JP6302407B2 - 植物におけるβ−ダマセノンの調節 - Google Patents
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Description
対応するABA4、NeSyおよびNCED2遺伝子はニコチアナ・タバカムからクローニングおよび配列決定されており、これら遺伝子の発現調節の影響が調べられている。NeSyおよびNCED2ポリヌクレオチドによってコードされる酵素はカロテノイド生合成経路の成分であると考えられ、植物中のNeSyポリヌクレオチドの発現の上方制御、およびNCED2ポリヌクレオチドの発現の下方制御は、カロテノイド含量を増大することが分かっている。しかしながら、改変されたβ−ダマセノンの生成は検出されなかった。驚くことに本発明者らは、ABA4ポリヌクレオチドの発現の増大はカロテノイド含量を増大しただけでなく、タバコ植物から調製した乾燥処理タバコの点火後に形成されたエアロゾル中の、β−ダマセノン含量も有意に増大したことを発見した。NeSyポリヌクレオチドは、ABA4ポリヌクレオチドとカロテノイド生合成経路中の同地点で作用する酵素をコードするので、この発見はより一層驚くべきものであったが、NeSyポリヌクレオチドはβ−ダマセノンレベルに対して有意な影響がないことが分かった。如何なる特定の理論によっても縛られることを望むものではないが、この発見は、ABA4ポリヌクレオチドによってコードされるネオキサンチンシンターゼは、ニコチアナ・タバカムでのβ−ダマセノン合成において中心的役割を果たすことを示唆する。これによって、β−ダマセノンレベルが調節され、したがって改変された香味プロファイルを有する植物を生成することができる。カロテノイド含量が調節された植物を工学的に作製することができる。このような植物は、消費者に対する栄養学的利点を有し得る。さらに、植物のカロテノイド含量の調節を使用して、カロテノイド生合成を阻害する除草剤に耐性がある植物を作製することができ、これによって現在これらの化合物に敏感である穀物用の除草剤としてのカロテノイド阻害剤の用途が広がり得る。有利なことにこれらの変化が、業界による容認および植物収率最大化などに関する重要な基準である、植物の外観を実質的に変えることはない。
一態様では、ネオキサンチンシンターゼをコードし配列番号1または配列番号6と少なくとも60%の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる単離ポリヌクレオチドを提供する。
別の態様では、ポリヌクレオチドによってコードされる単離ポリペプチドを提供する。
別の態様では、配列番号2と少なくとも66%の配列同一性または配列番号7と少なくとも60%の配列同一性を有する単離ポリペプチドを提供する。
別の態様では、本明細書に記載される単離ポリヌクレオチド(複数可)、ポリペプチドまたは構築物、ベクターまたは発現ベクターを含み、対照または野生型植物と比較して、ネオキサンチンシンターゼの発現または活性が調節された、突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物細胞を提供する。
一実施形態では、突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物は植物細胞を含む。
一実施形態では、リコペンβシクラーゼまたは9−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼまたはこれらの組合せの発現または活性も、植物において調節される。
別の態様では、植物中のβ−ダマセノン含量を調節するための方法であって、(i)植物におけるネオキサンチンシンターゼ、好ましくは本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を含むネオキサンチンシンターゼの発現または活性を調節するステップと、(ii)ステップ(i)で得られた突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物の少なくとも一部中のβ−ダマセノン含量を測定するステップと、(iii)ネオキサンチンシンターゼの発現または活性が調節されていない対照植物と比較して、β−ダマセノン含量が変化した、突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物を同定するステップとを含む方法を提供する。
別の態様では、ネオキサンチンシンターゼの発現またはそれによってコードされるタンパク質の活性が増大しており、植物の緑葉ルテイン含量もしくはβ−カロテン含量または組み合わせたルテインおよびβ−カロテンの含量が、ネオキサンチンシンターゼの発現または活性が増大していない対照植物より高く、乾燥処理植物材料のエアロゾル中のβ−ダマセノン含量が対照植物由来のエアロゾルより少なくとも10%高く、好ましくは(i)植物の緑葉ルテイン含量が少なくとも約18mg/100gであり、(ii)植物のβ−カロテン含量が少なくとも約12mg/100gであり、(iii)植物由来の葉バイオマスの加熱時のエアロゾル中のβ−ダマセノン含量が少なくとも約1ng/mgである、突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物を提供する。
別の態様では、本明細書に記載される植物細胞、植物の少なくとも一部、または植物材料を含むタバコ製品を提供する。
別の態様では、β−ダマセノンを生成するための方法であって、(a)本明細書に記載の植物、植物材料、またはタバコ製品の少なくとも一部を提供するステップと、(b)それを加熱してβ−ダマセノンを含むエアロゾルを生成するステップとを含む方法を提供する。
さらなる態様は以下のものを含む。
1つ以上の制御配列に作動可能に連結した、1つ以上の本明細書に記載される単離ポリヌクレオチドを含むキメラ遺伝子。
本明細書に記載される植物材料、バイオマス、種子もしくは葉を取り込んだ、またはこれらを利用した消耗品。
本明細書に記載される単離ポリヌクレオチド、キメラ遺伝子、ポリヌクレオチド構築物、二本鎖RNA、コンジュゲートまたは発現ベクターなどを含む細胞株。細胞内での本明細書に記載される1つ以上のポリヌクレオチドの発現、またはそれによってコードされる1つ以上のポリペプチドの活性を調節するための方法であって、本明細書に記載されるキメラ遺伝子、ポリヌクレオチド構築物、二本鎖RNA、コンジュゲートまたは発現ベクターを投与するステップを含む方法。
対照植物と比較した植物の少なくとも一部中のカロテノイド含量とβ−ダマセノン含量、またはカロテノイド含量もしくはβ−ダマセノン含量を調節するための方法であって、本明細書に記載される1つ以上のポリヌクレオチドの発現またはそれによってコードされるタンパク質の活性を調節する作用物質の使用を含む方法。
本出願の範囲内で使用する技術用語および表現は、植物および分子生物学の関連分野においてそれらに通常施用する意味を一般に示す。全ての以下の用語の定義は、本出願の全容に適用する。語句「含む」は他のエレメントまたはステップを除外するものではなく、不定冠詞「a」または「an」は複数形を除外するものではない。1つのステップが、特許請求の範囲に列挙する数個の特徴の機能を果たすことができる。所与の数値または範囲の文脈での用語「約」、「本質的に」および「およそ」は、所与の数値または範囲の20%以内、10%以内、または5%、4%、3%、2%もしくは1%以内にある数値または範囲を指す。
用語「単離」はその本来の環境から得られた任意の実体を指すが、この用語は如何なる精製度も意味しない。
「発現ベクター」は、核酸の発現を可能にする核酸成分の組合せを含む核酸媒体、例えばABA4ポリヌクレオチド、核酸構築物および核酸コンジュゲートなどである。適切な発現ベクターには、環状、二本鎖核酸プラスミドなどの染色体外複製が可能であるエピソーム、直鎖状二本鎖核酸プラスミド、および任意の起源の機能上同等な他の発現ベクターなどがある。発現ベクターは、以下に定義するような、上流に位置し核酸に作動可能に連結した少なくとも1個のプロモーター、核酸構築物または核酸コンジュゲートを含む。
「プロモーター」は、典型的には上流に位置し二本鎖DNA断片に作動可能に連結した核酸エレメント/配列を指す。プロモーターは対象の固有遺伝子と隣接した領域に完全に由来してよく、または異なる固有プロモーター由来の異なるエレメントまたは合成DNAセグメントで構成され得る。
「植物細胞」は、植物の構造および生理的単位を指す。植物細胞は、細胞壁がないプロトプラスト、単離単細胞もしくは培養細胞、または植物組織、植物器官、もしくは完全体植物などだけには限られないが、これらを含めた高度に編成された単位の一部の形であってよい。
用語「植物材料」は、バイオマス、葉、茎、根、花もしくは花部分、果実、花粉、卵細胞、接合子、種子、断片、分泌物、抽出物、細胞もしくは組織培養物、または植物の任意の他の部分もしくは産物を含めた、植物から入手可能な任意の固体、液体または気体組成物、またはこれらの組合せを指す。一実施形態では、植物材料は、バイオマス、種子または葉を含むか、またはこれらからなる。別の実施形態では、植物材料は葉を含むか、または葉からなる。
本明細書で使用する用語「株」または「品種改良株」は、植物品種改良中に使用される植物群を示す。1つ以上の対象の形質に関して個体間でほとんど違いを示さないので、株と品種は区別可能であるが、他の形質に関しては個体間である程度の違いが存在し得る。
用語「調節」は、ポリペプチドの発現または活性の低減、阻害、増大、または他の場合それに影響を与えることを指すことができる。この用語は、ポリペプチドをコードする遺伝子の活性の低減、阻害、増大、または他の場合それに影響を与えることも指すことができ、転写活性の調節だけには限られないが、それを含むことができる。
本明細書で使用する用語「阻害」または「阻害された」は、ポリペプチド活性、転写活性およびタンパク質発現などに限られないが、これらの量または活性の約98%〜約100%の低減、または少なくとも98%、少なくとも99%、ただし特に100%の低減を指す。
本明細書で使用する用語「増大」または「増大した」は、ポリペプチド活性、転写活性およびタンパク質発現などに限られないが、これらの量または活性の約5%〜約99%の増大、または少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%以上の増大を指す。
一実施形態では、配列表中に示す任意のポリヌクレオチドを含めた、本明細書に記載される任意の配列と少なくとも60%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる単離ポリヌクレオチドを提供する。単離ポリヌクレオチドは、それと少なくとも60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなることが適切である。
ポリペプチドは、成熟タンパク質、または未熟タンパク質、または未熟タンパク質由来のタンパク質であってよい。ポリペプチドは直線形であってよく、または知られている方法を使用して環化することができる。典型的にはポリペプチドは、少なくとも10個、少なくとも20個、少なくとも30個、または少なくとも40個の隣接アミノ酸を含む。
別の実施形態では、リコペンβシクラーゼをコードし配列番号9と少なくとも約87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる単離NtNeSyポリペプチドを提供する。
ポリペプチド配列の断片も本明細書で開示し、このような断片は、完全長配列の活性を適切に保持している。
本明細書で使用する用語「非天然型」は、例えばポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは植物などの実体が自然界で見られないことを意味し、したがって自然界に存在する実体は明らかに除外する。このような非天然型実体は、人間によって構造的に修飾、合成または操作することができる。特定の実施形態では、突然変異は、遺伝子またはタンパク質などのヌクレオチド配列またはポリペプチドに本来存在する天然突然変異ではない。
抗体をアッセイ中で使用して、in vitroまたはin vivoのいずれかで、ポリペプチドまたは断片の存在を検出することもできる。イムノアフィニティークロマトグラフィーによりポリペプチドまたは断片を精製する際に、抗体を利用することもできる。
例示的な実施形態では、低分子干渉RNA分子は、本明細書に記載されるいずれか一つのポリヌクレオチド配列の、少なくとも12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、またはそれより多くの隣接ヌクレオチドと相補的な特異的アンチセンス配列を含む。
標的mRNA配列と、1つ以上のオーバーハングを含む干渉RNA分子の同一率を決定するとき、オーバーハング(複数可)を考慮することができる、またはできない。例えば、3’オーバーハング由来のヌクレオチドおよび二本鎖の5’または3’末端由来の最大2ヌクレオチドを、低分子干渉RNA分子の実質的な活性消失なしで修飾することができる。
干渉RNA分子は、1つ以上の5’または3’キャップ構造を含むことができる。干渉RNA分子は、干渉RNA分子のセンス鎖、アンチセンス鎖、もしくはセンス鎖とアンチセンス鎖の両方の3’末端に、または干渉RNA分子のセンス鎖、アンチセンス鎖、もしくはセンス鎖とアンチセンス鎖の両方の5’末端にキャップ構造を含むことができる。あるいは干渉RNA分子は、干渉RNA分子の3’末端と5’末端の両方にキャップ構造を含むことができる。用語「キャップ構造」は、エクソヌクレアーゼ分解から分子を保護し、細胞内での送達または局在化も容易にすることができる、オリゴヌクレオチドの一末端に組み込まれた化学的修飾を指す。
様々な実施形態が、1つ以上のNtABA4もしくはNtNeSyもしくはNtNCED2ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、または1つ以上のポリヌクレオチドを含む干渉RNA構築物を対象とする。
様々な実施形態が、1つ以上のNtABA4もしくはNtNeSyもしくはNtNCED2ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、または1つ以上の干渉RNA構築物を対象とする。
したがって様々な実施形態が、1つ以上のNtABA4もしくはNtNeSyもしくはNtNCED2ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、または自己アニーリングすることができる干渉RNAポリヌクレオチドをコードする干渉RNA構築物を対象とし、その中で構築物は、(a)1つ以上の本明細書に記載されるポリヌクレオチド、および(b)第一配列と同じ方向に位置する、第一配列の相補(例えば逆相補)配列を含む第二配列を含む。
様々な実施形態が、多数のポリヌクレオチド(複数可)コピーの(タバコ)植物ゲノムへの組み込みによりNtABA4もしくはNtNeSyもしくはNtNCED2ポリヌクレオチド(複数可)(またはその2つ以上もしくは3つ以上の組合せ)の発現レベルを調節するための方法であって、ポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターを含む発現ベクターで植物細胞宿主を形質転換することを含む方法を対象とする。
mRNAの翻訳を調節するための様々な発現ベクターは、配列がプロモーターに対してアンチセンス方向に位置する、ポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターを含むことができる。アンチセンスRNAポリヌクレオチドの長さは変わる可能性があり、約15〜20ヌクレオチド、約20〜30ヌクレオチド、約30〜50ヌクレオチド、約50〜75ヌクレオチド、約75〜100ヌクレオチド、約100〜150ヌクレオチド、約150〜200ヌクレオチド、および約200〜300ヌクレオチドであってよい。
個々の植物、植物細胞、または植物材料から調製した核酸を場合によってはプールして、突然変異誘発植物組織、細胞または材料由来の植物集団における突然変異のスクリーニングを促進することができる。1つ以上の次世代の植物、植物細胞または植物材料をスクリーニングすることができる。場合によってはプールする群のサイズは、使用するスクリーニング法の感度に依存する。
多型は当技術分野で知られている手段によって同定することができ、いくつかは文献中に記載されている。
他の実施形態では、ポリヌクレオチドの制御配列と結合する、ジンクフィンガータンパク質を選択することができる。より詳細には制御配列は、転写開始部位、開始コドン、エクソンの領域、エクソン−イントロンの境界、ターミネーター、または停止コドンを含むことができる。したがって本発明は、本明細書に記載される1つ以上のポリヌクレオチドの近辺またはその中でジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介突然変異誘発により生成される、突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物もしくは植物細胞、およびジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介突然変異誘発によりこのような植物もしくは植物細胞を作製する方法を提供する。タバコ植物にジンクフィンガータンパク質およびジンクフィンガーヌクレアーゼを送達するための方法は、メガヌクレアーゼの送達に関して以下に記載する方法と類似している。
対照植物と比較したβ−ダマセノン含量の変化は、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または約100%以上、例えば200%もしくは300%以上の変化であってよい。
適切には、植物の一部(例えば、葉)中のβ−カロテン含量は、収穫した植物(例えば、葉)材料の少なくとも約11.5mg/100g、適切には、少なくとも約12mg/100g、適切には、少なくとも約12.5mg/100g、適切には、少なくとも約13mg/100g、適切には、少なくとも約13.5mg/100g、適切には、少なくとも14mg/100g、適切には、少なくとも約14.5mg/100g、または適切には、少なくとも約15mg/100g以上である。
適切には、焼いたまたは加熱した葉のエアロゾル中のβ−ダマセノンレベルは、焼いたまたは収穫した植物(例えば、葉)材料の少なくとも約1ng/mg、適切には、少なくとも約1.05ng/mg、適切には、少なくとも約1.1ng/mg、適切には、少なくとも約1.15ng/mg、または適切には、少なくとも約2ng/mg以上である。
対照植物と比較した活性の増加は、約5%〜約100%、または少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または100%以上、例えば200%もしくは300%以上の増加であってよい。
対照植物と比較した活性の減少は、約5%〜約100%、または少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは100%の減少であってよい。
別の態様において、植物のβ−ダマセノン含量を調節する方法であって、(i)植物中のネオキサンチン合成酵素の発現または活性を調節し、好ましくは、ネオキサンチン合成酵素が、本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を含むステップと、(ii)ステップ(i)において得られた突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物の少なくとも一部もしくはそのエアロゾル中のβ−ダマセノン含量を測定するステップと、(iii)ネオキサンチン合成酵素の発現または活性が調節されていない対照植物と比較して、その中のβ−ダマセノン含量が変化した、突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物を同定するステップとを含む方法が提供される。適切には、前記突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物の外観は、対照植物と実質的に同じである。適切には、植物はタバコ植物である。適切には、β−ダマセノン含量は、タバコの葉を加熱乾燥した後に形成されるエアロゾルにおいて測定される。
対照植物と比較したネオキサンチン合成酵素の発現の減少は、約5%〜約100%、または少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは100%の減少であってよく、その減少は、転写活性もしくはタンパク質発現または両方の減少を含む。
対照植物と比較したβ−ダマセノン含量の増加は、約5%〜約100%、または少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは100%までまたはそれ以上、例えば200%もしくは300%以上の増加であってよい。
対照植物と比較したβ−ダマセノン含量の減少は、約5%〜約100%、または少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは100%までの減少であってよい。
本明細書に記載されるポリヌクレオチドおよび組換え構築物を使用して、対象の植物種、適切にはタバコにおいて、本明細書に記載される酵素の発現を調節することができる。
別の実施形態において、本明細書に記載される突然変異タバコ植物、トランスジェニックタバコ植物または非天然型タバコ植物の葉、好ましくは乾燥処理した葉を含むエアロゾル形成材料含有タバコを含めたタバコ製品について記載される。本明細書に記載されるタバコ製品は、無修飾タバコをさらに含むことができるブレンドタバコ製品であり得る。
本発明は、本明細書に記載される突然変異植物、非天然型植物またはトランスジェニック植物を栽培するステップと、栽培した植物から種子を採取するステップとを含む、種子を作製する方法も提供する。本明細書に記載される植物由来種子を、当技術分野において公知の手法によって条件を整え包装材料に詰めて、製造物を形成することができる。包装材料、たとえば紙および布は、当技術分野で周知である。種子の包装は、ラベル、例えば、中にある種子の性質が記載されている、包装材料に固定されたタグまたはラベル、包装に印刷されたラベル、を有することができる。
ニコチアナ・タバカム由来ABA4のクローニング
ABA4に相同なニコチアナ・タバカムコード配列は、異所的に発現される。その遺伝子は、A.サリアナABA4との配列相同性に基づいてニコチアナ・タバカムABA4(NtABA4)と呼ばれる。NtABA4は、ビオラキサンチンからトランス−ネオキサンチンの形成を触媒するネオキサンチン合成酵素の拡大「ファミリー」(extended "family")に属する遺伝子である。遺伝子産物は、AtABA4との類似性により、およびWoLFPSORT分析により、色素体に局在する可能性が極めて高い。663kbの完全長コード配列を同定し、PCR鋳型として葉K326 cDNAを使用して増幅し、pENTR Gatewayベクター(Invitrogen)にクローニングし、配列決定し、pK2WG7(Flanders Interuniversity Institute for Biotechnology、Gent、ベルギーから入手したGatewayベクター)に移入して、ニコチアナ・タバカムにおいて構成的に発現させる。NtABA4のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号1および配列番号2ならびに図2に説明される。NtABA4は、シロイヌナズナタンパク質AtABA4、Atlg67080とアミノ酸レベルで65%の同一性を示す。鋳型としてHicks BroadleafのgDNAから開始するPCR増幅により、1808bpのNtABA4ホモログを同定することができた。cDNAとgDNA配列とを比較することにより遺伝子構造を推測して、NtABA4が4つのイントロンおよび5つのエクソンを持つことを実証した(図3A)。K326およびHicks BL NtABA4アイソフォームの間で差異が存在する(図3B)。Hicks Broadleaf由来NtABA4アミノ酸配列は、6アミノ酸の差異および9位におけるセリン1つの欠失により、K326配列と97%の同一性を有する(図3C)。発現配列タグの比較によって示されるように、N末端に同一の特徴を有する発現配列タグ(AM824569)が、SNNタバコのNCBI低温ストレス配列ライブラリー中に同定されたので、NtABA4ゲノム配列は偽遺伝子ではない。タバコの工学的作製では、NtABA4 K326 cDNA配列が使用され、TN90において強力なウィルス性CaMV35Sプロモーターの制御下で構成的に発現される。
ニコチアナ・タバカム由来ネオキサンチン合成酵素(NeSy)のクローニング
NeSy(リコピンβ−シクラーゼ)は、ABA4のように、ビオラキサンチンからのネオキサンチン(シス−ネオキサンチン)の形成を触媒する(図1を参照のこと)。この酵素は、色素体に局在している可能性が高い(アラビドプシス・サリアナNeSyに対する相同性に基づく)。TGIデータベースにある利用可能な配列から始めて、K326 RNAから1482kbの完全長コード配列(図4を参照のこと)を増幅し、pENTR Gatewayベクター(Invitrogen)にクローニングし、配列決定し、GatewayベクターpK2WG7(Flanders Interuniversity Institute for Biotechnology、Gent、ベルギーから入手した)にサブクローニングして過剰発現させる。BACクローンが、同定される。このBACクローンに存在するゲノム配列は、NtNeSyがゲノム構造内にイントロンを全く持たず、タバコにおいて、単一コピー遺伝子である可能性が極めて高いことを示している。35S::NtABA4植物と比較するために、TN90においてCaMV35Sプロモーターの制御下にNtNeSy K326 cDNAを構成的に発現させる。
ニコチアナ・タバカム由来9−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼ(CED2)のクローニング
CED2(9−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼ)は、シス−ネオキサンチンのC25−アレニック−アポ−アルデヒド(apo-aldehyde)およびキサントキシンへの切断を触媒する(図1を参照のこと)。NtCED2は、シロイヌナズナAtNCED4と高い相同性を共有し、これはプラスト顆粒に存在し、葉の葉緑体においてネオキサンチンを切断する可能性が高い。タバコcDNA断片を、TGIデータベースで同定する。これから、部分配列(407bp)を、pENTR Gatewayベクター(Invitrogen)にクローニングし、配列決定し、Flanders Interuniversity Institute for Biotechnology、Gent、ベルギーから入手したGatewayベクターpK7GWIWG2(II)にサブクローニングする。この場合、タバコ植物において、NtCED2断片はRNAヘアピンとして発現され、対応する内在性NtCED2転写産物の遺伝子サイレンシングを誘導する(図5)。
NtABA4 cDNAを用いるTN90バーレー種タバコの工学的作製
NtABA4コード配列(図2)を持つバイナリープラスミドpK2WG7を生成して、ニコチアナ・タバカムにおいてこの遺伝子を過剰発現させる。このベクターは、植物の全組織において導入遺伝子の構成的発現を駆動するカリフラワーモザイクウイルスCaMV35Sプロモーターをその上流に、および寒天プレートにおけるトランスジェニックニコチアナ・タバカム系統のカナマイシン(抗生物質)選抜(100mg/ml)用のkan/nptII遺伝子を含む。バーレー種タバコTN90を、古典的な葉ディスク手順を使用して、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)を介してこの構築物で形質転換する。カルスから、個々の系統を再生し、カナマイシンで選択する。次いで、35Sプロモーター(5’−GAGCATCGTGGAAAAAGAAGAC)中のプライマー1つおよびNtABA4コード配列内のプライマー1つを使用するゲノムDNAに対するPCRによってT0過剰発現系統を観察し、特異的NtABA4プライマーを使用するRT−PCRによって、NtABA4のトランスジェニックコピーを特異的に検出する。T1種子を採取し、カナマイシン含有寒天プレート上で再生長させ、T0小植物に関して厳密に観察した。NtABA4 cDNAを保有しているT−DNAが選択した系統のゲノムに挿入されたことをgDNAに対するPCRは示しており、RT−PCR分析によりその遺伝子を過剰発現している3系統を同定することができた。続いて、カナマイシン耐性植物を浮きトレイ中で生長させた後に、圃場で栽培する。NtABA4の3系統(NtABA4−1、NtABA−2およびNtABA−3)、ベクター対照(VC、空のpK7GWIWG2(II))およびTN90 USバックグラウンドタバコからなる20個体の植物を、4個体ずつ複製した20個体の植物で栽培する。圃場に移植してから3か月後(トッピングの36日後)に、1つの実験的複製を代表する、小区分の20個体の植物のうち10個体の同一植物で、中央の着葉位の葉を1枚試料採取する。これらの葉(「緑葉」)を直ちにドライアイスに保存し、凍結乾燥する。圃場において2カ月後、35S::NtABA4植物は、TN90およびVC植物と異なるどんな視覚的表現型も表さなかった。同様に、植物高さおよびクロロフィル含量分析からトランスジェニック35S::NtABA4系統がTN90およびVC対照に類似していることが実証され、NtABA4過剰発現が表現型特性に対して可視的影響を及ぼさないことが示唆される。小区分および系統当たり10個体の選択した植物の残りの葉材料を試料採取し、バーレー種農作業にしたがって乾燥処理した。乾燥処理後に、中央の着葉位で葉を3枚試料採取する。トランスジェニック3系統(NtABA4−1、NtABA4−2およびNtABA4−3)におけるNtABA4発現の増大の作用を観察するために、「緑葉」および「乾燥処理した葉」を粉砕し、カロテノイド分析に供する。
35S::NtABA4トランスジェニック系統の緑葉および乾燥処理した葉におけるカロテノイド分析
「緑葉」中のカロテノイドの定量分析は、技術的な制限により全てのキサントフィルに関して、特にネオキサンチン定量に関して(ニコチアナ・タバカムにおける低い濃度および低い分析分離により)不可能である。ネオキサンチンのプール(半定量分析に基づく、データ不掲載)は、TN90、VC、NtABA4−1、NtABA4−2およびNt−ABA4−3におけるルテイン含量と(およびより小さい程度でβ−カロテンとも)類似の傾向を有すると仮定される。両方の後の色素は、緑葉中の他のカロテノイド(キサントフィル)濃度の代表的な尺度として使用される。対照的に、ネオキサンチンプールは速やかに、完全に分解することが公知なので、老化し乾燥処理した葉においてはそのような仮定は考えられない。カロテノイド分析は、古典的なHPLC法および可視検出を使用して実施される。野生型およびベクター対照と比較したとき、NtABA4過剰発現系統においてNtABA4−2およびNtABA4−3系統においてルテインが著しく上昇していることが示される。TN90およびベクター対照バックグラウンド系統と比較したとき、NtABA4の過剰発現により、NtABA4−2およびNtABA4−3系統においてそれぞれ30%および26%の葉ルテインの増加が得られる。加えて、野生型TN90と比較して、β−カロテンもNtABA4系統において著しく高い(約15%高い)。これらのデータは、NtABA4の過剰発現が、カロテノイド含量の全体的な増加に作用することを指し示している。トランスジェニック植物系統内のカロテノイドの増加は、有意である(P<0.05;T検定)。
選択した35S:NeSyおよびNtCED2干渉RNA系統のカロテノイド分析
35S::NtABA4について記載した通り、35S:NtNeSyおよびNtNCED2干渉RNA形質転換系統は、遺伝子型判定およびRT−PCRに基づいて選択される。結果として、2個体の35S:NtNeSyおよび3個体のNtNCED2干渉RNA系統が同定され、同じ圃場に、同時に4個体ずつ複製して植えられる。主要なカロテノイド(ルテインおよびβ−カロテン)の含量が、NCED2干渉RNAおよび35S:NtNeSy系統において決定される。NCED2干渉RNAと35S:NtNeSy両方の系統が、緑葉中の主なカロテノイドの増加を表すので、植物形質転換に対するこれら2つの遺伝子候補が、タバコ葉におけるカロテノイド代謝に影響を及ぼすことが確認される。しかし、選択したトランスジェニック系統全てを比較する場合、緑葉で全体的なカロテノイドの増加を達成するには、NtABA4の過剰発現が最も効率的であるように思われる。
選択したトランスジェニック系統中のβ−ダマセノン分析
TN90−4(対照)、NtNeSy−1_2、NtABA4−2_2およびNtNCED2干渉RNA−1_4試料系統の乾燥処理したタバコを加熱した後に形成されるエアロゾル中のβ−ダマセノンの含量を分析するために、含浸したタバコ刻み充填剤からエアロゾルを生成させる。使用した喫煙台は、2秒毎に12回吹く方式を含むNHS熱源(54W)を備える喫煙シミュレータである。喫煙前に、タバコ乾燥処理葉身を切断し、20%グリセリンを含浸させた。含浸した乾燥処理タバコを加熱することによって生成したエアロゾル(100mg、3回の完全な複製)を、ケンブリッジフィルターパッドに捕集する。PADを、10mL水/EtOH(9/1、体積/体積)を含有するバイアルに導入した。β−ダマセノンを、スターバー抽出法によって抽出した(Lancas et al. (2009) J. Sep. Sci. 32, 813-824に記載の通り)。この方法により、吸着相に対して親和性を表す化合物を抽出できる。攪拌子を、GC−MS注入器に加熱脱着させ、β−ダマセノンについて分析する。TN90(対照)と比較して、NtABA4−2_2試料は、エアロゾル中のβ−ダマセノンについて68%の増加を示した(図7)。この差異は、統計学的に妥当である(P<0.01、T検定)。これらの結果は、乾燥処理した葉中のβ−ダマセノンに対する前駆体のプールが、NtABA4の異所的発現によって増強され、一方で他の2つの標的遺伝子、NtNeSy(過剰発現)およびNtNCED2(干渉RNAサイレンシング)の作用がTN90対照に似ていることを示唆している。したがって、タバコの葉において、NtNeSyまたはNtNCEDを工学的に作製するのではなくNtABA4を過剰発現させることによって、β−ダマセノン前駆体の産生を高められる可能性がある。
配列番号1(ニコチアナ・タバカムK326由来ABA4のヌクレオチド配列)
配列番号2(ニコチアナ・タバカムK326由来ABA4のアミノ酸配列)
配列番号3(プライマー中にクローニング用のcacc配列を含む、ニコチアナ・タバカムK326由来NtABA4の増幅に使用したフォワードプライマーのヌクレオチド配列)
配列番号4(プライマー中にクローニング用のcacc配列を含まない、ニコチアナ・タバカムK326由来NtABA4の増幅に使用したフォワードプライマーのヌクレオチド配列)
配列番号5(ニコチアナ・タバカムK326由来NtABA4の増幅に使用したリバースプライマーのヌクレオチド配列)
配列番号6(ニコチアナ・タバカムHicks Broadleaf由来ABA4のヌクレオチド配列)
配列番号7(ニコチアナ・タバカムHicks Broadleaf由来ABA4のアミノ酸配列)
配列番号8(ニコチアナ・タバカムK326由来NeSyのヌクレオチド配列)
配列番号9(ニコチアナ・タバカムK326由来NeSyのアミノ酸配列)
配列番号10(プライマー中にクローニング用のcacc配列を含む、ニコチアナ・タバカムK326由来NeSyの増幅に使用したフォワードプライマーのヌクレオチド配列)
配列番号11(プライマー中にクローニング用のcacc配列を含まない、ニコチアナ・タバカムK326由来NeSyの増幅に使用したフォワードプライマーのヌクレオチド配列)
配列番号12(ニコチアナ・タバカムK326由来NeSyの増幅に使用したリバースプライマーのヌクレオチド配列)
配列番号13(ニコチアナ・タバカム由来NCED2のヌクレオチド配列)
配列番号14(プライマー中にクローニング用のcacc配列を含む、ニコチアナ・タバカム由来NCED2の増幅に使用したフォワードプライマーのヌクレオチド配列)
配列番号15(プライマー中にクローニング用のcacc配列を含まない、ニコチアナ・タバカム由来NCED2の増幅に使用したフォワードプライマーのヌクレオチド配列)
配列番号16(ニコチアナ・タバカム由来NCED2の増幅に使用したリバースプライマーのヌクレオチド配列)
Claims (14)
- (i)ネオキサンチンシンターゼをコードし配列番号1もしくは配列番号6と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、もしくは本質的にそれからなるポリヌクレオチド、
(ii)(i)で示されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、
(iii)配列番号2と少なくとも90%の配列同一性もしくは配列番号7と少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド、または
(iv)(i)で示される単離ポリヌクレオチドを含む構築物、ベクターもしくは発現ベクターを含み、
ネオキサンチンシンターゼの発現が調節されていない対照植物と比較して、ネオキサンチンシンターゼの発現が増大された、突然変異、非天然型またはトランスジェニックタバコ植物細胞。 - 請求項1に記載の植物細胞を含む、突然変異、非天然型またはトランスジェニックタバコ植物。
- タバコ植物のカロテノイド含量を調節するための方法であって、
(a)以下を含む、前記植物におけるネオキサンチンシンターゼの発現または活性を調節するステップと、
(i)ネオキサンチンシンターゼをコードし配列番号1もしくは配列番号6と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、もしくは本質的にそれからなるポリヌクレオチド、
(ii)(i)で示されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または
(iii)配列番号2と少なくとも90%の配列同一性もしくは配列番号7と少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド、
(b)ステップ(a)で得られた突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物の少なくとも一部中のカロテノイド含量を測定するステップと、
(c)ネオキサンチンシンターゼの発現または活性が調節されていない対照植物と比較して、その中のカロテノイド含量が変化した、突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物を同定するステップと
を含む方法。 - リコペンβシクラーゼまたは9−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼまたはこれらの組合せの発現または活性もまた、前記植物において調節される、請求項3に記載の方法。
- リコペンβシクラーゼが配列番号8で示されるポリヌクレオチド配列もしくはそれと少なくとも90%の配列同一性を有する配列によりコードされ、または配列番号9で示されるポリペプチド配列もしくはそれと少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含み、及び9−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼが配列番号13で示されるポリヌクレオチド配列もしくはそれと少なくとも90%の配列同一性を有する配列によりコードされる、請求項4に記載の方法。
- タバコ植物中のβ−ダマセノン含量を調節するための方法であって、
(a)以下を含む、前記植物におけるネオキサンチンシンターゼの発現または活性を調節するステップと、
(i)ネオキサンチンシンターゼをコードし配列番号1もしくは配列番号6と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、もしくは本質的にそれからなるポリヌクレオチド、
(ii)(i)で示されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または
(iii)配列番号2と少なくとも90%の配列同一性もしくは配列番号7と少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドを含むネオキサンチンシンターゼ、
(b)ステップ(a)で得られた突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物の少なくとも一部もしくはそのエアロゾル中のβ−ダマセノン含量を測定するステップと、
(c)ネオキサンチンシンターゼの発現または活性が調節されていない対照植物と比較して、β−ダマセノン含量が変化した、突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物を同定するステップと
を含む方法。 - 請求項6に記載の方法によって入手されまたは入手可能である、突然変異、非天然型またはトランスジェニックタバコ植物、またはそれから誘導されもしくは誘導可能であるタバコ植物材料。
- ネオキサンチンシンターゼの発現が調節されていない対照植物と比較して、ネオキサンチンシンターゼの発現が増大しており、植物の緑葉ルテイン含量もしくはβ−カロテン含量または組み合わせたルテインおよびβ−カロテンの含量が、前記対照植物より高く、乾燥処理植物材料のエアロゾル中のβ−ダマセノン含量が前記対照植物由来のエアロゾルより少なくとも10%高く、(i)植物の緑葉ルテイン含量が少なくとも約18mg/100gであり、(ii)植物のβ−カロテン含量が少なくとも約12mg/100gであり、(iii)加熱時のエアロゾル中のβ−ダマセノン含量が少なくとも約1ng/mgである、突然変異、非天然型またはトランスジェニックタバコ植物。
- 請求項2、7または8に記載のタバコ植物由来のバイオマス、種子または葉を含む植物材料。
- 請求項1に記載の植物細胞、請求項2、7または8のいずれか1項に記載の植物の少なくとも一部、または請求項9に記載の植物材料を含むタバコ製品。
- β−ダマセノンを生成するための方法であって、
(a)請求項2、7または8のいずれか1項に記載のタバコ植物の少なくとも一部、請求項9に記載の植物材料、または請求項10に記載のタバコ製品を提供するステップと、
(b)それを加熱してβ−ダマセノンを含むエアロゾルを生成するステップと
を含む方法。 - ネオキサンチンシンターゼをコードし配列番号6と少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる単離ポリヌクレオチド。
- 請求項12に記載のポリヌクレオチドによってコードされる単離ポリペプチド。
- ネオキサンチンシンターゼ活性を有し、配列番号2と少なくとも90%の配列同一性もしくは配列番号7と少なくとも90%の配列同一性を有する単離ポリペプチド。
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