala Trp Ile Ile Val His Gly His Ile Tyr Asp Ala Thr

545 550 555 560

Arg Phe Leu Lys Asp His Pro Gly Gly Thr Asp Ser Ile Leu Ile Asn

565 570 575

Ala Gly Thr Asp Cys Thr Glu Glu Phe Asp Ala Ile His Ser Asp Lys

580 585 590

Ala Lys Lys Leu Leu Glu Asp Phe Arg Ile Gly Glu Leu Ile Thr Thr

595 600 605

Gly Tyr Thr Ser Asp Ser Pro Gly Asn Ser Val His Gly Ser Ser Ser

610 615 620

Phe Ser Ser Phe Leu Ala Pro Ile Lys Glu Leu Val Pro Ala Gln Arg

625 630 635 640

Ser Val Ala Leu Ile Pro Arg Glu Lys Ile Pro Cys Lys Leu Ile Asp

645 650 655

Lys Gln Ser Ile Ser His Asp Val Arg Lys Phe Arg Phe Ala Leu Pro

660 665 670

Ser Glu Asp Gln Val Leu Gly Leu Pro Val Gly Lys His Ile Phe Leu

675 680 685

Cys Ala Val Ile Asp Asp Lys Leu Cys Met Arg Ala Tyr Thr Pro Thr

690 695 700

Ser Thr Ile Asp Glu Val Gly Tyr Phe Glu Leu Val Val Lys Ile Tyr

705 710 715 720

Phe Lys Gly Ile His Pro Lys Phe Pro Asn Gly Gly Gln Met Ser Gln

725 730 735

Tyr Leu Asp Ser Met Pro Leu Gly Ser Phe Leu Asp Val Lys Gly Pro

740 745 750

Leu Gly His Ile Glu Tyr Gln Gly Lys Gly Asn Phe Leu Val His Gly

755 760 765

Lys Gln Lys Phe Ala Lys Lys Leu Ala Met Ile Ala Gly Gly Thr Gly

770 775 780

Ile Thr Pro Val Tyr Gln Val Met Gln Ala Ile Leu Lys Asp Pro Glu

785 790 795 800

Asp Asp Thr Glu Met Tyr Val Val Tyr Ala Asn Arg Thr Glu Asp Asp

805 810 815

Ile Leu Leu Lys Glu Glu Leu Asp Ser Trp Ala Glu Lys Ile Pro Glu

820 825 830

Arg Val Lys Val Trp Tyr Val Val Gln Asp Ser Ile Lys Glu Gly Trp

835 840 845

Lys Tyr Ser Ile Gly Phe Ile Thr Glu Ala Ile Leu Arg Glu His Ile

850 855 860

Pro Glu Pro Ser His Thr Thr Leu Ala Leu Ala Cys Gly Pro Pro Pro

865 870 875 880

Met Ile Gln Phe Ala Val Asn Pro Asn Leu Glu Lys Met Gly Tyr Asp

885 890 895

Ile Lys Asp Ser Leu Leu Val Phe

900

<210> 4

<211> 7096

<212> ДНК

<213> Nicotiana tabacum

<400> 4

tacatacaag ggcgcgaata aacttttttt aaagtaaatg tatatgaact tgcaatgaaa

60

gaggacctta acttgtttgt ctttgttgct ttctgcaaat ttcaccttaa cagcccattt

120

gagattgatt tagttagtta taacaattag ttaaatgctt gtgtaatttg aagaaaatat

180

ttggacgtgc tcgctgaaaa cattatactc ctatataata gaaatacttt ctgaaaagtt

240

ggtcttgttc aaaaacgtat aagagagttg gtcttctcat aaatagtcac tagctttctg

300

attttttttc actttctata tcacgtaaat aggtactcaa atttgatatt tacaccaaac

360

aaatgaaaat aggatatgtg tttttcatac gtatatttat ctatcgtact taatgataca

420

tacatataca tataacctta ctttttgatt actaaaaatt taattatatt taatttgggt

480

aaatatcaga tgccacaaaa catttaccta gccactgttt ttgactacta aaaatttaat

540

tatgtttagc ttgggtaaat atcagatgtc actaaacatt ttacctagcc attcctccga

600

aaagaaattg agaaggaaat tagagttagt ggagccataa taatgtttaa tgtgaccata

660

actcggtgaa aaccacggca agaataagaa acagctgtta aggctaacca acagctgcat

720

atctttaagc catttgctat taccccaaca tcgcatcttc ctctgatccc gaccctacgg

780

gcgtaaaaag tgtaaatcgt tagaattgtt ttatttattt tatgatgtca ctatttttta

840

aaatcaaaat taaattgggg tgtcgatttt tttgggtcct gcttatgtat agtatggcgc

900

tatggaggca ctgagagagt ccgaaacgtt tctatataag gccaccccac gcattcacaa

960

acttcgttcc caaacagaac aagaaaatca aatctcggag agagagagag agaaatattt

1020

tgagagagaa atacagaaaa tctctcttcc ttctttcctt tttttttcaa tccccattca

1080

tattcttttt ttagaataat ctatggcggc atctgtcgaa aacaggcagt tcagtcacct

1140

agaagccggt ttatcccggt ctttcaagcc ccggtctgat tccccggttc gtggctgcaa

1200

cttcccttcg cccaacagta ctaatttcca aaagaaacca aattccacca tttaccttga

1260

ttactcgtcg agtgaagacg acgatgatga tgacgaaaaa aatgagtacc ttcaaatgat

1320

taaaaaaggg aattcagagt tagagccatc tgttcatgac actagggacg aaggtaccgc

1380

tgataattgg attgaacgca acttttccat gattcgtctc accggaaagc atccatttaa

1440

ctccgaacca ccgttgaacc ggctcatgca ccacggcttt atcacaccgg tcccacttca

1500

ttacgttcgt aaccatggac cggttcccaa gggcacgtgg gatgactgga ccgtggaagt

1560

cacgggacta gtgaagcgtc ctatgaaatt cacaatggac cagttggtta acgaattccc

1620

ttgtagagaa ttgcccgtta cgcttgtttg tgctggcaat cgaaggaaag aacagaacat

1680

ggttaaacaa accattggtt tcaactgggg cgccgctgcc gtttcaacaa cgatatggcg

1740

cggggtaccc ctccgcgctt tgctaaaacg gtgcggtgtt tttagcaaga ataaaggggc

1800

gcttaatgtt tgcttcgaag gagctgatgt gttgcccgga ggtggtggtt caaagtatgg

1860

aaccagcatt aagaaggaat ttgcaatgga tccagcacga gatatcatcg tagcctacat

1920

gcagaacgga gaaaaattgg cacccgacca cgggtttcca gtacgaatga taattccagg

1980

attcattgga ggaagaatgg tgaaatggat aaagaggatt atagtcacca cccaagaatc

2040

agacagctat tatcatttca aggacaatag agttcttcct ccccatgttg atgctgaact

2100

tgcaaatacc gaaggtacgt accgtaacta tttcaattta ttactccatt tgttccaatt

2160

tatgtgaacc tatttccttt ttggtccgtt caaaaaagaa tgaacccttt ctaaatttgg

2220

taacaattta gcttaaactt acaacttcac ccttaatgag aaacttttat aaccacacaa

2280

ataccctggg gcccatttgg acttgtttag gtcgacaaat tccaaaagtt ttattttttt

2340

cttaaacttc gtgctcagtc aaacaggttc acgtaaattg aaacggagag agtatcattt

2400

ttattaaggg gtataaatat attttaatta gttgagactt gcacatacaa gtaaaatatt

2460

tcttagaata caaaatcaac tgaaagctta cttctaatta tatggttttg aattttcctt

2520

tcaatgaagt aaataaaaag gaaacaatta tattcaacgc atgtaggtat atggtcctgt

2580

cattatctca aatcaaatgg tttaaagaca aaggactttg gaaacataga attgtcagct

2640

ttatagttat ggagtactat attagttagc tgtttgcatc tattcataat tggtctatct

2700

gtgtgcagca tggtggtaca agccagagta tatcatcaat gagcttaata ttaactctgt

2760

cattacgacg ccgtgtcatg aagaaatttt gccaattaac gcctggacga ctcagcgacc

2820

ttacacgttg aggggctatt cttattctgg ttagtatttt tatattttcc gattttgctg

2880

agaatatcat atttcttagt tttgtcgata catcgtatcc tctaactctg acgttttact

2940

tcgtccttat gcacccactt acgtccttac tttctcagac agtttattga tgaaaactac

3000

ttactatttt cgacccgata gcctcagcgt ccttaattaa atgtgatgtt ttgaaagaga

3060

tattctctcc cgtctatttt aattaatttt tggctgtttt tatacgtggg aatctatttt

3120

taacattaat taatatagaa atgaaccata ttaatattat taatttcttc attgaaaata

3180

caacaaatac tcttcggctc ttactacaat gacaattttg aagaaaaata attaattcct

3240

tcctaatatc tgaaaaatca aatattgtgg accataaaaa aaggtcaaaa aattaattaa

3300

aatgaactgg agagagtaaa ttagaaaata taattatagc actagtaatt aaagttatta

3360

gatgtcttct ttaaaaagcg tgtgaaaact ttaaagacga aatataatat gaatattatc

3420

taatacttag aaagtgtcaa taattggtag acaatttaaa ctatatacta gttaaaaagt

3480

ctgtcaatac aactattagt attggggatt agagagaata gtagtaaaat ggagtaattg

3540

gacgcatgag cttgggcatg ctgattgctg tcagcttgtt tgctaatgtg aaaaagaaaa

3600

tagtaagaaa aggccaacat ggttttgttt attttattat gtggtagtac acaaaaacct

3660

ggggagcttt cctagttctg aagagtcggt ctttggtagc acaaaattaa tagtatagta

3720

taccaagtga atattaaatt caattgtcta aagcacggaa tctttttgac tactttagtt

3780

cctgcatctt gggttgcctc aacaacaccc tttattgaat tattatagta atgttcaata

3840

taatatacaa ttagaaaaca ctctaagtgg tcactttata tggatctagt caatactatt

3900

tcttctaaac aacgtgccta attacttccc actttccagt acatgaccac cattaagttt

3960

aatttttgtc aattccttgt gcaattggcc cttcaaatga gcagaagtgt tacgtaggaa

4020

aactaacttc agctactatt ataggagtaa acctgttagg aaaagatgct cgaggaactg

4080

acaaaacttg tagaataatt agccattgta ttgattgaaa tactgattgt gaacgtgtaa

4140

caaacaggcg gagggaaaaa agtaacgcga gtagaagtga cgttggatgg aggagaaaca

4200

tggcaagtta gcacactaga tcacccagag aagcccacca aatatggcaa gtactggtgt

4260

tggtgctttt ggtcactcga ggttgaggtg ttagacttgc tcagtgctaa agaaattgct

4320

gttcgagctt gggatgagac cctcaatact caacccgaga agcttatttg gaacgtcatg

4380

gtacgttcac ttcttctttt acctttattt cttttaactt ctatatacta gcggtgtaaa

4440

gttattttac accataagtt aacttacaaa aatatgtaac tatttatact acgagtgatg

4500

agggcaagaa ggggtttaag tatttgacaa taaatgtaaa ccctgcaatt ttgttcctaa

4560

ttttttatcc tttcaactct ttgtgattgc ttcattatct agattcacag agcacatgtg

4620

ttcacatgcc aaaacaaaaa actacaaaca aaaaaacttt tcactagctt tagtctaaga

4680

ttcccctttt tttttttggg aggtgtgtgg tccatactcc atagatcaat tccagccact

4740

gacgtaccaa accctgaaaa ttcctagtag ttatagcgac gtacaatcat ttcatattat

4800

gtaagcagag acgtgatcac atgaactaga tgtgaatacc acttgcccag tccaccaggt

4860

caattcatct agatgtgtaa atcttgacac cagcactggg tcacttttat aacactagca

4920

tttaacaaca tttcatcctt gaacattact tgggctaatt aataagtatt tttttttata

4980

tactctaaaa attgtaatta cataaatgaa tttaacttat acacgctgac aatgttacta

5040

attccacttt ttacggacgg ttatctatag aaatcattta ggtgaaacaa ttctcttaca

5100

ctatgatcag tgttagtaca taatggttat tacattttct aaatattgtg ctatgttgca

5160

atgttcaggg aatgatgaat aattgctggt tccgagtaaa gatgaatgtg tgcaagcctc

5220

acaagggaga gattggaata gtgtttgagc atccgactca acctggaaac caatcaggtg

5280

gatggatggc gaaggagaga catttggaga tatcagcaga ggcacctcaa acactaaaga

5340

agagtatctc aactccattc ataaacacag cttccaagat gtactccatg tccgaggtca

5400

ggaaacacag ctctgctgac tctgcttgga tcatagtcca tggtcatatc tatgacgcca

5460

cgcgtttctt gaaagatcac cctggtggga ctgacagcat tctcatcaat gctggcactg

5520

attgcactga ggaatttgat gcaattcatt ctgataaggc taagaagctc ttggaggatt

5580

tcaggattgg tgaactcata actactggtt acacctctga ctctcctggc aactccgtgc

5640

acggatcttc ttccttcagc agctttctag cacctattaa ggaacttgtt ccagcgcaga

5700

ggagtgtggc cctaattcca agagagaaaa tcccatgcaa actcatcgac aagcaatcca

5760

tctcccatga tgttaggaaa tttcgatttg cattgccctc tgaggatcaa gtcttgggct

5820

tgcctgttgg aaaacatatc ttcctctgtg ccgttattga cgataagctc tgcatgcgcg

5880

cttacacgcc tactagcacg atcgatgagg tggggtactt cgagttggtt gtcaagatat

5940

acttcaaagg aattcaccct aaattcccca atggagggca aatgtcacag tatcttgatt

6000

ctatgccgtt agggtcattt ctcgacgtga aaggtccatt aggtcacatt gaataccaag

6060

gaaagggaaa tttcttagtt catggcaaac agaagtttgc caagaagttg gccatgatag

6120

caggtggaac aggaataact ccagtgtatc aagtcatgca ggcaattctg aaagatccag

6180

aagatgacac agaaatgtat gtggtgtatg ctaacagaac agaggatgat attttactta

6240

aggaagagct tgattcatgg gctgagaaaa ttccagagag ggttaaagtt tggtatgtgg

6300

ttcaggattc tattaaagaa ggatggaagt acagcattgg ttttattaca gaagccattt

6360

tgagagaaca tatccctgag ccatctcaca caacactggc tttggcttgt ggaccacctc

6420

ctatgattca atttgctgtt aatccaaact tggagaagat gggctatgac attaaggatt

6480

ccttattggt gttctaattt taaaaacaaa acaatatctg caggaataaa tttttttttt

6540

ccccctatca gttgtacata ttgtatttgg tttatcaccc ccatgtacta cgtagtgttt

6600

gtagttctta catttttatt ttttagaatt tttttaaacc ttaggatata aaggttttct

6660

cttccaacaa agtgattctt tagggaagaa atgtactgta ctgtactagt atgtctaagc

6720

cgaaagttgt aatgtttacc atgacaaatt gtattcaatt cctcatggaa tagtaacatt

6780

gtgttcatgt gtcttcctgt aagcgatctt caaaatatca atgtatatat atagtaattg

6840

caaaccattg ttccttttcc cgatgtagtt aactactctt tctttagctt ctagtctctg

6900

gtgaatattt ttttttctat aactctttaa ttaatacggc cttaaataag agaaaagttt

6960

aaaccacgaa tatcattatg cagacgtata ggtaattaat ctactttttg aaaaaaaatc

7020

tattttcttt atgtggtcct tcaaaataat attctagaac cttttgtata ttccctttta

7080

acttctattt agtttt

7096

<210> 5

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Nicotiana tabacum

<220>

<221> ДРУГОЙ_ПРИЗНАК

<222> (3)..(3)

<223> Lys или Arg

<220>

<221> ДРУГОЙ_ПРИЗНАК

<222> (4)..(4)

<223> Ser или Thr

<220>

<221> ДРУГОЙ_ПРИЗНАК

<222> (5)..(5)

<223> Ile, или Val, или Ala

<220>

<221> ДРУГОЙ_ПРИЗНАК

<222> (7)..(7)

<223> Thr или Ser

<400> 5

Leu Lys Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Pro Phe Met

1 5 10

<210> 6

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Nicotiana tabacum

<220>

<221> ДРУГОЙ_ПРИЗНАК

<222> (3)..(3)

<223> Lys или Arg

<220>

<221> ДРУГОЙ_ПРИЗНАК

<222> (4)..(4)

<223> Ser или Thr

<220>

<221> ДРУГОЙ_ПРИЗНАК

<222> (5)..(5)

<223> Ile, или Val, или Ala

<220>

<221> ДРУГОЙ_ПРИЗНАК

<222> (7)..(7)

<223> Thr или Ser

<400> 6

Leu Lys Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Pro Phe Ile

1 5 10

<210> 7

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Nicotiana tabacum

<400> 7

Leu Lys Lys Ser Ile Ser Thr Pro Phe Met

1 5 10

<210> 8

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Nicotiana tabacum

<400> 8

Leu Lys Lys Ser Ile Ser Thr Pro Phe Ile

1 5 10

<210> 9

<211> 10

<212> ДНК

<213> Nicotiana tabacum

<400> 9

ctccattcat

10

<210> 10

<211> 10

<212> ДНК

<213> Nicotiana tabacum

<400> 10

aacacagctt

10

<210> 11

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 11

ccacttttta cggacggtta tct

23

<210> 12

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 12

gcaaatcgaa atttcctaac atcat

25

<210> 13

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Nicotiana tabacum

<400> 13

Lys Ser Ile Ser Thr Pro

1 5

<---

Claims (24)

1. Клетка табачного растения, характеризующаяся уменьшенными уровнями нитратов в высушенных листьях табачного растения, содержащего упомянутую клетку табачного растения, по сравнению с контрольным растением, причем упомянутая клетка табачного растения содержит:

(a) полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид нитратредуктазу, содержащий непрерывную полипептидную последовательность под SEQ ID NO: 7, где метионин заменен изолейцином (I) в положении 527, соответствующем положению 527 в последовательности, характеризующейся последовательностью с SEQ ID NO: 1, причем упомянутая замена уменьшает уровни нитратов в растительной клетке по сравнению с контрольной растительной клеткой; или

(b) полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью, представленной в (a).

2. Клетка по п. 1, где полипептид предпочтительно содержит непрерывную полипептидную последовательность под SEQ ID NO: 8.

3. Клетка по любому из предыдущих пунктов, где полипептид нитратредуктаза содержит полипептидную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 3, или состоит из нее.

4. Клетка по любому из предыдущих пунктов, где полинуклеотидная последовательность содержит полинуклеотидную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 80% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 4, или состоит из нее.

5. Клетка по любому из предыдущих пунктов, где полинуклеотидная последовательность содержит полинуклеотидную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 4, или состоит из нее.

6. Клетка по любому из предыдущих пунктов, где клетка табачного растения представляет собой клетку растения Nicotiana tabacum.

7. Клетка по п. 6, где растительная клетка представляет собой клетку растения Nicotiana tabacum культивара AA37.

8. Табачное растение, характеризующееся тем, что высушенные листья табачного растения содержат более низкие уровни нитратов по сравнению с контрольным табачным растением, и при этом уровень нитратов уменьшен по сравнению с контрольным растением, причем упомянутое табачное растение содержит клетку табачного растения по любому из предыдущих пунктов.

9. Часть табачного растения, характеризующаяся тем, что высушенные листья части табачного растения содержат более низкие уровни нитратов по сравнению с частью контрольного табачного растения, и при этом уровень нитратов уменьшен по сравнению с частью контрольного растения, причем упомянутая часть табачного растения содержит клетку табачного растения по любому из пп. 1-7.

10. Табачный растительный материал, характеризующийся уменьшенными уровнями нитратов в высушенных листьях по сравнению с высушенными листьями контрольного растения, причем упомянутый табачный растительный материал содержит клетку табачного растения по п. 1 или часть табачного растения, содержащего клетку табачного растения по п. 1, при этом растительный материал содержит биомассу, семя, стебель, цветки или листья табачного растения по п. 8 или части табачного растения по п. 9.

11. Высушенный табачный растительный материал, характеризующийся уменьшенными уровнями нитратов в высушенных листьях по сравнению с высушенными листьями контрольного растения, причем упомянутый высушенный табачный растительный материал содержит клетку табачного растения по п. 1 или часть табачного растения, содержащего клетку табачного растения по п. 1, при этом высушенный растительный материал содержит биомассу, семя, стебель, цветки или листья табачного растения по п. 8 или части табачного растения по п. 9.

12. Гомогенизированный табачный растительный материал, характеризующийся уменьшенными уровнями нитратов в высушенных листьях по сравнению с высушенными листьями контрольного растения, причем упомянутый гомогенизированный табачный растительный материал содержит клетку табачного растения по п. 1 или часть табачного растения, содержащего клетку табачного растения по п. 1, при этом гомогенизированный растительный материал содержит биомассу, семя, стебель, цветки или листья табачного растения по п. 8 или части табачного растения по п. 9.

13. Табачный продукт, характеризующийся уменьшенными уровнями нитратов в высушенных листьях по сравнению с табачным растительным материалом контрольного растения, причем упомянутый табачный продукт содержит клетку табачного растения по любому из пп. 1-7, растение по п. 8, часть табачного растения по п. 9, табачный растительный материал по п. 10, высушенный табачный растительный материал по п. 11 или гомогенизированный табачный растительный материал по п. 12.

14. Способ получения табачного растения по п. 8, включающий стадии:

(a) получения клетки табачного растения по любому из пп. 1-7 и

(b) размножения клетки табачного растения с получением растения.

15. Способ получения высушенного табачного растительного материала с измененным количеством нитратов по сравнению с контрольным табачным растительным материалом, включающий стадии:

(a) получения табачного растения по п. 8, или части табачного растения по п. 9, или табачного растительного материала по п. 10;

(b) необязательно сбора растительного материала с растения или его части и

(c) сушки растительного материала.

16. Способ по п. 15, в котором табачный растительный материал содержит высушенные листья.

17. Способ по п. 16, в котором способ сушки выбран из группы, состоящей из воздушной сушки, огневой сушки, дымовой сушки и трубоогневой сушки.

Images