JP2022550383A - 植物における還元糖含有量の調節（ｉｎｖ） - Google Patents

植物における還元糖含有量の調節（ｉｎｖ） Download PDF

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Abstract

（ｉ）配列番号５（ＮｔＩＮＶ４－Ｓ）に対して少なくとも８１％の配列同一性、または配列番号７（ＮｔＩＮＶ４－Ｔ）に対して少なくとも６２％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなるポリヌクレオチド、（ｉｉ）（ｉ）に記載されるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、（ｉｉｉ）配列番号６（ＮｔＩＮＶ４－Ｓ）に対して少なくとも８５％の配列同一性、または配列番号８（ＮｔＩＮＶ４－Ｔ）に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなるポリペプチド、または（ｉｖ）（ｉ）に記載される単離ポリヌクレオチドを含む構築物、ベクター、または発現ベクターであって、該植物細胞が、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現または活性が改変されていない対照植物細胞と比較して、（ａ）ポリヌクレオチドの発現または活性を調節する、または（ｂ）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現または活性を調節する少なくとも一つの改変を含む、構築物、ベクター、または発現ベクターを含む、植物細胞が本明細書に記載される。【選択図】なし

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１９年１０月１日に出願された欧州特許出願第１９２００８６５．４号からの優先権を主張するものであり、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、インベルターゼ（ＩＮＶ）の調節された発現または活性を有する植物細胞等に関する。
たばこ製品を製造するために、様々なタイプのたばこを様々な比率で混合して、特定の風味特性を有するブレンドを生成する。熱風乾燥たばこ（例えば、バージニア）は最も広く栽培されたたばこであり、糖と窒素の比率が高いのが特徴であるが、風味プロファイルは限定的である。空気乾燥（例えば、バーレー、メリーランド、およびガルパオ）または火力乾燥（例えば、ダーク）たばこタイプなどの他の種類のたばこは、代替の風味プロファイルを提供する。これらの異なる風味プロファイルは、ブレンドされたたばこ製品の製造において重要である。
風味特性は、たばこ植物に特定のレベルで存在する特定の風味化合物、またはこれらの化合物の前駆体の結果である。例として、乾燥したたばこの糖含有量が変化すると、たばこの風味および芳香の知覚が異なる可能性がある。エアロゾルおよび煙では、グルコース、および比較的程度は小さいがフルクトースは、メイラード反応を介してアマドリ化合物を生成し得る。これは、パン、ナッツ、またはポップコーンのような風味をもたらすことがある。
しかしながら、商業生産のためのたばこの種類は限定されているため、これは、異なる風味および芳香プロファイルを有するたばこ製品を開発するための機会も限定されることを意味する。これは同様に、リスク低減された製品において加熱されたたばこスティックに使用される再構成されたたばこ材料の製造にも適用される。
商業的に許容可能な収量および形質を維持しながら、消費者に新たな風味および感覚的体験を提供するたばこを作成する機会を改善する必要性が、当技術分野に残っている。本発明は、このおよび他の必要性の対処に努める。
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ由来のＩＮＶのポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列が本明細書に開示される。多くの異なる遺伝子が、構造的同一性に基づいて、植物の推定ＩＮＶをコードすると考えられているが、これらの遺伝子が、植物においてＩＮＶとして機能するようになる時点は、通常知られていない。特に、たばこ、特に乾燥処理中のたばこにおけるＩＮＶ遺伝子発現についてはほとんど知られていない。本発明者らは、乾燥処理中に機能的に発現する、植物中の特定のＮｔＩＮＶポリヌクレオチドを特定した。驚くべきことに、これらの特定のＮｔＩＮＶ遺伝子の発現、またはそれによりコードされるタンパク質の活性を調節することにより、葉の乾燥中に生成される還元糖およびスクロースのプールを変化させることができることが観察される。特定のＩＮＶ遺伝子の変化が、葉の乾燥中に生成される還元糖およびスクロースのレベルの変化につながる可能性があることは予想外である。有利なことに、これは今や、新しい風味と芳香の特徴を持つたばこブレンドを作り出す機会を提供する。これはまた、たばこブレンドを加熱するときに生成されるエアロゾルまたは煙の異なる風味または感覚的知覚をもたらし得る。同様に、たばこから得られた液体抽出物は、異なる風味または感覚的知覚を有し得る。還元糖およびスクロースのバランスの改変は、エアロゾルおよび煙中のアクリルアミドの放出にも影響を与え得る。
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ由来のいくつかのＩＮＶゲノムポリヌクレオチド配列、すなわちＮｔＩＮＶ３－Ｓ（配列番号１）、ＮｔＩＮＶ３－Ｔ（配列番号３）、ＮｔＩＮＶ４－Ｓ（配列番号５）、およびＮｔＩＮＶ４－Ｔ（配列番号７）が本明細書に記載される。Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ由来のいくつかのＩＮＶポリペプチド配列、すなわちＮｔＩＮＶ３－Ｓ（配列番号２）、ＮｔＩＮＶ３－Ｔ（配列番号４）、ＮｔＩＮＶ４－Ｓ（配列番号６）、およびＮｔＩＮＶ４－Ｔ（配列番号８）も本明細書に記載される。ＮｔＩＮＶ４－Ｓ、およびＮｔＩＮＶ４－Ｔは特に、乾燥処理中に糖代謝において役割を果たすことが示されている。たばこ乾燥処理中に、熱風乾燥たばこ（例えば、バージニア）は通常、空気乾燥たばこ（例えば、バーレー）よりも少なくとも八倍多い還元糖を含有し、これは主に、高レベルのデンプンを蓄積する遺伝的素因による。葉の収穫後および老化プロセス（黄変段階）中に、大部分のデンプンが最初にスクロースに、次いでＩＮＶに関与する可能性が高い還元糖に変換される。
ＮｔＩＮＶ４－ＳおよびＮｔＩＮＶ４－Ｔポリペプチド配列は、非常に類似しており、９６％の同一性を共有している。この状況は、これも非常に類似しているＮｔＩＮＶ３－ＳおよびＮｔＩＮＶ３－Ｔポリペプチド配列で類似しており、９６％の同一性を共有する。注目すべきことに、ＮｔＩＮＶ４－ＳおよびＮｔＩＮＶ４－Ｔの対、ならびにＮｔＩＮＶ３－ＳおよびＮｔＩＮＶ３－Ｔの対は、約６０％の低い同一性しか共有せず、異なる機能または制御を示唆している。驚くべきことに、ＮｔＩＮＶ４－ＳおよびＮｔＩＮＶ４－Ｔのみが乾燥処理中に過剰発現するのに対し、ＮｔＩＮＶ３－ＳおよびＮｔＩＮＶ３－Ｔは、乾燥中に過剰発現しない。特定の実施形態では、ＮｔＩＮＶ３－ＳおよびＮｔＩＮＶ３－Ｔの発現または活性は調節されない。ＮｔＩＮＶ３－ＳおよびＮｔＩＮＶ３－Ｔは他の代謝経路に関与している可能性が高く、その発現における変化は、農学的に有害な可能性のある表現型（例えば、遅い成長）をもたらし得る。どのＩＮＶ遺伝子が乾燥処理中に過剰発現されるのかを知ることにより、有利に、関連する遺伝子のみにおける変化を有する植物の選択が可能になり、他の代謝プロセスに対する潜在的な悪影響を減少させる。
一つまたは複数のＩＮＶの発現または活性に対する改変を、一つまたは複数のスクロース合成酵素（ＳＵＳ）の発現または活性に対する改変と組み合わせて、乾燥葉における糖のレベルをさらに調節することができる。したがって、ＩＮＶおよびＳＵＳに対する修飾の組み合わせが開示される。例えば、本明細書に記載される一つまたは複数のＩＮＶの発現または活性を減少させることは、乾燥葉におけるグルコースレベルもしくはフルクトースレベル、またはそれらの組み合わせを増加または減少させ、スクロースレベルを増加させ得る。さらなる例として、本明細書に記載される一つまたは複数のＩＮＶの発現または活性を増加させることは、乾燥葉におけるグルコースレベルもしくはフルクトースレベル、またはそれらの組み合わせを増加させ、スクロースレベルを減少させ得る。さらなる例として、本明細書に記載の一つまたは複数のＩＮＶおよび一つまたは複数のＳＵＳの発現または活性を減少させることは、一つまたは複数のＩＮＶ単独の発現または活性を減少させることと比較して、乾燥葉におけるグルコースレベルもしくはフルクトースレベルまたはそれらの組み合わせをさらに減少させ得る。さらなる例として、本明細書に記載の一つまたは複数のＩＮＶおよび一つまたは複数のＳＵＳの発現または活性を増加させることは、一つまたは複数のＩＮＶ単独の発現または活性を増加させることと比較して、乾燥葉におけるグルコースレベルもしくはフルクトースレベルまたはそれらの組み合わせをさらに増加させ得る。
ＮｔＳＵＳ１－Ｓ（配列番号１０）、ＮｔＳＵＳ１－Ｔ（配列番号１２）、ＮｔＳＵＳ２－Ｓ（配列番号１４）、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ（配列番号１６）、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ（配列番号１８）、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ（配列番号２０）、ＮｔＳＵＳ４－Ｓ（配列番号２２）、ＮｔＳＵＳ４－Ｔ（配列番号２４）、ＮｔＳＵＳ５－Ｓ（配列番号２６）、ＮｔＳＵＳ５－Ｔ（配列番号２８）、ＮｔＳＵＳ６－Ｓ（配列番号３０）、およびＮｔＳＵＳ６－Ｔ（配列番号：３２）が開示される。ＮｔＳＵＳ１－Ｓ（配列番号１１）、ＮｔＳＵＳ１－Ｔ（配列番号１３）、ＮｔＳＵＳ２－Ｓ（配列番号１５）、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ（配列番号１７）、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ（配列番号１９）、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ（配列番号２１）、ＮｔＳＵＳ４－Ｓ（配列番号２３）、ＮｔＳＵＳ４－Ｔ（配列番号２５）、ＮｔＳＵＳ５－Ｓ（配列番号２７）、ＮｔＳＵＳ５－Ｔ（配列番号２９）、ＮｔＳＵＳ６－Ｓ（配列番号３１）、およびＮｔＳＵＳ６－Ｔ（配列番号３３）の対応する推定ポリペプチド配列も開示されている。ＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、ＮｔＳＵＳ４－Ｓ、およびＮｔＳＵＳ４－Ｔは、乾燥処理中に糖代謝において役割を果たし得る。ＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、およびＮｔＳＵＳ４－Ｓは特に、乾燥処理中に糖代謝において役割を果たし得る。
一態様では、（ｉ）配列番号５（ＮｔＩＮＶ４－Ｓ）に対して少なくとも８１％の配列同一性、または配列番号７（ＮｔＩＮＶ４－Ｔ）に対して少なくとも６２％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなるポリヌクレオチド、（ｉｉ）（ｉ）に記載されるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、（ｉｉｉ）配列番号６（ＮｔＩＮＶ４－Ｓ）に対して少なくとも８４％または少なくとも８５％の配列同一性、または配列番号８（ＮｔＩＮＶ４－Ｔ）に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなるポリペプチド、または（ｉｖ）（ｉ）に記載される単離ポリヌクレオチドを含む構築物、ベクター、または発現ベクターであって、該植物細胞が、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現または活性が改変されていない対照植物細胞と比較して、（ａ）ポリヌクレオチドの発現または活性を調節する、または（ｂ）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現または活性を調節する少なくとも一つの改変を含む、構築物、ベクター、または発現ベクターを含む、植物細胞が提供される。
好適には、調節された発現または調節された活性は、対照植物細胞を含有する対照植物の乾燥葉の一つまたは複数の還元糖のレベルと比較して、植物細胞を含む植物の乾燥葉の一つまたは複数の還元糖のレベルを調節し、好適には、還元糖がグルコースもしくはフルクトース、またはそれらの組み合わせである。
好適には、調節された発現または調節された活性はまた、植物細胞を含む植物の乾燥葉中のスクロースのレベルを調節する。
好適には、乾燥葉は、対照の乾燥葉と比較して、グルコースのレベルを少なくとも約６３％減少させた。
好適には、乾燥葉は、対照の乾燥葉と比較して、フルクトースのレベルを少なくとも約４３％減少させた。好適には、乾燥葉は、対照の乾燥葉と比較して、グルコースおよびフルクトースのレベルをそれぞれ少なくとも約６３％および少なくとも約４３％減少させた。
好適には、乾燥葉は、植物の中間位置の葉からのものである。
好適には、植物細胞を含む植物の表現型にわずかな影響がある。例えば、植物の表現型は変化しない場合がある。
好適には、対照植物細胞を含む対照植物と比較して、総遊離アミノ酸に変動はない。
好適には、少なくとも一つの改変は、植物細胞のゲノム中の少なくとも一つの改変、または構築物、ベクター、もしくは発現ベクター中の少なくとも一つの改変、または少なくとも一つのトランスジェニック改変である。
好適には、少なくとも一つの改変は、ポリヌクレオチドの遺伝子変異である。
好適には、植物は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍである。
好適には、植物細胞が、ＮｔＳＵＳポリヌクレオチドまたはそれによってコードされるポリペプチドに少なくとも一つの改変をさらに含み、より好適には、ＮｔＳＵＳポリヌクレオチドまたはそれによってコードされるポリペプチドは、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、ＮｔＳＵＳ４－Ｓ、ＮｔＳＵＳ４－Ｔまたはその二つ以上の組み合わせからなる群から選択され、より好適には、ＮｔＳＵＳポリヌクレオチドまたはそれによってコードされるポリペプチドが、ＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－ＴおよびＮｔＳＵＳ４－Ｓまたはその二つ以上の組み合わせからなる群から選択される。
好適には、植物細胞は、ＮｔＩＮＶ４ポリヌクレオチドまたはＮｔＩＮＶ４ポリペプチドに少なくとも一つの突然変異、およびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドまたはそれによってコードされるポリペプチドに少なくとも一つの突然変異を含む。
さらなる態様では、本明細書に説明される植物細胞を含む、植物またはその部分が提供される。
植物もしくはその一部から誘導もしくは得られる植物材料、乾燥植物材料、または均質化植物材料は、さらなる態様で開示され、好適には、植物材料が、バイオマス、種子、茎、花、もしくは葉、またはそれらの二つ以上の組み合わせからなる群から選択される。乾燥植物材料は、熱風乾燥植物材料、日光乾燥植物材料、もしくは空気乾燥植物材料、またはそれらの二つ以上の組み合わせからなる群から選択することができる。
さらなる態様では、植物細胞、植物の一部、または植物材料を含むたばこ製品が提供されている。
さらなる態様では、（ａ）本明細書に記載される少なくとも一つの改変を含む植物細胞を提供する工程、および（ｂ）植物細胞を植物に増殖させる工程を含む、本明細書に記載の植物を生成するための方法が提供されている。
好適には、（ａ）の工程では、少なくとも一つの改変が、ゲノム編集によって導入され、好適には、ゲノム編集が、ＣＲＩＳＰＲ媒介ゲノム編集、ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介突然変異誘発、化学的突然変異誘発または放射線突然変異誘発、相同組み換え、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、およびメガヌクレアーゼ媒介突然変異誘発から選択される。
好適には、（ａ）の工程では、少なくとも一つの改変が、干渉ポリヌクレオチドを使用して、または少なくとも一つの突然変異もしくはその組み合わせを導入することによって導入される。
さらなる態様では、対照植物材料と比較して変化した量の還元糖を有する乾燥処理済みの植物材料を生成するための方法が開示され、（ａ）本明細書に記載される植物もしくはその一部または植物材料を提供する工程と、（ｂ）植物材料をそこから収穫する工程と、（ｃ）植物材料を乾燥処理する工程と、を含む。
さらなる態様では、液体たばこ抽出物を生成する方法が提供され、方法は、
（ａ）本明細書に記載されるＮｔＩＮＶの発現または活性を調節する少なくとも一つの改変を含む、植物細胞を含有する植物またはその一部からたばこ出発材料を調製する工程と、（ｂ）適切な抽出温度でたばこ出発材料を加熱する工程と、（ｃ）加熱中にたばこ出発材料から放出された揮発性化合物を収集する工程と、（ｄ）たばこ出発材料から放出された収集された揮発性化合物を組み合わせて、液体たばこ抽出物を形成する工程と、を含む。
さらなる態様では、液体たばこ抽出物を製造する方法が開示されており、方法は、（ａ）ＮｔＩＮＶの発現または活性が本明細書に記載されるように改変される、植物細胞を含有する植物またはその一部から、第一のたばこ出発材料を調製する工程と、（ｂ）ＮｔＳＵＳの発現または活性が本明細書に記載されるように改変される、植物細胞を含有する植物またはその一部から第二のたばこ出発材料を調製する工程と、（ｃ）第一のたばこ出発材料を第一の抽出温度で加熱する工程と、（ｄ）第二のたばこ出発材料を第二の抽出温度で加熱する工程と、（ｅ）加熱中に第一のたばこ出発材料および第二のたばこ出発材料から放出される揮発性化合物を収集する工程と、（ｆ）第一および第二のたばこ出発材料から放出された収集された揮発性化合物を組み合わせて、組み合わせた揮発性化合物から液体たばこ抽出物を形成する工程と、を含む。
さらなる態様では、本明細書に記載されるように、液体たばこ抽出物を生成する方法によって生成、取得、または取得可能な液体たばこ抽出物が開示される。
さらなる態様では、（ｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、および配列番号７に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなるポリヌクレオチド；配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなるポリヌクレオチド；（ｉｉ）（ｉ）に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、（ｉｉｉ）配列番号２または配列番号４に対して少なくとも８０％の配列同一性、配列番号６または配列番号８に対して８０％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなるポリペプチド；（ｉｖ）（ｉ）に記載した単離ポリヌクレオチドを含む構築物、ベクター、または発現ベクターを含む植物細胞であって、該植物細胞が、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現もしくは活性が改変されていない対照植物細胞と比較して、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現もしくは活性を調節する少なくとも一つの改変を含む、植物細胞が開示される。
有利なことに、たばこ中の糖－アミノ酸バランスを変更すると、エアロゾルおよび煙中で加熱した際に、風味化合物およびアクリルアミド（グルコース（フルクトース）とアスパラギンとの相互作用から生じる発がん性化合物）の放出に影響を与える可能性がある。
有利なことに、加熱式たばこスティックの再構成たばこ材料は、適切なキャストリーフ調製のために還元糖を必要とする。本開示は、糖類の含有量およびバランスに影響を与え、それによって、キャストリーフ調製に影響を与え得る。
有利なことに、消費者により受け入れられ得る、遺伝子組み換えされていない植物を作り出すことができる。
有利なことに、本開示は、ＥＭＳ突然変異体植物の使用に制限されない。
本開示は、様々な植物の品種または作物に適用され得る。通常、老化葉（ソースの葉）は、炭素源としてスクロースを、シンクの葉および種子のための同化窒素資源としてアスパラギンを生成する。したがって、スクロースおよびアスパラギンは、まず柔組織（光合成）老化葉細胞から師部へと輸送され、次いで上部シンク組織に輸送されなければならない。ＮｔＩＮＶ、またはそれによってコードされるポリペプチドを操作すると、グルコースおよびフルクトースなどの還元糖のレベルに影響を与え、遊離アミノ酸にはあまり影響を与えないようにすることができる。このアプローチにより、グルコースおよびフルクトースの含有量が少なく、スクロースの含有量が多い、新規のたばこ品種の開発が可能となる可能性がある。
有利なことに、本開示は、本明細書に記載されるように、ＮｔＳＵＳまたはそれによってコードされるポリペプチドなどの他の遺伝子の発現を調節することと一緒に組み合わせることができる。
図１は、以下を示す一連のグラフである。（Ａ）バージニアの熱風乾燥時間経過中の還元糖（グルコースおよびフルクトース）の変化、（Ｂ）バージニアの熱風乾燥時間経過中のＮｔＩＮＶ３－Ｓ、ＮｔＩＮＶ３－Ｔ、ＮｔＩＮＶ４－Ｓ、およびＮｔＩＮＶ４－Ｔの発現（Ｔｏｂａｒｒａｙ－Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）、および（Ｃ）バージニアの熱風乾燥時間経過中の老化関連遺伝子ＳＡＧ１２の発現。 図２は、以下を示す一連のグラフである。（Ａ）グルコースの変化、（Ｂ）フルクトースの変化、および（Ｃ）ダークたばこの空気乾燥時間経過中のスクロースの変化。Ｍｅｔａｂｏｌｏｎ社によるメタボロミクス解析からデータを作成した（利用可能な単位なし）。 同上。 同上。 図３は、ＧＡＴＥＷＡＹベクターを使用してＮｔＩＮＶ４－ＳおよびＮｔＩＮＶ４－Ｔをサイレンシングした結果と、４８時間の乾燥後のバージニアたばこ葉におけるＮｔＩＮＶ４－ＳおよびＮｔＩＮＶ４－Ｔの発現の測定値（ｑＰＣＲ）を示すグラフである。Ｔ０－ＩＮＶ４は生成されたトランスジェニック系統であり、ＣＴ０－ＩＮＶ４は対応する対照系統である。 図４は、以下を示す一連のグラフである。（Ａ）グルコース、（Ｂ）フルクトース、および（Ｃ）サイレンス化した３５Ｓ：ＩＮＶ４－ＲＮＡｉ（ＩＮＶ４－Ｔ０）乾燥葉および対照（ＣＴ０）乾燥葉のスクロース含有量（ＣＴ０、ｎ＝４、およびＴ０、ｎ＝４）。箱ひげ図、ならびにＴ検定統計解析が提示される。 同上。 図５は、バーレー、バージニア、およびオリエンタルたばこの収穫（成熟）後、二日間の乾燥処理（４８時間の乾燥処理）後、および乾燥処理終了時の、還元糖の種類毎の含有量を示す棒グラフである。
本開示で使用する段落の見出しは系統立てるためであり、限定することを意図していない。
１．定義
他に断りがない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているのと同じ意味を有する。矛盾がある場合は、定義を含めて本文書が適用される。好ましい方法および材料を以下に説明するが、本明細書に説明されるものと類似または同等の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができる。本明細書に開示される材料、方法、および例は単なる例示であり、制限することを意図していない。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有している」、「有する」、「できる」、「含有する」、およびそれらの変形は、付加的な作用または構成の可能性を除外しないオープンエンド移行句、用語、または言葉であることが意図されている。
単数形「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別段明白に指示しない限り、複数形の言及を含む。
本開示は、明示的な記載または非記載にかかわらず、本明細書に提示した実施形態または要素を「含む」、「それからなる」および「本質的にそれからなる」他の実施形態も意図する。
本明細書の数値範囲の詳細説明として、その間の中間の各数字も同程度の精度で明確に意図される。例えば、６－９の範囲では、数字６と９に加えて数字７と８が意図されており、６．０－７．０の範囲では、数字６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９および７．０が明確に意図される。
明細書および特許請求の範囲全体で使用される場合、以下の用語は次の意味を有する。
「コード配列」または「ポリヌクレオチドをコードする」とは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味する。コード配列は、ポリヌクレオチドが投与される個体または哺乳動物の細胞において発現を導くことが可能なプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む、制御要素に動作可能に連結された開始および終結シグナルをさらに含むことができる。コード配列はコドン最適化であり得る。
「相補体」または「相補的」は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体間のワトソン－クリック（例えば、Ａ－Ｔ／ＵおよびＣ－Ｇ）またはフーグスティーン塩基対合を意味することができる。「相補性」は、例えば、相互に逆平行に整列している場合に、各位置のヌクレオチド塩基が相補的であるような、二つのポリヌクレオチド間で共有される特性を指す。
「構築物」は、一つまたは複数のポリヌクレオチドを含む、二本鎖の組み換えポリヌクレオチド断片を指す。構築物は、相補的「センス鎖またはコード鎖」と塩基対合した「鋳型鎖」塩基を含む。所定の構築物は、可能性のある２つの配向性、すなわち、ベクター（例えば、発現ベクター）内に配置されているプロモーターの配向に対して同一の（またはセンス）配向性または反対の（またはアンチセンス）配向性のいずれかで、ベクターに挿入することができる。
対照植物または対照植物細胞の文脈における「対照」という用語は、一つまたは複数の遺伝子またはポリペプチドの発現、機能、もしくは活性が改変（例えば、増加または低下）されておらず、それゆえに一つまたは複数の遺伝子またはポリペプチドの発現、機能、もしくは活性が改変されている植物との比較を提供することができる、植物または植物細胞を意味する。「対照植物」は、試験パラメータを除いたすべてのパラメータにおいて試験植物または改変植物と実質的に同等である植物である。例えば、ポリヌクレオチドが導入された植物に言及する場合、対照植物はそのようなポリヌクレオチドが導入されていない同等の植物である。対照植物は、対照ポリヌクレオチドが導入された同等の植物であり得る。そのような事例では、対照ポリヌクレオチドは、植物にほとんどまたは全く表現型効果をもたらさないことが予期されているものである。対照植物は、空のベクターを含み得る。対照植物は、野生型植物に相当し得る。対照植物は、Ｔ１分離体が導入遺伝子をもはや保持していない、ヌル分離体であり得る。
「減少」または「減少した」という用語は、ポリペプチド機能、転写機能、またはポリペプチド発現などの量または機能の約１０％～約９９％の減少、または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％、または少なくとも１５０％、または少なくとも２００％以上の減少を指す。「減少した」という用語または「減少した量」という語句は、改変されていない植物または同じ様式で加工された同じ品種の植物由来の製品において発見され得るものよりも少ない、量または機能を指すことができる。したがって、一部の文脈では、同じ様式で加工されている同じ品種の野生型植物が、量の減少が得られるかどうかを測定するための対照として使用される。
「ドナーＤＮＡ」または「ドナー鋳型」は、対象の遺伝子の少なくとも一部分を含む、二本鎖ＤＮＡ断片または分子を指す。ドナーＤＮＡは、機能性ポリペプチドをコードしてもよい。
「内在性遺伝子またはポリペプチド」は、生物のゲノムに起源し、遺伝子材料の欠失、獲得、または交換等の変化を受けていない遺伝子またはポリペプチドを指す。内在性遺伝子は、正常な遺伝子伝達および遺伝子発現を受ける。内在性ポリペプチドは、正常な発現を受ける。
「エンハンサー配列」は、遺伝子発現を増加させることができる配列を指す。これらの配列は、転写領域の上流、イントロン内、または下流に位置することができる。転写領域は、プロモーターから転写終結領域までのエクソンおよび介在イントロンからなる。遺伝子発現の増加は、転写効率の増加、成熟ｍＲＮＡの安定化、および翻訳の強化を含む様々な機構によってできる。
「発現」は、機能性産物の生成を指す。例えば、ポリヌクレオチド断片の発現は、ポリヌクレオチド断片の転写（例えば、ｍＲＮＡもしくは機能性ＲＮＡが生じる転写）、またはｍＲＮＡの前駆体もしくは成熟ポリペプチドへの翻訳、またはそれらの組み合わせを指し得る。
「過剰発現」は、同じ実験のヌル分離（または非トランスジェニック）生物における産生レベルを超えるトランスジェニック生物における遺伝子産物の産生を意味する。
「機能性」は、生物学的機能または活性を有するポリペプチドを説明する。「機能性遺伝子」は、機能性または活性ポリペプチドに翻訳される、ｍＲＮＡに転写される遺伝子を指す。
「遺伝子構築物」とは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。コード配列は、発現を導くことが可能なプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む制御要素に動作可能に連結される開始および終結シグナルを含むことができる。
「ゲノム編集」とは、概して、細胞内のゲノム核酸が変更されるプロセスを指す。これは、例えば、ゲノム核酸中の一つまたは複数のヌクレオチドを除去、挿入、または置換することによってもよい。エンドヌクレアーゼを使用して、ゲノム内の所定の位置に特定の切断または切れ目を作製することができ、本明細書にさらに記載する。
「相同性」または「類似性」という用語は、配列整列によって比較される二つのポリペプチド分子間または二つのポリヌクレオチド分子間の配列類似性の度合いを指す。比較される二つの不連続ポリヌクレオチド間の相同性の度合いは、比較可能な位置での同一または一致するヌクレオチドの数の関数である。相同性または類似性は、対象配列の全長にわたって決定され得る。
二つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの文脈における「同一」または「同一性」は、配列が特定の領域にわたって同じである残基の特定の比率を有することを意味する。比率は、二つの配列を最適に整列し、二つの配列を特定の領域にわたって比較し、両方の配列において同一の残基が存在する位置の数を決定して一致した位置の数を得、一致した位置の数を特定の領域における位置の総数で除し、その結果に１００を乗じることによって算出され、配列同一性の比率を得ることができる。二つの配列が異なる長さを有する場合、または整列によって一つまたは複数の互い違いの末端が生じ、比較対象の特定の領域が単一配列しか含まない場合には、単一配列の残基は計算の分母に含まれるが、分子には含まれない。ＤＮＡとＲＮＡを比較するとき、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）は同等と見なされ得る。同一性は、手動で、またはＣｌｕｓｔａｌＷ、ＣｌｕｓｔａｌＸ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、もしくはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎなどのコンピュータ配列アルゴリズムを使用することによって決定され得る。ＣｌｕｓｔａｌＷの好適なパラメータは、以下の通りであり得る。ポリヌクレオチド整列について：ギャップオープンペナルティ＝１５．０、ギャップ伸長ペナルティ＝６．６６、およびマトリックス＝Ｉｄｅｎｔｉｔｙ。ポリペプチド整列について：ギャップオープンペナルティ＝１０．０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．２、およびマトリックス＝Ｇｏｎｎｅｔ。ＤＮＡおよびタンパク質の整列について：ＥＮＤＧＡＰ＝－１、およびＧＡＰＤＩＳＴ＝４。
「増加」または「増加した」という用語は、これらに限定されないが、一つまたは複数のポリペプチド機能もしくは活性、転写機能もしくは活性、およびポリペプチド発現などの、量または機能もしくは活性の約１０％～約９９％の増加、または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、もしくは少なくとも２００％以上またはそれ以上の増加を指す。「増加した」という用語または「増加した量」という語句は、改変されていない植物または同じ様式で加工された同じ品種の植物由来の製品において発見され得るものよりも多い、植物または植物から製造された製品における量または機能もしくは活性を指すことができる。したがって、一部の文脈では、同じ様式で加工されている同じ品種の野生型植物が、量の増加が得られるかどうかを測定するための対照として使用される。
「抑制する」または「抑制された」という用語は、これらに限定されないが、一つまたは複数のポリペプチド機能もしくは活性、転写機能もしくは活性、およびポリペプチド発現などの、量または機能もしくは活性の約９８％～約１００％の減少、または少なくとも９８％、少なくとも９９％であるが、特に１００％の減少を意味する。
「導入される」という用語は、ポリヌクレオチド（例えば、構築物）またはポリペプチドを細胞に提供することを意味する。「導入される」は、ポリヌクレオチドが細胞のゲノムに組み込まれ得る、真核細胞へのポリヌクレオチドの取り込みへの言及を含み、細胞へのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの過渡的な供給への言及を含む。「導入される」は、安定的または過渡的な形質転換方法ならびに有性交雑への言及を含む。したがって、ポリヌクレオチド（例えば、組み換え構築物／発現構築物）を細胞に挿入する文脈における「導入される」は、「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」を意味し、ポリヌクレオチドが細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、色素体、またはミトコンドリアＤＮＡ）に組み込まれ、自律レプリコンに変換されるか、または過渡的に発現され得る（例えば、トランスフェクトされたｍＲＮＡ）、真核細胞へのポリヌクレオチドの取り込みへの言及を含む。
「単離された」または「精製された」という用語は、その天然の状態で発見された場合通常それに付随する構成要素を実質的または本質的に含まない材料を指す。純度および均一性は、典型的にはポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィー等の分析化学技法を使用して決定される。調製物中に存在する優勢種であるポリペプチドは、十分に精製される。特に、単離ポリヌクレオチドは、所望の遺伝子に隣接し、所望のポリペプチド以外のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームから分離される。「精製される」という用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが電気泳動ゲルにおいて本質的に一つのバンドを引き起こすことを意味する。具体的には、これは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが少なくとも８５％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋、最も好ましくは少なくとも９９％純粋であることを意味する。単離ポリヌクレオチドは、天然に存在する宿主細胞から精製され得る。当業者に公知の従来的なポリヌクレオチド精製方法を使用して、単離ポリヌクレオチドを得ることができる。また、この用語は組み換えポリヌクレオチドおよび化学的に合成されたポリヌクレオチドも包含する。
「液体たばこ抽出物」は、たばこ出発材料に対して実施される抽出プロセスの直接産物を説明する。液体たばこ抽出物を生産するための抽出プロセスは、特定の加熱条件下でたばこ出発材料を加熱し、生成された揮発性化合物を収集することを含むことができる。液体たばこ抽出物は、たばこ出発材料に由来し、抽出プロセス中に除去された化合物の混合物を含有することができ、典型的には、液体担体または溶媒と組み合わせて、抽出プロセス中に除去されている。
「調節する」または「調節」とは、対象のプロセス、経路、機能、もしくは活性における定性的または定量的な変化、変更、もしくは改変を引き起こすか、または促進することを指す。限定されないが、そのような変化、変更、または改変は、対象の相対的なプロセス、経路、機能、または活性の増加または減少であり得る。例えば、遺伝子発現もしくはポリペプチド発現、またはポリペプチド機能もしくは活性は、調節することができる。典型的には、相対的な変化、変更、または改変は、対照と比較することによって決定されるであろう。
「非天然型」という用語は、天然では形成されないか、または天然には存在しないポリヌクレオチド、遺伝子突然変異、ポリペプチド、植物、植物細胞、および植物材料などの実体を説明する。このような非天然型実体または人工的実体は、本明細書に説明されるか、または当該技術分野において公知である方法によって、作成、合成、開始、改変、介入、または操作され得る。このような非天然型実体または人工的実体は、人間によって作成、合成、開始、改変、介入、または操作され得る。したがって、一例として、非天然型植物、非天然型植物細胞、または非天然型植物材料は、伝統的な植物育種技法（例えば、戻し交雑）を使用して、または遺伝子操作技術（例えば、アンチセンスＲＮＡ、干渉ＲＮＡ、メガヌクレアーゼ等）によって作成され得る。さらなる例として、非天然型植物、非天然型植物細胞、または非天然型植物材料は、得られる植物、植物細胞、もしくは植物材料、またはそれらの子孫が、天然では形成されないかまたは天然には存在しない遺伝的構成（例えば、ゲノム、染色体、またはそれらのセグメント）を含むように、一つまたは複数の遺伝的突然変異（例えば、一つまたは複数の多型）を第一の植物または植物細胞から第二の植物または植物細胞（これはそれ自体が天然型であり得る）に遺伝子移入するか、または移入することによって作成し得る。得られる植物、植物細胞、または植物材料は、したがって人工的または非天然型である。したがって、人工的または非天然型植物または植物細胞は、得られる遺伝子配列が第一の植物または植物細胞とは異なる遺伝的背景を含む第二の植物または植物細胞において天然に発生する場合であっても、第一の天然型植物または植物細胞において遺伝子配列を改変することによって作成し得る。ある特定の実施形態では、突然変異は、遺伝子またはポリペプチドなど、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドにおいて天然に存在する天然型突然変異ではない。遺伝的背景における差異は、表現型的差異によって、またはポリヌクレオチド配列決定、遺伝的マーカー（例えば、ミクロサテライトＲＮＡマーカー）の存在または非存在などの、当該技術分野において公知の分子生物学技法によって検出することができる。
「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、一緒に共有結合される少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。一本鎖の描写はまた、相補鎖の配列も定義する。したがって、ポリヌクレオチドはまた、描写された一本鎖の相補鎖も包含する。ポリヌクレオチドの多くの変異体は、所与のポリヌクレオチドと同じ目的で使用され得る。したがって、ポリヌクレオチドはまた、実質的に同一のポリヌクレオチドおよびその相補体も包含する。一本鎖は、厳密なハイブリッド形成条件下で所定の配列にハイブリッド形成し得るプローブを提供する。したがって、ポリヌクレオチドは、厳密なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成するプローブも包含する。ポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖であり得るか、または二本鎖および一本鎖配列の両方の部分を含有し得る。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ゲノムおよびｃＤＮＡの両方、ＲＮＡ、または混成体であり得、ポリヌクレオチドは、デオキシリボ－ヌクレオチドとリボ－ヌクレオチドの組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含有し得る。ポリヌクレオチドは、化学的合成法によって、または組み換え法によって得ることができる。
相補的断片をハイブリッド形成するための一本鎖ＤＮＡの特異性は、反応条件の「厳密性」によって決定される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８９））。「厳密な条件」下でハイブリッド形成するということは、互いに少なくとも６０％相同であるポリヌクレオチド配列がハイブリッド形成されたままである、ハイブリッド形成プロトコルを説明する。一般に、厳密な条件は、定義されたイオン強度およびｐＨで、特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、所与の配列に相補的なプローブの５０％が所与の配列に平衡状態でハイブリッド形成する（定義されたイオン強度、ｐＨ、およびポリヌクレオチド濃度下での）温度である。所与の配列は一般にＴｍで過剰に存在するため、プローブの５０％は平衡状態で占められる。
厳密な条件は、典型的には、（１）低イオン強度および高温洗浄、例えば、５０℃で、１５ｍＭの塩化ナトリウム、１．５ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、（２）ハイブリッド形成中の変性剤、例えば、４２℃で、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％Ｆｉｃｏｌｌ、０．１％ポリビニルピロリドン、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．５）、または（３）５０％ホルムアミドを含む。また、洗浄液は典型的には、４２℃で、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍＬ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを含み、４２℃で０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５５℃で５０％ホルムアミド中での洗浄、続いて５５℃でＥＤＴＡ含有０．１×ＳＳＣからなる高度厳密性洗浄液を含む。好適には、この条件は、互いに少なくとも約６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同である配列が、典型的には互いにハイブリッド形成されたままであるようなものである。
「中程度に厳密な条件」は、洗浄溶液、およびポリヌクレオチドがポリヌクレオチドの全体、断片、誘導体、または類似体にハイブリッド形成するような、厳密性が低いハイブリッド形成条件を使用する。一例には、５５℃で、６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ液、０．５％ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡ中でのハイブリッド形成、続いて、３７℃で、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での一回または複数回の洗浄が含まれる。温度、イオン強度等は、プローブの長さ等の実験的要因に適合するように調節することができる。他の中程度厳密性条件が説明されている（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １－３，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．（１９９３）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）、Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）を参照）。
「低度に厳密な条件」は、洗浄溶液、およびポリヌクレオチドがポリヌクレオチドの全体、断片、誘導体、または類似体にハイブリッド形成するような、中程度厳密性よりも厳密性が低いハイブリッド形成条件を使用する。低度厳密性ハイブリッド形成条件の非限定的な例には、４０℃で、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％ＢＳＡ、１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡ、１０％（重量／体積）硫酸デキストラン中でのハイブリッド形成、続いて、５０℃で、２×ＳＳＣ、２５ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ、および０．１％ＳＤＳ中での一回または複数回の洗浄が含まれる。交雑種ハイブリッド形成などの他の低度厳密性の条件は、十分に説明されている（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０を参照）。
「動作可能に連結される」は、遺伝子の発現が、空間的に結合されるプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターは、その制御下で遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置し得る。プロモーターと遺伝子の間の距離は、プロモーターがそれに由来する遺伝子において制御する、プロモーターと遺伝子の間の距離とほぼ同じであり得る。当該技術分野において公知であるように、この距離の変動は、プロモーター機能を喪失することなく行い得る。「動作可能に連結される」とは、ある機能が他者によって制御されるような、単一断片におけるポリヌクレオチド断片の会合を指す。例えば、プロモーターがポリヌクレオチド断片の転写を制御することが可能である場合、プロモーターはポリヌクレオチド断片に動作可能に連結されている。
「植物」という用語は、そのライフサイクルまたは発育の任意の段階にある任意の植物、およびその子孫を指す。一実施形態では、植物はたばこ植物であり、これはＮｉｃｏｔｉａｎａ属に属する植物を指す。この用語は、植物全体、植物器官、植物組織、植物珠芽、植物種子、植物細胞、およびその子孫への言及を含む。植物細胞としては、これらに限定されないが、種子、懸濁培養、胚、分裂組織部位、カルス組織、葉、根、苗条、配偶体、胞子体、花粉、および花粉粒の細胞が挙げられる。好適な種、栽培品種、混成体、および品種のたばこ植物が本明細書に説明される。
「植物材料」には、葉、根、咢片、根先、花弁、花、芽、茎、種および葉柄が含まれる。植物材料は、生存可能または非生存可能な植物材料であり得る。
「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、または「ポリヌクレオチド断片」は、本明細書において互換的に使用され、合成、非天然、または変更されたヌクレオチド塩基を任意に含有する一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを指す。本開示のポリヌクレオチドは、添付の配列表に記載されている。
「ポリペプチド」または「ポリペプチド配列」は、一つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然型アミノ酸の人工化学的類似体であるアミノ酸のポリマー、ならびにアミノ酸の天然型ポリマーを指す。これらの用語は、これらに限定されないが、グリコシル化、脂質付着、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ－カルボキシル化、水酸化、およびＡＤＰリボース化を含む改変も含む。本開示のポリペプチドは、添付の配列表に記載されている。
「プロモーター」は、細胞におけるポリヌクレオチドの発現を付与、活性化、または増強することが可能である合成または天然由来分子を意味する。この用語は、典型的には上流に位置し、二本鎖ポリヌクレオチド断片に動作可能に連結されたポリヌクレオチドの要素／配列を指す。プロモーターは、対象の天然遺伝子の近傍の領域に完全に由来し得るか、または異なる天然プロモーターもしくは合成ポリヌクレオチドセグメントに由来する異なる要素から構成され得る。プロモーターは、さらに発現を高めるため、または空間的発現もしくは時間的発現を変更するために、一つまたは複数の特異的転写制御配列を含み得る。プロモーターはまた、遠位エンハンサーまたはリプレッサー要素も含み得、転写の開始部位から数千個ほどの塩基対を配置し得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む発生源に由来し得る。プロモーターは、発現が起こる細胞、組織、もしくは器官に対して、または発現が起こる成長段階に対して、あるいは生理的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘発剤等の外部刺激に応答して、構成的または差示的に遺伝子成分の発現を制御し得る。
本明細書で互換的に使用される場合、「組織特異的プロモーター」および「組織優先的プロモーター」は、必ずしもそうではないが主に一つの組織または器官においてのみ発現するが、一つの特定の細胞においても発現し得るプロモーターを指す。「発生的に制御されたプロモーター」は、その機能が発生事象によって決定されるプロモーターを指す。「構成的プロモーター」は、ほとんどの場合にほとんどの細胞型において遺伝子を発現させるプロモーターを指す。「誘導プロモーター」は、例えば、化合物（化学誘導物質）による内因性もしくは外因性刺激の存在に応じて、または環境、ホルモン、化学、もしくは発生シグナル、もしくはそれらの二つ以上の組み合わせに応じて、動作可能に連結されたＤＮＡ配列を選択的に発現させる。誘導プロモーターまたは制御されたプロモーターの例としては、光、熱、圧力、湛水もしくは乾燥、病原体、植物ホルモン、創傷、またはエタノール、ジャスモン酸、サリチル酸、もしくは薬害軽減剤などの化学物質によって制御されるプロモーターが挙げられる。
「組み換え」は、例えば、化学的合成によるか、または遺伝子組み換え技法によるポリヌクレオチドの単離セグメントの操作による、二つの、そうでなければ分離した配列セグメントの人工的な組み合わせを指す。この用語はまた、異種ポリヌクレオチドの導入によって改変されている細胞もしくはベクター、またはそのように改変された細胞由来の細胞への言及も含むが、意図的な人間の介入なしに発生するものなどの、天然型事象（例えば、偶発突然変異、自然形質転換または形質導入または転位）による細胞またはベクターの変更を包含しない。
「組み換え構築物」は、通常天然では一緒に発見されないポリヌクレオチドの組み合わせを指す。したがって、組み換え構築物は、異なる供給源に由来する制御配列およびコード配列、または同じ供給源に由来するが、通常天然で発見されるものとは異なる様式で配列された制御配列およびコード配列を含み得る。組み換え構築物は、組み換えＤＮＡ構築物であり得る。
本明細書で互換的に使用される場合、「制御配列」および「制御要素」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部、または下流（３’非コード配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセッシングもしくは安定性、または関連するコード配列の翻訳に影響を及ぼすポリヌクレオチド配列を指す。制御配列としては、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列が挙げられる。「制御配列」および「制御要素」という用語は、本明細書において互換的に使用される。
「たばこ」という用語は集合的な意味で使用され、本明細書に説明されるように調製または取得される、たばこ作物（例えば、圃場で栽培され、水耕栽培たばこではない複数のたばこ植物）、たばこ植物、ならびに根、茎、葉、花、および種子を含むがこれらに限定されないその部分を指す。「たばこ」は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ植物およびその製品を含むことが理解される。
「たばこ製品」という用語は、限定はされないが、喫煙材料（例えば、紙巻たばこ、シガー、およびパイプたばこ）、嗅ぎたばこ、噛みたばこ、ガム、およびトローチ剤、ならびに消費者たばこ製品の製造のための構成要素、材料、および成分を含む、消費者たばこ製品を意味する。好適には、これらのたばこ製品は、たばこから収穫されるたばこ葉および葉柄から製造され、たばこ調製における従来的な技法に従って切断、乾燥、乾燥処理、または発酵される。
「転写ターミネーター」、「終止配列」、または「ターミネーター」は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指し、ポリアデニル化認識配列、およびｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことができる制御シグナルをコードする他の配列が含まれる。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸配列の付加に影響を及ぼすという特徴がある。
「トランスジェニック」は、そのゲノムが組み換え構築物などの異種ポリヌクレオチドの存在によって変更されている任意の細胞、細胞株、カルス、組織、植物部分、または植物を指し、それらの最初のトランスジェニック事象、ならびに最初のトランスジェニック事象から有性交雑または無性繁殖によって作り出されたものが含まれる。この用語は、従来的な植物育種方法によるか、または天然型事象（例えば、無作為な交雑受精、非組み換え型ウイルス感染、非組み換え型細菌形質転換、非組み換え型転位、または偶発突然変異）によるゲノム（染色体または染色体外）の変更を包含しない。
「トランスジェニック植物」は、そのゲノム内に一つまたは複数の異種ポリヌクレオチドを含む植物、すなわち、通常その中では発見されず、人為的操作によって問題の植物（またはその植物の祖先）に導入されている、組み換え遺伝子材料を含有する植物を指す。例えば、異種ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが継続世代に伝わるように、安定的にゲノム内に統合される。異種ポリヌクレオチドは、単独で、または組み換え構築物の一部として、ゲノムに統合することができる。また、遺伝的に改良された生殖質の商業開発は、複数の形質を作物植物に導入する段階まで進んでおり、しばしば遺伝子スタッキング手法と称される。当該手法では、対象の異なる特性を付与する複数の遺伝子を植物に導入することができる。遺伝子スタッキングは、これらに限定されないが、同時形質転換、再形質転換、および異なる導入遺伝子を有する交雑系統を含む多くの手段によって達成することができる。したがって、形質転換によって組み換えＤＮＡが導入された植物細胞から成長した植物はトランスジェニック植物であり、（有性生殖または無性生殖にかかわらず）導入された導入遺伝子を含有する植物の全子孫も同様である。トランスジェニック植物という用語は、植物または樹木の全体および植物または樹木の部分、例えば、穀粒、種子、花、葉、根、果実、花粉、葉柄等を包含することが理解される。各異種ポリヌクレオチドは、トランスジェニック植物に異なる形質を付与し得る。
「導入遺伝子」は、ある生物から単離され、かつ異なる生物に導入されている遺伝子配列を含有する遺伝子または遺伝子材料を指す。この非天然のＤＮＡセグメントは、トランスジェニック生物においてＲＮＡまたはポリペプチドを産生する能力を保持し得るか、またはトランスジェニック生物の遺伝子コードの正常な機能を変更し得る。
ポリヌクレオチドに関する「変異体」とは、（ｉ）ポリヌクレオチドの一部分もしくは断片、（ｉｉ）ポリヌクレオチドもしくはその一部分の相補体、（ｉｉｉ）対象のポリヌクレオチドもしくはその相補体と実質的に同一であるポリヌクレオチド、または（ｉｖ）対象のポリヌクレオチド、その相補体、もしくはそれらと実質的に同一のポリヌクレオチドに厳密な条件下でハイブリッド形成するポリヌクレオチドを意味する。
ペプチドまたはポリペプチドに関する「変異体」は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によって配列が相違するが、少なくとも一つの生物学的機能または活性を保持するペプチドまたはポリペプチドを意味する。変異体はまた、少なくとも一つの生物学的機能または活性を保持するポリペプチドを意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、あるアミノ酸を類似した特性（例えば、荷電領域の親水性、程度、および分布）を有する異なるアミノ酸で置き換えることは、典型的には軽微な変化を伴うと当該技術分野で認識されている。
「品種」という用語は、同じ種の他の植物から区別される一定の特性を共有する植物の集団を指す。一つまたは複数の特有の形質を有しながらも、品種は、その品種内の個体間の非常に軽微な全体的変化によってさらに特性付けられる。品種は、しばしば市販されている。
「ベクター」とは、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド構築物、およびポリヌクレオチド共役体などの輸送を可能にするためのポリヌクレオチド構成要素の組み合わせを含むポリヌクレオチド媒体を指す。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであり得る。好適なベクターには、円形の二本鎖ヌクレオチドプラスミド、線形の二本鎖ヌクレオチドプラスミド、および他の任意の起源のベクターなど、染色体外の複製が可能なエピソームが含まれる。「発現ベクター」は、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド構築物、およびポリヌクレオチド共役体などの発現を可能にするためのポリヌクレオチド構成要素の組み合わせを含むポリヌクレオチド媒体である。好適な発現ベクターには、円形の二本鎖ヌクレオチドプラスミド、線形の二本鎖ヌクレオチドプラスミド、および他の任意の起源の機能的に同等な発現ベクターなど、染色体外の複製が可能なエピソームが含まれる。発現ベクターは、以下に定義されるように、上流に位置し、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド構築物、またはポリヌクレオチド共役体に動作可能に連結された、少なくともプロモーターを含む。
本明細書に別段定義されない限り、本開示に関連して使用される科学的および技術的用語は、当業者によって通常理解されている意味を有するものとする。例えば、本明細書に説明される細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにポリペプチドおよびポリヌクレオチド化学およびハイブリッド形成に関連して使用される任意の命名および技術は、当該技術分野において周知であり、通常使用されているものである。用語の意味および範囲は明確でなければならないが、あらゆる潜在的な曖昧性が発生した場合には、本明細書に提供される定義がいかなる辞書または外部の定義を越えて優先される。さらに、文脈によって別段指定されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
２．ポリヌクレオチド
配列表に示される任意のポリヌクレオチドを含む、本明細書に説明される任意の配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる単離ポリヌクレオチドが開示される。単離ポリヌクレオチドは、それに対する少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％ ９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を持つ配列を含むか、それからなるか、それから実質的になることが適切である。
好適には、本明細書に説明されるポリヌクレオチドは、配列表に示されるポリペプチドの機能または活性の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％以上を有する活性ポリペプチドをコードする。
別の実施形態では、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、または配列番号９に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、それからなる、または本質的にそれからなる単離ＮｔＩＮＶポリヌクレオチドが提供される。
別の実施形態では、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、または配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、または配列番号３２に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、それからなる、または本質的にそれからなる単離ＮｔＳＵＳポリヌクレオチドが提供される。
好適には、単離ポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、または配列番号９に対して少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％ ９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる。
好適には、単離ポリヌクレオチドは、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、または配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、または配列番号３２に対して少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％ ９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる。
好適には、単離ポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、または配列番号９に対して少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％ ９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる。
好適には、単離ポリヌクレオチドは、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、または配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、または配列番号３２に対して少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％ ９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる。
好適には、単離ポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、または配列番号９に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる。
好適には、単離ポリヌクレオチドは、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、または配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、または配列番号３２に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる。
別の実施形態では、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、または配列番号９に対して実質的な相動性（すなわち、配列類似性）または実質的な同一性を有するポリヌクレオチドを含む、それからなる、または本質的にそれからなるポリヌクレオチドを提供する。
別の実施形態では、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、または配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、または配列番号３２に対して実質的な相動性（すなわち、配列類似性）または実質的な同一性を有するポリヌクレオチドを含む、それからなる、または本質的にそれからなるポリヌクレオチドを提供する。
別の実施形態では、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、または配列番号９の断片が提供され、断片は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、または配列番号９の対応する断片に対して少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％ ９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％の配列同一性を有する、それに対する実質的な相動性（すなわち、配列類似性）または実質的な同一性を有する。
別の実施形態では、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、または配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、または配列番号３２の断片が提供され、断片は、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、または配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、または配列番号３２の対応する断片に対して少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％ ９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％の配列同一性を有する、それに対する実質的な相動性（すなわち、配列類似性）または実質的な同一性を有する。
別の実施形態では、ＩＮＶとして機能するポリペプチドをコードする配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、もしくは配列番号９に対して十分なもしくは実質的な程度の同一性または類似性を含むポリヌクレオチドが提供される。
別の実施形態では、ＳＵＳとして機能するポリペプチドをコードする配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、または配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、もしくは配列番号３２に対して十分または実質的な程度の同一性または類似性を含むポリヌクレオチドが提供される。
別の実施形態では、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、または配列番号９として本明細書に指定されるポリヌクレオチドを含む、それからなる、または本質的にそれからなるポリヌクレオチドのポリマーを提供する。
別の実施形態では、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、または配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、または配列番号３２として本明細書に指定されるポリヌクレオチドを含む、それからなる、または本質的にそれからなるポリヌクレオチドのポリマーを提供する。
好適には、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、それぞれ、ＩＮＶ活性またはＳＵＳ活性を有する、ＩＮＶファミリーまたはＳＵＳファミリーのメンバーをコードする。
ポリヌクレオチドは、未改変もしくは改変デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）であり得るヌクレオチドの重合体を含むことができる。したがって、ポリヌクレオチドは、これらに限定されないが、ゲノムＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ｍＲＮＡ、もしくはアンチセンスＲＮＡ、またはそれらの断片であり得る。その上、ポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子、または一本鎖および二本鎖領域の混合物もしくはそれらの断片を含むハイブリッド分子であり得る。さらに、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはそれらの両方、またはそれらの断片を含む、三重鎖領域で構成され得る。ポリヌクレオチドは、ホスホチオアートなどの一つまたは複数の改変された塩基を含有することができ、ペプチド核酸であり得る。一般的に、ポリヌクレオチドは、単離されたかもしくはクローン化されたｃＤＮＡの断片、ゲノムＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、または個々のヌクレオチド、あるいは前述の組み合わせから組み立てることができる。本明細書に説明されるポリヌクレオチドはＤＮＡ配列として示されているが、それらは、それらの対応するＲＮＡ配列、およびそれらの逆相補体を含むそれらの相補的な（例えば、完全に相補的な）ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含む。
ポリヌクレオチドの断片は、少なくとも約２５個のヌクレオチド、約５０個のヌクレオチド、約７５個のヌクレオチド、約１００個のヌクレオチド、約１５０個のヌクレオチド、約２００個のヌクレオチド、約２５０個のヌクレオチド、約３００個のヌクレオチド、約４００個のヌクレオチド、約５００個のヌクレオチド、約６００個のヌクレオチド、約７００個のヌクレオチド、約８００個のヌクレオチド、約９００個のヌクレオチド、約１０００個のヌクレオチド、約１１００個のヌクレオチド、約１２００個のヌクレオチド、約１３００個のヌクレオチド、または約１４００個のヌクレオチドから、本明細書に説明されるポリペプチドをコードする完全長ポリヌクレオチドまでの範囲であり得る。
ポリヌクレオチドは一般的にリン酸ジエステル結合を含有するが、いくつかの場合では、ポリヌクレオチド類似体は、例えば、ホスホルアミド酸、ホスホロチオ酸、ホスホロジチオ酸、またはＯ－メチルホホロアミダイト連鎖、ならびにペプチドポリヌクレオチドの骨格および連鎖を含む、代替的な骨格を有し得る。他の類似体ポリヌクレオチドには、陽性骨格、非イオン性骨格、および非リボース骨格を有するものが含まれる。リボース－リン酸骨格の改変は、様々な理由で、例えば、このような分子の生理学的環境における、またはバイオチップ上のプローブとしての安定性および半減期を増大させるために行われ得る。天然型ポリヌクレオチドおよび類似体の混合物、あるいは、異なるポリヌクレオチド類似物の混合物、ならびに天然型ポリヌクレオチドおよび類似体の混合物を作製し得る。
例えば、ホスホルアミド酸、ホスホロチオ酸、ホスホロジチオ酸、Ｏ－メチルホホロアミダイト連鎖、ならびにペプチドポリヌクレオチドの骨格および連鎖を含む、様々なポリヌクレオチド類似体が知られている。他の類似体ポリヌクレオチドには、陽性骨格、非イオン性骨格、および非リボース骨格を有するものが含まれる。一つまたは複数の炭素環式糖を含有するポリヌクレオチドも含まれる。
他の類似体には、ペプチドポリヌクレオチド類似体であるペプチドポリヌクレオチドが含まれる。
開示されるポリヌクレオチドおよびその断片の用途の中には、ハイブリッド形成アッセイにおけるプローブ、または増幅アッセイにおいて使用するためのプライマーとしての断片の用途がある。このような断片は、一般的に、ＤＮＡ配列の少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０以上の連続するヌクレオチドを含む。他の実施形態では、ＤＮＡ断片は、ＤＮＡ配列の少なくとも約１０、１５、２０、３０、４０、５０または６０以上の連続するヌクレオチドを含む。したがって、一態様では、プローブもしくはプライマーまたは両方の使用を含む、ポリヌクレオチドを検出するための方法も提供される。
ハイブリッド形成条件の選択に影響を及ぼす基本的なパラメータ、および好適な条件を考案するための手引きについては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）によって説明されている。遺伝子コードを本明細書に説明されるポリペプチド配列と組み合わせた知識を用いて、縮重オリゴヌクレオチドの組を調製することができる。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ断片が単離され増幅されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、プライマーとして有用である。
少なくとも一つの改変（例えば、突然変異）を、ＮｔＩＮＶ３－Ｓ、ＮｔＩＮＶ３－Ｔ、ＮｔＩＮＶ４－Ｓ、およびＮｔＩＮＶ４－Ｔのうちの一つまたは複数に含めることができる。
少なくとも一つの改変（例えば、突然変異）を、ＮｔＩＮＶ４－ＳおよびＮｔＩＮＶ４－Ｔのうちの一つまたは複数に含めることができる。
少なくとも一つの改変（例えば、突然変異）は、ＮｔＩＮＶ３－Ｓ、ＮｔＩＮＶ３－Ｔ、ＮｔＩＮＶ４－Ｓ、およびＮｔＩＮＶ４－Ｔのうちの一つまたは複数に含めることができる。任意に、少なくとも一つまたは複数のさらなる改変（例えば、突然変異）は、ＮｔＳＵＳ１－Ｓ、ＮｔＳＵＳ１－Ｔ、ＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、ＮｔＳＵＳ４－Ｓ、ＮｔＳＵＳ４－Ｔ、ＮｔＳＵＳ５－Ｓ、ＮｔＳＵＳ５－Ｔ、ＮｔＳＵＳ６－ＳおよびＮｔＳＵＳ６－Ｔのうちの一つまたは複数に、好適には、ＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、ＮｔＳＵＳ４－ＳおよびＮｔＳＵＳ４－Ｔのうちの一つまたは複数に含めることができる。
少なくとも一つの改変（例えば、突然変異）は、ＮｔＩＮＶ３－Ｓ、ＮｔＩＮＶ３－Ｔ、ＮｔＩＮＶ４－Ｓ、およびＮｔＩＮＶ４－Ｔのうちの一つまたは複数に含めることができ、少なくとも一つの改変（例えば、突然変異）は、ＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、ＮｔＳＵＳ４－ＳおよびＮｔＳＵＳ４－Ｔのうちの一つまたは複数に含めることができる一方で、ＮｔＳＵＳ１－Ｓ、ＮｔＳＵＳ１－Ｔ、ＮｔＳＵＳ５－Ｓ、ＮｔＳＵＳ５－Ｔ、ＮｔＳＵＳ６－ＳおよびＮｔＳＵＳ６－Ｔのうちの一つまたは複数に改変（例えば、突然変異）は含まれない。
少なくとも一つの改変（例えば、突然変異）は、ＮｔＩＮＶ３－Ｓ、ＮｔＩＮＶ３－Ｔ、ＮｔＩＮＶ４－Ｓ、およびＮｔＩＮＶ４－Ｔのうちの一つまたは複数に含めることができ、少なくとも一つの改変（例えば、突然変異）は、ＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、およびＮｔＳＵＳ４－Ｓのうちの一つまたは複数に含めることができる一方で、ＮｔＳＵＳ１－Ｓ、ＮｔＳＵＳ１－Ｔ、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ、ＮｔＳＵＳ４－Ｔ、ＮｔＳＵＳ５－Ｓ、ＮｔＳＵＳ５－Ｔ、ＮｔＳＵＳ６－ＳおよびＮｔＳＵＳ６－Ｔのうちの一つまたは複数に改変（例えば、突然変異）は含まれない。
少なくとも一つの改変（例えば、突然変異）は、ＮｔＩＮＶ４－ＳおよびＮｔＩＮＶ４－Ｔのうちの一つまたは複数に含めることができ、少なくとも一つの改変（例えば、突然変異）は、ＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、ＮｔＳＵＳ４－ＳおよびＮｔＳＵＳ４－Ｔのうちの一つまたは複数に含めることができる一方で、ＮｔＳＵＳ１－Ｓ、ＮｔＳＵＳ１－Ｔ、ＮｔＳＵＳ５－Ｓ、ＮｔＳＵＳ５－Ｔ、ＮｔＳＵＳ６－ＳおよびＮｔＳＵＳ６－Ｔのうちの一つまたは複数に改変（例えば、突然変異）は含まれない。
少なくとも一つの改変（例えば、突然変異）は、ＮｔＩＮＶ４－ＳおよびＮｔＩＮＶ４－Ｔのうちの一つまたは複数に含めることができ、少なくとも一つの改変（例えば、突然変異）は、ＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、およびＮｔＳＵＳ４－Ｓのうちの一つまたは複数に含めることができる一方で、ＮｔＳＵＳ１－Ｓ、ＮｔＳＵＳ１－Ｔ、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ、ＮｔＳＵＳ４－Ｔ、ＮｔＳＵＳ５－Ｓ、ＮｔＳＵＳ５－Ｔ、ＮｔＳＵＳ６－ＳおよびＮｔＳＵＳ６－Ｔのうちの一つまたは複数に改変（例えば、突然変異）は含まれない。
３．ポリペプチド
配列表に示される任意のポリペプチドを含む、本明細書に説明される任意のポリペプチドに対して少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、それからなる、または本質的にそれからなる単離ポリペプチドも提供される。好適には、単離ポリペプチドは、それに対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる。
配列番号２、配列番号４、配列番号６、もしくは配列番号８に対して少なくとも６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％ ９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなるＮｔＩＮＶポリペプチドも提供する。
配列番号２、配列番号４、配列番号６、もしくは配列番号８に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％ ９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなるポリペプチドも提供する。
配列番号２、配列番号４、配列番号６、もしくは配列番号８に対して少なくとも９５％ ９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなるポリペプチドも提供する。
配列番号２、配列番号４、配列番号６、もしくは配列番号８によってコードされるポリペプチドも提供する。
ポリペプチドは、ＩＮＶとして機能するために、配列番号２、配列番号４、配列番号６、もしくは配列番号８に対して十分なもしくは実質的な程度の同一性または類似性を含む配列を含むことができる。
配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、もしくは配列番号３１、または配列番号３３に対して少なくとも６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％ ９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなるＮｔＳＵＳポリペプチドも提供する。
配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、もしくは配列番号３１、または配列番号３３に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％ ９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなるポリペプチドも提供する。
配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、もしくは配列番号３１、または配列番号３３に対して少なくとも９５％ ９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなるポリペプチドも提供する。
配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、もしくは配列番号３１、または配列番号３３によってコードされるポリペプチドも提供する。
ポリペプチドは、ＳＵＳとして機能するために、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、もしくは配列番号３１、または配列番号３３に対して十分または実質的な程度の同一性または類似性を含む配列を含むことができる。
ポリペプチドの断片は、典型的には、完全長配列の機能または活性の一部または全て（ＩＮＶまたはＳＵＳ活性など）を保持する。ポリペプチドの断片は、少なくとも約２５個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸、約７５個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸、約１５０個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸、約２５０個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸、約５００個のアミノ酸から、本明細書に説明される完全長ポリペプチドまでの範囲であり得る。
ポリペプチドはまた、任意の種類の変更（例えば、アミノ酸の挿入、欠失、または置換；グリコシル化状態の変化；再折り畳みもしくは異性化、三次元構造、または自己会合状態に影響を及ぼす変化）の導入によって生成される突然変異体も含み、それらの機能または活性の一部もしくはすべてを依然として有する場合には、意図的に操作するか、または自然に単離することができる。好適には、この機能または活性は調節される。
欠失は、ポリペプチドからの一つまたは複数のアミノ酸の除去を指す。挿入は、一つまたは複数のアミノ酸残基がポリペプチド内の所定の部位に導入されることを指す。挿入は、単一または複数のアミノ酸の配列内の挿入を含み得る。置換は、ポリペプチドのアミノ酸を、類似の特性（例えば、類似の疎水性、親水性、抗原性、αヘリックス構造もしくはβシート構造を形成または破損する傾向）を有する他のアミノ酸で置き換えることを指す。アミノ酸置換は、典型的には単一の残基の置換であるが、ポリペプチドに対して課された機能的制約に応じてクラスター化され得、約１～約１０アミノ酸の範囲であり得る。アミノ酸置換は、好ましくは、以下に説明されるような保存的アミノ酸置換である。アミノ酸の置換、欠失、または挿入は、ペプチド合成技法（例えば、固相ペプチド合成）を使用するか、または組み換えＤＮＡ操作によって行うことができる。ポリペプチドの置換、挿入、または欠失変異体を生成するためにＤＮＡ配列を操作する方法は、当該技術分野において周知である。変異体は、サイレント変化を生み出す改変を有し得、機能的に同等なポリペプチドをもたらし得る。物質の二次的な結合が保持されている限り、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および両親媒性における類似性に基づき、意図的なアミノ酸置換が行われ得る。例えば、負帯電のアミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含み、正帯電のアミノ酸は、リシンおよびアルギニンを含み、ならびに類似した親水性値を有する非帯電の極性頭基を備えたアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンを含む。保存的置換は、例えば、以下の表に従って行われ得る。二列目の同じ欄にあるアミノ酸、および好ましくは三列目の同じ行にあるアミノ酸は、互いに置換し得る。
Figure 2022550383000001
ポリペプチドは、成熟ポリペプチドもしくは未熟ポリペプチド、または未熟ポリペプチドに由来するポリペプチドであり得る。ポリペプチドは線形であり得、または公知の方法を使用して環化してもよい。ポリペプチドは、典型的には、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、または少なくとも４０個の連続アミノ酸を含む。
少なくとも一つの改変（例えば、突然変異）を、ＮｔＩＮＶ３－Ｓ、ＮｔＩＮＶ３－Ｔ、ＮｔＩＮＶ４－Ｓ、およびＮｔＩＮＶ４－Ｔのうちの一つまたは複数に含めることができる。
少なくとも一つの改変（例えば、突然変異）を、ＮｔＩＮＶ４－ＳおよびＮｔＩＮＶ４－Ｔのうちの一つまたは複数に含めることができる。
少なくとも一つの改変（例えば、突然変異）は、ＮｔＩＮＶ３－Ｓ、ＮｔＩＮＶ３－Ｔ、ＮｔＩＮＶ４－Ｓ、およびＮｔＩＮＶ４－Ｔのうちの一つまたは複数に含めることができる。任意に、少なくとも一つまたは複数のさらなる改変（例えば、突然変異）は、ＮｔＳＵＳ１－Ｓ、ＮｔＳＵＳ１－Ｔ、ＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、ＮｔＳＵＳ４－Ｓ、ＮｔＳＵＳ４－Ｔ、ＮｔＳＵＳ５－Ｓ、ＮｔＳＵＳ５－Ｔ、ＮｔＳＵＳ６－ＳおよびＮｔＳＵＳ６－Ｔのうちの一つまたは複数に、好適には、ＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、ＮｔＳＵＳ４－ＳおよびＮｔＳＵＳ４－Ｔのうちの一つまたは複数に含めることができる。
少なくとも一つの改変（例えば、突然変異）は、ＮｔＩＮＶ３－Ｓ、ＮｔＩＮＶ３－Ｔ、ＮｔＩＮＶ４－Ｓ、およびＮｔＩＮＶ４－Ｔのうちの一つまたは複数に含めることができ、少なくとも一つの改変（例えば、突然変異）は、ＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、ＮｔＳＵＳ４－ＳおよびＮｔＳＵＳ４－Ｔのうちの一つまたは複数に含めることができる一方で、ＮｔＳＵＳ１－Ｓ、ＮｔＳＵＳ１－Ｔ、ＮｔＳＵＳ５－Ｓ、ＮｔＳＵＳ５－Ｔ、ＮｔＳＵＳ６－ＳおよびＮｔＳＵＳ６－Ｔのうちの一つまたは複数に改変（例えば、突然変異）は含まれない。
少なくとも一つの改変（例えば、突然変異）は、ＮｔＩＮＶ３－Ｓ、ＮｔＩＮＶ３－Ｔ、ＮｔＩＮＶ４－Ｓ、およびＮｔＩＮＶ４－Ｔのうちの一つまたは複数に含めることができ、少なくとも一つの改変（例えば、突然変異）は、ＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、およびＮｔＳＵＳ４－Ｓのうちの一つまたは複数に含めることができる一方で、ＮｔＳＵＳ１－Ｓ、ＮｔＳＵＳ１－Ｔ、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ、ＮｔＳＵＳ４－Ｔ、ＮｔＳＵＳ５－Ｓ、ＮｔＳＵＳ５－Ｔ、ＮｔＳＵＳ６－ＳおよびＮｔＳＵＳ６－Ｔのうちの一つまたは複数に改変（例えば、突然変異）は含まれない。
少なくとも一つの改変（例えば、突然変異）は、ＮｔＩＮＶ４－ＳおよびＮｔＩＮＶ４－Ｔのうちの一つまたは複数に含めることができ、少なくとも一つの改変（例えば、突然変異）は、ＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、ＮｔＳＵＳ４－ＳおよびＮｔＳＵＳ４－Ｔのうちの一つまたは複数に含めることができる一方で、ＮｔＳＵＳ１－Ｓ、ＮｔＳＵＳ１－Ｔ、ＮｔＳＵＳ５－Ｓ、ＮｔＳＵＳ５－Ｔ、ＮｔＳＵＳ６－ＳおよびＮｔＳＵＳ６－Ｔのうちの一つまたは複数に改変（例えば、突然変異）は含まれない。
少なくとも一つの改変（例えば、突然変異）は、ＮｔＩＮＶ４－ＳおよびＮｔＩＮＶ４－Ｔのうちの一つまたは複数に含めることができ、少なくとも一つの改変（例えば、突然変異）は、ＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、およびＮｔＳＵＳ４－Ｓのうちの一つまたは複数に含めることができる一方で、ＮｔＳＵＳ１－Ｓ、ＮｔＳＵＳ１－Ｔ、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ、ＮｔＳＵＳ４－Ｔ、ＮｔＳＵＳ５－Ｓ、ＮｔＳＵＳ５－Ｔ、ＮｔＳＵＳ６－ＳおよびＮｔＳＵＳ６－Ｔのうちの一つまたは複数に改変（例えば、突然変異）は含まれない。
４．植物の改変
ａ．形質転換
組み換え構築物は、ポリペプチドの発現、機能、または活性を調節するために、植物または植物細胞を形質転換するために使用することができる。組み換えポリヌクレオチド構築物は、一つまたは複数の本明細書に説明されるポリヌクレオチドをコードし、ポリペプチドを発現するのに好適な制御領域に動作可能に連結されたポリヌクレオチドを含むことができる。したがって、ポリヌクレオチドは、本明細書に説明されるポリペプチドをコードするコード配列を含むことができる。ポリペプチドの発現、機能、または活性が調節されている植物または植物細胞としては、突然変異型、非天然型、トランスジェニック、人造、または遺伝子組み換え植物または植物細胞を挙げることができる。好適には、トランスジェニック植物または植物細胞は、組み換えＤＮＡの安定した組み込みによって変更されたゲノムを含む。組み換えＤＮＡは、遺伝子組み換えされ、細胞の外部に構築されたＤＮＡを含み、かつ天然型ＤＮＡもしくはｃＤＮＡ、または合成ＤＮＡを含有するＤＮＡを含む。トランスジェニック植物は、最初に形質転換された植物細胞から再生された植物や、形質転換された植物の後の世代または交雑種からの子孫トランスジェニック植物を含むことができる。好適には、トランスジェニック改変は、対照植物と比較して、ポリヌクレオチドまたは本明細書に説明されるポリペプチドの発現または機能または活性を変更する。
組み換えポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドは、天然ポリペプチドであり得るか、または細胞に対して異種であり得る。いくつかの場合では、組み換え構築物は、発現を調節し、制御領域と動作可能に連結されたポリヌクレオチドを含有する。好適な制御領域の例が、本明細書に説明される。
本明細書に説明されるものなど、組み換えポリヌクレオチド構築物を含有するベクターも提供される。好適なベクター骨格としては、例えば、プラスミド、ウイルス、人工染色体、細菌人工染色体、酵母人工染色体、またはバクテリオファージ人工染色体など、当該技術分野で日常的に使用されているものが挙げられる。好適な発現ベクターとしては、例えば、バクテリオファージ、バキュロウイルス、およびレトロウイルスに由来するプラスミドおよびウイルスのベクターが挙げられるが、これらに限定されない。多数のベクターおよび発現システムが市販されている。
ベクターは、例えば、複製の起源、足場アタッチメント領域、またはマーカーを含むことができる。マーカー遺伝子は、植物細胞に対して選択可能な表現型を付与することができる。例えば、マーカーは、殺生物剤耐性、例えば、抗生物質（例えば、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、またはハイグロマイシン）または除草剤（例えば、グリホサート、クロルスルフロン、またはフォスフィノスリシン）に対する耐性を付与することができる。さらに、発現ベクターは、発現されたポリペプチドの操作または検出（例えば、精製または局在化）を促進するように設計されたタグ配列を含むことができる。ルシフェラーゼ、ベータ－グルクロニダーゼ、緑色蛍光ポリペプチド、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン、ｃ－ｍｙｃ、またはヘマグルチニン配列などのタグ配列は、典型的には、コードされるポリペプチドとの融合物として発現される。このようなタグは、カルボキシルまたはアミノ末端のいずれかも含めた、ポリペプチド内のどこにおいても挿入することができる。
植物または植物細胞は、安定的に形質転換されるようにそのゲノムに統合された組み換えポリヌクレオチドを有することによって形質転換することができる。本明細書に説明される植物または植物細胞は、安定的に形質転換することができる。安定的に形質転換された細胞は、典型的には、導入されたポリヌクレオチドを毎回の細胞分裂において保持する。植物または植物細胞は、組み換えポリヌクレオチドがそのゲノムに統合されないように、過渡的に形質転換することができる。過渡的に形質転換された細胞は、典型的には、導入された組み換えポリヌクレオチドが十分な数の細胞分裂の後で娘細胞において検出されないように、導入された組み換えポリヌクレオチドのすべてまたは一部を毎回の細胞分裂において失う。
バイオリステック、遺伝子銃技法、アグロバクテリウム媒介形質転換、ウイルスベクター媒介形質転換、凍結融解法、微粒子衝撃、直接的なＤＮＡ取り込み、超音波処理、マイクロインジェクション、植物ウイルス媒介導入、および電気穿孔を含む、植物細胞を形質転換するための多くの方法が、当該技術分野において利用可能である。
細胞または培養組織が形質転換のための受容体組織として使用される場合、植物は、所望する場合、当業者にとって公知の技法によって形質転換された培養体から再生することができる。
組み換え構築物に含まれる制御領域の選択は、効率、選択可能性、誘導性、所望の発現レベル、および細胞優先的または組織優先的な発現を含むがこれらに限定されない、いくつかの要因に依存する。コード配列に対して制御領域を適切に選択し配置することにより、コード配列の発現を調節することは、当業者にとって日常的な事柄である。ポリヌクレオチドの転写は、類似した様式で調節することができる。いくつかの好適な制御領域は、特定の細胞型においてのみ、または主に特定の細胞型において、転写を開始する。植物ゲノムＤＮＡ内の制御領域の識別および特性付けをするための方法は、当該技術分野において公知である。
例示的なプロモーターは、異なる組織または細胞型（例えば、根特異的プロモーター、苗条特異的プロモーター、木部特異的プロモーター）において存在するか、または異なる発育段階中に存在するか、または異なる環境的条件に応じて存在する組織特異的要因によって認識される組織特異的プロモーターを含む。好適なプロモーターは、ほとんどの細胞型で特定の誘導物質を必要とせずに活性化できる構成的プロモーターを含む。ポリペプチドの発現を制御するために使用され得るプロモーターの例として、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ（ＣａＭＶ／３５Ｓ）、ＳＳＵ、ＯＣＳ、ｌｉｂ４、ｕｓｐ、ＳＴＬＳ１、Ｂ３３、ｎｏｓ、またはユビキチンプロモーターもしくはファゼオリンプロモーターが挙げられる。当業者は、組み換えプロモーターの複数の変形物を生成することができる。
組織特異的プロモーターは、植物組織または生殖組織など特定の細胞または組織において、植物の発育中の特定の時点にのみ活性である転写制御要素である。発育管理下の組織特異的プロモーターの例には、植物組織（例えば、根または葉）または生殖組織（例えば、果実、胚珠、種子、花粉、雌しべ、花、または任意の胚性組織）などの特定の組織においてのみ（または主にそのような組織においてのみ）転写を開始することができるプロモーターが含まれる。生殖組織特異的プロモーターは、例えば、葯特異的、胚珠特異的、胚特異的、胚乳特異的、外皮特異的、種子および種皮特異的、花粉特異的、花弁特異的、咢片特異的、またはそれらの組み合わせであり得る。
例示的な葉特異的プロモーターには、ピルビン酸塩、Ｃ４植物（トウモロコシ）由来のオルソリン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）プロモーター、トウモロコシ由来のｃａｂ－ｍ１Ｃａ＋２プロモーター、シロイヌナズナｍｙｂ関連遺伝子プロモーター（Ａｔｍｙｂ５）、リブロースニリン酸カルボキシラーゼ（ＲＢＣＳ）プロモーター（例えば、葉および人工光源で栽培された苗木において発現されるトマトＲＢＣＳ１、ＲＢＣＳ２、およびＲＢＣＳ３Ａ遺伝子、発育中のトマト果実において発現されるＲＢＣＳ１およびＲＢＣＳ２、または葉身および葉鞘の葉肉細胞においてほぼ排他的に高レベルで発現されるリブロースニリン酸カルボキシラーゼプロモーター）が含まれる。
例示的な老化特異的プロモーターには、果実の成熟、老化、および葉の脱離中に活性であるトマトプロモーター、システインプロテアーゼをコードする遺伝子のトウモロコシプロモーター、８２Ｅ４のプロモーター、およびＳＡＧ遺伝子のプロモーターが含まれる。例示的な葯特異的プロモーターを使用することができる。当業者にとって公知の例示的な根優先的プロモーターを選択し得る。例示的な種子優先的プロモーターには、種子特異的プロモーター（種子の発育中に活性であるプロモーター、例えば、種子保存ポリペプチドのプロモーター）および種子発芽プロモーター（種子の発芽中に活性であるプロモーター）の両方が含まれる。
誘導性プロモーターの例には、病原体の攻撃、嫌気性条件、高温、光、乾燥、低温、または高塩分濃度に反応するプロモーターが含まれる。病原体誘導性プロモーターには、病原性に関連したポリペプチド（ＰＲポリペプチド）に由来するものが含まれ、これらは病原体（例えば、ＰＲポリペプチド、ＳＡＲポリペプチド、ベータ－１，３－グルカナーゼ、キチナーゼ）による感染に続いて誘導される。
植物プロモーターに加えて、好適な他のプロモーターは、細菌性の起源、例えば、オクトピン合成酵素プロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター、およびＴｉプラスミドに由来する他のプロモーターから誘導され得るか、ウイルスのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓおよび１９Ｓ ＲＮＡプロモーター、たばこモザイクウイルスの構成的プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓおよび３５Ｓプロモーター、またはゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓプロモーター）から誘導され得る。
ｂ．突然変異
本明細書に記載される一つまたは複数のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに少なくとも一つの突然変異を含む植物または植物細胞が開示されており、前述の突然変異は、ＮｔＩＮＶまたはそれによりコードされるポリペプチドの調節された機能または活性、あるいはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳまたはそれによりコードされるポリペプチドの調節された機能または活性をもたらす。そのような突然変異の組み合わせを本明細書で論じる。
（乾燥処理済みの）植物内または（乾燥処理済みの）たばこ植物材料内のＮｔＳＵＳポリペプチドのレベルを調節するための方法が提供されており、前述の方法は、前述の植物のゲノム中に、少なくとも一つのＮｔＩＮＶ遺伝子、または少なくとも一つのＮｔＩＮＶ遺伝子および少なくとも一つのＮｔＳＵＳ遺伝子の発現を調節する一つまたは複数の突然変異を導入することを含み、前述の少なくとも一つの遺伝子は、本開示に従ったいずれかの配列から選択される。
また、調節されたレベルの還元糖を有する植物を特定するための方法も提供されており、前述の方法は、対象の植物からのポリヌクレオチド試料を、本開示に従った配列における一つまたは複数の突然変異（ＮｔＩＮＶ、またはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳ、またはそれらの組み合わせなど）の存在についてスクリーニングすることと、任意に、還元糖のレベルを調節することが公知である突然変異と、特定された突然変異を相関付けることとを含む。
また、本開示に従ってＮｔＩＮＶ遺伝子、またはＮｔＩＮＶ遺伝子およびＮｔＳＵＳ遺伝子内の一つまたは複数の突然変異に対してヘテロ接合性またはホモ接合性である植物または植物細胞も開示されており、前述の突然変異は、遺伝子の発現またはそれによりコードされるＮｔＩＮＶポリペプチド、またはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリペプチドの機能もしくは活性の調節をもたらす。
有性交雑を含む多くの手法を使用して、一つの植物に突然変異を組み合わせることができる。遺伝子の発現またはそれによりコードされるポリペプチドの機能もしくは活性を調節する本開示に従う遺伝子における一つまたは複数の好都合なヘテロ接合性またはホモ接合性の突然変異を有する植物は、その発現またはそれによりコードされるポリペプチドの機能もしくは活性を調節する一つまたは複数の他の遺伝子における一つまたは複数の好都合なヘテロ接合性またはホモ接合性の突然変異を有する植物と交雑することができる。一実施形態では、交雑は、同一の植物内の本開示に従う遺伝子内に、一つまたは複数の好都合なヘテロ接合性またはホモ接合性の突然変異を導入するために行われる。
植物における一つまたは複数の本開示のポリペプチドの機能または活性は、そのポリペプチドの機能または活性を抑制するように改変されておらず、かつ同一のプロトコルを使用して栽培、収穫、および乾燥処理されている植物における同一のポリペプチドの機能または活性よりも機能または活性が低いまたは高い場合に、増加または減少している。
いくつかの実施形態では、突然変異は、突然変異誘発手法を使用して植物または植物細胞中に導入され、導入された突然変異は、サザンブロット分析、ＤＮＡ配列決定、ＰＣＲ分析、または表現型分析などの、当業者にとって公知の方法を使用して特定または選択される。遺伝子発現に影響を与えるか、またはコードされたポリペプチドの機能を妨げる突然変異は、当該技術分野において周知である方法を使用して決定することができる。遺伝子エクソンにおける挿入性の突然変異は、通常はヌル突然変異体をもたらす。保存された残基における突然変異は、コードされたポリペプチドの代謝機能の抑制に特に有効であり得る。例えば、高度に保存された領域のうちの一つまたは複数における突然変異は、ポリペプチド機能を変更させる可能性が高いが、それらの高度に保存された領域の外側の突然変異は、ポリペプチド機能にはほとんどまたは全く影響を及ぼさない可能性が高いことが理解されるであろう。さらに、単一ヌクレオチドにおける突然変異は終止コドンを作り出すことができ、これは切断型ポリペプチドをもたらし、切断の程度に応じて機能の喪失をもたらし得る。
突然変異型ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを獲得するための方法も開示される。植物細胞または植物材料を含めた任意の関心の植物は、突然変異誘発を誘導することが公知である様々な方法によって遺伝的に改変することができ、これらの方法には、部位特異的突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、化学誘発型突然変異誘発、放射線誘発型突然変異誘発、改変された塩基を利用した突然変異誘発、ギャップ二重鎖ＤＮＡを利用した突然変異誘発、二本鎖分解突然変異誘発、修復欠損宿主系統を利用した突然変異誘発、全遺伝子合成による突然変異誘発、ＤＮＡシャフリング、および他の同等な方法が含まれる。
本明細書に説明されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドにおける突然変異は、人造の突然変異、または合成的な突然変異、または遺伝子組み換えの突然変異を含むことができる。本明細書に説明されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドにおける突然変異は、生体外または生体内の操作工程を含むプロセスによって獲得されるか、または獲得可能である突然変異であり得る。本明細書に説明されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドにおける突然変異は、人間による介入を含むプロセスによって獲得されるか、または獲得可能である突然変異であり得る。突然変異型ポリペプチド変異体の機能または活性は、未変異のポリペプチドと比較して高いか、低いか、またはほぼ同一であり得る。
突然変異をポリヌクレオチド内に無作為に導入する方法には、化学的突然変異誘発および放射線突然変異誘発が含まれ得る。化学的突然変異誘発には、突然変異を誘発するための、突然変異誘発性、催奇形性、または発癌性有機化合物などの外因的に付加された化学物質の使用が関与する。主に点突然変異、ならびに短い欠失、挿入、ミスセンス突然変異、単純配列反復、塩基転換、または遷移を引き起こす突然変異原は、化学的突然変異原または放射線を含めて、突然変異を引き起こすために使用され得る。突然変異原は、エチルメタンスルホン酸塩、メチルメタンスルホン酸塩、Ｎ－エチル－Ｎ－ニトロソウレア、トリエチルメラミン、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロソウレア、プロカルバジン、クロランブシル、シクロホスファミド、ジエチル硫酸塩、アクリルアミドモノマー、メルファラン、ナイトロジェン・マスタード、ビンクリスチン、ジメチルニトロソアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－ニトロソグアニジン、ニトロソグアニジン、２－アミノプリン、７，１２ジメチル－ベンズ（ａ）アントラセン、酸化エチレン、ヘキサメチルホスホルアミド、ビスルファン、ジエポキシアルカン（ジエポキシオクタン、ジエポキシブタン等）、２－メトキシ－６－クロロ－９［３－（エチル－２－クロロ－エチル）アミノプロピルアミノ］アクリジン二塩酸塩、およびホルムアルデヒドを含む。
突然変異原が直接原因ではなかったかもしれない遺伝子座における偶発突然変異もまた、それらが所望の表現型をもたらす場合には企図される。好適な突然変異誘発性物質としては、例えば、イオン化放射線（例えば、Ｘ線、ガンマ線、高速中性子照射、およびＵＶ放射線）も挙げることができる。突然変異誘発性化学物質または放射線の投与量は、致死性または不稔性によって特徴付けられる閾値レベル未満である突然変異頻度が得られるように、各種類の植物組織に対して実験的に決定される。当業者に公知の植物ポリヌクレオチドを調製する任意の方法を使用して、突然変異スクリーニングのための植物ポリヌクレオチドを調製し得る。
突然変異プロセスは、一つまたは複数の植物交雑工程を含み得る。
突然変異後、スクリーニングを実施して、早熟の終止コドンあるいは非機能性遺伝子を作り出す突然変異を特定することができる。突然変異後、スクリーニングを実施して、上昇または減少したレベルで発現することが可能である機能性遺伝子を作り出す突然変異を特定することができる。突然変異体のスクリーニングは、配列決定によって、または遺伝子もしくはポリペプチドに対して特異的な一つまたは複数のプローブもしくはプライマーを使用することによって実施することができる。遺伝子発現の調節、ｍＲＮＡの安定性の調節、またはポリペプチドの安定性の調節をもたらすことができる、ポリヌクレオチドにおける特定の突然変異も引き起こすことができる。このような植物は、本明細書では、「非天然型」または「突然変異型」植物と称される。典型的には、突然変異型または非天然型植物には、操作される前には植物内に存在しなかった、外来性または合成的な、または人造のヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の少なくとも一部分が含まれるようになる。外来性のヌクレオチドは、単一のヌクレオチド、二つ以上のヌクレオチド、二つ以上の連続ヌクレオチド、または二つ以上の非連続ヌクレオチド、例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、または１５００個以上の連続または非連続ヌクレオチドであり得る。
ｃ．トランスジェニックおよびゲノム編集
一つまたは複数の内在性遺伝子の転写を妨害できる配列特異的ポリヌクレオチド、ＲＮＡ転写物（例えば、二本鎖ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム）の翻訳を妨害できる配列特異的ポリヌクレオチド、一つまたは複数のポリペプチドの安定性を妨害できる配列特異的ポリペプチド、一つまたは複数のポリペプチドの酵素機能または基質もしくは調節ポリペプチドに関する一つまたは複数のポリペプチドの結合機能を妨害できる配列特異的ポリヌクレオチド、一つまたは複数のポリペプチドに対して特異性を示す抗体、一つまたは複数のポリペプチドの安定性または一つまたは複数のポリペプチドの酵素機能または一つまたは複数のポリペプチドの結合機能を妨害できる小分子化合物、一つまたは複数のポリヌクレオチドを結合するジンクフィンガーポリペプチド、および一つまたは複数のポリヌクレオチドに対して機能を有するメガヌクレアーゼが、本明細書に説明されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドのうちの一つまたは複数の発現または機能または活性を調節するために使用することができる。ゲノム編集技術は当技術分野で周知であり、以下でさらに論じる。
ｄ．ジンクフィンガーヌクレアーゼ
ジンクフィンガーポリペプチドは、本明細書で説明したＮｔＩＮＶ、またはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドのうちの一つまたは複数の発現または機能または活性を調節するために使用され得る。ジンクフィンガーヌクレアーゼの使用については、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．（２０１０）１１（９）：６３６～６４６）に記載されている。
ｅ．メガヌクレアーゼ
ａｓ Ｉ－ＣｒｅＩなどのメガヌクレアーゼは、本明細書で説明したＮｔＩＮＶ、またはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドのうちの一つまたは複数の発現または機能または活性を調節するために使用され得る。メガヌクレアーゼの使用は、Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（２０１１）Ｆｅｂ；１１（１）：１１－２７およびＩｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．（２０１９）２０（１６）、４０４５に記載されている。
ｆ．ＴＡＬＥＮ
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、本明細書で説明したＮｔＩＮＶ、またはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドのうちの一つまたは複数の発現または機能または活性を調節するために使用され得る。ＴＡＬＥＮの使用については、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（２０１３）１４：４９－５５およびＩｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．（２０１９）２０（１６）、４０４５に記載されている。
ｇ．ＣＲＩＳＰＲ
ＣＲＩＳＰＲシステムは、本明細書で説明したＮｔＩＮＶ、またはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドのうちの一つまたは複数の発現または機能または活性を調節するために使用され得、好ましい方法である。この技術は、例えば、Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ （２０１６） １２：８；Ｆｒｏｎｔ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．（２０１６）７：５０６、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ（２０１５）３３、１、ｐ４１－５２、Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ Ｂ（２０１７）７、３、ｐ２９２－３０２、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．（２０１７）３６、１－８およびＩｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ（２０１９）２０（１６）、４０４５に記載されている。当技術分野で周知であるように、ＣＲＩＳＰＲ編集システムは概して、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ）（例えば、Ｃａｓ９）およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の二つの構成要素を含む。Ｃａｓは、Ｃａｓに結合されたｇＲＮＡ分子の配列によって定義されるゲノム内の部位で二本鎖ＤＮＡ切断を形成する。ＣａｓがＤＮＡを切断する位置は、それに結合されるｇＲＮＡの固有の配列によって定義される。ｇＲＮＡは、目的の標的ＤＮＡ領域を認識し、そこにＣａｓヌクレアーゼを向けて編集するために特別に設計されたＲＮＡ配列である。これは、（ｉ）Ｃａｓヌクレアーゼの結合足場としての役割を果たすトレーサーＲＮＡ、および（ｉｉ）標的ＤＮＡに相補的な１７～２０ヌクレオチド配列のクリスパーＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の二つのセクションを有する。 標的化されるＤＮＡの正確な領域は、特定の用途に依存する。例えば、標的ポリヌクレオチドを活性化または抑制するために、ｇＲＮＡを、標的ポリヌクレオチドの発現を駆動するプロモーターに標的化することができる。ｇＲＮＡを設計する方法は、Ｃｈｏｐ Ｃｈｏｐ Ｈａｒｖａｒｄを含む当技術分野で周知である。
シロイヌナズナおよびたばこにおけるＣａｓ９－ベースのゲノム編集の適用は、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（２０１４）５４６：４５９－７２およびＰｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０１８）１３１：３７－４６に記載されている。ＣＲＩＳＰＲ技術は、植物に広く導入されている（例えば、ＷＯ２０１５／１８９６９３を参照）。
Ｃａｓ９に加えて、ＣＲＩＳＰＲシステムで使用するための他のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが記載されており、Ｃａｓｌ、ＣａｓｌＢ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、ＣａｓｌＯ、Ｃｐｆｌ、Ｃｓｙｌ、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅｌ、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃｌ、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒｌ、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂｌ、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘｌ７、Ｃｓｘｌ４、ＣｓｘｌＯ、Ｃｓｘｌ６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘｌ、Ｃｓｘｌ５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３およびＣｓｆ４が含まれる。ある実施形態では、Ｃａｓ９の使用が好ましい。
本開示はさらに、ＲＮＡ型誘導ヌクレアーゼおよびｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集システムを提供し、ＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集システムは、本明細書に記載されるポリヌクレオチドのうちの一つまたは複数の活性を調節する。本開示はまた、植物細胞において一つまたは複数のポリヌクレオチドを切断する方法を提供し、当該方法は、ｇＲＮＡおよびＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを植物細胞に導入することを含み、当該ｇＲＮＡは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼに関連して作用して、本明細書に記載されるポリヌクレオチドのうちの一つまたは複数に鎖切断を生じさせる。（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、および（ｉｉ）標的化される本明細書に記載のポリヌクレオチドのＤＮＡに相補的なポリヌクレオチド配列（典型的には約１７～２０ヌクレオチド）を含むｇＲＮＡを含む、ＣＲＩＳＰＲ構築物も開示される。
ｈ．アンチセンス改変
アンチセンス技術は、ＮｔＩＮＶポリペプチドのうちの一つまたは複数、またはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリペプチドのうちの一つまたは複数の発現または活性の調節に使用され得る別の周知の方法である。例えば、Ｇｅｎｅ（１９８８）１０；７２（１－２）：４５－５０を参照のこと。
ｉ．可動性遺伝要素
あるいは、遺伝子は、トランスポゾン（例えば、ＩＳ要素）を関心の植物のゲノムに導入することにより、不活性化に標的化することができる。例えば、Ｃｙｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２００６）４０（４）：６８－８１を参照のこと。
ｊ．リボザイム
別の方法として、ＮｔＩＮＶ、またはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドは、自己切断および複製の能力がある数多くの小さい環状ＲＮＡに由来するリボザイムを植物に導入することにより、不活性化のための標的にできる。例えば、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９９）２３、３、２５７～２７５を参照のこと。
５．植物
突然変異型または非天然型の植物もしくは植物細胞は、それらのポリヌクレオチドもしくはそのポリヌクレオチド産物の発現もしくは機能もしくは活性を調節する結果をもたらす、ＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳのうちの一つもしくは複数、またはＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳのうちの一つもしくは複数における一つまたは複数の改変（例えば、突然変異）の任意の組み合わせを有することができる。例えば、突然変異型または非天然型植物もしくは植物細胞は、単一のＮｔＩＮＶまたは単一のＮｔＩＮＶおよび単一のＮｔＳＵＳポリヌクレオチドまたはポリペプチドにおける単一の改変；単一のＮｔＩＮＶまたは単一のＮｔＩＮＶおよび単一のＮｔＳＵＳポリヌクレオチドまたはポリペプチドにおける複数の改変；二つ以上または三つ以上または四つ以上のＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドまたはポリペプチドにおける単一の改変；または二つ以上または三つ以上または四つ以上のＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドまたはポリペプチドにおける複数の改変を有することができる。さらなる例として、突然変異型または非天然型植物もしくは植物細胞は、ＮｔＩＮＶまたはＮｔＳＵＳポリペプチドまたはその一部分の活性部位をコードするＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳの一領域内でなど、ＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドまたはポリペプチドの特定の部分内での一つまたは複数の改変を有し得る。さらなる例として、突然変異型または非天然型植物もしくは植物細胞は、一つまたは複数のＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドまたはポリペプチドの外部の領域、例えば、それらがＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳ ｐの機能または発現を調節することを条件として、それが調節するＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドの上流または下流の領域で、一つまたは複数の改変を有し得る。上流要素には、プロモーター、エンハンサー、または転写因子を含めることができる。一部の要素（例えば、エンハンサー）は、調整する遺伝子の上流または下流に位置することができる。一部の要素は、それが調節する遺伝子の数十万塩基対だけ上流または下流に位置することが判明しているため、要素はそれが調節する遺伝子の近くに位置する必要はない。突然変異型または非天然型植物または植物細胞は、遺伝子の最初の１００個のヌクレオチド内、遺伝子の最初の２００個のヌクレオチド内、遺伝子の最初の３００個のヌクレオチド内、遺伝子の最初の４００個のヌクレオチド内、遺伝子の最初の５００個のヌクレオチド内、遺伝子の最初の６００個のヌクレオチド内、遺伝子の最初の７００個のヌクレオチド内、遺伝子の最初の８００個のヌクレオチド内、遺伝子の最初の９００個のヌクレオチド内、遺伝子の最初の１０００個のヌクレオチド内、遺伝子の最初の１１００個のヌクレオチド内、遺伝子の最初の１２００個のヌクレオチド内、遺伝子の最初の１３００個のヌクレオチド内、遺伝子の最初の１４００個のヌクレオチド内、または遺伝子の最初の１５００個のヌクレオチド内に位置する、一つまたは複数の改変を有し得る。突然変異型または非天然型植物または植物細胞は、遺伝子の１００個のヌクレオチドの第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、または第１５の組、またはそれらの組み合わせの中に位置する、一つまたは複数の改変を有し得る。突然変異型ポリペプチド変異体を含む、突然変異型または非天然型植物または植物細胞（例えば、本明細書に説明されるような、突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物または植物細胞等）が開示される。
一実施形態では、植物からの種子は突然変異誘発され、次いで第一世代突然変異型植物に成長する。次いで、第一世代植物は自家受粉がなされ、第一世代植物からの種子が第二世代植物に成長し、次いでこれがその座位で突然変異についてスクリーニングされる。突然変異誘発された植物材料を突然変異についてスクリーニングすることができるが、第二世代植物をスクリーニングすることの利点は、すべての体細胞系突然変異が生殖細胞系突然変異に対応することである。当業者であれば、突然変異型植物を作り出すために、種子、花粉、植物組織または植物細胞を含むがこれらに限定されない様々な植物材料が突然変異誘発され得ることを理解するであろう。しかしながら、突然変異誘発された植物材料の種類は、植物のポリヌクレオチドが突然変異についてスクリーニングされる場合に影響を及ぼし得る。例えば、非突然変異誘発性植物の受粉前に花粉が突然変異誘発の対象となる場合、その受粉の結果生じる種子は第一世代植物に成長する。第一世代植物のすべての細胞は、花粉において作り出された突然変異を含有することになり、したがってこれらの第一世代植物は、次いで、第二世代まで待たずに突然変異についてスクリーニングされ得る。
６．改変した植物の調製、スクリーニング、および交雑
個体植物、植物細胞、または植物材料から調製したＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドは、任意に、突然変異誘発性の植物組織、細胞、または材料を起源とする植物の母集団内で、突然変異についてのスクリーニングを促進させるためにプールすることができる。植物、植物細胞、または植物材料の、後続する一つまたは複数の世代をスクリーニングすることができる。任意にプールされる群のサイズは、使用するスクリーニング方法の感受性に依存する。
試料を任意にプールした後、それらを、ＰＣＲなどのポリヌクレオチド特異的増幅技法の対象とすることができる。遺伝子のすぐ隣にある遺伝子または配列に特異的な一つまたは複数の任意のプライマーまたはプローブを利用して、任意にプールされた試料内で配列を増幅し得る。好適には、一つまたは複数のプライマーまたはプローブは、有用な突然変異が最も発生する可能性の高い遺伝子座の領域を増幅するように設計される。最も好ましくは、プライマーは、ポリヌクレオチドの領域内での突然変異を検出するように設計される。さらに、プライマーおよびプローブは、点突然変異についてのスクリーニングを容易にするために、公知の多型部位を避けることが好ましい。増幅産物の検出を促進するために、一つまたは複数のプライマーまたはプローブを任意の従来的な標識付け方法を使用して標識付けし得る。プライマーまたはプローブは、当該技術分野でよく理解されている方法を使用して、本明細書に説明される配列に基づいて設計することができる。
増幅産物の検出を促進するために、プライマーまたはプローブを任意の従来的な標識付け方法を使用して標識付けし得る。これらは、当該技術分野でよく理解されている方法を使用して、本明細書に説明される配列に基づいて設計することができる。
多型は、当該技術分野において公知の手段によって識別し得、いくつかは文献に記載されている。
いくつかの実施形態では、植物は、植物、植物組織、または植物細胞から再生または栽培し得る。植物細胞または植物組織から植物を再生または栽培するための任意の好適な方法は、限定はされないが、組織培養またはプロトプラストからの再生等が使用できる。好適には、植物は、カルス誘導培地、苗条誘導培地、または根誘導培地上で形質転換された植物細胞を栽培することによって再生され得る。例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５：８１－８４（１９８６）．を参照のこと。次に、これらの植物を栽培し、同じ形質転換系統または異なる系統のいずれかで受粉し、所望の表現型特性の発現を有する結果物の雑種を同定する。二世代以上を栽培して、所望の表現型特性の発現が安定的に維持および継承されることを確実なものとし、次いで、種子を収穫して、所望の表現型特性の発現が達成されることを確実なものとする。したがって、「形質転換された種子」は、植物ゲノムに安定的に統合されるヌクレオチド構築物を含有する種子を指す。
したがって、さらなる態様では、突然変異型植物を調製する方法が提供される。方法は、本明細書に説明される機能性ポリヌクレオチド（または本明細書に説明されるようなその任意の組み合わせ）をコードするＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳ遺伝子を含む、植物の少なくとも一つの細胞を提供することに関与する。次に、植物の少なくとも一つの細胞が、ポリヌクレオチドの機能を調節するのに効果的な条件下で処理される。次に、少なくとも一つの突然変異体である植物細胞は、突然変異体である植物内に増殖させられ、突然変異体である植物は、対照植物のそれと比較して調節されたレベルの本明細書に記載されるＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリペプチド（または本明細書で説明した通りその任意の組み合わせ）を有する。突然変異型植物を作製する本方法の一実施形態では、処理工程は、上述の通り、および少なくとも一つの突然変異型植物細胞を得るのに効果的な条件下で、少なくとも一つの細胞を化学的突然変異誘発物質に供することに関与する。本方法の別の実施形態では、処理工程は、少なくとも一つの突然変異型植物細胞を得るのに効果的な条件下で、少なくとも一つの細胞を放射線源に供することに関与する。「突然変異型植物」という用語は、対照植物と比較して遺伝子型が改変されており、好適にはそれが遺伝子工学または遺伝的改変以外の手段によって改変されている、突然変異型植物を含む。
特定の実施形態では、突然変異型植物、突然変異型植物細胞、または突然変異型植物材料は、別の植物、植物細胞、または植物材料において天然に発生し、かつ所望の特性を付与する一つまたは複数の突然変異を含み得る。この突然変異を、別の植物、植物細胞、または植物材料（例えば、突然変異が誘導された植物とは異なる遺伝的背景を有する植物、植物細胞、または植物材料）に組み込んで（例えば、遺伝子移入して）、それに対する特性を付与することができる。したがって、一例として、第一の植物において天然に発生した突然変異は、第二の植物（例えば、第一の植物とは異なる遺伝的背景を有する第二の植物）に導入され得る。 したがって、当業者は、所望の特性を付与する本明細書に説明される遺伝子の一つまたは複数の突然変異対立遺伝子をそのゲノム内に天然に保有する植物を検索および特定することができる。天然に発生する突然変異対立遺伝子を、育種、戻し交雑、および遺伝子移入を含む様々な方法によって第二の植物に移入させて、本明細書に説明される遺伝子において一つまたは複数の突然変異を有する系統、品種、または混成体を生成することができる。同じ技法は、第一の植物から第二の植物への一つまたは複数の非天然型突然変異の遺伝子移入にも適用することができる。所望の特性を示す植物は、突然変異型植物のプールからスクリーニングして除外し得る。好適には、選択は、本明細書に説明されるポリヌクレオチド配列の知識を利用して実施される。結果的に、対照と比較した遺伝的特性についてのスクリーニングが可能である。このようなスクリーニングの手法には、本明細書に考察されるような従来的な増幅またはハイブリッド形成技法の適用が関与し得る。したがって、本開示のさらなる態様は、突然変異体である植物を特定するための方法に関し、（ａ）植物からのＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドのうちの一つまたは複数を含む試料を提供する工程と、（ｂ）ポリヌクレオチド配列を決定する工程とを含み、対照植物のポリヌクレオチドと比較したポリヌクレオチドの配列の差は、前述の植物が突然変異体である植物であることを示す。別の態様では、対照植物と比較して増加または減少したレベルの還元糖を蓄積する、突然変異体である植物を特定するための方法が提供されており、（ａ）スクリーニングされる植物からの試料を提供する工程と、（ｂ）前述の試料が、本明細書に記載されるＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドのうちの一つまたは複数において一つまたは複数の突然変異を含むかを決定する工程と、（ｃ）前述の植物の少なくとも一つの還元糖、好適には、グルコースまたはフルクトースまたはそれらの組み合わせのレベルを決定する工程と、を含む。好適には、少なくとも一つの還元糖のレベルは、乾燥葉において決定される。別の態様では、対照植物と比較して増加または減少したレベルの少なくとも一つの還元糖、好適には、グルコースまたはフルクトースまたはそれらの組み合わせを有する、突然変異体である植物を調製するための方法が提供されており、（ａ）第一の植物からの試料を提供する工程と、（ｂ）前述の試料が、調節されたレベルの少なくとも一つの還元糖をもたらす、本明細書に記載されるＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドのうちの一つまたは複数において一つまたは複数の突然変異を含むかを決定する工程と、（ｃ）第二の植物に一つまたは複数の突然変異を導入する工程とを含む。好適には、少なくとも一つの還元糖のレベルは、乾燥葉において決定される。突然変異は、遺伝子組み換え、遺伝子操作、遺伝子移入、植物育種、戻し交雑などの、当該技術分野において公知の様々な方法を使用して、第二の植物に移入することができる。一実施形態では、第一の植物は、天然型植物である。一実施形態では、第二の植物は、第一の植物とは異なる遺伝的背景を有する。別の態様では、対照植物と比較して増加または減少したレベルの少なくとも一つの還元糖、好適には、グルコースまたはフルクトースまたはそれらの組み合わせを有する、突然変異体である植物を調製するための方法が提供されており、（ａ）第一の植物からの試料を提供する工程と、（ｂ）前述の試料が、調節されたレベルの少なくとも一つの還元糖をもたらす、本明細書に記載されるＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドのうちの一つまたは複数において一つまたは複数の突然変異を含むかを決定する工程と、（ｃ）第一の植物から第二の植物に一つまたは複数の突然変異を遺伝子移入する工程とを含む。好適には、少なくとも一つの還元糖のレベルは、乾燥葉において決定される。一実施形態では、遺伝子移入の工程は、任意に戻し交雑等を含む、植物育種を含む。一実施形態では、第一の植物は、天然型植物である。一実施形態では、第二の植物は、第一の植物とは異なる遺伝的背景を有する。一実施形態では、第一の植物は、栽培品種または優良栽培品種ではない。一実施形態では、第二の植物は、栽培品種または優良栽培品種である。さらなる態様は、本明細書に説明される方法によって獲得されたか、または獲得可能である突然変異型植物（栽培品種または優良栽培品種の突然変異型植物を含む）に関する。ある一定の実施形態で、突然変異体である植物は、本明細書で説明した一つまたは複数のＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドの配列内など、植物の特定の領域にのみ局所化された一つまたは複数の突然変異を持ちうる。この実施形態によれば、突然変異型植物の残りのゲノム配列は、突然変異誘発前の植物と同一となるか、または実質的に同一となる。
特定の実施形態では、突然変異型植物は、植物の複数のゲノム領域内、例えば、一つまたは複数の本明細書に説明されるＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドの配列内、およびゲノムの一つまたは複数のさらなる領域内に局所化された一つまたは複数の突然変異を有し得る。この実施形態によれば、突然変異型植物の残りのゲノム配列は、突然変異誘発前の植物と同一ではなくなるか、または実質的に同一ではなくなる。ある一定の実施形態で、突然変異体である植物は、本明細書で説明したＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドの一つまたは複数、二つ以上、三つ以上、四つ以上、もしくは五つ以上のエクソンでは一つまたは複数の突然変異を有しなくてもよく、または本明細書で説明したＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドの一つまたは複数、二つ以上、三つ以上、四つ以上、もしくは五つ以上のイントロンでは一つまたは複数の突然変異を有しなくてもよく、または本明細書で説明したＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドのプロモーターでは一つまたは複数の突然変異を有しなくてもよく、または本明細書で説明したＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドの３’非翻訳領域では一つまたは複数の突然変異を有しなくてもよく、または本明細書で説明したＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドの５’非翻訳領域では一つまたは複数の突然変異を有しなくてもよく、または本明細書で説明したＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドのコード領域では一つまたは複数の突然変異を有しなくてもよく、または本明細書で説明したＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドの非コード領域では一つまたは複数の突然変異を有しなくてもよく、またはその二つ以上、三つ以上、四つ以上、五つ以上、もしくは六つ以上のその部分の任意の組み合わせであってもよい。
さらなる態様では、本明細書に説明されるＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドをコードする遺伝子における突然変異を含む植物、植物細胞、または植物材料を特定する方法が提供され、方法は、（ａ）植物、植物細胞、または植物材料を突然変異誘発に供すること、（ｂ）該植物、植物細胞、もしくは植物材料、またはそれらの子孫から試料を得ること、および（ｃ）ＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳ遺伝子またはその変異体もしくは断片のポリヌクレオチド配列を決定することを含み、ここで、該配列の差異は、その中での一つまたは複数の突然変異を示す。この方法はまた、転写開始部位、開始コドン、イントロンの領域、エクソン－イントロンの境界、ターミネーター、または終止コドンなど、植物細胞におけるＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳ遺伝子の発現に影響を及ぼす、ゲノム領域において生じる突然変異を有する植物の選択を可能にする。
７．植物科、種、品種、種子、および組織培養
本開示での使用に適した植物には、単子葉植物および双子葉植物および植物細胞系が含まれ、ツバキ属、大麻属またはたばこ属のメンバーが含まれ得る。ツバキおよび大麻の好適な種には、Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ（茶）、Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ、Ｃａｎｎａｂｉｓ ｉｎｄｉｃａおよびＣａｎｎａｂｉｓ ｒｕｄｅｒａｌｉｓが含まれる。
様々な実施形態が、突然変異型たばこ、非天然型たばこまたはトランスジェニックたばこ植物またはたばこ植物細胞を対象とし、Ｎ．ｒｕｓｔｉｃａおよびＮ．ｔａｂａｃｕｍ（例えば、ＬＡ Ｂ２１、ＬＮ ＫＹ１７１、ＴＩ １４０６、Ｂａｓｍａ、Ｇａｌｐａｏ、Ｐｅｒｉｑｕｅ、Ｂｅｉｎｈａｒｔ １０００－１、およびＰｅｔｉｃｏ）を含む、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ属の任意の種に適用され得る。他の種には、Ｎ．ａｃａｕｌｉｓ、Ｎ．ａｃｕｍｉｎａｔａ、Ｎ．ａｆｒｉｃａｎａ、Ｎ．ａｌａｔａ、Ｎ．ａｍｅｇｈｉｎｏｉ、Ｎ．ａｍｐｌｅｘｉｃａｕｌｉｓ、Ｎ．ａｒｅｎｔｓｉｉ、Ｎ．ａｔｔｅｎｕａｔａ、Ｎ．ａｚａｍｂｕｊａｅ、Ｎ．ｂｅｎａｖｉｄｅｓｉｉ、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ、Ｎ．ｂｉｇｅｌｏｖｉｉ、Ｎ．ｂｏｎａｒｉｅｎｓｉｓ、Ｎ．ｃａｖｉｃｏｌａ、Ｎ．ｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉ、Ｎ．ｃｏｒｄｉｆｏｌｉａ、Ｎ．ｃｏｒｙｍｂｏｓａ、Ｎ．ｄｅｂｎｅｙｉ、Ｎ．ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ、Ｎ．ｆｏｒｇｅｔｉａｎａ、Ｎ．ｆｒａｇｒａｎｓ、Ｎ．ｇｌａｕｃａ、Ｎ．ｇｌｕｔｉｎｏｓａ、Ｎ．ｇｏｏｄｓｐｅｅｄｉｉ、Ｎ．ｇｏｓｓｅｉ、Ｎ．ｈｙｂｒｉｄ、Ｎ．ｉｎｇｕｌｂａ、Ｎ．ｋａｗａｋａｍｉｉ、Ｎ．ｋｎｉｇｈｔｉａｎａ、Ｎ．ｌａｎｇｓｄｏｒｆｆｉｉ、Ｎ．ｌｉｎｅａｒｉｓ、Ｎ．ｌｏｎｇｉｆｌｏｒａ、Ｎ．ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｎ．ｍｅｇａｌｏｓｉｐｈｏｎ、Ｎ．ｍｉｅｒｓｉｉ、Ｎ．ｎｏｃｔｉｆｌｏｒａ、Ｎ．ｎｕｄｉｃａｕｌｉｓ、Ｎ．ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａ、Ｎ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｎ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｈｅｓｐｅｒｉｓ、Ｎ．ｏｔｏｐｈｏｒａ、Ｎ．ｐａｎｉｃｕｌａｔａ、Ｎ．ｐａｕｃｉｆｌｏｒａ、Ｎ．ｐｅｔｕｎｉｏｉｄｅｓ、Ｎ．ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ、Ｎ．ｑｕａｄｒｉｖａｌｖｉｓ、Ｎ．ｒａｉｍｏｎｄｉｉ、Ｎ．ｒｅｐａｎｄａ、Ｎ．ｒｏｓｕｌａｔａ、Ｎ．ｒｏｓｕｌａｔａ ｓｕｂｓｐ．ｉｎｇｕｌｂａ、Ｎ．ｒｏｔｕｎｄｉｆｏｌｉａ、Ｎ．ｓｅｔｃｈｅｌｌｉｉ、Ｎ．ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｎ．ｓｏｌａｎｉｆｏｌｉａ、Ｎ．ｓｐｅｇａｚｚｉｎｉｉ、Ｎ．ｓｔｏｃｋｔｏｎｉｉ、Ｎ．ｓｕａｖｅｏｌｅｎｓ、Ｎ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｎ．ｔｈｙｒｓｉｆｌｏｒａ、Ｎ．ｔｏｍｅｎｔｏｓａ、Ｎ．ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ、Ｎ．ｔｒｉｇｏｎｏｐｈｙｌｌａ、Ｎ．ｕｍｂｒａｔｉｃａ、Ｎ．ｕｎｄｕｌａｔａ、Ｎ．ｖｅｌｕｔｉｎａ、Ｎ．ｗｉｇａｎｄｉｏｉｄｅｓ、およびＮ．ｘ ｓａｎｄｅｒａｅが挙げられる。一実施形態では、植物は、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍである。
たばこ栽培品種および優良たばこ栽培品種の使用も、本明細書で意図されている。したがって、トランスジェニック、非天然型、または突然変異型植物は、一つまたは複数の導入遺伝子、または一つまたは複数の遺伝子突然変異、またはそれらの組み合わせを含む、たばこ品種または優良たばこ栽培品種であり得る。遺伝子突然変異（例えば、一つまたは複数の多型）は、個々のたばこ品種またはたばこ栽培品種（例えば、優良たばこ栽培品種）において天然には存在しない突然変異であり得るか、または突然変異が個々のたばこ品種またはたばこ栽培品種（例えば、優良たばこ栽培品種）において天然に発生しない場合には、天然に発生する遺伝子突然変異であり得る。
特に有用なＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ品種には、バーレー種、ダーク種、熱風乾燥処理種、およびオリエント種のたばこが含まれる。品種または栽培品種の非限定的な例は、ＢＤ６４、ＣＣ１０１、ＣＣ２００、ＣＣ２７、ＣＣ３０１、ＣＣ４００、ＣＣ５００、ＣＣ６００、ＣＣ７００、ＣＣ８００、ＣＣ９００、コーカー（Ｃｏｋｅｒ）１７６、コーカー３１９、コーカー３７１ゴールド、コーカー４８、ＣＤ２６３、ＤＦ９１１、ＤＴ ５３８ ＬＣ ガルパオ（Ｇａｌｐａｏ）たばこ、ＧＬ ２６Ｈ、ＧＬ ３５０、ＧＬ ６００、ＧＬ ７３７、ＧＬ ９３９、ＧＬ ９７３、ＨＢ ０４Ｐ、ＨＢ ０４Ｐ ＬＣ、ＨＢ３３０７ＰＬＣ、ハイブリッド４０３ＬＣ、ハイブリッド４０４ＬＣ、ハイブリッド５０１ ＬＣ、Ｋ１４９、Ｋ３２６、Ｋ３４６、Ｋ ３５８、Ｋ３９４、Ｋ３９９、Ｋ７３０、ＫＤＨ ９５９、ＫＴ２００、ＫＴ２０４ＬＣ、ＫＹ１０、ＫＹ１４、ＫＹ １６０、ＫＹ １７、ＫＹ １７１、ＫＹ ９０７、ＫＹ９０７ＬＣ、ＫＹ１４ｘＬ８ ＬＣ、リトルクリッテンデン（Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｒｉｔｔｅｎｄｅｎ）、マクネア（ＭｃＮａｉｒ）３７３、マクネア９４４、ｍｓＫＹ １４ｘＬ８、ナローリーフマドール（Ｎａｒｒｏｗ Ｌｅａｆ Ｍａｄｏｌｅ）、ナローリーフマドールＬＣ、ＮＢＨ ９８、Ｎ－１２６、Ｎ－７７７ＬＣ、Ｎ－７３７１ＬＣ、ＮＣ １００、ＮＣ １０２、ＮＣ ２０００、ＮＣ ２９１、ＮＣ ２９７、ＮＣ ２９９、ＮＣ ３、ＮＣ ４、ＮＣ ５、ＮＣ ６、ＮＣ７、ＮＣ ６０６、ＮＣ ７１、ＮＣ ７２、ＮＣ ８１０、ＮＣ ＢＨ １２９、ＮＣ ２００２、ニールスミスマドール（Ｎｅａｌ Ｓｍｉｔｈ Ｍａｄｏｌｅ）、オックスフォード ２０７、ＰＤ ７３０２ ＬＣ、ＰＤ ７３０９ ＬＣ、ＰＤ ７３１２ ＬＣ、「ペリケ」（Ｐｅｒｉｑｕｅ）たばこ、ＰＶＨ０３、ＰＶＨ０９、ＰＶＨ１９、ＰＶＨ５０、ＰＶＨ５１、Ｒ ６１０、Ｒ ６３０、Ｒ ７－１１、Ｒ ７－１２、ＲＧ １７、ＲＧ ８１、ＲＧ Ｈ５１、ＲＧＨ ４、ＲＧＨ ５１、ＲＳ １４１０、スペイト（Ｓｐｅｉｇｈｔ）１６８、スペイト１７２、スペイト１７９、スペイト２１０、スペイト２２０、スペイト２２５、スペイト２２７、スペイト２３４、スペイトＧ－２８、スペイトＧ－７０、スペイトＨ－６、スペイトＨ２０、スペイトＮＦ３、ＴＩ １４０６、ＴＩ １２６９、ＴＮ ８６、ＴＮ８６ＬＣ、ＴＮ ９０、ＴＮ ９７、ＴＮ９７ＬＣ、ＴＮ Ｄ９４、ＴＮ Ｄ９５０、ＴＲ（トムロッソン（Ｔｏｍ Ｒｏｓｓｏｎ））マドール、ＶＡ ３０９、ＶＡ３５９、ＡＡ ３７－１、Ｂ１３Ｐ、 キサンティ（Ｘａｎｔｈｉ）（ミッチェル－モル（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ－Ｍｏｒ））、Ｂｅｌ－Ｗ３、７９－６１５、サムスンホームズ（Ｓａｍｓｕｎ Ｈｏｌｍｅｓ）ＮＮ、ＫＴＲＤＣナンバー２ハイブリッド４９、バーリー（Ｂｕｒｌｅｙ）２１、ＫＹ８９５９、ＫＹ９、ＭＤ６０９、ＰＧ０１、ＰＧ０４、ＰＯ１、ＰＯ２、ＰＯ３、ＲＧ１１、ＲＧ ８、ＶＡ５０９、ＡＳ４４、バンケット（Ｂａｎｋｅｔ）Ａ１、バスマドラマ（Ｂａｓｍａ Ｄｒａｍａ）Ｂ８４／３１、バスマＩジクナ（Ｚｉｃｈｎａ）ＺＰ４／Ｂ、バスマキサンティ（Ｂａｓｍａ Ｘａｎｔｈｉ）ＢＸ ２Ａ、バテック（Ｂａｔｅｋ）、べスキジェンバー（Ｂｅｓｕｋｉ Ｊｅｍｂｅｒ） Ｃ１０４、コーカー３４７、クリオロミシオネロ（Ｃｒｉｏｌｌｏ Ｍｉｓｉｏｎｅｒｏ）、デルクレスト（Ｄｅｌｃｒｅｓｔ）、ジェベル（Ｄｊｅｂｅｌ）８１、ＤＶＨ ４０５、ガルパオコマム（Ｇａｌｐａｏ Ｃｏｍｕｍ）、ＨＢ０４Ｐ、ヒックスブロードリーフ（Ｈｉｃｋｓ Ｂｒｏａｄｌｅａｆ）、カバクラックエラソーナ（Ｋａｂａｋｕｌａｋ Ｅｌａｓｓｏｎａ）、カットセージ（Ｋｕｔｓａｇｅ）Ｅ１、ＬＡ ＢＵ ２１、ＮＣ ２３２６、ＮＣ ２９７、ＰＶＨ ２１１０、レッドロシアン（Ｒｅｄ Ｒｕｓｓｉａｎ）、サムスン（Ｓａｍｓｕｎ）、サプラック（Ｓａｐｌａｋ）、シンマバ（Ｓｉｍｍａｂａ）、タルガー（Ｔａｌｇａｒ）２８、ウィスリカ（Ｗｉｓｌｉｃａ）、ヤヤルダグ（Ｙａｙａｌｄａｇ）、プリレプ（Ｐｒｉｌｅｐ）ＨＣ－７２、プリレプＰ２３、プリレプＰＢ １５６／１、プリレプＰ１２－２／１、ヤカ（Ｙａｋａ）ＪＫ－４８、ヤカＪＢ １２５／３、ＴＩ－１０６８、ＫＤＨ－９６０、ＴＩ－１０７０、ＴＷ１３６、バスマ（Ｂａｓｍａ）、ＴＫＦ ４０２８、Ｌ８、ＴＫＦ ２００２、ＧＲ１４１、バスマキサンティ、ＧＲ１４９、ＧＲ１５３、プティハバナ（Ｐｅｔｉｔ Ｈａｖａｎａ）である。本明細書で具体的に識別されていない場合であっても、上記の低コンバーター亜種も意図されている。
実施形態は、本明細書で説明した一つまたは複数のＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチド（または本明細書で説明した通りその任意の組み合わせ）の発現または機能を調節するために修飾された、突然変異体である植物、非天然の植物、混成体である植物、またはトランスジェニック植物を生成するための組成物および方法も対象とする。有利なことに、得られた突然変異型植物、非天然型植物、ハイブリッド植物、またはトランスジェニック植物は、全体的な外観において対照植物と類似しているか、または実質的に同一であり得る。成熟度、植物当たりの葉の数、茎の高さ、葉の挿入角度、葉のサイズ（幅および長さ）、節間の距離、および葉身と中央脈の比率など、様々な表現型特性を圃場観察によって評価することができる。
一態様は、本明細書に説明される突然変異型植物、非天然型植物、ハイブリッド植物、またはトランスジェニック植物の種子に関する。好ましくは、種子はたばこ種子である。さらなる態様は、本明細書に説明される突然変異型植物、非天然型植物、ハイブリッド植物、またはトランスジェニック植物の花粉または胚珠に関する。さらに、雄性不稔性を付与するポリヌクレオチドをさらに含む、本明細書に説明される突然変異型植物、非天然型植物、ハイブリッド植物、またはトランスジェニック植物が提供される。
また、本明細書に説明される突然変異型植物、非天然型植物、ハイブリッド植物、もしくはトランスジェニック植物、またはそれらの部分の再生可能な細胞の組織培養も提供され、培養によって、親の形態学的特性および生理学的特性をすべて発現する能力を持つ植物が再生される。再生可能な細胞には、葉、花粉、胚、子葉、胚軸、根、根端、葯、花およびその部分、胚珠、苗条、幹、茎、随およびカプセルに由来する細胞、またはカルスまたはそれに由来する原形質体が含まれる。
本明細書に説明される植物材料は、乾燥処理されたたばこ材料（例えば、バージニアタイプまたはオリエンタルタイプの乾燥処理されたたばこ材料）であり得る。乾燥処理されたたばこ材料は、熱風乾燥または日光乾燥または空気乾燥されたたばこ材料であり得る。
たばこ乾燥処理に関するＣＯＲＥＳＴＡの推奨は、ＣＯＲＥＳＴＡ Ｇｕｉｄｅ Ｎ°１７，Ａｐｒｉｌ ２０１６，Ｓｕｓｔａｉｎａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｌｅａｆ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎに記載されている。
８．糖含量の調節
本開示の突然変異型、トランスジェニック、または非天然型植物またはその部分は、植物材料内（例えば、乾燥葉中）のグルコースまたはフルクトースまたはそれらの組み合わせなどの少なくとも一つの還元糖の調節されたレベルを示す。特定の実施形態では、グルコースまたはフルクトースまたはそれらの組み合わせのレベルが減少すると、スクロースのレベルが増加する場合がある。
好適には、少なくとも一つの還元糖の調節されたレベルは、少なくとも乾燥葉、好適には、完全に乾燥葉で観察される。好適には、乾燥葉は、植物の中間位置の葉から採取される。好適には、対照植物と比較して、視覚的な植物の適合性などは、表現型では存在しないか、または無視できる程度である。好適には、対照植物と比較して、総遊離アミノ酸の変動はないか、無視できる程度である。特定の実施形態では、乾燥葉またはそこから誘導された生成物を加熱することによって得られた煙中のアクリルアミドレベルは調節され得る。
さらなる態様は、該ＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリペプチドの発現または機能が調節されていない対照植物と比較して、その中の少なくとも一つの還元糖のレベルが少なくとも５％低下した、本明細書に記載される突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物もしくは細胞に関する。
特定の実施形態では、グルコースもしくはフルクトースのレベル、またはそれらの組み合わせは、対照植物と比較して、約３０％以上、例えば、約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、またはそれ以上低減される。
特定の実施形態では、グルコースもしくはフルクトースのレベル、またはそれらの組み合わせは、対照植物と比較して、約４０％以上、例えば、約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、またはそれ以上低減される。
特定の実施形態では、グルコースのレベルは、対照植物と比較して、少なくとも６０％以上または少なくとも６３％以上減少し、フルクトースのレベルは、少なくとも約４０％以上または少なくとも６３％以上減少する。
特定の実施形態では、グルコースのレベルは、対照植物と比較して、少なくとも６０％以上または少なくとも６３％以上減少し、フルクトースのレベルは、少なくとも約４０％以上または少なくとも６３％以上減少し、スクロースのレベルは、少なくとも２倍、少なくとも３倍、または少なくとも４倍増加する。
特定の実施形態では、グルコースおよびフルクトースのレベルは、対照植物と比較して増加する。
特定の実施形態では、対照植物と比較して、グルコースのレベルは増加し、フルクトースのレベルは増加し、スクロースのレベルは減少する。
増加は、対照植物と比較して、約２５％、５０％、１００％、２５０％、または５００％以上の増加とすることができる。減少は、対照植物と比較して、約２５％、５０％、または７５％以上の減少とすることができる。
なおさらなる態様は、突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物または細胞から誘導されるかまたは誘導可能な乾燥処理済み植物材料（乾燥葉または乾燥たばこなど）に関連し、ここで、一つまたは複数の本明細書で説明したＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドの発現またはそれによりコードされるＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリペプチドの機能は調節され、グルコース、フルクトースおよび任意にスクロースのレベルは、対照植物と比較して上述したように調節される。
実施形態は、一つまたは複数の本明細書に説明されるＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドまたはＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリペプチドの発現または機能を調節するために改変されている突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物または植物細胞を生成するための組成物および方法も対象とし、これは、調節されたグルコース、フルクトースおよび任意にスクロース含有量を有する植物または植物構成要素（例えば、乾燥葉などの葉）または植物細胞をもたらすことができる。
一実施形態では、突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物の表現型は、対照植物と実質的に同一である。一実施形態では、突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物の葉の重量は、対照植物と実質的に同一である。一実施形態では、突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物の葉の数は、対照植物と実質的に同一である。一実施形態では、突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物の葉の重量および葉の数は、対照植物と実質的に同一である。一実施形態では、突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物の茎の高さは、例えば、圃場移植後１か月、２か月、もしくは３か月以上、または最高の高さまで伸びた後１０日、２０日、３０日、もしくは３６日以上が経過した時点で、対照植物と実質的に同一である。例えば、突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物の茎の高さは、対照植物の茎の高さよりも低くない。別の実施形態では、突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物のクロロフィル含有量は、対照植物と実質的に同一である。別の実施形態では、突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物の茎の高さは、対照植物と実質的に同一であり、突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物のクロロフィル含有量は、対照植物と実質的に同一である。他の実施形態では、突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物の葉のサイズまたは形態または数または彩色は、対照植物と実質的に同一である。
別の態様では、植物の少なくとも一部（例えば、葉（乾燥葉など）またはたばこ）における少なくとも一つの還元糖の量を調節するための方法が提供されており、（ｉ）本明細書に記載されるＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリペプチドのうちの一つまたは複数（または本明細書に記載されるようなそれらの任意の組み合わせ）の発現または機能を調節する工程であって、好適には、ＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリペプチドが、対応する本明細書に記載されるＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドによってコードされる、工程と、（ｉｉ）工程（ｉ）で得られる突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物の少なくとも一部（例えば、葉（乾燥葉など）またはたばこもしくは煙）における少なくとも一つの還元糖（例えば、グルコースまたはフルクトース）および任意にスクロースなどの少なくとも一つの非還元糖のレベルを測定する工程と、（ｉｉｉ）その中の少なくとも一つの還元糖および任意に、少なくとも一つの非還元糖のレベルが対照植物と比較して調節された突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物のレベルを特定する工程とを含む。
別の態様では、乾燥処理済みの材料の少なくとも一部（乾燥葉など）における少なくとも一つの還元糖の量を調節するための方法が提供されており、（ｉ）ＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリペプチドのうちの一つまたは複数（または本明細書に記載されるようなそれらの任意の組み合わせ）の発現または機能を調節する工程であって、好適には、ＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリペプチドが、対応する本明細書に記載されるＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドによってコードされる、工程と、（ｉｉ）植物材料（葉のうちの一つまたは複数など）を収穫し、ある期間にわたって乾燥処理する工程と、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られる、または工程（ｉｉ）中の乾燥処理済みの植物材料の少なくとも一部における少なくとも一つの還元糖（例えば、グルコースおよびフルクトース）および任意にスクロースなどの少なくとも一つの非還元糖のレベルを測定する工程と、（ｉｖ）その中の少なくとも一つの還元糖および任意に少なくとも一つの非還元糖のレベルが対照植物と比較して調節された、乾燥処理済みの植物材料を特定する工程とを含む。
対照と比較した発現の増加は、約５％～約１００％、または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは１００％以上（２００％、３００％、５００％、１０００％以上など）の増加であり得、これには、転写機能、またはＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチド発現もしくはＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリペプチド発現、またはそれらの組み合わせが含まれる。
対照と比較した機能または活性の増加は、約５％～約１００％、または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは１００％以上（２００％、３００％、５００％、１０００％以上など）の増加であり得、これには、転写機能、またはＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチド発現もしくはＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリペプチド発現、またはそれらの組み合わせが含まれる。
対照と比較した発現の減少は、約５％～約１００％、または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％の減少であり得、これには、転写機能、またはＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチド発現もしくはＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリペプチド発現、またはそれらの組み合わせが含まれる。
対照と比較した機能または活性の減少は、約５％～約１００％、または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％の減少であり得、これには、転写機能、またはＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチド発現もしくはＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリペプチド発現、またはそれらの組み合わせが含まれる。
本明細書に説明されるポリヌクレオチドおよび組み換え体構築物を使用して、対象の植物種、好適にはたばこにおける、本明細書に説明されるＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドまたはＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリペプチドの発現または機能または活性を調節することができる。
数多くのポリヌクレオチドをベースにした方法を使用して、植物および植物細胞において遺伝子発現を増加させることできる。一例として、形質転換される植物との適合性のある構築物、ベクター、または発現ベクターを調製することができ、これは、植物または植物細胞において遺伝子を過剰発現する能力のある上流プロモーターと一緒に、関心の遺伝子を含む。例示的なプロモーターが本明細書に説明される。形質転換の後、および好適な条件下で栽培されたとき、プロモーターは、植物、またはその特定の組織においてＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳのレベルを調節するために、発現を駆動することができる。模範的な一つの実施形態で、一つまたは複数の本明細書で説明したＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチド（または本明細書で説明した通りその任意の組み合わせ）を持つベクターは、植物または植物細胞内で遺伝子を過剰発現するために生成される。ベクターは、植物のすべての組織でその構成的発現を駆動する導入遺伝子の上流に、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターなどの好適なプロモーターを保有する。ベクターはまた、形質転換されたカルスおよび細胞株の選択を与えるために、抗生物質耐性遺伝子を保有する。
プロモーターからの配列の発現は、当技術分野で周知である発現制御配列を含むことによって強化することができる。老化に関連するシグナルおよび乾燥処理中に活性であるシグナルが、特異的に示される。
したがって、様々な実施形態は、一つまたは複数の本明細書で説明したＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチド（または本明細書で説明した通りその任意の組み合わせ）の発現レベルを、ＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドの複数のコピーを植物ゲノムに組み入れることにより調節するための方法を対象とし、これは、本明細書で説明した一つまたは複数のＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドに作用可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクターを用いて植物細胞宿主を形質転換することを含む。組み換えポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドは、天然ポリペプチドであり得るか、または細胞に対して異種であり得る。
一実施形態では、本開示での使用のための植物は、そのような植物が高い還元糖含有量（圃場栽培された場合、乾燥処理の終了時に乾燥質量が約１４％を超える）を有する植物であるように熱風乾燥処理された植物である。熱風乾燥処理された突然変異型、トランスジェニック、または非天然型の植物またはその部分は、圃場栽培された場合、乾燥処理の終了時に約１４％未満の乾燥質量、例えば、圃場栽培された場合、乾燥処理の終了時に約１０％未満の乾燥質量、または圃場栽培された場合、乾燥処理の終了時に約５％未満の乾燥質量、または圃場栽培された場合、乾燥処理の終了時に約１％未満の乾燥質量である、還元糖含有量を有することができる。
一実施形態では、本開示での使用の植物は、そのような植物が（圃場栽培された場合、乾燥処理の終了時に乾燥質量が約６．８％を超える）還元糖含有量を有するように日光乾燥処理された植物である。日光乾燥処理された突然変異型、トランスジェニック、または非天然型の植物またはその部分は、圃場栽培された場合、乾燥処理の終了時に約５％未満の乾燥質量、例えば、圃場栽培された場合、乾燥処理の終了時に約２．５％未満の乾燥質量、または圃場栽培された場合、乾燥処理の終了時に約１％未満の乾燥質量である、還元糖含有量を有することができる。
一実施形態では、本開示での使用の植物は、空気乾燥処理された植物である。そのような植物は、圃場栽培された場合、乾燥処理の終了時に約１．７％の乾燥質量を超える還元糖含有量を有する。日光乾燥処理された突然変異型、トランスジェニック、または非天然型の植物またはその部分は、圃場栽培された場合、乾燥処理の終了時に約１．５％未満の乾燥質量、例えば、圃場栽培された場合、乾燥処理の終了時に約１％未満の乾燥質量、または圃場栽培された場合、乾燥処理の終了時に約０．５％未満の乾燥質量である、還元糖含有量を有することができる。
特定の実施形態では、熱風乾燥処理または日光乾燥処理された植物の使用が好ましい。
９．育種
本明細書で説明した一つまたは複数のＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチド（または本明細書で説明した通りのその任意の組み合わせ）の突然変異体対立遺伝子を持つ植物は、有用な系統、品種、および混成体を生成するための植物育種プログラムで使用できる。特に、突然変異体対立遺伝子は、上述した商業的に重要な品種に遺伝子移入され得る。したがって、本明細書に説明される突然変異型植物、非天然型植物またはトランスジェニック植物を異なる遺伝的同一性を含む植物と交雑することを含む、植物の育種方法が提供される。本方法は、子孫植物を別の植物と交雑すること、および任意で遺伝的形質または遺伝的背景を有する子孫が得られるまで交雑を繰り返すことをさらに含み得る。こうした育種方法が果たしている一つの目的は、望ましい遺伝的特性を他の品種、育種系統、混成体、または栽培品種、特に商業的利害のあるものに導入することである。別の目的は、単一植物品種、系統、混成体、または栽培品種における異なる遺伝子の遺伝的改変のスタッキングを容易にすることである。種内ならびに種間の交配が企図される。このような交雑から発生した子孫植物は、育種系統とも称され、本開示の非天然型植物の例である。
一実施形態では、（ａ）突然変異型またはトランスジェニック植物を第二の植物と交雑して、子孫たばこ種子を得ること、（ｂ）植物栽培条件下で子孫たばこ種子を栽培して、非天然型植物を得ること、を含む非天然型植物を生産するための方法が提供される。方法は、（ｃ）前世代の非天然型植物をそれ自体または別の植物と交雑して、子孫たばこ種子を得ることと、（ｄ）工程（ｃ）の子孫たばこ種子を植物栽培条件下で栽培して、さらなる非天然型植物を得ることと、（ｅ）（ｃ）および（ｄ）の交雑および栽培工程を複数回繰り返して、非天然型植物のさらなる世代を生成することと、をさらに含み得る。本方法は、工程（ａ）の前に、特徴付けされた遺伝的同一性を含み、かつ突然変異型またはトランスジェニック植物と同一ではない親株を提供する工程を任意に含み得る。いくつかの実施形態では、育種プログラムに応じて、交雑および栽培工程は、非天然型植物の世代を生成するために、０～２回、０～３回、０～４回、０～５回、０～６回、０～７回、０～８回、０～９回、または０～１０回繰り返される。戻し交雑は、親の一つに近い遺伝的同一性を有する次世代の子孫植物を得るために、子孫がその親の一つまたはその親と遺伝的に類似する別の植物と交雑される、そのような方法の例である。植物育種、特に植物育種の技法は周知であり、本開示の方法において使用することができる。本開示は、これらの方法によって生成された非天然型植物をさらに提供する。特定の実施形態では、植物を選択する工程は除外される。
本明細書に説明される方法のいくつかの実施形態では、変異遺伝子の育種およびスクリーニングから得られる系統は、標準的な圃場手順を使用して圃場で評価される。最初の突然変異誘発されていない親を含む対照遺伝子型が含まれ、エントリーは無作為化完全ブロック設計または他の適切な圃場設計で圃場に配列される。たばこについては、標準的な農耕法が使用され、例えば、たばこは、収穫され、秤量され、乾燥処理の前および乾燥処理中に化学的および他の一般的な試験のために試料抽出される。データの統計分析が実行され、選択した系統の親系統に対する類似性が確認される。選択された植物の細胞遺伝学的分析は、染色体補体および染色体の対合関係を確認するために任意で実行される。
ＤＮＡフィンガープリンティング、一塩基多型、マイクロサテライトマーカー、または同様の技術をマーカー支援選択（ＭＡＳ）育種プログラムで使用して、本明細書に説明した通り、遺伝子の突然変異対立遺伝子を他のたばこに移入または育種し得る。例えば、育種家は、農業的に望ましい遺伝子型を有する突然変異対立遺伝子を含有する遺伝子型をハイブリッド形成したものから、分離集団を作製できる。Ｆ２または戻し交雑世代の植物は、本明細書に列挙される技法のうちの一つを使用して、ゲノム配列またはその断片から開発されたマーカーを使用してスクリーニングすることができる。突然変異対立遺伝子を有すると識別された植物を戻し交雑または自家受粉して、スクリーニングされる第二の集団を作製することができる。予測される継承パターンまたは使用されるＭＡＳ技術に応じて、戻し交雑の各サイクルの前に、選択した植物を自家受粉させて、所望される個々の植物の識別を助ける必要があり得る。戻し交雑または他の育種手順は、反復親の所望の表現型が回復されるまで繰り返すことができる。
本開示によれば、育種プログラムにおいて、成功した交雑種は、稔性であるＦ１植物を産み出す。選択されたＦ１植物は親の一つと交雑することができ、戻し交雑の第一世代の植物は自家受粉して、変異体遺伝子発現（例えば、ヌルバージョンの遺伝子）について再度スクリーニングされる集団を生成する。戻し交雑、自家受粉、およびスクリーニングのプロセスは、例えば、最終的なスクリーニングによって稔性であり、かつ反復親と合理的に類似した植物が生成されるまで少なくとも４回繰り返される。所望する場合、この植物を自家受粉し、その後子孫を再度スクリーニングして、植物が変異体遺伝子発現を示すことを確認する。いくつかの実施形態では、Ｆ２世代の植物集団は、変異体遺伝子発現についてスクリーニングされ、例えば、標準的な方法に従って、例えば本明細書に説明されるポリヌクレオチド（または本明細書に説明されるそれらの任意の組み合わせ）のポリヌクレオチド配列情報に基づくプライマーを用いたＰＣＲ法を使用することにより、遺伝子の欠損のためにポリペプチドを発現しない植物が特定される。
ハイブリッドたばこ品種は、第一の品種の雌性の親株（すなわち、種子親）の自家受粉を防止し、第二の品種の雄性の親株からの花粉が雌性の親株と受粉できるようにし、Ｆ１ハイブリッド種子が雌性の植物において形成されるようにすることで生成できる。雌性の植物の自家受粉は、花の発生の初期段階で花の雄しべを除去することで防止できる。あるいは、花粉形成は、雄性不稔の形成を使用して、雌性の親株で防止することができる。例えば、雄性不稔は、細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）またはトランスジェニック雄性不稔により生成でき、導入遺伝子が小胞子生成または花粉形成、または自家不適合性を阻害する。ＣＭＳを含む雌性の親株は、特に有用である。雌性の親株がＣＭＳである実施形態では、花粉が雄性の稔性植物から収穫され、手作業でＣＭＳ雌性の親株の柱頭に適用され、得られたＦ１種子が収穫される。
本明細書に説明される品種および系統を使用して、単一交雑たばこＦ１ハイブリッドを形成することができる。そのような実施形態では、親品種の植物は、実質的に均質な隣接した集団として栽培して、雄性の親株から雌性の親株への自然な他家受粉を促進することができる。雌性の親株において形成されたＦ１種子は、従来的な手段によって選択的に収穫される。また、二つの親株品種を大量に栽培して、雌性の親において形成されたＦ１ハイブリッド種子と、自家受粉の結果として雄性の親において形成された種子との混合体を収穫することもできる。あるいは、三系交雑を行うことができ、ここでは単一交雑Ｆ１ハイブリッドが雌性の親として使用され、異なる雄性の親と交雑される。別の代替法として、二重交雑ハイブリッドを作製でき、ここでは異なる二つの単一交雑のＦ１子孫がそれら自体の間で交雑される。
突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物の集団は、所望の特性または表現型を有する集団のメンバーについてスクリーニングまたは選択することができる。例えば、単一形質転換事象の子孫の集団は、それによってコードされるポリペプチドの所望のレベルの発現または機能を有する植物についてスクリーニングすることができる。物理的および生化学的方法を使用して、発現または活性レベルを特定することができる。これらには、ポリヌクレオチドの検出のためのサザン分析またはＰＣＲ増幅；ＲＮＡ転写物を検出するためのノーザンブロット、Ｓ１ ＲＮａｓｅ保護、プライマー延長、またはＲＴ－ＰＣＲ増幅；ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの酵素またはリボザイム活性を検出するための酵素学的アッセイ；ならびにポリペプチドを検出するためのポリペプチドゲル電気泳動、ウエスタンブロット、免疫沈降、および酵素免疫測定法が含まれる。原位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリッド形成、酵素染色、および免疫染色および酵素アッセイなど、その他の技術も、ＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリペプチドまたはポリヌクレオチドの存在または発現、機能または活性を検出するために使用できる。
一つまたは複数の組み換えポリヌクレオチド、一つまたは複数のポリヌクレオチド構築物、一つまたは複数の二本鎖ＲＮＡ、一つまたは複数の共役体、または一つまたは複数のベクター／発現ベクターを含む、突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物細胞および植物が本明細書で説明される。
１０．他の遺伝子の修飾
限定されないが、本明細書に記載される植物およびその部分は、本開示による一つまたは複数のＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドまたはＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリペプチドの発現、機能または活性が調節される前または後のいずれかに修飾され得る。
以下の一つまたは複数の遺伝的修飾が、突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物において存在し得る。
窒素性代謝性の中間体の変換に関与する一つまたは複数の遺伝子が修飾され、より低いレベルの少なくとも一つのたばこ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）をもたらすことができる。そのような遺伝子の非限定的な例としては、ＷＯ２００６／０９１１９４、ＷＯ２００８／０７０２７４、ＷＯ２００９／０６４７７１、およびＷＯ２０１１／０８８１８０に記載されるようなＣＹＰ８２Ｅ４、ＣＹＰ８２Ｅ５、およびＣＹＰ８２Ｅ１０などのニコチンデメチラーゼ、ならびにＷＯ２０１６／０４６２８８に記載されるような硝酸レダクターゼをコードするものが挙げられる。
重金属の取り込みまたは重金属輸送に関与する一つまたは複数の遺伝子が修飾され、より低い重金属含有量をもたらすことができる。非限定的な例には、多剤耐性に関連するポリペプチドファミリー、陽イオン拡散促進物質（ＣＤＦ）ファミリー、Ｚｒｔ－Ｉｒｔ様ポリペプチド（ＺＩＰ）ファミリー、陽イオン交換体（ＣＡＸ）ファミリー、銅輸送体（ＣＯＰＴ）ファミリー、重金属ＡＴＰａｓｅｓファミリー（例えば、ＷＯ２００９／０７４３２５およびＷＯ２０１７／１２９７３９に記載されるＨＭＡ）、自然耐性に関連するマクロファージポリペプチド（例えば、ＮＲＡＭＰ）の相同体ファミリー、およびカドミウムなどの重金属の輸送に関与する、ＷＯ２０１２／０２８３０９に記載されるようなＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体ファミリー（例えば、ＭＲＰ）の他のメンバーに属する遺伝子が含まれる。
他の例示的な改変は、有益なプロファイルを変更するために使用することができるスクロースエステル組成物における変化をもたらす、イソプロピルリンゴ酸合成酵素の調節された発現または機能を有する植物をもたらすことができる（ＷＯ２０１３／０２９７９９を参照）。
他の例示的な修飾により、メチオンレベルが調節され得る、トレオニン合成酵素の発現または機能が調節された植物をもたらすことができる（ＷＯ２０１３／０２９８００を参照）。
他の例示的な修飾により、ベータ－ダマセノン含有量を調節して、風味プロファイルを変化させるために、ネオキサンチン合成酵素、リコペンベータシクラーゼ、および９－シス－エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼのうちの一つまたは複数の発現または機能が調節された植物をもたらすことができる（ＷＯ２０１３／０６４４９９を参照）。
他の例示的な修飾により、その中の硝酸塩レベルを調節するために、クロライドチャネルのＣＬＣファミリーのメンバーの発現または機能が調節された植物をもたらすことができる（ＷＯ２０１４／０９６２８３およびＷＯ２０１５／１９７７２７を参照）。
他の例示的な修飾により、葉中のアスパラギンのレベルを調節するために一つまたは複数のアスパラギンシンテターゼの発現または機能が調節され、かつ葉の加熱または燃焼時に生成されるエアロゾル中のアクリルアミドのレベルが調節された植物をもたらすことができる（ＷＯ２０１７／１２９７３９を参照）。
他の例示的な修飾は、乾燥処理中に調節されたプロテアーゼ活性を有する植物をもたらし得る（ＷＯ２０１６／００９００６を参照）。
他の例示的な修飾は、硝酸レダクターゼ（例えば、Ｎｉａ２）の遺伝子発現、またはそれによってコードされるタンパク質の活性を変更することによって、硝酸レベルが低下した植物をもたらし得る（ＷＯ２０１６／０４６２８８を参照）。
他の例示的な修飾は、推定上のＡＢＣ－２トランスポーターＮｔＡＢＣＧｌ－ＴおよびＮｔＡＢＣＧｌ－Ｓの遺伝子発現、またはそれによってコードされるタンパク質の活性を変更することによって、改変されたアルカロイドレベルを有する植物をもたらし得る（ＷＯ２０１９／０８６６０９を参照）
他の例示的な修飾は、末端花１（ＴＦＬ１）をコードする遺伝子の遺伝子発現、またはそれによってコードされるタンパク質の活性を変更することによって開花までの時間を調節する植物をもたらし得る（ＷＯ２０１８／１１４６４１を参照）。他の例示的な修飾は、葉中のアスパラギンのレベルを調節するために一つまたは複数のアスパラギン合成酵素の調節された発現または機能を有する植物、および葉を加熱または燃焼する際に生成されるエアロゾル中のアクリルアミドのレベルを調節する植物をもたらし得る（ＷＯ２０１７／０４２１６２を参照）。
他の修飾の例には除草剤耐性が含まれ、例えば、グリホサートは、多数の広範囲な除草剤の有効成分である。グリホサート耐性トランスジェニック植物は、ａｒｏＡ遺伝子（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍおよびＥ．ｃｏｌｉに由来するグリホサートＥＰＳＰ合成酵素）の導入により開発されている。スルホニル尿素耐性植物は、シロイヌナズナに由来する突然変異ＡＬＳ（アセト乳酸合成酵素）遺伝子の形質転換により生成されている。突然変異Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｈｙｂｒｉｄｕｓに由来する光化学系ＩＩ型のＯＢポリペプチドを植物に導入して、アトラジン耐性トランスジェニック植物が生成されており、ブロモキシニル耐性トランスジェニック植物は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細菌に由来するｂｘｎ遺伝子を組み込むことによって生成されている。
別の例示的な修飾は、昆虫に対して耐性のある植物をもたらす。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂｔ）毒素は、最近ブロッコリにおいて例証されたように、Ｂｔ耐性害虫の発生を遅らせる効果的な方法を提供することができ、錐体のｃｒｙ１Ａｃおよびｃｒｙ１ＣＢｔ遺伝子は、いずれかの単一ポリペプチドに対して耐性のあるコナガ（ｄｉａｍｏｎｄｂａｃｋ ｍｏｔｈ）を駆除し、かつ耐性昆虫の進化を有意に遅らせた。
別の例示的な修飾は、病原体（例えば、ウイルス、細菌、真菌類）によって生じた疾患に対して耐性のある植物をもたらす。Ｘａ２１遺伝子（斑点細菌病に対して耐性）を発現する植物が、Ｂｔ融合遺伝子およびキチナーゼ遺伝子（イッテンオオメイガに対して耐性かつ鞘翅目に対して耐性）の両方を発現する植物と共に操作されている。
別の例示的な修飾は、雄性不稔性などの生殖能力の変更をもたらす。
別の例示的な修飾は、非生物的ストレス（例えば、乾燥、温度、塩分）に対して耐性のある植物をもたらし、耐性トランスジェニック植物はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（シロイヌナズナ）に由来するアシルグリセロールリン酸塩酵素を導入することによって作り出され、マンニトールおよびソルビトールの合成に関与するマンニトール脱水素酵素およびソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子は、乾燥への耐性を改善する。
別の例示的な修飾は、乾燥処理中に形成されるノルニコチンおよびノルニコチンの代謝産物のレベルが調節できるように、一つまたは複数のニコチンＮ－デメチラーゼの活性が調節される植物をもたらす（ＷＯ２０１５１６９９２７を参照）。
他の例示的な修飾は、ポリペプチドおよび油の貯蔵能力が改善された植物、光合成効率が高められた植物、貯蔵寿命が延長された植物、炭水化物含有量が増加した植物、および真菌類に対して耐性のある植物をもたらすことができる。Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン（ＳＡＭ）またはシスタチオニンγ－合成酵素（ＣＧＳ）、またはそれらの組み合わせの発現が調節された遺伝子組み換えの植物も意図されている。
ニコチン合成経路に関与する一つまたは複数の遺伝子を修飾して、乾燥処理された場合にニコチンのレベルが調節される植物または植物の部分をもたらすことができる。ニコチン合成遺伝子は、Ａ６２２、ＢＢＬａ、ＢＢＬｂ、ＪＲＥ５Ｌ１、ＪＲＥ５Ｌ２、ＭＡＴＥ１、ＭＡＴＥ２、ＭＰＯ１、ＭＰＯ２、ＭＹＣ２ａ、ＭＹＣ２ｂ、ＮＢＢ１、ｎｉｃ１、ｎｉｃ２、ＮＵＰ１、ＮＵＰ２、ＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３、ＰＭＴ４、およびＱＰＴ、またはそれらの一つまたは複数の組み合わせからなる群から選択することができる。
一つまたは複数のアルカロイドの量の制御に関与する一つまたは複数の遺伝子を修飾して、調節されたレベルのアルカロイドを生成する植物または植物の部分をもたらすことができる。アルカロイドレベル制御遺伝子は、ＢＢＬａ、ＢＢＬｂ、ＪＲＥ５Ｌ１、ＪＲＥ５Ｌ２、ＭＡＴＥ１、ＭＡＴＥ２，ＭＹＣ２ａ、ＭＹＣ２ｂ、ｎｉｃ１、ｎｉｃ２、ＮＵＰ１、およびＮＵＰ２、またはそれらうちの二つ以上の組み合わせからなる群から選択することができる。
一つまたは複数のこのような形質は、別の栽培品種から突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物に遺伝子移入され得るか、またはそれに直接形質転換され得る。
様々な実施形態が、突然変異型植物、非天然型植物、またはトランスジェニック植物、ならびに本開示にしたがって一つまたは複数のポリヌクレオチドの発現レベルを調節することによってそれによりコードされるポリペプチドのレベルを調節するバイオマスを提供する。
１１．消費可能製品
本明細書に説明される植物の部分、特にそのような植物の葉身および中央脈は、様々な消費可能製品に組み込むか、またはそれらの製造に使用することができ、エアロゾル形成材料、エアロゾル形成デバイス、喫煙物品、喫煙可能物品、無煙製品、医療もしくは化粧品、静脈内投与製剤、錠剤、散剤、およびたばこ製品が挙げられるが、これらに限定されない。エアロゾル形成材料の例としては、たばこ組成物、たばこ、たばこ抽出物、刻みたばこ、刻みフィラー、乾燥処理たばこ、膨化たばこ、均質化たばこ、再構成たばこ、およびパイプたばこが挙げられる。喫煙物品および喫煙可能物品は、エアロゾル形成デバイスの種類である。喫煙物品または喫煙可能物品の例としては、紙巻たばこ、シガリロ、および葉巻たばこが挙げられる。無煙製品の例には、噛みたばこ、および嗅ぎたばこが含まれる。特定のエアロゾル形成デバイスでは、燃焼ではなく、たばこ組成物または別のエアロゾル形成材料が、一つまたは複数の電気発熱体によって加熱されて、エアロゾルを生成する。別の種類の加熱式エアロゾル形成デバイスでは、エアロゾルは、可燃性燃料要素または熱源からの熱を、熱源の内部、周囲、または下流に位置し得る物理的に分離されたエアロゾル形成材料に伝達させることによって生成される。無煙たばこ製品および様々なたばこ含有エアロゾル形成材料は、乾燥粒子、断片、顆粒、粉末、またはスラリーのほか、薄片、フィルム、タブ、発泡体、またはビーズなど任意の形式の他の成分への蒸着、それへの混合、それによる包囲、あるいはそれとの組み合わせを含めた、任意の形態のたばこを含有し得る。「煙」という用語は、紙巻たばこなどの喫煙物品によって、またはエアロゾル形成材料を燃焼することによって生成されるエアロゾルの種類を説明するために使用される。
一実施形態では、本明細書に説明される突然変異型、トランスジェニック、および非天然型植物に由来する乾燥処理された植物材料も提供される。たばこ生葉を乾燥処理するプロセスは当業者にとって公知であり、本明細書に説明されるような空気乾燥処理、火力乾燥処理、熱風送管乾燥処理、および日光乾燥処理が含まれるが、これらに限定されない。
別の実施形態では、本明細書に説明される突然変異型たばこ植物、トランスジェニックたばこ植物、または非天然型たばこ植物に由来する植物材料（例えば、葉、好ましくは乾燥葉）を含む、たばこ含有エアロゾル形成材料を含むたばこ製品が説明される。本明細書説明されるたばこ製品は、未改変たばこをさらに含み得る、ブレンドたばこ製品であり得る。
１２．作物管理および農業のための製品および方法
突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物は、例えば、農業において、他の用途を有し得る。
本開示はまた、本明細書に説明される突然変異型植物、非天然型植物、またはトランスジェニック植物の栽培、および栽培植物からの種子の収集を含む、種子を生産するための方法も提供する。本明細書に説明される植物由来の種子を、当該技術分野において公知の手段によって調整し、包装材料内に袋詰めして、製造物品を形成することができる。紙および布などの包装材料は、当該技術分野で周知である。種子のパッケージは、標識、例えば、包装材料に固定されたタグまたは標識、その中に入っている種子の性質を説明するパッケージに印刷された標識などを有することができる。
識別、選択、または育種のために植物の遺伝子型判別をするための組成物、方法、およびキットは、ポリヌクレオチドの試料中のＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドの存在を検出する手段を含むことができる。したがって、組成物は、増幅または検出を行うための、一つまたは複数のＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチド、および任意に一つまたは複数のプローブ、および任意に一つまたは複数の試薬の少なくとも一部分を特異的に増幅するための一つまたは複数のプライマーを含むものとして説明される。
したがって、本明細書に説明されるＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドに対応する約１０個以上の連続するポリヌクレオチドを含む、遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブが開示される。前述のプライマーまたはプローブは、本明細書で説明したＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドにハイブリッド形成（例えば、特異的にハイブリッド形成）する約１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、４５個または５０個超の連続するポリヌクレオチドを含むか、またはそれからなり得る。いくつかの実施形態では、プライマーまたはプローブは、遺伝子識別（例えば、サザンハイブリッド形成）または単離（例えば、細菌性コロニーまたはバクテリオファージプラークの原位置ハイブリッド形成）、または遺伝子検出（例えば、増幅または検出における一つまたは複数の増幅プライマーとして）の配列依存性方法において使用し得る、約１０～５０個の連続ヌクレオチド、約１０～４０個の連続ヌクレオチド、約１０～３０個の連続ヌクレオチド、または約１５～３０個の連続ヌクレオチドを含み得るか、またはそれらからなり得る。一つまたは複数の特異的なプライマーまたはプローブを設計して、一部またはすべてのポリヌクレオチドを増幅または検出するために使用することができる。特定の例として、二つのプライマーをＰＣＲプロトコルにおいて使用して、ポリヌクレオチド断片を増幅してもよい。また、ＰＣＲは、ポリヌクレオチド配列に由来する一つのプライマーと、ポリヌクレオチド配列の上流または下流の配列（例えば、プロモーター配列、ｍＲＮＡ前駆体の３’端またはベクターに由来する配列）にハイブリッド形成する第二のプライマーとを使用しても実施し得る。ポリヌクレオチドの生体外増幅に有用な温度および等温技法の例は、当該技術分野で周知である。試料は、植物、植物細胞、または植物材料、あるいは本明細書に説明されるような植物、植物細胞、もしくは植物材料から製造されたか、またはそれらに由来するたばこ製品であり得るか、それらに由来し得る。
さらなる態様で、試料中に含まれる本明細書で説明したＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチド（または本明細書で説明した通りその任意の組み合わせ）を検出する方法も提供されており、その方法は、（ａ）ポリヌクレオチドを含むか、またはそれを含むとみられている試料を提供する工程と、（ｂ）ＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドの少なくとも一部分を特異的に検出するために、前述の試料を一つまたは複数のプライマーまたは一つまたは複数のプローブと接触させる工程と、（ｃ）増幅生成物の存在を検出する工程であって、増幅生成物の存在は、試料中のＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドの存在を示すものである、工程とを含む。さらなる態様では、ＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドの少なくとも一部分を特異的に検出するための一つまたは複数のプライマーまたはプローブの使用も提供される。ＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドの少なくとも一部分を検出するためのキットも提供され、これは、ＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドの少なくとも一部分を特異的に検出するための一つまたは複数のプライマーまたはプローブを含む。キットは、ポリヌクレオチド増幅（例えば、ＰＣＲ）のための試薬、またはプローブハイブリッド形成検出技術（例えば、サザンブロット、ノーザンブロット、インサイチュハイブリッド形成、またはマイクロアレイ）のための試薬を含み得る。キットは、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＳＥＬＤＩ質量分析法、または試験片などの抗体結合検出技術のための試薬を含み得る。キットは、ＤＮＡ配列決定のための試薬を含み得る。キットは、試薬およびキットを使用するための説明書を含み得る。
いくつかの実施形態では、キットは、一つまたは複数の説明される方法についての説明書を含み得る。説明されるキットは、遺伝的同一性の決定、系統学的研究、遺伝子型判別、ハプロタイプ、系図分析、または植物育種に関して、特に共優性評価で有用であり得る。
本開示は、本明細書で説明したＮｔＩＮＶまたはＮｔＩＮＶおよびＮｔＳＵＳポリヌクレオチドを含む植物、植物細胞、または植物材料の遺伝子型判別をする方法も提供する。遺伝子型判別は、染色体対の相同体を区別する手段を提供し、植物の集団において分離体を識別するために使用することができる。分子マーカー法は、系統学的研究、作物品種間の遺伝的関係の特徴付け、交雑種または体細胞混成体の識別、単一遺伝形質に影響を及ぼす染色体のセグメントの局所化、マップベースのクローン化、および定量的継承の研究のために使用することができる。遺伝子型判別の具体的な方法は、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）を含む、任意の数の分子マーカー分析技法を援用し得る。ＡＦＬＰは、ポリヌクレオチドの可変性に起因する増幅断片間の対立遺伝子の差異の産物である。したがって、本開示は、一つまたは複数の遺伝子またはポリヌクレオチド、ならびにこれらの遺伝子またはポリヌクレオチドに遺伝的に関連した染色体配列の分離を、ＡＦＬＰ分析などの技法を使用して追跡する手段をさらに提供する。
１３．たばこ抽出物
液体たばこ抽出物を製造する方法、および本方法により製造される液体たばこ抽出物も本明細書に開示される。
特定の抽出温度は、好ましくは、たばこ出発材料の少なくとも還元糖含有量および任意にニコチン含有量に基づいて、たばこ出発材料に対して選択される。抽出温度は、典型的には摂氏約１００度～摂氏約１６０度の範囲内から選択される。加熱工程の時間は、任意選択的に、たばこ出発材料に由来する抽出物の組成に対するある程度の制御を提供するように制御されてもよい。好適には、各たばこ出発材料は、抽出温度で少なくとも約９０分間、より好適には、少なくとも約１２０分間加熱される。加熱する工程は、典型的には、不活性雰囲気中で実行される。好適には、窒素などの不活性気体の流れは、加熱する工程中にたばこ出発材料を通過する。揮発性たばこ化合物は、不活性ガスが揮発性成分の担体として作用するように、加熱工程中に不活性ガスの流れに放出される。不活性ガスの流れは、少なくとも約２５リットル／分の、より好適には少なくとも約３０リットル／分の流量とすることができる。不活性ガスの比較的高い流量は、たばこ出発材料からの抽出の効率を有利に改善し得る。任意選択的に、加熱工程は、真空下で実施されてもよい。たばこ出発材料の加熱を実施するための好適な加熱方法は、当業者に公知であり、乾留、水蒸気蒸留、真空蒸留、フラッシュ蒸留、および薄膜水蒸気蒸留を含む。
揮発性化合物が液体溶媒中の吸収によって収集される場合、液体たばこ抽出物を形成する工程は、溶液を濃縮するために、液体溶媒中の揮発性化合物の溶液を乾燥することを含むことができる。乾燥は、乾燥（ｄｅｓｉｃｃａｔｉｏｎ）、分子ふるい、凍結乾燥、相分離、蒸留、膜透過、水の制御された結晶化および濾過、逆吸湿性、超遠心分離、液体クロマトグラフィー、逆浸透または化学乾燥を含むがこれらに限定されない、任意の好適な手段を使用して実施され得る。
液体たばこ抽出物は、エアロゾル発生システムで使用するための、組成物または製剤またはゲル組成物の生産に特に好適である。組成物または製剤またはゲル組成物を含むエアロゾル発生システムが開示される。こうしたエアロゾル発生システムでは、組成物または製剤またはゲルは、典型的には、エアロゾル発生装置、例えば、液体たばこ抽出物を組み込んでエアロゾルを生成する組成物または製剤またはゲルと相互作用するヒーター要素を備える装置内で加熱される。使用中、揮発性化合物は、熱伝達によって放出され、エアロゾル発生装置を通して引き出された空気中に同伴される。放出された化合物は冷めるにつれて凝縮してエアロゾルを形成し、これを消費者が吸い込む。
本発明は、本発明をさらに詳細に説明するために提供される、以下の実施例においてさらに説明される。これらの実施例は、本発明を実施するために現時点で企図されている好ましい様式について記載しており、本発明を例証することを意図し、限定することを意図していない。
実施例１－材料および方法
ＤＮＡ抽出物および植物遺伝子型
葉の試料を、ＢｉｏＳｐｒｉｎｔ ９６ ＤＮＡ Ｐｌａｎｔ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ、ヒルデン）と合わせたＢｉｏＳｐｒｉｎｔ ９６（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ、ヒルデン）を用いて抽出する。植物の遺伝子型を求めるために、ＤＮＡ試料をＴａｑＭａｎ反応に用いる。ＴａｑＭａｎを、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティ）と、ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティ）とを用いて行う。
遊離アミノ酸含有量の測定
アミノ酸含有量は、当該技術分野において公知の様々な方法を使用して測定され得る。そのような方法の一つは、Ｍｅｔｈｏｄ ＭＰ １４７１ ｒｅｖ ５ ２０１１，Ｒｅｓａｎａ，Ｉｔａｌｙ：Ｃｈｅｌａｂ Ｓｉｌｌｉｋｅｒ Ｓ．ｒ．ｌ，Ｍｅｒｉｅｕｘ ＮｕｔｒｉＳｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｍｐａｎｙである。乾燥処理された植物葉中のアミノ酸決定のために、中間脈を除去した後、乾燥処理された葉片を、必要に応じて、４０℃で２～３日間乾燥させる。次いで、たばこ材料はアミノ酸含有量の分析の前に微粉末（約１００ｕＭ）に粉砕される。植物材料中のアミノ酸含有量を測定するための別の方法は、ＵＮＩ ＥＮ ＩＳＯ １３９０３：２００５に説明される。遊離アミノ酸含有量の測定は、ＵＮＩ ＥＮ ＩＳＯ １３９０３：２００５に従って実施され得る。
還元糖含有量の測定
Ｓｋａｌａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）により適応されるように、かつＴｏｂａｃｃｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０：１３９－１４４（１９７６）に記載されるように、たばこ試料の分析用に開発されたセグメントフロー比色法を使用して、還元糖含有量を測定することができる。還元糖含有量の測定は、Ｃｏｒｅｓｔａ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ ３８，ＣＲＭ３８，ＣＲＭ ａｎｄ ＩＳＯ １５１５４：２００３にも記載されている。乾燥葉中の還元糖決定のために、中央脈除去後、乾燥処理済みの葉身を必要に応じて４０℃で２～３日間乾燥させる。次いで、たばこ材料を還元糖の分析前に微粉末（約１００ｕＭ）に粉砕する。還元糖含有量の測定は、ＩＳＯ １５１５４：２００３に従って実施される。
実施例２－植物組織におけるＮｔＩＮＶ４－ＳおよびＮｔＩＮＶ４－Ｔの発現の分析
表１は、ＮｔＩＮＶ４－ＳおよびＮｔＩＮＶ４－Ｔが、圃場で栽培されたバージニアたばこの植物において、植物全体の組織、特に花弁で発現し、また未熟な花、咢片、下部の葉、中央部の葉および上部の葉でも、少ないが発現することを示す。対照的に、ＮｔＩＮＶ３－ＳおよびＮｔＩＮＶ３－Ｔは、圃場で栽培されたバージニアたばこの植物において、調査される組織で非常に低い発現を有し、未熟な花で、非常に低いが唯一の顕著な発現を有する。
実施例３－バージニア熱風乾燥時間経過中の還元糖（グルコースおよびフルクトース）の放出
バージニア（熱風乾燥）たばこの乾燥処理中、還元糖、主にグルコースおよびフルクトースは、黄色化葉において強く増加し、１～２日後に最大レベルに達する（図１Ａを参照）。興味深いことに、ＮｔＩＮＶ４－ＳおよびＮｔＩＮＶ４－Ｔの発現は、約２倍（ｌｏｇ２）増加し、１日または２日後に平坦域に到達する（図１Ａを参照）。ＮｔＩＮＶ４－Ｔは、ＮｔＩＮＶ４－Ｓよりも乾燥中に広範囲に発現する（図１Ｂおよび表２を参照）。ＮｔＩＮＶ３の両方のコピーは、乾燥葉（図２Ｂを参照）または緑色葉（表１を参照）では有意に発現しない。対照として、植物における老化の一般的なマーカーであるＳＡＧ１２は、１日の乾燥後に完全に発現する（図１Ｃを参照）。
実施例４－ダークたばこにおける空気乾燥時間経過中の還元糖（グルコースおよびフルクトース）の放出
ＮｔＩＮＶ４－ＳおよびＮｔＩＮＶ４－Ｔの誘導がバージニアたばこに特異的ではないかどうかを判断するために、ダークたばこにおける発現データを研究する。この場合、葉は空気乾燥される。最初の１２０時間の間、試料は、２４時間、４８時間、９６時間、および１２０時間後に収集され、凍結され、凍結乾燥され、代謝分析に提出される。バージニアたばこの葉に見られるように、グルコースおよびフルクトース（還元糖）は、０時間から１２０時間の乾燥（黄変段階の終わり）まで４～６倍増加する（図２を参照）。完全な乾燥葉（乾燥開始から約１０日後）では、グルコースおよびフルクトースのレベルは、熱風乾燥たばこのように葉の基質で減少する（図１および図２を比較）が、より大幅に減少する。スクロースは、最初の１２０時間の乾燥中、ほぼ安定した状態を維持し、それによって葉の黄変中のスクロース分子の供給がダークたばこ中で維持されることを示唆する。乾燥の終了時に、スクロースは完全に加水分解され、したがって完全に代謝される可能性が高い（図２Ｃを参照）。
同じ試料において、凍結葉材料を使用してＲＮＡを単離し、ＮｔＩＮＶ３－Ｓ、ＮｔＩＮＶ３－Ｔ、ＮｔＩＮＶ４－Ｓ、およびＮｔＩＮＶ４－Ｔの発現を分析する。熱風乾燥たばこで観察されたように、ＮｔＩＮＶ３遺伝子は、収穫された葉では発現されず、ダークたばこの空気乾燥中に上方制御もされない。一方で、ＮｔＩＮＶ４－ＳおよびＮｔＩＮＶ４－Ｔは、１０倍を超える係数で上方制御され、乾燥５日後に最大に達する（１２０時間、表２を参照）。熱風乾燥たばこで観察されたように、ＳＡＧ１２はより急速に上方制御され、その後乾燥５日後（１２０時間）に減少する。
実施例５－熱風乾燥たばこにおけるＮｔＩＮＶ４のサイレンシング
熱風乾燥たばこにおけるＮｔＩＮＶ４のサイレンシングを調査して、これら遺伝子が乾燥処理済みのたばこ葉中の還元糖レベルの減少に寄与するかどうかを判断する。ＮｔＩＮＶ４－ＳおよびＮｔＩＮＶ４－Ｔの両方のコード配列内の特定のＤＮＡ断片（配列番号９）を、ゲートウェイベクター中の強力な構成的ミラビリスモザイクウイルス（ＭＭＶ）プロモーターでクローン化する。ＮｔＩＮＶ４遺伝子断片は、ＭＭＶとＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのノパリン合成酵素遺伝子の３’ｎｏｓ末端配列との間に隣接している。たばこ系統Ｋ３２６を、標準的なアグロバクテリウム媒介形質転換プロトコルを使用して形質転換する。四つの対照および四つのトランスジェニック３５Ｓ：ＩＮＶ４－ＲＮＡｉ系統のＩＮＶ４発現レベルに関する結果を図３に示す。低還元糖含有量の植物の選択を可能にするために、４８時間の乾燥処理の後、独立したＴ０植物葉およびそれぞれの対照系統を分析して、還元糖含有量の減少に対する影響を決定する。対照系統と比較して、最低レベルのＮｔＩＮＶ４発現を示す最良のＴ０系統は、ｑＰＣＲによって選択される。種子を、これらの最良のＴ０系統から収穫する。ＮｔＩＮＶ４遺伝子の操作（例えば、構成的プロモーターまたは特定の老化プロモーター（ＳＡＧ１２またはＥ４など）のいずれかを使用）は、たばこの乾燥葉の化学を変化させ得る。同様に、ゲノム編集戦略（例えば、ＣＲＩＳＰＲまたは突然変異体選択）を使用するノックアウトＮｔＩＮＶ４遺伝子は、商業用たばこの主要品種のアミノ酸葉の化学的性質を変化させ得る。
実施例６－四つの対照および四つのトランスジェニック３５Ｓ：ＩＮＶ４－ＲＮＡｉ系統の完全乾燥葉におけるグルコース、フルクトース、およびスクロースの分析
図３に説明される四つの対照および四つのトランスジェニック３５Ｓ：ＩＮＶ４－ＲＮＡｉ系統の五つの中間位置の葉が、成熟時に収集され、熱風乾燥に供される。糖（グルコース、フルクトース、およびスクロース）は、完全な乾燥葉で分析される。図４に提示されたデータは、抗－ＩＮＶ４植物におけるグルコースおよびフルクトースの強力かつ有意な減少を示す。グルコースおよびフルクトースのレベルは、それぞれ約６３％および約４３％低減される。興味深いことに、スクロースは、３５Ｓ：ＩＮＶ４－ＲＮＡｉ系統において有意に４．１倍高く、それによって、葉の乾燥中に蓄積するスクロースプールの一部が、サイレンシングされた系統のＩＮＶ４遺伝子によって加水分解されないことを示唆している。対照と３５Ｓ：ＩＮＶ４－ＲＮＡｉ系統の間で、視覚的な植物の適合性および総遊離アミノ酸の変動への影響は観察されない。
ＮｔＩＮＶ４－ＳおよびＮｔＩＮＶ４－Ｔの発現をノックアウトまたは下方制御すると、乾燥葉における還元糖の含有量の減少に寄与し得る。還元糖の量をさらに減少させるために、ＮｔＳＵＳとＮｔＩＮＶのノックアウトまたは下方制御の組み合わせを考慮することができる。乾燥葉中の還元糖のプールを増加させるために、ＳＡＧ１２またはＥ４などの老化誘導性プロモーターを使用したＮｔＩＮＶ４－Ｓ、またはＮｔＩＮＶ４－Ｔ、またはそれらの組み合わせの過剰発現が考慮され得る（構成的プロモーターの使用は、栄養生長期で植物の代謝を変化させ得る）。
実施例７－バーレー、バージニア、およびオリエントたばこ葉における乾燥処理後のＳＵＳ遺伝子の特定
バーレー、バージニア、およびオリエントたばこ葉の早期乾燥処理時間中のスクロース代謝に寄与する主要機能を特定するために、収穫時の成熟葉と比較した、４８時間の乾燥処理後の乾燥葉における上方制御された遺伝子の機能についての過剰出現分析（ｌｏｇ２倍変化＞２、調整ｐ値＜０．０５）を、バーレー、バージニア、およびオリエントたばこにおいて実施する。乾燥処理の種類およびたばこの品種とは無関係に、４８時間の乾燥処理後に活性である還元糖の産生に関与する遺伝子を特定する。還元糖の産生に関与するたばこ遺伝子が特定される。
葉中の早期乾燥処理中の還元糖の産生に直接関与する主要遺伝子は、ＳＵＳの遺伝子ファミリーに属する。ＳＵＳは、乾燥処理済みの分離した葉における還元糖の蓄積を促進するための主要酵素である可能性が高い。
たばこゲノムは、各祖先からの一つのＳおよび一つのＴコピーを有する６つのファミリーに分配された１２個のＮｔＳＵＳ遺伝子産物を有することが分かっている：ＮｔＳＵＳ１－Ｓ（配列番号１０）、ＮｔＳＵＳ１－Ｔ（配列番号１２）、ＮｔＳＵＳ２－Ｓ（配列番号１４）、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ（配列番号１６）、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ（配列番号１８）、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ（配列番号２０）、ＮｔＳＵＳ４－Ｓ（配列番号２２）、ＮｔＳＵＳ４－Ｔ（配列番号２４）、ＮｔＳＵＳ５－Ｓ（配列番号２６）、ＮｔＳＵＳ５－Ｔ（配列番号２８）、ＮｔＳＵＳ６－Ｓ（配列番号３０）、および ＮｔＳＵＳ６－Ｔ（配列番号：３２）。
ＳＵＳ転写産物は、ゲノム配列ＮｔＳＵＳ２－Ｓ（配列番号１４）、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ（配列番号１８）、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ（配列番号２０）、およびＮｔＳＵＳ４－Ｓ（配列番号２２）に由来する。これらの遺伝子は、表３に示されるように葉の乾燥処理（老化）中に上方制御される。これは、Ｓコピーが早期乾燥葉の化学修飾、この特定の場合において、グルコースおよびフルクトースの増加に特に関与していることを確認する。
バージニアおよびオリエンタルと比較して、バーレーの乾燥葉において低量の還元糖レベルが見られるが、ＮｔＳＵＳ遺伝子は、それにもかかわらずバーレーにおいて活性化され（表３を参照）、構造的応答としても可能性が高く、早期乾燥処理段階中にアミノ酸合成のための利用可能な炭素源を確実にする。
バーレー（ＢＵ）およびバージニア（ＦＣ）の両方で、早期乾燥処理中に発現しないＮｔＳＵＳ１－ＳおよびＮｔＳＵＳ１－Ｔ（表３を参照）は、根および茎で特に発現し、細胞壁合成のために炭水化物を送達するため、または無酸素下で炭素源を供給するための、これらの組織における考えられる特定の機能を示す（表４を参照）。一方、早期葉乾燥処理中に誘発されるＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、ＮｔＳＵＳ４－Ｓは全ての器官でも発現するが、ＮｔＳＵＳ２－ＳおよびＮｔＳＵＳ２－Ｔは、主に未熟な花および花弁で発現する。ＮｔＳＵＳ５－Ｓ、ＮｔＳＵＳ５－Ｔ、ＮｔＳＵＳ６－Ｓ、およびＮｔＳＵＳ６－Ｔは、全ての分析された植物組織において低レベルで発現する（表４を参照）。
乾燥葉中の還元糖のプールを増加させるために、ＳＡＧ１２またはＥ４などの老化誘導性プロモーターを使用したＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、またはＮｔＳＵＳ４－Ｓ、またはそれらの組み合わせの過剰発現が考慮され得る（構成的プロモーターの使用は植物代謝を強く変化させ得る）。一方、ノックアウトＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、および／またはＮｔＳＵＳ４－Ｓは、乾燥葉中の還元糖の含有量の減少に寄与し得る。
実施例８－バージニアたばこ葉におけるＮｔＳＵＳ発現のサイレンシング
バーレーたばこにおけるＮｔＳＵＳのサイレンシングを調査して、これら遺伝子が乾燥処理済みのバージニアたばこ葉中の還元糖含有量の減少に寄与するかどうかを判断する。両方のＮｔＳＵＳのコード配列内の特定のＤＮＡ断片を、ゲートウェイベクター中の強力な構成的ミラビリスモザイクウイルス（ＭＭＶ）プロモーターでクローン化する。ＮｔＳＵＳ遺伝子断片は、ＭＭＶとＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのノパリン合成酵素遺伝子の３’ｎｏｓ末端配列との間に隣接している。
低還元糖含有量の植物の選択を可能にするために、６０時間の乾燥処理の後、独立したＴ０植物葉およびそれぞれの対照系統を分析して、還元糖含有量の減少に対する影響を決定する。還元糖の最も低いレベルを示す最良のＴ０系統を選択する。種子を、これらの最良のＴ０系統から収穫する。Ｔ１子孫をｑＰＣＲによって分析して、還元糖含有量の減少との関連でのＮｔＳＵＳサイレンシング事象の効率を決定する。
ＮｔＳＵＳ遺伝子の操作（例えば、構成的プロモーターまたは特定の老化プロモーター（ＳＡＧ１２またはＥ４など）のいずれかを使用）は、たばこの乾燥葉の化学を変化させ得る。同様に、ゲノム編集戦略（例えば、ＣＲＩＳＰＲまたは突然変異体選択）を使用するノックアウトＮｔＳＵＳ遺伝子は、商業用たばこの主要品種のアミノ酸葉の化学的性質を変化させ得る。
実施例９－各々還元糖含有量が調節されたＮｔＩＮＶ４修飾たばこ植物およびＮｔＳＵＳ修飾たばこ植物から液体たばこ抽出物を生産すること
たばこ出発材料は、本開示によるＮｔＩＮＶ４修飾たばこ植物またはＮｔＳＵＳ修飾たばこ植物の乾燥葉から調製される。たばこ材料は、約２．５ミリメートル×約２．５ミリメートルの寸法を有するたばこ断片を形成するように切断され、たばこ断片は、圧縮することなく、抽出チャンバの中に装填される。たばこ出発材料は、抽出チャンバ内で加熱される。加熱中、窒素の流れは、約４０リットル／分の流量で抽出チャンバを通過する。各たばこ出発材料について、加熱工程中に放出される揮発性化合物は、摂氏マイナス１０度で、７５０ｒｐｍの撹拌で、プロピレングリコールから形成される液体溶媒に吸収することによって収集される。収集された揮発性化合物を有するプロピレングリコールの溶液を、乾燥プロセスで乾燥させて、溶液の水分レベルを約１５パーセントまで低減する。たばこ出発材料から回収された揮発性の濃縮溶液を回収する。
合わせた液体たばこ抽出物を調製することができる。上述のように処理されたたばこ出発材料のそれぞれについて、第一のたばこ出発材料は、第二のたばこ出発材料とは異なる温度および期間で加熱される。各たばこ出発材料について、加熱工程中に放出される揮発性化合物を収集し、乾燥させる。結果として得られた第一および第二のたばこ出発材料から収集された揮発性の濃縮溶液は、定義された比率で合わせて、液体たばこ抽出物を生成することができる。
本明細書に引用または記載されるあらゆる刊行物は、本出願の出願日以前に開示された関連情報を提供する。本明細書における記述は、本発明者らがそのような開示に先だって権利を与えられないことの承認としては解釈されないものとする。上記の明細書で言及したすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の様々な改変および変形が、本発明の範囲および趣旨を逸脱することなく、当業者に明らかになるであろう。特定の好ましい実施形態に関連付けて本発明を説明してきたが、特許請求される本発明は、このような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際に、本発明を実施するための記述された方法の様々な改変は、細胞生物学、分子生物学、および植物生物学、または関連分野の当業者には明らかであり、以下の特許請求の範囲の範囲内に収まるものであることが意図される。
Figure 2022550383000002
Figure 2022550383000003
Figure 2022550383000004
Figure 2022550383000005
配列表
配列番号１：ＮｔＩＮＶ３－Ｓのポリヌクレオチド配列
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配列番号２：ＮｔＩＮＶ３－Ｓのポリペプチド配列
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配列番号３：ＮｔＩＮＶ３－Ｔのポリヌクレオチド配列atggcggaaacaaacaatagcgttccttacacccaattaccggcggaggacaataacacctccagtaattctccggccaaatgccggcgacgacccaaaagagtgtcgttcatagtattaacagggctggtggcagctttgttactttttgtggcagtgaaatatgggaataacgaggcggaggatgtaaatccagggccagtaccaccacaagaaaccgtgtgtaacatgcttggttctaatctaatgccgctgaccaccatgaggacggtggcgcgtggggtggcagaaggtgtctccgccaagtcacgcggtcgtttcttgggattacggccgtttccatggaccaaacaaatgttggcttggcaaagaacatccttccactttcaacctaagaagaattggatgaatggttagtaattctttttctcttatgttattttcataaatcagctttgtttttattaaacaataaatcaacagcttattgataattttaaacataaaaccgccttatgcttgacgagattaactagaactttatgtacaatgaatggttatctccattccattacatgcccatgaattttatgtgtcttaatttaaagatttgacaggacattacattacgtttatagtttaagaaaagcttggtattgatataaaaaaaaccattacagcttcgaatatgggataccttgtctttttctttgcctaagatggatctttgattgcaagaacagagtttgaattactcaggaaaaatatgaaatcgttttggaacttatttgcttgtttattattttttgaggtgaacattaatgatttattcttatttggcatgtgttggattctttggctttggactgcgttgctcacggaaattacctgattctgttcgtcagatcctaatggtaagtccatattttctgccggtattattattattattattgttattgttattattattattattattattaatttattttgatatattggaaaccatcgacaaaacggggacctcaaaacatactagtcggggtagtttgtaagtagacagattgacaatatgatgaagacagttgtctttagacaattgcatgtgaattttgtaggagcaaacacaaattcctagaatggtatacaacttcaatcctgtctgtccaattataacctcgctacttttgatccactacacctttttcgatcaacaggggatcacttatttaattatacggaaccctttatataacaatcatatttgttcccgtattttttaggttttatattgagtggttgttatgcaaatattacaggatttgacgtttaaatatttttttggttgttatagataaaaattatctataaataaataatcattccttttttcatgttacatataaaaaataaggaaattatttaaatttaaaatctcacaagctatgcatatttcactaattaaatattaaagaaagttaatacattattaataaattcataactaaaaatataaagatttaaactctaaggcagacattttaaggctaccaaaaaaataatttttttcaagattgatggaagtggaacaactttgtaattgtagcttgtttcgtagatttcattctcttactagcgatataacacttgaattggcaaagatccgtgtctaaattttcagcaaaaaggtatccaatagtttttccttgaatacaatctaagagtttaaccgttaaattttctatccaagtattttttaaatttatccaataaaaaagatatcatgtgcaaatctataaatcttatattttatgcaagatagaaactttatttatttttagaattattattagcaatcttaaagattttatatggctgttatagaggggtaattttacaaaaagcgttctgctataaatatggttgttgctgttataggtaaaaagttgttataaaattgtttatgaaagtcactttactttattttttaactgaaaagtcactatactttgcacattgtaactcaaaagtcaatcaacacttttagggcgttattaaacattatttttcatatttcttttcagcccaaccatttaaaaaataaaaaaaaatatttaaatcatgactcgacggttccatgacctgacccattttctcttatttatgttataaaaaacataaatattactttgttgtagtgtattatattggttctcaatatagttatactaaatgtatacattggtttaagcaaagtattaaatagagaataaggaattaatcttaacaaactagaggagttagatttgaaactgaaacaagaaaattagtagcgttgaagtgaaaaaaaataaaaaggaggaagaaaaaataaaaaaagtatttatgcttgaaattttgactgagaaatattaatataagagtaaattaaaagacaatatccttgatgttttagaacaagaacgcgcattttagtaaagataatgttactagacgaccatttttagtcgaactaatttaatactttgcttaaatcaatatgttgaaaatcaagacaattaacagtaaagtaatatttacgtttttttgtaacaaaaataagagagtgggtcgagttaaagagcgggttgagtcacggtttaaatgggtatttttttattgtttaaatgattgagttaaaaaaaatatgaaaaaaaaaatttaatatggcctaaatgtattgagtgacttttgagttacaatgtgtaaagtatgatgactttccttttacaaaacaaagtaaagtgactttcataaacaattttcattagttcaatgacttctgagaaatggactccttaaaaaattgattctgaagaaaacttggtttttacggtgaatgactgttatatatgaatgttgttatcgaaaggtctgactgtatgtgacctagtttattgagacgtttttacattaaagccctttcgtatttacacttcaatatgcatcatacaaaaaatatgtgcttcataattatacattacattcatttctaactccacttttacaaaaaatattttaggtccattattctacaaaggatggtaccatttgttctatcaatacaatccagaggctgcagtatggggaaatattgtatggggccatgcagtttcaagagacttaattcactggcaacaccttccagttgctatggttgcggatcaatggtacgacattaacggtgtatggaccggatccgcaaccattttacccgatggtaaactcgtcatgttatataccgggtcaaccaacgagtcagtacaggttcaaaatctagcgtacccggctgacccatcggatcctctcctaagaaaatgggtcaaatatgagggcaacccggtacttgtaccaccacccggaattgctactaaagattttcgtgaccccaccactgcatggaccacaccacaaggcaaatggaggattactattggttcaaaggttaataaaactggaatttcattggtctatgacactattgattttaagaaatttgagttgttggatggggtgctccatggtgtaccgggtacgggtatgtgggaatgtgtggacttttacccggtttcgaaagttgttgaaaatgggcttgacacatcagataatgggcctgcagtaaaacatgtgttaaagtccagtctagatgatgatagaaatgattattatgcacttggaacttatgatgcagtggctggtaaatggattcctgataatcccacaattgatgttggtattggattaagatatgattatggaaatttttacgcatcaaaaacattttatgaccaagaaaaaaagagaagagtcctttgggcttggattactgaaggtgatagtgaagctgctgatatttgcaaaggttgggcatcacttcaggtacaattcaattgtgtcgaagacaatttagctagtgttgggatatagatttggttgaaacttaaaaaaaaaaatatttaaaattatggacatgtattttatttgaaaaaaattaaaattctgtgagtggaagaaaaccttttacccaaaaactaccctaaaccagattttgggaatgtaaaaaaaagaatcagatcatattctatgaacaaacaatattatcaaaagttttttaaaaacaattttcaaaatctatggtcaatttcctcttttattttacttcattttgtcatatttgaattttggtctcatttaacacttggtaacgtgtgatgtaaaacagcctattccaaggactataaaatatgacaagaagacaggaagcaacataattacttggccagtggcggaggttgagaatttgagattaaacagtaaggaattcgacaaggtggaggtaaaaccagggtcagtttttccactagaagttggcactgccactcaggtttgttgattgaatttaactatacacgtgtaaaagaatttctttacgttatcggtctattttaaactattatagcacgtaacatgctaatattcgataagtttaacttactataatttgaattgttgatgattatagttggacataatggctgagtttgaaatagaccctaaggtcttggagagattagaaggaaataatgctacatatgagtgcagaagcagtgggggatctgctgaacgtggtgccttaggaccatttggtttattggttttaacagataagggcttgtccgagcaaactccaatttacttctacattgcaaaagacgctgctggaaatttcaccacattcttctgcaatgatcttaccaggttctaatttctcctctcttgcattttcatctcatcaatgaagttttagcccctcccccccaccaaaaccaaactaagaaattggagaaaaacctttattggttcactgcttaatagcagtacggaattcaggattttgagtcattaggttctgctctatatatatatatataat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配列番号４：ＮｔＩＮＶ３－Ｔのポリペプチド配列
MAETNNSVPYTQLPAEDNNTSSNSPAKCRRRPKRVSFIVLTGLVAALLLFVAVKYGNNEAEDVNPGPVPPQETVCNMLGSNLMPLTTMRTVARGVAEGVSAKSRGRFLGLRPFPWTKQMLAWQRTSFHFQPKKNWMNGPLFYKGWYHLFYQYNPEAAVWGNIVWGHAVSRDLIHWQHLPVAMVADQWYDINGVWTGSATILPDGKLVMLYTGSTNESVQVQNLAYPADPSDPLLRKWVKYEGNPVLVPPPGIATKDFRDPTTAWTTPQGKWRITIGSKVNKTGISLVYDTIDFKKFELLDGVLHGVPGTGMWECVDFYPVSKVVENGLDTSDNGPAVKHVLKSSLDDDRNDYYALGTYDAVAGKWIPDNPTIDVGIGLRYDYGNFYASKTFYDQEKKRRVLWAWITEGDSEAADICKGWASLQPIPRTIKYDKKTGSNIITWPVAEVENLRLNSKEFDKVEVKPGSVFPLEVGTATQLDIMAEFEIDPKVLERLEGNNATYECRSSGGSAERGALGPFGLLVLTDKGLSEQTPIYFYIAKDAAGNFTTFFCNDLTRSSEATDVRKLIYGSTVPVLQGEKLSLRTLVDHSIVESFAQSGRTAITSRVYPTKAIYEDAKLYLFNNATDVSTASLKIWQMNSANIQSS

配列番号５：ＮｔＩＮＶ４－Ｓのポリヌクレオチド配列
atggccacccaccattcccattatgacccggaaaactccacgacccattacactgtcctaccggatcaacccgaatccgccggcgccgggcgccggaagtctcttaaagttgtctccggcattttgctctcctctttctttttgctttctttagtctttgtgatcctcaaccagtcttcagatttatcacaagaaaactcccgctcgtcggagactttgacgccggcgttgtcacgaggtgtatctcagggagtttccgagaagactttcaaggatgtttccggtagaagcctttcgtactacccgtggactaatgctatgcttacttggcaaaggactgcttaccattttcaacctcaaaagaattggatgaacggtaaattttttggcttatctttctcttattaattcttttaataaaacatgaattttaagatacttatactggctttttcttattgattcttatggctattttgttggggtatcctatggattctgattggatgatatgctgcagatcctaatggtgagtttacttattaccataattactttttattatttattattcccaaaccatgattagtgcatccggctattggttaaagattcacaaaaccaataaaatagtaatcttgtcatagtttccataataatctacacgtacgctattgtttaatgacaagaaatttgacgctcagcatagttaattctctcatatttgtattgtttactttatagcctttgagctaattaattctgggtttctttgaactaaacctttataagttacaatcacacatagatgagttggcacattattcaggctaataatgaaagaaattggattacttgactaatatggcaaatgcggccaatttaatttggattaacacgatatatgtgtggtaataatgcttttgtgcaacatctctcatacaaggacacatgattaggtgattttgtaccaagtctcgggaccaatcacaatatatgggtcacaccttatatattattgtaagagttgggacccaccaaggatttgtctgtctttccaactagccacttgtctttttctcttttttatatttttaaatgaaatggtgtgggttttttatttttgggtcgatctaaccgcttctgcctattatcaatttagccttgtgattgtgagaatagaagagagaaatagaggataataataataaggataagaattaagaacgtaccttcttattgtcgaaattatttgagaagactattcattgttctgattagtgtccatcgatgtccctttcctcctttttctatcttggagaggtttcctcttctttgttttacttttcctttttctaaatatgcattccaaaatcttaacactactcgaacgtccattcttggaaagtctctttgaaagtttagggcaacatcattcggacaacttaattagcattcactattaaaaattaatagaacagaaaagttcatgtatttttttagggagagtaagaggcggattcagaatttaaatcttatgtgtttagtttttaaaatttttaggattgataactgaacatggcgagaaacatgaacatgtgacataaattccgtgtttcaacactaaacaggtccattataccacaaaggatggtaccatcttttttatcaatacaatcctgattcagctgtttggggaaatatcacatggggccatgcaatatccacggacttgatccactggctttacttgcctttcgccatggttccgatcaatggtacgatatcaacggtgtctggaccgggtccgcgaccatcttgcccgacggtcagatcatgatgctatacaccggtgataccaatgattacgtgcaggtgcaaaatcttgcataccctgctaacttatcggatcctctcctcatcgactgggtcaagtaccaggacaatccggtcatggttcccccacccggcattggtgtcaaggacttcagagacccgacaactgcttggaccggaccccaaaacgggcagtggctgctaaccatcgggtccaagattggtaaaacgggtattgcacttgtttatgatacgtccaacttcacaaactttaagctattggatggagttttgcatgcggttccgggtacgggtatgtgggagtgtgtggacttttacccggtatcaaccgttgaggcaaacgggttggacacatcatataacgggccaggtataagcatgtgttaaaagcaagtttagatgacgataagcatgattactatgctattgggacatatgacccggtaaagaacaaatggactcctgataacccggaattggatgtgggtatcgggttgagactggactacgggaaatactatgcgtcaaagacattttatgacccgaaagaacaaagaagaatattgtggggatggattggagaaactgacagtgaagctgctgatctgctgaagggatgggcatctgtacaggtatggactcttttaagtacactacctcagcatccgaagagcattacacttttatttttgttttacattagaccacatgaatgggtgttttggcataactggtaaagttgttgccatgtgaccctgaggtcacgggttcgagccgtagaaatagcctcttgcagtaatgtaataaactcttagtgcatagggttgccttttttattagaccacacacatgttcaagttatgtcatgttagtcgtgtcaattttttgtggaaatcaatttactgcacctcaatcttgaattagttgagactagctataggaacctttgtattgagaggacttatcataatttgatcatttttgcactaactgtcacactatgatattcactttctttatccagtttagtagtgtgccaatacaccttaagcacgtgacaagaatttattagcagggtcatctcgattttatgtaggagtacagaattgaattgaatcttttcttctagtaaattctcaattgcaacttgacaatgaagtttttcagatgcaaaaaagatgaaatatctctaataatttccttttccaataacagagtattccaaggactctgctttatgacaaggagacaaggacacatgtacttcagtggccagttaaagaaattgagagcttaagaattggtgatcctctagtgaaacaggtcaatcttcaaccaggctcaattgagcttgtccatgttgactcagccgcacaggtttgctttctcatccttcgaaattgaaaacgtttcacttatatgtgcttgatgtacagtcctaaaacttgtatgcgcaatggtgcagttggatgtagaagcctcatttgaagtggacaaagcagcactcgcgggaacaattgaagcagatgtggtttcaactgcagtactagtggaggtgctgctaaaagaggcattttgggaccatttggtgtcgttgtaattgctgatcaaacgctttctgagctaaccccagtttacttctacattgccaaaggaactggtggccgagctgaaacctacttctgcgctgatgaaactaggtttgcttctactatgtttatcttgtatactctatcttaatagtccttgtcaaagtatagaggaataacatagcggcgtgatctgatgcagatcctcagaggctcctggagttgctaaacaagtgtatggtagttcagtaccagtgttagatggtgaacaacactcaatgagattattggtaagtgataatccctttattctgactttcttcaaatcaagaataatatcaagcttattagttcttccagtcatcttacttaatttgtggaaatgctccaaagtagtcaatttggtaactattcaagataatgtggttcagaataatttgtgttatgaatgtatttgacagttgggatgatctgttttttagtaaaatttcttaaaaacttaattcaggtggaccactcaattgtggaaagctttgctcaaggaggaagaacagtcataacatcgcgaatttacccaacaaaagcaatcaatggagcagcacgactgttcgttttcaacaatgccaccggggctagtgtgactgcctccctcaagatttggtcactcaaatcagctgatattcgatccttccccttggaccagttgtaa

配列番号６：ＮｔＩＮＶ４－Ｓのポリペプチド配列

MATHHSHYDPENSTTHYTVLPDQPESAGAGRRKSLKVVSGILLSSFFLLSLVFVILNQSSDLSQENSRSSETLTPALSRGVSQGVSEKTFKDVSGRSLSYYPWTNAMLTWQRTAYHFQPQKNWMNDPNGPLYHKGWYHLFYQYNPDSAVWGNITWGHAISTDLIHWLYLPFAMVPDQWYDINGVWTGSATILPDGQIMMLYTGDTNDYVQVQNLAYPANLSDPLLIDWVKYQDNPVMVPPPGIGVKDFRDPTTAWTGPQNGQWLLTIGSKIGKTGIALVYDTSNFTNFKLLDGVLHAVPGTGMWECVDFYPVSTVEANGLDTSYNGPGIKHVLKASLDDDKHDYYAIGTYDPVKNKWTPDNPELDVGIGLRLDYGKYYASKTFYDPKEQRRILWGWIGETDSEAADLLKGWASVQSIPRTLLYDKETRTHVLQWPVKEIESLRIGDPLVKQVNLQPGSIELVHVDSAAQLDVEASFEVDKAALAGTIEADVGFNCSTSGGAAKRGILGPFGVVVIADQTLSELTPVYFYIAKGTGGRAETYFCADETRSSEAPGVAKQVYGSSVPVLDGEQHSMRLLVDHSIVESFAQGGRTVITSRIYPTKAINGAARFVFNNATGASVTASLKIWSLKSADIRSFPLDQL

配列番号７：ＮｔＩＮＶ４－Ｔのポリヌクレオチド配列
atgatgttatacaccggtgataccaatgattacgtgcaggtgcaaaatcttgcgtaccccgccaacttatcggatcccctcctcatcgactgggtcaagtaccggggcaacccggtcatggttccaccacccggcattggtgtcaaggactttagagacccaacgactgcttggaccggaccacaaaacgggcagtggctgcttaccatcgggtccaagattggtaaaacgggtattgcaattgtttatggtacttccaacttcacaaactttaagctattggatggagttttgcatgcggttccgggtacgggtatgtgggagtgtgtggacttttacccggtatcaaccgatgaggcaaacgggttggacacatcatataacgggccaggtataaagcatgtgttaaaagcaagtttagatgacgataagcatgattactatgctattgggacatatgaccggtaaagaacaaatggactcctgataacccgcaattggatgtgggtatcgggttgagactggactacgggaaatactatgcgtcaaagacattttatgacccgaaggaacaaagaagaatattgtggggatggattggggaaactgacagtgaagctgctgatctgctgaagggatgggcatctgtacaggtatggacacttttcaagtacactacctcagcttccgaagagcattacacatttatttttgtattacattagggtgccttggcgtaactctggtaaagtaagttctgaattgcaacgtgaaaatggaggtttttagatgcaaagagatgatatatccctaatagttttcctgttttaataacagagtattccaaggactgtgctttatgataaggagactaggacacatgttcttcagtggccagttaaagaaattgagagcttaagaattggtgatcctctagtgaaacgggtcaatcttcaaccaggctcaattgagctagtccatgttgactcagccgcacaggttgctttctcatccttggaaattgaaaacgtttcacttatatgtgcttaatgtgcagtcctaaaacttgtatgtgcaatggtgcagttggatgtagaagcctcatttgaagtggacaaagcagcactcgagggaacaattgaagcagatgttggtttcaactgcagtactagtggaggtgctgctaaaagaggcattttgggaccatttggtgtcgttgtaattgctgatcaaacgctttctgagctaactccagtttacttctacattgccaaaggacctgatggccgagctgaaacctacttctgtgctgatgaaactaggtttgcttctactatgtttatcttgtatactctatcttaatagtccttgtcaaagtatagatgaataacatagcggcgtgatctgatgcagatcctcagaggctcctggagttgctaaacaagtgtatggtagttcagtaccagtgttagatgatgaacaacactcaatgagattattggtaagtgataatcccgttattctgaccttcgtcaaatcagaataatatcaagcttattagttcttccagtcatcttattaaatttatggaaatgctccaaagtagtcaatttggtaactattcaagataatgtggttcagaataatttgtgttatgaatgtatttgacagttgggatgatctgtgtttttgagtaaaatttcttaaaactgaactcaggtggaccactcaattgtggagagctttgctcaaggaggaagaacagtcataacatcgcgaatttacccaacaaaggcaatcaatggagcagcacgactgttcgttttcaacaatgccacgagggcaaggtgactgcctccctgaagatttggtcactcgaatcagctgatattcgatccttccccttggaccagttgtaa

配列番号８：ＮｔＩＮＶ４－Ｔのポリペプチド配列
MATHHSHYDPENSTTHYTVLPDQPESAGSGHRKSLKVVSGILLSSFFLLSLVFVIVNQSSDLSQKNSHSSETLTPALSRGVSQGVSEKTFRDVSGGSLSYYPWTNAMLTWQRTAYHFQPQKNWMNGPLYHKGWYHLFYQYNPDSAIWGNITWGHAISTDLIHWLYLPFALVPDQWYDINGVWTGSATFLPDGQIMMLYTGDTNDYVQVQNLAYPANLSDPLLIDWVKYRGNPVMVPPPGIGVKDFRDPTTAWTGPQNGQWLLTIGSKIGKTGIAIVYGTSNFTNFKLLDGVLHAVPGTGMWECVDFYPVSTDEANGLDTSYNGPGIKHVLKASLDDDKHDYYAIGTYDPVKNKWTPDNPQLDVGIGLRLDYGKYYASKTFYDPKEQRRILWGWIGETDSEAADLLKGWASVQSIPRTVLYDKETRTHVLQWPVKEIESLRIGDPLVKRVNLQPGSIELVHVDSAAQLDVEASFEVDKAALEGTIEADVGFNCSTSGGAAKRGILGPFGVVVIADQTLSELTPVYFYIAKGPDGRAETYFCADETRSSEAPGVAKQVYGSSVPVLDDEQHSMRLLVDHSIVESFAQGGRTVITSRIYPTKAINGAARLFVFNNATRSVTASLKIWSLESADIRSFPLDQ

配列番号９：ＮｔＩＮＶ４－ＴおよびＮｔＩＮＶ４－Ｓのサイレンシングに使用されるヌクレオチド配列
ggtttcaactgcagtactagtggaggtgctgctaaaagaggcattttgggaccatttggtgtcgttgtaattgctgatcaaacgctttctgagctaac

配列番号１０：ＮｔＳＵＳ１－Ｓのポリヌクレオチド配列
atggcagctagtggtcttagcattaagaaaagtttggaggaatccattttggctcatccagatgaaattttggctctcaagtcaaggtacattactacatataatgatattaagaactagaggcttatccaaggttttgttacatttttgaaattataagtttagaacctaatagtacttggtagcacttgtttccttattatctagctgttgttactgcttgttgctactgctttctgttcatctttccttgagcccggtctatcggaaacaacctctctattctcaaagtataaggtttgcgtacatactacctccccagactctacttgtggaatttactgtttttgttgtgttgttgtaatctaatatttattagaattttactgatttttcacatatatatatctatgtcccctgtcgaaaattctatagctcatgttagctaaatacattagtaccattgtttttaattgttttggttttggcacaggattgaaactgaagggaaaggggtaatgaaaccacttgatctcttgaaccatttggtttctgttactagtaagacaaatggagtaaatattgtacctagtgcacttgtggaagttctcagttgcagccaagaagctgtgattgtaccaccaaaactagcactagctgtacgtccgaggcccggtgtatgggagtacttgtcactgaatcttaagacaaagaaagtggctgaattaagcattcctgaataccttcaattgaaagagaacactgttgatgaaaggtaaagtattagtctgcgatttcgctttgtgaaattgaagtttttgttttgattcataatgttttgtgtatcaattatgttaccagtggaaacatattggagttggattttgagccatttacaacagttacaccaccaaaaacactttctgactctattggcaatggtttggagtttcttaatcgccacattgcttcgaaaatgtttcatgataaggagatttccagatgcctccttgacttcctcagaaaccataactacaaaggaaaggtaataaaaaaaagtgtttctttaaacaagttgtatgattatgtgtatatttctaagtatgttaacttgaaaacagtcattgatggtgaaagaaagcattcaaagcctagagagtttccaacttgttctgaaaaaagcagaggaacatttgtgcacattgaatccagaaactccatactccaattttgaatcaaagtttgaagagattggcttggaaagagggtggggaaacaccgctgaacgcgtgcaagacactatcagtcatcttttgcatctccttgaggctcctaacgcgtcttctttggaaaatttccttggtagaatcccattggttttcaatgttgtgattctaactccacatggttattttgctcaagataatgtcttgggctatcctgacactggtggccaggtttgtgtccaatattttgcattcttgatcaagttctttataccatttgaaccaacaatcttnaacattctttttttggttgtgaaatgttgaataggttgtttacattcttgatcaagttccagctatggagcgtgagatgcttcatcgtatgaagcttcaaggactcgatgatatcatccctcgcatccttgttgtaagtggccttaattttcctagtttcatttacacctctaaatgaaattgatcttttttgttgttttatatcaggtaacaaggctgctgcctgatgcagtaggaaccacctgtggcgagcggatggagaaagtatatggggcagaacattctcatataattcgtgttccatttagaactgagaagggaatgttgcgcaaatggatctcacgattcgaagtctggccatacatggaaactttcactgaggttggaacataaaaacaaataaaatccattggaatgttccttctgcaattgaaaatgtcttgctaactgaagacccatttttaaattgatcatcaggatgttgcagaagaacttgtcaaagaattgcaagctaaaccagacttgatcattggaaactacagtgagggaaatcttgctgcctctttgcttgcgaagaaatttggggctactcagtgtactattgctcatgccttggaaaaaactaagtatccaaactctgaccttaattggaagaagtttgatgacaagtatcatttctcaagtcagttcactgctgatctctttgccatgaatcacactgatttcatcatcaccagcactttccaagaaattgctggaaggtaaaagcaaatgcacaccatcatagtatttcatatttttacccttgtttatactatttccattcaccgaccccgacttgtttaggattgagccatagttgttgttgttgtttgtttatactatttccatttgccgaccacaacttgtttaggactgaggtatagttgttgttgttggtttgttcatattattttcattcgctaaccctaacttgtttgggactgaggcatagtagtagtagtagttgttgctattagtttatactatttccatttgccaaccccaacttgtttggtactgagacatagttgttgttgttgttgtttgtttatactatttccatttgccgaccccaacttgtttaggactgaggtatagttgttgttgttggtttgttcatattattttcattcgctaaccccaacttgtttgggactgaggcatagtagtagtagtagtagttgttgctattagtttatactatttccatttgccaaccccaacttgtttggtactgagacatagttgttgttgttgtttgtttatactatttcaatttgtcgaccccaatttgtttgggaccaaggcatggttgttgttgttgtttgtttgtttttactgtttccattgatattggaacatttgttatttgcagcaaaaacactgtaggacagtatgagagtcatactgcttttaccatgcctggattgtaccgagtagtccatggaatcgattcgtttgatccaaagttcaacattgtctcccctggggctgatatgtcaatctacttcccttacactgagaaggagaaaaggctaaccaacttccacccggaaattgaagaactcctctacagtcctgttgagaataaggaccacttgttagtctccttaatttgcttttatttcatcccatttatgatcgcttttatcccaacagatcgattaatcatttgttatcaacataaacagatgtgtgttgaaggaccggaacaagccaattctctttaccatggcaaggctagatcgcgtgaagaatctaacagggctcgtggaatggtatgctaagaatgcaaggctgagggagcttgttaaccttgtggttgtaggcggagacagaaggaaagaatccaaagatttagaagagcaagcagagatgaagaagatgtatgatcttatcgaaacctataacctgaacggccaattcaggtggatttcttcccaaatgaatcgtgtgaggaacggagaactctatcgttacattgcagacacgaggggtgctttcgttcaaccagcattctacgaggcttttggtttgacagttgtagagtctatgacttgtggtttgccaacttttgctacttgtaatggtggaccatttgagattatagtgaatggaaaatctggtttccatattgatcctaatcaaggtgacaaggctgctgatatgttggtaaatttctttgaaaaatctaaagaagatccaagttattgggatgctatttccaagggaggtctgcaacgtattcttgaaaagtaagcttttgcatttgattagcacaagtgcacaaccaagatttaacttttgaacaaactaaaactaacccttttttgtattttcttttgctaggtatacatggcaaatttattcacagaaagtgatcacactatctgggatttatggattctggaagtatgcaaccaagaatgataaagttgctagtgcaaagaagcgctatcttgagatgttttatgaacttggatttaagaaatcagtaagtgtcaattttaaaggggaaccttggatcaacggttaagttgtctttgtgcaacctataggtcaggggtttgagccgtagaagtagccactaatatttacattagggtagactgtgtacatatcacaccccttggggtacggccctttcctggatcctgtatgaacgcgggatgccttgtgcaccgggctgtatttttttttttagtgtcacttctgtattttgtttgagcttgtttataaagtttggaaatctgctgctaatttgtatatttgttggttgtgtatttcaggctgagaaagttccattggctattgatgaatag

配列番号１１：ＮｔＳＵＳ１－Ｓのポリペプチド配列
MAASGLSIKKSLEESILAHPDEILALKSRIETEGKGVMKPLDLLNHLVSVTSKTNGVNIVPSALVEVLSCSQEAVIVPPKLALAVRPRPGVWEYLSLNLKTKKVAELSIPEYLQLKENTVDESGNILELDFEPFTTVTPPKTLSDSIGNGLEFLNRHIASKMFHDKEISRCLLDFLRNHNYKGKSLMVKESIQSLESFQLVLKKAEEHLCTLNPETPYSNFESKFEEIGLERGWGNTAERVQDTISHLLHLLEAPNASSLENFLGRIPLVFNVVILTPHGYFAQDNVLGYPDTGGQVVYILDQVPAMEREMLHRMKLQGLDDIIPRILVVTRLLPDAVGTTCGERMEKVYGAEHSHIIRVPFRTEKGMLRKWISRFEVWPYMETFTEDVAEELVKELQAKPDLIIGNYSEGNLAASLLAKKFGATQCTIAHALEKTKYPNSDLNWKKFDDKYHFSSQFTADLFAMNHTDFIITSTFQEIAGSKNTVGQYESHTAFTMPGLYRVVHGIDSFDPKFNIVSPGADMSIYFPYTEKEKRLTNFHPEIEELLYSPVENKDHLCVLKDRNKPILFTMARLDRVKNLTGLVEWYAKNARLRELVNLVVVGGDRRKESKDLEEQAEMKKMYDLIETYNLNGQFRWISSQMNRVRNGELYRYIADTRGAFVQPAFYEAFGLTVVESMTCGLPTFATCNGGPFEIIVNGKSGFHIDPNQGDKAADMLVNFFEKSKEDPSYWDAISKGGLQRILEKYTWQIYSQKVITLSGIYGFWKYATKNDKVASAKKRYLEMFYELGFKKSAEKVPLAIDE

配列番号１２：ＮｔＳＵＳ１－Ｔのポリヌクレオチド配列
atggcaggcagtggtcttagcattaaggaaagtttggaggaatccattttggctcatccagatgaaattttggctctcaagtcaaggtacattactgcataatgatattaagacctagaagcggatccaagattttgttacatttttgaaattataagtttagaatctaatatttgttatcgcttgtttccttattatcttgctgttgttactgcctgttgctactagtttctgttcatccttccttgagctgagtttctatcggaaacaacctctctactctcaaagtaggaataagttatgcgtacacactaccctccccagactccacttgtgtaatttactgagtttgttgttgttgttgttgtaatctaatacttgttagaattttactgatttttcacatatatatctatgacccatgtcgaaaatactatagctcatgtgctaaatacattagtaccattgttttgtaattgttttggttttggaacaggattgaaactgaagggaaaggggtaatgaaaccagttgatctcttgaaccatttggtttctgttactagtaaaacaaatggagtaaatgttgtacctagtgcacttgtggaagttctcagttgcagccaagaagctgtgattgtaccaccaaaactagcactagctgtacgtccgaggcccggtgtatgggagtacttgtcactgaatcttaagacaaagaaagtggctgaattgagcattcctgagtaccttcaattgaaagagaatactgttgatgaaaggtaaagtaatagtctgcgatttcgctttgtgaaattgaagttttttgtttgattcttaatgttttgtgtatcaattatgttaccagtggaaacatcttggagttggattttgagccatttacaactgttacaacaccaaaaacactttctgactctattggcaatggtttggagtttcttaatcgccacattgcttcgaaaatgtttcttgataaggagattgccaagtgcctccttgactttctcagaaaccataactacaaaggaaaggtagtaaaaaaagtgtttctttaaacaagttgtatgattatgtgtgtatttctaaatatgtcaatttgaaaacagtcattgatggtgaaagaaagcattcaaagcctggagagtttccaacttgttctgaaaaaagcagaggaatatttgcacacactgaatccagaaactccatactccaaatttgaatccaagtttgaagagattggcttggaaagagggtggggaaacaccgctgaacgcgtgcaagacaccattagtcatcttttgcatctccttgaggctcctaacgcgtcttccttggaaaatttccttggtagaatcccattggttttcaatgttgtgattctcaccccacatggttattttgctcaagataatgtcttgggctatcctgacactggtggccaggtttgtgtccgatataacatatcaagaaattttgcattcttgatcatgttctttataccatttgaaccaacattctttttttggttgtgaaatgttgaataggttgtttacattcttgatcaagttccagctatggagcgtgagatgcttcatcgtatgaagcttcaaggactcgacgatatcatccctcgcatccttgttgtaagtgcccttaattttcctggtttggtttacctctaaatgaaattgattttctggctttctaacttttttggattgatctttttgttgttttatatcaggtaactaggctgctgcctgatgctgtaggaaccacttgtggcgagtggatggagaaagtatatggggcagaacattctcatataattcgtgttccatttagaactgagaaaggaatgttgcgcaaatggatctcacgattcgaagtctggccatacatggaaactttcactgaggttggaacataaaaacaaataaaaatcattggaatgttcttctgcatttgaaaatgtcttgctaactaaagactcatttttaaattaatcatcaggatgttgcagaagaacttgtcaaagaattgcaagctaaaccagacttgataattggaaactacagtgagggaaatcttgctgcctcattgcttgctaagaaatttggggctactcagtgtactattgctcatgccttggaaaaaactaagtatccaaactctgaccttaattggaagaagtttgatgacaagtatcatttctcaagtcagttcactgctgatctttttgccatgaatcacactgatttcattatcaccagcactttccaagaaattgctggaaggtaaaagcaaatgcacaccatcatagtatttcatatttttaccctagtttatactatttccatttgtcaactccaacttgtttgggattgaaccatagttgttgtttgtttatactatttccattcgccgaccccaacttatttgggactgagacataattgttgttattattgtttgtttgtttatactatttccattctcagaccccaacttctttgggactgagccgtagattgttgttgttgttgttgttgttgtttgtttatgctatttccgttcaccgaccccaacttatttgggactgaggtgtagaagtagtcgttgttgtttgtttatacgacttccaattgatattcgaatgtttttatttttgcagcaagaacactgtaggacagtatgagagtcatactgcttttaccatgcctggattgtatcgagtagtccatggaatcaattcgtttgatccaaagttcaacattgtctcccctggggctgatatgtcaatctacttcccttacactgagaaggagaaaagactaaccaacttccacccggaaattgaagaactcctctacagtcctgttgagaataaggaccacttgttagtcttctttatttcattcatttttctacaccttttttttcaacagattgattgattggttcttatcaacgtaaacagatgtgtgttgaaggaccagaacaagccaattctctttaccatggcaaggctagatcgcgtgaagaatctaacagggctcgtggaatggtatgcaaagaatgcaaggctaagggagctcgttaaccttgtggttgtaggcggagacagaaggaaagaatccaaagatttagaagagcaagcagagatgaagaagatgtatgatcttatcgaaacatacaacctgaatggccaattcaggtggatttcttcccaaatgaatcgtgtgaggaacggagaactttatcgatacattgcagacacgaggggtgctttcgttcaaccagcattttatgaggcatttggtttgacagttgttgagtctatgacttgtggtttgccaacttttgctacttgtaatggtggaccatttgagattatagtgaatggaaaatctggtttccatattgatcctaatcaaggtgacaaggctgctgatatgttggttaatttcttcgaaaaatctaaagaagatccaagttattgggatactatttccaagggtggtctgcagcgtattcttgaaaagtaagcttttgcatttgattagcacaagtgtacaaccaagatttaacttatgaacaaactaaaactaaccctttttttattttcttttgctaggtatacatggcaaatttattcacagaaagtgatcacattatctgggatttatggattctggaaatatgcaaccaagaatgacaaagttgctagtgcgaagaagcgctatcttgaaatgttttatgaatttgggtttaagaaatcagtaagtgtcacttctgtattttgtttgagcttgtttgtaaagtttggcaatcttctgctaatttgtactatatttgttgacttgtgcatttcaggctgagaaagttccattggctattgatgaatag

配列番号１３：ＮｔＳＵＳ１－Ｔのポリペプチド配列
MAGSGLSIKESLEESILAHPDEILALKSRIETEGKGVMKPVDLLNHLVSVTSKTNGVNVVPSALVEVLSCSQEAVIVPPKLALAVRPRPGVWEYLSLNLKTKKVAELSIPEYLQLKENTVDESGNILELDFEPFTTVTTPKTLSDSIGNGLEFLNRHIASKMFLDKEIAKCLLDFLRNHNYKGKSLMVKESIQSLESFQLVLKKAEEYLHTLNPETPYSKFESKFEEIGLERGWGNTAERVQDTISHLLHLLEAPNASSLENFLGRIPLVFNVVILTPHGYFAQDNVLGYPDTGGQVVYILDQVPAMEREMLHRMKLQGLDDIIPRILVVTRLLPDAVGTTCGEWMEKVYGAEHSHIIRVPFRTEKGMLRKWISRFEVWPYMETFTEDVAEELVKELQAKPDLIIGNYSEGNLAASLLAKKFGATQCTIAHALEKTKYPNSDLNWKKFDDKYHFSSQFTADLFAMNHTDFIITSTFQEIAGSKNTVGQYESHTAFTMPGLYRVVHGINSFDPKFNIVSPGADMSIYFPYTEKEKRLTNFHPEIEELLYSPVENKDHLCVLKDQNKPILFTMARLDRVKNLTGLVEWYAKNARLRELVNLVVVGGDRRKESKDLEEQAEMKKMYDLIETYNLNGQFRWISSQMNRVRNGELYRYIADTRGAFVQPAFYEAFGLTVVESMTCGLPTFATCNGGPFEIIVNGKSGFHIDPNQGDKAADMLVNFFEKSKEDPSYWDTISKGGLQRILEKYTWQIYSQKVITLSGIYGFWKYATKNDKVASAKKRYLEMFYEFGFKKSAEKVPLAIDE

配列番号１４：ＮｔＳＵＳ２－Ｓのポリヌクレオチド配列
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配列番号１５：ＮｔＳＵＳ２－Ｓのポリペプチド配列
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配列番号１６：ＮｔＳＵＳ２－Ｔのポリヌクレオチド配列
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配列番号１７：ＮｔＳＵＳ２－Ｔのポリペプチド配列
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配列番号１８：ＮｔＳＵＳ３－Ｓのポリヌクレオチド配列
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配列番号１９：ＮｔＳＵＳ３－Ｓのポリペプチド配列
MANPKFTRVPSMRERVEDTLSAHRNQLVALLSRYVAQGKGILQPHHLIDEFNNAVCDDTACEKLKDGPFSEVLKATQEAIVLPPFVAIAVRPRPGVWEYVRVNVYDLSVEQLTVPEYLHFKEELVDGEGNNHFVLELDFEPFNASVPRPSRSSSIGNGVQFLNRHLSSIMFRSKDSLDPLLDFLRGHCHKGNVLMLNDRIQRISRLESALSKAEDYLSKLSPDTSYNEFEYALQEMGFERGWGDTARRVLETMHLLSDILQAPDPSTLETFLGRLPMVFNVVILSPHGYFGQANVLGLPDTGGQVVYILDQVRALEAEMLLRIKQQGLNFKPRILVVTRLIPDAKGTMCNQRLERISGTEYSHILRVPFRTEKGILHKWISRFDVWPYLEKFTEDVASEMTAELQGKPDLIIGNYSDGNLVASLLAYKMGVTQCTIAHALEKTKYPDSDIYWKKFEEKYHFSCQFTADLLAMNNSDFIITSTYQEIAGTKNTVGQYESHTAFTLPGLYRVVHGIDVFDPKFNIVSPGADMTIYFPYSDKEKRLTSLHGSIEKLLFDPAQNEEHIGNLNDKSKPIIFSMARLDHVKNITGLVECYAKNATLRELANLVVVAGYNDVKKSSDREEITEIEKMHALIKEHKLDGQFRWVSAQTNRARNGELYRYIADQRGIFVQPAFYEAFGLTVVEAMTCGLPTFATCHGGPNEIIEPGVSGFHIDPYHPDKAAELMSEFFQRCKQDPTHWEKISASGLRRILERYTWKIYSERLMTLSGVYGFWKLVSKLERRETRRYLEMFYILKFRELAKSVPLAIDDK

配列番号２０：ＮｔＳＵＳ３－Ｔのポリヌクレオチド配列
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配列番号２１：ＮｔＳＵＳ３－Ｔのポリペプチド配列
MFTWLKLNIKNKGRKNTVGQYESHTAFTLPGLYRVVHGIDVFDPKFNIVSPGADMTIYFPYSDKEKRLTSLHGSIEKLLFDPAQNEEHIGNLNDKSKPIIFSMARLDHVKNITGLVECYAKNATLRELANLVVVAGYNDVKKSSDREEIAEIEKMHALIKEHKLDGQFRWIAAQTNRARNGELYRYIADKRGIFVQPAFYEAFGLTVVEAMTCGLPTFATCHGGPNEIIEHGVSGFHIDPYHPDKAAELMAEFFQRCKQDPTHWEKISASGLRRILERYTWKIYSERLMTLSGVYGFWKLVSKLERRETRRYLEMFYILKFRELAKSVPLAIDDK

配列番号２２：ＮｔＳＵＳ４－Ｓのポリヌクレオチド配列
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配列番号２３：ＮｔＳＵＳ４－Ｓのポリペプチド配列
MAERVLTRVHSLRERLDATLAAHRNEILLFLSRIESHGKGILKPHQLLAEFDSIHKEDKNKLNDHAFEEVLKSTQEAIVLSPWVALAIRLRPGVWEYVRVNVNALVVEELTVPEYLQFKEELVNGTSHDNFVLELDFEPFTASFPKPTLTKSIGNGVEFLNRHLSAKMFHDKESMTPLLEFLRVHHYKGKTMMLNDRIQDLNTLQNVLRKAEEYLTTLSPETSYSAFEHKFQEIGLERGWGDTAERVLEMICMLLDLLEAPDSCTLEKFLGRIPMVFNVVILSPHGYFAQENVLGYPDTGGQVVYILDQVPALEREMLKRIKEQGLDIKPRILIVTRLLPDAVGTTCGQRLEKVFGTEHSHILRVPFRTEKGIVRKWISRFEVWPYMETFTEDVAKEIAAELQAKPDLIIGNYSEGNLAASLLAHKLGVTQCTIAHALEKTKYPDSDIYLKKFDEKYHFSAQFTADLIAMNHTDFIITSTFQEIAGSKDTVGQYESHMAFTMPGLYRVVHGIDVFDPKFNIVSPGADMNLYFPYYEKEKRLTAYHPEIEELLFSDVENDEHMCVLKNRNKPIIFTMARLDRVKNLTGLVELYAKNPRLRELVNLVVVGGDRRKESKDLEEQAEMKKMYELIKTHNLNGQFRWISSQMNRVRNGELYRYIADTRGAFVQPAFYEAFGLTVVEAMTCGLPTFATNHGGPAEIIVHGKSGFHIDPYHGDQAAELLADFFEKCKKEPSHWEAISEGGLKRIQEKYTWQIYSDRLLTLAAVYGFWKHVSKLDRLEIRRYLEMFYALKFRKLVSFIAFCTPAIV
配列番号２４：ＮｔＳＵＳ４－Ｔのポリヌクレオチド配列
atggccgaacgtgtgctaactcgtgttcacagccttcgcgaacgtcttgatgctactttggctgctcatcgcaatgagattttgctgtttctttcaaggtatagtcttagcagattgttctttgatttagttggtgttatttgccagttctaatgtatggactaatatatgaacaaagtgcgaccatttcaactgacaacttaaaatgtttgagagaatacacgtttatttacttaattatggcttgagcataggaagtgtatcttggcgtaactcgtaaagttgacctcatgtgacaaggaggtcacggtttcgagccgtggaaacagcctcttgcagaaatgcaggtaaggctgcgtgcaatagatcgcccttccacggacccgcgcatagcgggaacttagtgcaccggttgggctgtccttttttatgtcttcagcacaaaaatttagtttaaacatgtgtatcatggattattcatgctggttttgccggttgcaggattgaaagccacggaaaagggatattgaaacctcaccagttgctggctgagtttgaatcaattcacaaagaagacaaaaacaaactgaatgatcatgcttttgaagaagtcctgaaatctactcaggtaatttgtggttttagtgttaggtgatggatagcatttattgtcttactaagatcatatatgtgtcagtttgtggctagtatttgaaaagtctggtgtggtttgtcatactaggaagcaattgtcttgtccccttgggttgcgcttgccattcgtctgcggcctggtgtgtgggaatatgttcgtgtgaatgtcaatgcacttattgtcgaggagctgactgtgcctgaatatttgcaattcaaggaagaacttgttaatggaacgtaagttttaggttcgaaatgatgatttgttaaataatatgttctgaactttttgattaatgttgtgttttcccctgatgcagctcgaacgataactttgttcttgagctggattttgagcccttcactgcatcatttcccaaaccaaccctcaccaaatcaattggaaatggagttgaattcctcaaccgacacctctctgccaaaatgttccatgacaaggaaagcatgacccctcttctcgagtttcttcgagttcatcactacaagggcaaggtaaacttgtttttcctgtttgtctatgaatttagtttctgaaagttgctttgcttcgtgaattttttagtggcaactgatttatgattttctgtgcagacaatgatgctgaatgacagagttcaggacttaaacactctccaaaatgtcctaaggaaggctgaggaatatctcactaccctttcccctgaaacttcatactcggtatttgagcacaagttccaagaaattggcctagagaggggctggggtgacaatgctgagcgtgttctagagatgatctgcatgctcctggatctcctcgaggctccagactcatgcactcttgagaagttccttggtagaattcctatggtttttaatgtggtcattctttcacctcacggatatttcgcccaggaaaatgtcttgggttaccccgatactggtggccaggtgcactgcttatttgtaacaccttacgcttttccctctgaaacttatttgcggcaagttctaaggtcctccttccttaatttgcaggttgtctatattttggatcaagttccggccttggagcgtgagatgctcaagcgcataaaggagcaaggacttgatatcaaaccgcgtattcttattgttcgtatctccaataattgcgtttaaacttatgattgtgcaggatttgatctgttcaaatctaatgactgattttcttttttttttttttttccctcaggttactcggctgctgcctgatgcggttggtaccacttgtggtcagcggcttgagaaagtgtttggaacagagcattcacatattcttagggtcccctttaggaccgagaagggcatcgttcgcaaatggatctctcgctttgaagtctggccttacatggagacattcactgaggtgaagcaagctttctctattcatttttcaatcttccaatctgttttggcagcaatttttcacttactaacactttggctttcgctaaaacttcggattttattacattaggatgtggcaaaagaaattgctgcagaactgcaggcaaagccagatcttataatcggcaactacagcgagggcaaccttgctgcctccttgttggctcacaagttaggtgtaactcaggtctgtaatgtttgtcacctgttatttcaactttgcatttcctttcatttgcaactagaagttaagagttctctctcttttatcttttccgtctattttgccttctgcagtgcaccatagctcatgcgttggagaaaacaaaatatcctgattctgatatctacttgaagaaatttgatgaaaaataccatttctcagcccagtttactgccgatcttattgcaatgaatcacaccgatttcataatcaccagcactttccaggagatagcgggaaggtattacatcacaatggatttccgatatgattaaattagttaatttaatcctacttcattgtgtttgatcctaaaacttttctaaatttcccagcaaggacactgttggacagtacgagagccacatggctttcacgatgcctggattgtatagagttgttcacggcattgatgtgttcgatcccaaattcaacattgtgtcaccaggagctgatatgaatctctatttcccctacttcgagaaggaaaagcgattgacagcatatcaccctgaaattgaggagctgctgtttagcgatgttgagaatgacgaacacatgtatgttactaaactagcaatcctgctgcaaaattgtggctaattatgtaaaaaagtttttactgaatagatttgtgcttctatcaggtgtgtgctgaaggacaggaataagccaattatattcaccatggctagattggatcgagtgaagaacttaactggacttgtggagttgtacgccaagaacccacggctaagggagttggttaaccttgtcgtggttggtggagaccgaaggaaggaatccaaagatttggaagaacaggcagagatgaagaagatgtatgaacttataaagacgcacaatttaaacggccaattccgatggatttcttcccagatgaaccgcgtgaggaatggcgaactctacaggtacattgccgatactaggggagcttttgtgcagcctgcattttacgaggcttttggtttgactgttgttgaggccatgacctgtggtttgcctacgtttgcaactaatcacggtggtccagctgagatcatcgttcacgggaagtctggttttcacattgatccataccacggcgagcaggcagctgaacttctagctgatttctttgagagatgtaagaaagaaccttcacactgggaagccatttccgagggcggccttaagcgtatacaggagaagtaagcaagctgctactcttttcatttttgcaaaacctaccatgatcattattaagctcatttttgcaaaacctacttgttattctttgttgcttccttttccctgttttttgagccgaggttttatcgaaaacatgctttctaccttcacaaggtaggggtaaggtctgcgtttgttattattgttgttgttgattctctgcgaattaattaaaaggtacacatggcaaatctactcggatcggttgttgacactggctgctgtttatggattctggaagcatgtttccaaacttgatcgtcttgaaattcgtcgttatcttgaaatgttctatgctctaaaattccgcaaactggtgagtttcactgctttctgcactcttccaattgttagttgagtgcactcatttaaactgtagctaaagctgttgtaaatcttcagttaagcagctgctaatgaagtttttatcttttgtttttggttcaggctgaagctgtcccgttggctgttgagtaa

配列番号２５：ＮｔＳＵＳ４－Ｔのポリペプチド配列
MAERVLTRVHSLRERLDATLAAHRNEILLFLSRIESHGKGILKPHQLLAEFESIHKEDKNKLNDHAFEEVLKSTQEAIVLSPWVALAIRLRPGVWEYVRVNVNALIVEELTVPEYLQFKEELVNGTSNDNFVLELDFEPFTASFPKPTLTKSIGNGVEFLNRHLSAKMFHDKESMTPLLEFLRVHHYKGKTMMLNDRVQDLNTLQNVLRKAEEYLTTLSPETSYSVFEHKFQEIGLERGWGDNAERVLEMICMLLDLLEAPDSCTLEKFLGRIPMVFNVVILSPHGYFAQENVLGYPDTGGQVVYILDQVPALEREMLKRIKEQGLDIKPRILIVTRLLPDAVGTTCGQRLEKVFGTEHSHILRVPFRTEKGIVRKWISRFEVWPYMETFTEDVAKEIAAELQAKPDLIIGNYSEGNLAASLLAHKLGVTQCTIAHALEKTKYPDSDIYLKKFDEKYHFSAQFTADLIAMNHTDFIITSTFQEIAGSKDTVGQYESHMAFTMPGLYRVVHGIDVFDPKFNIVSPGADMNLYFPYFEKEKRLTAYHPEIEELLFSDVENDEHMCVLKDRNKPIIFTMARLDRVKNLTGLVELYAKNPRLRELVNLVVVGGDRRKESKDLEEQAEMKKMYELIKTHNLNGQFRWISSQMNRVRNGELYRYIADTRGAFVQPAFYEAFGLTVVEAMTCGLPTFATNHGGPAEIIVHGKSGFHIDPYHGEQAAELLADFFERCKKEPSHWEAISEGGLKRIQEKYTWQIYSDRLLTLAAVYGFWKHVSKLDRLEIRRYLEMFYALKFRKLAEAVPLAVE

配列番号２６：ＮｔＳＵＳ５－Ｓのポリヌクレオチド配列
atggcctcaacagttgctgatagcatgcctgatgctttgaaacaaagccggtatcatatgaagagatgcttcgctaggtgaacacccttcttttatgttttttcccctctacgtgtttatgtcaaatttccatgcataatgctaactacttttcttctttttgacttcaaaattggatgtgaaaggttcattgcaatgggaaggaggctaatgaagttgaaacatttaacagaagaaatagaagaaactattgaagacaaggcagaaagaaccaggattttggagggttcacttggaaaaattatgagttccacacaggtcagcaccatttaaccaacttagttgaacaggaaaaaaagaaaaagcaaaagagttattgcaaggcgtaacgattttctttgaaattttcaggaggcagctgttgttccaccttatgttgcttttgcagtaaggcacaatcctggcttctgggattatgtcaaagttaacgctgaaactctctctgtggaagctatttcagccagggaatatctcaaattcaaagagatgatctttgacgaagactggtaagtggaaaattgtatcattttaaagagaaacaattttgtaacatacaagaatagttttgatggttgaatgtgcaagcagggcaaaggatgataatgcactggaagtagattttggtgcttttgactactctaatcctcggttagccctttcctcttctgtcggaaatgggctcaactttatctcaaaagttctgtcttcaaagtttggtggaaagccagaggacgcccagcctttgcttgattacttactagctcttaatcatcaaggagaggtatgaaaatggactacctttgtttcttaaaggtattatataatgatgcgcgttataaagttcctttttaaattgaaactttgcagaatctaatgatcaatgagaatctgaatggtgttgctaagcttcaagcagcattgatagtagctgaagtttttgtatcttcctttcccaaagacacaccttataaagactttgagcataagtaagcttctcatatgcttccattgtcatatgcagtataccaatgacatgctaccgaaaagttgtttatgtttgtgacttgattatgaaaactctaggctcaaagaatggggctttgataaagggtggggtcacaatgcaggaagagtaagagagacaatgagactgctttccgagataatccaagcaccagatcccataaatatggagtcctttttcagcaagcttcctactacattcaacattgttatcttctccattcatggttactttggccaagcagatgtccttggtctgcccgatactggaggccaggtctacatatacagcaatttatctccttttgcctcatattgcttattagcgacacttgcatcattgaaatcagacttttacttcacaggttgtttatattctggatcaagtaagggctttagaggaggaaatgttacaaagaatcaagcagcaagggctaaacgtgaagcccaagattcttgtggtgagttttgcaaaaatatgcttagacaggttttgagattgatcggagaagggattaagatgatcaagatctttgtttcctgctttcatgatgtaaacaggtatctcgtctcataccagatgctcgagggacaacatgcaatcaggagatggaacctattcttaactcatcccattctcacatcctgagaattccattcaggactgagaaaggagttcttcgccaatgggtttctcggtttgatatctatccttacttggagaactatgccaaggcaagtcttctaacaaaattaccacctattcatacactttatttactttcttgaactaatcgtttggtttgtgacgtatatcattaggatgcttctgctaagatacttgagctcatggaaggtaaaccagacctcataattgggaactacactgatggaaatttagtggcatctctattggccaacaaacttggagttactcaggttccgtagctgatcatatgatcatattttctacattgtttcttgataattaaatggaaatcttattggatgataacattttagggaaccattgctcatgcattagagaaaactaagtatgaagattctgatgtgaagtggaagcagtttgatcccaagtaccacttttcttgccaatttactgccgatttattggcaatgaatgctgctgattttatcattaccagcacatatcaagaaatcgctggaaggttagcactgactctctcagtatatttggcaacttaatgaatttactgcagtggccaacactaaaagctatcattcgtccttcagcgaaactaggcctggacaatatgaaagtcacacagcatttaccatgccggggctttatagagctgtttcaggcatcaatgtatttgatccaaagttcaacattgctgctcctggggctgaacagtctacctatttccctttcactgagaaacagaaacgattcagcacatttcgtcctgctattaacgaattactttacagtaatgaggaaaacaatgagcacatgtaagtctaattgcccattttcctaatctaaccattgcttaaatcgttctgtttttaccggatgtgtggtacttatcagtaacatttttttttggatcagtggatttcttgcagaccggaaaaaaccaattatattttcaatggcgagatttgatacagtgaagaacctgtcaggcttgactgagtggtatgggaagaataagaagttgcggaacttggtaaaccttgttattgttgggggattcttcgatccatcaaaatcaaaagaccgggaggaagcagctgaaatcaagaagatgcatgaattgattgagaaataccagctcaagggacaaatgagatggatagcagctcaaactgataaatatcgaaatagtgagctataccgaactattgctgacactaagggagcttttgtccaaccggctttatatgaagcttttggactaaccgttattgaagcaatggattgtggattgcctacgtttgcaactaatcaaggtggacctgcagaaatcattgttgatggggtttcaggtttccatattgatccttacaatggggacgaatcaagcaagaaaatagctgatttctttgagaagtgtaaggttgattctaaatattggaacaggatatctgagggaggtctcaagcgcattgaagaatggtaacaaactagttccaagtttaaaaaatggaaaaaatgcttatcatgttatattttcgtggttttaagttctgcttcgatgcagttatacgtggaagatttatgcaaacaaagtgttgaatatgggatcaatctatggattttggagacaattcaatgtggggcaaaagcaggctaagcaaagatactttgagatgttttacaatcctctcttcaggaaattggtaggttgtatatgttgaatacaatttactaagatcctcaaaatgaccaagaaatatacattgactatgctacttttgtaatttcacaggccaaaagcgtgccgatcccacatgaagagccattgccacttgcaacatcagactctactcaatcccaagaattaaaactaccactaccagttccagcagcagtagctaaagttctgccattaacaaggcatgcttttaacttaattacttctctacctagagtaactggtaaagtggatgtcaagtga

配列番号２７：ＮｔＳＵＳ５－Ｓのポリペプチド配列
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配列番号２８：ＮｔＳＵＳ５－Ｔのポリヌクレオチド配列
atggcctcaactgttgctggtagcatgcctgatgctttgaaacaaagccgatatcatatgaagagatgcttcgctaggtgaacacccttcttgttctttttgttttttccctctaccatttatgtcaaatttcaatgcataatgctaactactttttttctttttgacttcaaaattggacgtgaaaggttcattgcaatgggaaggaggttgatgaagctgaaacatttaacagaagaaatagaaaaaactattgaagacaaggcagaaagaaccaagattttggagggttcacttggaaaaattatgagttccacacaggtcagcaccatttaaccaacttaattgaataggaagaaaaaaaaaagcaaaagagttattgcaaggcgtaacgatttcctttgaaattttcaggaggcagctgttgtcccaccttatgttgcttttgcagtaaggcacaatcctggcttctgggattatgtcaaagttgacgctgaaactctctctgtggaagctatttcagccagggactatctcaaattcaaagagatgatctttgatgaagattggtaactggaagattgtatcattttaaagaaacaattttttaatattcaagattagttttgatggttgaatgtgcaagcagggcaaaggatgaaaatgcactcgaagtagattttggtgcttttgactactctaatcatcggttagccctttcctcttctgtcggaaatgggctaaacttcatctcgaaagttttgtcttcaaagtttggtggaaaggcagaagatgcccagcctttgcttgattacttactagctcttaatcatcaaggagaggtatggaaatggactaccttcctttcttaaggaattatataatgatgtatgttataaagatcctttttaaacattgacactttgcagaatctaatgatcaatgagaatctgaatggcgtctctaagcttcaagcagcattgatagtagctgaagtttttgtatcttcctttcccaaagacacaccttataaagactttgagcataagtaagcttttcaaacgcttctgttatcatatgcaatataccaagaatatgttgccttttgaaaagttgtttatgtttatgacttgataatgaaaatactaggctcaaagaatggggctttgagaaagggtggggtcacaatgcaggaagagtaagagagacaatgagactgctttccgagataatccaagcgccagatcccataaatatggagtcctttttcagcaggcttcctactacattcaacattgttatcttctccattcatggttactttggccaagcagatgtccttggtttgcccgatactggaggccaggtttacatacacagcaatttatctccttttgcctcatatttacttattagcgacacttgcattattgaaatcacatttgtatttaacaggttgtttatattctggatcaagtaagagccttagaggaggaaatgttacaaagaatcaagcagcaagggttaaatgtgaagcccaagattcttgtggtgagttatgcaaaaatatgcgtagccaaggttttgaaattgttcagaggggattaagatgatcgagatatttgtttccttcttccattgatgtgtacaggtcactcgtctcattccagatgctcgagggactacatgcaatcaggagatggaacctatacttaactcgtcccattctcacatcctgagaattccattcaggacagagaaaggagttcttcgccaatgggtttctcggtttgatatctatccttacttggagaactatgccaaggcaagtctcctaccaaaattaccacctattcatacactttattcagttttttgagctaatcattctcatttgtcacgtatgtgattaggatgcttctgctaagatacttgagctcatggaaggtaaaccagacctcattattgggaactacactgatggaaatttagtggcatctctattggccaacaaacttggagttactcaggttctacagctgatcatttatctgatcagattttctacattgttttcttgataattaaacggaaatcttatgagattgtaacattttagggaaccattgctcatgcattagagaaaaccaagtatgaagattctgatgtcaagtggaagcagtttgattccaagtaccacttttcttgccaattcactgccgatttattggcaatgaatgctgctgattttatcattaccagcacatatcaagaaatcgcaggaaggttagcactgactctctcagtatatttggcaacttaatgaatgtactgcttgtggccaacactaaaagctattactcgtccttcagcgaaactaggcctggacaatatgaaagtcacacagcatttaccatgccggggctttatagagctgtttcaggcatcaatgtatttgatccaaagttcaacattgctgctcctggggctgaacagtctgcctatttccccttcactgagaaacagaaacgattcagcgcgtttcgtcctgctattgaggaactactttacagtaatgagcaaaacaacgagcacatgtaagtctaattgccccattttcctaatctaaccattgcttaaatgttctgtttttacttgatatgtggtacttatcagtgatattttttattggaacagtggatttcttgcagaccgtaaaaaaccaattatattttcaatggcaagatttgatacggtgaagaacttgtcaggcttgactgagtggtatgggaagaataagaagttgcggaacttggttaacctcgttatcgttgggggattcttcgatccatcaaaatcaaaagaccgggaggaagcagctgaaatcaagaagatgcatgaattgattgagaaatacaagctcaagggacaaatgagatggatagcagctcaaactgataaatatcaaaacagtgagctatatcgaactattgctgacactaaaggagctttcgtccaaccggctttatatgaagcttttggactaactgttattgaagcaatgaattgtggactgcctacatttgctactaatcaaggcggacctgcagaaatcattgttgatggggtttcaggcttccatattgatccttacaatggggatgaatcgagcaagaaaatagctgatttctttgagaagtgtaaggttgattctaaatattggaacaagatatgtggaggaggtctcaagcgcattgaagaatggtaa

配列番号２９：ＮｔＳＵＳ５－Ｔのポリペプチド配列
MASTVAGSMPDALKQSRYHMKRCFARFIAMGRRLMKLKHLTEEIEKTIEDKAERTKILEGSLGKIMSSTQEAAVVPPYVAFAVRHNPGFWDYVKVDAETLSVEAISARDYLKFKEMIFDEDWAKDENALEVDFGAFDYSNHRLALSSSVGNGLNFISKVLSSKFGGKAEDAQPLLDYLLALNHQGENLMINENLNGVSKLQAALIVAEVFVSSFPKDTPYKDFEHKLKEWGFEKGWGHNAGRVRETMRLLSEIIQAPDPINMESFFSRLPTTFNIVIFSIHGYFGQADVLGLPDTGGQVVYILDQVRALEEEMLQRIKQQGLNVKPKILVVTRLIPDARGTTCNQEMEPILNSSHSHILRIPFRTEKGVLRQWDASAKILELMEGKPDLIIGNYTDGNLVASLLANKLGVTQGTIAHALEKTKYEDSDVKWKQFDSKYHFSCQFTADLLAMNAADFIITSTYQEIAGSETRPGQYESHTAFTMPGLYRAVSGINVFDPKFNIAAPGAEQSAYFPFTEKQKRFSAFRPAIEELLYSNEQNNEHIGFLADRKKPIIFSMARFDTVKNLSGLTEWYGKNKKLRNLVNLVIVGGFFDPSKSKDREEAAEIKKMHELIEKYKLKGQMRWIAAQTDKYQNSELYRTIADTKGAFVQPALYEAFGLTVIEAMNCGLPTFATNQGGPAEIIVDGVSGFHIDPYNGDESSKKIADFFEKCKVDSKYWNKICGGGLKRIEEW

配列番号３０：ＮｔＳＵＳ６－Ｓのポリヌクレオチド配列
atggctactgcaccagccctaaatagatcagagtccatagctgatagcatgccagaggccttaaggcaaagccggtaccacatgaagaaatgttttgccaagtacatagagcaaggaaagaggatgatgaaacttcataacttgatggatgagttggagaaagtaattgatgatcctgctgaaaggaaccatgttttggaaggcttacttggctacatattatgcactacaatggtatagctagattcatatgtacttatgatgcccttatattgtttcctgatgtattactcttaaaaccttctttgatcaaatttacaggaggctgcagttgttcctccctacattgcctttgccacgagacagaatcctggattctgggaatatgtgaaagtgaatgctaatgatctttctgttgagggtattacagctacagaatacttgaaattcaaggaaatgatagttgatgaatgctggtatagtatacgttgcagcttatcataccttttgtggttttataacttcaatcagaaaactcatcagagttacctttgtgtgaacatgaaatgcagggcaaaagatgaatatgcactggaaattgattttggagcagtagacttctcaacgcctcgactgaccctatcctcttcaattggcaatggtctcagttatgtttccaagtttctaacttcaaagctaaatgctacctccgcgagtgcacagtgtctggttgactacttgctcactttgaatcatcaaggagatgtacgtcaacaaaaatcaaactccataagtaaacttgtcaactctaagaagaaaaaataggaaaagaagattcacgtaacaaattttctttatgttcaactgcagaaactgatgatcaatgagacactcagcactgtctcaaagcttcaggctgcactggttgtagcagaagcatctatttcctctttaccaacagatacaccatatgagagctttgagctaaggtgatttgttttttcctctacttccctccacttgtgccatgctacgtagtactaagtaacttcaattcttgtaaagattcaaacagtggggttttgagaaaggatggggtgatacagctgaaagggtcagcgacaccatgagaacactgtctgaggtgcttcaggcaccagatccattgaacattcagaagttctttggaagggttccaactgttttcaatattgtattgttctctgtccatggatactttggccaagcagatgttcttggcttgccagacactggtggtcaggtaagcatttaatagcttttacatttaacttctatgcattgacaataaaataatttttaacagtttgaccacttctgctcttgttcaacaggtagtttatgttttggatcaagttgtagcttttgaagaagaaatgctacaaagaattaaacagcaggggctcaatattaagcctcaaattcttgtggtgagttcctagacaatcgacgtgactatgcaattatgtagaggctgtttagaaaagttaatatcatatgttgattgcacagttaacccgactgattccggatgcaaaaggaacaaagtgcaaccaggaactagaaccaatcaagaatacaaaacattcacacatcctcagagttccatttaggacagaaaaaggagtgcttaatcaatgggtttcacgatttgatatctatccatatctggagagatatactcaggtatgtatttttatatcaaccttgctcatcaaagatgtgttgtttcctcaattccatttttccccttggcaaaaggatgctgctgacaaaatcgtcgagctaatggaaggcaaacctgatctaatcattggtaactacactgatgggaatctagtggcttcactaatggctagaaaacttgggataactctggtaacttttcttaatcatatttgatgttgcttcttctccaagttagttcttaatctccactgacctagaccatctttgcaacagggaactattgctcatgctttggagaagacaaaatatgaagactctgacataaaattgaaggaactcgatccgaagtaccacttctcttgccaattcacagctgatttgattgcaatgaattcagcagatttcattatcactagcacataccaagaaatagctggaaggtaagaattagagctaataagtaatgcattcatatgtatttcagcatcgctctttcaccatcatcgaatacacaccactactcagtaaatgtatttgctcaaaagtttgcaacttaatggatctcattcttgaatgcttcaacatatgcagcaaagataaaccaggacagtatgagagccatagtgcatttacccttccagggctttacagagttgcttcaggtatcaatgtctttgatccaaaatttaatattgctgcacctggggcagaccagtcggtgtatttcccttacacagaaaagcagaagcgtttgactgctttccgccctgccattgaggaactgctttttagtaaagtggacaatgacgagcacgtgtaagtctaagtgttaaacttcagcttagtgcctagaacatcccactgctctatgtattgatgtttcacttgtttcaaacagtggatatttagaagacagaaagaaacctatcctgtttaccatggcaaggctggacacagtgaagaacacatctggactaacagaatggtatggcaagaacaagaggctcagaagcttagttaaccttgttgtggttggtggttcctttgatcctacaaaatccaaggatagggaagaagcagctgaaataaaaaagatgcacatgctgatagagaaataccagcttaagggtcagattagatggatagcagctcagactgacagatacagaaatagtgaactctaccgcacaatagcagattccaaaggagcttttgtgcagcctgcattgtatgaagcatttggtctaacagtcattgaggcaatgaactgtggattaccaacctttgctaccaaccaaggtggccctgctgagattattgttgatggggtctcaggctttcatattgatccaaataatggggatgaatcaagcaacaaaattgccaactttttccaaaaatgcagggaggatcctgagtattggaacaggatttcagtccagggtctaaaccgtatatatgaatggtaactcacagataagccattcaaattgcaaagaggcacatatcttgcagaaaatttcttaatccttaaatcctaattttttgcagttacacatggaagatctatgcaaacaaggtattgaatatggggtccatctatactttttggaggacattgtacagagatcagaaacaagcaaagcaaagatacatcgagactttctacaatcttgagtttaggaacttggtatagtgctgcatgacattgacagtataccacaaacatctttatgagatgaattacttttaataaaattgtttttaacctttgcttccttaatggcacttattgcaggtaaaaaatgtgcctatcagaaaggacgaaacaccacaaggaccaaaggagagggagaaagttaagccacagatatcacaaaggcatgctctaaagcttttgcctacagtttttcaagagaccctagtatattctagtactaaattagaattatacagcatgcagcttttgctgttcacctttctaaatcaccagttgtgtcaatcaagttgacaaaatcaataaattgggattttccctttcctatgcttgattgttattactcctactttgtttatggtagtcttccttcattgttttctcctgtacttcttttactacaactgtactgacatactaattatttctgtgtaccaggcgctcacaatcaaggttgcagaagtaagattagataaaattgctactgcatga

配列番号３１：ＮｔＳＵＳ６－Ｓのポリペプチド配列
MATAPALNRSESIADSMPEALRQSRYHMKKCFAKYIEQGKRMMKLHNLMDELEKVIDDPAERNHVLEGLLGYILCTTMEAAVVPPYIAFATRQNPGFWEYVKVNANDLSVEGITATEYLKFKEMIVDECWAKDEYALEIDFGAVDFSTPRLTLSSSIGNGLSYVSKFLTSKLNATSASAQCLVDYLLTLNHQGDKLMINETLSTVSKLQAALVVAEASISSLPTDTPYESFELRFKQWGFEKGWGDTAERVSDTMRTLSEVLQAPDPLNIQKFFGRVPTVFNIVLFSVHGYFGQADVLGLPDTGGQVVYVLDQVVAFEEEMLQRIKQQGLNIKPQILVLTRLIPDAKGTKCNQELEPIKNTKHSHILRVPFRTEKGVLNQWVSRFDIYPYLERYTQDAADKIVELMEGKPDLIIGNYTDGNLVASLMARKLGITLGTIAHALEKTKYEDSDIKLKELDPKYHFSCQFTADLIAMNSADFIITSTYQEIAGSKDKPGQYESHSAFTLPGLYRVASGINVFDPKFNIAAPGADQSVYFPYTEKQKRLTAFRPAIEELLFSKVDNDEHVGYLEDRKKPILFTMARLDTVKNTSGLTEWYGKNKRLRSLVNLVVVGGSFDPTKSKDREEAAEIKKMHMLIEKYQLKGQIRWIAAQTDRYRNSELYRTIADSKGAFVQPALYEAFGLTVIEAMNCGLPTFATNQGGPAEIIVDGVSGFHIDPNNGDESSNKIANFFQKCREDPEYWNRISVQGLNRIYECYTWKIYANKVLNMGSIYTFWRTLYRDQKQAKQRYIETFYNLEFRNLVKNVPIRKDETPQGPKEREKVKPQISQRHALKLLPTVFQETLALTIKVAEVRLDKIATA

配列番号３２：ＮｔＳＵＳ６－Ｔのポリヌクレオチド配列
atggctactgcaccagccctgaaaagatcagagtccatagctgatagcatgccagaggccttaaggcaaagccggtaccacatgaagaaatgttttgccaagtacatagagcaaggcaagaggatgatgaaacttcataacttgatggatgaattggagaaagtaattgatgatcctgctgaaaggaaccatgttttggaaggcttacttggctacatattatgtactacaatggtatagctagattcatatgtacttatgatgtccttatattgtttccggaggcattattcttaaatccttctttgatcaaatttgtaggaggctgcagttgttcctccctatattgccttcgccacgagacagaatcctggattctgggaatatgtgaaagtcaatgctaatgatctttctgttgagggtattacagctacagattacttgaaattcaaggaaatgatagttgatgaaagctggtatagaatactttgcagcttatcataccttttgtggttttataatttcaatcagaaaactcatcagagttacctttgtgtgaacatgacatgcagggcaaaagatgaatatgcactggaaattgattttggagcagtagacttctcaacgcctcgactgaccctatcctcttcaattggaaatggtctcagttatgtttccaagtttctaacttcaaagctaaatgctacctcagcgagtgcacagtgtctggttgactacttgctcactttgaatcaccaaggagatgtacgtcaacaaaaatcaaactccataagtaaacttgtcaactctaagaagtaaaaataggaaaagaagattcatgtaacaaattttctttatgttcaactgtagaaactgatgatcaatgagacactcggcactgtctcaaagcttcaggctgcactggttgtagcagaagcatctatttcctccttaccaacagatacaccataccagagctttgagctaaggtgatttgttttttcctctacttccttccacttttggtgtgctacatagtactaagtaacttcaattcttgtaaagattcaaacagtggggttttgagaaaggatggggtgatacagctgaaagggtccgcgacaccatgagaacactttctgaggtacttcaggcgccagatccattgaacattgagaagttctttgggagggttccaactgttttcaatattgtattgttctctgttcatggatactttggccaagcaaatgttcttggcttgccagacacaggtggtcaggtaagcatctaatagcttttacatttaacttctatgcattgacaataaaataacttctacactaccaaataatttttgaaagtttgaccacttcggctcttgttcaacaggtggtttatgttttggatcaagttgtagcttttgaagaagaaatgctccaaagaattaaacagcaggggctcaatattaagcctcaaattcttgtggtgagctcctagacaatgacgtgactatgcaattaagtagaggctgtttagaaaagttaatatcatatgttgattgcacagttaacccgactgattccggacgccaaaggaacaaagtgcaaccaggaactagaaccaatcaagaatacaaaacattcacacatcctcagagttccatttaggacagaaaaaggagtgcttaatcaatgggtttcacgatttgatatctatccatatctggagagatatactcaggtgtgtatttttatatcaaccctgctcatcaaagatgtgttgtttcctcaattccatttttcgccttgacaaaaggacgctgctgacaaaatcatcgagctaatggaaggcaaacctgatctaatcattggtaactacactgatgggaatctagtggcttctctaatggctagaaagcttgggataactctggtaacttttcttatcatatttgatgttgtttcttctccaagttggttcttaatgtcaactaacccagaccatctttgtaacagggaactattgctcatgctctggagaagacaaaatatgaagactctgacatcaaattgaaggaactcgatccgaagtaccacttttcttgccaattcacagctgatttgattgcaatgaattcagcagatttcattatcacaagcacatatcaagaaatagccggaaggtaagaattggaactacggaagcagagagctaataagtagtgcactcatatatttcagcatcgctctttcgcataatcgaatacacaccactactcagtaaatgtacttgctcaaaagtttacaagtttatggatcttattcttgaatgcttcaacatatgcagcaaagataggccaggacagtatgagagccatagtgcatttacccttccagggctttacagagttgcttcaggcatcaatgtctttgatcctaaatttaatattgctgcacctggggcagaccaatcggtgtatttcccttacacagaaaagcagacgcgtttgactgctttccgccctgccattgaggaactgctttttagtaaagtggacaatgacgagcacatgtaagtcttagtgttaaacttcagctttcagcttagtgcctagaacattccactggctctatgtattaatgtttcacttgtttcaaacacagtggatatttagaagacagaaagaaacctatcctgtttaccatggcaaggctggacacagtgaagaacacatctggactaacagaatggtatggcaagaacaagaggctcagaagcttagttaaccttgttgtggttggtggttcctttgatcctacaaaatccaaggatagagaagaagcagctgaaataaaaaagatgcacatgctgatagagaaataccagcttaagggtcagatcagatggatagcagctcagactgacagatatagaaacagtgaactctaccgcacaatagcagattccaaaggagcttttgtgcagcctgcattatatgaagcatttggtctaacagtcattgaggcaatgaactgtggattaccaacctttgctaccaaccaaggtggccctgctgagattattgttgatggggtctcaggctttcatattgatccaaataatggggatgaatcaagcaacaaagttgccaactttttccaaaaatgcagggaggatcctgagtattggaacaggatttcagtccagggtctaaaccgtatatatgaatggtaactcacagataagccattcaaattgcaaagaggcacatatcttgctgaaaatttcttaatcctttaatcctaaaattttgcagttacacatggaagatctatgcaaacaaggtattgaatatggggtccatctatactttttggaggacattgtacagagatcagaaacaagcaaagcaaagatacatcgagactttctacaatcttgagtttaggaacttggtatagtgctgcatgacattgacagtataccacaaacatctttatgagatgaattacttttaataaaattgtttttaacctttgcctccttaatgacacttattgcaggtaaaaaatgtgcctatcagacaggacgaaacaccacaaggaccaaaggagaggagggagaaagttaagccacagatatcacaaaggcatgctctaaagcttttgcctatagtttttcaggagaccctagtatattctagtactaaattagaattatacagcatgcagcttgcttctgctgttcacctttctaaatcaccagttatgtcaatcaagttgacaaaatcaataaattcggcttttccctttcctatgcttgattgttattactcctacttcgtttatggtagtcttccttcattgttttctcctgtacttcttttactacaactgtactga

配列番号３３：ＮｔＳＵＳ６－Ｔのポリペプチド配列
MATAPALKRSESIADSMPEALRQSRYHMKKCFAKYIEQGKRMMKLHNLMDELEKVIDDPAERNHVLEGLLGYILCTTMEAAVVPPYIAFATRQNPGFWEYVKVNANDLSVEGITATDYLKFKEMIVDESWAKDEYALEIDFGAVDFSTPRLTLSSSIGNGLSYVSKFLTSKLNATSASAQCLVDYLLTLNHQGDKLMINETLGTVSKLQAALVVAEASISSLPTDTPYQSFELRFKQWGFEKGWGDTAERVRDTMRTLSEVLQAPDPLNIEKFFGRVPTVFNIVLFSVHGYFGQANVLGLPDTGGQVVYVLDQVVAFEEEMLQRIKQQGLNIKPQILVLTRLIPDAKGTKCNQELEPIKNTKHSHILRVPFRTEKGVLNQWVSRFDIYPYLERYTQDAADKIIELMEGKPDLIIGNYTDGNLVASLMARKLGITLGTIAHALEKTKYEDSDIKLKELDPKYHFSCQFTADLIAMNSADFIITSTYQEIAGSKDRPGQYESHSAFTLPGLYRVASGINVFDPKFNIAAPGADQSVYFPYTEKQTRLTAFRPAIEELLFSKVDNDEHIGYLEDRKKPILFTMARLDTVKNTSGLTEWYGKNKRLRSLVNLVVVGGSFDPTKSKDREEAAEIKKMHMLIEKYQLKGQIRWIAAQTDRYRNSELYRTIADSKGAFVQPALYEAFGLTVIEAMNCGLPTFATNQGGPAEIIVDGVSGFHIDPNNGDESSNKVANFFQKCREDPEYWNRISVQGLNRIYECYTWKIYANKVLNMGSIYTFWRTLYRDQKQAKQRYIETFYNLEFRNLVKNVPIRQDETPQGPKERREKVKPQISQRHALKLLPIVFQETLVYSSTKLELYSMQLASAVHLSKSPVMSIKLTKSINSAFPFPMLDCYYSYFVYGSLPSLFSPVLLLLQLY

Claims (15)

  1. 植物細胞であって、
    （ｉ）配列番号５（ＮｔＩＮＶ４－Ｓ）に対して少なくとも８１％の配列同一性、または配列番号７（ＮｔＩＮＶ４－Ｔ）に対して少なくとも６２％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、本質的にそれからなるポリヌクレオチド；
    （ｉｉ）（ｉ）に記載した前記ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
    （ｉｉｉ）配列番号６（ＮｔＩＮＶ４－Ｓ）に対して少なくとも８５％の配列同一性、または配列番号８（ＮｔＩＮＶ４－Ｔ）に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなるポリペプチド；または
    （ｉｖ）（ｉ）に記載した前記単離ポリヌクレオチドを含む構築物、ベクター、または発現ベクターを含み、
    前記植物細胞が、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現または活性が改変されていない対照植物細胞と比較して、（ａ）前記ポリヌクレオチドの発現または活性あるいは（ｂ）前記ポリヌクレオチドまたは前記ポリペプチドの発現または活性を調節する少なくとも一つの改変を含む、植物細胞。
  2. 前記調節された発現または調節された活性は、前記対照植物細胞を含有する対照植物の乾燥葉の一つまたは複数の還元糖のレベルと比較して、前記植物細胞を含む植物の乾燥葉の前記一つまたは複数の還元糖のレベルを調節し、好適には、前記還元糖がグルコースもしくはフルクトース、またはそれらの組み合わせである、請求項１に記載の植物細胞。
  3. 中間位置の乾燥葉が、対照の中間位置の乾燥葉と比較して、少なくとも約６３％のグルコースレベルを減少させた、または
    中間位置の乾燥葉が、対照の中間位置の乾燥葉と比較して、それぞれ、少なくとも約４３％のフルクトースレベルを減少させた、または
    中間位置の乾燥葉が、対照の中間位置の乾燥葉と比較して、それぞれ、少なくとも約６３％のグルコースレベルを減少させ、かつ少なくとも約４３％のフルクトースレベルを減少させた、請求項２に記載の植物細胞。
  4. 前記少なくとも一つの改変が前記ポリヌクレオチドにおける遺伝子変異であり、前記植物がＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍである、請求項１～３のいずれかに記載の植物細胞。
  5. ＮｔＳＵＳポリヌクレオチドまたはそれによってコードされたポリペプチドに少なくとも一つの改変をさらに含み、
    好適には、前記ＮｔＳＵＳポリヌクレオチドまたはそれによってコードされたポリペプチドは、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、ＮｔＳＵＳ４－Ｓ、ＮｔＳＵＳ４－Ｔまたはそれらの二つ以上の組み合わせからなる群から選択され、
    より好適には、前記ＮｔＳＵＳポリヌクレオチドまたはそれによってコードされたポリペプチドは、ＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－ＴおよびＮｔＳＵＳ４－Ｓまたはそれらの二つ以上の組み合わせからなる群から選択される、請求項１～４のいずれかに記載の植物細胞。
  6. 請求項１（ｉ）に記載のＮｔＩＮＶ４ポリヌクレオチド、または請求項１（ｉｉ）もしくは請求項１（ｉｉｉ）に記載のＮｔＩＮＶ４ポリペプチド中の少なくとも一つの突然変異、および前記ＮｔＳＵＳポリヌクレオチドもしくはそれによってコードされるポリペプチド中の少なくとも一つの突然変異を含む、請求項５に記載の植物細胞。
  7. 請求項１～６のいずれかに記載の植物細胞を含む、植物またはその一部。
  8. 請求項７に記載の植物もしくはその部分に由来するか、またはそれから得られた植物材料、乾燥植物材料、または均質化された植物材料であって、好適には、
    前記植物材料が、バイオマス、種子、茎、花、もしくは葉、またはそれらの二つ以上の組み合わせからなる群から選択され、または、
    前記乾燥植物材料が、熱風乾燥（ｆｌｕｅ－ｃｕｒｅｄ）植物材料、日光乾燥植物材料もしくは空気乾燥植物材料、またはそれらの二つ以上の組み合わせからなる群から選択される、植物材料、乾燥植物材料または均質化された植物材料。
  9. 請求項１～６のいずれかに記載の植物細胞、請求項７に記載の植物の部分、または請求項８に記載の植物材料を含む、たばこ製品。
  10. 請求項７に記載の植物を生成するための方法であって、
    （ａ）請求項１～６のいずれかに記載の少なくとも一つの改変を含む植物細胞を提供する工程と、
    （ｂ）前記植物細胞を植物に増殖させる工程と、を含む、方法。
  11. 工程（ａ）において、前記少なくとも一つの改変がゲノム編集によって導入され、好適には、
    前記ゲノム編集が、ＣＲＩＳＰＲ媒介性ゲノム編集、ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介性変異誘発、化学的変異誘発または放射線変異誘発、相同組換え、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発およびメガヌクレアーゼ媒介性変異誘発から選択される、請求項１０に記載の方法。
  12. 工程（ａ）において、前記少なくとも一つの改変が、干渉ポリヌクレオチドを使用して、もしくは少なくとも一つの突然変異を導入することによって、またはその組み合わせで導入される、請求項１０または１１に記載の方法。
  13. 対照植物材料と比較して変化した量の還元糖を有する乾燥植物材料を生成するための方法であって、
    （ａ）請求項７に記載の植物もしくはその部分、または請求項８に記載の植物材料を提供する工程と、
    （ｂ）前記植物材料をそこから収穫する工程と、
    （ｃ）前記植物材料を乾燥処理する工程と、を含む、方法。
  14. 液体たばこ抽出物を生産する方法であって、
    （ａ）請求項１～４のいずれかに記載の植物細胞を含有する植物またはその一部から、第一のたばこ出発材料を調製する工程と、
    （ｂ）ＮｔＳＵＳポリヌクレオチドまたはそれによってコードされるポリペプチドに少なくとも一つの改変を含む植物細胞を含有する植物またはその一部から、第二のたばこ出発材料を調製する工程であって、
    好適には、前記ＮｔＳＵＳポリヌクレオチドまたはそれによってコードされたポリペプチドは、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、ＮｔＳＵＳ４－Ｓ、ＮｔＳＵＳ４－Ｔまたはそれらの二つ以上の組み合わせからなる群から選択され、または
    より好適には、前記ＮｔＳＵＳポリヌクレオチドまたはそれによってコードされたポリペプチドは、ＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－ＴおよびＮｔＳＵＳ４－Ｓまたはそれらの二つ以上の組み合わせからなる群から選択される、調製する工程と、
    （ｃ）第一の抽出温度で、前記第一のたばこ出発材料を加熱する工程と、
    （ｄ）第二の抽出温度で、前記第二のたばこ出発材料を加熱する工程と、
    （ｅ）加熱中に、前記第一のたばこ出発材料および第二のたばこ出発材料から放出された揮発性化合物を回収する工程と、
    （ｆ）前記第一および第二のたばこ出発材料から放出された前記回収された揮発性化合物を組み合わせ、前記組み合わされた揮発性化合物から液体たばこ抽出物を形成する工程と、を含む、方法。
  15. 請求項１４に記載の方法によって製造、取得、または取得可能な液体たばこ抽出物。
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