UA116530C2 - Спосіб одержання рослини тютюну з підвищеним вмістом бета-дамасценону - Google Patents

Спосіб одержання рослини тютюну з підвищеним вмістом бета-дамасценону Download PDF

Info

Publication number
UA116530C2
UA116530C2 UAA201405845A UAA201405845A UA116530C2 UA 116530 C2 UA116530 C2 UA 116530C2 UA A201405845 A UAA201405845 A UA A201405845A UA A201405845 A UAA201405845 A UA A201405845A UA 116530 C2 UA116530 C2 UA 116530C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
plant
sequence
polynucleotide
beta
expression
Prior art date
Application number
UAA201405845A
Other languages
English (en)
Inventor
Люсьєн Бове
Жеремі Катіно
Джоанн ШВААР
Original Assignee
Філіп Морріс Продактс С.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from EP11187332.9A external-priority patent/EP2586792A1/en
Application filed by Філіп Морріс Продактс С.А. filed Critical Філіп Морріс Продактс С.А.
Publication of UA116530C2 publication Critical patent/UA116530C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/825—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving pigment biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y503/00—Intramolecular oxidoreductases (5.3)
    • C12Y503/99—Other intramolecular oxidoreductases (5.3.99)
    • C12Y503/99009—Neoxanthin synthase (5.3.99.9)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Manufacture Of Tobacco Products (AREA)

Abstract

Винахід стосується трансгенної клітини рослини тютюну, що включає полінуклеотид, який містить послідовність, що кодує неоксантинсинтазу, та в якій експресія або активність неоксантинсинтази підвищена в порівнянні з контрольною рослиною або рослиною дикого типу з метою підвищення кількості бета-дамасценону, яка може бути виявлена в аерозолі нагрітого тютюну, що призводить до одержання нових профілів смаку у тютюну.

Description

з метою підвищення кількості бета-дамасценону, яка може бути виявлена в аерозолі нагрітого тютюну, що призводить до одержання нових профілів смаку у тютюну. т
Піковен шк Зо щих Ще я Ти
Є Й Масу й ве
З з
ЇкацнУии КВОТ.
Зааковнтв ; Лютеїн Н- й і ж я Вал ер
Мівавкознте умій з ко во незжкантіненитаза 7 ку ї Шк Її М й
Я б Км Щ й хо
НІ НИ з инхозиди? ще ї Кинь ви а х о нн
МСЕ | МНеОКСаНнтіН бод нон зе жк ою зх як ко же ВО ТВ ДМС ВеНОВ ї Е нано ру ну Н М оммеккуесккуккккнккссс йо баенеевокенкавитиної
Я 000 діокснтенаха х ї
Кеантокенн (5 С є
Й ев ня о Єраленовиавох»
Е СТ" аньанів
Н
Амецизова кеолеотв САВА
Гі
ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ
Даний винахід описує полінуклеотидні послідовності неоксантінсинтази, лікопен-бета- циклази і 9-цис-епоксикаротиноїд діоксигенази з Місоїйапа їарасит і варіанти, гомологи та їх фрагменти. Зокрема, описується модифікація експресії неоксантінсинтази або активності білка, кодованого таким чином, з метою модулювання кількості бета-дамасценону, яка може бути виявлена в аерозолі нагрітого тютюну, що призводить до отримання нових профілів смаку в тютюні.
ПЕРЕДУМОВИ ВИНАХОДУ
Бета-дамасценон є ароматичним чинником у дистиляційному аерозолі висушеного тютюну.
Він має типовий фруктовий аромат і аромат печених яблук, який також можливо знайти у природі в Ноза Оатазсепа МіїЇ (дамаська троянда), що вказує на існування ферментативного шляху, який веде до його синтезу в деяких рослинах. Квіти Ноза ЮОатавзсепа відомі своїм тонким ароматом, і їх комерційно збирають для отримання трояндової олії, що використовується у парфумерії, та виготовлення трояндової води. Пелюстки квітів також іноді використовуються безпосередньо для ароматизації харчових продуктів чи напоїв і вважаються безпечними для споживання людиною.
Каротиноїди є потенційними попередниками для виробництва бета-дамасценону. Термічне окислення неоксантіну призводить до утворення бета-дамасценону. Неоксантін є оксигенованою похідною каротиноїду, що належить до класу ксантофілів і складається з восьми ізопренових одиниць. У зів'ялому і висушеному листі вільний неоксантін є відсутнім або може бути виявленим тільки на дуже низьких рівнях. В межах шляху біосинтезу каротиноїдів рослини, який виникає у пластидах, наприклад, хлоропластах, ферменти, відомі як такі, що утворюють неоксантін, належать до класу неоксантінсинтази. Неоксантінсинтаза каталізує утворення неоксантіну з віолаксантіну і кодується полінуклеотидом АВА4. Лікопен-бета-циклаза також каталізує утворення неоксантіну з віолаксантіну і кодується полінуклеотидом Мебзу. 9-цис- епоксикаротиноїд діоксигеназа(и) каталізує розщеплення цис-неоксантіну у Сее--аленовому-апо- альдегіді та ксантіні і кодується полінуклеотидом МСЕО2.
Існує постійна потреба в даній галузі техніки у рослинних матеріалах, таких як тютюн, з модифікованими смаковими профілями. Мета даного винаходу - задовольнити таку потребу.
Коо) СУТЬ ВИНАХОДУ
Відповідні гени АВА4, МеЗу і МСЕЮ2 були клоновані та секвеновані з Місоїйапа їабасит і ефект модульованої експресії цих генів було досліджено. Ферменти, що кодуються полінуклеотидами МебЗу і МСЕЮ2, як вважається, є компонентами шляху біосинтезу каротиноїдів, при цьому було встановлено, що регулювання на підвищення експресії полінуклеотиду Мезу та регулювання на пониження експресії полінуклеотиду МСЕОВ2 у рослині призводить до підвищення вмісту каротиноїдів. Проте, змінене виробництво бета-дамасценону не було виявлене. Неочікувано, але винахідники виявили, що підвищення експресії полінуклеотиду АВА4 не тільки підвищило вміст каротиноїдів, але також значно підвищило вміст бета-дамасценону в аерозолі, утвореному після нагріву висушеного тютюну, отриманого з рослини тютюну. Ця знахідка була ще більш дивною, оскільки полінуклеотид МезЗу кодує фермент, який діє на шлях біосинтезу каротиноїдів подібно до полінуклеотиду АВА4, але при цьому було встановлено, що полінуклеотид МебЗу не має істотного впливу на рівні бета- дамасценону. Не бажаючи бути зв'язаним якоюсь конкретною теорією, ця знахідка дозволяє припустити, що неоксантінсинтаза, яка кодується полінуклеотидом АВАХ4, відіграє центральну роль у синтезі бета-дамасценону в Місоїапа їабасит. Це дозволяє отримувати рослини, в яких рівні бета-дамасценону є модульованими, і таким чином, мають змінені смакові профілі.
Рослини, в яких вміст каротиноїдів є модульованим, можуть бути отримані шляхом генної інженерії. Такі рослини можуть мати поживні переваги для споживача. Крім того, модулювання вмісту каротиноїдів у рослині може використовуватися для створення рослин, стійких до гербіцидів, що інгібують біосинтез каротиноїдів, який може розширити використання інгібіторів каротиноїдів як гербіцидів для сільськогосподарських культур, які на даний час є чутливими до цих сполук. Переважно, ці зміни суттєво не змінюють зовнішній вигляд рослин, який є важливим критерієм для прийняття у промисловості і для максимізації врожайності рослин, тощо.
АСПЕКТИ І ВАРІАНТИ ВИКОНАННЯ ВИНАХОДУ
Аспекти і варіанти виконання даного винаходу викладені у формулі винаходу, що додається.
В одному аспекті, пропонується ізольований полінуклеотид, який містить, складається або складається по суті з послідовності, що кодує неоксантінсинтазу, та має принаймні 6090 ідентичності послідовності з ФЕО ІЮ МО: 1 або ЗЕО ІО МО: 6.
В іншому аспекті пропонується в ізольований поліпептид, який кодується полінуклеотидом. бо В іншому аспекті пропонується ізольований поліпептид, який має принаймні 6690 ідентичності послідовності з ФЕО ІЮО МО: 2 або принаймні 6095 ідентичності послідовності з БЕО
ІО МО: 7.
В іншому аспекті пропонується конструкція, вектор або вектор експресії, який містить ізольований полінуклеотид(си).
В іншому аспекті пропонується мутантна, що не зустрічається в природі, або трансгенна рослинна клітина, яка містить ізольований полінуклеотид(и), поліпептид або конструкцію, вектор або вектор експресії, описані тут, і, в якій експресія або активність неоксантінсинтази є модульованою в порівнянні з контрольною рослиною або рослиною дикого типу.
В одному варіанті, мутантна, що не зустрічається в природі, або трансгенна рослина включає в себе рослинну клітину.
В іншому аспекті пропонується спосіб модулювання вмісту каротиноїдів у рослині, який включає в себе стадії: () модулювання експресії або активності неоксантінсинтази у рослині, переважно, в якій неоксантінсинтаза має полінуклеотидну послідовність або поліпептидну послідовність, визначені тут; (ії) вимірювання вмісту каротиноїдів принаймні у частині мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини, отриманої на стадії (і), та (ії) ідентифікації мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини, в якій вміст каротиноїдів було змінено порівняно з контрольною рослиною, в якій експресія або активність неоксантінсинтази не була модульована.
В одному варіанті, експресія або активність лікопен-бета-циклази або 9-цис- епоксикаротиноїд діоксигенази або їх комбінації є також модульованою у рослині.
В одному варіанті, лікопен-бета-циклаза має полінуклеотидну послідовність, визначену у
ЗЕО ІО МО: 8, або має принаймні 6095 ідентичності послідовності з нею, або має поліпептидну послідовність, визначену у 5ЕО ІЮ МО: 9, або має принаймні 6095 ідентичності послідовності з нею, і де 9-цис-епоксикаротиноїд діоксигеназа має полінуклеотидну послідовність, визначену у
ЗЕО ІЮ МО: 13, або має принаймні 6095 ідентичності послідовності з нею.
В іншому аспекті пропонується спосіб модулювання вмісту бета-дамасценону у рослині, який включає в себе стадії: () модулювання експресії або активності неоксантінсинтази у рослині, переважно, в якій неоксантінсинтаза має полінуклеотидну послідовність або поліпептидну послідовність, описані тут; (ії) вимірювання вмісту бета-дамасценону принаймні у
Зо частині мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини, отриманої на стадії (ї), та (ії) ідентифікації мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини, в якій вміст бета-дамасценону було змінено порівняно з контрольною рослиною, в якій експресія або активність неоксантінсинтази не була модульована.
В іншому аспекті пропонується мутантна, що не зустрічається в природі, або трансгенна рослина, або рослинний матеріал, який походить або може походити з неї, і який було отримано або може бути отримано способом(ами), описаним тут.
В іншому аспекті пропонується мутантна, що не зустрічається в природі, або трансгенна рослина, в якій експресія неоксантінсинтази або активність білка, кодованого таким чином, була підвищена; в якій вміст лютеїну у зеленому листі або вміст бета-каротину, або комбінований вміст лютеїну і бета-каротину у рослині є вищим, ніж у контрольній рослині, в якій експресія або активність неоксантінсинтази не була підвищена, і в якій вміст бета-дамасценону в аерозолі висушеного рослинного матеріалу є принаймні на 1095 вищим, ніж в аерозолі від контрольної рослини, переважно, де (і) вміст лютеїну у зеленому листі рослини становить принаймні близько 18 мг/100 г; (ії), де вміст бета-каротину у рослині становить принаймні близько 12 мг/100 г, і (її), де вміст бета-дамасценону в аерозолі при нагріванні листової біомаси рослини становить принаймні близько 1 нг/мг.
В іншому аспекті пропонується рослинний матеріал, що включає в себе біомасу, насіння або листя рослини, описані тут.
В іншому аспекті пропонується тютюновий виріб, який містить рослинні клітини, принаймні частини рослини або рослинний матеріал, описані тут.
В іншому аспекті пропонується спосіб отримання бета-дамасценону, який включає в себе стадії: (а) отримання принаймні частини рослини, рослинного матеріалу або тютюнового виробу, як описано тут; і (Б) їх нагрівання для отримання аерозолю, який містить бета- дамасценон.
Інші аспекти даного винаходу включають наступне.
Химерний ген, який містить один або більше ізольованих полінуклеотидів, описаних тут, і функціонально пов'язаних з однією або більше регуляторними послідовностями.
Полінуклеотидна конструкція, яка містить один або більше ізольованих полінуклеотидів, описаних тут, і яка містить, складається або складається по суті з принаймні 15-30 нуклеотидів, 60 30-50 нуклеотидів, 50-100 нуклеотидів, 100-150 нуклеотидів, 150-200 нуклеотидів, 200-300 нуклеотидів, 300-400 нуклеотидів, 400-500 нуклеотидів, 500-600 нуклеотидів або 600-700 нуклеотидів.
Витратний матеріал, який включає в себе або використовує рослинний матеріал, біомасу, насіння або листя, як описано тут.
Лінія клітин, що включає в себе ізольований полінуклеотид, химерний ген, полінуклеотидну конструкцію, дволанцюгову РНК, кон'югат або вектор експресії, тощо, як описано тут. Спосіб модулювання експресії одного або більше полінуклеотидів, описаних тут, або активності одного або більше поліпептидів, кодованих таким чином у клітині, при цьому зазначений спосіб включає в себе введення химерного гену, полінуклеотидної конструкції, дволанцюгової РНК, кон'югату або вектору експресії, як описано тут.
Спосіб виявлення, ізолювання, ампліфікації або аналізу одного або більше полінуклеотидів, описаних тут, причому спосіб включає в себе стадію отримання зразка, що містить полінуклеотид, і гібридизацію зазначеного полінуклеотиду у полінуклеотидну молекулу, що включає в себе нуклеотидну послідовність принаймні 10 суміжних нуклеотидів від ізольованої нуклеотидної послідовності.
Спосіб модулювання вмісту каротиноїдів та вмісту бета-дамасценону або вмісту каротиноїдів, або вмісту бета-дамасценону у принаймні частині рослини порівняно з контрольною рослиною, який включає в себе використання агента, що модулює експресію одного або більше полінуклеотидів, описаних тут, або активність білка, кодованого таким чином.
Використання агента, який модулює експресію одного або більше полінуклеотидів, описаних тут, або активність білка, кодованого таким чином, для модулювання вмісту каротиноїдів та вмісту бета-дамасценону або вмісту каротиноїдів, або вмісту бета-дамасценону у принаймні частині рослини порівняно з контрольною рослиною.
В одному варіанті, агент являє собою або є похідним від химерного гену полінуклеотиду, полінуклеотидної конструкції, що містить один або більше полінуклеотидів, антисенсову РНК, дволанцюгову РНК, кДНК, кон'югат, який включає в себе один або більше полінуклеотидів, або принаймні один ненуклеотидний або неполінуклеотидний фрагмент, ковалентно-приєднаний до нього, рибозим, мутаген, "цинковий палець", малу молекулу або мегануклеазу.
В іншому варіанті, полінуклеотидний фрагмент(и) кодує антисенсову нуклеїнову кислоту,
Зо рибозим, РНК, що впливає на опосередкований сплайсосомою транс-сплайсинг, інтерферуючу
РНК (РНКІ), гідову РНК, або іншу нетрансльовану РНК, тощо. В іншому варіанті, полінуклеотидний фрагмент(и) кодує РНКІ.
КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУР
Фігура 1. Спрощена версія шляху біосинтезу каротиноїдів у рослинах. Неоксантін і лютеїн є кандидатами-попередниками, які сприяють утворенню бета-дамасценону в листі. Додаткові, але до цих пір неохарактерізованні стадії, включають в себе утворення глікозиду і бактеріальне розкладання в процесі сушіння, відповідно.
Фігура 2. (А) Послідовність КДНК МІАВАХ ампліфікована від КЗ326, що використовується для генної інженерії рослин 355: МІАВАХ; (В) трансльована послідовність МАВАА; (С) Прямі (Р) і зворотні (К) праймери, що використовуються для ампліфікації послідовності МАВАА.
Послідовність 5'-сасс у праймері Е потрібна для клонування у вектори шлюзу РЕМТЕ.
Фігура 3. Клонування і секвенування геномної послідовності тютюну сорту Ніск5 Вгоадаіеаєї (Хікс широколистяний), що відповідає копії гену МАВАХ. (А) Ця геномна послідовність з п'ятьма екзонами і чотирма інтронами охоплює в цілому 1808 пар основ (бр) (1792 -- 16 Бр меж інтронів). (В) КДНК МАВАА (Т) та ізоформа клонованої геномної МІАВА4 (СО) не є ідентичними. (С)
Передбачена копія МІАВА4 завдовжки 786 Бр, виведена з геномної послідовності (5БісО, відрізняється у 7 амінокислотах від клонованої каНК М1АВАА (Запит), включаючи один серин у положенні 9 в транзитному пептиді хлоропласта, що є відсутнім у геномній копії.
Фігура 4 (А) Послідовність КДНК МІМебу ампліфікована від КЗ326, що використовується для генної інженерії рослин 355: МІМевбзу; (В) трансльована послідовність МІМевбу; (С) Прямі (БР) і зворотні (КК) праймери, що використовуються для ампліфікації послідовності МіІМевбу.
Послідовність 5'-сасс у праймері Е потрібна для клонування у вектори шлюзу РЕМТЕ.
Фігура 5. (А) Часткова послідовність КДНК МІМСЕЮО2, що використовується для генної інженерії рослин МІМСЕО2-інтерферуючих РНК. (В) Прямі (Р) і зворотні (К) праймери, що використовуються для ампліфікації часткової послідовності МІМСЕО2. Послідовність 5'-сасс у праймері Е потрібна для клонування у вектори шлюзу РЕМТЕ
Фігура 6. Концентрації лютеїну, бета-каротину і напівкількісний аналіз неоксантіну у "зелених" зразках (пулах листя) обраних ліній ТМ90-4, 355: МІМебу-1 2 (Мебу1-2), 355: МІАВА4- 2 2(АВА4 -2 2) і МІМСЕО2-інтерферуючих РНК-1 4 (СЕО2-1 4). бо Фігура 7. Вміст бета-дамасценону в аерозолі (Аерозоль), висушений тютюн (Тютюн) і пресований тютюн після утворення аерозолю (пресований тютюн) ліній ТМ90-4 (контроль ТМОО), 355::МІМебу-!ї 2 (Мебу1-2), З55:С:МАВА4-2 2 (АВА4-2-2) і МІМСЕО2-інтерферуючих РНКІ-1 4 (СЕО2-1 4). Кількісний аналіз бета-дамасценону виконується у трьох паралелях, включаючи симулятор паління тютюну, уловлювання аерозолю і кількісний аналіз бета-дамасценону.
Аналіз на основі Т-тесту свідчить про те, що вміст бета-дамасценону в аерозолі лінії МАВА4- 2 2 статистично відрізняється від ТМ90-4 (Р«0,01) і, що зміст бета-дамасценону у пресованому тютюні лінії МАВА4-2 2 статистично відрізняється від ТМУ90-4 (Р-0,05).
ВИЗНАЧЕННЯ
Технічні терміни та вирази, які використовуються в об'ємі цієї заявки, як правило, мають значення, що зазвичай застосовуються до них у галузі рослинної та молекулярної біології.
Визначення усіх наступних термінів застосовуються до усього змісту цієї заявки. Слово "містить" не виключає інші елементи або стадії, а також однина не виключає множини. Одна стадія може виконувати функції кількох ознак, перерахованих у формулі винаходу. Терміни "близько", "по суті" ії "приблизно" у контексті даного нумерованого значення або діапазону відносяться до значення або діапазону, що знаходяться в межах 2095, в межах 1095, або в межах 595, 490, 390, 295 або 195 від заданого значення або діапазону.
Термін "ізольований" стосується будь-якого об'єкту, взятого з його природного середовища, але цей термін не означає будь-якого ступеню очищення. "Вектор" стосується транспорту нуклеїнової кислоти, що містить комбінацію компонентів нуклеїнової кислоти для забезпечення транспортування нуклеїнової кислоти, конструкцій нуклеїнової кислоти і кон'югатів нуклеїнової кислоти, тощо. Відповідні вектори включають в себе епісоми, здатні до екстра-хромосомної реплікації, такі як плазміди кільцевих, дволанцюгових нуклеїнових кислот; плазміди лінеаризованих дволанцюгових нуклеїнових кислот; та інші вектори будь-якого походження. "Вектор експресії" являє собою транспорт нуклеїнової кислоти, що містить комбінацію компонентів нуклеїнової кислоти для забезпечення експресії нуклеїнової кислоти, наприклад, полінуклеотиду АВАЯ4, конструкцій нуклеїнової кислоти і кон'югатів нуклеїнової кислоти, тощо.
Відповідні вектори включають в себе епісоми, здатні до екстра-хромосомної реплікації, такі як плазміди кільцевих, дволанцюгових нуклеїнових кислот; плазміди лінеаризованих
Зо дволанцюгових нуклеїнових кислот; та інші функціонально еквівалентні вектори експресії будь- якого походження. Вектор експресії містить принаймні промотор, розташований попереду і функціонально пов'язаний з нуклеїнової кислотою, конструкціями нуклеїнової кислоти або кон'югатом нуклеїнової кислоти, як визначено нижче.
Термін "конструкція" стосується фрагменту дволанцюгової, рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що містить один або більше полінуклеотидів. Конструкція включає в себе "матричний ланцюг" основу, спарений з комплементарним "сенсовим або кодуючим ланцюгом". Дана конструкція може бути вставлена у вектор, в двох можливих орієнтаціях, або в аналогічній (чи сенсовій) орієнтації, або у зворотній (чи антисенсовій) орієнтації по відношенню до орієнтації промотору, розташованого всередині вектора, наприклад, вектора експресії. "Промотор" стосується елемента / послідовності нуклеїнової кислоти, зазвичай розташованих попереду і функціонально пов'язаних з фрагментом дволанцюгової нуклеїнової кислоти. Промотори можуть бути отримані повністю з ділянок поблизу нативного гену, що представляє інтерес, або можуть складатися з різних елементів, отриманих від різних нативних промоторів або сегментів синтетичної ДНК.
Терміни "гомологія, ідентичність чи схожість" відносяться до ступеня схожості послідовностей між двома поліпептидами або між двома молекулами нуклеїнової кислоти в порівнянні з вирівнюванням послідовностей. Ступінь гомології між двома дискретними послідовностями нуклеїнових кислот, що порівнюються, є функцією числа ідентичних або комплементарних нуклеотидів у порівнянних позиціях. Відсоток ідентичності може бути визначений шляхом візуального огляду і математичних розрахунків. Альтернативно, відсоток ідентичності двох послідовностей нуклеїнових кислот може бути визначений шляхом порівняння інформації про послідовність за допомогою комп'ютерної програми, такої як Сіивіа!МУу, ВІ АТ,
ЕА5ТА або 5тіїйп-У/аіегптап.
Термін "рослина" стосується будь-якої рослини на будь-якій стадії її життєвого циклу або розвитку, і її нащадків. В одному варіанті винаходу, рослина являє собою рослину тютюну, яка стосується рослини, що належать до роду Місойапа. Переважні види рослини тютюну описані тут. "Рослинна клітина" стосується структурної та фізіологічної одиниці рослини. Рослинна клітина може бути у формі протопласта без клітинної стінки, ізольованої окремої клітини або 60 культивованої клітин, або як частина вищої організованої одиниці, такої як, але не обмежуючись, рослинної тканини, рослинного органу або всієї рослини.
Термін "рослинний матеріал" стосується будь-якої твердої, рідкої або газоподібної композиції, або їх комбінації, що може бути отримана від рослини, в тому числі біомаси, листя, стебла, коріння, квітів або частини квітки, фруктів, пилку, сім'ябруньки, зиготи, насіння, живця, секреції, екстрактів, культури клітин або тканин, або будь-яких інших частин або продуктів рослини. В одному варіанті, рослинний матеріал містить або складається з біомаси, насіння або листя. В іншому варіанті, рослинний матеріал містить або складається з листя.
Термін "сорт" стосується популяції рослин, які поділяють постійні характеристики, що відрізняють їх від інших рослин того ж виду. Володіючи однією або кількома відмінними ознаками, сорт додатково характеризується дуже незначною загальною відмінністю між окремими рослинами в межах цього сорту. Сорт часто продається на комерційній основі.
Термін "лінія" або "селекційна лінія", як використовується тут, позначає групу рослин, які використовуються для селекції рослин. Лінія відрізняється від сорту, оскільки вона виявляє незначну відмінність між індивідуальними рослинами стосовно однієї або кількох ознак, що представляють інтерес, хоча може бути певна відмінність між індивідуальними рослинами щодо інших ознак.
Термін "модулювання" може відноситися до зниження, інгібування, підвищення або інакшим чином здійснення впливу на експресію або активність поліпептиду. Термін може також відноситися до зниження, інгібування, підвищення або інакшим чином здійснення впливу на активність гену, що кодує поліпептид, який може включати в себе, але не обмежується, модулювання транскрипційної активності.
Термін "знизити" або "знижений", як використовується тут, стосується зниження від близько 1095 до близько 9995, або зниження принаймні на 1095, принаймні на 2095, принаймні на 2595, принаймні на 3095, принаймні на 4095, принаймні на 5095, принаймні на 6095, принаймні на 7095, принаймні на 7595, принаймні на 8095, принаймні на 9095, принаймні на 9595, принаймні на 985965, принаймні на 9995, або принаймні на 10095 або більше кількості або активності, наприклад, але не обмежуючись, поліпептидної активності, транскрипційної активності та експресії білка.
Термін "інгібування" або "Іінгібований", як використовується тут, стосується зниження від близько 9895 до близько 10095, або до зниження принаймні на 9895, принаймні на 9995, але особливо на 10095, кількості або активності, наприклад, але не обмежуючись, поліпептидної активності, транскрипційної активності та експресії білка.
Термін "підвищення" або "підвищений", як використовується тут, стосується підвищення від близько 595 до близько 9995, або підвищення принаймні на 595, принаймні на 1095, принаймні на 20965, принаймні на 2595, принаймні на 3095, принаймні на 4095, принаймні на 5095, принаймні на 6095, принаймні на 7095, принаймні на 7595, принаймні на 8095, принаймні на 9095, принаймні на 9595, принаймні 9895, принаймні на 9995, принаймні на 10095 або більше кількості або активності, наприклад, але не обмежуючись, поліпептидної активності, транскрипційної активності та експресії білка.
Термін "контрольний" у контексті контрольної рослини означає рослину або рослинну клітину, в яких експресія або активність ферменту не була модифікована (наприклад, підвищена або знижена), і таким чином, вона може забезпечити порівняння з рослиною, в якій експресія або активність ферменту була модифікована. Контрольна рослина може містити порожній вектор. Контрольна рослина може відповідати рослині дикого типу.
ДОКЛАДНИЙ ОПИС
В одному варіанті, пропонується ізольований полінуклеотид, який містить, складається або складається по суті з полінуклеотидної послідовності, та має принаймні 6095 ідентичності послідовності із будь-якими з описаних тут послідовностей, включаючи будь-який з полінуклеотидів, представлених у переліку послідовностей. Відповідно, ізольований полінуклеотид містить, складається або складається по суті з послідовності, що має принаймні бою, 61905, 62905, 63905, 6495, 6590, 6ббою, 6790, 6890, бю, 7090, 7590, 8090, 859о, 879о, 8890, 8990, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595 9бою, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентичності послідовності з нею.
В іншому варіанті, пропонується ізольований полінуклеотид, який містить, складається або складається по суті з полінуклеотидної послідовності, що кодує неоксантінсинтазу, та має принаймні 6095 ідентичності послідовності з ЗЕО ІО МО: 1. Відповідно, ізольований полінуклеотид містить, складається або складається по суті з послідовності, що має принаймні бою, 61905, 62905, 63905, 6495, 6590, 6ббою, 6790, 6890, бю, 7090, 7590, 8090, 859о, 879о, 8890, 8990, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентичності послідовності з
ЗЕО ПО МО: 1. 60 В іншому варіанті, пропонується ізольований полінуклеотид, який містить, складається або складається по суті з полінуклеотидної послідовності, що кодує лікопен-бета-циклазу, і має принаймні 6095 ідентичності послідовності з ЗЕО 10 МО 8. Відповідно, ізольований полінуклеотид містить, складається або складається по суті з послідовності, що має принаймні близько 6095, 6195, 6295, 63905, 6495, 6595, 6695, 6795, 6895, 6995, 7095, 7595, 8095, 8595, 8795, 88905, 8995, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 97905, 9895, 9995 або 10095 ідентичності послідовності з ЗЕОІЮ МО: 8.
В іншому варіанті, пропонується ізольований полінуклеотид, який містить, складається або складається по суті з 9-цис-епоксикаротиноїд діоксигенази і має принаймні 6095 ідентичності послідовності з зЗЕО ІЮ МО 13. Відповідно, ізольований полінуклеотид містить, складається або складається по суті з послідовності, що має принаймні 6095, 6195, 6295, 63905, 64905, 65905, 6690, б7Фо, 6895, 699, 7090, 7595, 8090, 859о, 8790, 8895, 89905, 9090, 9195, 9295, 9390, У4Фо, 9590, 9690, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентичності послідовності з «ЕО ІЮ МО: 13.
Як використовується тут, термін "полінуклеотид" стосується полімеру нуклеотидів, який може бути немодифікованою або модифікованою дезоксирибонуклеїновою кислотою (ДНК), або рибонуклеїновою кислотою (РНК). Відповідно, полінуклеотид може бути, без обмеження, геномною ДНК, комплементарною ДНК (кКДНК), мРНК або антисенсовою РНК або їх фрагментом (фрагментами). Крім того, полінуклеотид може бути одноланцюговою або дволанцюговою нуклеїновою кислотою, ДНК, що являє собою суміш одноланцюгових і дволанцюгових ділянок, гібридною молекулою із сумішшю одноланцюгових і дволанцюгових ділянок чи їх фрагменту(ів).
Крім того, полінуклеотид може складатися з триланцюгових ділянок, що містять ДНК, РНК, або обидві, або їх фрагмент(и). Полінуклеотид може містити одну або більше модифікованих основ, таких як фосфотіоати, і може являти собою пептид нуклеїнової кислоти. Як правило, полінуклеотиди можуть бути зібрані з ізольованих або клонованих фрагментів кКДНК, геномної
ДНК, олігонуклеотидів або окремих нуклеотидів, або комбінації вищезгаданих. Хоча полінуклеотидні послідовності, описані тут, представлені у вигляді послідовностей ДНК, послідовності включають їх відповідні послідовності РНК, а також їх комплементарні (наприклад, повністю комплементарні) послідовності ДНК або РНК, в тому числі їх зворотні комплементи.
Термін "полінуклеотид МАВА4" стосується полінуклеотидів, які кодують неоксантінсинтазу з
Ко) Місойапа їабасит і включає в себе інші полінуклеотиди, які містять, складаються або складаються по суті з полінуклеотидів з істотною гомологією (тобто, схожістю послідовності) або істотною ідентичністю з ЗЕО ІЮ МО: 1 або 5ЕО ІО МО: 6; варіанти полінуклеотиду, які мають принаймні близько 6095, 6195, 62905, 6390, 6495, 65905, 6695, 6795, 6895, 6995, 7090, 7595, 8090, 8595, 8795, 8895, 8995, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595 9695, 9795, 9895 або 9995 ідентичності послідовності з послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 1 або 5ЕО ІЮ МО: 6; фрагменти полінуклеотиду
МАВА4, які включають в себе фрагменти 5ЕО ІЮ МО: 1 або 5ЕО ІО МО: 6; фрагменти ЗЕО ІЮ
МО: 1 або 5ЕО ІО МО: 6 з істотною гомологією (тобто, схожістю послідовності) або істотною ідентичністю з ними, які мають принаймні близько 6095, 6195, 6295, 63905, 6495, 6595, 6690, 67905, бос, бУбю, 7090, 7595, 80905, 8595, 87905, 8895, 8996, 9090, 9195, 9295, 9390, 9495, 9595 9бовю, 97905, 9895, 9995 або 10095 ідентичності послідовності з відповідними фрагментами 5ЕО ІЮ МО: 1 або
ЗЕО ІЮО МО: 6. Полінуклеотид МІАВАЯ також включає в себе послідовності, які містять достатній або істотний ступінь ідентичності або схожості з БЗЕО ІЮО МО: 1 або 5ЕО ІО МО: 6, для кодування поліпептиду, який функціонує як неоксантінсинтаза. В одному варіанті, термін "полінуклеотид
МАВА4" стосується полімеру нуклеотидів, який містить, складається або складається по суті з полінуклеотиду, позначеному тут як ЗЕО ІЮ МО: 1 або 5ЕО ІО МО: 6.
Термін "полінуклеотид МіМеву", стосується полінуклеотидів, які кодують лікопен-бета- циклазу з Місойапа їіабасит і включає в себе інші полінуклеотиди, які містять, складаються або складаються по суті з полінуклеотидів з істотною гомологією (тобто, схожістю послідовності) або істотною ідентичністю з ЗЕО ІЮ МО: 8; фрагменти полінуклеотиду МіМезу, які включають в себе фрагменти ЗЕО ІО МО: 8; варіанти полінуклеотиду, які мають принаймні близько 6095, 6195, б2ою, 6395, 6495, 6595, 66бОо, 6790, 689о, 699, 7095, 7595, 809о, 8590, 8795, 8895, 8990, 9095, 9190, 92905, 9395, 9490, 9595 9690, 9795, 9895 або 9995 ідентичності послідовності з послідовністю ЗЕО ІЮ
МО: 8; фрагменти 5ЕО ІЮ МО: 8 з істотною гомологією (тобто, схожістю послідовності) або істотною ідентичністю з ними, які мають принаймні близько 6095, 6195, 6290, 6395, 64905, 6595, ббос, б7Фо, 6895, 6995, 70905, 7595, 8095, 8595, 8790, 8895, 8995, 9095, 9195, 9295, 9395, 94905, 9590 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентичності послідовності з відповідними фрагментами 5ЕО ІЮ
МО: 8; і фрагменти ЗЕО ІЮ МО: 8 з істотною гомологією (тобто, схожістю послідовності) або істотною ідентичністю з ними, які мають принаймні близько 6095, 6195, 62905, 6395, 64905, 6595, ббос, б7Фо, 6895, 6995, 70905, 7595, 8095, 8595, 8790, 8895, 8995, 9095, 9195, 9295, 9395, 94905, 9590 60 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентичності послідовності з відповідними фрагментами 5ЕО ІЮ б
МО: 8. Полінуклеотид МіМебу також включає в себе послідовності, які містять достатній або істотний ступінь ідентичності або схожості з ЗЕО ІЮ МО: 8 для кодування поліпептиду, який функціонує як лікопен-бета-циклаза. В одному варіанті, термін "полінуклеотид МіМезу" стосується полімеру нуклеотидів, який містить, складається або складається по суті з полінуклеотиду, позначеному тут як ЗЕО ІО МО: 8, який має 10095 ідентичності послідовності з ним.
Термін "полінуклеотид МІМСЕЮ2" стосується полінуклеотидів, які кодують 9-цис- епоксикаротиноїд діоксигеназу з Місоїйапа іабасит і включає в себе інші полінуклеотиди, які містять, складаються або складаються по суті з полінуклеотидів з істотною гомологією (тобто, схожістю послідовності) або істотною ідентичністю з 5ЕО ІЮО МО: 13; варіанти полінуклеотиду, які мають принаймні близько 6095, 6195, 6295, 6395, 6495, 6595, 6695, 6795, 6895, 6995, 70905, 7590, 8095, 8595, 8795 , 8895, 8995, 9090, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595 9695, 9795, 9895 або 9995 ідентичності послідовності з ФЕО ІЮО МО: 13; фрагменти полінуклеотиду МіМезу, які включають в себе фрагменти ЗЕО ІЮО МО: 13; фрагменти ЗЕО ІЮ МО: 13 з істотною гомологією (тобто, схожістю послідовності) або істотною ідентичністю з ними, які мають принаймні близько 60905, б195, 6295, 6395, 6495, бою, бою, 6790, 6895, 699, 7090, 75905, 809ю, 8590, 8790, 8890, 8990, 9090, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентичності послідовності з відповідними фрагментами 5ЕО ІЮ МО: 13. Полінуклеотид МІМСЕЮ2 також включає в себе послідовності, які містять достатній або істотний ступінь ідентичності або схожості з «ЕО ІЮ МО: 13 для кодування поліпептиду, який функціонує як 9-цис-епоксикаротиноїд діоксигеназа. В одному варіанті, термін "полінуклеотид МІМСЕЮ2" стосується полімеру нуклеотидів, який містить, складається або складається по суті з полінуклеотиду, позначеному тут як ЗЕО ІЮ МО: 13 з 10095 ідентичністю послідовності з ним.
Полінуклеотид, як описано тут, зазвичай містить фосфодіефірні зв'язки, хоча в деяких випадках, включені аналоги полінуклеотидів, які можуть мати альтернативні кістяки, що включають, наприклад, фосфорамідат, фосфоротіоат, фосфородітіоат, або -(-00- метилфосфороамідитні зв'язки, і пептид полінуклеотидні кістяки і зв'язки. Інші аналогічні полінуклеотиди включають в себе полінуклеотиди з позитивними кістяками; неіонні кістяки і не- рибозні кістяки. Модифікації рибозофосфатного кістяка можуть бути виконані з різних причин,
Зо наприклад, для підвищення стабільності і періоду напіврозпаду таких молекул у фізіологічних середовищах або як зонди на біочипі. Можуть бути отримані суміші полінуклеотидів, що зустрічаються в природі, і аналогів; альтернативно, можуть бути отримані суміші різних аналогів полінуклеотидів, і суміші полінуклеотидів, що зустрічаються в природі, і аналогів.
Різноманітні аналоги полінуклеотидів є відомими, включаючи, наприклад, фосфорамідат, фосфоротіоат, фосфородітіоат, або О-метилфосфороамідитні зв'язки, і пептид полінуклеотидні кістяки і зв'язки. Інші аналогічні полінуклеотиди включають в себе полінуклеотиди з позитивними кістяками; неїіонні кістяки і не-рибозні кістяки. Полінуклеотиди, що містять один або більше карбоциклічних цукрів, також включені.
Інші аналоги включають пептидні полінуклеотиди, що є пептид полінуклеотидними аналогами. Ці кістяки є по суті неїонними в нейтральних умовах, на відміну від високозарядженого фосфодіефірного кістяка полінуклеотидів, що зустрічаються в природі. Це може призвести до отримання переваг. По-перше, пептид полінуклеотидний кістяк може виявляти покращену кінетику гібридизації. Пептидні полінуклеотиди мають більші зміни температури плавлення для пар основ нуклеотидів, з порушеною комплементарністю, в порівнянні з абсолютно комплементарними парами основ. ДНК і РНК зазвичай мають 2-4 70 зниження температури плавлення для внутрішнього порушення комплементарності. З неюонним пептид полінуклеотидним кістяком зниження становить ближче до 7-9 "С. Аналогічно, внаслідок своєї неіонної природи, гібридизація основ, з'єднаних з цими кістяками, є відносно нечутливою до концентрації солі. Крім того, пептидні полінуклеотиди можуть не деградувати або деградувати меншою мірою клітинними ферментами, і, таким чином, можуть бути більш стабільними.
Серед способів використання описаних полінуклеотидів і комбінацій їх фрагментів, слід зазначити використання фрагментів як зондів при виконанні аналізу гібридизації нуклеїнової кислоти або як праймерів при виконанні ампліфікаційного аналізу нуклеїнової кислоти. Такі фрагменти зазвичай включають, принаймні, близько 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 або 20 або більше суміжних нуклеотидів послідовності ДНК. В інших варіантах, фрагмент ДНК містить, принаймні, близько 10, 15, 20, 30, 40, 50 або 60 або більше суміжних нуклеотидів послідовності
ДНК. Таким чином, в одному аспекті, також пропонується спосіб виявлення полінуклеотиду
АВА4, який включає в себе використання зондів або праймерів, або їх обох. Ілюстративні 60 праймери представлені у послідовностях 5ЕО ІЮО МО: 3-5. В іншому аспекті, також пропонується спосіб виявлення полінуклеотиду Мебу, який включає в себе використання зондів або праймерів, або їх обох. Ілюстративні праймери представлені у послідовностях 5ЕО ІЮ МО: 10- 12. В іншому аспекті, також пропонується спосіб виявлення полінуклеотиду МСЕЮО2, який включає в себе використання зондів або праймерів, або їх обох. Ілюстративні праймери представлені у БЕО ІО МО: 14-16.
Основні параметри, що впливають на вибір умов гібридизації, та рекомендації щодо розробки відповідних умов описуються ЗатргооК, у., Е. Е. Егі5сй, апа Т. Мапіаїї5 (1989,
Моїіесшіаг Сіопіпа: А І арогаїюгу Мапиаї, Соїд ріпу Натотг І арогаїогу Ргез5, Соїд 5ргіпа Нагбог,
М.М.). Використовуючи знання про генетичний код в поєднанні з амінокислотними послідовностями, описаними тут, можуть бути отримані набори вироджених олігонуклеотидів.
Такі олігонуклеотиди можуть використовуватися як праймери, наприклад, у полімеразних ланцюгових реакціях (ПЛР), в результаті яких фрагменти ДНК ізолюються і ампліфікуються. У деяких варіантах, вироджені праймери можуть використовуватися як зонди для генетичних бібліотек. Такі бібліотеки будуть включати в себе, але не обмежуються, бібліотеки кКДНК, геномні бібліотеки, і навіть електронний маркер експресованої послідовності або бібліотеки ДНК.
Гомологічні послідовності, визначені цим способом, потім будуть використовуватися як зонди для визначення гомологів послідовностей, визначених тут. Також потенційне використання полінуклеотидів і олігонуклеотидів (наприклад, праймерів або зондів), які гібридизують в умовах зниженої жорсткості, як правило, помірно жорстких умовах, і зазвичай дуже жорстких умовах з полінуклеотидом(ами), як описано тут. Основні параметри, що впливають на вибір умов гібридизації, та рекомендації щодо розробки відповідних умов наведені ЗатргоокК 9., Е. ЕК.
Еиївси, апа Т. Мапіаїї5 (1989, МоїІесшаг Сіопіпд: А Гарогаїгу Мапиаї, Соїа 5ргіпд Нагрог, М.У.), і можуть бути легко визначені середнім фахівцем у даній галузі техніки на основі, наприклад, довжини або базової композиції полінуклеотиду.
Один зі шляхів досягнення помірно жорстких умов включає в себе використання розчину для попереднього промивання, що містить 5х стандартний цитрат натрію, 0,590 додецилсульфат натрію, 1,0 мМ етилендіамінтетраоцетової кислоти (рН 8,0), буферний розчин для гібридизації близько 5095 формаміду, бх стандартний цитрат натрію і має температуру гібридизації близько 55 "С (або інші подібні розчини для гібридизації, такі як розчин, що містить
Зо близько 5095 формаміду, з температурою гібридизації близько 42 "С), і умови для промивання близько 60 "С, у 0,5 х стандартному цитраті натрію, 0,195 додецилсульфату натрію. Як правило, дуже жорсткі умови визначені як умови гібридизації, як описані вище, але з промиванням приблизно при 68 "С, 0,2 х стандартним цитратом натрію, 0,195 додецилсульфату натрію. 55РЕ (1 х 55РЕ являє собою 0,15 М хлориду натрію, 10 мМ фосфату натрію, і 1,25 мМ етилендіамінтетраоцтової кислоти, рН 7,4) може бути замінений на стандартній цитрат натрію (1 х стандартний цитрат натрію являє собою 0,15 М хлориду натрію і 15 мМ цитрату натрію) у буферних розчинах для гібридизації та промивання; промивання виконуються протягом 15 хвилин після завершення гібридизації. Слід розуміти, що температура промивання і концентрація солей у промивальному розчині можуть регулюватися за необхідності, щоб досягти бажаного ступеня жорсткості із застосуванням основних принципів, які регулюють реакції гібридизації і стабільність дуплексу, що є відомими фахівцям в даній галузі, і описані далі нижче (див., наприклад, Ззатьгоок, ., Е. Е. Епівсн, апа Т. Мапіаїіз (1989, МоІесшціаг Сіопіпа:
А Гарогаюгту Мапиа!ї, Соїй ріпа Нагбог Іарогаюгу Ргезв, Соїй Зрігіпд Натог, М.М.). При гібридизації полінуклеотиду з полінуклеотидом-мішенню з невідомою послідовністю, за гібридну довжину береться довжина полінуклеотиду, що гібридизує. При гібридизації полінуклеотидів з відомою послідовністю, гібридна довжина може бути визначена шляхом вирівнювання послідовностей полінуклеотидів та ідентифікації ділянки чи ділянок оптимальної комплементарності послідовності. Температура гібридизації для гібридів, що, як передбачається, будуть мати менше, ніж 50 пар основ у довжину, має становити від 5 до 10 "С менше, ніж температура плавлення гібриду, де температура плавлення визначається відповідно до наступних рівнянь. Для гібридів, що мають у довжину менше 18 пар основ, температура плавлення (С) - 2 (кількість основ А « Т) 4 (кількість основ (з). Для гібридів, що мають у довжину понад 18 пар основ, температура плавлення (С) - 81,5 416,6 (логарифм 10 (Ма--Ї) 0,41 (95 1-0) - (600/М), де М - це кількість основ у гібриді, і (Махж| означає концентрацію іонів натрію у буферному розчині для гібридизації (Матх| для їх стандартного цитрату натрію -0,165 М). Як правило, кожен такий гібридизуючий полінуклеотид має довжину, яка становить принаймні 2595 (як правило, принаймні, 5095, 6095 або 7095 і найчастіше принаймні 8095) від довжини полінуклеотиду, з яким він гибрідизує, і має принаймні 6095 ідентичності послідовності (наприклад, принаймні 7095, 7595, 8095, 8595, 9095, 9595, 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095) з 60 полінуклеотидом, з яким він гібридизує.
Як буде зрозуміло фахівцю в даній галузі техніки, лінійна ДНК має дві можливі орієнтації: напрямок від 5'-до-3 і напрямок від 3'-до-5ї. Наприклад, якщо еталонна послідовність розташована у напрямку від 5'-до-3", і якщо друга послідовність розташована у напрямку від 5'- до-- в межах однієї молекули/нитки полінуклеотиду, тоді еталонна послідовність і друга послідовність орієнтовані у одному напрямку, або мають однакову орієнтацію. Як правило, послідовність промотору та ген, що представляє інтерес, який регулюється даним промотором, розташовані в одній і тій же орієнтації. Проте, стосовно еталонної послідовності, розташованої у напрямку від 5'-до-37, якщо друга послідовність розташована у напрямку від 3'-до-5 в межах однієї молекули/нитки полінуклеотиду, тоді еталонна послідовність і друга послідовність орієнтовані у антисенсовому напрямку, або мають антисенсову орієнтацію. Дві послідовності, що мають антисенсові орієнтації по відношенню одна до одної, можуть бути альтернативно описані, як такі, що мають однакову орієнтацію, якщо еталонна послідовність (напрямок від 5'- до-3) і зворотна ккомплементарна послідовність еталонної послідовності (еталонна послідовність розташована у напрямку від 5'-до-3) розташовані в межах однієї молекули/нитки полінуклеотиду. Послідовності, викладені тут, зображені у напрямку від 5'-до-3'.
Рекомбінантні конструкції, представлені тут, можуть використовуватися для трансформації рослин або рослинних клітин з метою модулювання рівнів експресії або активності білка.
Рекомбінантна полінуклеотидна конструкція може включати в себе полінуклеотид, який кодує один або більше полінуклеотидів, як описано тут, функціонально пов'язаних з регуляторною ділянкою, що є придатною для експресії поліпептиду у рослині або рослинній клітині. Таким чином, полінуклеотид може містити кодувальну послідовність, що кодує поліпептид, як описано тут. До рослин, в яких рівні експресії або активності білка є модульованими, можуть належати мутантні рослини, рослини, що не зустрічаються в природі, трансгенні рослини, рослини, створені людиною, або рослини, отримані способом генної інженерії. Відповідно, трансгенна рослина містить геном, який був змінений за допомогою стабільної інтеграції рекомбінантної
ДНК. Рекомбінантна ДНК включає в себе ДНК, яка була створена шляхом генної інженерії і сконструйована за межами клітини, і включає в себе ДНК, що містить природну ДНК або кКДНнК, або синтетичну ДНК. Трансгенна рослина може включати в себе рослину, регенеровану від спочатку трансформованої рослинної клітини і трансгенних рослин-нащадків з пізніших поколінь
Зо чи кросів трансформованої рослини.
Поліпептид, який кодується рекомбінантним полінуклеотидом, може бути нативним поліпептидом, або може бути гетерологічним по відношенню до клітини. У деяких випадках, рекомбінантна конструкція містить полінуклеотид, який модулює експресію, що є функціонально пов'язаним із регуляторною ділянкою. Приклади відповідних регуляторних ділянок описані в даному документі.
Також пропонуються вектори, що містять рекомбінантні полінуклеотидні конструкції, такі як описані тут. Відповідні кістяки векторів, включають в себе, наприклад, ті, що зазвичай використовуються в даній галузі техніки, такі як плазміди, віруси, штучні хромосоми, бактеріальні штучні хромосоми (ВАС5), штучні хромосоми дріжджів (УАС5), або штучні хромосоми бактеріофагів (РАС5). Відповідні вектори експресії включають в себе, без обмеження, плазміди і вірусні вектори, похідні від, наприклад, бактеріофагу, бакуловірусів і ретровірусів. Численні вектори та системи експресії є комерційно доступними.
Вектори можуть також включати в себе, наприклад, точки початку реплікації, послідовності
ДНК, що мають здатність зв'язуватися з ядерним матриксом, або маркери. Маркерний ген може надавати селектовуваний фенотип рослинній клітині. Наприклад, маркер може надавати біоцидну стійкість, наприклад, стійкість до антибіотика (наприклад, канаміцину, (418, блеоміцину або гігроміціну), або гербіциду (наприклад, гліфосату, хлорсульфурону або фосфінотріцину). Крім того, вектор експресії може включати в себе маркерну послідовність, призначену для полегшення маніпуляцій або виявлення (наприклад, для очищення або локалізації) експресованого поліпептиду. Маркерні послідовності, такі як послідовності люциферази, бета-глюкуронідази (505), зеленого флуоресцентного білка (СЕР), глутатіон-5- трансферази (О5Т), полігістидіну, с-тус або гемаглютиніну, як правило, експресовані у формі злиття з кодованим поліпептидом. Такі маркери можуть бути введені у будь-якому місці в межах поліпептиду, в тому числі як на карбоксильному кінці, так і на амінокислотному кінці білкового ланцюга.
Рослина або рослинна клітина може бути трансформована шляхом інтегрування рекомбінантного полінуклеотиду в її геном, щоб стати стабільно трансформованою. Рослина або рослинна клітина, описані тут, можуть, таким чином, бути стабільно трансформованими.
Стабільно трансформовані клітини зазвичай зберігають введений полінуклеотид з кожним бо клітинним поділом. Рослина або рослинна клітина також може бути тимчасово трансформована, таким чином, що рекомбінантний полінуклеотид не є інтегрованим у її геном.
Тимчасово трансформовані клітини зазвичай втрачають усі або певну частину введеного рекомбінантного полінуклеотиду з кожним клітинним поділом, таким чином, що введений рекомбінантний полінуклеотид не може бути виявлений у дочірніх клітинах після достатньої кількості клітинних поділів.
Існує ряд способів в даній галузі техніки для трансформації рослинної клітини, що всі включені тут, в тому числі біолістика, способи генної гармати, трансформація, опосередкована агробактеріями, трансформація, опосередкована вірусним вектором та електропорація.
Агробактеріальна система для інтеграції чужорідної ДНК у хромосоми рослини була ретельно досліджена, модифікована і використовується в генній інженерії рослин. Голі молекули рекомбінантної ДНК, що містять послідовності ДНК, які відповідають досліджуваному очищеному білку тютюну, функціонально пов'язаному, у сенсовій або антисенсовій орієнтації, з регуляторними послідовностями, приєднуються до відповідних послідовностей Т-ДНК звичайними способами. Вони вводяться у протопласти тютюну за допомогою способів з використанням поліетиленгліколю або за допомогою способів електропорації, обидва з яких є стандартними. Альтернативно, такі вектори, що містять молекули рекомбінантної ДНК, які кодують досліджуваний очищений білок тютюну, вводяться в живі агробактеріальні клітини, які потім передають ДНК у рослинні клітини тютюну. Трансформація за допомогою голої ДНК без супутніх векторних послідовностей Т-ДНК може бути здійснена шляхом злиття протопластів тютюну з ліпосомами, що містять ДНК, або шляхом електропорації. Гола ДНК без супроводу векторних послідовностей Т-ДНК також може бути використана для трансформації клітин тютюну за допомогою інертної, високошвидкісної балістичної трансфекції.
Якщо клітина або тканина, яку культивують, використовується як тканина-реципієнт для трансформації, рослини можуть бути регенеровані з трансформованих культур, за бажанням, за допомогою способів, відомих фахівцям у даній галузі техніки. Вибір регуляторних ділянок, які будуть включені у рекомбінантну конструкцію залежить від декількох факторів, включаючи, але не обмежуючись, ефективність, селективність, індуцибельність, бажаний рівень експресії і клітинну або тканинну переважну експресію. Для фахівця в даній галузі техніки є звичайною справою модулювання експресії кодувальної послідовності шляхом відповідного вибору і
Зо розміщення регуляторних ділянок по відношенню до кодувальної послідовності. Транскрипція полінуклеотиду може модулюватися аналогічним чином. Деякі відповідні регуляторні ділянки ініціюють транскрипцію тільки або переважно в певних типах клітин. Способи визначення та характеризування регуляторних ділянок у геномній ДНК рослини є добре відомими в даній галузі техніки.
Відповідні промотори включають в себе тканиноспецифічні промотори, визнані за їх тканиноспецифічні фактори, присутні у різних типах тканин або клітин (наприклад, кореневоспецифічні промотори, паростковоспецифічні промотори, ксилема-специфічні промотори), або присутні під час різних стадій розвитку, або присутні як відповідь на різні умови навколишнього середовища. Відповідні промотори включають в себе конститутивні промотори, які можуть бути активовані у більшості типів клітин, не потребуючи спеціальних індукторів.
Приклади відповідних промоторів для контролю отримання поліпептиду РНКІі включають в себе вірус мозаїки цвітної капусти 355 (Самм/355), 55, ОС5, ІїБ4, ибр, 57151, В33, по5 або убіквітинові, або фазеолінові промотори. Фахівці у даній галузі техніки здатні генерувати численні варіації рекомбінантних промоторів. Тканиноспецифічні промотори є транскрипційними елементами контролю, які є активними тільки у певних клітинах або тканинах у певний час розвитку рослини, наприклад, у вегетативних тканинах або репродуктивних тканинах.
Тканиноспецифічна експресія може бути корисною, наприклад, коли перевага надається експресії полінуклеотидів у певних тканинах. Приклади тканиноспецифічних промоторів під контролем розвитку, включають в себе промотори, які можуть ініціювати транскрипцію тільки (або переважно тільки) у певних тканинах, таких як вегетативні тканини, наприклад, коріння або листя, або у репродуктивних тканинах, таких як фрукти, сім'ябруньки, насіння, пилок, маточки, квіти, або будь-які ембріональні тканини. Репродуктивні тканиноспецифічні промотори можуть бути, наприклад, пиловик-специфічними, сім'ябрунька-специфічними, ембріон-специфічними, ендосперм-специфічними, оболонка сім'ябруньки-специфічними, насіння і оболонка насіння- специфічними, пилок-специфічними, пелюстка-специфічними, чашолистик-специфічними, або їх комбінаціями.
Відповідні листоспецифічні промотори включають в себе пірувату, ортофосфат-дікінази (РРОК) промотор від рослини С4 (кукурудза), промотор сар-птіСат2 від кукурудзи, промотор тур-залежного гену арабідопсису (Агабідорзів Іпа/апа) (Айтубрб), 60 рибулозобіфосфаткарбоксилази (КВС5) промотори (наприклад, гени томату КВСО5 1, КВС52 і
ЕВСЗЗА, експресовані у листі та розсаді, вирощеній із забезпеченням освітлення, гени КВС51 і
ЕВСО52, експресовані у плодах томату, що розвиваються, або рибулозобіфосфаткарбоксилази промотор, експресований майже виключно у клітинах мезофілу в листових пластинках і листових піхвах при високих рівнях).
Відповідні старіння-специфічні промотори включають в себе промотор томату, активний під час дозрівання плодів, старіння і опадання листя, промотор гену кукурудзи, що кодує цистеїн протеазу. Можуть використовуватися відповідні пиловик-специфічні промотори. Можуть також обиратися відповідні кореневоспецифічні промотори, відомі фахівцям у даній галузі техніки.
Відповідні насіння-специфічні промотори включають в себе, як насіння-специфічні промотори (ті промотори, що є активними під час розвитку насіння, такі як промотори запасних білків насіння), так і промотори проростання насіння (ті промотори, що є активними під час проростання насіння). Такі насіння-специфічні промотори включають в себе, але не обмежуються, Сіт! (цитокінін-індукована транскрипція); сС21981 (зеїн кукурудзи 19 Ка); тіїре (міо-інозит-1-фосфат- синтаза); т2Е40-2, також відомий як 2М-40; писіс; та сеіА (целюлози синтаза). Гамма-зеїн є ендосперм-специфічним промотором. (ІоБ-1 є ембріон-специфічним промотором. Для дводольних рослин, насіння-специфічні промотори включають, але не обмежуються, бета- фазеолін бобових, напін, п-конгліцинін, соєвий лектин, круціферін, тощо. Для однодольних рослин, насіння-специфічні промотори включають, але не обмежуються, промотор зеїну кукурудзи 15 КОа, промотор зеїну 22 КОа, промотор зеїну 27 КОба, промотор гамма-зеїну, промотор у-зеїну 27 КОа (наприклад, промотор д7"уУ6б4А, див. інвентарний номер Генобанку 578780), восковий промотор, промотор "зморшкуватого" зерна 1, промотор "зморшкуватого" зерна 2, промотор глобуліну 1 (див. інвентарний номер Генобанку І 22344), промотор Праг, промотор сіт!, промотори кукурудзи епаї і епаг2, промотор пис1, промотор 2М40, еер!11 і еерг; промотор Іей, промотор тіоредоксіну Н; промотор тіїр!5, промотор РСМА2 ї промотор "зморшкуватого" зерна 2.
Приклади індукованих промоторів включають в себе промотори, що реагують на атаки патогену, анаеробні умови, підвищену температуру, світло, посуху, низьку температуру або високу концентрацію солі. Патоген-індуковані промотори включають в себе промотори від патогенез-залежних білків (РЕ-білків, які індукуються після інфікування патогеном (наприклад,
Ко) РВА-білки, БАК-білки, бета-1,3-глюканаза, хітіназа).
Крім рослинних промоторів, інші відповідні промотори можуть мати бактеріальне походження, наприклад, октопінсинтази промотор, нопалінсинтази промотор та інші промотори, що походять від плазмідів Ті, або можуть бути отримані від вірусних промоторів (наприклад, промотори РНК 355 і 195 вірусу мозаїки цвітної капусти (Саму), конститутивні промотори вірусу мозаїки тютюну, промотори 195 і 355 вірусу мозаїки цвітної капусти (Саму), або промотор 355 вірусу мозаїки ранника). Термін "поліпептид МАВАЯ4" стосується поліпептиду, який кодує так звану "неоксантінсинтазу" з Місойапа іабасит, і включає в себе інші варіанти поліпептидів, які містять, складаються або складаються по суті з амінокислотної послідовності, кодованої варіантом полінуклеотиду, з принаймні близько 669», 6795, 6895, 6990, 70905, 7595, 8090, 8590, 8790, 8895, 8995, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895, або 9995 ідентичністю послідовності з ЗЕО ІЮО МО: 1, або варіантом полінуклеотиду з принаймні близько 6095, 6195, 6295, 6395, 6495, ббос, ббОс, 6795, 6895, 690, 7090, 7595, 8095, 8595, 879Ую, 8895, 8995, 9095, 9195, 9295, 9395, 9490, 9595 9695, 97905, 9895 або 9995 ідентичністю послідовності з 5ЕО ІЮ МО: 6; варіантом поліпептиду, який має принаймні близько 6695, 6795, 6895, 6995, 7095, 7590, 8095, 8595, 8790, 8890, 8990, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595 9695, 9795, 9895 або 9995 ідентичності послідовності з ЗЕО ІЮ МО: 2 або варіантом поліпептиду, який має принаймні близько 6095, 6195, 6295, 63905, 6495, 6595, 6690, б7зо, 6895, 6996, 70905, 7590, 8095, 8595, 87Ую, 8890, 8995, У09ю, 9195, 9У29Ую, УЗ95, 9495, 9590 9690, 9795, 9895 або 9995 ідентичності послідовності ЖЕО ІЮ МО: 7; фрагментами поліпептиду МІАВА4 з 5ЕО ІЮО МО: 2 або 5ЕО ІО МО: 7; і фрагментами 5ЕО ІЮО МО: 2 або ЗЕО ІО МО: 7, які мають принаймні близько 6095, 6595, 7095, 7595, 8095, 85905, 8790, 8895, 8995, 9095, 9195, 9290, 9390, 9490, 9595 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентичності послідовності з відповідними фрагментами
ЗЕБЕО І МО: 2 або 5ЕО ІО МО: 7, відповідно. Поліпептид(и) МАВА4 також включає в себе послідовності, які містять достатній або істотний ступінь ідентичності або схожості з ЗЕО ІЮ МО: 2 або 5ЕО ІЮО МО: 7 для функціонування як неоксантінсинтаза. Фрагменти поліпептиду МІАВА4 зазвичай зберігають активність неоксантінсинтази. Поліпептиди МІАВА4- також включають в себе мутанти, отримані шляхом введення будь-якого типу змін (наприклад, вставки, делеції або заміни амінокислот, зміни станів глікозилювання, зміни, що впливають на рефолдинг або ізомеризації, тривимірні структури, або стани самоасоціації), які можуть бути навмисно створені шляхом генної інженерії або ізольовані природно за умови, що вони досі функціонують як бо неоксантінсинтаза. Поліпептиди МАВАЯ4 можуть бути в лінійній формі або піддані циклізації з використанням відомих способів. Термін "поліпептид МАВА4" може також відноситися до поліпептиду, кодованого послідовностями ЗЕО ІЮ МО:1ї або 5ЕО ІЮО МО:б, які мають 10095 ідентичності послідовності з ним, або поліпептид, який містить, складається або складаються по суті з послідовності, представленої в 5ЕО ІЮ МО:2 або 5ЕО ІЮ МО:7, що має 10095 ідентичності послідовності з ними.
Термін "поліпептид МІМебЗу" стосується поліпептиду, який кодує лікопен-бета-циклазу з
Місоїйапа їабасит, і включає в себе інші варіанти поліпептиду, які містять, складаються або складаються по суті з амінокислотної послідовності, кодованої полінуклеотидом з принаймні близько 6095, 6195, 6295, 63905, 6495, 6595, 6695, 6795, 6895, 6995, 7095, 7595, 8095, 8595, 8795, 8895, 8995, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентичністю послідовності з ЗЕО ІЮО МО: 9; варіантом поліпептиду, який має принаймні 8795, 8895, 8995, 9095, 9195, 9296, 9395, 9495, 9595 96, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентичності послідовності з 5ЕО ІЮ МО: 9; фрагментами поліпептиду МіМезу з 5ЕО ІЮ МО: 9; і фрагментами 5ЕО ІЮО МО: 9, які мають принаймні близько 6095, 6195, 6295, 6390, 6495, 6595, 7095, 7595, 8095, 8595, 8795, 8895, 89905, 9090, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595 965, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентичності послідовності з відповідними фрагментами ЗЕО ІО МО: 9. Поліпептид МіМебу також включає в себе послідовності, які містять достатній або істотний ступінь ідентичності або схожості з ЗЕО ІЮ МО: 9 для функціонування як лікопен-бета-циклаза. Фрагменти поліпептиду МіМебЗу зазвичай зберігають активність лікопен-бета-циклази. Поліпептиди МіМебу також включають в себе варіанти та мутанти, отримані шляхом введення будь-якого типу змін (наприклад, вставки, делеції або заміни амінокислот, зміни станів глікозилювання, зміни, що впливають на рефолдинг або ізомеризації, тривимірні структури, або стани самоасоціації), які можуть бути навмисно створені шляхом генної інженерії або ізольовані природно за умови, що вони досі функціонують як лікопен-бета-циклаза. Поліпептиди МіМебу можуть бути в лінійній формі або піддані циклізації з використанням відомих способів. Термін "поліпептид МІМебу" може також відноситися до поліпептиду, який містить, складається або складаються по суті з послідовності, представленої в ЗЕО ІЮ МО:9, що має 100595 ідентичності послідовності з ними.
Термін "поліпептид МІМСЕЮО2" стосується поліпептиду, який кодує 9-цис-епоксикаротиноїд діоксигеназу з Місоїапа їарбасит, і включає в себе поліпептид, який містить, складається або складається по суті з амінокислотної послідовності, кодованої полінуклеотидом, з 10090 ідентичністю послідовності з «ЕО ІЮ МО:13; або варіант поліпептиду, який містить, складається або складається по суті з амінокислотної послідовності, кодованої полінуклеотидом, з принаймні близько 6095, 6195, 6295, 63905, 6495, 6595, 6695, 6795, 6895, 6995, 7095, 7595, 8095, 8595, 8795, 8895, 8995, 9090, 9195, 92905, 9390, 9490, 9590 9690, 9795, 9895 або 9995 ідентичністю послідовності з ФЕО
ІЮО МО: 13. Також сюди включені фрагменти поліпептиду МІМСЕЮО2, які зазвичай зберігають активність 9-цис-епоксикаротиноїд діоксигенази. Поліпептиди МІМСЕВ2 також включають в себе варіанти та мутанти, отримані шляхом введення будь-якого типу змін (наприклад, вставки, делеції або заміни амінокислот, зміни станів глікозилювання, зміни, що впливають на рефолдинг або ізомеризації, тривимірні структури, або стани самоасоціації), які можуть бути навмисно створені шляхом генної інженерії або ізольовані природно за умови, що вони досі функціонують як 9-цис-епоксикаротиноїд діоксигеназа. Поліпептиди МІМСЕЮО2 можуть бути в лінійній формі або піддані циклізації з використанням відомих способів.
В іншому аспекті, пропонується ізольований полінуклеотид, який містить, складається або складається по суті з поліпептидної послідовності, яка має принаймні 6095 ідентичності послідовності з будь-якою з послідовностей, описаних тут, в тому числі з будь-яким з поліпептидів, зображених у переліку послідовностей. Відповідно, ізольований полінуклеотид містить, складається або складається по суті з послідовності, яка має принаймні 6095, 6195, б2ою, 639, 64905, 65905, 669, 6790, 6890, бУо, 7090, 7590, 8090, 85905, 8790, 889о, 899о, 9090, 9190, 9296, 9395, 9496, 9595 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентичності послідовності з ним.
Поліпептиди включають в себе варіанти, отримані шляхом введення будь-якого типу змін (наприклад, вставок, делецій або заміни амінокислот, зміни станів глікозилювання, зміни, що впливають на рефолдинг або ізомеризації, тривимірні структури, або стани самоасоціації), які можуть бути навмисно створені шляхом генної інженерії або ізольовані природно. Варіант може мати зміни, які спричиняють "мовчазну" зміну і в результаті дають функціонально еквівалентний білок. Навмисні заміни амінокислоти можуть здійснюватися на основі подібності полярності, заряду, розчинності, гідрофобності, гідрофільності та/або амфіпатичного характеру залишків до тих пір, поки вторинна активність зв'язування речовини зберігається. Наприклад, негативно заряджені амінокислоти включають аспарагінову кислоту і глутамінову кислоту; позитивно заряджені амінокислоти включають лізин та аргінін; і амінокислоти з незарядженими полярними бо головними групами, що мають аналогічні значення гідрофільності, включають лейцин,
ізолейцин, валін, гліцин, аланін, аспарагін, глутамін, серин, треонін, фенілаланін і тирозин.
Консервативні заміни можуть бути зроблені, наприклад, відповідно до наведеної нижче Таблиці.
Амінокислоти в одному блоці у другому стовпці і переважно в тому ж рядку у третьому стовпці можуть бути замінені одне на одного:
Таблиця . сту Аа Рго
Авп С, . Азр Сім
АРОМАТИЧНАЇ (| 777777ю7юьє С 77717111 нівРпетртуї7///
Поліпептид може бути зрілим білком або незрілим білком, або білком, отриманим від незрілого білка. Поліпептиди можуть бути в лінійній формі або піддаватися циклізації з використанням відомих способів. Поліпептиди зазвичай містять принаймні 10, принаймні 20, принаймні 30, або принаймні 40 суміжних амінокислот.
В іншому варіанті, пропонується ізольований поліпептид МАВАХ, який містить, складається або складається по суті з послідовності, що кодує неоксантінсинтазу, і має принаймні 6695, 6795, бос, 6995, 7095, 7595, 809ю, 8595, 8795, 8895, 8995, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 95905 9695, 9790, 9895, 9995 або 10095 ідентичності послідовності з «ЕО ІЮ МО: 2 або 6095, 6195, 6295, 6395, 6495, ббос, ббОс, 6795, 6895, 690, 7090, 7595, 8095, 8595, 879Ую, 8895, 8995, 9095, 9195, 9295, 9395, 9490, 9595 9695, 9790, 9895, 9995 або 10095 ідентичності послідовності з ЗЕО ІЮ МО:7.
В іншому варіанті, пропонується ізольований поліпептид МіМезу, який містить, складається або по суті складається з послідовності, що кодує лікопен-бета-циклазу, і має принаймні 8795, 8895, 8995, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентичності послідовності з ФЕО ІЮ МО: 9.
В іншому варіанті, пропонується ізольований поліпептид МІМСЕЮО2, який кодується полінуклеотидом МІМСЕО2, описаним тут.
Фрагменти поліпептидних послідовностей також представлені в даному описі, відповідно, такі фрагменти зберігають активність по всій довжині послідовності.
Варіанти мутантних поліпептидів можуть використовуватися для створення мутантних рослин, рослин, що не зустрічаються в природі, і трансгенних рослин (наприклад, мутантних, що не зустрічаються в природі, трансгенних, створених людиною або шляхом генної інженерії рослин), що містять один або більше варіантів мутантних поліпептидів. Відповідно, варіанти мутантних поліпептидів зберігають активність немутантного поліпептиду. Активність варіанту мутантного поліпептиду може бути вищою, нижчою або приблизно такою ж, що і активність немутантного поліпептиду. Мутації у нуклеотидних послідовностях і поліпептидах, описаних тут, можуть включати в себе штучні мутації або синтетичні мутації, або мутації, створені способами генної інженерії. Мутаціями у нуклеотидних послідовностях і поліпептидах, описаних тут, можуть бути мутації, які були отримані, або такі, що можуть бути отримані, за допомогою способу, який включає в себе стадію маніпуляції іп міго або іп мімо. Мутаціями у нуклеотидних послідовностях і поліпептидах, описаних тут, можуть бути мутації, які були отримані, або такі, що можуть бути отримані, за допомогою способу, який включає в себе втручання людини. Як приклад, спосіб може включати в себе мутагенез з використанням екзогенних хімічних речовин, що додаються, таких як, мутагенні, тератогенні або канцерогенні органічні сполуки, наприклад етилметансульфонат (ЕМ5), які виробляють випадкові мутації у генетичному матеріалі. Як ще один приклад, спосіб може включати в себе одну або більше стадій генної інженерії, наприклад, одну або більше стадій генної інженерії, описаних тут, або їх комбінації. Як ще один приклад, спосіб може включати в себе одну або більше стадій схрещування рослин.
Як використовується тут, термін "що не зустрічається в природі" означає, що об'єкт, наприклад, поліпептид, полінуклеотид або рослина, тощо, не зустрічається в природі, і, таким чином, однозначно виключає об'єкти, які існують в природі. Такі об'єкти, що не зустрічаються в природі можуть бути структурно модифіковані, синтезовані або піддані маніпулюванню людиною. У деяких варіантах, мутація не є мутацією, що зустрічається в природі, яка існує в природі у нуклеотидній послідовності або поліпептиді, наприклад, ген або білок.
Поліпептид може бути отримано шляхом культивування трансформованих або рекомбінантних клітин-хазяїв в умовах культивування, відповідних для експресії поліпептиду.
Отриманий експресований поліпептид може бути потім очищений від такої культури з використанням відомих способів очищення. Очищення поліпептиду може включати в себе використання колонки для афінної хроматографії, що містить агенти, які зв'язуються з поліпептидом; одну або більше стадій очищення на колонці з використанням таких смол для афінної хроматографії; одну або більше стадій, які передбачають хроматографію з гідрофобною взаємодією, або імуноафінну хроматографію. Альтернативно, поліпептид може бути також експресований у формі, яка полегшує очищення. Наприклад, він може бути експресований як злитий поліпептид, наприклад, як поліпептид, зв'язуючий мальтозу, глутатіон-5--трансфераза або тіоредоксин. Набори для експресії та очищення злитих поліпептидів є комерційно доступними. Поліпептид може бути маркований епітопом, а потім очищений з використанням специфічного антитіла, спрямованого на такий епітоп. Одна або більше стадій рідинної хроматографії, наприклад, обернено-фазової високоефективної рідинної хроматографії, може застосовуватися для подальшого очищення поліпептиду. Деякі або всі з вищезазначених стадій очищення, в різних комбінаціях, можуть використовуватися для забезпечення по суті гомогенного рекомбінантного поліпептиду. Очищений таким способом поліпептид може бути по суті вільним від інших поліпептидів і визначається тут як "по суті очищений поліпептид"; такі очищені поліпептиди включають в себе поліпептиди, їх фрагменти, варіанти, тощо. Експресія, ізоляція та очищення поліпептидів і їх фрагментів може здійснюватися будь-яким придатним способом, включаючи, але не обмежуючись, способи, описані тут.
Також можливо використовувати афінну колонку у такий спосіб, щоб генерувати моноклональні антитіла проти поліпептидів, з метою афінного очищення експресованих поліпептидів. Ці поліпептиди можуть бути видалені з афінної колонки з використанням звичайних способів, наприклад, в елююючому буфері з високим вмістом солі з наступною діалізацією у буферний розчин з меншим вмістом солі для використання або шляхом зміни значення рН або інших компонентів залежно від афінної матриці, що використовується, або шляхом конкурентного видалення з використанням природного субстрату афінної групи.
Поліпептид може бути також отриманий за допомогою відомого звичайного хімічного синтезу. Способи конструювання поліпептидів або їх фрагментів синтетичним шляхом є відомими фахівцям у даній галузі техніки. Синтетично-побудовані поліпептидні послідовності, в
Зо силу спільного володіння первинними, вторинними або третинними структурними або конформаційними характеристиками з нативними поліпептидами, можуть володіти біологічними властивостями, спільними з ними, в тому числі біологічною активністю.
Термін "що не зустрічається в природі", як використовується тут, описує об'єкт (наприклад, полінуклеотид, генетичну мутацію, поліпептид, рослину, рослинну клітину і рослинний матеріал), який не утворюється в природі або який не існує в природі. Такі об'єкти, що не зустрічаються в природі, або штучні об'єкти можуть бути отримані, синтезовані, ініційовані, модифіковані, піддані втручанню або маніпуляції за допомогою способів, описаних тут, або способів, що є відомими в даній галузі техніки. Таким чином, як приклад, рослина, що не зустрічається в природі, рослинна клітина, що не зустрічається в природі, або рослинний матеріал, що не зустрічається в природі, можуть бути отримані з використанням звичайних способів селекції рослин, таких як зворотне схрещування (беккрос), або за допомогою технологій генетичної маніпуляції, наприклад, антисенсової РНК, інтерферуючої РНК, мегануклеази, тощо. Як ще один приклад, рослина, що не зустрічається в природі, рослинна клітина, що не зустрічається в природі, або рослинний матеріал, що не зустрічається в природі, можуть бути отримані за допомогою інтрогресії або шляхом перенесення однієї або більше генетичних мутацій (наприклад, одного або більше поліморфізмів) від першої рослини або рослинної клітини у другу рослину або рослинну клітину (що сама може зустрічатися в природі), таким чином, що отримана рослина, рослинна клітина або рослинний матеріал або їх потомство включає в себе генетичну структуру (наприклад, геном, хромосому або її сегмент), що не утворюється в природі або не існує в природі. Отримана рослина, рослинна клітина або рослинний матеріал є, таким чином, штучними або такими, що не зустрічаються в природі.
Відповідно, штучна або така, що не зустрічається в природі, рослина або рослинна клітина може бути отримана шляхом модифікації генетичної послідовності у першій рослині або рослинній клітині, що зустрічаються в природі, навіть якщо отримана в результаті генетична послідовність виникає природно у другій рослині або рослинній клітині, що містить генетичний фон, відмінний від першої рослини або рослинної клітини. Відмінності у генетичному фоні можуть бути виявлені за допомогою фенотипових відмінностей або за допомогою способів молекулярної біології, відомих у даній галузі техніки, наприклад, секвенування нуклеїнової кислоти, наявності або відсутності генетичних маркерів (наприклад, маркерів мікросателітної бо РНК). Також пропонуються антитіла, що є імунореактивними з поліпептидами МАВА4 або
МіМезЗу, або МІМСЕЮ2. Поліпептиди, фрагменти, варіанти, злиті поліпептиди, тощо, як викладено в даному описі, можуть використовуватися як "імуногени" при утворенні антитіл, імунореактивних з ними. Такі антитіла можуть специфічно зв'язуватися з поліпептидами через антиген-зв'язуючі сайти антитіла. Специфічно-зв'язуючі антитіла є такими, що будуть специфічно розпізнавати і зв'язуватися з поліпептидом, гомологами і їх варіантами, але не з іншими молекулами. В одному варіанті, антитіла є специфічними для поліпептидів, що мають амінокислотну послідовність, як викладено тут, і не вступають у перехресну реакцію з іншими поліпептидами.
Зокрема, поліпептиди, фрагмент, варіанти, злиті поліпептиди, тощо містять антигенні детермінанти або епітопи, які викликають утворення антитіл. Ці антигенні детермінанти або епітопи можуть бути, або лінійними, або конформаційними (переривчастими). Лінійні епітопи складаються з однієї секції амінокислот поліпептиду, тоді як конформаційні або переривчасті епітопи складаються з секцій амінокислот з різних ділянок поліпептидного ланцюга, які розміщуються в безпосередній близькості під час складання поліпептидного ланцюга. Епітопи можуть бути визначені будь-яким зі способів, відомих у даній галузі техніки. Крім того, епітопи з поліпептидів можуть використовуватися як дослідні реагенти при виконанні аналізів, та для очищення специфічних зв'язуючих антитіл від таких речовин, як поліклональна сироватка або супернатанти від культивованих гібридом. Такі епітопи або їх варіанти можуть бути отримані з використанням способів, відомих у даній галузі техніки, таких як твердофазний синтез, хімічне або ферментативне розщеплення поліпептиду, або за допомогою технології рекомбінантної
ДНК.
Як поліклональні, так і моноклональні антитіла, для поліпептидів, можуть бути отримані звичайними способами. Клітинні лінії гібридоми, які утворюють моноклональні антитіла, специфічні для поліпептидів, також розглядаються в даному описі. Такі гібридоми можуть бути отримані та ідентифіковані за допомогою звичайних способів. Для утворення антитіл, різні тварини-хазяї можуть бути імунізовані за допомогою ін'єкції поліпептиду, його фрагменту, варіанту, або їх мутантів. Такі тварини-хазяї можуть бути, але не обмежуються, кроликами, мишами і щурами, серед інших. Різні ад'юванти можуть використовуватися для підвищення імунної відповіді. Залежно від виду хазяїна, такі ад'юванти включають, але не обмежуються, ад'юванти Фрейнда (повні та неповні), мінеральні гелі, такі як гідроксид алюмінію, поверхнево- активні речовини, такі як лізолецитин, плюронові поліоли, поліаніони, пептиди, олійні емульсії, гемоцианін лімфи равлика, динітрофенол і потенційно придатні людські ад'юванти, такі як БЦЖ (бацила Кальметта-Герена) і коринебактерія - Согупебрасієегішт рагмит. Моноклональні антитіла можуть бути відновлені за допомогою звичайних способів. Такі моноклональні антитіла можуть належати до будь-якого класу імуноглобулінів, включаючи Ідс, ІДМ, ІД9ЗЕ, ІдА, ІдО і будь-який їх підклас.
Антитіла можуть також використовуватися в аналізах для виявлення присутності поліпептидів або фрагментів, або іп міго або іп мімо. Антитіла можуть також використовуватися при очищенні поліпептидів або їх фрагментів за допомогою імуноафінної хроматографії.
Композиції, які можуть модулювати (наприклад, підвищити) експресію або активність МАВА4 або МіМебЗу, або МІМСЕЮ2 (або поєднання двох або більше, або трьох або більше з них) включають, але не обмежуються, послідовність-специфічні полінуклеотиди, які можуть перешкоджати транскрипції одного або більше ендогенного гену (генів), послідовність- специфічні полінуклеотиди, які можуть перешкоджати трансляції РНК-транскриптів (наприклад, дволанцюгових РНК, міРНК, рибозим); послідовність-специфічні поліпептиди, які можуть перешкоджати стабільності одного або більше білків; послідовність-специфічні полінуклеотиди, які можуть перешкоджати ферментативній активності одного або більше білків, або активності зв'язування одного або більше білків по відношенню до субстратів або регуляторних білків; антитіла, які виявляють специфічність щодо одного або більше білків; низькомолекулярні сполуки, які можуть перешкоджати стабільності одного або більше білків, або ферментативній активності одного або більше білків, або активності зв'язування одного або більше білків; білки "цинкові пальці", які зв'язують один або більше полінуклеотидів; та мегануклеази, які мають активність по відношенню до одного або більше полінуклеотидів. Технології генного "редагування", технології генетичного "редагування" та технології "редагування" геному є добре відомими у даній області техніки.
Антисенсова технологія є одним з відомих способів, який можливо використовувати для модуляції експресії поліпептиду. Полінуклеотид гену, який підлягає репресуванню, клонується і функціонально пов'язується з регуляторною ділянкою та послідовністю термінації транскрипції, таким чином, що антисенсовий ланцюг РНК транскрибується. Рекомбінантну конструкцію потім бо трансформують у рослинах і отримують антисенсовий ланцюг РНК. Полінуклеотид не має бути всією послідовністю гену, що підлягає репресуванню, але зазвичай буде по суті комплементарним принаймні з частиною сенсового ланцюга гену, що підлягає репресуванню.
Полінуклеотид може транскрибуватися в рибозим або каталітичну РНК, яка впливає на експресію МРНК. Рибозими можуть призначатися спеціально для спарювання з практично будь- якою РНК-мішенню і розщеплюють фосфодіефірний кістяк у певній локалізації, таким чином функціонально інактивуючи РНК-мішень. Гетерологічні полінуклеотиди можуть кодувати рибозими, призначені для розщеплення певних транскриптів мРНК, таким чином перешкоджаючи експресії поліпептиду. Рибозими у вигляді головки молотка використовуються для руйнування певних мРНК, хоча також можуть використовуватися різні рибозими, які розщеплюють мРНК у сайт-специфічних розпізнавальних послідовностях. Рибозими у вигляді головки молотка розщеплюють мРНК у локалізаціях, обумовлених фланкувальними ділянками, які формують комплементарні пари основ з мРНК-мішенню. Єдина вимога передбачає, щоб
РНК-мішень містила нуклеотидну послідовність 5'-ШС-3'. Конструювання і отримання рибозим у вигляді головки молотка є відомим у даній галузі техніки. Послідовності рибозиму у вигляді головки молотка можуть бути вбудовані у стабільну РНК як транспортна РНК (ТЕМА) з метою підвищення ефективності розщеплення іп мімо.
В одному варіанті, послідовність-специфічні полінуклеотиди, які можуть перешкоджати трансляції РНК-транскрипту(ів), являють собою інтерферуючу РНК. РНК-інтерференція або сайленсінг РНК є еволюційно-консервативним процесом, за допомогою якого специфічні МРНК можуть піддаватися ферментативному розщепленню. Певна дволанцюгова РНК (дволанцюгова
РНК) має бути введена або вироблена клітиною (наприклад, вірус дволанцюгової РНК, або полінуклеотиди інтерферуючої РНК) з метою ініціювання шляху інтерферуючої РНК.
Дволанцюгова РНК може бути конвертована у множинні малі інтерферуючі РНК-дуплекси довжиною 21-23 пар основ за допомогою РНКаз І, які являють собою дволанцюгові РНК- специфічні ендонуклеази. Малі інтерферуючі РНК (мігРНК) можуть надалі розпізнаватися за допомогою РНК-індукованих комплексів сайленсінгу, які сприяють розмотуванню міРНК через
АТФ-залежний процес. Розмотаний антисенсовий ланцюг міРНК спрямовує активовані РНК- індуковані комплекси сайленсінгу до мРНК-мішені, що містить послідовність, комплементарну з антисенсовим ланцюгом мігРНК. мРНК-мішень і антисенсовий ланцюг можуть утворити А-форму
Зо спіралі, і велика борозенка А-форми спіралі може розпізнаватися активованими РНК- індукованими комплексами сайленсінгу. мРНК-мішень може розщеплятися за допомогою активованих РНК-індукованих комплексів сайленсінгу в одному сайті, визначеному сайтом зв'язування 5'-кінця ланцюга мігРНК. Активовані РНК-індуковані комплекси сайленсінгу можуть рециркулюватися, щоб каталізувати іншу подію розщеплення.
Вектори експресії інтерферуючої РНК (РНКІ) можуть містити конструкції РНКІ, що кодують полінуклеотиди РНКІ, які виявляють активність РНК-інтерференції шляхом зниження рівня експресії МРНК, пре-мРНК, або пов'язаних варіантів РНК. Вектори експресії можуть включати в себе промотор, який розміщується вище і функціонально пов'язаний з конструкцією РНКІ, як додатково описано тут. Вектори експресії РНКі можуть містити відповідний мінімальний основний промотор, конструкцію РНКІ, що представляє інтерес, верхню (5) регуляторну ділянку, нижню (3) регуляторну ділянку, включаючи термінацію транскрипції і сигнали поліаденілювання, та інші послідовності, відомі фахівцям у даній галузі техніки, наприклад, різні маркери відбору.
Полінуклеотиди можуть бути отримані у різних формах, включаючи, дволанцюгові структури (тобто, молекулу дволанцюгової РНК, що містить антисенсову нитку і комплементарну сенсову нитку), дволанцюгові шпилькоподібні структури, або одноланцюгові структури (тобто, молекули
ОоЛРНК, які містять тільки антисенсову нитку). Структури можуть містити дуплекс, асиметричний дуплекс, шпильку або асиметричну шпилькову вторинну структуру, що мають самокомплементарні сенсові та антисенсові нитки. Дволанцюгові інтерферуючі РНК можуть ферментативно конвертуватися у дволанцюгові малі інтерферуючі РНК (міРНК). Одна з ниток дуплексу міРНК може ренатурувати у комплементарну послідовність в межах мРНК-мішені і суміжних варіантів РНК. Дуплекси міРНК/мРНК розпізнаються за допомогою РНК-індукованих комплексів сайленсінгу, які можуть розщеплювати РНК у кількох сайтах послідовність-залежним чином, що призводить в результаті до деградації мРНК-мішені і суміжних варіантів РНК.
Молекули дволанцюгової РНК можуть включати в себе молекули міРНК, зібрані з одного олігонуклеотиду у структурі "петля-на-стеблі", в якій самокомплементарні сенсові та антисенсові ділянки молекули міРНК зв'язані за допомогою лінкера(ів) на полінуклеотидній основі або неполінуклеотидній основі, а також кільцеву одноланцюгову РНК, що має дві або більше петльових структури і стебло, які включають в себе самокомплементарні сенсові і антисенсові нитки, де кільцева РНК може бути оброблена або іп мімо, або іп міт, щоб генерувати активну бо молекулу міРНК, здатну до опосередкованого формування інтерферуючої РНК.
Використання молекул малої шпилькової РНК (мшРНК) також розглядається тут. Вони включають в себе специфічну антисенсову послідовність на додаток до зворотної комплементарної (сенсової) послідовності, як правило, розділених спейсером або петльовою послідовністю. Розщеплення спейсера або петлі забезпечує молекулу одноланцюгової РНК і її зворотний комплемент, таким чином, що вони можуть ренатурувати з утворенням молекули дволанцюгової РНК (необов'язково з додатковими стадіями обробки, які можуть забезпечувати в результаті додавання або видалення одного, двох, трьох або більше нуклеотидів з З3' кінця або 5 кінця однієї або обох ниток). Спейсер може мати достатню довжину, щоб дозволити антисенсовій і сенсовій послідовностям ренатурувати, і сформувати дволанцюгову структуру (або стебло) до розщеплення спейсера (і, необов'язково, подальших стадій обробки, які можуть забезпечувати в результаті додавання або видалення одного, двох, трьох або більше нуклеотидів з 3' кінця або 5' кінця однієї або обох ниток). Спейсерна послідовність, як правило, являє собою непов'язану нуклеотидну послідовність, що знаходиться між двома ділянками комплементарної нуклеотидної послідовності, яка при ренатурації (відпалу) у дволанцюговий полінуклеотид, містить МШРНК. Спейсерна послідовність зазвичай містить від близько З до близько 100 нуклеотидів.
Будь-який полінуклеотид РНК, що представляє інтерес, може бути отриманий шляхом вибору відповідної композиції послідовності, розміру петлі і довжини стебла для отримання шпилькового дуплексу. Відповідний діапазон для проектування довжини стебла шпилькового дуплексу включає в себе довжину стебла принаймні близько 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 або 20 нуклеотидів, наприклад, близько 14-30 нуклеотидів, близько 30-50 нуклеотидів, близько 50-100 нуклеотидів, близько 100-150 нуклеотидів, близько 150-200 нуклеотидів, близько 200-300 нуклеотидів, близько 300-400 нуклеотидів, близько 400-500 нуклеотидів, близько 500-600 нуклеотидів, та близько 600-700 нуклеотидів. Відповідний діапазон для проектування довжини петлі шпилькового дуплексу включає в себе довжину петлі близько 4-25 нуклеотидів, близько 25-50 нуклеотидів, або довше, якщо довжина стебла шпилькового дуплексу є суттєвою. У деяких варіантах, молекула дволанцюгової РНК (длРНК) або одноланцюгової РНК (олЛРНК) має від близько 15 до близько 40 нуклеотидів у довжину. В іншому варіанті, молекула малої інтерферуючої РНК (мігРНК) може бути молекулою длРНК або олРНК, що має від близько 15 до
Зо близько 35 нуклеотидів у довжину. В іншому варіанті, молекула міРНК може бути молекулою
ДлЛРНК або олРНК, що має від близько 17 до близько 30 нуклеотидів у довжину. В іншому варіанті, молекула міРНК може бути молекулою длРНК або олРНК, що має від близько 19 до близько 25 нуклеотидів у довжину. В іншому варіанті, молекула мігРНК є молекулою длРНК або
ОоЛРНК, що має від близько 21 до близько 23 нуклеотидів у довжину. У деяких варіантах, шпилькові структури з дуплексними ділянками довшими, ніж 21 нуклеотид, можуть сприяти ефективному сайленсінгу, спрямованому на міРНК, незалежно від послідовності і довжини петлі.
Послідовність мРНК-мішені зазвичай становить від близько 14 до близько 50 нуклеотидів у довжину. мРНК-мішені, таким чином, можуть бути відскановані в ділянках від близько 14 до близько 50 нуклеотидів у довжину, які переважно відповідають одному або більше з наступних критеріїв для цільової послідовності: співвідношення АжТ/(Зж- С від близько 2:11 і близько 1:2; динуклеотиду АА або динуклеотиду СА на 5'-кінці послідовності-мішені; послідовність принаймні 10 суміжних нуклеотидів, унікальних для мРНК-мішені (тобто послідовність, що не є присутньою в інших послідовностях мРНК від однієї рослини), та відсутність "відтинків" із понад трьох суміжних нуклеотидів гуаніну (с) або понад трьох суміжних нуклеотидів цитозину (С). Ці критерії можуть оцінюватися за допомогою різних способів, відомих у даній галузі техніки, наприклад, комп'ютерних програм, таких як ВІГА5БТ, можуть використовуватися для пошуку загальнодоступних баз даних, щоб визначити, чи є обрана послідовність-мішень унікальною для
МРНК-мішені. Альтернативно, послідовність-мішень може обиратися (а послідовність міРНК визначатися) з використанням комп'ютерного програмного забезпечення, що є комерційно доступним (наприклад, ОіідоЕпдіпе, Тагдеї Ріпаег ї 5таї! іпіепегіпд АМА Оезідп Тоої, які є комерційно доступними).
В одному варіанті, обираються послідовності мРНК-мішені, що мають від близько 14 до близько 30 нуклеотидів у довжину, які задовольняють одному або більше із зазначених вище критеріїв. В іншому варіанті, обираються послідовності-мішені, що мають від близько 16 до близько 30 нуклеотидів у довжину, які задовольняють одному або більше із зазначених вище критеріїв. У ще одному варіанті, обираються послідовності-мішені, що мають від близько 19 до близько 30 нуклеотидів у довжину, які задовольняють одному або більше із зазначених вище критеріїв. У іншому варіанті, обирають послідовності-мішені, що мають від близько 19 до 60 близько 25 нуклеотидів у довжину, які задовольняють одному або більше із зазначених вище критеріїв.
В ілюстративному варіанті, молекули малої інтерферуючої РНК можуть мати специфічну антисенсову послідовність, що є комплементарною принаймні для 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 або більше суміжних нуклеотидів будь-якої з полінуклеотидних послідовностей, описаних тут.
Специфічна антисенсова послідовність, що складається з молекули міРНК, може бути ідентичною або по суті ідентичною з комплементом послідовності-мішені. В одному варіанті, специфічна антисенсова послідовність, що складається з молекули міРНК, може бути принаймні близько на 7595, 8095, 8595, 9095, 9595, 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентичною з комплементом послідовності мРНК-мішені. Способи визначення ідентичності послідовності є відомими у даній галузі техніки і можуть бути визначені, наприклад, за допомогою програми
ВГАБТМ програмного забезпечення Університету штату Вісконсін (Опімегейу ої УмМізсопвіп
Сотршег сСгтоир (5СсС)) або за допомогою веб-сайту МСВІ.
Специфічна антисенсова послідовність молекул міРНК може демонструвати мінливість, відрізняючись (наприклад, шляхом заміни нуклеотидів, включаючи транзицію або трансверсію) на один, два, три, чотири або більше нуклеотидів від послідовності мРНК-мішені. Коли такі нуклеотидні заміни присутні в антисенсовій нитці молекули дволанцюгової РНК, комплементарний нуклеотид у сенсовій нитці, 3 якою заміняючий нуклеотид, як правило, утворює водневий зв'язок шляхом спарювання основ, може або не може бути відповідним чином заміщений. Також розглядаються молекули дволанцюгової РНК, в яких одна або більше нуклеотидних замін відбувається у сенсовій послідовності, а не у антисенсовій нитці. Коли антисенсова послідовність молекули міРНК містить одне або більше порушень комплементарності між нуклеотидною послідовністю міРНК і нуклеотидною послідовністю- мішенню, як описано вище, порушення комплементарності можуть знаходитися на 3'-кінці, 5'- кінці або у центральній частині антисенсової послідовності.
В іншому варіанті, молекули міРНК містять специфічну антисенсову послідовність, що є здатною селективно гібридизуватися у жорстких умовах з частиною природного гену-мішені або
МРНК-мішені. Як відомо фахівцям з середнім рівнем знань у даній галузі техніки, варіації жорсткості умов гібридизації можуть бути досягнуті шляхом зміни часу, температури або
Зо концентрації розчинів, що використовуються для стадій гібридизації та промивання. Відповідні умови можуть також частково залежати від конкретних використовуваних нуклеотидних послідовностей, наприклад, послідовності мРНК-мішені або гену-мішені.
Одним зі способів індукування сайленсінгу дволанцюгової РНК у рослинах є трансформація з генною конструкцією, що утворює шпилькову РНК (див. Зтійй еї аї. (2000) Мате, 407, 319- 320). Такі конструкції містять інвертовані ділянки послідовності гену-мішені, розділені за допомогою відповідного спейсера. Введення функціональної інтронної ділянки рослини як спейсерного фрагмента додатково підвищує ефективність індукції сайленсінгу гену за рахунок генерації інтрон-сплайсованої шпилькової РНК (Умезіеу еї а/. (2001) Р/апі у, 27, 581-590).
Відповідно, довжина стебла становить від близько 50 нуклеотидів до близько 1 кілобаз у довжину. Способи отримання інтрон-сплайсованої шпилькової РНК добре описані у даній галузі техніки (див., наприклад, Віозсіепсе, Віоїесппоїоду, апа Віоспетівзігу (2008) 72, 2, 615-617).
Молекули РНКІ, що мають дуплекс або дволанцюгову структуру, наприклад дволанцюгову РНК або мшРНК, можуть мати тупі кінці, або можуть мати 3 або 5' липкі (виступаючі) кінці. Як використовується тут, "липкий кінець" стосується неспареного нуклеотиду або нуклеотидів, які виступають з дуплексної структури, коли 3'-кінець одного ланцюга РНК виходить за межі 5-кінця іншого ланцюга (3 липкий кінець), або навпаки (5 липкий кінець). Нуклеотиди, що містять липкий кінець, можуть бути рибонуклеотидами, дезоксирибонуклеотидами або їх модифікованими версіями. В одному варіанті, принаймні один ланцюг молекули РНКІі має 3' липкий кінець від близько 1 до близько 6 нуклеотидів у довжину. В інших варіантах, 3' липкий
БО кінець має від близько 1 до близько 5 нуклеотидів, від близько 1 до близько З нуклеотидів, і від близько 2 до близько 4 нуклеотидів у довжину.
Коли молекула інтерферуючої РНК має 3' липкий кінець на одному кінці молекули, інший кінець може бути тупим кінцем або може мати також липкий кінець (5' або 3). Коли молекула
РНКІ має липкий кінець на обох кінцях молекули, довжина липких кінців може бути однаковою або різною. В одному варіанті, молекула РНКІі має 3' липкі кінці від близько 1 до близько З нуклеотидів на обох кінцях молекули. У ще одному варіанті, молекула РНКІі є дволанцюговою
РНК, що має 3' липкий кінець з 2 нуклеотидів на обох кінцях молекули. У ще одному варіанті, нуклеотиди, що мають липкий кінець РНКІі, являють собою динуклеотиди ТТ або динуклеотиди ци. 60 При визначенні відсоткової ідентичності молекули РНКІ, що містить один або більше липких кінців, з послідовністю мРНК-мішені, липкий кінець (кінці) може бути або може не бути взятий до уваги. Наприклад, нуклеотиди від З' липкого кінця і до 2 нуклеотидів від 5- або 3'-кінця подвійного ланцюга можуть бути модифіковані без значної втрати активності молекули мігРНК.
Молекули РНКІ можуть мати одну або більше 5' або 3'- кеп-структур. Молекула РНКІі може мати кеп-структуру на 3'-кінці сенсової нитки, антисенсової нитки, або як сенсової, так і антисенсової ниток, або на 5'-кінці сенсової нитки, антисенсової нитки, або як сенсової, так і антисенсової ниток молекули РНКІ. Альтернативно, молекула РНКІі може мати кеп-структуру, як на 3'-кінці, так ії на 5'-кінці молекули РНКІі. Термін "кеп-структура" стосується хімічної модифікації, введеної на будь-якому кінці олігонуклеотиду, який захищає молекулу від екзонуклеазної деградації, а також може полегшити доставку або локалізацію всередині клітини.
Іншою модифікацією, що застосовується до молекул РНКІ, є хімічний зв'язок з молекулою
РНКІі одного або декількох фрагментів або кон'югатів, які підвищують активність, клітинний розподіл, клітинне поглинання, біодоступність і стабільність молекули РНКІ. Полінуклеотиди можуть бути синтезовані або модифіковані способами, що є добре відомими у даній галузі техніки. Хімічні модифікації можуть включати, але не обмежуються, до 2' модифікацій, введення ненатуральних основ, ковалентне приєднання до ліганда, і заміну фосфатних зв'язків тіофосфатними зв'язками. У цьому варіанті, цілісність дуплексної структури посилена принаймні одним, а зазвичай двома, хімічними зв'язками. Хімічне зшивання може бути досягнуте за допомогою будь-якого з різних добре відомих способів, наприклад, шляхом введення ковалентних, іонних або водневих зв'язків; гідрофобних взаємодій, сил Ван-дер-Ваальса або стекінг-взаємодій; за допомогою метало-іонної координації, або шляхом використання аналогів пурину.
Нуклеотиди в одній або обох з двох окремих ниток можуть бути модифіковані з метою модулювання активації клітинних ферментів, таких як, наприклад, без обмеження, певних нуклеаз. Способи зниження або інгібування активації клітинних ферментів є добре відомими у даній галузі техніки, включаючи, але не обмежуючись, 2-аміно модифікації, 2'-фтор модифікації, 2г'-алкіл модифікації, модифікації незарядженого кістяка, морфолінові модифікації, 2'-О-метил модифікації, і фосфорамідат. Таким чином, принаймні, одна 2'"-гідроксильна група нуклеотидів на дволанцюговій РНК замінюється хімічною групою. Крім того, принаймні один нуклеотид може
Зо бути модифікованим з метою формування заблокованого нуклеотиду. Такий заблокований нуклеотид містить метиленовий або етиленовий міст, що з'єднує 2'-кисень рибози з 4'-вуглецем рибози. Введення заблокованого нуклеотиду в олігонуклеотид покращує спорідненість для комплементарних послідовностей і підвищує температуру плавлення на кілька градусів.
Ліганди можуть бути кон'юговані з молекулою РНКІ, наприклад, для підвищення її клітинного поглинання. У деяких варіантах, гідрофобний ліганд кон'югується з молекулою для сприяння безпосередньому проникненню клітинної мембрани. Ці підходи були використані для сприяння проникненню клітин антисенсових олігонуклеотидів. У деяких випадках, кон'югація катіонного ліганда з олігонуклеотидами часто призводить до покращеної резистентності до дії нуклеаз.
Репрезентативні приклади катіонних лігандів включають в себе пропіламоній (ІК«4 диметилпропіламоній. Антисенсові олігонуклеотиди можуть зберігати свою високу афінність зв'язування з мРНК, коли катіонний ліганд є розосередженим по всьому олігонуклеотиду.
Молекули і полінуклеотиди, описані тут, можуть бути отримані з використанням добре відомих способів твердофазного синтезу. Додатково або альтернативно можуть використовуватися будь-які інші засоби для такого синтезу, відомі у даній галузі техніки.
Різні варіанти відносяться до векторів експресії, що містять один або більше полінуклеотидів
МАВА4 або МІМезу, або МІМСЕО2, описаних тут, або конструкцій РНКІ, що містять один або більше полінуклеотидів.
Різні варіанти відносяться до векторів експресії, що містять один або більше полінуклеотидів
МАВА4 або МіМебу, або МІМСЕО2, або одну, або більше конструкцій РНКІ.
Різні варіанти відносяться до векторів експресії, що містять один або більше полінуклеотидів
МАВА4 або МіМебу, або МІМСЕО2, або одну, або більше конструкцій РНКІ, що кодують один або більше полінуклеотидів РНКі, здатних до саморенатурації (самовідпалу) з метою формування шпилькової структури, в якій конструкція включає в себе: (а) один або більше полінуклеотидів, описаних тут; (б) другу послідовність, що кодує спейсер, який формує петлю шпилькової структури, і (с) третю послідовність, що містить зворотну комплементарну послідовність першої послідовності, розташовану в тій же самій орієнтації, що і перша послідовність, при цьому друга послідовність розташована між першою послідовністю і третьою послідовністю, і друга послідовність є функціонально пов'язаною з першою послідовністю і з третьою послідовністю. бо Описані послідовності можуть використовуватися для конструювання різних полінуклеотидів
МАВА4 або МіМебЗу, або МІМСЕЮ2, які не утворюють шпилькових структур. Наприклад, дволанцюгова РНК може бути сформована шляхом (1) транскрибування першої нитки ДНК шляхом функціонального зв'язування з першим промотором, і (2) транскрибування зворотної комплементарної послідовності фрагмента першої нитки ДНК шляхом функціонального зв'язування з другим промотором. Кожна нитка полінуклеотиду може бути транскрибована з одного вектора експресії, або з різних векторів експресії. Дуплекс РНК, що має активність РНК- інтерференції, може бути ферментативно конвертований у міРНК для модулювання рівнів РНК.
Таким чином, різні варіанти відносяться до векторів експресії, що містять один або більше полінуклеотидів МЕАВА4 або МіМебу, або МІМСЕЮО2, або конструкції РНКІі, що кодують полінуклеотиди РНКІ, здатні до самовідпалу, в яких конструкція включає в себе: (а) один або більше полінуклеотидів, описаних тут, і (б) другу послідовність, що містить комплементарну (наприклад, зворотну комплементарну) послідовність першої послідовності, розташовану в тій же самій орієнтації, що і перша послідовність.
Пропонуються різні композиції і способи для модулювання рівнів ендогенної експресії одного або більше поліпептидів МАВА4- або МіМебу, або МІМСЕО2 (або комбінації двох або більше, або трьох, або більше з них) шляхом стимулювання косупресії генної експресії. Явище косупресії має місце в результаті введення декількох копій трансгену у рослинну клітину-хазяїн.
Інтеграція декількох копій трансгену може привести до модульованої експресії трансгену і ендогенного гену-мішені. Ступінь косупресії залежить від ступеня ідентичності послідовностей між трансгеном і ендогенним геном-мішенню. Сайленсінг, як ендогенного гену, так і трансгену, може здійснюватися шляхом екстенсивного метилування локусів, підданих сайленсінгу (тобто, ендогенного промотору і ендогенного гену, що представляє інтерес), які можуть перешкоджати транскрипції. Альтернативно, в деяких випадках, косупресія ендогенного гену і трансгену може здійснюватися шляхом посттранскрипційного сайленсінгу генів, при якому транскрипти можуть бути отримані, але підвищена швидкість деградації виключає накопичення транскриптів.
Механізм косупресії шляхом посттранскрипційного сайленсінгу генів, як вважають, є схожим на
РНК-інтерференцію, в тому сенсі, що РНК, судячи з усього, є як важливим ініціатором, так і мішенню в цих процесах, і може бути опосередковано опрацьована принаймні частково одним і тим же молекулярним механізмом, можливо, через РНК-спрямовану деградацію мРНК.
Зо Косупресія нуклеїнових кислот може досягатися шляхом інтеграції декількох копій нуклеїнової кислоти або її фрагментів, як трансгенів, у геном рослини, що представляє інтерес.
Рослина-хазяїн може бути трансформована за допомогою вектора експресії, що містить промотор, функціонально пов'язаний з нуклеїновою кислотою або її фрагментами. Різні варіанти відносяться до векторів експресії для стимулювання косупресії ендогенних генів, що містять промотор, функціонально-пов'язаний з полінуклеотидом. Різні варіанти відносяться до способів модулювання рівня експресії полінуклеотиду(ів) МАВА4 або МіІМезу, або МІМСЕЮ2 (або комбінації двох або більше, або трьох, або більше з них) шляхом інтеграції декількох копій полінуклеотиду(ів) у геном рослини (тютюну), який включає в себе: трансформування рослинної клітини-хазяїна з вектором експресії, який містить промотор, функціонально-пов'язаний з полінуклеотидом.
Пропонуються різні композиції і способи для модулювання рівня ендогенної експресії гену шляхом модулювання трансляції мРНК. Рослинна клітина-хазяїн (тютюну) може бути трансформована з вектором експресії, який містить: промотор, функціонально пов'язаний з полінуклеотидом, розташованим в антисенсовій орієнтації по відношенню до промотору, з метою забезпечення експресії полінуклеотидів РНК, що мають послідовність комплементарну з частиною мРНК.
Різні вектори експресії для модулювання трансляції мРНК можуть містити: промотор функціонально-пов'язаний з полінуклеотидом, в якому послідовність розташована в антисенсовій орієнтації по відношенню до промотору. Довжина полінуклеотидів антисенсової
РНК може змінюватися і може складати від близько 15-20 нуклеотидів, близько 20-30 нуклеотидів, близько 30-50 нуклеотидів, близько 50-75 нуклеотидів, близько 75-100 нуклеотидів, близько 100-150 нуклеотидів, близько 150-200 нуклеотидів, і близько 200-300 нуклеотидів.
Також пропонуються способи отримання мутантних полінуклеотидів і поліпептидів. Будь-яка рослина, що представляє інтерес, у тому числі рослинна клітина або рослинний матеріал, може бути генетично модифікована різними відомими способами, які індукують мутагенез, включаючи сайт-спрямований мутагенез, олігонуклеотид-спрямований мутагенез, хімічно-індукований мутагенез, опромінення-індукований мутагенез, мутагенез із використанням модифікованих основ, мутагенез із використанням "рваної" дволанцюгової ДНК, мутагенез із дволанцюговим розривом, мутагенез із використанням репаративних дефіцитних штамів-хазяїв, мутагенез бо шляхом загального генного синтезу, перестановку в ДНК та інші еквівалентні способи.
Альтернативно, гени можуть бути мішенями для інактивації шляхом введення транспозонів (наприклад, елементів ІЗ) в геноми рослин, що представляють інтерес. Ці мобільні генетичні елементи можуть бути введені шляхом статевого перехресного запилення, і мутантні вставки можуть піддаватися скринінгу на предмет втрати активності білка. Ген з порушеннями у батьківській рослині може бути введений в інші рослини шляхом схрещування батьківської рослини з рослиною, що не піддавалася транспозон-індукованому мутагенезу, наприклад, шляхом статевого перехресного запилення. Будь-які стандартні способи селекції, відомі фахівцям в даній галузі техніки, можуть використовуватися. В одному варіанті, один або більше генів можуть бути інактивовані шляхом введення одного або більше транспозонів. Мутації можуть призвести до гомозиготного порушення одного або більше генів, гетерозиготного порушення одного або більше генів, або комбінації як гомозиготних, так і гетерозиготних порушень, якщо більше ніж один ген порушується. Відповідні мобільні елементи включають в себе ретротранспозони, ретропозони і синусоподібні елементи. Такі способи є відомими фахівцям у даній галузі техніки.
Альтернативно, гени можуть бути мішенями для інактивації шляхом введення рибозим, отриманих від ряду малих кільцевих РНК, які є здатними до саморозщеплення і реплікації у рослинах. Ці мРНК можуть реплікуватися або самостійно (мРНК віроїди) або з вірусом- помічником (сателітні мРНК). Приклади відповідних мРНК включають мРНК, похідні від віроїдних і сателітних мРНК "сонячної" плямистості авокадо, похідні від вірусу кільцевої плямистості тютюну, вірусу тимчасової смугастості люцерни, вірусу оксамитової плямистості тютюну, вірусу плямистості пасліну (Зоіїапит поашогит) та вірусу плямистості конюшини підземної. Різні РНК-мішені-специфічні рибозими є відомими фахівцям у даній галузі техніки.
У деяких варіантах, експресія поліпептиду модулюється за допомогою нетрансгенних засобів, таких як створення мутації у гені. Способи, які вводять мутацію довільним чином у послідовність гену, можуть включати в себе хімічний мутагенез, ЕМ5 (етилметансульфонат) мутагенез та радіаційний мутагенез. Способи, які вводять одну або більше цільових мутацій у клітину, включають, але не обмежуються, технологію редагування геному, зокрема цинк- палецьва нуклеаза-опосередкований мутагенез, "Шіпуд" (таргетінг-індуковані локальні ушкодження в геномах), гомологічну рекомбінацію, олігонуклеотид-спрямований мутагенез та
Зо мегануклеаза-опосередкований мутагенез.
Деякі необмежувальні приклади мутацій включають в себе делеції, вставки та міссенс- мутації принаймні одного нуклеотиду, одиночні нуклеотидні поліморфізми і простий повтор послідовності. Після мутації, може бути виконаний скринінг, щоб ідентифікувати мутації, які створюють передчасні стоп-кодони чи інакше нефункціональні гени. Після мутації, може бути виконаний скринінг, щоб ідентифікувати мутації, які створюють функціональні гени, здатні до експресування у підвищених рівнях. Скринінг мутантів може здійснюватися шляхом секвенування, або з використанням одного або більше зондів, або праймерів, специфічних для гену або білка. Специфічні мутації можуть також бути створені у полінуклеотидах, що може призвести до модульованої генної експресії, модульованої стабільності мРНК, або зниження або модульованої стабільності білка. Такі рослини згадуються тут як "такі, що не зустрічаються в природі" або як мутантні рослини. Як правило, мутантні або такі, що не зустрічаються в природі рослини включатимуть в себе принаймні частину сторонньої або синтетичної, або штучної нуклеїнової кислоти (наприклад, ДНК або РНК), яка не була присутня у рослині до проведення з нею маніпуляцій. Стороння нуклеїнова кислота може бути одиночним нуклеотидом, двома або більше нуклеотидами, двома або більше суміжними нуклеотидами, або двома, або більше несуміжними нуклеотидами, наприклад, принаймні 10, 20, 30, 40, 50 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 або 1500, або більше суміжними або несуміжними нуклеотидами.
Мутантні або "такі, що не зустрічаються в природі" рослини можуть мати будь-яку комбінацію однієї або більше мутацій, що призводить до модульованих рівнів білка. Наприклад, мутантні або "такі, що не зустрічаються в природі" рослини можуть мати одну мутацію в одному гені; множинні мутації в одному гені; одну мутацію в двох або більше, або трьох, або більше генах; або множинні мутації у двох або більше, або трьох або більше генах. Як ще один приклад, мутантні або такі, що не зустрічаються в природі рослини можуть мати одну або більше мутацій у певній частині гену(ів), наприклад, у ділянці гену, який кодує активний сайт білка або його частину. Як ще один приклад, мутантні або такі, що не зустрічаються в природі рослини можуть мати одну або більше мутацій у ділянці за межами одного або більше гену(ів), наприклад, у ділянці вище або нижче гену, який вона регулює, за умови, що вони модулюють активність або експресію гену(ів). Вищі елементи можуть включати в себе промотори, бо енхансери або фактори транскрипції. Деякі елементи, такі як енхансери, можуть розміщуватися вище або нижче гену, який він регулює. Елемент(и) не повинен розміщуватися поряд з геном, який він регулює, оскільки деякі елементи були виявлені, які розміщуються на кілька сотень тисяч пар основ вище або нижче гену, який він регулює. Мутантні або такі, що не зустрічаються в природі рослини можуть мати одну або більше мутацій, розташованих в межах перших 100 нуклеотидів гену(ів), в межах перших 200 нуклеотидів гену(ів), в межах перших 300 нуклеотидів гену(ів), в межах перших 400 нуклеотидів гену(ів), в межах перших 500 нуклеотидів гену(ів), в межах перших 600 нуклеотидів гену(ів), в межах перших 700 нуклеотидів гену(ів), в межах перших 800 нуклеотидів гену(ів), в межах перших 900 нуклеотидів гену(ів), в межах перших 1000 нуклеотидів гену(ів), в межах перших 1100 нуклеотидів гену(ів), в межах перших 1200 нуклеотидів гену(ів), в межах перших 1300 нуклеотидів гену(ів), в межах перших 1400 нуклеотидів гену(ів) або в межах перших 1500 нуклеотидів гену(ів). Мутантні або такі, що не зустрічаються в природі рослини можуть мати одну або більше мутацій, розташованих в першого, другого, третього, четвертого, п'ятого, шостого, сьомого, восьмого, дев'ятого, десятого, одинадцятого, дванадцятого, тринадцятого, чотирнадцятого або п'ятнадцятого набору 100 нуклеотидів гену(ів) або їх комбінацій. Пропонуються мутантні або такі, що не зустрічаються в природі рослини (наприклад, мутантні, що не зустрічаються в природі, або трансгенні рослини, тощо, як описано тут), які містять варіанти мутантного поліпептиду.
В одному варіанті, насіння рослин піддали мутагенізації, і потім вирощували для отримання мутантних рослин першого покоління. Рослинам першого покоління дали можливість самозапилюватися, і насіння від рослин першого покоління виростили для отримання рослин другого покоління, які потім піддали скринінгу на предмет мутацій в їхніх локусах. Хоча мутагенізований рослинний матеріал може піддаватися скринінгу на наявність мутацій, перевага скринінгу рослин другого покоління полягає в тому, що всі соматичні мутації відповідають мутаціям зародкової лінії. Фахівцеві у даній галузі техніки буде зрозуміло, що різні рослинні матеріали, включаючи, але не обмежуючись, насіння, пилок, рослинну тканину або рослинні клітини можуть бути мутагенізовані з метою створення мутантних рослин. Проте, тип мутагенізованого рослинного матеріалу може впливати на результати, коли нуклеїнову кислоту рослини піддають скринінгу на наявність мутацій. Наприклад, коли пилок піддають мутагенезу перед запиленням немутагенізованої рослини, насіння, отримане в результаті цього запилення,
Зо вирощують для отримання рослин першого покоління. Кожна клітина рослин першого покоління буде містити мутації, створені в пилку, таким чином, ці рослини першого покоління можуть потім бути піддані скринінгу на наявність мутацій замість того, щоб чекати на друге покоління.
Мутагени, які створюють точкові мутації, короткі делеції, вставки, трансверсії та/або транзиції, включаючи хімічні мутагени або випромінювання, можуть використовуватися для створення мутацій. Мутагени включають, але не обмежуються, етилметансульфонат, метилметансульфонат, М-етил-М-нітрозосечовину, триетилмеламін, М-метил-М- нітрозосечовину, прокарбазин, хлорамбуцил, циклофосфамід, діетилсульфат, мономер акриламіду, мелфалан, азотистий іприт, вінкристин, диметилнітрозамін, М-метил-М'-нітро- нітрозогуанідін, нітрозогуанідін, 2-амінопурін, 7,12 диметил-бенз(азантрацен, етиленоксид, гексаметилфосфорамід, бісульфан, діепоксиалкени (діепоксиоктан, діепоксибутан, тощо), 2- метокси-6-хлор-9І3-(етил-2-хлор-етил)іамінопропіламіноІакридину дигідрохлорид і формальдегід.
Спонтанні мутації в локусі, які не можуть бути безпосередньо спричинені мутагеном, також розглядаються за умови, що вони призводять до отримання бажаного фенотипу. Відповідні мутагенні агенти також включають, наприклад, іонізуюче випромінювання, наприклад, рентгенівські промені, гамма-промені, швидке нейтронне опромінення і УФ-випромінювання.
Будь-який спосіб отримання нуклеїнової кислоти рослини, відомий у даній галузі техніки, може використовуватися для отримання нуклеїнової кислоти рослини для скринінгу мутації.
Отримана нуклеїнова кислота від окремих рослин, рослинних клітин або рослинного матеріалу може необов'язково об'єднуватися з метою прискорення скринінгу на предмет наявності мутацій у популяції рослин, що походить від мутагенізованої рослинної тканини, клітин або матеріалу. Одне або кілька наступних поколінь рослин, рослинних клітин або рослинного матеріалу можуть піддаватися скринінгу. Розмір необов'язково об'єднаної групи залежить від чутливості способу скринінгу, що використовується.
Після того, як зразки нуклеїнових кислот були необов'язково об'єднані, вони можуть піддаватися полінуклеотид-специфічним способам ампліфікації таким як, полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР). Будь-який один або більше праймерів або зондів, специфічних для гену або послідовностей, що є безпосередньо суміжними до гену, можуть використовуватися для ампліфікації послідовностей в межах необов'язково об'єднаного зразка нуклеїнової кислоти. бо Ілюстративні праймери представлені у ЗЕО ІЮ МО: 3-5, 10-12 і 14-16. Переважно, один або більше праймерів призначені для ампліфікації ділянок локусу, в яких корисні мутації виникають найбільш імовірно. Найбільш переважно, праймер призначений для виявлення мутацій у ділянках полінуклеотиду. Крім того, переважно, щоб праймер(и) уникав відомих поліморфних сайтів для полегшення скринінгу на предмет наявності точкових мутацій. З метою сприяння виявленню продуктів ампліфікації, один або більше праймерів або зондів можуть маркуватися за допомогою будь-якого звичайного способу маркування. Праймер(и) або зонди можуть бути сконструйовані на основі послідовностей, описаних тут, з використанням способів, які є добре відомими в даній галузі техніки.
З метою сприяння виявленню продуктів ампліфікації праймер(и) або зонди можуть маркуватися за допомогою будь-якого звичайного способу маркування. Вони можуть бути сконструйовані на основі послідовностей, описаних тут, з використанням способів, які є добре відомими в даній галузі техніки.
Поліморфізми можуть бути ідентифіковані за допомогою засобів, відомих у даній галузі техніки. У ще одному аспекті, пропонується спосіб отримання мутантної рослини. Спосіб включає в себе отримання принаймні однієї клітини рослини, що містить ген, який кодує функціональний полінуклеотид МІАВА4 або МіМебу, або МІМСЕБ2 (або комбінацію двох або більше, або трьох, або більше з них). Далі, принаймні одну клітину рослини обробляють в умовах, ефективних для модулювання активності полінуклеотиду МАВА4 або МіМебу, або
МІМСЕВ2. Потім принаймні одна мутантна рослинна клітина переноситься у мутантну рослину, де мутантна рослина має модульований рівень поліпептидів МАВАЯ4 або МіМезу, або МІМСЕВ2 (або комбінації двох або більше, або трьох, або більше з них) у порівнянні з контрольною рослиною. В одному варіанті цього способу отримання мутантної рослини, стадія обробки включає в себе застосування принаймні до однієї клітини хімічного мутагенізуючого агента, як описано вище, і в умовах, ефективних для отримання принаймні однієї мутантної рослинної клітини. В іншому варіанті цього способу, стадія обробки включає в себе застосування принаймні до однієї клітини джерела випромінювання в умовах, ефективних для отримання принаймні однієї мутантної рослинної клітини. Термін "мутантна рослина" включає в себе мутантні рослини, в яких генотип є модифікованим у порівнянні з контрольною рослиною, відповідно за допомогою засобів, відмінних від генної інженерії або генетичної модифікації.
Зо У деяких варіантах, мутантна рослина, мутантна рослинна клітина або мутантний рослинний матеріал може містити одну або більше мутацій, які виникли природно в іншій рослині, рослинній клітині або рослинному матеріалі, і надають бажаної ознаки. Ця мутація може бути введена (наприклад, шляхом інтрогресії) в іншу рослину, рослинну клітину або рослинний матеріал (наприклад, рослину, рослинну клітину або рослинний матеріал з генетичним фоном, відмінним від рослини, з якої була отримана мутація) для надання їм бажаної ознаки. Таким чином, як приклад, мутація, що виникла природно у першій рослині, може бути введена у другу рослину, наприклад, другу рослину з генетичним фоном, відмінним від першої рослини.
Спеціаліст у даній галузі техніки, таким чином, має можливість вести пошук і ідентифікувати рослину, що містить природно у своєму геномі один або більше мутантних алелів генів, описаних тут, які надають бажану ознаку. Мутантний алель(і), який виникає природно, може передаватися другій рослині за допомогою різних способів, включаючи селекцію, зворотне схрещування (беккрос) та інтрогресію для отримання ліній, сортів або гібридів, які мають одну або більше мутацій у генах, описаних тут. Рослини, які демонструють бажану ознаку, можуть піддаватися скринінгу окремо від пулу мутантних рослин. Відповідно, вибір здійснюється з використанням знання нуклеотидних послідовностей, як описано тут. Отже, існує можливість скринінгу на наявність генетичної ознаки в порівнянні з контрольною рослиною. Такий скринінговий підхід може передбачати застосування звичайної ампліфікації нуклеїнової кислоти та/або способів гібридизації, як описано тут. Таким чином, інший аспект стосується способу ідентифікації мутантної рослини, що включає в себе наступні стадії: (а) отримання зразка, що містить полінуклеотид МЕАВА4 або МіМебу, або МІМСЕЮ2 від рослини, і (Б) визначення нуклеотидної послідовності полінуклеотиду, в якому відмінність у послідовності полінуклеотиду
МАВА4 або МіМебу, або МІМСЕЮБ2 порівняно з полінуклеотидною послідовністю контрольної рослини свідчить про те, що зазначена рослина є мутантною рослиною МІАВАЯ4 або МІМезу, або
МІМСЕЮ2. В іншому аспекті, пропонується спосіб ідентифікації мутантної рослини, яка накопичує підвищені рівні або (ї) каротиноїду або бета-дамасценону; або (ії) каротиноїду і бета- дамасценону, в порівнянні з контрольною рослиною, що включає в себе наступні стадії: (а) отримання зразка від рослини, що підлягає скринінгу, (б) визначення, чи зазначений зразок має одну або більше мутацій у полінуклеотиді МІАВА4 або МіМебу, або МІМСЕО2; і (с) визначення вмісту (ї) каротиноїду або бета-дамасценону; або (її) каротиноїду і бета-дамасценону у бо зазначеній рослині; при цьому, якщо зразок містить одну або більше мутацій у полінуклеотиді
МАВАЯ4 або МІМезу, або МІМСЕО2, що модулюють експресію або активність білка, кодованого в порівнянні з контрольною рослиною, і частина рослини тютюну має підвищення або (і) каротиноїду або бета-дамасценону; або (ії) каротиноїду і бета-дамасценону принаймні на 595 в порівнянні з контрольною рослиною тютюну, в якій експресія або активність МАВА4 або МіМевбу, або МІМСЕО2 не була модульована, є свідченням мутантної рослини, що накопичує підвищені рівні або (ї) каротиноїду або бета-дамасценону; або (ії) каротиноїду і бета-дамасценону. В іншому аспекті, пропонується спосіб отримання мутантної рослини, яка накопичує підвищені рівні або (ї) каротиноїду або бета-дамасценону; або (ії) каротиноїду і бета-дамасценону в порівнянні з контрольною рослиною, що включає в себе наступні стадії: (а) отримання зразка від першої рослини, (Б) визначення, чи зазначений зразок має одну або більше мутацій у полінуклеотиді МІАВА4 або МіМебу, або МІМСЕО2, які призводять до накопичення підвищених рівнів або (ї) каротиноїду або бета-дамасценону; або (ії) каротиноїду і бета-дамасценону, і (с) перенесення однієї або більше мутацій у другу рослину. Мутація(ї) може переноситися у другу рослину з використанням різних способів, відомих у даній галузі техніки, наприклад, за допомогою генної інженерії, генетичної маніпуляції, інтрогресії, селекції рослин, зворотного схрещування (беккросу), тощо. В одному варіанті, перша рослина є рослиною, що зустрічається в природі. В одному варіанті, друга рослина має генетичний фон, відмінний від першої рослини.
В іншому аспекті, пропонується спосіб отримання мутантної рослини, яка накопичує підвищені рівні або (ї) каротиноїду або бета-дамасценону; або (ії) каротиноїду і бета-дамасценону в порівнянні з контрольною рослиною, що включає в себе наступні стадії: (а) отримання зразка від першої рослини, (б) визначення, чи зазначений зразок має одну або більше мутацій у полінуклеотиді МІАВА4 або МіМебу, або МІМСЕО2, які призводять до накопичення підвищених рівнів або (ї) каротиноїду або бета-дамасценону; або (ії) каротиноїду і бета-дамасценону, і (с) введення шляхом інтрогресії однієї або більше мутацій від першої рослини у другу рослину. В одному варіанті, стадія інтрогресії включає в себе селекцію рослини, що необов'язково включає зворотне схрещування, тощо. В одному варіанті, перша рослина є рослиною, що зустрічається в природі. В одному варіанті, друга рослина має генетичний фон, відмінний від першої рослини. В одному варіанті, перша рослина не є культурним сортом або елітним культурним сортом. В одному варіанті, друга рослина являє собою культурний сорт або елітний культурний сорт. Ще
Зо один аспект стосується мутантної рослини (включаючи культурний сорт або елітний культурний сорт мутантної рослини), отриманої або такої, що може бути отримана способами, описаними тут. У деяких варіантах, "мутантні рослини" можуть мати одну або більше мутацій, локалізованих тільки у певній ділянці рослини, наприклад, у послідовності полінуклеотиду(ів)
МАВА4 або МіМебЗу, або МІМСЕЮ2. Відповідно до цього варіанту, геномна послідовність мутантної рослини, що залишається, буде такою ж або по суті такою ж, як у рослини до мутагенезу.
У деяких варіантах, мутантні рослини можуть мати одну або більше мутацій, локалізованих в більш ніж одній ділянках рослини, наприклад, у послідовності полінуклеотиду МІАВА4 або
МіМезу, або МІМСЕО, і в одній або декількох подальших ділянках геному. Відповідно до цього варіанту, геномна послідовність мутантної рослини, що залишається, не буде такою ж, або не буде по суті такою ж, як у рослини до мутагенезу. У деяких варіантах, мутантна рослина може не мати однієї або більше мутацій в одному або більше, двох або більше, трьох або більше, чотирьох або більше, або п'яти, або більше екзонах полінуклеотиду МІАВА4 або МіІМезу, або
МІМСЕО2; або може не мати в одному або більше, двох або більше, трьох або більше, чотирьох або більше, або п'яти, або більше інтронах полінуклеотиду МАВАЯ4 або МіМебу, або МІМСЕО2; або може не мати однієї або більше мутацій у промоторі полінуклеотиду МІАВА4 або МіМезу, або МІМСЕЮ2; або може не мати однієї або більше мутацій у 3' нетрансльованій ділянці полінуклеотиду МІАВА4 або МіМебу, або МІМСЕО2; або може не мати однієї або більше мутацій у 5'-четрансльованій ділянці полінуклеотиду МАВА4 або МіМебу, або МІМСЕЮ2; або може не мати однієї або більше мутацій у кодувальній ділянці полінуклеотиду МІАВА4 або МіМезу, або
МІМСЕВО2, або може не мати однієї або більше мутацій у некодувальній ділянці полінуклеотиду
МАВАЯ4 або МІМезу, або МІМСЕБО2, або будь-яку комбінацію двох або більше, трьох або більше, чотирьох або більше, п'яти або більше; або шести, або більше їх частин відповідно.
У ще одному аспекті пропонується спосіб ідентифікації рослини, рослинної клітини або рослинного матеріалу, що містить мутацію в гені, який кодує МІАВА4 або МіМезу, або МІМСЕВ2, що включає в себе: (а) застосування до рослини, рослинної клітини або рослинного матеріалу мутагенезу, (б) отримання зразка нуклеїнової кислоти від зазначеної рослини, рослинної клітини або рослинного матеріалу або їх нащадків, і (с) визначення послідовності нуклеїнової кислоти гену, що кодує МШАВА4 або МіМебЗу, або МІМСЕЮ2, або його варіанту, або фрагменту, де 60 відмінність у зазначеній послідовності свідчить про наявність однієї або більше мутацій в них.
Білки "цинкові пальці" можуть використовуватися для модулювання експресії або активності полінуклеотидів МАВА4 або МіМебу, або МІМСЕЮ2, описаних тут. У різних варіантах, послідовність геномної ДНК, що містить частину або всю кодувальну послідовність полінуклеотиду, модифікується за допомогою цинк-пальцевої нуклеази-опосередкованого мутагенезу. Послідовність геномної ДНК піддається пошуку на наявність унікального сайту для зв'язування з білками "цинкові пальці". Альтернативно, послідовність геномної ДНК піддається пошуку на наявність двох унікальних сайтів для зв'язування з білками "цинкові пальці", де обидва сайти знаходяться на протилежних нитках і близько одне від одного, наприклад, на відстані 1, 2, 3, 4, 5, 6 або більше пар основ одне від одного. Відповідно, пропонуються білки "цинкові пальці", які зв'язуються з полінуклеотидами.
Білок "цинкові пальці" може бути сконструйований засобами генної інженерії для розпізнавання обраного сайта-мішені у гені. Білок "цинкові пальці" може містити будь-яку комбінацію мотивів, похідних від природних ДНК цинкові пальці-зв'язуючих доменів і неприродних ДНК цинкові пальці-зв'язуючих доменів, за допомогою відсікання або розширення, або процесу сайт-спрямованого мутагенезу в поєднанні зі способом селекції, наприклад, але не обмежуючись, селекцією фагового дисплею, бактеріальною двогібридною селекцією або бактеріальною одногібридною селекцією. Термін "неприродний ДНК цинкові пальці-зв'язуючий домен" стосується ДНК цинкові пальці-зв'язуючого домену, який зв'язує послідовність з трьох пар основ у ДНК-мішені і, який не виникає у клітині чи організмі, що містить ДНК, яка має бути модифікована. Способи конструювання білка "цинкові пальці", який зв'язується із певними нуклеотидними послідовностями, що є унікальними для гену-мішені, є відомими у даній галузі техніки.
Цинк-пальцева нуклеаза може бути сконструйована шляхом злиття першого полінуклеотиду, що кодує білок "цинкові пальці", який зв'язується з полінуклеотидом, і другого полінуклеотиду, що кодує неспецифічні ендонуклеази, такі як, але не обмежуючись, ендонуклеази Типу ІЗ. Злитий білок між білком "цинкові пальці" і нуклеазою може містити спейсер, що складається з двох пар основ або, альтернативно, спейсер може містити три, чотири, п'ять, шість, сім або більше пар основ. У різних варіантах, цинк-пальцева нуклеаза вводить дволанцюговий розрив у регуляторну ділянку, кодувальну ділянку, або некодувальну
Зо ділянку послідовності геномної ДНК полінуклеотиду і призводить до зниження рівня експресії полінуклеотиду, або зниження активності білка, кодованого таким чином. Розщеплення за допомогою цинк-пальцевої нуклеази часто призводить до делеції ДНК у сайті розщеплення з наступною репарацією ДНК шляхом негомологічного з'єднання кінців.
В інших варіантах, білок "цинкові пальці" може обиратися для зв'язування з регуляторною послідовністю полінуклеотиду. Зокрема, регуляторна послідовність може містити сайт ініціації транскрипції, стартовий кодон, ділянку екзону, екзон-інтронний стик, термінатор або стоп-кодон.
Відповідно, винахід пропонує мутанту, що не зустрічається в природі, або трансгенну рослину, або рослинні клітини, отримані шляхом цинк-пальцевої нуклеази-опосередкованого мутагенезу в безпосередній близькості або всередині одного або більше полінуклеотидів, описаних тут, і способи отримання такої рослини або рослинної клітини за допомогою цинк-пальцевої нуклеази-опосередкованого мутагенезу. Способи доставки білка "цинкові пальці" і цинк- пальцевої нуклеази у рослину тютюну є аналогічними тим, що описані нижче для доставки мегануклеази.
В іншому аспекті, пропонуються способи отримання мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних, або іншим чином генетично модифікованих рослин з використанням мегануклеаз, таких як І-Сте!І мегануклеаза. Природні мегануклеази, а також рекомбінантні мегануклеази, можуть використовуватися для цілеспрямованого створення дволанцюгового розриву в одному сайті або відносно невеликій кількості сайтів у геномній ДНК рослини з метою забезпечення порушення одного або більше полінуклеотидів, описаних тут. Мегануклеаза може бути генетично-інженерною (сконструйованою) мегануклеазою зі зміненими властивостями
ДНК-розпізнавання. Білки мегануклеази можуть доставлятися у клітини рослини за допомогою множини різних механізмів, відомих у даній галузі техніки.
Винахід охоплює використання мегануклеази для інактивації полінуклеотиду(ів) МІАВА4 або
МІМебу або МІМСЕВОа (або комбінації двох або більше, або трьох, або більше з них) у рослинній клітині або рослині. Зокрема, аспекти винаходу також відносяться до способу інактивації полінуклеотиду у рослині з використанням мегануклеази, який включає в себе: (а) отримання рослинної клітини, що містить один або більше полінуклеотидів, описаних тут; (б) введення мегануклеази або конструкції, що кодує мегануклеазу, у зазначену рослинну клітину; і (с) забезпечення можливості для мегануклеази істотно інактивувати полінуклеотид(и). бо Мегануклеази можуть використовуватися для розщеплення сайтів розпізнавання мегануклеази в межах кодувальних ділянок полінуклеотиду. Таке розщеплення часто призводить до делеції
ДНК у сайті розпізнавання мегануклеази з наступною репарацією мутагенної ДНК шляхом негомологічного з'єднання кінців. Такі мутації у кодувальній послідовності гену, як правило, є достатніми, щоб інактивувати ген. Цей спосіб модифікації рослинної клітини включає в себе, по- перше, доставку касети експресії мегануклеази у рослинну клітину, використовуючи відповідний спосіб трансформації. Для досягнення максимальної ефективності, бажано зв'язати касету експресії мегануклеази із селектовним маркером і вибирати успішно трансформовані клітини у присутності селективного агента. Такий підхід призведе до інтеграції касети експресії мегануклеази у геном, проте, це може бути небажаним, якщо рослина, ймовірно, потребуватиме схвалення регулюючих органів. У таких випадках касета експресії мегануклеази (і пов'язаний селектовний маркерний ген) можуть бути відокремлені в наступних поколіннях рослини з використанням звичайних селекційних способів. Альтернативно, рослинні клітини можуть бути із самого початку трансформовані за допомогою касети експресії мегануклеази, що не має селектовного маркера, і можуть вирощуватися у середовищі без селективного агента. У таких умовах, частка оброблених клітин набуде касету експресії мегануклеази і буде експресувати генно-інженерну мегануклеазу тимчасово без інтеграції касети експресії мегануклеази у геном.
Оскільки цей підхід не враховує ефективності трансформації, така остання процедура трансформації потребує, щоб більша кількість оброблених клітин піддавалася скринінгу для отримання бажаної модифікації геному. Вищезазначений підхід може також застосовуватися для модифікації рослинної клітини при використанні білка "цинкові пальці" або цинк-пальцевої нуклеази.
Після доставки касети експресії мегануклеази, рослинні клітини вирощують, на початковому етапі, в умовах, характерних для певної процедури трансформації, що була використана. Це може означати вирощування трансформованих клітин на носієві при температурах нижче 26"С, часто в темряві. Такі стандартні умови можуть застосовуватися протягом певного періоду часу, переважно 1-4 дні, щоб дозволити рослинній клітині відновитися після процесу трансформації.
У будь-який момент після цього початкового періоду відновлення, температура росту може бути підвищена, щоб стимулювати активність генно-інженерної мегануклеази для розщеплення і мутування сайту розпізнавання мегануклеази.
Для деяких застосувань може бути бажаним точно видалити полінуклеотид з генома рослини. Такі застосування є можливими за допомогою пари генно-інженерних мегануклеаз, кожна з яких розщеплює сайт розпізнавання мегануклеази по обидві сторони від передбачуваної делеції. Також можуть використовуватися ТАЇ -ефекторні нуклеази (ТАГ ЕМ), які здатні розпізнавати і зв'язуватися з геном та вводити дволанцюговий розрив у геном. Таким чином, в іншому аспекті, розглядаються способи отримання мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних, або іншим чином генетично модифікованих рослин, як описано тут, з використанням ТАЇ -ефекторних нуклеаз.
Рослини, що є придатними для використання в генетичній модифікації включають в себе однодольні і дводольні рослини і системи рослинних клітин, включаючи види з однієї з наступних родин: Асапіпасеає, А|Пасеєає, А|Ібігоетегіасеає, АтагуїПдасеає, Аросупасеає,
Агесасеає, Авієгасеає, Вепегідасєає, Віхасеає, Вгазвісасеає, Вготеїїасеає, Саппабасеавє,
СагуорнпуїПІасеає, СернаІотахасєає, Спепородіасєає, СоіІспісасєає, Сисигріїасєає, Оіозсогеасєає,
Ерпеадгасеає, Егуїтгохуіасеає, Еирпоїбіасєає, Рабврасеає, І атіасеає, І Іпасеає, І усородіасеєає,
Маїмасеає, Меїапіпіасеєає, Мивзасеає, Мупасеає, Муззасеає, Рарамегасеає, Ріпасєає,
Ріапіадіпасєає, Роасеає, Козасєає, Вибріасєає, Заїїсасєає, Заріпдасеає, 5оіапасеає, Тахасєавє,
Тпеасеає або Мііасеає.
Відповідні види можуть включати в себе членів родів АбеІто5спив5, АбБіе5, Асег, Адговії5,
АйПит, АїІбігоетегіа, Апапах, Апагодгарні5, Апагородоп, Апйетівіа, Агипао, Аїгора, Вегбегів, Веїа,
Віха, Вгаззіса, Саієпаціа, Сатеїйа, Сатріоїнеса, Саппабіз, Сарвісит, Сапнатив, Саїагапіпив, Серпаіоїахив, Спгузапптетит, Сіпспйопа, Сігии5, Сомїеа, СоІспісит, Соїєив5, биситів, Сиситойа,
Суподоп, Оаїцга, Оіапіпив, Оідіайв, Оіовзсогеа, ЕЇаєї5, ЕрПпеадга, Епапіпи5, Егуїйттохуїшт,
Еисаїуріиз, Еевіиса, Егадага, Саїапіпив, Спіусіпе, Сяозвзурішт, Неїйапійи5, Немуєа, Ногаєт,
Нуозсуативх, дЧаїгорна, ІГасіиса, Гіпит, І оїїшт, І иріпи5, І усорегвісоп, Гусородішит, Мапіної,
Медісадо, Мепійпа, Мівзсапіпи5, Мивза, Місойапа, Огуга, Рапісит, Рарамег, Рапйепіит,
Реппізешт, Решпіа, РІаїагі5, РпІєит, Ріпих5, Роа, Роіпзейціа, Роршив, Нашмоїа, Вісіпив, Ноза,
Засспагит, зЗаїїх, Запаціпайа, Зсороїйїа, бесаіє, бБоїапит, Богапйит, Зрапіпа, Зріпасеєа,
Тапасешт, Тахив, ТПпеобгота, Гийісозесаїє, Тийісит, Опіоіа, Мегаїгит, Міпса, Міїів і 2еа.
Відповідні види можуть включати в себе Рапісшт 5рр., Зогупит 5рр., Мізсапійи5 5рр.,
Засспагит 5рр., Егіапійи5 5рр., Рорши5 5рр., Апагородоп дегагаїй (бородач), Реппізешт бо ригригешт (слонова трава), РІаїагі5 агипаіпасеа (двокісточник тростинний), Суподоп дасіуюп
(бермудська трава), Ревбіиса агипаїпасеа (костриця лучна), Зрапіпа ресііпаїа (спатина витончена), Медісадо заїїма (люцерна), Агипдо допах (арундо тростяний), зесаїе сегеаїе (жито),
Заїїх 5рр. (верба), ЕЄисаїуріив 5рр. (евкаліпт), Тгйісозесаїе (тритикале - гібрид жита з пшеницею), бамбук, НеїЇапіпи5 аппии5 (соняшник), Сапйпатиз їіпсіогіи5 (сафлор), Удаїгорпа сигса5 (ятрофа),
Кісіпи5 соттипів (рицина звичайна), ЕІаеіз диїпеепзі5 (пальма), Гіпит изпаівззітит (льон),
Вгаззіса |ппсеа, Веїа мицЇдагі5 (цукровий буряк), Мапійої езсцепіа (маніок їстівний), І усорегвісоп езсціепішт (томат), ІГасіиса займа (салат-латук), Миза рагадізіаса (банан), Зоїапит їшбегозит (картопля), Вгазвіса оіІегасеа (броколі, цвітна капуста, брюссельська капуста), Сатеїа 5іпепвів (чай), Егадагіа апапазза (полуниця), Тпеобгота сасао (какас), СоїПеа агабіса (кава), Мй5 міпітега (виноград), Апапаз сотозиз (ананас), Сарзісит аппит (гострий і солодкий перець), АПит сера (цибуля), Сисцитіє те (диня), Сиситіє 5аїймиє (огірок), Сисигрйа тахіта (гарбуз великоплідний), Сисигрйа то5спайа (гарбуз мускатний), Зріпасеа оЇегасеа (шпинат), СйгиоПи5
Іапайш5 (кавун), Абеітоб5спив5 езсціепіи5 (бамія), бЗоїапит теїЇопдепа (баклажан), Коза 5рр. (роза), Оіапіпих сагуорпуїи5 (гвоздика), Рейшпіа 5рр. (петунія), Роіпзхеціа риЇспегтіта (пуансетія),
Гиріпиз аіІри5 (люпин), Опіоїа рапісціаїа (овес), польовиця (Адговії5 зрр.), Роршиз ігетиіоїдев5 (осика), Ріпиз 5рр. (сосна), Абіез 5рр. (ялина), Асег 5рр. (клен), Ногдешт уцідаге (ячмінь), Роа ргаїепвівз (тонконіг), І оЇйшт 5рр. (райграс) і РпІешт ргаїепзе (тимофіївка), Рапісит мігдаєйт (просо прутеподібне), Зогопит Бісоїог (сорго, суданська трава), Мібзсапійиє5 дідапіви5 (міскантус), Засспагит зр. (цукрова тростина), Рорши5 бБаїзатіїега (тополя), 7є6єа таув5 (кукурудза), Сіусіпе тах (соя), Вгаззіса париз (канола), Тгйсут аезіїмит (пшениця), Соззурійт пПігвишт (бавовна), Огула заїїма (рис), Неїапіпих5 аппии5 (соняшник), Медісадо заїїма (люцерна),
Веїа миїдагі5 (цукровий буряк) або Реппізешт діансит (просо африканське).
Різні варіанти відносяться до мутантних рослин, рослин, що не зустрічаються в природі, і трансгенних рослин, модифікованих з метою модулювання рівнів генної експресії, таким чином, отримуючи рослини, такі як рослини тютюну, в яких рівень експресії поліпептиду є модульованим у тканинах рослин, що представляють інтерес, порівняно з контрольною рослиною. Описані композиції і способи можуть бути застосовані до будь-яких видів роду
Місоїйапа, включаючи М. гливса і М. їарасит (наприклад, ГА В21, ЇМ КМ171, ТІ 1406, Вахта,
Са!рас, Регідиє, Веїіпнат 1000-1 та Реїісо). Інші види включають М. асашіїв, М усіїве а, М усіїзе їа маг тийШога, М усіїве па, М. аїіаїа, М. атріехісації5, М. агепівії, М усіїбве їа, М. Бепамідевії, М. репінатіапа, М. рідеїомії, М. ропаїіепвів, М. самісоїа, М. сіємеїІапайї, М. согайоїйа, М. согутроза, М. дерпеуї, М. ехсе|5іог, М. тогдейапа, М. їадгапв, М. діаийса, М. дішіпоза, М. доодзрееаії, М. дов55веї, М. пубтіа, М. іпдиїба, М. КажаКкатії, М. Кпідпапа, М. Іапдзаотії, М. Іпеагів, М. ІопоуШога, М усіїзе та,
М. теда!Іозірпоп, М. тіегвії, М. посійога, М. пидісаціїв, М. обіи5оїіа, М. оссідепіаїів5, М. оссідепіаїйїб
З5 5Ир5р. Пезрегіз5, М. оїорпога, М. рапісшата, М. раисшШога, М. решпіоіде5, М. ріитбБадіпноїіа, М. диадгіма!мі5, М. гаітопай, М. герапада, М. гозцШіаїа, М. го5цШіайа 5!ирз5р. іпдціба, М. "«отшпайоїа, М. зеїспеїй, М. вітшіапв, М. 5оЇапітоїйа, М. зредаггіпії, М. віосКюпії, М. 5цамеоЇеп5, М. зуїмевігів, М.
ТШутешога, М. Юютепіоза, М. тотепіовіїоптів, М. ідопорНпуїПа, М. итбгаїїса, М усіїве їа, М. меІшіпа,
М. мідапайіде5 та М. х запаегає.
Використання культурних сортів тютюну і елітних культурних сортів тютюну також розглядається тут. Трансгенна, що не зустрічається в природі, або мутантна рослина, таким чином, може бути сортом тютюну або елітним культурним сортом тютюну, який містить один або більше трансгенів, або одну або більше генетичних мутацій, або їх комбінацію. Генетична мутація(ї) (наприклад, один або більше поліморфізмів) може являти собою мутації, які не існують у природі в окремому сорті тютюну або культурному сорті тютюну (наприклад, елітному культурному сорті тютюну), або може являти собою генетичну мутацію), яка виникає природно за умови, що ця мутація не зустрічається в природі в окремому сорті тютюну або культурному сорті тютюну (наприклад, елітному культурному сорті тютюну).
Особливо корисні сорти Місойапа їарасит включають в себе тютюн типу Берлі, темного типу, димового сушіння і орієнтального типу. Необмежувальні приклади сортів або культурних сортів включають в себе наступні: ВО 64, СС 101, 2 200, СС 27, СС 301, СС 400, СС 500, СС 600, СС 700, СС 800, СС 900, СокКег 176, СоКег 319, СоКег 371 Сюоїд, Сокен48, СО 263, ОБ911,
РТ 538 І С СаїІрао юобрассо, СІ 26Н, СІ 350, І 600, 1 737, І 939, СІ 973, НВ 04Р, НВ 04РІС,
НВЗЗ307РІ С, Нубгіа 4031! С, Нубгіа 4041 С, Нубгіа 501 І С, К 149, К 326, К 346, К 358, КЗ394, К 399,
К 730, КОН 959, КТ 200, КТ2041С, КМ10, КМ14, КМ 160, КМ 17, КМ 171, КМ 907, КМ9071С,
КТУТАХІ 8 І С, І ІШе СтНепаеп, МеМаїк 373, МеМаїг 944, т5Км 14ХІ 8, Ма!їтоу»х І вєаї Мадоїє, Маттом
Ї єаї Мадоїє І С, МВН 98, М-126, М-7771 0, М-73711 С, МО 100, МО 102, МО 2000, МО 291, МО 297,
МО 299, МО 3, МО 4, МО 5, МО 6, МС7, МО 606, МО 71, МО 72, МО 810, МО ВН 129, МО 2002, Меаї
Зтій Мадоіїе, ОХРОНО 207, РО 73021С, РО 73091, РО 73912 І С, "Регідне" їорбассо, РМНОЗ, 60 РМНОЗ, РУНІТ9, РМН5О, РУН5БІ, А 610, А 630, А 7-11, А 7-12, Ва 17, Ва 81, Ва НО, Ван 4,
ван 51, 5 1410, б5реїдні 168, 5реїдні 172, Зреїдні 179, Зреїдні 210, 5реїдні 220, 5реїдні 225, зЗреїдні 227, Зреїдні 234, 5Зреїднпі 1-28, 5Зреїанпі 1-70, бреїданпі Н-6, бреїдні Н2гО, бреїдні МЕЗ, ТІ 1406, ТІ 1269, ТМ 86, ТМ861 С, ТМ 90, ТМ 97, ТМ971 С, ТМ 094, ТМ 0950, ТА (Тот ВРоззоп)
Мадо!є, МА 309, МАЗ359, АА 37 - В 1З3Р, Хапійпі (МіїспеїІ-Мог), ВеІ-ХМу3, 79-615, Затвип Ноїтев ММ,
КТКОС питрег 2 Нубгіа 49, Вигпіеу 21, КМ 8959, КМ 9, МО 609, РОО1, РО 04, РО, РО2, РОЗ, КО 11, Ва 8, МА 509, А5А4, Вапкеї А1, Вахта Огата В84/31, Вахта І 7існпа 7РА/В, Вазта Хапійі
ВХ 2А, Ваїек, Везикі дУетбег, С104, СоКег 347, СтіоПо Мівзіопего, ЮвїЇстезі, біебе! 81, ОМН 405,
Саїрао Сотит, НВО4Р, Ніскз5 Вгоадієа?ї, Кабакшак ЕіІаззопа, Київзаде ЕТ, ГА ВО 21, МО 2326, МС 297, РМУН2110, Вей Виззіап, Затвзип, ЗаріакК, 5іттава, ТаїЇдаг 28, М/ізіїса, Хауаідаа, Риїєр НО-72,
Риїєр Р2З, Рийер РВ 156/1, Риїер Р12-2/1, МаКа УК-48, МаКка ОВ 125/3, ТІ-1068, КОН-960, ТІ-1070,
ТМ/136, Вазта, ТКЕ 4028, 18, ТКЕ 2002, В141, Вахта хапійі, СНА149, 28153, Реїй Намапа.
Підсорти з незначними відмінностями вищезазначених сортів, навіть якщо не були конкретно ідентифіковані тут, також розглядаються.
Варіанти також відносяться до композицій і способів отримання мутантних, що не зустрічаються в природі, гібридних, або трансгенних рослин, які були модифіковані з метою модулювання експресії або активності полінуклеотиду МАВА4 або МіІМезу, або МІМСЕ02 (або комбінації двох або більше, або трьох, або більше з них), або поліпептиду МІАВА4 або МіМевбу, або МІМСЕЮ2 (або комбінації двох або більше, або трьох, або більше з них). Переважно, отримані мутантні, що не зустрічаються в природі, гібридні або трансгенні рослини можуть бути однаковими або по суті однаковими за зовнішнім виглядом з контрольною рослиною. Різні фенотипічні характеристики, такі як ступінь зрілості, кількість листя на рослині, висота стебла, кут вростання листа, розмір листа (ширина і довжина), відстань міжвузловини, співвідношення листової пластинки - головної жилки можуть оцінюватися за допомогою польових спостережень.
Одним з аспектів є насіння мутантної, що не зустрічається в природі, гібридної або трансгенної рослини, описаної тут. Переважно, насіння являє собою насіння тютюну. Іншим аспектом даного винаходу є пилок або сім'ябрунька мутантної, що не зустрічається в природі, гібридної або трансгенної рослини, описаної тут. Крім того, даний винахід пропонує мутантну, що не зустрічається в природі, гібридну або трансгенну рослину, як описано тут, яка додатково включає в себе нуклеїнову кислоту, що додає чоловічої стерильності.
Зо Винахід також пропонує тканинну культуру клітин, здатних до регенерації, мутантної, що не зустрічається в природі, гібридної або трансгенної рослини або їх частини, як описано тут, культура яких регенерує рослини, здатні до експресії всіх морфологічних та фізіологічних характеристик рослини-батька. Клітини, здатні до регенерації, включають в себе, але не обмежуються, клітини від листя, пилку, зародків, сім'ядолей, гіпокотилів, коренів, кінчиків коренів, пиловиків, квітів і їх частини, сім'ябруньок, пагонів, стовбурів, стебла, серцевини і коробочок або калюсу, або протопластів, отриманих з них.
Однією з цілей є створення мутантних, трансгенних, або таких, що не зустрічаються в природі, рослин, які виявляють модульовані рівні каротиноїду або бета-дамасценону, або модульовані рівні каротиноїду і бета-дамасценону, при збереженні по суті такого ж зовнішнього вигляду у порівнянні з контрольною рослиною. Відповідно, описуються мутантні, трансгенні або такі, що не зустрічаються в природі, рослини або рослинні клітини, які мають модульовані рівні каротиноїдів або бета-дамасценону, або модульовані рівні каротиноїдів і бета-дамасценону, в порівнянні з контрольними клітинами або контрольними рослинами. Мутантні, трансгенні або такі, що не зустрічаються в природі, рослини або рослинні клітини були модифіковані, щоб модулювати синтез або активність одного або більше ферментів, описаних тут, шляхом модулювання експресії одного або більше поліпептидів, що кодує полінуклеотидні послідовності, описані тут. Ще один аспект стосується мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини або клітини, в якій експресія або активність одного або більше ферментів, описаних тут, є модульованою, і частина рослини (наприклад, листя) має підвищення або зниження рівнів каротиноїдів принаймні на 595 порівняно з контрольною рослиною, в якій експресія або активність зазначеного ферменту(ів) не була модульована. Ще один аспект стосується мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини або клітини, в якій експресія неоксантінсинтази або активність білка, кодованого таким чином, є модульованою і, в якій рівні бета-дамасценону в аерозолі є підвищеними або зниженими принаймні на 595 порівняно з аерозолем від контрольної рослини.
Зміна вмісту каротиноїдів в порівнянні з контрольною рослиною може становити принаймні близько 595, принаймні близько 1095, принаймні близько 2095, принаймні близько 2595, принаймні близько 3095, принаймні близько 4095, принаймні близько 5095, принаймні близько 6096, принаймні близько 7095, принаймні близько 7595, принаймні близько 8095, принаймні 60 близько 9095, принаймні близько 9595, принаймні близько 9695, принаймні близько 9795,
принаймні близько 9895, принаймні близько 9995, або близько 10095, або більше, наприклад, 20095 або 30095, або більше.
Зміна вмісту бета-дамасценону в порівнянні з контрольною рослиною може становити принаймні близько 595, принаймні близько 1095, принаймні близько 2095, принаймні близько 25956, принаймні близько 3095, принаймні близько 4095, принаймні близько 5095, принаймні близько 6095, принаймні близько 7095, принаймні близько 7595, принаймні близько 8095, принаймні близько 9095, принаймні близько 9595, принаймні близько 9695, принаймні близько 9795, принаймні близько 9895, принаймні близько 9995, або близько 10095, або більше, наприклад, 20095 або 30095, або більше.
Відповідно, вміст лютеїну у частині рослини (наприклад, листі) становить принаймні близько 18 мг/100 г., відповідно, принаймні близько 18.5 мг/100 г., відповідно, принаймні близько 19 мг/100 г., відповідно, принаймні близько 19.5 мг/100 г., відповідно, принаймні близько 20 мг/100 г., відповідно, принаймні близько 25 мг/100 г. або більше.
Відповідно, вміст бета-каротину в частині рослини (наприклад, листі) становить принаймні близько 11.5 мг/100 г. зібраного рослинного (наприклад, листя) матеріалу, відповідно, принаймні близько 12 мг/100 г., відповідно, принаймні близько 12,5 мг/100, відповідно, принаймні близько 13 мг/100 г., відповідно, принаймні близько 13,5 мг/100 г, відповідно, принаймні 14 мг/100 г., відповідно, принаймні близько 14.5 мг/100 г., або відповідно, принаймні близько 15 мг/100 г. або більше.
Відповідно, вміст лютеїну у частині рослини (наприклад, листі) становить принаймні близько 18 мг/100 г. зібраного рослинного (наприклад, листя) матеріалу, відповідно, принаймні близько 18.5 мг/100 г., відповідно, принаймні близько 19 мг/100 г., відповідно, принаймні близько 19.5 мг/100 г., відповідно, принаймні близько 20 мг/100 г., відповідно, принаймні близько 25 мг/100 г. або більше, і вміст бета-каротину у частині рослини (наприклад, листі) становить принаймні близько 11.5 мг / 100 г, відповідно, принаймні близько 12 мг/100 г., відповідно, принаймні близько 12.5 мг/100 г., відповідно, принаймні близько 13 мг/100 г., відповідно, принаймні близько 13,5 мг/100 г, відповідно, принаймні 14 мг/100 г., відповідно, принаймні близько 14.5 мг / 100 г, або відповідно, принаймні близько 15 мг/100 г., або більше.
Відповідно, рівні бета-дамасценону в аерозолі спаленого або нагрітого листя становлять
Зо принаймні близько 1 нг/мг спаленого або зібраного рослинного (наприклад, листя) матеріалу, відповідно, принаймні близько 1,05 нг/мг, відповідно, принаймні близько 1,1 нг/мг, відповідно, принаймні близько 1,15 нг/мг, або відповідно, принаймні близько 2 нг/мг і більше.
Відповідно, () вміст лютеїну у частині рослини (наприклад, листі) становить принаймні близько 18 мг/100 г. зібраного рослинного (наприклад, листя) матеріалу, відповідно, принаймні близько 18.5 мг/100 г., відповідно, принаймні близько 19 мг/100 г., відповідно, принаймні близько 19.5 мг/100 г., відповідно, принаймні близько 20 мг/100 г.; відповідно, принаймні близько 25 мг/100 г. або більше; відповідно, (ії) вміст бета-каротину у частині рослини (наприклад, листі) становить принаймні близько 11.5 мг/100 г. зібраного рослинного (наприклад, листя) матеріалу, відповідно, принаймні близько 12 мг/100 г., відповідно, принаймні близько 12.5 мг/100 г., відповідно, принаймні близько 13 мг/100 г., відповідно, принаймні близько 13,5 мг/100 г, відповідно, принаймні 14 мг/100 г., відповідно, принаймні близько 14.5 мг/100 г. або відповідно, принаймні близько 15 мг/100 г. або більше; і (ії) відповідно, рівні бета-дамасценону в аерозолі спаленого або нагрітого листя становлять принаймні близько 1 нг/мг спаленого або зібраного рослинного (наприклад, листя) матеріалу, відповідно, принаймні близько 1,05 нг/мг, відповідно, принаймні близько 1,1 нг/мг, відповідно, принаймні близько 1,15 нг/мг, або відповідно, принаймні близько 2 нг/мг або більше.
Рослина може нагріватися до 100"С або вище, наприклад, принаймні 125"С, принаймні 1507С, принаймні 1757С або принаймні 20070 - для вивільнення аерозолю.
У ще одному аспекті, пропонується в мутантна, що не зустрічається в природі, або трансгенна рослина, в якій експресія ферменту, обраного з групи, що складається з неоксантінсинтази, лікопен-бета-циклази і 9-цис-епоксикаротиноїд діоксигенази або комбінації двох або більше, або трьох, або більше з них (зазначені комбінації описані тут), або активність білка, кодованого таким чином, є підвищеною, і (ї) вміст лютеїну у частині рослини (наприклад, листі) становить принаймні близько 18 мг/100 г. зібраного рослинного (наприклад, листя) матеріалу; (ії) вміст бета-каротину у частині рослини (наприклад, листі) становить принаймні близько 11.5 мг/100 г. зібраного рослинного (наприклад, листя) матеріалу; і (іїї) рівні бета- дамасценону в аерозолі спаленого або нагрітого листя становлять принаймні близько 1 нг/мг спаленого або зібраного рослинного (наприклад, листя) матеріалу. Відповідно, зовнішній вигляд зазначеної рослини, по суті, є таким же, що і зовнішній вигляд контрольної рослини. Відповідно, 60 рослина є рослиною тютюну.
Варіанти також відносяться до композицій і способів отримання мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних рослин, які були модифіковані з метою модулювання експресії або активності неоксантінсинтази; або експресії або активності лікопен-бета-циклази; або експресії або активності 9-цис-епоксикаротиноїд діоксигенази, що може привести до отримання рослин або рослинних компонентів (наприклад, листя, такого, як зелене листя або висушене листя) з модульованими рівнями каротиноїдів (наприклад, але не обмежуючись, лютеїну або бета-каротину, або обох) в порівнянні з контрольною рослиною. Варіанти також відносяться до композицій і способів отримання мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних рослин, які були модифіковані з метою модулювання експресії або активності комбінації двох або більше, або трьох або більше неоксантінсинтази, лікопен-бета-циклази і 9- цис-епоксикаротиноїд діоксигенази. Таким чином, один варіант стосується модулювання експресії або активності неоксантінсинтази, лікопен-бета-циклази і 9-цис-епоксикаротиноїд діоксигенази; інший варіант стосується модулювання експресії або активності неоксантінсинтази і лікопен-бета-циклази; інший варіант стосується модулювання експресії або активності неоксантінсинтази і 9-цис-епоксикаротиноїд діоксигенази; і інший варіант стосується модулювання експресії або активності лікопен-бета-циклази і 9-цис-епоксикаротиноїд діоксигенази або будь-якої іншої комбінації цих двох або більше послідовностей. Модулювання рівнів каротиноїдів у рослинах може мати поживну цінність для споживача, особливо коли рівні каротиноїдів у рослині є підвищеними. Модулювання вмісту каротиноїдів у рослині може використовуватися для створення рослин, стійких до гербіцидів, що інгібують біосинтез каротиноїдів, особливо коли рівні каротиноїдів у рослині є підвищеними. Таким чином, в одному конкретному варіанті, пропонуються композиції і способи отримання мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних рослин, які були модифіковані з метою підвищення експресії або активності вищезазначених полінуклеотидів і їх комбінацій, що може призвести до отримання рослин або рослинних компонентів (наприклад, листя, такого, як зеленого листя або висушене листя) з поліпшеними поживними перевагами або підвищеною стійкістю до гербіцидів. Варіанти також відносяться до композицій і способів отримання мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних рослин, які були модифіковані з метою модулювання експресії або активності неоксантінсинтази, що може призвести до отримання рослин або
Зо рослинних компонентів (наприклад, нагрітого висушеного листя) з модульованими рівнями бета-дамасценону в порівнянні з контрольною рослиною. Таким чином, в іншому варіанті, пропонуються композиції і способи отримання мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних рослин, які були модифіковані з метою модулювання експресії або активності неоксантінсинтази, що може призвести до отримання рослин або рослинного матеріалу, наприклад, нагрітого або спаленого висушеного листя тютюну, в яких рівні бета-дамасценону є модульованими. Таким чином, підвищення або зниження вмісту бета-дамасценону може призвести до отримання рослинного матеріалу зі зміненим смаковим профілем. В одному конкретному варіанті, пропонуються композиції і способи отримання мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних рослин, які були модифіковані з метою підвищення експресії або активності неоксантінсинтази, що може призвести до отримання рослин або рослинного матеріалу, наприклад, нагрітого або спаленого висушеного листя тютюну, в яких рівні бета-дамасценону є підвищеними. Підвищення вмісту бета-дамасценону може призвести до отримання рослинного матеріалу, який має смаковий профіль з ароматом печеного яблука.
Зниження вмісту бета-дамасценону може призвести до отримання рослинного матеріалу, який має модифікований смаковий профіль. Згідно з деякими варіантами, посилання на бета- дамасценону тут може також включати в себе його попередники. Така модифікація може також модулювати вміст каротиноїдів рослин.
Переважно, мутантні, що не зустрічаються в природі, або трансгенні рослини, отримані відповідно до способів, описаних тут, є подібними або по суті такими ж за зовнішнім виглядом до контрольних рослин. В одному варіанті, висота стебла мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних рослин по суті є такою ж, що і висота стебла контрольних рослин, наприклад, через один, два або три місяці після пересадження у поле, або 10, 20, 30 або 36 або більше днів після прищипування верхівки. Наприклад, висота стебла мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних рослин є не меншою, ніж висота стебла контрольних рослин. В іншому варіанті, вміст хлорофілу у мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних рослинах по суті є таким же, що і вміст хлорофілу у контрольних рослинах. В іншому варіанті висота стебла мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних рослин по суті є такою ж, що і висота стебла контрольних рослин, і вміст хлорофілу у мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних рослинах по суті є таким же, що і бо вміст хлорофілу у контрольних рослинах. В інших варіантах, розмір або форма, або кількість,
Зо або забарвлення листя мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних рослин по суті є такими ж, що і у контрольних рослин. Відповідно, рослина являє собою рослину тютюну.
В іншому аспекті, запропоновано спосіб модулювання вмісту каротиноїдів у принаймні частині рослини (наприклад, листі), що включає в себе наступні стадії: () модулювання експресії або активності ферменту, обраного з групи, що складається з неоксантінсинтази, лікопен-бета- циклази і 9-цис-епоксикаротиноїд діоксигенази або поєднання двох або більше, або трьох, або більше з них (зазначені комбінації описані вище) у рослині, переважно, в якій неоксантінсинтаза, лікопен-бета-циклаза і 9-цис-епоксикаротиноїд діоксигеназа включає в себе полінуклеотидну послідовність, описану тут, або поліпептидну послідовність, описану тут; (ії) вимірювання вмісту каротиноїдів у принаймні частині (наприклад, листі) мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини, отриманої на стадії (ії); та (ії) ідентифікацію мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини, в якій вміст каротиноїдів був модульований порівняно з контрольною рослиною. Відповідно, зовнішній вигляд зазначеної мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини по суті є таким же, що і зовнішній вигляд контрольної рослини. Відповідно, рослина являє собою рослину тютюну.
В іншому аспекті, пропонується спосіб підвищення вмісту каротиноїдів у принаймні частині рослини (наприклад, листі), що включає в себе наступні стадії: (|) підвищення експресії або активності ферменту, обраного з групи, що складається з неоксантінсинтази, лікопен-бета- циклази і 9-цис-епоксикаротиноїд діоксигенази або поєднання двох або більше, або трьох, або більше з них (зазначені комбінації описані вище) у рослині, переважно, в якій неоксантінсинтаза, лікопен-бета-циклаза і 9-цис-епоксикаротиноїд діоксигеназа включає в себе полінуклеотидну послідовність, описану тут, або поліпептидну послідовність, описану тут; (її) вимірювання вмісту каротиноїдів у принаймні частині (наприклад, листі) мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини, отриманої на стадії (ії); та (ії) ідентифікацію мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини, в якій вміст каротиноїдів був підвищений порівняно з контрольною рослиною. Відповідно, зовнішній вигляд зазначеної мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини по суті є таким же, що і зовнішній вигляд контрольної рослини. Відповідно, рослина являє собою рослину тютюну.
В іншому аспекті, пропонується спосіб зниження вмісту каротиноїдів у принаймні частині
Зо рослини (наприклад, листі), що включає в себе наступні стадії: () зниження експресії або активності ферменту, обраного з групи, що складається з неоксантінсинтази, лікопен-бета- циклази і 9-цис-епоксикаротиноїд діоксигенази або поєднання двох або більше, або трьох, або більше з них (зазначені комбінації описані вище) у рослині, переважно, в якій неоксантінсинтаза, лікопен-бета-циклаза і 9-цис-епоксикаротиноїд діоксигеназа включає в себе полінуклеотидну послідовність, описану тут, або поліпептидну послідовність, описану тут; (ії) вимірювання вмісту каротиноїдів у принаймні частині (наприклад, листі) мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини, отриманої на стадії (ії); та (ії) ідентифікацію мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини, в якій вміст каротиноїдів був знижений порівняно з контрольною рослиною. Відповідно, зовнішній вигляд зазначеної мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини по суті є таким же, що і зовнішній вигляд контрольної рослини. Відповідно, рослина являє собою рослину тютюну.
Підвищення експресії в порівнянні з контрольною рослиною може становити від близько 590 до близько 10095, або підвищення принаймні на 1095, принаймні на 2095, принаймні на 2595, принаймні на 3095, принаймні на 4095, принаймні на 5095, принаймні на 6095, принаймні на 7095, принаймні на 7595, принаймні на 8095, принаймні на 9095, принаймні на 9595, принаймні на 9890 або 10095 або більше, наприклад на 20095 або 30095, або більше, що включає в себе підвищення транскрипційної активності або експресії білка, або обох.
Підвищення активності в порівнянні з контрольною рослиною може становити від близько 595 до близько 10095, або підвищення принаймні на 1095, принаймні на 2095, принаймні на 2595, принаймні на 3095, принаймні на 4095, принаймні на 5095, принаймні на 6095, принаймні на 7095, принаймні на 7595, принаймні на 8095, принаймні на 9095, принаймні на 9595, принаймні на 9890 або 10095, або більше, наприклад на 20095 або 30095, або більше.
Зниження експресії в порівнянні з контрольною рослиною може становити від близько 595 до близько 10095, або зниження принаймні на 1095, принаймні на 2095, принаймні на 2595, принаймні на 3095, принаймні на 4095, принаймні на 5095, принаймні на 6095, принаймні на 7095, принаймні на 7595, принаймні на 8095, принаймні на 9095, принаймні на 9595, принаймні на 9895 або 10095, що включає в себе зниження транскрипційної активності або експресії білка, або обох.
Зниження активності в порівнянні з контрольною рослиною може становити від близько 595 60 до близько 10095, або зниження принаймні на 1095, принаймні на 2095, принаймні на 2595,
принаймні на 3095, принаймні на 4095, принаймні на 5095, принаймні на 6095, принаймні на 70905, принаймні на 7595, принаймні на 8095, принаймні на 9095, принаймні на 9595, принаймні на 9895 або 100965.
Підвищення вмісту каротиноїдів в порівнянні з контрольною рослиною може становити від близько 595 до близько 10095, або підвищення принаймні на 1095, принаймні на 2095, принаймні на 25965, принаймні на 3095, принаймні на 4095, принаймні на 5095, принаймні на 6095, принаймні на 7095, принаймні на 7595, принаймні на 8095, принаймні на 9095, принаймні на 9595, принаймні на 9895, або до 10095, або більше, наприклад на 20095 або 30095, або більше.
Зниження вмісту каротиноїдів в порівнянні з контрольною рослиною може становити від близько 595 до близько 10095, або зниження принаймні на 1095, принаймні на 2095, принаймні на 25965, принаймні на 3095, принаймні на 4095, принаймні на 5095, принаймні на 6095, принаймні на 7095, принаймні на 7595, принаймні на 8095, принаймні на 9095, принаймні на 9595, принаймні на 9895, або до 10095.
В іншому аспекті, запропоновано спосіб модулювання вмісту бета-дамасценону у рослині, що включає в себе наступні стадії: (ї) модулювання експресії або активності неоксантінсинтази у рослині, переважно, в якій неоксантінсинтаза включає в себе полінуклеотидну послідовність або поліпептидну послідовність, описані тут; (ії) вимірювання вмісту бета-дамасценону у принаймні частині мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини, отриманої на стадії () або у її аерозолі; та (ії) ідентифікацію мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини, в якій вміст бета-дамасценону був змінений порівняно з контрольною рослиною, в якій експресія або активність неоксантінсинтази не була модульована. Відповідно, зовнішній вигляд зазначеної мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини по суті є таким же, що і зовнішній вигляд контрольної рослини. Відповідно, рослина являє собою рослину тютюну. Відповідно, вміст бета-дамасценону вимірюється в аерозолі, що утворюється після нагрівання листя висушеного тютюну.
В іншому аспекті, запропоновано спосіб підвищення вмісту бета-дамасценону у рослині, що включає в себе наступні стадії: (ї) підвищення експресії або активності неоксантінсинтази у рослині, переважно, в якій неоксантінсинтаза включає в себе полінуклеотидну послідовність або поліпептидну послідовність, описані тут; (ії) вимірювання вмісту бета-дамасценону у принаймні
Зо частині мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини, отриманої на стадії (ї); та (ії) ідентифікацію мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини, в якій вміст бета-дамасценону був підвищений порівняно з контрольною рослиною, в якій експресія або активність неоксантінсинтази не була підвищена. Відповідно, зовнішній вигляд зазначеної мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини по суті є таким же, що і зовнішній вигляд контрольної рослини. Відповідно, рослина являє собою рослину тютюну. Відповідно, вміст бета-дамасценону вимірюється в аерозолі, що утворюється після нагрівання листя висушеного тютюну.
В іншому аспекті, запропоновано спосіб зниження або інгібування (наприклад, суттєвого інгібування) вмісту бета-дамасценону у рослині, що включає в себе наступні стадії: (ї) зниження або інгібування експресії або активності неоксантінсинтази у рослині, переважно, в якій неоксантінсинтаза включає в себе полінуклеотидну послідовність або поліпептидну послідовність, описані тут; (ії) вимірювання вмісту бета-дамасценону у принаймні частині мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини, отриманої на стадії (ї); та (ії) ідентифікацію мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини, в якій вміст бета-дамасценону був знижений або інгібований порівняно з контрольною рослиною, в якій експресія або активність неоксантінсинтази не була знижена або інгібована. Відповідно, зовнішній вигляд зазначеної мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини по суті є таким же, що і зовнішній вигляд контрольної рослини. Відповідно, рослина являє собою рослину тютюну. Відповідно, вміст бета-дамасценону вимірюється в аерозолі, що утворюється після нагрівання листя висушеного тютюну.
Підвищення експресії неоксантінсинтази в порівнянні з контрольною рослиною може становити від близько 595 до близько 10095, або підвищення принаймні на 1095, принаймні на 20965, принаймні на 2595, принаймні на 3095, принаймні на 4095, принаймні на 5095, принаймні на 6095, принаймні на 7095, принаймні на 7595, принаймні на 8095, принаймні на 9095, принаймні на 9595, принаймні на 9895, або на 10095 або більше, наприклад, на 20095 або 30095 і більше, яке включає в себе підвищення транскрипційної активності або експресії білка або їх обох.
Підвищення активності неоксантінсинтази в порівнянні з контрольною рослиною може становити від близько 595 до близько 10095, або підвищення принаймні на 1095, принаймні на 20965, принаймні на 2595, принаймні на 3095, принаймні на 4095, принаймні на 5095, принаймні на 60 6095, принаймні на 7095, принаймні на 7595, принаймні на 8095, принаймні на 9095, принаймні на
9595, принаймні на 9895, або на 10095 або більше, наприклад, на 20095 або 30095 і більше.
Зниження експресії неоксантінсинтази в порівнянні з контрольною рослиною може становити від близько 595 до близько 10095, або зниження принаймні на 1095, принаймні на 20965, принаймні на 2595, принаймні на 3095, принаймні на 4095, принаймні на 5095, принаймні на 6095, принаймні на 7095, принаймні на 7595, принаймні на 8095, принаймні на 9095, принаймні на 9595, принаймні на 9895, або на 10095, яке включає в себе зниження транскрипційної активності або експресії білка або їх обох.
Зниження активності неоксантінсинтази в порівнянні з контрольною рослиною може становити від близько 595 до близько 10095, або зниження принаймні на 1095, принаймні на 20965, принаймні на 2595, принаймні на 3095, принаймні на 4095, принаймні на 5095, принаймні на 6095, принаймні на 7095, принаймні на 7595, принаймні на 8095, принаймні на 9095, принаймні на 9595, принаймні на 9895, або на 10095 або більше.
Підвищення вмісту бета-дамасценону в порівнянні з контрольною рослиною може становити від близько 595 до близько 10095, або підвищення принаймні на 1095, принаймні на 2095, принаймні на 2595, принаймні на 3095, принаймні на 4095, принаймні на 5095, принаймні на 60965, принаймні на 7095, принаймні на 7595, принаймні на 8095, принаймні на 9095, принаймні на 95965, принаймні на 9895, або на 10095 або більше, наприклад, на 20095 або 30095 або більше.
Зниження вмісту бета-дамасценону в порівнянні з контрольною рослиною може становити від близько 595 до близько 10095, або зниження принаймні на 1095, принаймні на 2095, принаймні на 2595, принаймні на 3095, принаймні на 4095, принаймні на 5095, принаймні на 60965, принаймні на 7095, принаймні на 7595, принаймні на 8095, принаймні на 9095, принаймні на 95965, принаймні на 9895, або до 10095.
Полінуклеотиди і рекомбінантні конструкції, описані тут, можуть використовуватися для модуляції експресії ферментів, описаних тут, у видах рослин, що представляють інтерес, відповідно тютюні.
Ряд способів на основі полінуклеотидів може використовуватися для підвищення експресії генів у рослинах. Як приклад, конструкція, вектор або вектор експресії, що є сумісними з рослиною, що має піддаватися трансформації, можуть бути приготовані, при цьому вони містять ген, що представляє інтерес, разом з верхнім промотором, який здатний надекспресувати ген у
Зо рослині. Приклади промоторів описані тут. Після трансформації і при вирощуванні у відповідних умовах, промотор може стимулювати експресію з метою модулювання (наприклад, підвищення) рівнів цього ферменту в рослині або в її специфічній тканині. В одному ілюстративному варіанті, вектор, який містить в собі полінуклеотид МІАВА4 або МіМезу, або МІМСЕВ2 (або будь-яку з їх комбінацій, як описано тут), генерується для надекспресії гену в рослині. Вектор містить придатний промотор, наприклад, промотор вірусу мозаїки цвітної капусти Самм 355, вище від трансгену, поширюючи його конститутивну експресію у всіх тканинах рослини. Вектор може також містити ген стійкості до антибіотика з метою забезпечення вибору трансформованих калусів і клітинних ліній.
Різні варіанти, таким чином, відносяться до способів модулювання (наприклад, підвищення) рівня експресії полінуклеотиду МІАВА4 або МІМезу, або МІМСЕВО2 (або будь-якої з їх комбінацій, як описано тут) шляхом введення множинних копій полінуклеотиду в геном рослини, які включають в себе: трансформування рослинної клітини-господаря з вектором експресії, який містить промотор, функціонально-пов'язаний з полінуклеотидом МЕАВА4 або МіМебзу, або
МІМСЕЮ2. Поліпептид МАВА4 або МіМебЗу, або МІМСЕЮО2, який кодується рекомбінантним полінуклеотидом, може бути нативним поліпептидом, або може бути гетерологічним до клітини.
Згідно з винаходом, рослина тютюну, яка містить мутантний алель МІАВА4 або МІіМезЗу або
МІМСЕЮ2 (або будь-яких їх комбінацій, як описано тут) може використовуватися у програмі селекції рослин для створення корисних ліній, сортів і гібридів. Зокрема, мутантний алель вводиться шляхом інтрогресії в комерційно важливі сорти, описані вище. Таким чином, пропонуються способи селекції рослин, які включають в себе схрещування мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини, як описано тут, з рослиною, що має відмінну генетичну ідентичність. Спосіб може додатково включати схрещування рослини-нащадка з іншою рослиною і, необов'язково, повторення схрещування до тих пір, поки не буде отримано потомство з бажаними генетичними ознаками або генетичним фоном. Однією з цілей, яку переслідують такі способи селекції, є введення бажаної генетичної ознаки в інші сорти, селекційні лінії, гібриди або культурні сорти, особливо тих ознак, які представляють комерційний інтерес. Іншою ціллю є стимулювання стекінг-взаємодії генетичних модифікацій різних генів у сортах, лініях, гібридах або культурних сортах однієї рослини. Розглядаються внутрішньовидове, а також міжвидове схрещування. Рослини-нащадки, які виникають внаслідок бо таких схрещувань, які також згадуються як селекційні лінії є прикладами рослин, що не зустрічаються в природі, відповідно до винаходу.
В одному варіанті, пропонується спосіб отримання рослини тютюну, що не зустрічається в природі, який включає в себе: (а) схрещування мутантної або трансгенної рослини тютюну з другою рослиною тютюну для отримання насіння потомства тютюну, (б) вирощування насіння потомства тютюну, в умовах зростання рослини, для отримання рослини тютюну, що не зустрічається в природі. Спосіб може додатково включати в себе: (с) схрещування попереднього покоління рослини тютюну, що не зустрічається в природі, з собою або іншою рослиною тютюну для отриманням насіння потомства тютюну, (4) вирощування насіння потомства тютюну, отриманого на стадії (с), в умовах зростання рослини, для отримання додаткових рослин тютюну, що не зустрічаються в природі, і (є) повторення схрещування і вирощування за стадіями (с) і (4) кілька разів для отримання наступних поколінь рослин тютюну, що не зустрічаються в природі. Спосіб може необов'язково включати перед стадією (а), стадію отримання батьківської рослини, що містить генетичну ідентичність, яка характеризується, і яка не є ідентичною мутантній або трансгенній рослині. У деяких варіантах, залежно від програми селекції, стадії схрещування і вирощування повторюються від 0 до 2 разів, від 0 до З разів, від 0 до 4 разів, від 0 до 5 разів, від 0 до 6 разів, від 0 до 7 разів, від 0 до 8 разів, від 0 до 9 разів або від О до 10 разів, з метою отримання поколінь рослин тютюну, що не зустрічаються в природі.
Зворотне схрещування (беккрос) є прикладом такого способу, в якому потомство схрещується з одним зі своїх батьків або іншою рослиною, що є генетично подібною до свого батька, з метою отримання рослини-нащадка в наступному поколінні, яка має генетичну ідентичність, що є ближчою до генетичної ідентичності одного з батьків. Способи селекції рослин, зокрема селекції рослини тютюну, є добре відомими і можуть бути використані у способах за винаходом. Винахід додатково пропонує рослини тютюну, що не зустрічаються в природі, отримані цими способами.
У деяких варіантах способів, описаних тут, лінії, отримані в результаті селекції та скринінгу варіанту генів, оцінюються у польових умовах з використанням стандартних процедур польових досліджень. Контрольні генотипи, включаючи вихідну батьківську рослину, що не піддавалася мутагенезу, включені і посіви розташовані у полі відповідно до рандомізованого повноблочного плану або іншої відповідної структури поля. Для тютюну, використовуються стандартні агрономічні практики, наприклад, тютюн збирають, зважують і відбирають проби для хімічних та інших загальних тестів до і під час сушіння. Статистичні аналізи даних проводяться для підтвердження схожості обраних ліній з батьківською лінією. Цитогенетичні аналізи відібраних рослин необов'язково проводяться, щоб підтвердити взаємозв'язки хромосомних наборів та хромосомної кон'югації.
ДНК-дактилоскопія, одиничний нуклеотидний поліморфізм, мікросателітні маркери, або аналогічні технології, можуть використовуватися у програмі селекції з використанням відбору за допомогою маркерів (МА5) для передачі або селекції мутантних алелів гену в інші рослини тютюну, як описано тут. Наприклад, селекціонер може створити популяції після розщеплення від гібридизації генотипу, що містить мутантний алель з агрономічно бажаним генотипом.
Рослини у поколіннях Е2 або поколіннях, отриманих шляхом зворотного схрещування, можуть бути піддані скринінгу з використанням маркера, сконструйованого з геномної послідовності або її фрагмента, з використанням одного зі способів, перерахованих тут. Рослини, ідентифіковані як такі, що володіють мутантним алелем, можуть піддаватися зворотному схрещуванню або самозапилюватися для створення другої популяції, що має піддаватися скринінгу. Залежно від передбачуваної схеми спадкування або технології МА5, що використовується, може знадобитися самозапилювання обраних рослин перед кожним циклом зворотного схрещування для полегшення ідентифікації бажаних окремих рослин. Зворотне схрещування (беккросинг) або інша процедура селекції може повторюватися до тих пір, поки бажаний фенотип рекурентної батьківської форми не буде відновлено.
Відповідно до опису, у програмі селекції, успішні кроси дають покоління рослин Н1, які є фертильними. Відібрані рослини Е1 можуть схрещуватися з одним з батьків, і рослини першого покоління зворотного схрещування самозапилюються для отримання популяції, яка знову піддається скринінгу на предмет наявності варіантної експресії гену (наприклад, нульова версія гену). Процес зворотного схрещування (беккросинг), самозапилення та скринінг повторюється, наприклад, принаймні, 4 рази до тих пір, поки остаточний скринінг не забезпечить отримання рослини, що є фертильною і досить схожою на рекурентну батьківську рослину. Ця рослина, якщо бажано, самозапилюється, а потомство згодом піддається скринінгу знову для підтвердження того, що рослина виявляє варіантну експресію гену. У деяких варіантах, популяція рослини у поколінні Е2 піддається скринінгу на предмет наявності варіантної експресії гену, наприклад, рослина була ідентифікована як така, що не змогла експресувати поліпептид у 60 зв'язку з відсутністю гену відповідно до стандартних способів, наприклад, за допомогою способу
ПЛР з праймерами, на основі інформації про нуклеотидну послідовність щодо полінуклеотидів, включаючи полінуклеотид МАВА4 або МіМезу, або МІМСЕО2 (або будь-яку їх комбінацію), як описано тут.
Гібридні сорти тютюну можуть бути отримані шляхом запобігання самозапиленню жіночих батьківських рослин (тобто, батьківського насіння) першого сорту, дозволяючи пилку від чоловічих батьківських рослин другого сорту запліднювати жіночі батьківські рослини, і дозволяючи насінню гібрида Е1 формуватися на жіночих рослинах. Самозапиленню жіночих рослин можливо запобігти шляхом видалення незрілих маточок у квітах на ранній стадії розвитку квітки. Альтернативно, формуванню пилка можливо запобігти на жіночих батьківських рослинах шляхом використання форми чоловічої стерильності. Наприклад, чоловіча стерильність може бути отримана шляхом цитоплазматичної чоловічої стерильності (СМ5), або трансгенної чоловічої стерильності, де трансген інгібує мікроспорогенез та/або утворення пилку, або шляхом самонесумісності. Жіночі батьківські рослини, що містять СМ5, є особливо корисними. У варіантах, в яких жіночі батьківські рослини мають СМ5, пилок збирається з чоловічих фертильних рослин і наноситься вручну на приймочки СМ5 жіночих батьківських рослин, і отриманий врожай насіння Е1 збирають.
Сорти та лінії, описані тут, можуть використовуватися для формування простих гібридів Е1 (одиничним схрещуванням). У таких варіантах, рослини батьківських сортів можуть вирощуватися як по суті гомогенні суміжні популяції, щоб полегшити природне перехресне запилення від чоловічих батьківських рослин до жіночих батьківських рослин. Насіння РЕ1, сформоване на жіночих батьківських рослинах, вибірково збирають за допомогою звичайних засобів. Можливо також вирощувати два сорти батьківської рослини в загальній групі і зібрати врожай суміші Е1 гібридного насіння, сформованого на жіночій батьківській рослині, і насіння, сформованого на чоловічій батьківській рослині, в результаті самозапилення. Альтернативно, потрійне схрещування може здійснюватися, в якому простий (одиночний) гібрид 1 використовується як жіноча батьківська рослина, і схрещується з відмінною чоловічою батьківською рослиною. Як інша альтернатива, можуть створюватися подвійні гібриди, де потомство Е1 двох різних простих (одиночних) гібридів схрещується між собою.
Популяція мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних рослин може
Зо піддаватися скринінгу або відбору тих представників популяції, які мають бажану ознаку або фенотип. Наприклад, популяція потомства, отриманого шляхом одиночної трансформації, може піддаватися скринінгу на предмет пошуку тих рослин, які мають бажаний рівень експресії або активності МАВА4 або МіМебу, або МІМСЕО2, або поліпептиду, кодованого таким чином. Фізичні та біохімічні способи можуть використовуватися для ідентифікації рівнів експресії або активності. Вони включають в себе Саузерн-блотинг або ПЛР ампліфікацію для виявлення полінуклеотиду; Нозерн-блотинг, захист від РНКази 51, подовження праймера, або ЗТ-ПЛР ампліфікацію для виявлення РНК-транскриптів; ферментативні аналізи для виявлення активності ферменту або рибозиму поліпептидів і полінуклеотидів, а також гель-електрофорез білків, Вестерн-блотинг, імунопреципітацію та імуноферментний аналіз для виявлення поліпептидів. Інші способи, такі як локальна (іп 5йи) гібридизація, Фарбування ферменту та імунне фарбування і ферментний аналіз, також можуть використовуватися для виявлення присутності або експресії, або активності поліпептидів або полінуклеотидів.
Мутантні, що не зустрічаються в природі, або трансгенні рослинні клітини та рослини, описані тут, містять один або більше рекомбінантних полінуклеотидів, наприклад, один або більше ізольованих полінуклеотидів МІАВА4 або МіМезу, або МІМСЕО2 (або комбінації двох або більше, або трьох, або більше з них), одну або більше полінуклеотидних конструкцій, одну або більше дволанцюгових РНК, один або більше кон'югатів, або один або більше векторів / векторів експресії.
Без обмеження, рослини, описані тут, можуть бути модифіковані для інших цілей або до того, або після того, як експресія або активність була модульована згідно з даним винаходом.
Одна або більше з наступних генетичних модифікацій можуть бути присутньою у мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних рослинах. В одному варіанті, один або кілька генів, залучених до поглинання важких металів або транспорту важких металів, модифікуються, в результаті чого рослини або частини рослин (наприклад, листя) мають нижчий вміст важких металів, ніж у контрольних рослинах або їх частинах без модифікації (модифікацій).
Необмежувальні приклади включають гени, що належать до родини білка, асоційованого з множинною лікарською резистентністю, родини посередників катіонної дифузії (СОЕ), родини 2 п-, ІП-подібних білків (7ІР), родини катіонообмінників (САХ), родини транспортерів міді (СОРТ), родини АТФаз Р-типу важких металів (НМА5, як описано у УМО2009074325), родини гомологів бо природних резистентність-пов'язаних білків макрофагів (МКАМР), і родини АТФ-зв'язуючих касетних (АВС) транспортерів, які беруть участь у транспорті важких металів, наприклад, кадмію. Термін "важкий метал", як використовується тут, включає в себе перехідні метали. В іншому варіанті, один або більше генів, які беруть участь у конверсії азотистих проміжних продуктів метаболізму, модифікуються, в результаті чого рослини або частини рослин (наприклад, листя) при нагріванні виробляють нижчі рівні принаймні одного тютюн-специфічних нітрозамінів (наприклад, 4-(метилнітрозаміно)-1-(З-піридил)-1-бутанон, М-нітрозонорнікотин, М- нітрозоанатабін, і М-нітрозоанабазін), ніж контрольні рослини або їх частини. Необмежувальні приклади генів, які можуть бути модифіковані, включають гени, що кодують нікотин деметилазу, наприклад, СУР82Е4, СУР82Е5 і СУР82ЕТ10, які беруть участь у конверсії нікотину в норнікотин, і описані в патентах УУО2006091194, УМО2008070274, ММО2009064771 та РСТ/І52011/021088.
Приклади інших модифікацій включають резистентність до гербіцидів, наприклад, гліфосату, що є активним інгредієнтом багатьох гербіцидів широкого спектру дії. Гліфосат-резистентні трансгенні рослини були отримані шляхом передачі гену агоА (гліфосат ЕРБР синтетази від
ЗаІтопеїа їурпітигіит і Е.соїї). Сульфонілсечовина-резистентні рослини були отримані шляхом трансформації мутантного гену А! 5 (ацетолактат синтетази) від Арабідопсису. ОВ білок фотосистеми Ії від мутантної рослини Атагапіпив пургідиз був переданий рослинам для отримання атразин-резистентних трансгенних рослин; і бромоксініл-резистентні трансгенні рослини отримали шляхом включення гену Брхп від бактерії К/ервзіе/а рпеитопіає. Інша ілюстративна модифікація дозволяє отримати рослини, стійкі до ураження комахами- шкідниками. Токсини ВасіЇн5 ІПигіпдіеєпвіз (ВО можуть забезпечити ефективний спосіб затримки появи Ві-резистентних комах-шкідників, як нещодавно було проілюстровано на прикладі броколі, де пірамідні сгуїАс і стуЇС Ві гени контролювали міль капустяну, стійку до будь-якого одного білка, і значно затримали еволюцію стійких комах. Інша ілюстративна модифікація дозволяє отримати рослини, стійкі до захворювань, спричинених патогенними мікроорганізмами (наприклад, вірусами, бактеріями, грибками). Рослини, які експресують ген Хаг1 (резистентності до бактеріозу) із рослинами, що експресують, як злитий ген Ві, так і ген хітинази (резистентності до жовтого стеблового точильника і стійкості до захворювань піхви листка), були створені шляхом генної інженерії. Інша ілюстративна модифікація дозволяє отримати змінений репродуктивний потенціал, наприклад, чоловічу стерильність. Інша ілюстративна модифікація
Зо дозволяє отримати рослини, стійкі до абіотичних стресів (наприклад, посухи, температури, солоності), та стійкі трансгенні рослини отримані шляхом передачі ферменту ацилгліцеринфосфату від Арабідопсису; гени, що кодують маніт дегідрогеназу, (4 сорбітолдегідрогеназу, які беруть участь у синтезі маніту і сорбіту, покращують посухостійкість.
Інша ілюстративна модифікація дозволяє отримати рослини, які виробляють білки, що мають сприятливі імуногенні властивості для використання в організмі людини. Наприклад, рослини, здатні виробляти білки, в яких по суті відсутні альфа-1,3-пов'язані залишки фукози, бета-1,2- пов'язані залишки ксилози, або обидва, в яких може використовуватися М-глікан. Інші ілюстративні модифікації дозволяють отримати рослини з покращеними запасними білками і оліями, рослини з підвищеною ефективністю фотосинтезу, рослини з тривалим терміном зберігання, рослини з підвищеним вмістом вуглеводів, і рослини, стійкі до грибків; рослини, що кодують фермент, який бере участь у біосинтезі алкалоїдів. Також розглядаються трансгенні рослини, в яких експресія 5-аденозил-! -метіоніну (ЗАМ) та/або цистатіонін гамма-синтази (Со5) була модульована.
Одна або декілька таких ознак можуть вводиться шляхом інтрогресії у мутантні, що не зустрічаються в природі, або трансгенні рослини від іншої рослини або від культурного сорту тютюну, або можуть безпосередньо трансформуватися в ньому. Інтрогресія ознаки (ознак) у мутантні, що не зустрічаються в природі, або трансгенні рослини може бути досягнута будь- яким способом селекції рослин, відомим у даній галузі техніки, наприклад, шляхом схрещування потомства, зворотного схрещування (беккросу), подвійного гаплоїдного схрещування, тощо (див., М/етвтап, Е. А, апа Вийпу, В. б. 1987. СНнарієгї Земепівеп. Тобассо. Раде5 669-698 Іп:.
Сиіуаг ОемеІортепі. Стор бресіев. МІ. Н. Репйг (вд.), Масміїап Рибіївнпіпд Со, Іпс., Мем/ МогїКк, М.М 761 рр.). Способи на основі молекулярної біології, описані вище, зокрема КЕРІ Р і мікросателітні маркери, можуть використовуватися у таких беккроссах для ідентифікації потомства, що має найвищу ступінь генетичної ідентичності з рекурентним батьком. Це дозволяє прискорити селекцію сортів тютюну, що мають принаймні 9095, переважно принаймні 9595, більш переважно принаймні 9995 генетичну ідентичність з рекурентним батьком, ще більш переважно є генетично ідентичними рекурентному батьку, і додатково включають в себе ознаку(и), що була введена шляхом інтрогресії від донорської батьківської рослини. Таке визначення генетичної ідентичності може грунтуватися на молекулярних маркерах, відомих у даній галузі техніки. 60 Останнє покоління зворотного схрещування може самозапилюватися для отриманням чистого селекційного потомства для перенесення нуклеїнової кислоти (кислот). Отримані в результаті рослини, як правило, мають по суті всі морфологічні та фізіологічні характеристики мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних рослин тютюну за винаходом, на додаток до переданої ознаки (ознак) (наприклад, однієї або більше моногенних ознак). Точний протокол зворотного схрещування залежатиме від ознаки, що піддається зміні, з метою визначення відповідного протоколу тестування. Хоча способи зворотного схрещування спрощуються, коли ознака, що передається, є домінантним алелем, рецесивний алель також може передаватися. У цьому випадку, може знадобитися введення тестування потомства, щоб визначити, чи бажана ознака була успішно передана. Різні варіанти винаходу забезпечують мутантні, що не зустрічаються в природі, або трансгенні рослини, а також біомасу, в яких рівень експресії полінуклеотиду МАВА4 або МіМебЗу, або МІМСЕЮ2 (або будь-якої їх комбінації) є модульованим з метою модуляції вмісту каротиноїдів або бета-дамасценону в аерозолі, що утворюється після нагрівання висушеного тютюну, отриманого з рослин. Частини таких рослин, зокрема рослин тютюну, і більш конкретно листової пластинки і жилки тютюнових рослин, можуть бути включені чи використані при виготовленні різних витратних матеріалів, включаючи, але не обмежуючись, матеріали, що утворюють аерозоль, пристрої, що утворюють аерозоль, вироби для паління, курильні вироби, бездимні продукти і тютюнові вироби. Приклади матеріалів, що утворюють аерозоль, включають, але не обмежуються, тютюнові композиції, тютюни, екстракт тютюну, різаний тютюн, різаний наповнювач, сушений тютюн, підірваний тютюн, гомогенізований тютюн, відновлений тютюн і люлькові тютюни. Вироби для паління і курильні вироби є типами пристроїв, що утворюють аерозоль. Приклади виробів для паління або курильних виробів включають, але не обмежуються, сигарети, сигарили, і сигари. Приклади бездимних продуктів включають жувальний тютюн і нюхальний тютюн. У деяких пристроях, що утворюють аерозоль, не шляхом спалювання, тютюнові композиції чи інший матеріал, що утворює аерозоль, нагрівають одним або кількома електричними нагрівальними елементами для отримання аерозолю. В іншому типі пристрою, що утворює аерозоль шляхом нагрівання, аерозоль отримують шляхом передачі тепла від горючого паливного елемента або джерела тепла до фізично відокремленого матеріалу, що утворює аерозоль, який може бути розташований в межах, близько, суміжно або нижче за потоком від джерела тепла. Вироби з
Зо бездимного тютюну та різні тютюнові матеріали, що утворюють аерозоль, можуть містити тютюн у будь-якій формі, в тому числі як висушені частинки, стружку, гранули, порошки або суспензію, нанесені поверх, змішані всередині, або іншим чином поєднані з іншими інгредієнтами в будь- якому форматі, наприклад, пластівці, плівки, таблетки, піни, або гранули. Як використовується тут, термін "дим" використовується для опису типу аерозолю, який утворюється під час паління таких виробів, як сигарети, або при спалюванні матеріалу, що утворює аерозоль.
В одному варіанті, також пропонується висушений рослинний матеріал від мутантних, трансгенних, та таких, що не зустрічаються в природі, рослин тютюну, описаних тут. Процеси сушіння зеленого листя тютюну є відомими спеціалістам у даній галузі техніки і включають в себе, без обмеження, тіньове сушіння, вогневе сушіння, димове сушіння і сонячне сушіння.
Процес сушіння зеленого листя тютюну залежить від типу зібраного тютюну. Наприклад, тютюн типу Вірджинія світлий (Мігдіпіа бгідпО, як правило, піддається димовому сушінню, тютюн Берлі (Випйеу) і деякі темні штами зазвичай піддаються тіньовому сушінню, і люльковий тютюн, жувальний тютюн та нюхальний тютюн, як правило, піддаються вогневому сушінню.
В іншому варіанті, описуються тютюнові вироби, які включають в себе матеріали, що містять тютюн і утворюють аерозоль, включаючи листя, переважно висушене листя, виготовлені з листя мутантних рослин тютюну, трансгенних рослин тютюну або рослин тютюну, що не зустрічаються в природі, описаних тут. Тютюнові вироби, описані тут, можуть бути змішаними тютюновими виробами, які можуть додатково містити тютюн від немодифікованих рослин.
Відсоток кротиноїду або бета-дамасценону абобдо каротиноїду і бета-дамасценону в цих курильних виробах і бездимних продуктах та їх аерозолях може становити принаймні близько на 5905, 1095, 1595, 2095, 2590, 3095, З5Ую, 4090, 4595, 5090, 550, бОбю, 6595, 7090, 7595, 809, 85905, 9095, 9595, 9695, 9795, 9895, 9995 ії 10095 або вище, наприклад на 20095 або 30095, або вище, порівняно з витратними матеріалами, отриманими від немутантних, що не зустрічаються в природі, або нетрансгенних відповідних рослин.
Відсоток кротиноїду або бета-дамасценону абобдо каротиноїду і бета-дамасценону в цих курильних виробах і бездимних продуктах та їх аерозолях може становити принаймні близько на 5905, 1095, 1595, 20905, 2590, 3090, 3590, 40905, 45905, 209, 559, бо, бю, 7090, 75905, 8090, 8590, 9095, 9595, 9690, 9795, 9890, 99905 і 100905 нижче порівняно з витратними матеріалами, отриманими від немутантних, що не зустрічаються в природі, або нетрансгенних відповідних рослин. бо Мутантні, що не зустрічаються в природі, або трансгенні рослини можуть мати інше застосування, наприклад, у сільському господарстві. Наприклад, мутантні, що не зустрічаються в природі, або трансгенні рослини, описані тут, можуть використовуватися для виготовлення тваринного корму і продуктів харчування людини.
Винахід також стосується способів отримання насіння, який включає в себе вирощування мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини, описаних тут, і збирання насіння з вирощених рослин. Насіння від рослин, описаних тут, може бути оброблене і упаковане в пакувальному матеріалі за допомогою засобів, відомих у даній галузі техніки, для отримання готового виробу. Пакувальний матеріал, такий як папір і тканина, є добре відомими у даній галузі техніки. Пакет насіння може мати маркування, наприклад, ярлик або етикетку, прикріплені до пакувального матеріалу, етикетку, надруковану на пакувальному матеріалі, яка описує характеристику насіння, що знаходиться всередині.
Ще один аспект стосується способу виробництва бета-дамасценону, який включає в себе стадії: (а) отримання частини мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини; біомаси, насіння або листя, або тютюнового виробу, як описано тут, і (Б) їх нагрівання.
Композиції, способи та набори для генотипування рослин для ідентифікації, відбору або селекції можуть містити засоби для виявлення наявності полінуклеотиду МІАВА4 або МіМезу, або МІМСЕЮ2 (або комбінації двох або більше, або трьох, або більше з них) у зразку полінуклеотиду. Відповідно, описується композиція, яка містить один або більше праймерів (наприклад, один або більше праймерів або зондів, які містять, складаються або складаються по суті з в послідовності, що представлена у 5ЕО ІЮ МО: 3-5, 10-12 або 14-16) для специфічної ампліфікації принаймні частини одного або більше полінуклеотидів, і необов'язково один або більше зондів і, необов'язково один або більше реагентів для проведення ампліфікації або для виявлення.
Відповідно, описані ген-специфічні олігонуклеотидні праймери або зонди, що містять близько 10 або більше суміжних полінуклеотидів, які відповідають полінуклеотиду МІАВА4 або
МіМезу, або МІМСЕО2. Зазначені праймери або зонди можуть містити або складатися з близько 15, 20, 25, 30, 40, 45 або більше 50 суміжних полінуклеотидів, що гібридизують (наприклад, спеціально гібридизують) з полінуклеотидом МІАВА4 або МіІМезЗу, або МІМСЕЮО2. У деяких варіантах, праймери або зонди можуть містити або складатися з близько від 10 до 50 суміжних нуклеотидів, близько від 10 до 40 суміжних нуклеотидів, близько від 10 до 30 суміжних нуклеотидів, або близько від 15 до 30 суміжних нуклеотидів, які можуть використовуватися у послідовність-залежних способах ідентифікації гену (наприклад, гібридизації за Саузерном) або ізоляції (наприклад, /л7 5йи гібридизації колоній бактерій або бляшок бактеріофага), або виявлення генів (наприклад, як один або більше праймерів ампліфікації при ампліфікації або виявленні нуклеїнової кислоти). Один або більше специфічних праймерів або зондів можуть бути сконструйовані і використані для ампліфікації або виявлення частини або усього полінуклеотиду МАВА4 або МіМезЗу, або МІМСЕЮ2. Як конкретний приклад, два праймери можуть використовуватися у протоколі полімеразної ланцюгової реакції для ампліфікації фрагмента нуклеїнової кислоти, який кодує нуклеїнові кислоти МАВА4 або МіМезу, або
МІМСЕО2, такі як ДНК або РНК. Полімеразна ланцюгова реакція також може виконуватися з використанням одного праймеру, похідного від послідовності нуклеїнової кислоти МАВА4 або
МіМезу, або МІМСЕО2, і другого праймеру, який гібридизує з послідовністю вище або нижче послідовності нуклеїнової кислоти МІАВА4 або МіМебЗу, або МІМСЕО2, такою як послідовність промотору МІАВА4 або МіМебзу, або МІМСЕО2, 3'-кінець мРНК попередника або послідовність, похідна з вектора, тощо. Приклади термічних та ізотермічних способів, придатних для /л уУйго ампліфікації полінуклеотидів, є добре відомими у даній галузі техніки. Зразок може бути або може походити з рослини, рослинної клітини або рослинного матеріалу, або тютюнового виробу, виготовленого або похідного з рослини, рослинної клітини або рослинного матеріалу, як описано тут.
У іншому аспекті, пропонується також спосіб виявлення полінуклеотиду МІАВА4 або МІМезу, або МІМСЕО2 (або комбінації двох, або більше, або трьох, або більше з них) у зразку, який включає в себе стадію: (а) отримання зразка, що містить, або імовірно містить полінуклеотид, (Б) контактування зазначеного зразка одним або більше праймерами, або одним або більше зондами для виявлення зокрема принаймні частини полінуклеотиду(ів), і (с) виявлення наявності продукту ампліфікації при цьому наявність продукту ампліфікації свідчить про присутність полінуклеотиду(ів) у зразку. В іншому аспекті, також пропонується використання одного або більше праймерів або зондів для виявлення зокрема принаймні частини полінуклеотиду(ів). Також пропонуються набори для виявлення принаймні частини полінуклеотиду(ів), які містять один або більше праймерів або зондів для виявлення зокрема бо принаймні частини полінуклеотиду(ів). Набір може містити реагенти для полінуклеотидної ампліфікації наприклад, для полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), або реагенти для технології гіоридизації-виявлення із зондом для нуклеїнової кислоти, наприклад, Саузерн- блотингу, Нозерн-блотингу, іп 5йи гібридизації, або гібридизації на мікрочипах. Набір може містити реагенти для технології антитілозв'язуючого виявлення, наприклад, Вестерн-блотингу,
ЕГПІЗА5, ЗЕ ОЇ мас-спектрометрії або тест-смужок. Набір може містити реагенти для секвенування ДНК. Набір може містити реагенти та інструкції для визначення вмісту каротиноїдів (наприклад, лютеїну або бета-каротину, або лютеїну і бета-каротину) і бета- дамасценону або вмісту бета-дамасценону. Набір може містити реагенти та інструкції для визначення вмісту каротиноїдів (наприклад, лютеїну або бета-каротину, або лютеїну і бета- каротину) і бета-дамасценону або вмісту бета-дамасценону.
У деяких варіантах, набір може включати в себе інструкції для одного або більше описаних способів. Описані набори можуть бути корисними для визначення генетичної ідентичності, філогенетичних досліджень, генотипування, гаплотипування, аналізу родоводу або селекції рослин, особливо з кодомінантним скорингом. Даний винахід також пропонує спосіб генотипування рослини, рослинної клітини або рослинного матеріалу, що містить полінуклеотид, як описано тут. Генотипування забезпечує засоби для розрізнення гомологів пари хромосом і може використовуватися для диференціації сегрегантів у популяції рослин.
Способи молекулярних маркерів можуть використовуватися для філогенетичних досліджень, для характеризування генетичних відносин між сортами сільськогосподарських культур, ідентифікації схрещувань (кросів) або соматичних гібридів, локалізації хромосомних сегментів, що впливають на моногенні риси, клонування на основі генетичних мап, і дослідження кількісної спадковості. Певний спосіб генотипування може використовувати будь-яку кількість аналітичних способів на основі молекулярних маркерів, включаючи поліморфізми довжини фрагмента ампліфікації (АРІ Р). АБРГ Р є продуктом алельних відмінностей між фрагментами ампліфікації, спричиненими варіативністю нуклеотидної послідовності. Таким чином, даний винахід додатково пропонує засоби для подальшої сегрегації одного або більше генів, або нуклеїнової кислоти, а також хромосомних послідовностей, генетично-пов'язаних з цими генами або нуклеїновими кислотами, з використанням таких способів, як аналіз АРІ Р.
В одному варіанті, також пропонується висушений рослинний матеріал від мутантних, трансгенних, та таких, що не зустрічаються в природі, рослин, описаних тут. Наприклад, процеси сушіння зеленого листя тютюну є відомими спеціалістам у даній галузі техніки і включають в себе, без обмеження, тіньове сушіння, вогневе сушіння, димове сушіння і сонячне сушіння. Процес сушіння зеленого листя тютюну залежить від типу зібраного тютюну.
Наприклад, тютюн типу Вірджинія світлий (Мігдіпіа бгіднО, як правило, піддається димовому сушінню, тютюн Берлі (Вигієу) і деякі темні штами зазвичай піддаються тіньовому сушінню, і люльковий тютюн, жувальний тютюн та нюхальний тютюн, як правило, піддаються вогневому сушінню.
В іншому варіанті, описуються тютюнові вироби, які включають в себе тютюнові вироби, що містять листя, переважно висушене листя, з мутантних, трансгенних або таких, що не зустрічаються в природі, рослин, описаних тут, або які виготовляються способами, описаними тут. Тютюнові вироби, описані тут, можуть додатково містити не модифікований тютюн.
В іншому варіанті, описуються тютюнові вироби, що містять рослинний матеріал, переважно листя, наприклад, висушене листя, від мутантних, трансгенних, та таких, що не зустрічаються в природі, рослин, описаних тут. Наприклад, рослинний матеріал може додаватися до внутрішньої або зовнішньої частини тютюнового виробу, таким чином, при спалюванні вивільняється бажаний аромат. Тютюновий виріб відповідно до цього варіанту може бути навіть немодифікованим тютюном або модифікованим тютюном. Тютюновий виріб відповідно до цього варіанту може навіть бути отриманим від мутантної, трансгенної або такої, що не зустрічається в природі, рослини, яка має модифікації в одному або більше генах, інших ніж гени, що описані тут.
Ще один аспект стосується ізольованого полінуклеотиду, який містить, складається або складається по суті з послідовності, що кодує лікопен-бета-циклазу і, яка має принаймні 6095 ідентичності послідовності з ЕС ІО МО: 8. Ще один аспект стосується ізольованого полінуклеотиду, який кодується цим полінуклеотидом. Ще один аспект стосується ізольованого полінуклеотиду, який має принаймні 8795 ідентичності послідовності з «ЕО ІЮО МО: 9. Ще один аспект стосується конструкції, вектору або вектору експресії, який містить ізольований полінуклеотид. Інший аспект стосується мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослинної клітини, яка містить ізольований полінуклеотид, поліпептид або конструкцію, вектор або вектор експресії, у якій експресія або активність лікопен-бета-циклази є 60 модульованою в порівнянні з контрольною рослиною або рослиною дикого типу, переважно, в якій експресія або активність неоксантінсинтази і 9-цис-епоксикаротиноїд діоксигенази є також модульованою. Ще один аспект стосується мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини, яка містить рослинну клітину. Ще один аспект стосується способу модулювання вмісту каротиноїдів у рослині, який включає в себе стадії: () модулювання експресії або активності лікопен-бета-циклази у рослині, переважно, в якій лікопен-бета-циклаза має полінуклеотидну послідовність або поліпептидну послідовність, описані тут; (ії) вимірювання вмісту каротиноїдів принаймні у частині мутантної що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини, отриманої на стадії (і), та (ії) ідентифікації мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини, в якій вміст каротиноїдів було змінено порівняно з контрольною рослиною, в якій експресія або активність лікопен-бета-циклази не була модульована. У одному варіанті, експресія або активність лікопен-бета-циклази або 9-цис- епоксикаротиноїд діоксигенази; і лікопен-бета-циклази і 9-цис-епоксикаротиноїд діоксигенази є також модульованою. Ще один аспект стосується мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини або рослинного матеріалу, що походить або може походити з такої рослини, отриманих або таких, що можуть бути отримані цим способом. В іншому аспекті пропонується мутантна, що не зустрічається в природі, або трансгенна рослина, в якій експресія лікопен-бета-циклази або активність білка, кодованого таким чином, була підвищена; в якій вміст лютеїну у зеленому листі або вміст бета-каротину, або їх комбінований вміст у рослині є вищим, ніж у контрольній рослині, в якій експресія або активність лікопен-бета-циклази не була підвищена, переважно, де (ії) вміст лютеїну у зеленому листі рослини становить принаймні близько 17 мг/100 г (наприклад, принаймні близько 17.5 мг/100 г.; принаймні близько 18 мг/100 г.. принаймні близько 18.5 мг/100 г. або принаймні близько 19 мг/100 г.); (її), де вміст бета- каротину у рослині становить принаймні близько 10 мг/100 г (наприклад, принаймні близько 10.5 мг / 100 г.; принаймні близько 11 мг/100 г., принаймні близько 11.5 мг/100 г. або принаймні про 12 мг/100 г.). В іншому аспекті пропонується рослинний матеріал, що включає в себе біомасу, насіння або листя, які містять клітини або тканини рослини. Ще один аспект стосується тютюнового виробу, який містить рослинні клітини, принаймні частину рослини або рослинний матеріал. Ще один аспект стосується ізольованого полінуклеотиду, який містить, складається або складається по суті з послідовності, що кодує 9-цис-епоксикаротиноїд діоксигеназу, і має
Ко) принаймні 6095 ідентичності послідовності з 5ЕО ІЮ МО: 13. Ще один аспект стосується ізольованого поліпептиду, який кодується цим полінуклеотидом. Ще один аспект стосується конструкції, вектору або вектору експресії, який містить ізольований полінуклеотид. Ще один аспект відноситься мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослинної клітини, що містить ізольований полінуклеотид, поліпептид або конструкцію, вектор або вектор експресії і, в якій експресія або активність 9-цис-епоксикаротиноїд діоксигенази є модульованою в порівнянні з контрольною рослиною або рослиною дикого типу, переважно, в якій експресія або активність неоксантінсинтази, або лікопен-бета-циклази; або неоксантінсинтази і лікопен-бета- циклаза також є модульованою. Ще один аспект стосується мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини, яка містить рослинну клітину. Ще один аспект стосується способу модулювання вмісту каротиноїдів у рослині, який включає в себе стадії: (і) модулювання експресії або активності 9-цис-епоксикаротиноїд діоксигенази у рослині, переважно, в якій 9-цис-епоксикаротиноїд діоксигеназа має полінуклеотидну послідовність або поліпептидну послідовність, описані тут; (і) вимірювання вмісту каротиноїдів принаймні у частині мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини, отриманої на стадії (і), та (ії) ідентифікації мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини, в якій вміст каротиноїдів було змінено порівняно з контрольною рослиною, в якій експресія або активність 9-цис-епоксикаротиноїд діоксигенази не була модульована. В одному варіанті, експресія або активність неоксантінсинтази або лікопен-бета-циклази; і неоксантінсинтази і лікопен-бета-циклаза також є модульованою. Ще один аспект стосується мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини або рослинного матеріалу, що походить або може походити з неї, який було отримано або може бути отримано цим способом. Ще один аспект стосується мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини, в якій експресія з 9-цис-епоксикаротиноїд діоксигенази або активність білка, кодованого таким чином, була підвищена; в якій вміст лютеїну у зеленому листі або вміст бета-каротину або їх комбінований вміст у рослині є вищим, ніж у контрольній рослині, в якій експресія або активність 9-цис-епоксикаротиноїд діоксигенази не була підвищена, переважно, в якій: (ї) вміст лютеїну у зеленому листі рослини становить принаймні близько 15 мг/100 г. (наприклад, принаймні близько 15.5 мг/100 г.; принаймні близько 16 мг/100 г., принаймні близько 16.5 мг/100 г. або принаймні близько 17 мг/100 г.); і (ії) вміст бета-каротину у рослині становить принаймні близько 60 11 мг/100 г. (наприклад, принаймні близько 11.5 мг/100 г.; принаймні близько 12 мг/100 г.,
принаймні близько 12.5 мг/100 г. або принаймні близько 13 мг/100 г.). Ще один аспект стосується рослинного матеріалу, який включає в себе біомасу, насіння або листя, які містять клітини або тканини рослини. Ще один аспект стосується тютюнового виробу, який містить рослинні клітини, принаймні частину рослини або рослинний матеріал.
Винахід додатково описано в наведених нижче Прикладах, які мають на меті більш докладно описати винахід. Ці приклади, що визначають переважний спосіб, який наразі розглядається для реалізації даного винаходу, призначені для ілюстрації, а не для обмеження винаходу.
ПРИКЛАДИ
Приклад 1: Клонування АВАА від Місоїїпіа ї(абасит
Кодувальна послідовність Місоїїпіа їабасит, огомологічна до АВА4, є ектопічно експресованою. Ген називається Місоїїпіа їабасит АВА4 (МАВА4) на основі гомології послідовності з А. Іпаійапа АВА4. МІАВАА є геном, що належить до розширеної "сім'ї" ферментів неоксантінсинтази, який каталізує утворення транснеоксантіну від віолаксантіну. Генний продукт досить імовірно буде локалізований у пластидах за аналогією з АГАВАХА і відповідно до аналізів
МО ЕРБЗОКТ. Повнорозмірна кодувальна послідовність з 663 кілобаз (КБ) ідентифікується і ампліфікується за допомогою листя К326 кКДНК як ПЛР шаблон, клонується у вектор шлюзу рРЕМТК (Іпмігодеп), секвенується і переноситься у ркК2Уус7 (вектор шлюзу, отриманий від
Напаег5 Іпіегипімегейу Іпзійше Тог ВіотесппоЇоду, сепі, Веїдіит (Гент, Бельгія)) для конститувної експресії у Місоїіпіа їабасит. Нуклеотидні та амінокислотні послідовності МАВАА представлені у
ЗБЕО ІО МО 1 і 5ЕО ІО МО 2, відповідно, на Фігурі 2. МІАВА4 виявляє 6595 ідентичність на амінокислотному рівні з білком Арабідопсису ЛІАВАЯ4, АЦ9б7080. ПЛР -ампліфікація, починаючи з
ГДНК від сорту тютюну Ніскб5 Вгоадієаї як шаблону, дозволила нам ідентифікувати гомолог
МАВА4 з 1808 пар основ (Бр). Порівнюючи послідовності КДНК і гДНК, була виведена генна структура для демонстрації того, що МАВА4 має 4 інтрони і 5 екзонів (Фігура ЗА). Існують відмінності між ізоформами МАВвВА4 КЗ26 і Ніск5 ВГ. (Фігура 38). Амінокислотна послідовність
МАВА4 від Ніске Вгоаадієаї має 9795 ідентичність з послідовністю КЗ326, що обумовлена різницею 6 амінокислот і одним відсутнім серином у положенні 9 (Фігура 3С). Як засвідчено порівняннями маркерів експресованих послідовностей, геномна послідовність МАВА4 не є псевдо геном, оскільки маркер експресованої послідовності (АМ824569), який має ідентичні ознаки на М-кінці, був ідентифікований у бібліотеці послідовностей МСВІ, в умовах стресу від низьких температур, від тютюну 5ММ. Для генної інженерії тютюну, КЗ26 кКДНК послідовність
МАВА4 використовується і конститутивно експресується у ТМУ90 під контролем активного вірусного промотору Саму355.
Приклад 2: Клонування неоксантінсинтази (Мезу) від Місоїіпіа їарасит
Мезу (лікопен-бета-циклаза), подібно до АВА4, каталізує утворення неоксантіну (цис- неоксантіну) від віолаксантіну (див. Фігуру 1). Цей фермент ймовірно локалізований у пластидах (на основі гомології з Мебу Агабрідорвіз Ійаійапа). Починаючи з послідовності, наявної в базі даних ТОЇ, повнорозмірна кодувальна послідовність з 1482 КЬ (див. Фігуру 4) ампліфікується від
РНК КЗ26, клонується у вектор шлюзу рРЕМТЕ (Іпмігодеп), секвенується і субклонується у вектор шлюзу рК2МІс7 (отриманий від Ріапаег5 Іпіегипімегейу Іпвійше ог ВіоїесппоІоду, Сепі, ВеІдійт) для надекспресії. ВАС-клон ідентифікується. Геномна послідовність, присутня на цьому ВАС- клоні, свідчить про те, що МіМебу не має інтрону у геномній структурі і дуже ймовірно є однокопійним геном у тютюні. кКДНК КЗ26 МІМебу є конститутивно експресованою у ТМ90 під контролем промотору СамМмуз355 для порівняння з рослинами 355::МАВА4.
Приклад 3: Клонування 9-цис-епоксикаротиноїд діоксигенази (СЕО2) від Місоїїпіа тарасит
СЕОВ2 (9-цис-епоксикаротиноїд діоксигеназа) каталізує розщеплення цис-неоксантіну у Сг5- аленовому-апо-альдегіді та ксантоксині (див. Фігуру 1). МІСЕЮ2 поділяє активну гомологію з
АЇМСЕОВЯА4 Арабідопсису, який є присутнім у пластоглобулах і, ймовірно, розщеплює неоксантіну в хлоропласті листя. Фрагмент КДНК тютюну ідентифікується у базі даних ТОЇ. Виходячи з цього, часткова послідовність (407рр) клонується увектор шлюзу рЕМТК (Іпмігодеп), секвенується і субклонується у вектор шлюзу рК7СУММИ2 (І), отриманий від Ріападеге
Іптегипіметгейу Іпвійше ог Віоїесппоіоду, Сепі, ВеЇдішт. У цьому випадку, фрагмент МІСЕО2 експресується як шпилькова РНК у рослинах тютюну, індукуючи сайленсінг генів відповідного ендогенного транскрипту МІСЕ02 (Фігура 5).
Приклад 4: Інженерія тютюну сорту Берлі ТМ90О (Вигієу) з КДНК МАВА4
Бінарний плазмід рК2М7, що містить кодувальну послідовність МАВА4 (Фігура 2), генерується для надекспресії цього гену у Місоїїпіа тарасит. Цей вектор включає в себе промотор 355 вірусу мозаїки цвітної капусти Самм вище від трансгену, що сприяє його бо конститутивній експресії в усіх тканинах рослини і гені Кап/пріїЇ для відбору канаміцину
(антибіотику) трансгенних ліній Місоїїпіа їабасит на чашках з агаром (100 мг/мл). Тютюн сорту
Берлі ТМ9О трансформується з цією конструкцією за допомогою Адгобасієгішт їштеїасієепв5 з використанням класичної процедури листових дисків. Окремі лінії регенерували з калусу, і відбирали на канаміцині. Лінії надекспресії ТО контролювали шляхом ПЛР на геномній ДНК з використанням одного праймера у промоторі 355 (5'ЗАССАТСИ,ТасАААДАСААСВАС) і одного праймера в межах кодувальної послідовності МАВА4, конкретно виявляючи трансгенну копію
МАВА4 за допомогою ЗТ-ПЛР з використанням специфічних праймерів МАВАХ4. Насіння Т1 зібрали, знову виростили на агарі, що містить канаміцин, і піддали контролю точно так, як паростки ТО. ПЛР на геномній гДНК свідчить про те, що Т-ДНК, яка несе кДНК МІАВАЯ, була вставлена у геном у обраних лініях, і аналіз ЗТ-ПЛР дозволив ідентифікувати три лінії, в яких ген був надекспресованим. Канаміцин-стійкі рослини вирощували у гідропонних лотках до їх пересадження у поле. Двадцять рослин трьох ліній МАВА4 (МАВА4-1, МТАВА-2 і МТАВА-3), векторний контроль (МС, порожній рк7сУЛММУСа (ІЇ)) ії базовий тютюн США ТМО90 вирощували у чотирьох репліках з 20 рослин. Через три місяці після пересадження у поле (36 днів після прищипування верхівки), один лист з середини стебла відбирали як зразок у 10 ідентичних рослин з 20 на частині ділянки, що представляє одну дослідну репліку. Це листя ("зелене листя") відразу ж зберігати у сухому льоду і ліофілізували. Рослини 355::МІАВА4 не виявили будь-яких візуальних фенотипів, відмінних від рослин ТМО90 ї МС після двох місяців зростання у полі. Для тих самих ліній, аналіз висоти рослин і вмісту хлорофілу задокументував, що трансгенні лінії 355: МІАВАЯ4 були подібними до контрольних рослин ТМО90 і МС, що наводить на думку про те, що надекспресія МАВА4 не має помітного впливу на фенотипічні властивості.
Решта листового матеріалу з 10 обраних рослин на кожну частину ділянки та лінію відбиралася і сушилася відповідно до сільськогосподарської практики для сорту Берлі. Після сушіння, зразки трьох листків з середини стебла були відібрані. Для контролю ефекту підвищеної експресії
МАВАХА у трьох трансгенних лініях (МІАВА4-1, МАВА4-2 і МАВАЗ4-3), "зелене листя" і "висушене листя" подрібнили і піддали аналізу на вміст каротиноїдів.
Приклад 5: Аналіз каротиноїдів у зеленому і висушеному листі трансгенних ліній 355::МАВА4
У "зеленому листі" кількісний аналіз каротиноїдів є неможливим для всіх ксантофілів внаслідок технічних обмежень, зокрема для кількісного визначення неоксантіну (низькі концентрації у Місоїїпіа їабасит і неналежний аналітичний поділ). Передбачається, що пул неоксантіну (на основі напівкількісного аналізу, дані не показані) має аналогічну тенденцію до вмісту лютеїну (а також бета-каротину у меншій мірі) у ТМОО, МС, МАВА4-1, МАВА4-2 і МЕ-АВАЗ- 3. Обидва останні пігменти використовуються як репрезентативні виміри концентрацій інших каротиноїдів (ксантофілів) у зеленому листі. Навпаки, у в'янучому і висушеному листі ці припущення не розглядаються, оскільки пул неоксантіну, як відомо, швидко і повністю розкладається. Аналіз каротиноїдів виконується з використанням традиційного способу ВЕРХ і візуального виявлення, надекспресовані лінії МАВАХ свідчать, що лютеїн є значно підвищеним у лініях МАВА4-2 і МАВА4-3 у порівнянні з контрольними рослинами дикого типу і векторним контролем. Надекспресія МАВА4 призводить до підвищення лютеїну у листі на 30905 і 26905 у лініях МАВА4-2 ії МАВА4-3, відповідно, в порівнянні з базовими лініями ТМ90О і векторного контролю. Крім того, бета-каротин є також значно вищим у лініях МАВАЯ (близько на 1595 вище) в порівнянні з рослинами дикого типу ТМ90. Ці дані свідчать про те, що надекспресія МАВА4 має загальний зростаючий вплив на вміст каротиноїдів. Підвищення каротиноїдів у лініях трансгенних рослин є значним (Р«0,05; Т-тест).
Аналіз каротиноїдів у висушеному листі в цілому свідчить про зниження пулу лютеїну і бета- каротину в порівнянні із зеленим листям. Від 87 до 9595 лютеїну і бета-каротину, присутнього у зразках зеленого листя, деградує під час сушіння у всіх рослинах дикого типу, векторного контролю і трансгенних лініях 355::МАВА4. Це свідчить про те, що ці каротиноїди піддаються активним ферментативним або хімічним модифікаціям в процесі сушіння. Наявність значних варіацій в межах кожної серії висушених зразків вказує на те, що катаболізм каротиноїдів під час сушіння є менш "контрольованим" і однорідним процесом, ніж синтез каротиноїдів у зеленому листі. Аналіз на основі Т-тесту свідчить про те, що вміст лютеїну значно відрізняється при порівнянні наступних ліній: МАВА4-2 є вищим, ніж ТМ90О (Р«0,0011) і векторний контроль (Р«0,05); векторний контроль є вищим, ніж ТМУ0О (Р«0,05) ії МАВА4-1 є вищим, ніж ТМУО0 (Р«0,05). Вміст бета-каротину є вищим у векторному контролі (Р«е0,05) і МАВАЯ4-1 (Р«0,01 І) в порівнянні з ТМО9О.
Приклад 6: Аналіз каротиноїдів обраних ліній 355::МезЗу і МІСЕО2-інтерферуючих РНК
Як описано для 355::МАВА4, 355::МІМезу і МІМСЕО2-інтерферуючої РНК трансформовані бо лінії обираються на основі генотипування і ЗТ-ПЛР. В результаті, дві лінії 355::МІМебу і три лінії
МІМСЕО2-інтерферуючої РНК були ідентифіковані і висаджені у чотирьох репліках одночасно і на одному полі. Вміст основних каротиноїдів (лютеїну і бета-каротину) визначався у лініях
МСЕО2-інтерферуючої РНК і 355::МІМезу. Обидві лінії МСЕО2-інтерферуючої РНК і 355::МІМезЗу демонструють підвищення основних каротиноїдів у зеленому листі, підтверджуючи, що ці два гени-кандидати на трансформацію рослин впливають на метаболізм каротиноїдів у тютюновому листі. Проте при порівнянні всіх обраних трансгенних ліній, надекспресія МІАВА4 виявляється найбільш ефективною для досягнення загального підвищення каротиноїдів у зеленому листі.
Зібраний листовий матеріал піддали тіньовому сушінню для того, щоб підтвердити, що спостережувані зміни каротиноїдів призводять до зміни кількості бета-дамасценону, виробленого у відповідному аерозолі. З метою відбору найбільш перспективних висушених зразків, обирали зразки/лінії з найбільш значними змінами лютеїну, бета-каротину і неоксантіну (дані напівкількісного аналізу) у зеленому листі. Ці зразки/лінії були МіМезу-! 2, МАВА4-2 2 і
МІМСЕО2-інтерферуюча РНК-Ї 4 відповідно (Фігура 6). Припущення полягає тут в тому, що неоксантін або, можливо, інші каротиноїди, які накопичуються в зеленому листі, конвертуються у висушеному листі в бета-дамасценон-глюкозид або інші попередники бета-дамасценону, які потім вивільняються шляхом нагрівання.
Приклад 7: Аналіз бета-дамасценону в обраних трансгенних лініях
Для аналізу вмісту бета-дамасценону в аерозолі, що утворюється після нагрівання висушеного тютюну пробовідбірних ліній ТМ90-4 (контроль), МІМеву-! 2, МІАВА4-2 2 і МІМСЕО2- інтерферуючої РНК-І 4, отримали аерозолі від просоченого посіченого тютюну. Як платформа для паління використовується симулятор паління з джерелом тепла типу "МН" (54), включаючи режим 12 випускань диму за 2 сек. Перед палінням, висушену пластинку тютюну обрізали і просочили 2095 гліцерином. Аерозолі, отримані шляхом нагрівання просоченого висушеного тютюну (100 мг, З повних репліки), були уловлені у фільтруючому набитті
Кембриджського фільтра. Фільтруюче набиття помістили у пробірку, яка містить 10 мл. води/ЕОН (9/1, об./06.). Бета-дамасценон екстрагували за допомогою магнітної мішалки способом сорбційної екстракції (як описано у І апсазх еї аї. (2009) 9. Бер. осі. 32, 813-824). Цей спосіб забезпечує екстрагування хімічних сполук, які виявляють аффінність до фази адсорбції.
Мішалку термічно десорбували в інжекторі ГХ-МС і аналізували на бета-дамасценон. У
Зо порівнянні з ТМО9О (контроль), зразок МАВА4-2 2 засвідчив 6895 підвищення бета-дамасценону в аерозолі (Фігура 7). Ця різниця є статистично релевантною (Ре0,01, Т-тест). Ці результати дозволяють припустити, що пул попередника(ів) для бета-дамасценону у висушеному листі посилюється ектопічною експресією МАВА4 в той час як ефект двох інших генів-мішеней,
МіМезу (надекспресія) і МІМСЕО2 (сайленсінг інтерферуючої РНК) є подібним до контролю
ТМ90. Таким чином, надекспресія МАВА4, а не інженерія МІМезЗу або МІМСЕО у тютюновому листі, ймовірно призводить до підвищеного вироблення попередника(ів) бета-дамасценону.
Будь-яка публікація, що цитується або описана тут, містить відповідну інформацію, розкриту до дати реєстрації цієї заявки. Інформація, заявлена у даному документі, не може тлумачитися як допущення того, що винахідники не мають права датувати заднім числом таке розкриття суті винаходу. Всі публікації, згадані у вищенаведеному описі, включені тут шляхом посилання. Різні модифікації і варіації винаходу будуть очевидними фахівцям у даній галузі техніки без відхилення від об'єму та суті винаходу. Хоча винахід було описано у зв'язку з конкретними переважними варіантами його здійснення, слід розуміти, що винахід, як заявлено, не має бути неналежним чином обмежений такими конкретними варіантами здійснення. Дійсно, різні модифікації описаних способів здійснення винаходу, що є очевидними фахівцям у галузі клітинної, молекулярної біології та біології рослин або суміжних галузях, мають на меті бути включеними в об'єм наведеної далі формули винаходу.
прах пух ск оч ку хж ау ауху пОоСстпавНОоєсті
ЗЕ МО: З (Нуклеотидна єослідовність ВАЄ від Вісонов (зВисит КОВІ вифоивстексхнккзахку пункт авта савц им рт
ПА ДК ВК тина дао щ- ВАТ УНАЄКИ ї попити ува зве укілі вичавки асвсксвзан света масо осваче сіно вому зап лосичч ни осозазеассаккактсваст ває савасвак секс задавав
Частлоскосочисквиасиоосакве екстаз са сі сани аеадиа плтиаа птсванозсонстос космосом взасос висип. «смлуловсве тк а Касове Крус арена кою кчиаВа ВЕ исдисдсоаоссодивевеасукамавк осот танка виписали зашахихвЕчкзсаасчи сив оопн асп а парадним ен КС НО НЕ Ко АК о НН КН ВН ЕНН
ПОЕМАХ С МКК
Со 5 ВУ З дк: же вуж 3. УК ЖЖ Кіа ки орг їуух МЕ
ВЕС КС Я СА МіНОКИНО Єна песденність ЗДИЯА Я від Моє вовни КЗ
МВВ ЬМК ема ІВЕМиОоКАВАТИВАНОВТа ТЕ ЕМВ Ки В,
МОМ У КАШІ АТО и В ІАЕ ТАБУ К ПУ УК ТВКИМКи щі
ТЕЛЕКОМ ПИТВО КО ТЕМПІ АОАМІНОАТ ОК АМКУ ВОІВ
ПЕТІНМУМСТЬЕ ВУ УТ ТЕКА ВЕН
ОО у Кік ХУ 5 я з се сах сазан» ту: кидки уже Со ючтя Ву, З с ше
ЯН ВС З (Нувластядня послідовність прямо зваймева. що використовується для чзуж.х. ІойхіслхсуУ и Й. ; да КУ х ку. я з оф ж і УЖ. с . сажу сб пеня сеокх «й зужих зеаанхаии Я БАЯ в Айосгнн слон я КИ а посліовНтю сабо у пам ду
КУХНЯ песен кп авкт т жду к г. г х ж Уу фо їє і . ри ще с. с. й са уже. зх щ
КО З АК Я (Нрухлеотдна постів ітюе прог права. но еикзрастовується дих сліди ; Ех Хм ще «оту с. б жк ї - ми х се зеплрннац МАМАЯ від Алое іа" За без поспідвавност сасе у праймер диня каОомуВаННя
ДИЧКО М, їхахУ х КК В Бук союжежуух ужив Кк ажоєеюві сих. теж Ух реч сок коухмии не хек ик жк дими Ж. сухо
ЗБ НЕ: пі іухклестидня вості вннть зворотного визнав, ще використовується ДИ лохухохУйки кує УК ВІ. у у з уж 5. їн ; сих сви ККУ, амп наці МАМАЯ Ві Міссвана везе в КЗ полками и ВЕ КИ же х Ж с г с сб Уч ка бус З : Діди м «Ух . хом. 55
БЕЗ НК БінНукавотвана послідовність ЯНА від Абеоане вас квка БроаеаВ
БУд М ЗМи ен ен и А Ж ЗИ Ве ОНИ ЕН МИ ЖЕН пити лиса лан сои а влК ІВ В па Е
МАЛОМУ КОЛА КВ А ЗАБАВ, КУКА МУК ІК и ВИ, В ДВ ВАТИ ДНА, СКЛІ ду,
Іри ПО КК В ВО КЕ КВ КН М НАУК А В КАТ ПА ВМОХ КИ ЗК а КК щита опо сваиттвидаа и рсивикакикпсваокиаоаиа К акшжизспов ис аа вовча вдала вно мим аа доски как исатАкамсюсиш іа ва аю КИ ХВ АК есксохаувисопссто са сама всвас рми акие КУ Кар кпк подиву ста салавихамсзкизкипа т ісазваиза ас лавас а ак ру пал ВЕ, ПЕПТІКАЛ М ПАК В. КІ КНУ гади Кому. НЕЛЛІ И а КД АТМ дови ме па
ЖЕ 3 дух Ж жук: ї «жк 5 5. Ж: КУ щі. Є с Ех 5: Міс. кв уки. хз
БОЮ МО: т ТА вінокисоуна посвовніть За на Мена овен Ніка Вгозвай
КЛІК иК КВК АВНЕВЕМОвТ ОЕМ УК КВ
ЯК ВЕН З ВЕК ки КО и ЦИ СОЗНЕ СВ ЗИ НВК З Во З НОВ ст ЗК КВ
ПиМТКЕМУКАВМЕВу КМ КІМЕМИЕИ ТЕМНЕ МТАМОКІНЛКВУСЬ АВК ВІЮТЬ
МІБІЖСУКУОІУТНКТТКАСТВВЕКЕНОННХИ х х КН ну кижккрух ще 5 ех ек ї ху. ї. я г. ци У
ЗК НО МС В (чукиветнана похідне Мебе від АЛоозноме Маси КО «соч австкислисаоти осанки попасид пока кс аа
Кесувосиксда соска иоссвсаипх кс аа сао всаваи за во ьо епоха каси сосводксвеавосвва актах вт а ко кивссах
Спок ипактсовово уп ти тво ев и вив квас вада крат тата саванах апихмчанавчос попа нев ака хе возковкав засос вата оя витає вквиниМмов акаде вовна зване з кс вка око пава цукати юву качок уча ники а кону зіпивтзачансастиви нок ссевза нава екон и ва во ВпоИко а авцазаспаксискаосваво усві вим свна заказов г вавогі ах искали шовного ванна ас кчивракоаслесахкие сим иа касовими КИ пеУчдацох коН ІК, зопалу овоча тим саванах кам а тя аклучссаксоссврсансаосаноиооіа носив авнякассочоза ва ах сита сішеасооавсчнсв кан ач с кад пливе сатани са КІ о ВО чписпазщсаслввсмпаднахк задати касу а ак оз аа то зашичщввннм уві мали ее и кВ ау а а МІ звішекикскомавесносаосоввавквс сосна иаи гама провал хи ок и М о р Ма МК нка КН ТК главах са сх ях Кк К х ї. уж й Зк гуску байок о схіхм Кіличеейх чо Й. чи: У
ВЕС НО: Я САНЯ Взк нову на пед нієт» Мебу ві Все ізбаени КЗ)
МЕТО ЕЕКИЕОЛЕТЕТЕНВиІ ОТ ВКНЕКМККО КАТОК ІН
ДОБА ЕТУТІ ТОВ ОАВУОКУОСІКУЄТ УЮ КІМ КАЗКОВЕ еМТ СВУ МИЕ.
ТЕХ ЕСсКУ КЕКВ УКУС ЛКАЙРЕІ ЖК
ВЕН О ТАНЕ ГАСУ МИМ КВОТ ОКИУ ВОНО КВУ МТК КРАХ УМВБ пАВУМВЕУ ТИХ
БЕУКМЕМУДКТНИММКУТОУ КЕКСУ ТУТ ВМІТИ Ми НМ МІВ
ПУЕТ МІМВОМОВБІНКУКМ МИ Високі ОАКЕПВК КО ОО У КО
ПЕЖО УКВ КУ КММКХ пк ки ки. с дукжчнх я щ ЕХ яку Таким уки чука жук н аж, пукиги
БЕК НУ ВК НЕмуЄТСТИДМЕ ПОВЗ ЇДЕ ЕВН» ПЕВ ЄТИХ уКУ КІВ. ЗБ Івент ється дя зує кодів ех дим. х зх чо . сих мкс Що Кк н дже їх Жоужокж завали ц Ме іх АНссмаєя басма КООВ З осів оо У праневої ди косу манн падали ви КК МК ВТ ли Ух БК ц чи ка оюк :. ск; жи а я КУ
КОН ЗТ (Нукивотидна послідовність првмого зоаянара, що використовується для ск ії ВХ щї Ку самку имі у М З Ж У х скік и усткуси ї сук і валлннеаий беж в миня іввасьи КЗ Без послідовності Вес У рана ДАя хрануванняхк
ФАСТІВ МК
ЗБОЮ МС ТО (МНуклезтидня кесмідоните зворотнє праймоюи, жу мире товується для
ХАЙ ВХ ВИХ В СРЕЕ КИМ НЕНСТНКНННІ ТВ ЗМНОНУ ЕНН ПОН Ов, КЕ ЖИМУ Му ється де де Уч С ї дм ик Й Кл жк с сок, хз замеевікаіх МАВ я Леоонівн сао ени КЗИВ
ТАКТИ УК ди
КІН ЗінУє ;. х ікла ЕВ віх ев: ; хг З
ВЕБ К 5 і Неквевотвдна песидовність ВСЕ віз Абе сфе аМстасладсвиике вдоско ша та КЕ каш ОК Во Ва о ситними КД В ам У ЕК КА авт омак кова види ши п КО ЕЕ ОМС КК ВВ В КО В звссдзавколхссвавевсас садами васис чена скакати ами зхваахававомтаха ис соди асва кн слва соснова ких пасе зпадпловаалносзунанаги
ЗЕМНЕ З КНуклоствама воспиюювність прямо праймер, що виковистовується дура заавножані МНОССОО від пбоюгпана зва ци З После еаок у пуиме вах хпомувавня
ПВЛ КИ 5 ОЕМ ЛУК Ки
ЕВ ОО ЕХ 14 ухва еТиДдНя ВОК В» ЗОМ Оог праймер. що викорневується див звУавнажаци МСКОС ід ово знав паз пеолівовності свое У праймер див хаос уУваННеХ зашивати а кто
ВЕУ НО МК: Та Нуклестидна пек мєють зорова вваймера, ще вихористовується див змивиБінаці НСКУ від Анеолаляе паст
СПЕСОК ПеСКЛіІдОоВНстЕИ «і» ВНібЗв Вегретія РенНнее 5,а. «МЕ» МОДУЛЮОВАННЯ БЕТА-ДАМАЄЦЕНОМУ В ВК НИНАХ «3» ЗОУЯВБ- ОВС «1» Вакевїй хегеіо" 3,3 «Вії» Вб м-н к «гай ДЕКО «Ії» вісесіяна сану «НЕ її зкоксасЕиї стає ЕТСЖЕЦЕКЕЕ вЗЕКссеКІс хтВаєвацес аззеакЗЗає що
КТЄТСЕЕсЕт Ст ТО стаєксткає акстнсксВ вовсоваєтО саобесвех 120
Кс кааках сен «сс с кексакВстх сестацааах заз Ко «кої завЕс засватни мае сова зосаавткка завонкнев: завести ке пк сча ЗасФісЕтах ЄсааеЖЕВаАХ сттсзавсва сістНастса задавав З сов оВ стастиех сових дазаєтасте стаєте свсасомюа о зезасвасаВ БЕсТКЄсоКК Етатастстє зт За стєстзазас тевассі ах я зовзажуєня Їїохзаваєтва саевесквах Зк састєтоаєа сзеасзтсєа Зх пен асикех сстідовкасєє аовтасвакх сосна стасхаоїва зкасмчнсЕ КБ сем кас ссцосвЕає сзасатеє сесбазсовоз совсвеше фестосатоЗ що
ЗіжсеКкцЕ гуде аюа ож КЕКОсх зсзаорсвов сстаїсаа козак Оєсва що зако аксто зазсссзсса кеставсЕ сіє вотЕЕеоКх сассоцаах чо пЕжвсжсВКх ссзссвссаз застсвавєс аВбзаессв звазаовазсв пса 7 свахи. ТИВ «і СБ хай Білою «ВА Міша ЗЕ НВ «НЕ 2
Меж Жег ген баг Бе аа бек Щек Суб ВНЕ Сух ек орРгО Кби АВ ув і ВЗ М 15
Хег век МЕЖ Ахв Ре Бек хег лег сух ВН Су» Тув его нів їв ще «З Ку КІ ізн бух меж ахп о сСух аго АЇЗ кро Аїа Бен Меї бек о АКО АгО Ам ДІВ їх Б У
Бга о твР.Обек о Тув Те Рв Бе сі бух ази Зак ойхв Ті УВТ д5а тя ій ме! Уді їн РВае о1у ТВг Буд Бе ага бек опію ві Аа вве ву се ча -к ще ща ме З ща
ЗУ БІіУ аг аго Уві Ї18 КІ6 бій ев ап вв Бій Тк оївК вве дій а ЗО щ ту м У им йауух Ку 2. 1233 ж 7 хх хг ще бух ує У ще іп аг Ух бак фак ага Уві їБк одаіа су вм обо бек бек біб хе 10 їх Ка діж хек тк Уа! РБе їйг без біу Тбг одіж діа УВІ Без го ее тує х І, ложу й
ЩЕ 125
ТВг їжу мет Уві Узі Аїя Бгто фу ТВТ бів ви твг ака вух мії МЕЖ це 135 ке З
МУ его Же їі бте ази і6 ТУ Вме Фу вен гей тує ТР о ТуК Бор 135 їі зу ще
УВІ тТуг бе баг тгв о ТНг БгОо А ТК УЗ! аг ієн мес вне А1З Бог 165 І 175 ; зумкк ем м лох т їахмз Му Міо їі» вне му З ї суух че іже ТУ Тер Рг бів бер; кро бі КТ ТТН бух мех вве щег дай ік їй що
Зі веатї їв ів іа бБег від їв; Хе Ні ев ви дів чаї дв фен ще 00 КІЗ вних їз аїа ага ів УВІ тек нія дер о Зіу ви Фів дей Бр о жіє у а Ії В тКе оАго Ні ЗвК Уві Жег о баец бух Ем іще Ба сСу5 вго о Уукі 51 418 чо я че и і в 2 в
Их За Та ач
Уа! тВг мів Ве зі ТК оКух ДІВ ем йіз Шег Бек ВГ Бін ух Аг зів мів дра о тве жмх
ВЕК
«Ох З «І» «В» ВНЕ
М УДой й : «йіЯ» штучна веослідаанікть ан «ЕМїх джерела «ай ЯК «ЗАЛ» уБМримітяае СН шфтТучнеї послідевності: Муклестидна послідовність
Враного лраимера, що зикорнставується ди ЗМплівінаії МІаВАЯ від
Ммісотізва каищеня
Се дачах дубі джу Сея У дугу іму ІІ міки зхту й
КОЖ з вослідовністю сасс у пане для клонування «Ве З «ассаКаЕсВ ст ЕКИ ВЕСТ КСККО З «Ек Я «Ак 87 «йіїйх ДНК ва піжами зм ку й кі «Ки штучна ВОСЛІДВВН СТЬ «ВЕОх «ееї» джеренпо а МЕ ЖК «Вб» «примітках нс ШТУЧНОЇ поєлідевності: Нунлечутидна послідевність й . ВИивнОгОо лраиченх, ще зинористовується для ачпазВівації взтайАЯ від
Місніщийа саван я
КН су маки жах Мо бує « вам «мах сх М куб без ежлідОВнОст св У Зраямеві для кловування «НК я зтаїсаскІх сткктазжес сесттах 27 «ВН 5 «КІ У екАйх ДНК «ії» щтТуЧчнЕ ПОСЛІДОВНІСТЬ «вою «акі» дЖеренО «ай 01.87
ЯК зу цаки і чі. ЗМечувівих чех шу Ху си я ї схемі я мах кі судини ие ке УНрЕМіїТняє ВНС ЖТУЧНЯЇ послідовності: Вуклевтидна пюслідавність
І звщБюБОотнога пваеНера, ще використовується для випав вації ВЕанАЯ від місію «ВВваКия ка «Ме 5 хз ацЕє стакОостцс ТОЖКЕТКЕ іч
КЕ, зо хе 5 «вій» ДЕ ле хх М дру м - паху кр ух «ії заКекзава ант яю В аішжсВсЕс ста їс ТЕКС ВТО КІссК стеЕкаакаиа дес ааОЕаа 5 дасте пет киЕ Кс іВеТех свевВІстсВе гевнрвіояа стає ниа 1250 «сема іов сесссвнн засне заст сттаКа сіна вада і85 писемна зіва мис возаесаНи став воску КЕНЕ сиооеан сазоаассах саїжсвастЕ віскі сназ свастсце само аЗ 3о5 ки НК НКИ НК ярих дефи ху оф вх же ун Удг щатссВвоцу туз О сет сК со сек Крос ЗО цпозасвасаа суб кс Зк зІвевВ ссаснивВО Меса звостааеЕ 33 весзчизавО созсспазаао свосакасес баса ссЗОастесЕ пев сааЕ Б ставі аск шстстзас ассвоатака вс соосоз саке їЗскаО сзаакас кет сЕгссаае спесспосах застава тесіссавко заасцасвЕк воски а о тео сясх Сас сої зщаксІї ЗзсіосзВає заг такої вата о нн и в В В НВ НИ ЗЕ саван еВ стовавсеса сект Коса сте ке сККтсоя Уго дж иКіІ сут ку суричсу супорт хто в жітті су о юс гія за
ПОЕТИ В Ве сану З кс сан зок ази ТК ветсВїта Ка «ам 7 евіше БІВОК «Ах місвтіява а еше
«НМ
МЕ его геу 5ег РНе АЖ» БЕК бек Зек бух Не Суз Зв Бра ів дха ї і: М 15 іже Жег Бек Мет 850 кВе 5Зег 5Зег Зєг Сух Не Суб туго Зег Ні їв
Кг 25 53 его зу МОЄ Аза Сух ага ліз вго АЇз ев Межх Зог ага АРО Дей
З За Я
БИК гО ТВР бек тує ТР ОБНВ це Фіз бух ай Беає АВ ї18 УЩі Ахв що 55 а ців дга кі буді ОО Ре АгО ТВг Бу ВНЕ ага Зак оБіУ АЇв дян рне пе а и КН НИ НК КН Ка чик пух водії вах пед Жах го іве бі бБіу Зак Аго 8 Хе їі ій рем Ап Бео бів тТВготТВк ев ща З іх іп аво іш бек Жабо ага Ущі Тпг оАїа Суб івц бе баг зак вів 180 ЩІ а: їів аїз ет тТвг од) ВНЕ ТйР о Беи біу тк оаїз АТЗ Уа сен вро вве тз5 БЖ Й 355
МУ КМ 125 здутті х, н пек ще Ж жах щ- З. щі; їх вм дм їх ХА їШР Вк ів меж Учі ма! дід бе фу АТЗ бін Бео Те о аго бух Ма їх їз» ща
Мет уз ща Баг жі губ Ту Тів Зі вве Чі реа се) тує ТЕ тує
ЩА Бо 53 м ів: УВІ Ту вец бак тер тТвг о ргаО аАЗО Твері аАгО Бе меж бе АТ ак фу жк Тгв сво те бів ів Рго йіу Хі ТВгоБух Меї БВе Зак 150 її 130
Ч се с муж и Кк Фк С шо зусакж СК що їх сх че тр. її Кк за він мМей ТТГ обео піз Щек одіз Тго іє ніх гм оі«ц дів Уві Ажо іди вне аїв із АРО бів Узі тТук міх ав оБіЖ зе Зів аз ахо Ті
Ка їй З І ШК
КЗ мА КАЄ ці тне ака віз девБ Уві его іев бух баб осв вне Суз рко вве о ке 83 25 ТЯ
Її Щі їйг нія Ре їі тТВгобуз АТХ фе ТНЕ БЕК 5вК орга бів вух «АВ Ка 55 ага бів нів ака ТВР ОН зо пух т «Ах Кк
«їм ЛЯЩо «Ком ДЕ «А» мікокіана сабасвв «Нік й зкеазаваєтс ттстсвавсє ТЕТТссаЖест сстетасТтЕ хезетсстає асствсаЗа ЕІ хстакЕКтск зактоважк Хассе КтО зав в сссацааКх гесаацаяаа 120 чїсаїсосз зазасванаВ савсадчхВас зав еа КЕ тва се 1856 зсавтсаваає садок зов овс атетовічО совежсвва ссср а псІстаткса всокватсях сахсоаосє збсесстасВа Бесікеоцєх воставасая КУ
Ззтатсоваозвт зкідотатеза зе чеком есіє свссвекесє сабамоєса З авгавстато саке СИНЄ Фа сао оагооаВн жк 42) сасавомни стзтаЗКщ ЗЕ сзкахЗ азсозстваса звовеканахя сто оВ ЗО ссазвВІча схе ззааавасва азввсовав: ми кора ах хай затнрнеюоа заїсттзеаа адскавовВії содзавио восатозаєв агітоваксх Б ксацвстщЕї човен сек а заз совок СН Зах БО сжеопстває сот зїЗаа затв мн севазааеск зо асва вазах Ж сЗоаакІттвІ сзсзаасооа хата сеа КЕТІ візами есте Кк капаодоВеЕ сесзтстоЗа заасзаасся та сОазсзатаєс гвазЗаасса о сви екаУх зсззаксс зт аЗсІтшасВЕ ссжтшоВаВа пастка ще зване ствтнцстаєх Фата стозазааата Фа зач Зо «кат вз сгсзавокоас авохо ся мно засо тоааж ссссвснов ХО засос срЧазкосє скан зма) зсоозаатє зозавсаак ЗОКО «акссвисвеа казав Е широ ацсвмнизе бикзесвак сосни Ока се зозассїсва сзсайссяиз абз вжнн агетесасК ссВссВказа 0 зІстоцаа зт щекс кстаововов зва зззазкаеа сто ЗО ває х состав стаз товаз запас тазов пава аа бас 0 КО часове ссаватасєто сани сектссткаа погас квавонаккк КО штатссва поста їаеєкх СЕК аж цесткнавЕх созстацеЕК ота ОВ зслаззасисс сор скскх усе занато зона ва МЕ «ев я хвійм Білак «Я» міскіапа ЕВ «ан: З мес Бі ТК рев гео бух ре) РВе рго Хег Вех реб фец вве ТНК Бга твк Бгто ніЗ ка его їі Ре цій без аз заг Ме вне рев хво рка
КЕ 25 КО
ТВеОТНг ів аз ро Заг о аг фу УЗ НІ Ага Яка аз ух ЩВР 5аР їх С а
Зак аАхВ Му Ме Сух Бек не Бей ащо бе) із вт ТВР обав вже БРо й а ЩО я шодаж о х одуїе з г шах Бо зує ак се хе упак й лк ку Я сів шеР газ ар Ома! Ар іє бек тт УВІ АЗвобго Аква бак сі го п то ТЗ ва хіх іди ВНЕ де зі жів їі їів зі діз ші бро й 3; щі. з кі пи
ІД КМ БИК Ар УМІ Кі дів КІВ І КІ ОБІУ БГО АВ щіІЮ БО АХ З 85 і 5 їжу хх г їх УК М чі а зх СО х жк їмо чаї на и НЄ ї жиє
Кай вій бі нь Ві ЗК АК БУЄ Зіу іш БУХ УВІ: КУв КУ Ма АВК
КК 5 зла
Бго ее бро ів бег Меж то) вго аз Ажша Тук сію Фа тез ма А
КВ КЕ 1275
Зів вБа біє бу во 1 без ін ав Су сн аЗО Нія вух ТТБ ВкВ
ІВ 15 ща меж таг бух Уві ніз її Аз А АЯВ 1іУу ТНК оф ТуК Ки щі АГ
Е хх "7 у й ск 7 " ій ЧУ 145 Не і135 їі
Вкез теє Бім ага Уві Бек Аго уз УЗ Ген бух ЕМ бух бер рем АВ їх 175 в
Хеаг Суз Уді 50 Азп бі Біу вуз Ре ТУР Бужх Вів Був Уві Ткр ув
ВО її 130 мер и и ке: УАИ й уд чан и у а и НИ Я че ве: што: чаі біз ні Зів біб ве 31б бек ха Узі Уві сСух хв АБО ші Ага
З щу ЗЕ
ЩЕ о «ЗКУ зх 118 дго Зі шавБ оівм ів 58) до дід его бі Бе дів щвБоБте що ух що - т З їх 7 У М
РИБ ши ке
Бме їі іч Туг ази бу бра Ако дея ніх біу тТук бів Кі дія мів ік жів їво аїв зів Узі дзр аз Мія ВгО ВИБ ах) БО АВ БУЄ Ме ве 23 та
УВІ Ген Меб дар тго дра АЗе Хек міх рец біу ях ів ер Стук ве
ТБ щу жУВ ага УЗІ АБя дей тик рух бі ВО ТНг о ВНе ям ТуК Уві меж бгОо вне си ЩО З ази ага дей зви хаї ВВе Без біб біз Тйг обЗег зем а баг дк ВКе
ОО сх цю
Уві ев же Тег яке віч тв) фуд дан Ага Мет та? їі дк бе АГУ
Мік фен бі Хів 52 Уа) тТнг о Жег Уві ї16 515 Аа Зв БУБ Суб ха!
Ки Зо ке - ГУ Уч ун ик, м. г: с У бах жує МУ. Ж г ж ї с тів вто меї піу піх вт зе рго аб хів ко сів єм Уві меж 8із 0 145 З їі бі шіу ав вк О1у їв Уа! Мі вкео Зав Те о біу тук мет ді
ЖЕ з 385 я вх, сх. , ї. хе с її КУ хузї хх З ух 3 ще и З дід до Зак Мет із ей ліз вго У! їз аіз бів діа їв аа ів а ма ІВ
ЗО ЗЕ ЗК
Мам 1 веб ім рію ще ок м Мо жи ша шу К сука ках крах
Баг оз (ФУ ТВгОївР ага мех Зі6 АГО біу бегб ого БевотУук нів вує
З8х БЕ 355 кю ді Тк дза щіу кер отгтв ого їв» 15 АМО ага ек хві ага Біб Сех ях В 15
Тут бег вва біу Ме Зі: ТВР ву Би Бу ів вай вен БУЄ БіЖ ТР
СУ 425 535 ще й ще А о х які дошк ща ще сим кокхя нкхаю Калує с у
Ага Аг ви БнЕ Ахр АЇЗ ВН ОБНе Ахв ово АВ РКО Ух ТуЄ ТВ Об 435 Б 45 ші ВЖЕ Бе бег Заг Ага івоб его ві вуз ів Ббеу дій мех баз жк
За 55 БУ
Мац отуг зви обме сі ні ліз Зег ах рев АТХ Аго свв азр ов Уві 485 473 ЗУ Зо
ТВЕ ух Су» вго узі ро їв Уа іє мет меж ЗіБ її я ЗО «Ак о «Вії» УЗ «Мас» ДНК «ії» штучна посяідеовніСть клйї» дженело «Аа» примітна ОБСЄ втуУчНОУ ПпОосСяїзДдЕВНеасті: Нуклертидна послідавність поямого прваймера, Що знЕОрестОовВУЄТЬСЯ ДЗ ВМПпЛлЗфвіквції Мем від чнакіайа кавасув | й
ЕВ з поспідезвістю сасс У праимезі для клонування" «ню саке нва асістхста авосКеТКе З «ОМ «Міс» ДНК «ії» штучна їблідовнієть «ВМї» джереояоа «вк 4:55 «Ва ТОМІ тТнах СОС штТКУнНОХ селідовності: Зукавотидна послідзаністе й прямого йраммева, ЩО векорнстовується для знлазштнації мебу від місзттана таВасев
Ка без песяздевнесті ЄВС У праимені для клонувцння" «У ТІ акцанаастк тет сзаоє їж 25 «ей» «ай» ДНК «ії» штучна послідовність «ех кі» джерело «вх 1.25 сжай» уприміткає СИС шужчнОї послідовності: о Мукавотияни посяідовнік»х і звОоротмаго поранена, що внновистовується для ЗМпліфвікаці! Меху від кіКкокізиз табзєня
КЗ кА» ії сівзаттсс зхсаЕкмена се 25 «діб» 13 «Ме У «І ДЕ «кеаі» мМієотізвВа айс ее 13 мозсазвЗКЕх постекаскс сазщксанак таїжкастек спвисзненжЕ закекасех ЕН зкосзотааа згтааескса паксвиа саке сна паса їгО паеваскскх сага зсоЗкасахс сскаваєках сссвавсх засос за шкі кос стасозксса зтасекесеЕ сет ЗасЕта ство джассааВаКо КЕН
Чізсвнавас зссважКокО Козак стат Коса саВих ста Зо
Іжкесзаїтаес завіз осовЕаск созлисвівса засво засос Бе щмижкассас сет ся сс: сесію озааае ЗП «еї3з Штучна песвідовність «а «ії» десерене «вх 4,25 й , «ейй» примітка СсВЄ штучне послідовності: Муклестидня поспідеВність тряваге поакмема. Ве використову ЄТЬСЯ Дж ЗаПплівінації ВОМ вд зіскаєіваиа УВЕВеЦВ І
З песпідовніств свсс У прадмені для кломування" «МНЕ а тавссзсзсза сс ІКЕ ас хХ «аз і кі лУ ДНЕ І «ВА» шщтТуУЧНА ПпЕЛІДЮВНІСТЬ «З2їх джевевпа кое жов жи Мих ооо их,
«ЖЖ» уприміткає Опис щтучнОЇ пОослідванесті: нУуВОотидНна послідовність ; зпряжн прзинерва,. що використовується для зеаліфікаії ВСБОХ від
Ммікокіана тавасья без послідовності сш У ПОБВМЯВІ дпя клонування" кн В 15 зсевоваНЕЕу поста В гії «МУ 16 ке 8 «кіс» НЕ «ей» ВтТучна ПпПесСЛідДОВНіІКТЕ «кі» джере нах ЖЕ «вам 0 у ее Ка св ух будову дих ку хікти З у вух Ко сх сІУхі іа ві сах пуху Кг, «ве» примі ткає ОЛЯЄ штучної пПослідванеєті: о нуклезтидна послідавність.
УмншетТногео праймеох. що викопистовується дай ямпалзщікації МСКОе від п ую свиня Му ив і; мікатіазля ТВЕН
Ватт ссес папЕстозае ХЕ 2 «ее У соя ях Щі Кк й «ійх ДЕ «ІЗ» бані Кіожеє вас УТгВУ «НВ Ту папства ЗааавацаВа як ЇХ «вію ЗО? «вас» ДНК «ії» Віскозна саОзсня «НЕ ЗК змсасЕЕ сект тавжке кестжЕїКаЄ ха кскс стсжтевахаа зако що зате тсте сетстІВс стОстВеКех свсВте кове Ще ць «тій» ДЕК «Жїї» ікона хаб «я 15 заватозасти сао зессковіок ссвооаовав сесвсстасс сота ескЕ що сжехасвааа зайексвас Віто кавВаЄ засо х оз яса ЕКЕВ 126 звавісовоє завести зазооасва зааЕсвЕКах совет авВЕ села 180 стос сВ задав есе коа Стас сс ех сваакоєхх жо
УКВ М сут уУУМ хов ЗЕ о о На ин и суку кажи, ЕН: стастоасКЕ сенсом ЗеВОосас КІС св асасКи ЗОН ВОКО щюЮ тисставаає тезу КЖе «30» я «еїхе віткекіана Кай не о запасам аа аснааа засн асеє секзЕаткоВ сКжКоаИКЕ сво 3 зІстяцівта сскстсттЗО зсвссвоВса сацессВОся дата ота аїсх а заст ксова ЗЕ 4335 хофяз ДЕ «її» Ммісотізна бавакшю «Ще 1 щвиїасссю сатазставо атестссссв асозаасово атжядетееВ це що яхт тдає соїаавестЕ стос оаЕ ща «Вії 5 «вай» ДНК «її» Місуєідна бабасев «ню» 8 нюсжниї зесжннвто) зесосаанаї зас ояаа сесОсеВКс ото тв Бо тЕЕТЕаСТЦ ТЕТ СССЕХ СМТ Е ЗежсВсттка тевссзавє Тека е за авсссзозаа зааоасзвеа тадозстсвжх тай ке

Claims (10)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Трансгенна клітина рослини тютюну, що включає в себе: () полінуклеотид, який містить послідовність, що кодує неоксантинсинтазу, яка визначена послідовністю ЗЕО ІО МО: 1 або 5ЕО ІЮ МО: 6; (ії) поліпептид, який кодується полінуклеотидом, визначеним у (Її); (ії) поліпептид, який визначений послідовністю 5ЕО І МО: 2 або 5ЕБО ІЮ МО: 7 та має активність неоксантинсинтази, або (ім) конструкцію, вектор або вектор експресії, які містять ізольований полінуклеотид, визначений У (ї); в якій експресія або активність неоксантинсинтази є підвищеною порівняно з контрольною рослиною або рослиною дикого типу.
2. Трансгенна клітина рослини тютюну, що включає в себе рослинну клітину за п. 1.
3. Спосіб одержання рослини тютюну з підвищеним вмістом каротиноїдів, який включає в себе наступні стадії: (а) підвищення експресії або активності неоксантинсинтази у рослині, переважно, в якій неоксантинсинтаза включає в себе: () полінуклеотид, що містить послідовність, що кодує неоксантинсинтазу, яка визначена послідовністю ЗЕО ІО МО: 1 або 5ЕО ІЮ МО: 6; (ії) поліпептид, кодований полінуклеотидом, визначеним у (ї); або (ії) поліпептид, який визначений послідовністю 5ЕО І МО: 2 або 5ЕБО ІО МО: 7 та має активність неоксантинсинтази, (Б) вимірювання вмісту каротиноїдів принаймні у частині трансгенної рослини, одержаної на стадії (а), та (с) ідентифікацію трансгенної рослини, в якій вміст каротиноїдів було змінено порівняно з контрольною рослиною, в якій експресія або активність неоксантинсинтази не була підвищена.
4. Спосіб за п. 3, в якому експресія або активність лікопен-бета-циклази або 9- Зо цисепоксикаротиноїддіоксигенази або їх поєднання є також підвищеною у рослині.
5. Спосіб за п. 4, в якому лікопен-бета-циклаза містить полінуклеотидну послідовність, представлену у ЗЕО ІЮО МО: 8, або має принаймні 90 95 ідентичності послідовності з нею, або поліпептидна послідовність містить послідовність, представлену у 5ЗЕО ІЮО МО: 9, або має принаймні 90 95 ідентичності послідовності з нею, і в якій 9-цисепоксикаротиноїддіоксигеназа містить полінуклеотидну послідовність, представлену у 5ЕО ІЮ МО: 13, або має принаймні 90 95 ідентичності послідовності з нею.
6. Спосіб одержання рослини тютюну з підвищеним вмістом бета-дамасценону порівняно з контрольною рослиною, який включає в себе наступні стадії:
(а) підвищення експресії або активності неоксантинсинтази у рослині, переважно, в якій неоксантинсинтаза включає в себе: () полінуклеотид, що містить послідовність, що кодує неоксантинсинтазу, яка визначена послідовністю ЗЕО ІО МО: 1 або 5ЕО ІЮ МО: 6; (її поліпептид, кодований полінуклеотидом, зазначеним у (ії), та який має активність неоксантинсинтази; або (ії) поліпептид, який визначений послідовністю 5ЗЕО ІЮ МО: 2 або 5ЕО ІО МО: 7; (б) вимірювання вмісту бета-дамасценону принаймні у частині трансгенної рослини, отриманої на стадії (а), або її аерозолі, згенерованого шляхом нагрівання рослини до 100 "С або вище; та (с) ідентифікацію трансгенної рослини, в якій вміст бета-дамасценону було змінено порівняно з контрольною рослиною, в якій експресія або активність неоксантинсинтази не була підвищена.
7. Трансгенна рослина тютюну, що була одержана або може бути одержана за допомогою способу за п. 6.
8. Трансгенна рослина тютюну за пунктом 2 або 7, в якій експресія неоксантинсинтази або активність білка, кодованого таким чином, була підвищена; в якій вміст лютеїну у зеленому листі або вміст бета-каротину, або комбінований вміст лютеїну і бета-каротину у рослині є вищим, ніж у контрольній рослині, в якій експресія або активність неоксантинсинтази не була підвищена, і в якій вміст бета-дамасценону в аерозолі висушеного рослинного матеріалу є принаймні на 10 95 вищим, ніж в аерозолі від контрольної рослини, переважно де (ії) вміст лютеїну у зеленому листі рослини становить принаймні близько 18 мг/100 г; (її) де вміст бета-каротину у рослині становить принаймні близько 12 мг/100 г, і (ії) де вміст бета-дамасценону в аерозолі при нагріванні становить принаймні близько 1 нг/мг.
9. Тютюновий рослинний матеріал, який включає в себе біомасу, насіння або листя рослини за пп. 2, 7 або 8, в якому експресія або активність неоксантинсинтази підвищена в рослинному матеріалі порівняно з рослинним матеріалом з контрольної рослини дикого типу.
10. Тютюновий виріб, що містить рослинну клітину за п. 1, принаймні частину рослини за будь- яким з пп. 2, 7 або 8 або рослинний матеріал за п. 9, в якому експресія або активність неоксантинсинтази підвищена в клітині рослини, частині рослини або рослинному матеріалі порівняно з клітиною рослини, частиною рослини або рослинним матеріалом з контрольної Зо рослини дикого типу.
х х Ж ЯАікопев я ее Ве ее ШУ п, У ж, щих а с я - с роз щ. ї3 зе угх м З Їказветин КВН : : , ї Я ; х Н вм х х шити хх шк Зав АЧНН Лев син ОВЗКОЯНИМ х ших 2 7 Мк ШТ ї ак КЕ мож дух бук.
Ж - хо Мактеря Кк ких ув. г.
Б Вівпаксантів й : с удо сег сур х . й зепкиантТІнкянтяа - Б Її х й ; ча У - ї ре - хх Ві х ї в х -е г жо, ОД » З ; ск ЕЕ - Є У Зі Ж "тини « я нин ННЯ З ЕН ЕККНХ ч Ї ДУ ккАкКККХ ние Е ЕК В ех, оку чу Ї їх г. хм м Ї Зак.
Ук х Ук ї МСЕ і знеоюонн о «й фхожеотм сю хх люх сх ех хх мента дамасцаноВ Н 3 5 ох ї : ї - ох ум как и 2 У Її що ; г Вон ї гу Км г Ї дехт : 8 шо : Е - : Її КЕ Ч сад у дк: КЗ ї ой ЦЯ г м ях Її МУ ще х.
В т я Її хе Х з ху Я її вка а їх ЧИ Ї зем і Кезитовеня Зі я г оапоновийа ай зав 4 ПК хкукукнххюю Й ц зд 3 хе З Зиьаег 3 : 1 : їх х Ме евусхксу єть ХЕ Авбецизова касвота (АВ ФГ ЖОВ я й дор е муки в Ки КК Кк діжку и и КВ у п кВ ВН и В ам а Кок ЕФЕ Я В Я МИ Все С ВАВ ОВ М КК КН КО В СН фо за о ж а о з Кона кидки ли ее чу р ом м ви ВІК и В Ми КЕ вх МКИВИОИ КИТА ВК КО МЕ КВ КИ КІМ ПНО КК АК суду ут В Кк им ох КК дж вом УК ик Кит М Кота и в ет ка Во М М и Ком у мг У апоптоз итоваковса вали па КАН МИШКУ а ах. пила аа а п ОМ ОЦ ОО ОН ОВ І ОО НО В ОАЕ зкхсизсастквакиклсоасвсмиовскизкноцазаноевхмауи нами Ви умами аа нити ти ЕК ДК тр ме пики в мих пу и иа ВА ак КІ ин м АК М ХК Корі м МК ПОРУКА ЦК Ти в ЕТ І І КА КМ КС КАТЕ ЕКО КОКО КА ВО ОЗ КУ ТВ КК ОВ мм міх им УК ом им Кот р хек ри КА ві Кепки ев КК ЕК ро и КО В З НН В НК КВ НВ В В КВ В УКВ ав речо чн м п в и КОТОВ Ко о Ко ТО ФЕН ОО Я ВЕ ЕН Кр ЕК НЯ КЕ а НЕК СПО З ЕК о о о и и КК я ТИВИ ОІВ К ЦО АЮ КНУ Я СОКІВ ДК КЕ АВ ВЦи КК МЕ КТК пе а нн ок В НК ОО СО ОО ЧО ЧО ВО КК УА Я ЗО ЧО ОКО Б У ОО ОН яння пе АКТУ КК ІН ВО КК НО ВІ КК ВК ВВ ЦЕ І КИ КЕ КВ А ЕД КИ ІК, ОНА В п й лу ІМЛІ МЕ УДК куки м ММ В КТ АК І МКК У М КМУ КИМ В Оп КІ ОКХ ОЗ КН В В и и и и УМУ КУКА шк Ж МКК ри АК ВІКУ КАМИ КИМ М ПІ Мт ПК КІ І п ТМ БЕК и о М и НЯ ВН В я Уа НЕО ОТ ЕЕ и КОВІ е В я ОККО ФМ УМ пн они ВІК ВІ Ки кує У меми ІНК МБУБЗЖЕЩОВВИКУК ККУ МАКСА ВВКАВАЦМ УВІМК ЕКНІ ЕС КЕККТКВКиКиЦ хх УМО со КД и и Ки М ВК мою ВК пет ІК МЕЛЕ: о вена в ко аа Оу хЕБЕДЯ-Х ХЕНД АЕ МК КАК Чнкоо ЖИ УЖ ж о жх нт а а а и а ИН х з к Ух ККУ вИиВніьнання и, мн ПП, п ПО ВО ех се зх УЄ сх Кене и ТЕМУКУУМУЮММХХ їх (Сх Ж ОМЛЧУХ УМ ХУ соч МИТИ ХК МІУ у КУМ М ДВ ВИ с: Б її АМУМПАДСИУ ВУХА ПОР ЕККЕИКЕКЕМУККК ТУК ВАСКО ТЕС ії: 51:12:15 1:11: р: 11:15:11: 213111: 1::5::14311:1 81:15:13: ІТ: 1:13 БТР ЕЕІІІТРТРЕТТРЕЕТРРЕРБРЕ:РІР РР РРЕКІЇ ТЕР с до пу ЮМу В НИ ру МУ и ри ху мив и Ви ЖК ІК ЛИТІ ДИТИ МОДИ, Ух З ї а ВЕОФКМУКЕТИТ КТС ЕТО РЕРЕККС ОА ХАВУ ММК пе Пп жо миуІду у КВУ и у у уми Ми ти У Вик КИ М Ух скит щи Кум кт ої МЩУХСЮУУСЮКУХ ІМК УААН КС ВЕМа со ТаКЦНЕ ІБК ТИ 12511511: 22:1::11:11:1211122:1:1:::::511::1Ф11:1:: 11:15 З з ЕІ БТІ 111131115311111111 РІ ИХ ва хи оо СУМУ МОМ ус и М МІ Ме Ме г МУКУ и М имя «І її х Ка пух в а КВ ни У Й ще Й х :5-5 З І ХЖЕТСТСЖ ЕРОТИКИ МЕ хист» 1 САМИМ УА якщо сюжх Ко о и ке М Во и в у и В Ви М м МО ВИ а ца УП її й ЖД о вЗиУ КЕКВ МАН АТ КАК ХК УК МА НН КИ ККНТККї м ді: 1:521:1:1:1:11::1:1:1:1Р1 31:31:11: 1:5:1135::11:1:):::1: 8:11: ЖІ ІЇІ РІ: 11111311 РІГ чих печити и А ВВЕ МЕ ІС з 5 АМЛУ Т зх кю кох и ТАТ УЗАМИ СХ УУКОМАУКТ УКТУ МАМА МІХ А КІЕК КК АХ ЛОККА ТАК АХ тк її Ер ТКК ов Ка В хе ВТ у ВІВ є ххх 1 ї ТАКТИКИ МАК АКТ КУТ ММ ТКА ХК ВКМ ТОКМАК кх 11:13:13 1:1:1::11:11:1113::15112::1:1 5511113: 11:31:11: 1:11: 1111151: 1:113111Р2111:111351111351 15121521 рт І:1511 здо шо МАКИ АЙ М КЛІК АТМ КК М ОК ВИК ВК я ту ТІ ж АХА ВАХ СТАТ ТАКУ ТУТ ММ 5 а нич а он і и в о и но о а В тутах М а СКЖ ТОМАТУ ММ КК КМ А КАН ТКА ПАН ТАКЕ ММ їх МТ з:5:1 У: 15:13:11: 5:511 21:11:51: 35111: 115534: х5:1х:1:11 р: ТРЕТІ РЕРБІРРЕЕВРРІІРРР БЕРЕ РВІ 1111111 РРІТРЕІІЕІЕ ІЕЕ, о АН о АН А А нн ВН НН в ОЙ сел ТМ т КУХОННІ ЕН ОК ККУ ММНУТТНМ ї10ООМВ Що 8 дурне ЕЕ Камо КЕ М АК Ох туда ОН С о ЕВ С ОВ Ва ВИ З ВА З В В С ВЕ З КЗ и З НО ме 117 БІЕІІ111:111Р1111РРТРІРРІ:1113Р211111111111111РРІ11І11111І пай. пщалуекецемрцчУА как ду УА им у еко А миК В и. силі ун и и А С о КВ о ки и в В В ЕМ В З ИН МА пох гУВдЕОнЕ Кс УМХ ДЕК ОД в ев ву ДТ М КК х дер ЗМО СТЕ ХТ КУМ УКВ АКТМИ НАВИ МУ МУКУ КУКА МЕ КОКО УКХ МА 11:71:15: 111:1:1::3:1:1:,735 21:11:51: 11:11:31: :11:::: 53:11 11: КІ: ЗРІЗІ 13111111: 11111511 1351 БІТ 15311 о нн в о Й з МК ої: ПЕАЙТИХ ТАЛУ ММК МКК ТТ ОАЕ КУТКУ УМХ ММК пи
З. ТМ ИН и зем о біди ю Ж жу М юю ДІМ ВІВ пи я а лук ДЖ ХОДА ВАСЕХ Ух СКІТІКМВ ОМИНУЛА МВА УВК ЕК МУ М тт: РЕ РФ: :З5 ті 55 же:ф:1121:51і:1:1:5111: ТІК ТТ я ще екІіІкІІ 13521133: до Те щи вух сек Ву ув що І Ва КОТ ММ МАУ МХ и и и и м КЕ и и М М ЕК по АН АФК ТЕМАМ 3 Ми оч лимани чуми Дим Уи МУКУ М и І ВУС Дим и Ми Ми, щ МТУ ЗЛЕ 1 АКСАСМТАІМЛМ НУК ЖИ ХІМ КИТ У ААУ АК ГІМНУ Б сІ1711:1:1 2:15: ТІЇ: :1:11:1:1:12г1:1::1::31,р::11:2::1:1:1:11:1:1:1:31:1511:1:1::11:11::3 ЗІР РІ РІ11135111Р11Р111351 КІ Р1151 11:11:11 І11:1111 со сх
Чнг. З
ЗО ої Фу ВО ДОКИ ТИВ А И КУ ХИТ уми Ми М ЖИ В КК ТУ У ВУХ ж ІБК о НАНУ Кф З КК В о Ка в ОН КВ ОО о МНН ЧНО с М ОВ ОО ЗВ В М НВ В З МУ ВЗ СОН В З ФВ ВО в СМ В МЕЧ ЗХ ою Ло Ву В тити ре М Ку и пи м км И М еии ЕЕ зику ср ал ІБ 8 ХАМОУА УТА КИ КАК ЕТ АТАКА КК КМ Ж ААУ У УЖ У 1рЕФфБКЬІІ2:1:31::1:1:1::11::11::1,р:1:3:ї111:1 235 З БЕРБІТЕРІРЕРРРЕЕЕРБЕЗЛІ РІ ІЕ ТІ РІ ВІР РР РР рЕжя ! їм 0 ЕК ЩТИИМ В Им У Ти Му и пи Ким М и и их - СЕ МЕМ ОХ ВСАА ВАК КУТ КТК НТ МІТОК КОМ схо Ї ДТ ШИ Жука . тку. Сх тику лу НМ ем хм у М ли КИ я. цк аа тт якщо ОО АлКту лем ччц ик о ВО в БОМ К о. цію ЗБ з шви сша ДЕ АЗААЧКТАНВК ТНМК ТКУ НО ТАК К Я г ВИЙ ТО БУ век ЕрІїРЬР:11,1:1 ГР: :113:::17:1111Р11311:11:15 111155: : мок ТК 11111Р51 БРІВ: РІІ 1111113 15113111 ХОЛУТЕ. зт луку У М ма ММ и УМ и лю Ми иІ МИ АТІ КК М рН її, дви УК ІЕЕ УТА АВ ою а Ек не М З СЕ и А м ВЕ МЕ в В Ви МУКА КК ОКХ ОВК КАК о КК ВМ ях Фе одлІв вв Кроти у ми ж Ха В лвмхоя їх ДО Ж ЗУ МІЗА МА ДАМУ БІК МКАС МКМ ХК КТК У КАТА КЕ СКАНЕН ВАНН ик ДЕК З Мп Е хх М 11:11: 1 ЕР1:І:т::1:135:1:11:1:1: 1771 :1::1:351:ї:1:: г: ЗА ож ТРБІЕРРЕЕРЕЕРЕРРЕРТРЕРЕТРР: ВБІФІРЕРТІІІБЕРРЕРЕрРІ Ер МАЮ У я му В Мох ККУ Кум м г пи им Кути Ми кое ТАК ох ГТ ТКА ПЗУ ЕМУККТІАКММА . : кежа У їде АЖ ж СУК КОМ КАК АК АКТ КК КУТОМ ККУ КМ ж Вк а ЧЕ ЗК М З ЧИ З КО ВУ о о о ень чуму Ве и у пути М ВИК ЕВ ул и ук у шу щи ж Олю жи Уу ОНА КА КАКАО У ТАМ КТ МАХ ККУ КАМ ве дж 1:15: 11:1:3:3р:гІф::111:11:31:::11:11:112111311:131 111111 ТІВ РР ОРЕ 31151511: 11313111 151131 У МКУ ВИК У и и А В В М ЕК у ОК УЛ З Ух ЗЕНИК КФК ЧО о в о ВН ААУ гг ко МКК УХ МКХАНУКЦ КУМ ОС ММК МАК УМА К КК З АЖ кла Ку мУ М Ку Ми МО и КУ В КМУ ув му І ий МО их задх цЕ хх а В КОМ а и ЯН ГУ НИІ ТИ г Ве о В ВО ; Бах ЕМО Її ЮК хе Кг юМІмУх МКХУ ХК А КАМИ ОКНХВА Хі УКХ СХ КК ов а о ЗК ЗО НУ ТУ 11511111: :151:1:111:1:р1:1 111 Ерф;:І:р::1:5:111:2р:211:13:1і2::5::115: ТЕ: 51111111: 11351115 1111Р13515 1111511: 111 ТИМ шо пкт умо У у ЕМ КЕх им ике вмим мем в оих кщ ДМ Ж СКС КАСККУЮИх В АХІМОА МКАС ІА МІК МКУ ГІ КК МА ІМ КЕТІ КЕ 3 СТИХ "ах луку у ик ТК и ЖК Уго Ук "хо ВК па Оу В в аа ВЕ о ре ІЩЕ) СВІ ВК КАРЕ ВИН МКК А Ел 1:31: :31::3::3:11::111:1:11::1::,1:1:51:: ТЕРРІ КРІВТІ31111111211І1РЕТІТРІТіІ: о и а в в и в НН ИН ЕМ І МАКИ МИ МУКУ У ВУ: КЕ С Ко сах мит Ми и КТ І МІК о ши віх у ех Кі ми у мМ Си хх БО ВЕ В В ВІ ЗК ИН ЯН З ЗК а МА Я ОВ Мел оїікцІх сему МЕ умо Оу Мі хТ КИ Милі КУМ МОУ Маа СЕС ОІД ВЕЖ ХК ЦЕ шик и малим дими Килим І милі мм и дм РИМІ ВН в ОА ВЕ ЗВ Со ВОК ЗК ЯН Я ЕН СВУ Сбурауттух Щі ГЕН шщУучЕВН Куда ІК кпк, їй УА А сУчУМШУМУ ЗІУ КА ЖЖ ККУ МУВХЮЧУЖ УМА ОКА КМ ВАМИ ВО ЗАКО. МІК Кжш мо тт І секр МІН У М ТУЮ В ду МУК ВК ВК ЕМ, ПМЖ ТЕКИ МКМ ТІК, га ді, я що ТК МУ ІУУМх МКІ МК КУкіу ж му Ух ХОМ КІ і КВК ЖК ей о У тк Ко ІШІАС еВ Я ЛИ УТУВОК ТО ПК р о о В С во ЗИ В КЕ ВОК ТА ОСМКОКУ ВЕК ІАВКМЕКЕ пчрхижькя УЖ сему Вл ШК у іх КК В ФЕВ муху хрому мм Ме дими ЗСЖ Ми МІ ВЕК ліки м ВІКУ у хром ки мус на В В В В в В Б З В КИ З С З КЗ ЗЕ НО ВК Я З СО ДЕ В ОН в ВХ гом АЛЕ ДОМУ ВТІМ пот ТИуХ ВМ СКеЗІМОУТ ї ХМК В ЗКУ ШКО Кук стих ХК о
ПК. поруку шт Іл У КУ Мт гаІМВЕшЖАЛЕХ шамотна етики ТОК У БеУОюТК КВ Фк Я типи Ук ми у Ух нн У Ми а ЖИЛА КАМ ОІВ МЕТІ Х КУМ МІК ККЕМКЛАТВМІ я он М м ВЗ САМ ЕК У Куда ютих ОВО ТТ ІМ ТОМИ т мі ММ Ки І Ми Іти Ед СТ МУЛУ ДА КІ МА КІМ ТМ Х КЕ МАМ МІУ Х КНЕУ КМ М Кк Ж ВКМ ХМ тд и кс МУК Хот ВИ ТУ В ВМД У В ХУ МЕМ МУ ЕХ М УХ т, МБ ІуКМЕиМИМ АМІНЬ Х МАМ ВИМИ М ТМ ВІКІ КК ОО КУ захо с ЛОЖЕ ох І У мМ ютер Од ХВ ту М Ж ких В КВИ Кук вх сі ам с ки Ми пріо ЩІ том кІ ЕТ ЦД ЦІ нг КМУ УМ оо а КЛОН ХХІХ а ми В НК Ко о З КВ я КВ о В В в ВА ОВ ЕЕ ПЕ С ВК ВО їли СИ ТІНІ ДВІ Ж п ЛЮ ІМ ИМІМІ Х ПО А В КО ВО КЗ МК теп. ККУ, ЕХ МОЮ Олю чн пу ІБ ю махи моху речи ми жк Уа ТА ЗК ДК ТИКИ Си Оп МІ хх З УРН Е КАСА ШІ КЕТ ех с" тує й о ж. рух к пута екі Я.
и. а ПОД ВКННЯ
Ж КРУТ ТС НАТО ТКТАК ТТ ТЕАТРАХ МКЕАСЕТ ВУАН АС ТЕ КТС АВМ АКТ САТАНИ ТК АК ТВО ВАТ ТОТАОСТ ТС ТВО ТАС ОО ОА КОВО АКОТ СТЕ ЛИ КОКО ТЕС ОЗ ТОВ РОТОВУ ЕХ СКК МЕ МУК МКК ЛО КОВКА МОСКВИ КЕКС КОТУ АКОТ ПОТУ ТАВВТКА МУКУ КОМАР КТС ВІКОВА ЕВ ТАКО ТМ К МО О КВТ ПММ ЕК ТІНИ ККУ КТ АА ТОВ АЛЕКС АТА ТЛА ТА АТМ ЕАЖТ ТАМ КАКАО ПИКА ИИ НУТИ АКТА ЕТИКИ ПМК СТАКАНА КТК ММ МОСК УК ОВ АКОТ АК ЕТО КО ТАККХ ЖУКИ МКАКО НО КТ МАК СХОДОМ КТ ВТК А ТА А КОМА ЕКО ВАК ЕКО КН КК ЧК ЗХ БЕН НК З В В В СЕ КОВІ ЖЕК ТЕН КО ОА КИ КАК УТ ТЕМ ОА С АВАЛАВМОСМ КЕ КО КТ УТАТИМУ І СИАВККОУТО ОАЕ АТОМ ТЕО КС А КО ТАТА ОА ВА КАЖЕМО ОК КМ ТК МКАС ВТ ТАТА А МОВА КТ ТАТО ЕКО А КТ КК МАТОМ ТАКУ КК ОТО КВН КНТУ КВОТ КОКО МОКАСИНИ А ТОСТІВ КОВО КСО АВК ВНК БУК ее НН и В М ВН НН и М В НИ ТАСВСВУ ТО ОА ОАЕ ТОК КОМЕТ КЛИМ КАТ ОА ТК АТО КРТ ЕТ АОКУ ОАКОКОВАХКВИ ТИМИ АК КТК КРЕАТИВ КУТИ КОВАНОГО КТК ТУ ВАЛ ЕЕ ПИКА КИСЛА ТОВ МКК ОА КУ КИЕВ АВК МКМ ЕК ТАН НМУ в МЕТКИ ТКТВНЕВККОВМОТМЕТ ТОМУ ВКУСИВ иМИ НВ НЕ ЯВНУ З В НЯ ВЗН у Зо Я КУКА ХіІЕЕКИВ ОКИС УМ МИ ОКК КАН КОМИ ТОМА ЕВ АММ НЕК НЯ ВН С ЗНОВ КК ВЕ В У КИ КН КН ОК А КК МЕМУАК ТЕНТ ТУ КВОТ Є МЕН В ВОМУ МВ ОСІ У КЕ ТОМ ВВА КАВА ТИМИ ТВ МІВКВЕЄУНКУММОСКрИВКВИУВЕСиВ ЮК КОТОВ ОІВ ОНАЧМЕАБОСЕУ ТКУ КИМ - ж ОК ПАССАТИАВСТСЕ КАСИ каажем МАО КАТЕТ КТ АМОСОВА ща ХХ ОЖОУМНУКММ ЕВ УАНМ МА ВАС АХКОКТИ СТ МУ ОАЕТККОАКТ КК ОТАТОСВУТ САЛА А ТОМАХ ОАЕ ТАКТ МК ТАКЕ У КОЛО АВЛАСТ ТК КУНА КОНКУ КК ОАСКОЛИТА СМІТТ САКЕ КХ ТК ВАК ТАКТ УА КАВА ТАКА ТОМКНУВА ТКУ УК ОВК ТЕ ОА КОДАК ВАТХ ТО АВТО КАТ ВСКААКА ТАФАТ ТЕКА КАСЕТ МАКИ КТС КК ВМ ВУ КОВКИ ТАТО їх МЕОБОІ МАЛ ет сализвсасиааносхлаусиане МЕЛЕ Ви еМі дико
ФІГ.
коки. Щ ВТ А !
шиш. і н- о шАВДАЬЮ Я зяожу. Н ї іх ЕВ ЗХ Н позику хх Я У мас сі ши АЙ Ко ЕХ ПТУ : НИ: Е БО Я і ІЗ НЕ Н Н ї г БЕК кл Н : Н ЕВ ПИ КВ хо : шу С ее о пе кди я ЕН у і ВИ АВ мае "ох ; 1 щем ЩІ В з 0 КІВ ! в ОО На ПОВ Б НЕ : її : "Ж х фл КВ КВ о впли КВ Н МЕ ї І ВШ КВ ге ОО Коти КВ І Х НИ: о КО КМ КО БО : Май : ! о. ут КВ КЕ ; п КВ : зу лм Ї НЕК ШО М ОО КИТИ: М х
БОБ. о. п. о. о. : Бо ШЕ о Б п : Ж рі о Мо о БОКУ Я хи І ІМ ВИШІ КН х ФИИШИ. З У Ему Ще Я . КОШИК о МО Н Ж Го. . ПЕВ о БО КУ ї її ГО З ВО ОО з У Я Кв р. ее я - о. ГеСщая ше З Люта Катачаротин яеокоантінм НЕ І г пе ВАврежив і і Н г: по... яд В Ж пе. хе мл ПИ: . п. її еко ЕЕ е Н ІЗ ее ІЗ І х з ї й і
8. ії В ї ГЕ ще ВК : Ка і . . Е ї : З: : КО Є х ЕХ І : ї
UAA201405845A 2011-10-31 2012-10-30 Спосіб одержання рослини тютюну з підвищеним вмістом бета-дамасценону UA116530C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11187332.9A EP2586792A1 (en) 2011-10-31 2011-10-31 Modulating beta-damascenone in plants
EP12152508 2012-01-25
PCT/EP2012/071488 WO2013064499A1 (en) 2011-10-31 2012-10-30 Modulating beta-damascenone in plants

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA116530C2 true UA116530C2 (uk) 2018-04-10

Family

ID=47351568

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201405845A UA116530C2 (uk) 2011-10-31 2012-10-30 Спосіб одержання рослини тютюну з підвищеним вмістом бета-дамасценону

Country Status (16)

Country Link
US (1) US9683240B2 (uk)
EP (1) EP2773658B1 (uk)
JP (1) JP6302407B2 (uk)
KR (1) KR101965019B1 (uk)
CN (1) CN104080802B (uk)
AU (1) AU2012331235B2 (uk)
BR (1) BR112014010259B1 (uk)
CA (1) CA2853320A1 (uk)
IL (1) IL232220A0 (uk)
MX (1) MX356893B (uk)
MY (1) MY167122A (uk)
RU (1) RU2681497C2 (uk)
SG (1) SG11201401858YA (uk)
UA (1) UA116530C2 (uk)
WO (1) WO2013064499A1 (uk)
ZA (1) ZA201403109B (uk)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR100338A1 (es) * 2014-05-08 2016-09-28 Philip Morris Products Sa Promotor de plantas
MX2017003210A (es) * 2014-09-15 2017-06-06 Rijk Zwaan Zaadteelt En Zaadhandel Bv Germinacion de semilla a alta temperatura.
US10647989B2 (en) 2016-10-07 2020-05-12 Altria Client Services Llc Composition and methods for producing tobacco plants and products having reduced tobacco-specific nitrosamines (TSNAs)
JP2021519064A (ja) 2018-03-28 2021-08-10 フィリップ・モーリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム 植物体における還元糖含有量の調節
WO2019185703A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 Philip Morris Products S.A. Modulating amino acid content in a plant
BR112021012596A2 (pt) 2018-12-30 2021-11-30 Philip Morris Products Sa Produtos de tabaco compreendendo uma célula vegetal, parte de uma planta ou um material vegetal, método para produzir uma planta e método para produzir material vegetal curado
CN112390856A (zh) * 2019-08-19 2021-02-23 辽宁医学诊疗科技研发中心有限公司 一种具有生物活性的多肽eep2和二倍体的固相合成方法
WO2021063863A1 (en) 2019-10-01 2021-04-08 Philip Morris Products S.A. Modulating sugar and amino acid content in a plant (sultr3)
JP2022550383A (ja) 2019-10-01 2022-12-01 フィリップ・モーリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム 植物における還元糖含有量の調節（ｉｎｖ）
CN110656114B (zh) * 2019-10-18 2022-07-01 云南中烟工业有限责任公司 一种烟草色素合成相关的基因及其应用
EP4140293A1 (en) 2020-04-21 2023-03-01 Japan Tobacco Inc. Tobacco plant body and method for producing same
WO2023036691A1 (en) 2021-09-10 2023-03-16 Philip Morris Products S.A. Modulating alkaloid profiles in nicotiana tabacum
WO2023117661A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 Philip Morris Products S.A. Increasing anatabine in tobacco leaf by regulating methyl putrescine oxidase
WO2023117701A1 (en) 2021-12-21 2023-06-29 Philip Morris Products S.A. Modulation of nicotine production by alteration of nicotinamidase expression or function in plants
WO2024079137A1 (en) 2022-10-13 2024-04-18 Philip Morris Products S.A. Increasing leaf biomass and nitrogen use efficiency by regulating ntp2

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3940499A (en) 1974-09-19 1976-02-24 International Flavors & Fragrances Inc. Food or flavor containing 2,6,6-trimethyl-1-cyclohexen-1-ylacetaldehyde
US6252141B1 (en) * 1998-08-14 2001-06-26 Yissum Research And Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Tomato gene B polynucleotides coding for lycopene cyclase
AR021056A1 (es) 1998-11-03 2002-06-12 Syngenta Participations Ag Adn que comprende un gen especifico de antera de arroz y planta transgenica transformada con el mismo
US7575766B2 (en) * 2001-06-29 2009-08-18 Ball Horticultural Company Tagetes erecta with altered carotenoid compositions and ratios
US7081478B2 (en) * 2001-06-29 2006-07-25 Chrysantis, Inc. Mixed zeaxanthin ester concentrate and uses thereof
EP1851317B1 (en) 2005-02-23 2011-10-26 North Carolina State University Alteration of tobacco alkaloid content through modification of specific cytochrome p450 genes
DE102006005711A1 (de) 2006-02-08 2007-08-23 Robert Bosch Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur Überwachung wenigstens einer Glühkerze eines Kraftfahrzeugs
EP1867723A1 (en) * 2006-06-16 2007-12-19 Genoplante-Valor Plants with increased tolerance to water deficit
ATE519853T1 (de) 2006-10-13 2011-08-15 Univ North Carolina State Änderung des alkaloid-gehalts von tabak mittels modifizierung spezifischer p450-cytochromgene
RU2324737C1 (ru) * 2006-10-18 2008-05-20 Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук (СО РАН) Способ получения трансгенных растений табака с повышенным содержанием пролина
WO2009064771A2 (en) 2007-11-12 2009-05-22 North Carolina State University Alteration of tobacco alkaloid content through modification of specific cytochrome p450 genes
EP2559766B1 (en) 2007-12-13 2017-10-18 Philip Morris Products S.A. Plants modified for reduced cadmium transport, derivative products, and related methods
CN101624556A (zh) 2009-07-30 2010-01-13 无锡嘉华香精香料有限公司 一种具有红花大金元烟叶风格特征的烟用香精
JP5393341B2 (ja) 2009-08-20 2014-01-22 株式会社デンソー グロープラグ劣化判定装置

Also Published As

Publication number Publication date
CN104080802B (zh) 2017-09-01
MY167122A (en) 2018-08-13
MX2014005298A (es) 2014-10-24
ZA201403109B (en) 2015-07-29
JP2015505666A (ja) 2015-02-26
AU2012331235B2 (en) 2017-06-15
KR101965019B1 (ko) 2019-04-02
US20140289901A1 (en) 2014-09-25
AU2012331235A1 (en) 2014-05-22
BR112014010259A2 (pt) 2017-04-18
BR112014010259B1 (pt) 2021-07-06
JP6302407B2 (ja) 2018-03-28
US9683240B2 (en) 2017-06-20
WO2013064499A1 (en) 2013-05-10
EP2773658B1 (en) 2018-05-16
NZ624229A (en) 2016-04-29
RU2014121656A (ru) 2015-12-10
KR20140087025A (ko) 2014-07-08
CA2853320A1 (en) 2013-05-10
EP2773658A1 (en) 2014-09-10
MX356893B (es) 2018-06-19
CN104080802A (zh) 2014-10-01
SG11201401858YA (en) 2014-05-29
IL232220A0 (en) 2014-06-30
RU2681497C2 (ru) 2019-03-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA116530C2 (uk) Спосіб одержання рослини тютюну з підвищеним вмістом бета-дамасценону
RU2733837C2 (ru) Снижение превращения никотина в норникотин в растениях
ES2698154T3 (es) Reducción de metales pesados en plantas
RU2689719C2 (ru) Треонинсинтаза из nicotiana tabacum и относящиеся к ней способы применения
CN105247053B (zh) 植物中的烟草特异性亚硝胺降低
CN103958673B (zh) 来自红花烟草的异丙基苹果酸合酶及其方法和用途
US10883114B2 (en) Plants with reduced asparagine content
EP2586792A1 (en) Modulating beta-damascenone in plants
NZ624229B2 (en) Modulating beta-damascenone in plants