ES2698154T3 - Reducción de metales pesados en plantas - Google Patents

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Abstract

Un vector de expresión para inhibir la traducción de ARNm de NtMRP4 cuando se expresa en una planta de tabaco, que comprende un promotor unido operativamente a: (a) un polinucleótido, la secuencia del polinucleótido que consiste de cualquiera de secs. con núms. de ident.: 13- 23 o 53, ubicadas en orientación antisentido con respecto al promotor; o (b) un constructo de polinucleótidos de 15 a 100 nucleótidos de longitud que es al menos 80 % idéntico a una región de sec. con núm. de ident.: 1, ubicado en orientación antisentido con respecto al promotor; o (c) un polinucleótido que codifica un polinucleótido de ARNi capaz de autoaparearse para formar una estructura de horquilla que comprende: una primera secuencia de 15 a 300 nucleótidos que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con sec. con núm. de ident.: 1; una segunda secuencia que codifica un elemento espaciador que forma un lazo de la estructura en horquilla; y una tercera secuencia que tiene una secuencia complementaria inversa de la primera secuencia, ubicada en la misma orientación que la primera secuencia, en donde la segunda secuencia se ubica entre la primera secuencia y la tercera, y la segunda secuencia se une operativamente a la primera secuencia y a la tercera secuencia.

Description

DESCRIPCIÓN
Reducción de metales pesados en plantas
Campo de la invención
La presente invención se dirige a polinucleótidos y polipéptidos que codifican transportadores ABC que se implican en el transporte de metales pesados. La presente invención se dirige, además, a modificar la expresión de dichos polinucleótidos o polipéptidos en plantas. En particular, la presente invención se refiere a la modulación (por ejemplo, reducción o inhibición) de la expresión o actividad de uno o más transportadores ABC implicados en el transporte de metales pesados subcelular.
Introducción
Las plantas obtienen metales pesados esenciales - tales como el zinc y el cobre - mediante la absorción de substratos con iones metálicos de su entorno mediante diversos mecanismos de transporte mediados por transportadores transmembrana que se expresan en la superficie de las células de las raíces y otros tejidos vasculares. Un mecanismo usa el transporte de toxinas hacia fuera del citosol. Por ejemplo, la familia de bombas de glutatión S-conjugado (GS-X) es una clase de transportadores de casete de unión a ATP (ABC) que es responsable de la eliminación/secuestro de compuestos en plantas así como también en células de levadura y de mamífero. La estructura molecular y la función de las bombas GS-X codificadas por los genes MRP, cMOAT (transportador de aniones multiespecíficos canalizado) y YCF1 (factor de cadmio de levadura) de mamíferos y plantas parecen haberse conservado a lo largo de la evolución molecular.
Las plantas se exponen a toxinas exógenas - tales como productos microbianos, aleloquímicos, agroquímicos y metales pesados - lo que hace que la supervivencia celular dependa de mecanismos para desintoxicar o reducir la acumulación de estos agentes. Los metales pesados - tales como plomo, cadmio, mercurio, etcétera - son tóxicos ambientales importantes, que causan la generación de especies de oxidación reactiva, daño en el ADN y la inactivación enzimática mediante la unión a sitios activos de enzimas en células de organismos vivos. La contaminación del ambiente con metales pesados ha aumentado drásticamente debido a la industrialización y al aumento del tamaño de la población. Los suelos contaminados con metales pesados inhiben el crecimiento normal de las plantas y causan la contaminación de los productos alimenticios. Muchos metales pesados son muy tóxicos para la salud humana y cancerígenos a bajas concentraciones.
La reducción en el contenido de metales pesados - tales como el cadmio - en plantas o productos vegetales consumidos por animales y humanos es muy conveniente y se requiere urgentemente. Un objeto de la presente invención es satisfacer esta necesidad.
Aspectos y modalidades de la invención
Los aspectos y modalidades de la presente invención se exponen en las reivindicaciones adjuntas. La presente invención se define en las reivindicaciones independientes y ciertas características opcionales de estas se definen en las reivindicaciones dependientes. En la medida en que los términos “invención”, “ejemplo”, “aspecto” y “modalidad” se usan en la presente descripción, esto se interpretará de tal manera que la única protección buscada es para la invención tal como se reivindica.
En un aspecto, se proporciona un polinucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste en: un polinucleótido aislado que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia que tiene al menos un 71 % de identidad de secuencia con sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: 2 o sec. con núm. de ident.: 27 o sec. con núm. de ident.: 28, sec. con núm. de ident.: 29 o sec. con núm. de ident.: 51; un polinucleótido aislado que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia que tiene al menos un 65 % de identidad de secuencia con cualquiera de secs. con núms. de ident.: 3 a 23 o 30 a 50; un polinucleótido que codifica un polipéptido NtMRP que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia que tiene al menos un 65 % de identidad de secuencia con cualquiera de secs. con núms. de ident.: 24 a 26 o 52, y preferentemente, en donde el polipéptido tiene actividad transportadora de metales pesados.
En un aspecto adicional, se proporciona un constructo de polinucleótido de al menos 15 nucleótidos contiguos de longitud que es al menos un 65 % idéntico a una región de cualquiera de secs. con núms. de ident.: 1 a 23 o 27 a 51.
En un aspecto adicional, se proporciona un ribopolinucleótido bicatenario que comprende al menos dos secuencias que son al menos complementarias parcialmente entre sí y en donde una cadena sentido comprende una primera secuencia y una cadena antisentido comprende una segunda secuencia y en donde al menos una de las secuencias comprende al menos 10 nucleótidos contiguos de ARN de NtMRP.
Adecuadamente, el ARN bicatenario comprende una primera secuencia que tiene al menos un 65 % de identidad de secuencia con al menos 10 nucleótidos de ADN de NtMRP; una segunda secuencia; y una tercera secuencia que tiene una secuencia complementaria inversa de la primera secuencia, colocada en la misma orientación que la primera secuencia, en donde la segunda secuencia se coloca entre la primera secuencia y la tercera secuencia, y la segunda secuencia se une operativamente a la primera secuencia y a la tercera secuencia.
Adecuadamente, la primera secuencia tiene al menos un 65 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: sec. con núm. de ident.: 3, sec. con núm. de ident.: 4, sec. con núm. de ident.: 5, sec. con núm. de ident.: 6, sec. con núm. de ident.: 7, sec. con núm. de ident.: 8, sec. con núm. de ident.: 9, sec. con núm. de ident.: 10, sec. con núm. de ident.: 11, sec. con núm. de ident.: 12, sec. con núm. de ident.: 13, sec. con núm. de ident.: 14, sec. con núm. de ident.: 15 sec. con núm. de ident 16, sec. con núm. de ident.: 17, sec. con núm. de ident.: 18, sec. con núm. de ident.: 19, sec. con núm. de ident.: 20 sec. con núm. de ident.: 21, sec. con núm. de ident. 21, sec. con núm. de ident.: 22, sec. con núm. de ident.. 23, sec. con núm. de ident. 30, sec. con núm. de ident. 31, sec. con núm. de ident.: 32, sec. con núm. de ident.: 33, sec. con núm. de ident. 34, sec. con núm. de ident. 35, sec. con núm. de ident.: 36, sec. con núm. de ident.: 37, sec. con núm. de ident. 38, sec. con núm. de ident. 39, sec. con núm. de ident.: 40, sec. con núm. de ident.: 41, sec. con núm. de ident. 42, sec. con núm. de ident. 43, sec. con núm. de ident.: 44, sec. con núm. de ident.: 45, sec. con núm. de ident. 46, sec. con núm. de ident. 47, sec. con núm. de ident.: 48, sec. con núm. de ident.: 49, sec. con núm. de ident.: 50 y sec con núm. dr ident. 53.
Adecuadamente, la tercera secuencia tiene al menos 65 % de identidad de secuencia con el complemento inverso de la secuencia correspondiente a sec. con núm. de ident .: 3, sec. con núm. de ident.: 4, sec. con núm. de ident.: 5, sec. con núm. de ident.: 6, sec. con núm. de ident.: 7, sec. con núm. de ident.: 8, sec. con núm. de ident.: 9, sec. con núm. de ident.: 10, sec. con núm. de ident.: 11, sec. con núm. de ident.: 12, sec. con núm. de ident.: 13, sec. con núm. de ident.: 14, sec. con núm. de ident.: 15 sec. con núm. de ident.: 16, sec. con núm. de ident.: 17, sec. con núm. de ident.: 18, sec. con núm. de ident.: 19, sec. con núm. de ident.: 20, sec. con núm. de ident.: 21, sec. con núm. de ident.: 21, sec. con núm. de ident.: 22, sec. con núm. de ident..23, sec. con núm. de ident.: 30, sec. con núm. de ident.: 31, sec. con núm. de ident.: 32, sec. con núm. de ident.: 33, sec. con núm. de ident.: 34, sec. con núm. de ident.: 35, sec. con núm. de ident.: 36, sec. con núm. de ident.: 37, sec. con núm. de ident.: 38, sec. con núm. de ident.: 39, sec. con núm. de ident.: 40, sec. con núm. de ident.: 41, sec. con núm. de ident.: 42, sec. con núm. de ident.: 43, sec. con núm. de ident.: 44, sec. con núm. de ident.: 45, sec. con núm. de ident.: 46, sec. con núm. de ident.: 47, sec. con núm. de ident.: 48, sec. con núm. de ident.: 49, sec. con núm. de ident.: 50 y sec con núm. de ident. 53.
En un aspecto adicional, se proporciona un vector de expresión que comprende el polinucleótido aislado o el constructo de polinucleótido.
En un aspecto adicional, se proporciona una célula vegetal mutante, de origen no natural o transgénica que comprende el polinucleótido aislado, el constructo de polinucleótido, el ribonucleótido bicatenario o el vector de expresión.
En un aspecto adicional, se proporciona una planta mutante, de origen no natural o transgénica que comprende la célula vegetal mutante, de origen no natural o transgénica.
En un aspecto adicional, se proporciona material vegetal lo que incluye biomasa, semillas u hojas que comprenden células o tejido de dicha planta.
En un aspecto adicional, se proporciona un producto de tabaco que comprende una parte de dicha planta o célula vegetal o dicho material vegetal.
En un aspecto adicional, se proporciona una planta mutante, de origen no natural o transgénica, en donde disminuye la expresión del polinucleótido de NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta manera o la actividad de la proteína codificada de esta manera y las hojas de dicha planta tienen una reducción en el contenido de cadmio de al menos 5 % en comparación con una planta control en la cual la expresión del polinucleótido NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta manera o la actividad de la proteína codificada de esta manera no han disminuido.
En un aspecto adicional, se proporciona biomasa, semillas u hojas que comprenden tejido de la planta.
En un aspecto adicional, se proporciona un método para reducir los niveles de cadmio en al menos una parte de una planta, que comprende la etapa de reducir la expresión del polinucleótido de NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta manera o la actividad de la proteína codificada de esta manera en comparación con una planta control en la cual la expresión del polinucleótido NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta manera o la actividad de la proteína codificada de esta manera no ha disminuido.
En un aspecto adicional, se proporciona una planta mutante, de origen no natural o transgénica obtenida u obtenible por el método descrito en la presente descripción, en donde hay una reducción en el contenido de cadmio de al menos aproximadamente 5 % en al menos una parte de la planta en comparación con una planta control en la cual la expresión del polinucleótido NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta manera o la actividad de la proteína codificada de esta manera no ha disminuido.
En un aspecto adicional, se proporciona un polipéptido NtMRP aislado expresado por la secuencia expuesta en cualquiera de secs. con núms. de ident.: 24 a 26 o sec. con núm. de ident.: 52, preferentemente, en donde el polipéptido tiene actividad transportadora de metales pesados.
En un aspecto adicional, se proporciona un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido aislado.
En un aspecto adicional, se proporciona un método para detectar un polinucleótido NtMRP en una muestra que comprende la etapa de: (a) proporcionar una muestra que comprende un polinucleótido; (b) poner en contacto dicha muestra con uno de más cebadores o una o más sondas para detectar específicamente al menos una porción del polinucleótido NtMRP; y (c) detectar la presencia de un producto de amplificación, en donde la presencia de un producto de amplificación indica la presencia del polinucleótido NtMRP en la muestra.
Otros aspectos de la presente invención se exponen más abajo.
Un gen quimérico que comprende el polinucleótido que unido operativamente a una o más secuencias reguladoras. Un constructo polinucleotídico o un ARN bicatenario de acuerdo con la presente invención, en donde el polinucleótido comprende, consiste o consiste esencialmente en al menos 15-30 nucleótidos, 30-50 nucleótidos, 50­ 100 nucleótidos, 100-150 nucleótidos, 150-200 nucleótidos, 200-300 nucleótidos, 300-400 nucleótidos, 400-500 nucleótidos, 500-600 nucleótidos o 600-700 nucleótidos.
Un conjugado que comprende el polinucleótido aislado, el gen quimérico, el constructo de polinucleótido o el ARN bicatenario de acuerdo con la presente invención y al menos un resto no nucleotídico o no polinucleotídico que se une covalentemente al mismo.
Una célula vegetal mutante, de origen no natural o transgénica que comprende el polinucleótido aislado, el gen quimérico, el constructo de polinucleótido, el ARN bicatenario, el conjugado o el vector de expresión de acuerdo con la presente invención.
Una planta mutante, de origen no natural o transgénica que comprende la célula vegetal mutante, de origen no natural o transgénica de acuerdo con la presente invención.
Adecuadamente, la biomasa seca de las hojas recolectadas es aproximadamente la misma que la de la planta control.
Biomasa, semilla u hojas que comprenden tejido de la planta de la presente invención.
Un producto consumible que incorpora o usa la biomasa, la semilla o las hojas de acuerdo con la presente invención.
Biomasa, semilla u hojas de acuerdo con la presente invención o un producto consumible de acuerdo con la presente invención, en donde hay una reducción en el contenido de cadmio de al menos aproximadamente 5 % en la misma en comparación con la biomasa, semilla u hojas de una planta control en la cual la expresión del polinucleótido NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta manera o la actividad de la proteína codificada de esta manera no ha disminuido.
Una línea celular que comprende el polinucleótido aislado, el gen quimérico, el constructo de polinucleótido, el ARN bicatenario, el conjugado o el vector de expresión de acuerdo con la presente invención.
Un método para preparar una planta mutante, de origen no natural o transgénica que comprende la etapa de reducir la expresión del polinucleótido NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta manera o la actividad de la proteína codificada en al menos una parte de dicha planta en comparación con una planta control en la cual la expresión del polinucleótido NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta manera o la actividad de la proteína codificada de esta manera no ha disminuido.
Un método para reducir los niveles de cadmio en al menos una parte de una planta, que comprende la etapa de reducir la expresión del polinucleótido NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta manera o la actividad de la proteína codificada de esta manera en comparación con una planta control en la cual la expresión del polinucleótido NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta manera o la actividad de la proteína codificada de esta manera no ha disminuido.
Adecuadamente, dicho método comprende la primera etapa de poner en contacto dicha planta con el constructo de polinucleótido, el ARN bicatenario, el conjugado, el vector de expresión, una meganucleasa o una proteína con dedos de zinc.
Adecuadamente, dicho método comprende la primera o la etapa adicional de poner en contacto dicha planta con un mutágeno.
Una planta mutante, de origen no natural o transgénica obtenida u obtenible por los métodos de la presente invención, en donde hay una reducción en el contenido de cadmio de al menos aproximadamente 5 % en al menos una parte de la planta en comparación con una planta control en la cual la expresión del polinucleótido NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta manera o la actividad de la proteína codificada de esta manera no ha disminuido.
Un método para modular (por ejemplo, reducir o inhibir) la expresión del polinucleótido NtMRP o la actividad de la proteína codificada de esta manera en una célula, dicho método comprende administrar el gen quimérico, el constructo del polinucleótido, el ARN bicatenario, el conjugado o el vector de expresión de acuerdo con la presente invención.
Un método para detectar, aislar, amplificar o analizar un polinucleótido NtMRP, el método comprende la etapa de proporcionar una muestra que comprende un polinucleótido e hibridar dicho polinucleótido a una molécula de polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 10 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos aislada de acuerdo con la presente invención.
El uso de un agente que modula (por ejemplo, reduce o inhibe) la expresión del polinucleótido NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta manera o la actividad de la proteína codificada de esta manera para reducir el contenido de cadmio en al menos una parte de una planta por lo menos 5 % en comparación con una planta control en la cual la expresión del polinucleótido NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta manera o la actividad de la proteína codificada de esta manera no ha disminuido.
El método o el uso de acuerdo con la presente invención, en donde el agente es o se deriva del polinucleótido NtMRP, un gen NtMRP quimérico, un constructo de polinucleótido que comprende un polinucleótido NtMRP, un ARN antisentido, un ARN bicatenario, un ADNc, un conjugado que comprende un polinucleótido NtMRP y al menos un resto no nucleotídico o no polinucleotídico que se une covalentemente a él, una ribozima, un mutágeno, una dedos de zinc, una molécula pequeña o una meganucleasa.
En un aspecto adicional, se proporciona un método para producir un producto de tabaco que comprende las etapas de: (a) obtener semilla de la planta de tabaco mutante, de origen no natural o transgénica; (b) plantar y cultivar la semilla hasta obtener una planta; (c) cosechar la planta; y (d) preparar un producto de tabaco a partir de la planta cosechada.
Las modalidades mencionadas anteriormente se describen como modalidades de cada uno de los aspectos descritos anteriormente.
Algunas ventajas
Producir plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas (lo que incluye biomasa, semillas y hojas obtenidas a partir de las mismas) en las cuales están presentes cantidades menores de cadmio proporciona una serie de ventajas.
A manera de ejemplo, las plantas, lo que incluye las plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas, pueden cultivarse en suelos que contienen concentraciones variables de cadmio, o en suelos que contienen concentraciones de cadmio menores que las convenientes. Estas plantas y las semillas derivadas pueden proporcionar más opciones para cultivarlas en una gama más amplia de ambientes de suelo, lo que puede aumentar la cantidad de suelos cultivables disponibles para los practicantes (por ejemplo, agricultores).
A modo de ejemplo adicional, las plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas (lo que incluye biomasa, semillas y hojas obtenidas a partir de las mismas) exhiben un contenido de cadmio reducido, en comparación con sus contrapartes control y pueden consumirse directamente como productos comestibles. El consumo de estos productos comestibles puede ser una opción más saludable. Plantas adecuadas que pueden manipularse de acuerdo con los métodos descritos incluyen plantas cultivables para uso agrícola, lo que incluye tabaco, arroz, maíz, calabaza, soja, lechuga, patatas, remolachas, hierbas, trigo, cebada y zanahorias, etcétera.
A modo de ejemplo adicional, la altura y/o el peso de las plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas es igual sustancialmente que las plantas control. Por lo tanto, no se encuentran diferencias significativas en las hojas secas recogidas de las plantas en comparación con un control lo que indica que la modulación de los transcritos de NtMRP no tiene un efecto relevante estadísticamente sobre la biomasa seca. Esto es ventajoso porque las plantas se usan para la producción comercial de diversos productos, lo que incluye el tabaco, donde las alteraciones en el aspecto visual no serían aceptables para la industria o podrían resultar en rendimientos de producción reducidos inaceptablemente.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. La Figura 1(a) es un diagrama esquemático del locus de NtMRP4; la Figura 1(b) muestra la secuencia de nucleótidos de NtMRP4 en la cual las regiones 5' y 3' UTR están subrayadas; los exones se muestran en letras mayúsculas y negritas; los intrones se muestran en letra minúscula y normal; y los codones de inicio y finalización se muestran en gris. Las secuencias 5' y 3' de los cebadores para la generación de una secuencia de ARNi de NtMRP4 se indican en cursiva y tachadas.
La Figura 2 ilustra la expresión del polinucleótido NtMRP4 durante el tratamiento con cadmio en condiciones hidropónicas durante 7 días. Se trataron plántulas KY14 de tres semanas con 0, 0,05 y 0,5 CdCh (a) y plántulas de 4 semanas de N. rustica y N. tabacum (TN90) se trataron con 0,5 pM de CdCl2 durante una semana (b). El ARN se aisló y se sometió a RT-PCR semicuantitativa.
La Figura 3 ilustra la reducción de cadmio en la hoja en las líneas 1 y 2 de las líneas de ARNi de NtMRP4 en comparación con las plantas cultivadas en el campo de tipo silvestre.
La Figura 4 muestra la reducción de cadmio en la hoja para dos líneas cultivadas de ARNi de NtMRP4. En este experimento, se añadió un vector control sin una inserción de NtMRP4.
La Figura 5 muestra la estructura del intrón-exón y la localización de los intrones y exones a lo largo de la secuencia de clonación genómica NtPMI-BAC-GOTOWE_5_gDNA BAC que abarca la región de codificación de NtMRP4. La homología de la secuencia de ADNc (pares de bases 1-4.521 de cadena superior) y la secuencia de clonación de BAC genómica que comprende la región de codificación de MRP4 (pares de bases 61 781-69 748 de cadena inferior) es del 100 %.
La Figura 6 muestra la secuencia de nucleótidos de NtMRP3 en la cual las regiones 5' y 3' UTR están en cursiva; los exones se muestran en letras mayúsculas y en negrita; los intrones se muestran en letra minúscula y normal; y los codones de inicio y finalización se muestran en letras mayúsculas, en negrita y en cursiva.
Definiciones
Los términos técnicos y expresiones usados dentro del alcance de esta solicitud generalmente tendrán el significado aplicado comúnmente para ellos en la técnica pertinente a la biología molecular y de plantas. Todas las definiciones de los términos siguientes se aplican a todo el contenido de esta solicitud. La palabra "que comprende" no excluye otros elementos o etapas, y los artículos indefinidos "un" o "una" no excluyen una pluralidad. Una sola etapa puede cumplir con las funciones de varias características enumeradas en las reivindicaciones. Los términos “esencialmente”, “alrededor de”, “aproximadamente” y similares en conexión con un atributo o un valor particularmente también definen exactamente el atributo o exactamente el valor, respectivamente. El término “aproximadamente” en el contexto de un valor o intervalo numérico dado se refiere a un valor o intervalo que está dentro del 20 %, dentro del 10 %, o dentro del 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 % del valor o intervalo dado. Un “polinucleótido” se refiere a un polímero de nucleótidos, que puede ser un desoxirribopolinucleótido (ADN) o un ribopolinucleótido (ARN) modificado o no modificado. En consecuencia, un polinucleótido puede ser, sin limitación, un ADN genómico, ADN complementario (ADNc) (por ejemplo, sec. con núm. de ident.: 27), ARNm, o ARN antisentido. Además, un polinucleótido puede ser a Dn monocatenario o bicatenario, ADN que es una mezcla de regiones monocatenarias o bicatenarias, una molécula híbrida que comprende ADN y ARN, o una molécula híbrida con una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias. Adicionalmente, el polinucleótido puede estar compuesto de regiones de triple cadena que comprenden ADN, ARN, o ambos. Un polinucleótido puede contener una o más bases modificadas, tales como fosfotioatos, y puede ser un polinucleótido peptídico (PNA). Generalmente, los polinucleótidos descritos en la presente descripción pueden ensamblarse a partir de fragmentos de ADNc, ADN genómico, oligonucleótidos aislados o clonados, o nucleótidos individuales, o una combinación de los anteriores. Aunque las secuencias de polinucleótidos descritas en la presente descripción se muestran como secuencias de ADN, las secuencias incluyen sus secuencias de ARN correspondientes, y sus secuencias de ADN o ARN complementarias (por ejemplo, complementarias completamente), lo que incluye los complementos inversos de estas.
El término “polinucleótido NtMRP” abarca polinucleótidos en los cuales un polímero de nucleótidos comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia expuesta en secs. con núms. de ident.: 1, 2, 27, 28, 29 o 51. Este término abarca, además, una secuencia de polinucleótidos con homología sustancial (es decir, similitud de secuencia) o identidad sustancial con secs. con núms. de ident.: 1, 2, 27, 28, 29 o 51; fragmentos de secs. con núms. de ident.: 1, 2, 27, 28, 29 o 51; y fragmentos de secs. con núms. de ident.: 1, 2, 27, 28, 29 o 51 con homología sustancial (es decir, similitud de secuencia) o identidad sustancial con la misma. La variante puede tener al menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia del gen NtMRP aislado - tales como el gen NtMRP3 o el gen NtMRP4. Aunque las secuencias de polinucleótidos NtMRP descritas en la presente descripción se muestran como secuencias de ADN, las secuencias incluyen sus secuencias de ARN correspondientes y sus secuencias de ADN o ARN complementarias (por ejemplo, complementarias completamente), lo que incluye el(los) complemento(s) inverso(s) de estos y las secuencias de ADN o ARN antisentido. Fragmentos ilustrativos se exponen en secs. con núms. de ident.: 3 a 23 y 30 a 50 y 53.
El término "polinucleótido NtMRP3" se refiere a una modalidad en la cual un polímero de nucleótidos comprende, consiste o consiste esencialmente en un polinucleótido designado en la presente descripción como sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29 o sec. con núm. de ident.: 51. El término abarca variantes de polinucleótidos con homología sustancial (es decir, similitud de secuencia) o identidad sustancial con sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29 o sec. con núm. de ident.: 51; fragmentos de sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29 o sec. con núm. de ident.: 51; y fragmentos de sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29 o sec. con núm. de ident.: 51 con homología sustancial (es decir, similitud de secuencia) o identidad sustancial con la misma. Como se describe en la presente descripción, la variante puede tener al menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia del gen NtMRP3 aislado. Fragmentos ilustrativos se exponen en secs. con núms. de ident.: 30 a 50.
El término "polinucleótido NtMRP4" se refiere a una modalidad en la cual un polímero de nucleótidos comprende, consiste o consiste esencialmente en un polinucleótido designado en la presente descripción como sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: 2 o sec. con núm. de ident.: 27. El término abarca variantes de polinucleótidos con homología sustancial (es decir, similitud de secuencia) o identidad sustancial con sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: 2 o sec. con núm. de ident.: 27; fragmentos de sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: 2 o sec. con núm. de ident.: 27; y fragmentos de sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: 2 o sec. con núm. de ident.: 27 con homología sustancial (es decir, similitud de secuencia) o identidad sustancial con la misma. La variante puede tener al menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia del gen NtMRP3 aislado. Fragmentos ilustrativos se exponen en secs. con núms. de ident.: 3 a 23 y 53.
El término "polipéptido NtMRP" se refiere a un polipéptido que comprende, que consiste o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos que tiene homología sustancial (es decir, similitud de secuencia) o identidad sustancial a secs. con núms. de ident.: 24 a 26 y 52; fragmentos de secs. con núms. de ident.: 24 a 26 y 52; y fragmentos de secs. con núms. de ident.: 24 a 26 y 52 con homología sustancial (es decir, similitud de secuencia) o identidad sustancial a la misma. Los polipéptidos NtMRP incluyen fragmentos y secuencias que comprenden un grado suficiente o sustancial de identidad o similitud con secs. con núms. de ident.: 24 a 26 y 52 que pueden funcionar mediante el transporte de metales pesados (por ejemplo, cadmio) a través de las membranas celulares. Los polipéptidos NtMRP incluyen, además, las variantes o mutantes producidas mediante la introducción de cualquier tipo de alteraciones (por ejemplo, inserciones, deleciones, o sustituciones de aminoácidos; cambios en estados de glicosilación; cambios que afectan el replegamiento o isomerizaciones, estructuras tridimensionales, o estados de autoasociación), las que pueden modificarse genéticamente deliberadamente o aislarse naturalmente. Los polipéptidos NtMRP pueden estar en forma lineal o cíclica mediante el uso de métodos conocidos. La variante puede tener al menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %,70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la secuencia del polipéptido NtMRP4.
El término "polipéptido NtMRP3" se refiere a una modalidad en la cual el polipéptido comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia expuesta en sec. con núm. de ident.: 52 o a un polipéptido que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos con homología sustancial (es decir, similitud de secuencia) o identidad sustancial con sec. con núm. de ident.: 52; fragmentos de sec. con núm. de ident.: 52; y fragmentos de sec. con núm. de ident.: 52 con homología sustancial (es decir, similitud de secuencia) o identidad sustancial con la misma. Los polipéptidos NtMRP3 incluyen fragmentos y secuencias que comprenden un grado suficiente o sustancial de identidad o similitud con sec. con núm. de ident.: 52 que pueden funcionar mediante el transporte de metales pesados (por ejemplo, cadmio) a través de las membranas celulares. Los polipéptidos NtMRP3 incluyen, además, las variantes o mutantes producidos mediante la introducción de cualquier tipo de alteraciones (por ejemplo, inserciones, deleciones, o sustituciones de aminoácidos; cambios en estados de glicosilación; cambios que afectan el replegamiento o isomerizaciones, estructuras tridimensionales, o estados de autoasociación), las que pueden modificarse genéticamente deliberadamente o aislarse naturalmente. Los polipéptidos NtMRP3 pueden estar en forma lineal o cíclica mediante el uso de métodos conocidos. Como se describe en la presente descripción, la variante puede tener al menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad con la secuencia del polipéptido NtMRP3.
El término "polipéptido NtMRP4" se refiere a una modalidad en la cual el polipéptido comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia expuesta en sec. con núm. de ident.: 24, sec. con núm. de ident.: 25, o sec. con núm.
de ident.: 26 o a un polipéptido que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos con homología sustancial (es decir, similitud de secuencia) o identidad sustancial con sec. con núm. de ident.: 24, sec. con núm. de ident.: 25, o sec. con núm. de ident.: 26; fragmentos de sec. con núm. de ident.: 24, sec. con núm. de ident.: 25, o sec. con núm. de ident.: 26; y fragmentos de sec. con núm. de ident.: 24, sec. con núm. de ident.: 25, o sec. con núm. de ident.: 26 con homología sustancial (es decir, similitud de secuencia) o identidad sustancial con la misma. Los polipéptidos NtMRP4 incluyen fragmentos y secuencias que comprenden un grado suficiente o sustancial de identidad o similitud con sec. con núm. de ident.: 24, sec. con núm. de ident.: 25, o sec. con núm. de ident.: 26 que pueden funcionar mediante el transporte de metales pesados (por ejemplo, cadmio) a través de las membranas celulares. Los polipéptidos NtMRP4 incluyen, además, las variantes o mutantes producidos mediante la introducción de cualquier tipo de alteraciones (por ejemplo, inserciones, deleciones, o sustituciones de aminoácidos; cambios en estados de glicosilación; cambios que afectan el replegamiento o isomerizaciones, estructuras tridimensionales, o estados de autoasociación), las que pueden modificarse genéticamente deliberadamente o aislarse naturalmente. Los polipéptidos NtMRP4 pueden estar en forma lineal o cíclica mediante el uso de métodos conocidos. Como se describe en la presente descripción, la variante puede tener al menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad con la secuencia del polipéptido NtMRP4.
El término “aislado” se refiere a cualquier entidad que se toma de su ambiente natural, pero el término no implica ningún grado de purificación.
“Secuencia génica” se refiere a la secuencia de nucleótidos de una molécula de polinucleótido o polinucleótido que codifica un polipéptido o un ARN activo biológicamente, y abarca la secuencia de nucleótidos de una secuencia codificante parcial que solo codifica un fragmento de una proteína.
El término “vector” se refiere a un vehículo de polinucleótidos que comprende una combinación de componentes de polinucleótidos para permitir el transporte de polinucleótidos, constructos de polinucleótidos y conjugados de polinucleótidos y similares. Los vectores adecuados incluyen episomas capaces de replicación extracromosómica tales como plásmidos de polinucleótidos circulares bicatenarios; plásmidos de polinucleótidos lineales bicatenarios; y otros vectores de cualquier origen.
"Vector de expresión" se refiere a un vehículo de polinucleótidos que comprende una combinación de componentes de polinucleótidos para permitir la expresión de polinucleótidos, constructos de polinucleótidos y conjugados de polinucleótidos y similares. Los vectores de expresión adecuados incluyen episomas capaces de replicación extracromosómica tales como plásmidos de polinucleótidos circulares bicatenarios; plásmidos de polinucleótidos lineales bicatenarios; y otros vectores de expresión equivalentes funcionalmente de cualquier origen. Un vector de expresión comprende al menos un promotor ubicado aguas arriba y unido operativamente a un polinucleótido, constructos de polinucleótidos o conjugado de polinucleótidos, como se define más abajo.
Un “constructo” se refiere a un fragmento de polinucleótido recombinante bicatenario que comprende uno o más polinucleótidos NtMRP. El constructo comprende una “cadena molde” con apareamiento de bases con una “cadena codificante o sentido” complementaria. Un constructo dado puede insertarse en un vector en dos orientaciones posibles, ya sea en la misma orientación (o sentido) o en la orientación inversa (o antisentido) con respecto a la orientación de un promotor ubicado dentro de un vector - tal como un vector de expresión.
El término “conjugado” se refiere a un compuesto formado por la unión covalente ("conjugación") de un polinucleótido a uno o más restos que no son en sí mismos polinucleótidos o monómeros ("restos conjugados"). “Cadena molde” se refiere a la cadena que comprende una secuencia que complementa la de la "cadena de sentido o codificación" de un dúplex de polinucleótidos, tal como un fragmento genómico de NtMRP, ADNc de NtMRP o un constructo de NtMRP, o cualquier fragmento de polinucleótido que comprende una secuencia de polinucleótidos que puede transcribirse por la a Rn polimerasa. Durante la transcripción, la ARN polimerasa puede translocarse a lo largo de la cadena molde en la dirección de 3' a 5' durante la síntesis del ARN naciente.
“Cadena sentido” se usa de forma intercambiable en la presente descripción con el término "cadena de codificación", y se refiere a la cadena que comprende una secuencia que complementa a la de la cadena molde en un dúplex de ADN. Por ejemplo, la secuencia de la cadena sentido ("secuencia sentido") para el clon genómico de NtMRP identificado se designa como sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: Por ejemplo, si la cadena sentido comprende una secuencia hipotética 5'-TAATCCGGT-3', entonces la secuencia correspondiente sustancialmente idéntica dentro de un ARNm objetivo hipotético es 5'-UAAUCCGGU-3'.
"Secuencia complementaria inversa" se refiere a la secuencia que complementa la "secuencia sentido" de interés (por ejemplo, secuencia del exón) ubicada dentro de la misma cadena, en la misma orientación con respecto a la secuencia sentido. Por ejemplo, si una cadena comprende una secuencia hipotética 5'-TAATCCGGT-3', entonces la secuencia complementaria inversa 5'-ACCGGATTA-3' puede unirse operativamente a la secuencia sentido, separada por una secuencia espaciadora.
“NtMRP”, “NtMRP3” o “transcrito de ARN de NtMRP4” incluye moléculas de polirribopolinucleótidos producidas dentro de una célula vegetal huésped de interés, que resultan de la transcripción del gen NtMRP3 o NtMRP4 endógeno o ADNc como se describe en la presente descripción. Por lo tanto, este término incluye cualquier especie de ARN o variantes de ARN producidas como productos transcripcionales de NtMRP3 o NtMRP4 o ARN de NtMRP3 o NtMRP4, lo que incluye aquellas especies de ARN o variantes de ARN que tienen similitud suficiente a niveles estructurales/funcionales. Por ejemplo, los transcritos de ARN de NtMRP3 o NtMRP3 incluyen, pero no se limitan a: (1) pre-ARNm y ARNm producidos a partir de la transcripción del gen o ADNc NtMRP3 o NtMRP3 aislado; (2) pre-ARNm y ARNm producidos a partir de la transcripción de cualesquiera genes que tengan al menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 % , 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia del gen NtMRP3 aislado (es decir, otros genes distintos sustancialmente idénticos al gen NtMRP3 identificado y que codifican isoformas relacionadas de transportadores ABC); y (3) pre-ARNm y ARNm producidos a partir de la transcripción de alelos del gen NtMRP3. Los transcritos de ARN de NtMRP3 incluyen variantes de ARN producidas como resultado de reacciones alternativas de corte y empalme de ARN heteronucleares ("ARNhn") de un gen particular, variantes de ARNm que resultan de tales reacciones alternativas de corte y empalme del ARN, y cualquier variante intermedia de ARN.
A modo de ejemplo adicional, las transcripciones de ARN de NtMRP4 o NtMRP4 incluyen: (1) pre-ARNm y ARNm producidos a partir de la transcripción del gen o ADNc de NtMRP4 o NtMRP4 aislado, como se describe en la presente descripción; (2) pre-ARNm y ARNm producidos a partir de la transcripción de cualesquiera genes que tengan al menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % o más, identidad de secuencia con la secuencia del gen NtMRP4 aislado (es decir, otros genes distintos sustancialmente idénticos al gen NtMRP4 identificado y que codifican isoformas relacionadas de transportadores ABC); y (3) pre-ARNm y ARNm producidos a partir de la transcripción de alelos del gen NtMRP o NtMRP4. Los transcritos de ARN de NtMRP y NtMRP4 incluyen variantes de ARN producidas como resultado de reacciones de corte y empalme de ARN alternativas de ARN heteronucleares ("ARNhn") de un gen particular, variantes de ARNm resultantes de tales reacciones de corte y empalme de ARN alternativas y cualquier variante de ARN intermedia.
"Homología, identidad o similitud" se refiere al grado de similitud de secuencias entre dos polipéptidos o entre dos moléculas de polinucleótidos comparadas mediante alineación de secuencias. El grado de homología entre dos secuencias de polinucleótidos discretas que se comparan es una función del número de nucleótidos idénticos o coincidentes, en posiciones comparables. El grado de similitud expresado en términos de porcentaje de identidad puede determinarse mediante inspección visual y cálculo matemático. Alternativamente, el porcentaje de identidad de dos secuencias de polinucleótidos puede determinarse mediante la comparación de la información de la secuencia mediante el uso del programa de computadora GAP, versión 6.0 descrito por Devereux y otros (Nucl. Acids Res. 12: 387, 1984) y disponible del Genetics Computer Group de la Universidad de Wisconsin (Uw Gc G), ClustalW, BLAST, FASTA o Smith-Waterman. Los parámetros predeterminados típicos para el programa GAP incluyen: (1) una matriz de comparación unitaria (que contiene un valor de 1 para las identidades y 0 para las no identidades) para los nucleótidos, y la matriz de comparación ponderada de Gribskov y Burgess, Nucl. Acids Res.
14: 6745, 1986, como se describe por Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979; (2) una penalización de 3,0 para cada hueco y una penalización adicional de 0,10 para cada símbolo en cada hueco; y (3) sin penalización para los huecos en los extremos. Pueden usarse alternativamente diversos programas conocidos por los expertos en la técnica de comparación de secuencias.
El término “aguas arriba” se refiere a una dirección/posición relativa con respecto a un elemento de referencia a lo largo de una secuencia de polinucleótido lineal, que indica una dirección/posición hacia el extremo 5' de la secuencia de polinucleótido. “Aguas arriba” puede usarse indistintamente con el "extremo 5' de un elemento de referencia".
“Unido operativamente” se refiere a la unión de distintos elementos, fragmentos o secuencias de polinucleótidos para producir una unidad de transcripción funcional o un vector de expresión funcional.
Un “promotor” se refiere a un elemento/secuencia de polinucleótido, ubicado típicamente aguas arriba y unido operativamente a un fragmento de ADN bicatenario - tal como un constructo de ARNi de NtMRP. Por ejemplo, un promotor adecuado permite la activación transcripcional de un constructo de ARNi de NtMRP mediante el reclutamiento del complejo de transcripción, lo que incluye la ARN polimerasa y diversos factores, para iniciar la síntesis de ARN. Los promotores pueden derivarse totalmente de regiones próximas a un gen de interés nativo, o pueden componerse de elementos diferentes derivados de promotores nativos diferentes o segmentos de ADN sintéticos.
Un “potenciador” se refiere a una molécula de polinucleótido, o una secuencia de polinucleótidos, que puede reclutar proteínas reguladoras de la transcripción tales como activadores transcripcionales, para potenciar la activación transcripcional mediante el aumento de la actividad del promotor. Los potenciadores adecuados pueden derivarse de regiones próximas a un promotor de interés nativo (fuentes homologas) o pueden derivarse de contextos no nativos (fuentes heterólogas) y unirse operativamente a cualquier promotor de interés dentro de los constructos de NtMRP -tales como los vectores de expresión de ARNi - para potenciar la actividad o la especificidad de tejido de un promotor. Algunos potenciadores pueden funcionar en cualquier orientación con respecto a la orientación de una unidad de transcripción. Por ejemplo, los potenciadores pueden ubicarse aguas arriba o aguas abajo de una unidad transcripcional que comprende un promotor y un constructo de NtMRP.
Como se usa en la presente descripción, el término “planta” se refiere a cualquier planta en cualquier etapa de su ciclo de vida o desarrollo, y a sus progenies. En una modalidad, la planta es una “planta de tabaco”, la cual se refiere a una planta que pertenece al género Nicotiana. Las especies, cultivares, híbridos y variedades de la planta de tabaco se describen en la presente descripción.
El término “célula vegetal” se refiere a una unidad estructural y fisiológica de una planta. La célula vegetal puede estar en la forma de un protoplasto sin una pared celular, una sola célula aislada o una célula en cultivo, o como una parte de una unidad más organizada, tal como pero sin limitarse a, un tejido vegetal, un órgano de una planta, o una planta completa.
"Material vegetal" se refiere a cualquier composición sólida, líquida o gaseosa, o sus combinaciones, obtenible a partir de una planta, lo que incluye biomasa, hojas, lámina foliar, nervadura, tallos, raíces, flores o partes de una flor, frutos, polen, óvulos, cigotos, semillas, esquejes, secreciones, extractos, cultivos de células o tejidos, o cualquiera de otras partes o productos de una planta. En una modalidad, el material vegetal comprende o consiste en biomasa, semilla u hojas. En otra modalidad, el material vegetal comprende o consiste en las hojas.
El término "variedad" se refiere a una población de plantas que comparten características constantes que las separan de otras plantas de la misma especie. A la vez que poseen uno o más rasgos distintivos, una variedad se caracteriza además por una variación global muy pequeña entre los individuos dentro de esa variedad. Frecuentemente una variedad se vende comercialmente.
El término "línea" o “línea de mejoramiento” denota un grupo de plantas que se usan durante el mejoramiento de plantas. Una línea es distinguible de una variedad cuando exhibe poca variación entre los individuos para uno o más rasgos de interés, aunque puede existir cierta variación entre individuos para otros rasgos.
El término “reducir” o “reducido”, se refiere a una reducción de aproximadamente 10 % a aproximadamente 99 %, o una reducción de al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o al menos 100 %, 200 % o 300 % o más de una cantidad o una actividad, tal como, pero sin limitarse a, la actividad de un polipéptido, la actividad transcripcional y/o la expresión de proteínas.
El término “inhibir” o “inhibido” como se usa en la presente descripción, se refiere a una reducción de aproximadamente 98 % a aproximadamente 100 %, o una reducción de al menos 98 %, al menos 99 %, pero particularmente de 100 %, de una cantidad o una actividad, tal como, pero sin limitarse a, la actividad de un polipéptido, la actividad transcripcional y/o la expresión de proteínas.
El término “aumentar” o “aumentado”, se refiere a un aumento de aproximadamente 10 % a aproximadamente 99 %, o un aumento de al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o al menos 100 %, 200 % o 300 % o más de una cantidad o una actividad, tal como, pero sin limitarse a, la actividad de un polipéptido, la actividad transcripcional y/o la expresión de proteínas.
El término "control" en el contexto de una planta control o células vegetales control significa una planta o células vegetales en las cuales la expresión o actividad de un gen o proteína en particular - tal como NtMRP - no se ha modificado (por ejemplo, aumentado o reducido) por lo que puede proporcionar una comparación con una planta en donde la expresión o actividad de un gen o proteína en particular - tal como NtMRP - se ha modificado. La planta control puede comprender un vector vacío. La planta control puede corresponder a una planta de tipo silvestre. Descripción detallada
Los polinucleótidos y polipéptidos NtMRP se describen en la presente descripción, lo que incluye polinucleótidos y polipéptidos NtMRP3 y NtMRP4. Como se muestra en la Figura 6, el clon genómico NtMRP3, designado como sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29 comprende: intrón 1 (sec. con núm. de ident.: 30), intrón 2 (sec. con núm. de ident.: 31), intrón 3 (sec. con núm. de ident.: 32), intrón 4 (sec. con núm. de ident.: 33), intrón 5 (sec. con núm. de ident.: 34), intrón 6 (sec. con núm. de ident.: 35), intrón 7 (sec. con núm. de ident.: 36), intrón 8 (sec. con núm. de ident.: 37), intrón 9 (sec. con núm. de ident.: 38), intrón 10 (sec. con núm. de ident.: 39), exón 1 (sec. con núm. de ident.: 40), exón 2 (sec. con núm. de ident.: 41), exón 3 (sec. con núm. de ident.: 42) exón 4 (sec. con núm. de ident.: 43), exón 5 (sec. con núm. de ident.: 44), exón 6 (sec. con núm. de ident.: 45) exón 7 (sec. con núm. de ident.: 46) exón 8 (sec. con núm. de ident.: 47), exón 9 (sec. con núm. de ident.: 48) exón 10 (sec. con núm. de ident.: 49) y exón 11 (sec. con núm. de ident.: 50).
Diversas modalidades se dirigen a polinucleótidos aislados que representan fragmentos genómicos aislados en el locus NtMRP3, que comprende sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29, fragmentos de sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29, o variantes de estas.
Diversas modalidades se dirigen a polinucleótidos aislados que representan secuencias de ADNc del locus NtMRP3, que comprende sec. con núm. de ident.: 51, fragmentos de sec. con núm. de ident.: 51, o variantes de estas.
Diversas modalidades se dirigen a variantes aisladas de polinucleótidos NtMRP que comprenden al menos 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de secuencia con sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29, o fragmentos de sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29.
Diversas modalidades se dirigen a polinucleótidos aislados que complementan las variantes de polinucleótidos NtMRP que comprenden al menos 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, y 99 % de identidad de secuencia con sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29 o sec. con núm. de ident.: 51 o fragmentos de sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29 o sec. con núm. de ident.: 51.
Diversas modalidades se dirigen a polinucleótidos aislados que pueden hibridar específicamente, en condiciones moderadas a altamente rigurosas, con polinucleótidos que comprenden sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29 o sec. con núm. de ident.: 51, o fragmentos de sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29 0 sec. con núm. de ident.: 51.
Como se muestra en la Figura 1, el clon genómico NtMRP4, designado como sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: 2 comprende: intrón 1 (sec. con núm. de ident.: 3), intrón 2 (sec. con núm. de ident.: 4), intrón 3 (sec. con núm. de ident.: 5), intrón 4 (sec. con núm. de ident.: 6), intrón 5 (sec. con núm. de ident.: 7), intrón 6 (sec. con núm. de ident.: 8), intrón 7 (sec. con núm. de ident.: 9), intrón 8 (sec. con núm. de ident.: 10), intrón 9 (sec. con núm. de ident.: 11), intrón 10 (sec. con núm. de ident.: 12), exón 1 (sec. con núm. de ident.: 13), exón 2 (sec. con núm. de ident.: 14), exón 3 (sec. con núm. de ident.: 15) exón 4 (sec. con núm. de ident.: 16), exón 5 (sec. con núm. de ident.: 17), exón 6 (sec. con núm. de ident.: 18) exón 7 (sec. con núm. de ident.: 19) exón 8 (sec. con núm. de ident.: 20), exón 9 (sec. con núm. de ident.: 21) exón 10 (sec. con núm. de ident.: 21) y exón 11 (sec. con núm. de ident.: 22) o sec. con núm. de ident.: 23.
Diversas modalidades se dirigen a polinucleótidos aislados que representan fragmentos genómicos aislados en el locus NtMRP4, que comprende sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: 2, fragmentos de sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: 2, o variantes de estas.
Varias modalidades se refieren a ADNc aislado que comprende sec. con núm. de ident.: 27, fragmentos de sec. con núm. de ident.: 27, o variantes de estas.
Diversas modalidades se dirigen a variantes aisladas de polinucleótidos NtMRP que comprenden al menos 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de secuencia con sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: 2 o sec. con núm. de ident.. 27, o fragmentos de sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: 2 o sec. con núm. de ident.: 27.
Diversas modalidades se dirigen a polinucleótidos aislados que complementan variantes de polinucleótidos NtMRP que comprenden al menos 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, y 99 % de identidad de secuencia con sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: 2 o sec. con núm. de ident.: 27 o fragmentos de sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: 2 o sec. con núm. de ident.: 27.
Diversas modalidades se dirigen a polinucleótidos aislados que pueden hibridar específicamente, en condiciones moderadas a altamente rigurosas, con polinucleótidos que comprenden sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: 2 o sec. con núm. de ident.: 27, o fragmentos de sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: 2 o sec. con núm. de ident.: 27.
Un polinucleótido como se describe en la presente descripción generalmente contendrá enlaces fosfodiéster, aunque en algunos casos se incluyen análogos de polinucleótidos que pueden tener cadenas principales alternas, que comprenden, por ejemplo, fosforamidato, fosforotioato, fosforoditioato, o enlaces O-metilfosforoamidita; y cadenas principales y enlaces de polinucleótidos peptídicos. Otros polinucleótidos análogos incluyen los que tienen cadenas principales positivas; cadenas principales no iónicas, y cadenas principales sin ribosa. Las modificaciones de la cadena principal de ribosa-fosfato pueden realizarse por una variedad de razones, por ejemplo, para aumentar la estabilidad y el tiempo de vida media de tales moléculas en ambientes fisiológicos o como sondas en un biochip. Pueden obtenerse mezclas de polinucleótidos y análogos de origen natural; alternativamente, pueden obtenerse mezclas de diferentes análogos de polinucleótidos, y mezclas de polinucleótidos y análogos de origen natural.
Se conoce una diversidad de análogos de polinucleótidos, lo que incluye, por ejemplo, fosforamidato, fosforotioato, fosforoditioato, enlaces O-metilfosforoamidita y cadenas principales y enlaces de polinucleótidos peptídicos. Otros polinucleótidos análogos incluyen aquellos con cadenas principales positivas, cadenas principales no iónicas y cadenas principales sin ribosa. Se incluyen además polinucleótidos que contienen uno o más azúcares carboxílicos.
Otros análogos incluyen polinucleótidos peptídicos (PNA) que son análogos de polinucleótidos peptídicos. Estas cadenas principales son esencialmente no iónicas en condiciones neutras, a diferencia de la cadena principal de fosfodiéster altamente cargada de los polinucleótidos de origen natural. Esto puede resultar en ventajas. En primer lugar, la cadena principal de PNA puede mostrar una mejor cinética de hibridación. Los PNA tienen cambios más grandes en la temperatura de fusión (Tm) para los pares de bases con error de apareamiento frente a los apareados perfectamente. El ADN y el ARN muestran típicamente una caída de 2-4 °C en la Tm durante un error de apareamiento interno. Con la cadena principal de PNA no iónica, la caída es cercana a 7-9 °C. Similarmente, debido a su naturaleza no iónica, la hibridación de las bases unidas a estas cadenas principales es relativamente insensible a la concentración de sales. Adicionalmente, los PNA no deben degradarse o se degradan en una menor extensión por las enzimas celulares, y por lo tanto pueden ser más estables.
Entre los usos de los polinucleótidos NtMRP descritos, y combinaciones de fragmentos de estos, está el uso de fragmentos como sondas en ensayos de hibridación de polinucleótidos o cebadores para su uso en ensayos de amplificación de polinucleótidos o el uso de fragmentos en el desarrollo de diversos constructos de polinucleótidos -tales como moléculas de ARNi. Dichos fragmentos comprenden generalmente al menos aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 o más nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN. En otras modalidades, un fragmento de ADN comprende al menos aproximadamente 10, 15, 20, 30, 40, 50 o 60 o más nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN. Por lo tanto, en un aspecto adicional, se proporciona, además, un método para detectar polinucleótidos NtMRP que comprende el uso de las sondas y/o los cebadores descritos en la presente descripción.
Los parámetros básicos que afectan la elección de las condiciones de hibridación y la guía para proyectar las condiciones adecuadas se describen por Sambrook, J., E. F. Fritsch, y T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Mediante el uso del conocimiento del código genético en combinación con las secuencias de aminoácidos descritas anteriormente, pueden prepararse conjuntos de oligonucleótidos degenerados. Dichos oligonucleótidos son útiles como cebadores, por ejemplo, en las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR), de manera que los fragmentos de polinucleótidos se aíslan y se amplifican. En ciertas modalidades, pueden usarse cebadores degenerados como sondas para las genotecas no humanas. Dichas genotecas incluirían, pero no se limitan a, genotecas de ADNc, genotecas genómicas, e incluso genotecas de ADN o EST (etiquetas de secuencias de expresión) electrónicas. Las secuencias homólogas identificadas por este método podrían usarse después como sondas para identificar homólogos no humanos de la secuencia de NtMRP identificada en la presente descripción.
Además, son de uso potencial los polinucleótidos y oligonucleótidos (por ejemplo, cebadores o sondas) que hibridan en condiciones de rigurosidad reducidas, típicamente condiciones moderadamente rigurosas, y comúnmente condiciones altamente rigurosas para el(los) polinucleótido(s) de NtMRP como se describe en la presente descripción. Los parámetros básicos que afectan la elección de las condiciones de hibridación y la guía para idear condiciones adecuadas se describen en Sambrook, J., E. F. Fritsch y T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) y pueden determinarse fácilmente por los expertos en la técnica basándose, por ejemplo, en la longitud o composición de bases del polinucleótido.
Una manera de lograr condiciones moderadamente rigurosas implica el uso de una solución de prelavado que contiene Citrato de sodio estándar 5x, Dodecil sulfato de sodio al 0,5 %, ácido etilendiaminotetraacético 1,0 mM (pH 8,0), tampón de hibridación de formamida aproximadamente al 50 %, Citrato de sodio estándar 6x, y una temperatura de hibridación de aproximadamente 55 °C (u otras soluciones de hibridación similares, tales como una que contiene formamida aproximadamente al 50 %, con una temperatura de hibridación de aproximadamente 42 °C), y condiciones de lavado de aproximadamente 60 °C, en Citrato de sodio estándar 0,5x, Dodecil sulfato de sodio al 0,1 %. Generalmente, las condiciones altamente rigurosas se definen como las condiciones de hibridación anteriores, pero con lavado a aproximadamente 68 °C, Citrato de sodio estándar 0,2x, Dodecil sulfato de sodio al 0,1 %. SSPE (SSPE 1x es cloruro de sodio 0,15 M, fosfato de sodio 10 mM, y ácido etilendiaminotetraacético 1,25 mM, pH 7,4) puede sustituirse por Citrato de sodio estándar (Citrato de sodio estándar 1x es cloruro de sodio 0,15 M y citrato de sodio 15 mM) en los tampones de hibridación y lavado; los lavados se realizan durante 15 minutos después que se completa la hibridación. Debe entenderse que la temperatura del lavado y la concentración de sales del lavado pueden ajustarse según sea necesario para alcanzar un grado de rigurosidad deseado mediante la aplicación de los principios básicos que gobiernan las reacciones de hibridación y la estabilidad de dúplex, como se conoce por los expertos en la técnica y se describe con más detalle más abajo (ver, por ejemplo, Sambrook, J., E. F. Fritsch, y T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y). Cuando un polinucleótido hibrida con un polinucleótido objetivo de secuencia desconocida, se asume que la longitud del híbrido es la del polinucleótido con que hibrida. Cuando los polinucleótidos de secuencia conocida se hibridan, la longitud del híbrido puede determinarse mediante la alineación de las secuencias de los polinucleótidos y la identificación de la región o regiones de complementariedad de secuencias óptima. La temperatura de hibridación para los híbridos que se anticipa que sean menores que 50 pares de bases de longitud debe ser de 5 a 10 °C menor que la temperatura de fusión (Tm) del híbrido, donde la Tm se determina de acuerdo con las siguientes ecuaciones. Para híbridos menores de 18 pares de bases de longitud, la Tm (°C)=2(número de bases A+T)+4(número de bases G+C). Para híbridos por encima de 18 pares de bases de longitud, la Tm (°C)=81,5+16,6(log10 [Na+])+0,41(% G+C)-(600/N), donde N es el número de bases en el híbrido, y [Na+] es la concentración de iones de sodio en el tampón de hibridación ([Na+] para el Citrato de sodio estándar 1x=0,165 M). Típicamente, cada polinucleótido que hibrida tiene una longitud que es al menos 25 % (comúnmente al menos 50 %, 60 %, o 70 %, y más comúnmente al menos 80 %) de la longitud de un polinucleótido con el cual hibrida, y tiene al menos 60 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97,5 %, o al menos 99 %) con un polinucleótido con el cual hibrida.
Como se entenderá por el experto en la técnica, un ADN lineal tiene dos orientaciones posibles: la dirección 5' a 3' y la dirección 3' a 5'. Por ejemplo, si una secuencia de referencia se ubica en la dirección 5' a 3', y si una segunda secuencia se ubica en la dirección 5' a 3' dentro de la misma molécula/cadena de polinucleótido, entonces la secuencia de referencia y la segunda secuencia se orientan en la misma dirección, o tienen la misma orientación. Típicamente, una secuencia promotora y un gen de interés bajo la regulación del promotor dado se ubican en la misma orientación. Sin embargo, con respecto a la secuencia de referencia ubicada en la dirección 5' a 3', si una segunda secuencia se ubica en la dirección 3' a 5' dentro de la misma molécula/cadena de polinucleótido, entonces la secuencia de referencia y la segunda secuencia se orientan en la dirección antisentido, o tienen orientación antisentido. Dos secuencias que tienen orientaciones antisentido una con respecto a la otra pueden describirse alternativamente como que tienen la misma orientación, si la secuencia de referencia (dirección 5' a 3') y la secuencia complementaria inversa de la secuencia de referencia (secuencia de referencia ubicada en 5' a 3') se ubican dentro de la misma molécula/cadena de polinucleótido. Las secuencias que se exponen en la presente descripción se muestran en la dirección 5' a 3'.
Los polipéptidos NtMRP incluyen variantes producidas mediante la introducción de cualquier tipo de alteraciones (por ejemplo, inserciones, deleciones, o sustituciones de aminoácidos; cambios en estados de glicosilación; cambios que afectan el replegamiento o isomerizaciones, estructuras tridimensionales, o estados de autoasociación), las que pueden modificarse genéticamente deliberadamente o aislarse de manera natural. Los polipéptidos NtMRP3 o NtMRP4 pueden estar en forma lineal o cíclica mediante el uso de métodos conocidos. Los polipéptidos NtMRP4 comprenden al menos 10, al menos 20, al menos 30, o al menos 40 aminoácidos contiguos.
Diversas modalidades se dirigen a polipéptidos NtMRP3 aislados codificados por una secuencia de polinucleótidos que comprende, consiste o consiste esencialmente en sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29 o sec. con núm. de ident.: 51 y fragmentos de sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29 o sec. con núm. de ident.: 51, o variantes de estas.
Diversas modalidades se dirigen a polipéptidos NtMRP4 aislados codificados por una secuencia de polinucleótidos que comprende, que consiste de o consiste esencialmente en sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: 2 o sec. con núm. de ident.: 27, fragmentos de sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: 2 o sec. con núm. de ident.: 27, o variantes de estas.
Diversas modalidades se dirigen a variantes de polipéptido NtMRP aisladas que comprenden al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de secuencia con sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: 2 o sec. con núm. de ident.: 27 o sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29 o sec. con núm. de ident.: 51 o fragmentos de sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: 2 o sec. con núm. de ident.: 27 o sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29 o sec. con núm. de ident.: 51.
Las variantes de polipéptidos mutantes de NtMRP, NtMRP3 y NtMRP4 se abarcan, además, por las reivindicaciones y se describen en la presente descripción como plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas (por ejemplo, plantas de tabaco mutantes, de origen no natural o transgénicas) que comprenden las variantes de polipéptidos mutantes de NtMRP y/o NtMRP3 y/o NtMRP4.
El término “de origen no natural” como se usa en la presente describe una entidad (por ejemplo, un polinucleótido, una mutación genética, un polipéptido, una planta, una célula vegetal y material vegetal) que no se forma naturalmente o que no existe en la naturaleza. Dichas entidades de origen no natural o entidades artificiales pueden obtenerse, sintetizarse, iniciarse, modificarse, intervenirse, o manipularse mediante métodos descritos en la presente descripción o que se conocen en la técnica. Así, a manera de ejemplo, una planta de origen no natural, una célula vegetal de origen no natural o material vegetal de origen no natural puede producirse con el uso de técnicas tradicionales de mejoramiento de plantas - tales como retrocruzamiento - o mediante tecnologías de manipulación genética - tales como ARN antisentido, ARN de interferencia, meganucleasa y similares. A modo de ejemplo adicional, una planta de origen no natural, una célula vegetal de origen no natural o material vegetal de origen no natural puede producirse mediante introgresión de, o al transferir una o más mutaciones genéticas (por ejemplo uno o más polimorfismos) a partir de una primera planta o célula vegetal dentro de una segunda planta o célula vegetal (la cual puede ser en sí misma de origen natural), de manera que la planta, célula vegetal o material vegetal resultantes o la progenie de estas comprende una constitución genética (por ejemplo, un genoma, un cromosoma o un segmento de estos) que no se forma naturalmente o que no existe en la naturaleza. Así, la planta, célula vegetal o material vegetal resultantes son artificiales o de origen no natural. En consecuencia, una planta o célula vegetal artificial o de origen no natural puede producirse mediante la modificación de una secuencia genética en una primera planta o célula vegetal de origen natural, incluso si la secuencia genética resultante se produce naturalmente en una segunda planta o célula vegetal que comprende un fondo genético diferente de la primera planta o célula vegetal. Las diferencias en el fondo genético pueden detectarse mediante diferencias fenotípicas o mediante técnicas de biología molecular conocidas en la técnica - tales como secuenciación de polinucleótidos, presencia o ausencia de marcadores genéticos (por ejemplo, marcadores de ARN de microsatélites).
Un polipéptido puede prepararse mediante el cultivo de células huéspedes transformadas o recombinantes en condiciones de cultivo adecuadas para expresar un polipéptido. El polipéptido expresado resultante puede purificarse después a partir de dicho cultivo mediante el uso de procesos de purificación conocidos. La purificación del polipéptido puede incluir además una columna de afinidad que contiene agentes que se unirán al polipéptido; una o más etapas en columna sobre tales resinas de afinidad tal como concanavalina A-agarosa, heparinatoyopearl® o Cibacron blue 3GA Sepharose®; una o más etapas que implican cromatografía por interacción hidrofóbica mediante el uso de dichas resinas como fenil éter, butil éter, o propil éter; o cromatografía por inmunoafinidad. Alternativamente, el polipéptido puede expresarse, además, en una forma que facilitará la purificación. Por ejemplo, puede expresarse como un polipéptido de fusión, tal como el polipéptido de unión a maltosa (MBP), glutatión-5-transferasa (GST) o tioredoxina (TRX). Los kits para la expresión y purificación de dichos polipéptidos de fusión están disponibles comercialmente de New England BioLab (Beverly, Mass.), Pharmacia (Piscataway, N.J.), e InVitrogen, respectivamente. El polipéptido puede marcarse con un epítopo y posteriormente purificarse mediante el uso de un anticuerpo específico dirigido a dicho epítopo. Finalmente, una o más etapas de cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) que emplean medios de RP-HPLC hidrófobos, por ejemplo, gel de sílice que tiene grupos metilo colgantes u otros grupos alifáticos, pueden emplearse para purificar adicionalmente el polipéptido. Algunas o todas las etapas de purificación anteriores, en varias combinaciones, también pueden emplearse para proporcionar un polipéptido recombinante homogéneo esencialmente. El polipéptido purificado de esta forma es esencialmente libre de otros polipéptidos y en la presente descripción se define como un "polipéptido esencialmente purificado"; dichos polipéptidos purificados incluyen polipéptidos, fragmentos, variantes de NtMRP, y similares. La expresión, aislamiento, y purificación de los polipéptidos y fragmentos pueden llevarse a cabo mediante cualquier técnica adecuada, lo que incluye, pero no se limita a, los métodos descritos en la presente descripción.
Es posible, además, usar una columna de afinidad tal como un anticuerpo monoclonal generado contra los polipéptidos, para purificar por afinidad los polipéptidos expresados. Estos polipéptidos pueden retirarse de una columna de afinidad mediante el uso de técnicas convencionales, por ejemplo, en un tampón de elución con contenido alto de sales y después separar mediante diálisis en un tampón con bajo contenido de sales para el uso o mediante el cambio del pH u otros componentes en dependencia de la matriz de afinidad usada, o retirarse de manera competitiva mediante el uso del sustrato de origen natural del motivo de afinidad, tal como un polipéptido derivado de la descripción.
Un polipéptido puede producirse, además, mediante síntesis química convencional conocida. Los métodos para construir los polipéptidos o fragmentos de estos por medios sintéticos se conocen por los expertos en la técnica. Las secuencias de polipéptidos construidas sintéticamente, en virtud de compartir características conformacionales o estructurales primarias, secundarias o terciarias con los polipéptidos nativos pueden poseer propiedades biológicas en común con ellos, lo que incluye la actividad biológica.
Las modalidades se dirigen a composiciones y métodos para producir plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas que se han modificado para reducir o impedir el transporte de metales pesados (por ejemplo, cadmio) a la lámina foliar mediante la reducción de los niveles de expresión del polinucleótido NtMRP o mediante la reducción de la actividad de la proteína codificada de esta manera. El nivel en estado de equilibrio de los transcritos de ARN de NtMRP puede disminuirse en comparación con una planta de control. En consecuencia, el número de transportadores de NtMRP activos funcionalmente disponibles para transportar metales pesados (por ejemplo, cadmio) a través de las membranas celulares puede disminuirse de manera que también disminuye el nivel de cadmio en la planta.
La reducción en la expresión de polinucleótido NtMRP puede ser de aproximadamente 5 % a aproximadamente 100 %, o una reducción de al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, o hasta 100 %, lo que incluye una reducción en la actividad transcripcional o la expresión de proteínas.
La reducción de la actividad de la proteína NtMRP puede ser de aproximadamente 5 % a aproximadamente 100 %, o una reducción de al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, o hasta 100 %.
La inhibición se refiere a una reducción de aproximadamente 98 % a aproximadamente 100 %, o una reducción de al menos 98 %, al menos 99 %, pero particularmente del 100 %.
Los polinucleótidos y constructos recombinantes descritos en la presente descripción pueden usarse para modular (por ejemplo, reducir o inhibir) la expresión de un polipéptido NtMRP en una especie vegetal de interés. Se conoce que varios métodos basados en polinucleótidos, lo que incluye ARN antisentido, escisión de ARN dirigida por ribozima, silenciamiento génico postranscripcional (PTGS), por ejemplo, ARN de interferencia (ARNi) y silenciamiento génico transcripcional (TGS) inhiben la expresión génica en plantas. Los polinucleótidos adecuados incluyen polinucleótidos de longitud completa que codifican polipéptidos NtMRP o fragmentos de dichos polinucleótidos de longitud completa. En algunas modalidades, puede usarse un complemento del polinucleótido de longitud completa o un fragmento de este. Típicamente, un fragmento es de al menos 10 nucleótidos contiguos, por ejemplo, al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 35, 40, 50, 80, 100, 200, 500 nucleótidos contiguos o más. Generalmente, puede usarse una homología más alta para compensar el uso de una secuencia más corta.
Por tanto, las composiciones que pueden modular (por ejemplo, reducir o inhibir) la expresión o la actividad de NtMRP incluyen, pero no se limitan a, polinucleótidos específicos de secuencia que pueden interferir con la transcripción de uno o más gen(es) NtMRP endógeno(s); polinucleótidos específicos de secuencia que pueden interferir con la traducción de transcritos de ARN de NtMRP (por ejemplo, ARN bicatenario, ARNip, ribozimas); polipéptidos específicos de secuencia que pueden interferir con la estabilidad de las proteínas NtMRP; polinucleótidos específicos de secuencia que pueden interferir con la actividad enzimática de la proteína NtMRP o la actividad de unión de la proteína NtMRP con respecto a sustratos o proteínas reguladoras; anticuerpos que exhiben la especificidad por la proteína NtMRP; compuestos de moléculas pequeñas que pueden interferir con la estabilidad de la proteína NtMRP o la actividad enzimática de la proteína NtMRP o la actividad de unión de la proteína NtMRP; proteínas con dedos de zinc que se unen al polinucleótido NtMRP; y meganucleasas que tienen actividad hacia el polinucleótido NtMRP.
La tecnología antisentido es un método que se conoce bien que puede usarse para modular (por ejemplo, reducir o inhibir) la expresión de un polipéptido NtMRP. Un polinucleótido del gen a reprimir se clona y se une operativamente a una región regulatoria y una secuencia de terminación de la transcripción de manera que la cadena de ARN antisentido se transcribe. El constructo recombinante se transforma después en las plantas, como se describe en la presente descripción, y se produce la cadena de ARN antisentido. El polinucleótido no necesita ser la secuencia completa del gen a reprimir, pero típicamente será complementaria esencialmente a al menos una porción de la cadena sentido del gen a reprimir.
Un polinucleótido puede transcribirse en una ribozima, o ARN catalítico, que afecta la expresión de un ARNm. Las ribozimas pueden diseñarse para aparearse específicamente con virtualmente cualquier ARN objetivo y escindir la cadena principal de fosfodiéster en una ubicación específica, de esta manera inactivan funcionalmente el ARN objetivo. Los polinucleótidos heterólogos pueden codificar ribozimas diseñadas para escindir transcritos de ARNm particulares, lo que impide así la expresión de un polipéptido. Las ribozimas cabeza de martillo son útiles para destruir ARNm particulares, aunque pueden usarse varias ribozimas que escinden ARNm en secuencias de reconocimiento específicas de sitio. Las ribozimas cabeza de martillo escinden ARNm en ubicaciones determinadas por regiones flanqueantes que forman pares de bases complementarios con el ARNm objetivo. El único requerimiento es que el ARN objetivo contenga una secuencia de nucleótidos 5'-UG-3'. La construcción y producción de ribozimas cabeza de martillo se conoce en la técnica. Las secuencias de ribozimas cabeza de martillo pueden incorporarse en un ARN estable tal como un ARN de transferencia (ARNt) para aumentar la eficacia de escisión in vivo.
Por ejemplo, puede prepararse un constructo que incluye una secuencia que se transcribe en un ARN que puede aparearse a sí mismo, por ejemplo, un ARN bicatenario que tiene una estructura en tallo-lazo. En algunas modalidades, una hebra de la porción de tallo de un ARN bicatenario comprende una secuencia que es similar o idéntica a la secuencia codificadora sentido o un fragmento de esta de un polinucleótido NtMRP, y que es de aproximadamente 10 nucleótidos a aproximadamente 2 500 nucleótidos contiguos en longitud. La longitud de la secuencia que es similar o idéntica a la secuencia de codificación sentido puede ser de 10 nucleótidos contiguos a 500 nucleótidos contiguos, de 15 nucleótidos contiguos a 300 nucleótidos contiguos, de 20 nucleótidos contiguos a 100 nucleótidos contiguos, o de 25 nucleótidos contiguos a 100 nucleótidos contiguos. La otra cadena de la porción del tallo de un ARN bicatenario comprende una secuencia que es similar o idéntica a la cadena antisentido o un fragmento de esta de la secuencia codificante del polinucleótido NtMRP, y puede tener una longitud que es más corta, la misma que, o más larga que la longitud correspondiente de la secuencia sentido. En algunos casos, una cadena de la porción de tallo de un ARN bicatenario comprende una secuencia que es similar o idéntica a la región 3' o 5' no traducida, o un fragmento de esta, de un ARNm que codifica un polipéptido NtMRP, y la otra cadena de la porción del tallo del ARN bicatenario comprende una secuencia que es similar o idéntica a la secuencia que es complementaria a la región 3' o 5' no traducida, respectivamente, o un fragmento de esta, del ARNm que codifica el NtMRP. En otras modalidades, una cadena de la porción de tallo de un ARN bicatenario comprende una secuencia que es similar o idéntica a la secuencia de un intrón, o un fragmento de esta, en el pre-ARNm que codifica un polipéptido NtMRP, y la otra cadena de la porción de tallo comprende una secuencia que es similar o idéntica a la secuencia que es complementaria a la secuencia del intrón, o un fragmento de esta, en el pre-ARNm.
La porción de lazo de un ARN bicatenario puede ser de aproximadamente 3 nucleótidos a aproximadamente 5000 nucleótidos, tal como de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 1 000 nucleótidos, de aproximadamente 20 nucleótidos a aproximadamente 500 nucleótidos, de aproximadamente 25 nucleótidos a 250 nucleótidos. La porción de lazo del ARN puede incluir un intrón o un fragmento de este. Un ARN bicatenario puede tener cero, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más estructuras de tallo-lazo.
Un constructo que incluye una secuencia que se une operativamente a una región reguladora o una secuencia de terminación de la transcripción, y que se transcribe en un ARN que puede formar un ARN bicatenario, puede transformarse en plantas como se describe en la presente descripción. Los expertos en la técnica conocen métodos para usar ARNi para inhibir la expresión de un gen.
Las constructos que comprenden regiones reguladoras unidas operativamente a moléculas de polinucleótidos en orientación sentido pueden usarse, además, para inhibir la expresión de un gen. El producto de transcripción puede ser similar o idéntico a la secuencia de codificación sentido, o un fragmento de esta, de un polipéptido NtMRP. El producto de transcripción también puede ser no poliadenilado, carecer de una estructura de caperuza 5' o contener un intrón no divisible. Los métodos para inhibir la expresión génica mediante el uso de un ADNc completo así como también una secuencia parcial de ADNc se conocen en la técnica.
En algunas modalidades, se usa un constructo que comprende un polinucleótido que tiene al menos una cadena que es un molde para las secuencias sentido y antisentido que son complementarias entre sí para inhibir la expresión de un gen. Las secuencias sentido y antisentido pueden ser parte de una molécula de polinucleótido mayor o pueden ser parte de moléculas de polinucleótidos separadas que tienen secuencias que no son complementarias. La secuencia sentido o antisentido puede ser una secuencia que es idéntica o complementaria a la secuencia de un ARNm, la región 3' o 5' no traducida de un ARNm, o un intrón en un pre-ARNm que codifica un polipéptido NtMRP, o un fragmento de dichas secuencias. En algunas modalidades, la secuencia sentido o antisentido es idéntica o complementaria a una secuencia de la región reguladora que dirige la transcripción del gen que codifica un polipéptido NtMRP. En cada caso, la secuencia sentido es la secuencia que es complementaria a la secuencia antisentido.
Las secuencias sentido y antisentido pueden tener una longitud mayor que aproximadamente 10 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más nucleótidos). Por ejemplo, una secuencia antisentido puede tener una longitud de aproximadamente 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos. Típicamente, las secuencias sentido y antisentido varían en longitud de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 30 nucleótidos, por ejemplo, de aproximadamente 18 nucleótidos a aproximadamente 28 nucleótidos, o de aproximadamente de aproximadamente 21 nucleótidos a aproximadamente 25 nucleótidos, o de aproximadamente 23 nucleótidos a aproximadamente 25 nucleótidos.
En algunas modalidades, una secuencia antisentido es una secuencia complementaria a una secuencia de ARNm, o un fragmento de esta, que codifica un polipéptido NtMRP descrito en la presente descripción. La secuencia sentido complementaria a la secuencia antisentido puede ser una secuencia presente dentro del ARNm del polipéptido NtMRP. Típicamente, las secuencias sentido y antisentido se diseñan para que correspondan a una secuencia de 15-30 nucleótidos de un ARNm objetivo de manera que se reduce el nivel de ese ARNm objetivo.
En algunas modalidades, un constructo que comprende un polinucleótido que tiene al menos una cadena que es un molde para más de una secuencia sentido (por ejemplo, aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más secuencias sentido) puede usarse para inhibir la expresión de un gen. Asimismo, un constructo que comprende un polinucleótido que tiene al menos una cadena que es un molde para más de una secuencia antisentido (por ejemplo, aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más secuencias antisentido) puede usarse para inhibir la expresión de un gen. Por ejemplo, un constructo puede contener un polinucleótido que tiene al menos una cadena que es un molde para dos secuencias sentido y dos secuencias antisentido. Las secuencias sentido múltiples pueden ser idénticas o diferentes. Las secuencias antisentido múltiples pueden ser idénticas o diferentes. Por ejemplo, un constructo puede comprender un polinucleótido que tiene una cadena que es un molde para dos secuencias sentido idénticas y dos secuencias antisentido idénticas que son complementarias a las dos secuencias sentido idénticas. Alternativamente, un polinucleótido aislado puede comprender una cadena que es un molde para (1) dos secuencias sentido idénticas de aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 o más nucleótidos de longitud, (2) una secuencia antisentido que es complementaria a las dos secuencias sentido idénticas de aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 o más nucleótidos de longitud, (3) una secuencia sentido de aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 o más nucleótidos de longitud, y (4) tres secuencias antisentido idénticas que son complementarias a la secuencia sentido de aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 o más nucleótidos de longitud. Los constructos proporcionados en la presente descripción pueden diseñarse para tener cualquier disposición de secuencias sentido y antisentido. Por ejemplo, dos secuencias sentido idénticas pueden seguirse por dos secuencias antisentido idénticas o pueden posicionarse entre dos secuencias antisentido idénticas.
Un polinucleótido que comprende al menos una cadena que es un molde para una o más secuencias sentido o antisentido puede unirse operativamente a una región reguladora para conducir la transcripción de una molécula de ARN que comprende la(s) secuencia(s) sentido o antisentido. Además, dicho polinucleótido puede unirse operativamente a una secuencia de terminación de la transcripción, tal como el terminador del gen de la nopalina sintasa (nos). En algunos casos, dos regiones reguladoras pueden dirigir la transcripción de dos transcritos: una de la cadena superior y una de la cadena inferior. Las dos regiones reguladoras pueden ser iguales o diferentes. Los dos transcritos pueden formar moléculas de ARN bicatenario que inducen la degradación del ARN diana. En algunos casos, un polinucleótido puede colocarse dentro de un ADN-T o ADN de transferencia derivado de una planta (ADN-P) de manera que las secuencias de borde izquierdo y derecho del ADN-T, o las secuencias de borde izquierdo y derecho del ADN-P, flanquean o están a cada lado del polinucleótido. La secuencia de polinucleótidos entre las dos regiones regulatorias puede ser de aproximadamente 15 a aproximadamente 300 nucleótidos de longitud, de aproximadamente 15 a aproximadamente 200 nucleótidos de longitud, de aproximadamente 15 a aproximadamente 100 nucleótidos de longitud, de aproximadamente 15 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, de aproximadamente 18 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, de aproximadamente 18 a aproximadamente 40 nucleótidos de longitud, de aproximadamente 18 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, o de aproximadamente 18 a aproximadamente 25 nucleótidos de longitud.
En consecuencia, las composiciones que pueden modular (por ejemplo, regulan negativamente) la expresión o la actividad de la proteína NtMRP incluyen polinucleótidos específicos de secuencia que pueden interferir con la transcripción de uno o más gen(es) de NtMRP endógeno(s); polinucleótidos específicos de secuencia que pueden interferir con la traducción de transcritos de ARN de NtMRP (por ejemplo, ARN bicatenario, ARNip, ribozimas); polipéptidos específicos de secuencia que pueden interferir con la estabilidad de las proteínas NtMRP; polinucleótidos específicos de secuencia que pueden interferir con la actividad enzimática de la proteína NtMRP o la actividad de unión de la proteína NtMRP con respecto a sustratos o proteínas reguladoras; anticuerpos que exhiben especificidad por la proteína NtMRP; compuestos de moléculas pequeñas que pueden interferir con la estabilidad de la proteína NtMRP o la actividad enzimática de la proteína NtMRP o la actividad de unión de la proteína NtMRP; proteínas con dedos de zinc que se unen al polinucleótido NtMRP; y meganucleasas que tienen actividad hacia el polinucleótido NtMRP.
Un antagonista eficaz puede reducir el transporte de metales pesados (por ejemplo, cadmio) hacia la hoja (por ejemplo, estructuras de la lámina foliar) por al menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %.
En una modalidad, el polinucleótido de secuencia específica que puede interferir con la traducción de transcrito(s) de ARN de NtMRP es un ARNi.
La interferencia por ARN ("ARNi") o el silenciamiento por ARN es un proceso conservado evolutivamente mediante el cual los ARNm específicos pueden dirigirse a la degradación enzimática. Un ARN de doble cadena (ARN bicatenario) debe introducirse o se produce por una célula (por ejemplo, virus de ARN bicatenario, o polinucleótidos de ARNi de NtMRP) para iniciar la vía del a Rní. El ARN bicatenario puede convertirse en múltiples dúplex de ARNip de 21-23 pb de longitud ("ARNip") por las RNasas III, que son endonucleasas específicas de a Rn bicatenario (“Dicer”). Los ARNip pueden reconocerse posteriormente mediante complejos de silenciamiento inducidos por ARN ("RISC") que promueven el desenrollamiento de ARNip a través de un proceso dependiente de ATP. La cadena antisentido desenrollada del ARNip guía al RISC activado hacia el ARNm objetivo (por ejemplo, variantes de ARN de NtMRP) que comprende una secuencia complementaria a la cadena antisentido del ARNip. El ARNm objetivo y la cadena antisentido pueden formar una hélice en forma A, y el surco mayor de la hélice en forma A puede ser reconocido por los RISC activados. El ARNm objetivo puede escindirse mediante el RISC activado en un sitio único definido por el sitio de unión del extremo 5' de la cadena del ARNip. El RISC activado puede reciclarse para catalizar otro evento de escisión.
Los vectores de expresión de ARNi de NtMRP que comprenden constructos de ARNi de NtMRP que codifican polinucleótidos de ARNi de NtMRP exhiben actividad de interferencia de ARN lo que reduce el nivel de expresión de ARN de NtMRP, pre-ARN de NtMRP, o variantes de ARN de NtMRP relacionadas. Los vectores de expresión pueden comprender un promotor ubicado aguas arriba y unido operativamente a un constructo de ARNi de NtMRP, como se describe adicionalmente en la presente descripción. Los vectores de expresión de ARNi de NtMRP pueden comprender un promotor mínimo adecuado, un constructo de ARNi de NtMRP de interés, una región reguladora aguas arriba (5'), una región reguladora aguas abajo (3'), lo que incluye señales de terminación de la transcripción y poliadenilación, y otras secuencias conocidas para los expertos en la técnica, tales como varios marcadores de selección.
Los polinucleótidos NtMRP pueden producirse en varias formas, lo que incluye estructuras bicatenarias (es decir, una molécula de ARN bicatenario que comprende una cadena antisentido y una cadena sentido complementaria), estructuras bicatenarias similares a horquilla ("ARNi-bc"), estructuras monocatenarias (es decir, una molécula de ARNmc que comprende solo una cadena antisentido). Las estructuras pueden comprender un dúplex, dúplex asimétrico, horquilla o estructura secundaria de horquilla asimétrica, que tiene cadenas sentido y antisentido autocomplementarias. Los ARNbc-i de NtMRP pueden convertirse enzimáticamente a ARNip de NtMRP bicatenarios. Una de las cadenas del dúplex de ARNip de NtMRP puede aparearse con una secuencia complementaria dentro del ARNm de NtMRP objetivo y variantes de ARN de NtMRP relacionadas. Los híbridos de ARNip/ARNm son reconocidos por el RISC que puede escindir los ARN de NtMRP en múltiples sitios de una manera dependiente de la secuencia, lo que da como resultado la degradación del ARNm de NtMRP objetivo y variantes relacionadas del ARN de NtMRP.
Las moléculas de ARN bicatenario pueden incluir moléculas de ARNip, ensambladas a partir de un solo oligonucleótido en una estructura de tallo-lazo, en donde las regiones sentido y antisentido autocomplementarias de la molécula de ARNip se unen por medio de un enlazador(es) basado(s) en un polinucleótido o no basado(s) en un polinucleótido, así como también ARN circular monocatenario que tiene dos o más estructuras de lazo y un tallo que comprende las cadenas sentido y antisentido autocomplementarias, en donde el ARN circular puede procesarse lo mismo in vivo que in vitro para generar una molécula activa de ARNip capaz de mediar ARNi.
Las moléculas de ARN en horquilla pequeña (ARNhp) también se describen en la presente descripción y comprenden una secuencia antisentido específica además de la secuencia complementaria (sentido) inversa, separadas típicamente por un espaciador o secuencia en lazo. La escisión del espaciador o lazo proporciona una molécula de ARN monocatenario y su complemento inverso, de manera que pueden aparearse para formar una molécula de ARN bicatenario (opcionalmente con etapas de procesamiento adicionales que pueden resultar en la adición o eliminación de uno, dos, tres o más nucleótidos a partir del extremo 3' o el extremo 5' de cualquiera de las cadenas o de ambas). El espaciador puede ser de una longitud suficiente para permitir que las secuencias antisentido y sentido se apareen y formen una estructura bicatenario (o tallo) antes de la escisión del espaciador (y, opcionalmente, etapas de procesamiento posteriores que pueden resultar en la adición o eliminación de uno, dos, tres, cuatro, o más nucleótidos a partir del extremo 3' o el extremo 5' de cualquiera de las cadenas o de ambas). La secuencia del espaciador típicamente es una secuencia de nucleótidos no relacionada que se ubica entre dos regiones complementarias de secuencias de nucleótidos las cuales, cuando se aparean en un polinucleótido bicatenario, comprenden un ARNhp. La secuencia del espaciador comprende generalmente entre aproximadamente 3 y aproximadamente 100 nucleótidos.
Cualquier polinucleótido de ARN de NtMRP de interés puede producirse mediante la selección de una adecuada composición de secuencias, tamaño del lazo, y longitud del tallo para producir el dúplex en horquilla de NtMRP. Un intervalo adecuado para diseñar las longitudes del tallo de un dúplex en horquilla, incluye las longitudes del tallo de al menos aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos - tal como aproximadamente 14­ 30 nucleótidos, aproximadamente 30-50 nucleótidos, aproximadamente 50-100 nucleótidos, aproximadamente 100­ 150 nucleótidos, aproximadamente 150-200 nucleótidos, aproximadamente 200-300 nucleótidos, aproximadamente 300-400 nucleótidos, aproximadamente 400-500 nucleótidos, aproximadamente 500-600 nucleótidos, y aproximadamente 600-700 nucleótidos. Un intervalo adecuado para diseñar las longitudes del lazo de un dúplex en horquilla, incluye las longitudes del lazo de aproximadamente 4-25 nucleótidos, aproximadamente 25-50 nucleótidos, o más largas si la longitud del tallo del dúplex en horquilla es sustancial. En ciertas modalidades, una molécula de ARN bicatenario o de ARNmc es de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 40 nucleótidos en longitud. En otra modalidad, la molécula de ARN es una molécula de ARN bicatenario o un ARNmc entre aproximadamente 15 y aproximadamente 35 nucleótidos en longitud. En otra modalidad, la molécula de ARN es una molécula de ARN bicatenario o un ARNmc entre aproximadamente 17 y aproximadamente 30 nucleótidos en longitud. En otra modalidad, la molécula de ARN es una molécula de a Rn bicatenario o un ARNmc entre aproximadamente 19 y aproximadamente 25 nucleótidos en longitud. En otra modalidad, la molécula de ARN es una molécula de ARN bicatenario o un ARNmc entre aproximadamente 21 y aproximadamente 23 nucleótidos en longitud. En ciertas modalidades, las estructuras de horquillas con regiones dobles más largas que 21 nucleótidos pueden promover un eficaz silenciamiento dirigido por el ARNip, independientemente de la secuencia y la longitud del lazo.
La secuencia del ARNm objetivo está típicamente entre aproximadamente 14 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. El ARNm objetivo puede, por lo tanto, examinarse por regiones entre aproximadamente 14 y aproximadamente 50 nucleótidos de longitud que cumplen preferentemente con uno o más de los siguientes criterios para una secuencia objetivo: una relación A+T/G+C de entre aproximadamente 2:1 y aproximadamente 1:2; un dinucleótido AA o un dinucleótido CA en el extremo 5' de la secuencia objetivo; una secuencia de al menos 10 nucleótidos consecutivos única para el ARNm objetivo; y sin "corridas" de más de tres nucleótidos de guanina (G) consecutivos o más de tres nucleótidos de citosina (C) consecutivos. Estos criterios pueden evaluarse mediante el uso de diversas técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo, pueden usarse programas informáticos tales como BLAST para buscar bases de datos disponibles públicamente para determinar si la secuencia objetivo seleccionada es única para el ARNm objetivo. Alternativamente, puede seleccionarse una secuencia objetivo (y se diseña una secuencia de ARNip) mediante el uso de un software informático disponible comercialmente (por ejemplo, OligoEngineTM (Seattle, Washington); Dharmacon, Inc. (Lafayette, Colorado); Target Finder de Ambion Inc. (Austin, TX) y la herramienta de diseño de ARNip de QIAGEN, Inc. (Valencia, CA)).
En una modalidad, se selecciona que las secuencias de ARNm objetivo sean entre aproximadamente 14 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud que cumplan uno o más de los criterios anteriores. En otra modalidad, se selecciona que las secuencias objetivos sean entre aproximadamente 16 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud que cumplan con uno o más de los criterios anteriores. En una modalidad adicional, se selecciona que las secuencias objetivos sean entre aproximadamente 19 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud que cumplan con uno o más de los criterios anteriores. En otra modalidad, se selecciona que las secuencias objetivos sean entre aproximadamente 19 y aproximadamente 25 nucleótidos de longitud que cumplan con uno o más de los criterios anteriores.
En una modalidad ilustrativa, las moléculas de ARNip comprenden una secuencia antisentido específica que es complementaria a al menos 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más nucleótidos contiguos de una cualquiera de las secuencias como se expone en secs. con núms. de ident.: 1-23. La secuencia antisentido específica comprendida por la molécula de ARNip puede ser idéntica o idéntica sustancialmente al complemento de la secuencia objetivo. En una modalidad, la secuencia antisentido específica comprendida por la molécula de ARNip es al menos aproximadamente 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica al complemento de la secuencia de ARNm objetivo. Los métodos para determinar la identidad de secuencia se conocen en la técnica y pueden determinarse, por ejemplo, mediante el uso del programa BLASTN del programa informático del Grupo de Computación de la Universidad de Wisconsin (GCG) o proporcionarse en el sitio de internet del NCBI.
La secuencia antisentido específica de la molécula de ARNip descrita en la presente descripción puede exhibir variabilidad al diferir (por ejemplo, por sustitución de nucleótidos, lo que incluye transición o transversión) en uno, dos, tres, cuatro o más nucleótidos de la secuencia del ARNm objetivo. Cuando tales sustituciones de nucleótidos están presentes en la cadena antisentido de una molécula de ARN bicatenario, el nucleótido complementario en la cadena sentido con el cual el nucleótido sustituto típicamente formaría apareamiento de bases por enlace de hidrógeno puede o no estar sustituido de manera correspondiente. Las moléculas de ARN bicatenario en las cuales se produce una o más sustituciones de nucleótidos en la secuencia sentido, pero no en la cadena antisentido, también se contemplan. Cuando la secuencia antisentido de una molécula de ARNip comprende uno o más errores de apareamiento entre la secuencia de nucleótidos del ARNip y la secuencia de nucleótidos objetivo, como se describió anteriormente, los errores de apareamiento pueden encontrarse en el extremo 3' terminal, el extremo 5' terminal o en la porción central de la secuencia antisentido.
En otra modalidad, la molécula de ARNip comprende una secuencia antisentido específica que es capaz de hibridar selectivamente en condiciones rigurosas a una porción de un gen objetivo de origen natural o ARNm objetivo. Las condiciones rigurosas adecuadas incluyen, por ejemplo, hibridación de acuerdo con procedimientos de hibridación convencionales y condiciones de lavado de 1-3 veces. Citrato de sodio estándar, sulfato de dodecilo sódico al 0,1-1 %, 50-70 °C, con un cambio de solución de lavado después de aproximadamente 5-30 minutos. Como se conoce por los expertos en la técnica, las variaciones en la rigurosidad de las condiciones de hibridación pueden lograrse mediante la alteración del tiempo, temperatura o concentración de las soluciones usadas para las etapas de hibridación y lavado. Además, las condiciones adecuadas pueden depender en parte en las secuencias de nucleótidos particulares usadas, por ejemplo la secuencia del ARNm o gen objetivos.
Las moléculas de ARNi que tienen una estructura dúplex o bicatenaria, por ejemplo ARN bicatenario o ARNhp, pueden tener extremos romos, o pueden tener salientes en 3' o 5'. Como se usa en la presente descripción, "saliente" se refiere al nucleótido o nucleótidos no pareados que se proyectan a partir de una estructura dúplex cuando un extremo 3' terminal de una cadena de ARN se extiende más allá del extremo 5' terminal de la otra cadena (saliente en 3'), o viceversa (saliente en 5'). Los nucleótidos que comprenden el saliente pueden ser ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos o versiones modificadas de estos. En una modalidad, al menos una cadena de la molécula de ARNi tiene un saliente en 3' de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 nucleótidos de longitud. En otras modalidades, el saliente en 3' es de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 nucleótidos, de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 nucleótidos y de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 nucleótidos de longitud.
Cuando la molécula de ARNi comprende un saliente en 3' en un extremo de la molécula, el otro extremo puede ser un extremo romo o tener también un saliente (5' o 3'). Cuando la molécula de ARNi comprende un saliente en ambos extremos de la molécula, la longitud de los salientes puede ser la misma o diferente. En una modalidad, la molécula de ARNi descrita en la presente descripción comprende salientes en 3' de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 nucleótidos en ambos extremos de la molécula. En una modalidad adicional, la molécula de ARNi es un ARN bicatenario que tiene un saliente en 3' de 2 nucleótidos en ambos extremos de la molécula. En aún otra modalidad, los nucleótidos que comprenden el saliente del ARNi son dinucleótidos TT o dinucleótidos UU.
Cuando se determina el porcentaje de identidad de la molécula de ARNi que comprende uno o más salientes con la secuencia de ARNm objetivo, el(los) saliente(s) puede(n) tomarse en cuenta o no. Por ejemplo, los nucleótidos de un saliente en 3' y hasta 2 nucleótidos de los extremos 5' o 3' terminales de la doble cadena pueden modificarse sin una pérdida significativa de la actividad de la molécula de ARNip.
Las moléculas de ARNi pueden comprender una o más estructuras de caperuza en 5' o 3'. La molécula de ARNi puede comprender una estructura de caperuza en el extremo 3' de la cadena sentido, la cadena antisentido, o ambas cadenas sentido y antisentido; o en el extremo 5' de la cadena sentido, la cadena antisentido, o ambas cadenas sentido y antisentido de la molécula de ARNi. Alternativamente, la molécula de ARNi puede comprender una estructura de caperuza en ambos extremos 3' y 5' de la molécula de ARNi. El término "estructura de caperuza" se refiere a una modificación química incorporada en cualquier extremo terminal de un oligonucleótido (ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Núm. 5,998,203), la cual protege la molécula de la degradación de exonucleasas, y puede facilitar además el suministro o localización dentro de una célula.
Otra modificación aplicable a moléculas de ARNi es el enlace químico a la molécula de ARNi de uno o más motivos o conjugados que mejoran la actividad, distribución celular, captación celular, biodisponibilidad o estabilidad de la molécula de aRní. Los polinucleótidos pueden sintetizarse o modificarse mediante métodos bien establecidos en la técnica. Las modificaciones químicas pueden incluir, pero no se limitan a modificaciones en 2', introducción de bases no naturales, unión covalente a un ligando, y reemplazo de enlaces fosfato con enlaces tiofosfato. En esta modalidad, la integridad de la estructura de dúplex se fortalece mediante al menos uno, y típicamente dos, enlaces químicos. La unión química puede alcanzarse mediante cualquiera de una variedad de técnicas bien conocidas, por ejemplo mediante la introducción de enlaces covalentes, iónicos o de hidrógeno; interacciones hidrofóbicas, interacciones de van der Waals o de apilamiento; por medio de una coordinación metal-ión, o a través del uso de análogos de purina.
En aún otra modalidad, los nucleótidos en una o ambas de las dos cadenas sencillas pueden modificarse para evitar o inhibir la activación de enzimas celulares, tales como, por ejemplo, sin limitación, determinadas nucleasas. Las técnicas para inhibir la activación de enzimas celulares se conocen en la técnica, incluyen, pero no se limitan a, modificaciones 2'-amino, modificaciones 2'-fluoro, modificaciones 2'-alquilo, modificaciones a la cadena principal no cargada, modificaciones morfolino, modificaciones 2'-O-metil, y fosforamidato. Así, al menos un grupo 2'-hidroxilo de los nucleótidos en un ARN bicatenario se reemplaza por un grupo químico. Además, al menos un nucleótido puede modificarse para formar un nucleótido bloqueado. Tal nucleótido bloqueado contiene un puente de metileno o etileno que conecta el oxígeno 2' de la ribosa con el carbono 4' de la ribosa. La introducción de un nucleótido bloqueado en un oligonucleótido mejora la afinidad por secuencias complementarias y aumenta la temperatura de fusión en varios grados.
Los ligandos pueden conjugarse a una molécula de ARNi, por ejemplo, para aumentar su absorción celular. En cierta modalidad, un ligando hidrófobo se conjuga a la molécula para facilitar la permeación directa de la membrana celular. Estos enfoques se han usado para facilitar la permeación celular de oligonucleótidos antisentido. En ciertos casos, la conjugación de un ligando catiónico a oligonucleótidos resulta frecuentemente en una resistencia mejorada a las nucleasas. Los ejemplos representativos de ligandos catiónicos incluyen propilamonio y dimetilpropilamonio. Los oligonucleótidos antisentido pueden retener su afinidad alta de unión al ARNm cuando el ligando catiónico está disperso en todo el oligonucleótido.
Las moléculas y nucleótidos descritos en la presente descripción pueden prepararse mediante el uso de técnicas bien conocidas de síntesis en fase sólida. Cualquier otro medio conocido en la técnica para dicha síntesis puede emplearse adicionalmente o alternativamente.
Varias modalidades se dirigen a vectores de expresión de NtMRP (por ejemplo, vectores de expresión de NtMRP3) que comprenden polinucleótidos NtMRP o constructos de ARNi de NtMRP que comprenden uno o más de: sec. con núm. de ident.: 28, sec. con núm. de ident.: 29, sec. con núm. de ident.: 51, intrón 1 (sec. con núm. de ident.: 30), intrón 2 (sec. con núm. de ident.: 31), intrón 3 (sec. con núm. de ident.: 32), intrón 4 (sec. con núm. de ident.: 33), intrón 5 (sec. con núm. de ident.: 34), intrón 6 (sec. con núm. de ident.: 35), intrón 7 (sec. con núm. de ident.: 36), intrón 8 (sec. con núm. de ident.: 37), intrón 9 (sec. con núm. de ident.: 38), intrón 10 (sec. con núm. de ident.: 39), exón 1 (sec. con núm. de ident.: 40), exón 2 (sec. con núm. de ident.: 41), exón 3 (sec. con núm. de ident.: 42) exón 4 (sec. con núm. de ident.: 43), exón 5 (sec. con núm. de ident.: 44), exón 6 (sec. con núm. de ident.: 45) exón 7 (sec. con núm. de ident.: 46) exón 8 (sec. con núm. de ident.: 47), exón 9 (sec. con núm. de ident.: 48) exón 10 (sec. con núm. de ident.: 49) o exón 11 (sec. con núm. de ident.: 50) y fragmentos de estos, y variantes de estos. Como se describe en la presente descripción, la referencia a las secuencias específicas incluye, además, el complemento o complemento inverso de estas.
Varias modalidades se dirigen a vectores de expresión de NtMRP (por ejemplo, vectores de expresión de NtMRP4) que comprenden polinucleótidos NtMRP o constructos de ARNi de NtMRP que comprenden uno o más de: sec. con núm. de ident.: 1, sec. con núm. de ident.: 2, sec. con núm. de ident.: 27, intrón 1 (sec. con núm. de ident.: 3), intrón 2 (sec. con núm. de ident.: 4), intrón 3 (sec. con núm. de ident.: 5), intrón 4 (sec. con núm. de ident.: 6), intrón 5 (sec. con núm. de ident.: 7), intrón 6 (sec. con núm. de ident.: 8), intrón 7 (sec. con núm. de ident.: 9), intrón 8 (sec. con núm. de ident.: 10), intrón 9 (sec. con núm. de ident.: 11), intrón 10 (sec. con núm. de ident.: 12), exón 1 (sec. con núm. de ident.: 13), exón 2 (sec. con núm. de ident.: 14), exón 3 (sec. con núm. de ident.: 15) exón 4 (sec. con núm. de ident.: 16), exón 5 (sec. con núm. de ident.: 17), exón 6 (sec. con núm. de ident.: 18) exón 7 (sec. con núm. de ident.: 19) exón 8 (sec. con núm. de ident.: 20), exón 9 (sec. con núm. de ident.: 21) exón 10 (sec. con núm. de ident.: 21), exón 11 (sec. con núm. de ident.: 22) o sec. con núm. de ident.: 23 y fragmentos de estos y variantes de estos. Como se describe en la presente descripción, la referencia a las secuencias específicas incluye, además, el complemento o complemento inverso de estas.
Diversas modalidades se dirigen a vectores de expresión que comprenden: uno o más polinucleótidos NtMRP o constructos de ARNi de NtMRP (por ejemplo, polinucleótido NtMRP3 o constructos de ARNi de NtMRP3) que tienen al menos 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: sec. con núm. de ident.: 28, sec. con núm. de ident.: 29, intrón 1 (sec. con núm. de ident.: 30), intrón 2 (sec. con núm. de ident.: 31), intrón 3 (sec. con núm. de ident.: 32), intrón 4 (sec. con núm. de ident.: 33), intrón 5 (sec. con núm. de ident.: 34), intrón 6 (sec. con núm. de ident.: 35), intrón 7 (sec. con núm. de ident.: 36), intrón 8 (sec. con núm. de ident.: 37), intrón 9 (sec. con núm. de ident.: 38), intrón 10 (sec. con núm. de ident.: 39), exón 1 (sec. con núm. de ident.: 40), exón 2 (sec. con núm. de ident.: 41), exón 3 (sec. con núm. de ident.: 42) exón 4 (sec. con núm. de ident.: 43), exón 5 (sec. con núm. de ident.: 44), exón 6 (sec. con núm. de ident.: 45) exón 7 (sec. con núm. de ident.: 46) exón 8 (sec. con núm. de ident.: 47), exón 9 (sec. con núm. de ident.: 48), exón 10 (sec. con núm. de ident.: 49), exón 11 (sec. con núm. de ident.: 50) o sec. con núm. de ident.: 51 y fragmentos de estos, y variantes de estos o una combinación de dos o más de estos. Como se describe en la presente descripción, la referencia a las secuencias específicas incluye, además, el complemento o complemento inverso de estas.
Varias modalidades se dirigen a vectores de expresión que comprenden: polinucleótido NtMRP o constructos de ARNi de NtMRP (por ejemplo, polinucleótido NtMRP4 o constructos de ARNi de NtMRP4) que tienen al menos 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: sec. con núm. de ident.: 1, sec. con núm. de ident.: 2, intrón 1 (sec. con núm. de ident.: 3), intrón 2 (sec. con núm. de ident.: 4), intrón 3 (sec. con núm. de ident.: 5), intrón 4 (sec. con núm. de ident.: 6), intrón 5 (sec. con núm. de ident.: 7), intrón 6 (sec. con núm. de ident.: 8), intrón 7 (sec. con núm. de ident.: 9), intrón 8 (sec. con núm. de ident.: 10), intrón 9 (sec. con núm. de ident.: 11), intrón 10 (sec. con núm. de ident.: 12), exón 1 (sec. con núm. de ident.: 13), exón 2 (sec. con núm. de ident.: 14), exón 3 (sec. con núm. de ident.: 15) exón 4 (sec. con núm. de ident.: 16), exón 5 (sec. con núm. de ident.: 17), exón 6 (sec. con núm. de ident.: 18) exón 7 (sec. con núm. de ident.: 19) exón 8 (sec. con núm. de ident.: 20), exón 9 (sec. con núm. de ident.: 21) exón 10 (sec. con núm. de ident.: 21), exón 11 (sec. con núm. de ident.: 22) o sec. con núm. de ident.: 23 y fragmentos de estas, y variantes de estas o una combinación de dos o más de estas. Como se describe en la presente descripción, la referencia a las secuencias específicas incluye, además, el complemento o complemento inverso de estas.
Varias modalidades se dirigen a vectores de expresión que comprenden: polinucleótido NtMRP o constructo de ARNi de NtMRP que codifica polinucleótidos de ARNi de NtMRP (por ejemplo, polinucleótido NtMRP3 o constructos de ARNi de NtMRP3 que codifican polinucleótidos de ARNi de NtMRP3) capaz de auto-aparearse para formar una estructura en horquilla, en la cual el constructo comprende (a) una primera secuencia que tiene al menos 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: sec. con núm. de ident.: 28, sec. con núm. de ident.: 29, intrón 1 (sec. con núm. de ident.: 30), intrón 2 (sec. con núm. de ident.: 31), intrón 3 (sec. con núm. de ident.: 32), intrón 4 (sec. con núm. de ident.: 33), intrón 5 (sec. con núm. de ident.: 34), intrón 6 (sec. con núm. de ident.: 35), intrón 7 (sec. con núm. de ident.: 36), intrón 8 (sec. con núm. de ident.: 37), intrón 9 (sec. con núm. de ident.: 38), intrón 10 (sec. con núm. de ident.: 39), exón 1 (sec. con núm. de ident.: 40), exón 2 (sec. con núm. de ident.: 41), exón 3 (sec. con núm. de ident.: 42) exón 4 (sec. con núm. de ident.: 43), exón 5 (sec. con núm. de ident.: 44) , exón 6 (sec. con núm. de ident.: 45) exón 7 (sec. con núm. de ident.: 46), exón 8 (sec. con núm. de ident.: 47), exón 9 (sec. con núm. de ident.: 48), exón 10 (sec. con núm. de ident.: 49), exón 11 (sec. con núm. de ident.: 50) o sec. con núm. de ident.: 51 y fragmentos de estos, y variantes de estos o una combinación de dos o más de estos; (b) una segunda secuencia que codifica un elemento espaciador del que forma un lazo de la estructura en horquilla; y (c) una tercera secuencia que comprende una secuencia complementaria inversa de la primera secuencia, ubicada en la misma orientación que la primera secuencia, en donde la segunda secuencia se ubica entre la primera secuencia y la tercera, y la segunda secuencia se une operativamente a la primera secuencia y a la tercera secuencia. Como se describe en la presente descripción, la referencia a las secuencias específicas incluye, además, el complemento o complemento inverso de estas.
Varias modalidades se dirigen a vectores de expresión que comprenden: polinucleótido NtMRP o constructo de ARNi de NtMRP que codifica polinucleótidos de ARNi de NtMRP (por ejemplo, polinucleótido NtMRP4 o constructos de ARNi de NtMRP4 que codifican polinucleótidos de ARNi de NtMRP4) capaz de autoaparearse para formar una estructura en horquilla, en donde el constructo comprende (a) una primera secuencia que tiene al menos 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: sec. con núm. de ident.: 1, sec. con núm. de ident.: 2, intrón 1 (sec. con núm. de ident.: 3), intrón 2 (sec. con núm. de ident.: 4), intrón 3 (sec. con núm. de ident.: 5), intrón 4 (sec. con núm. de ident.: 6 ), intrón 5 (sec. con núm. de ident.: 7), intrón 6 (sec. con núm. de ident.: 8), intrón 7 (sec. con núm. de ident.: 9), intrón 8 (sec. con núm. de ident.: 10), intrón 9 (sec. con núm. de ident.: 11), intrón 10 (sec. con núm. de ident.: 12), exón 1 (sec. con núm. de ident.: 13), exón 2 (sec. con núm. de ident.: 14), exón 3 (sec. con núm. de ident.: 15) exón 4 (sec. con núm. de ident.: 16) , exón 5 (sec. con núm. de ident.: 17), exón 6 (sec. con núm. de ident.: 18) exón 7 (sec. con núm. de ident.: 19) exón 8 (sec. con núm. de ident.: 20), exón 9 (sec. con núm. de ident.: 21) exon 10 (sec. con núm. de ident.: 21), exón 11 (sec. con núm. de ident.: 22), sec. con núm. de ident.: 23 o sec. con núm. de ident.: 51 y fragmentos de estos, y variantes de estos o una combinación de dos o más de los mismos; (b) una segunda secuencia que codifica un elemento espaciador del que forma un lazo de la estructura en horquilla; y (c) una tercera secuencia que comprende una secuencia complementaria inversa de la primera secuencia, ubicada en la misma orientación que la primera secuencia, en donde la segunda secuencia se ubica entre la primera secuencia y la tercera, y la segunda secuencia se une operativamente a la primera secuencia y a la tercera secuencia. Como se describe en la presente descripción, la referencia a las secuencias específicas incluye, además, el complemento o complemento inverso de estas.
Las secuencias descritas pueden usarse para construir diversos polinucleótidos NtMRP que no forman estructuras en horquilla. Por ejemplo, un ARN bicatenario de NtMRP puede formarse mediante (1) transcribir una primera cadena del ADNc de NtMRP mediante la unión operativa a un primer promotor, y (2) transcribir la secuencia complementaria inversa de la primera cadena del fragmento de ADNc de NtMRP mediante la unión operativa a un segundo promotor. Cada cadena del polinucleótido NtMRP puede transcribirse a partir del mismo vector de expresión, o a partir de vectores de expresión diferentes. El dúplex de ARN de NtMRP que tiene actividad de interferencia del ARN puede convertirse enzimáticamente a ARNip para reducir los niveles de ARN de NtMRP.
Varias modalidades se dirigen a vectores de expresión de NtMRP que comprenden polinucleótidos NtMRP o constructos de ARNi de NtMRP que codifican polinucleótidos de a Rní de NtMRP (por ejemplo, vectores de expresión de NtMRP3 que comprenden polinucleótidos NtMRP3 o constructos de ARNi de NtMRP3 que codifican polinucleótidos de ARNi de NtMRP3) capaces de autoaparearse, en los cuales el constructo comprende (a) una primera secuencia que tiene al menos el 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de secuencia identidad a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: sec. con núm. de ident.: 28, sec. con núm. de ident.: 29, sec. con núm. de ident.: 30, sec. con núm. de ident.: 31, sec. con núm. de ident.: 32, sec. con núm. de ident.: 33, sec. con núm. de ident.: 34, sec. con núm. de ident.: 35, sec. con núm. de ident.: 36, sec. con núm. de ident.: 37, sec. con núm. de ident.: 38, sec. con núm. de ident.: 39, sec. con núm. de ident.: 40, sec. con núm. de ident.: 41, sec. con núm. de ident.: 42, sec. con núm. de ident.: 43, sec. con núm. de ident.: 44, sec. con núm. de ident.: 45, sec. con núm. de ident.: 46, sec. con núm. de ident.: 47, sec. con núm. de ident.: 48, sec. con núm. de ident.: 49, sec. con núm. de ident.: 50 y sec. con núm. de ident.: 51, y fragmentos de estos, y variantes de estos o una combinación de dos o más de estos; y (b) una segunda secuencia que comprende una secuencia complementaria (por ejemplo, complementaria inversa) de la primera secuencia, ubicada en la misma orientación que la primera secuencia. Como se describe en la presente descripción, la referencia a las secuencias específicas incluye, además, el complemento o complemento inverso de estas.
Otras modalidades se dirigen a vectores de expresión de NtMRP que comprenden polinucleótidos NtMRP, constructos de ARNi de NtMRP que codifican polinucleótidos de ARNi de NtMRP (por ejemplo, vectores de expresión de NtMRP4 que comprenden polinucleótidos NtMRP4 o constructos de ARNi de NtMRP4 que codifican polinucleótidos de ARNi de NtMRP4) capaces de autoaparearse, en los cuales el constructo comprende (a) una primera secuencia que tiene al menos el 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de secuencia identidad a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: sec. con núm. de ident.: 1, sec. con núm. de ident.: 2, sec. con núm. de ident.: 3, sec. con núm. de ident.: 4, sec. con núm. de ident.: 5, sec. con núm. de ident.: 6, sec. con núm. de ident.: 7, sec. con núm. de ident.: 8, sec. con núm. de ident.: 9, sec. con núm. de ident.: 10, sec. con núm. de ident.: 11, sec. con núm. de ident.: 12, sec. con núm. de ident.: 13, sec. con núm. de ident.: 14, sec. con núm. de ident.: 15, sec. con núm. de ident.: 16, sec. con núm. de ident.: 17, sec. con núm. de ident.: 18, sec. con núm. de ident.: 19, sec. con núm. de ident.: 20, sec. con núm. de ident.: 21, sec. con núm. de ident.: 21, sec. con núm. de ident.: 22, sec. con núm. de ident.: 23 y sec. con núm. de ident.: 27 y fragmentos de estos, y variantes de estos o una combinación de dos o más de estos; y (b) una segunda secuencia que comprende una secuencia complementaria (por ejemplo, complementaria inversa) de la primera secuencia, ubicada en la misma orientación que la primera secuencia. Como se describe en la presente descripción, la referencia a las secuencias específicas incluye, además, el complemento o complemento inverso de estas.
Se proporcionan diversas composiciones y métodos para modular (por ejemplo, reducir) los niveles de expresión endógenos para miembros de la familia de genes NtMRP mediante la promoción de la cosupresión de la expresión génica de NtMRP. El fenómeno de cosupresión se produce como un resultado de introducir múltiples copias de un transgén en una célula vegetal huésped. La integración de múltiples copias de un transgén puede resultar en una expresión reducida del transgén y el gen objetivo endógeno. El grado de cosupresión depende del grado de identidad de secuencias entre el transgén y el gen objetivo endógeno. El silenciamiento de ambos, el gen endógeno y el transgén, puede producirse por metilación extensa de los loci silenciados (es decir, el promotor endógeno y el gen endógeno de interés) que puede impedir la transcripción. Alternativamente, en algunos casos, la cosupresión del gen endógeno y el transgén puede producirse mediante silenciamiento génico post transcripcional ("PTGS"), en la cual los transcritos pueden producirse pero el aumento de las tasas de degradación impide la acumulación de transcritos. El mecanismo para la cosupresión mediante PTGS parece asemejarse a la interferencia por ARN, en que el ARN parece ser tanto un cebador importante como un objetivo en estos procesos, y puede mediarse al menos en parte por la misma maquinaria molecular, a través posiblemente de la degradación de los ARNm guiada por ARN.
La cosupresión del polinucleótido de NtMRP puede lograrse mediante la integración de múltiples copias del ADNc de NtMRP o fragmentos de este, como transgenes, en el genoma de una planta de interés. La planta huésped puede transformarse con un vector de expresión que comprende un promotor unido operativamente al ADNc de NtMRP o fragmentos de este. Diversas modalidades se dirigen a vectores de expresión para promover la cosupresión de genes endógenos de NtMRP que comprenden: un promotor unido operativamente a NtMRP (por ejemplo, ADNc de NtMRP) identificado como sec. con núm. de ident.: 1, sec. con núm. de ident.: 2, sec. con núm. de ident.: 28, sec. con núm. de ident.: 29 o sec. con núm. de ident.: 51 o un fragmento de esta - tal como cualquiera de secs. con núms. de ident.: 3 a 23 o de 30 a 50 - o una variante de estas que tiene al menos aproximadamente 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con ellas.
Varias modalidades se dirigen a métodos para modular (por ejemplo, reducir o inhibir) el nivel de expresión de polinucleótido NtMRP mediante la integración de múltiples copias de polinucleótido NtMRP (por ejemplo, ADNc de NtMRP) identificado como sec. con núm. de ident.: 1, sec. con núm. de ident.: 2, sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29 o sec. con núm. de ident.: 51 o un fragmento de estas - tal como cualquiera de secs. con núms. de ident.: 3 a 23 o de 30 a 50 - o una variante de estas que tiene al menos aproximadamente 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con estas en el genoma de una planta, que comprende: transformar una célula vegetal huésped con un vector de expresión que comprende un promotor unido operativamente a sec. con núm. de ident.: 1, sec. con núm. de ident.: 2, sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29 o sec. con núm. de ident.: 51 o un fragmento de estas - tal como cualquiera de secs. con núms. de ident.: 3 a 23 o de 30 a 50 - o una variante de estas que tiene al menos aproximadamente 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con ellas.
Se proporcionan diversas composiciones y métodos para reducir el nivel de expresión génica endógena de NtMRP mediante la inhibición de la traducción de ARNm de NtMRP. Una célula vegetal huésped puede transformarse con un vector de expresión que comprende: un promotor unido operativamente a un polinucleótido NtMRP o una variante o fragmento de este, ubicado en orientación antisentido con respecto al promotor para permitir la expresión de polinucleótidos de ARN que tienen una secuencia complementaria a una porción de ARNm de NtMRP.
Diversos vectores de expresión para inhibir la traducción de ARNm de NtMRP pueden comprender: un promotor unido operativamente a NtMRP (por ejemplo, ADNc de NtMRP) identificada como sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: 2 o sec. con núm. de ident.: 27 o sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29 o sec. con núm. de ident.: 51 o un fragmento de estas - tales como cualquiera de secs. con núms. de ident.: 3 a 23 o de 30 a 50 - o una variante de estas que tiene al menos aproximadamente 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con ellas en los cuales la secuencia se ubica en orientación antisentido con respecto al promotor. Las longitudes de los polinucleótidos de ARN de NtMRP antisentido pueden variar, y pueden ser de aproximadamente 15-20 nucleótidos, aproximadamente 20-30 nucleótidos, aproximadamente 30-50 nucleótidos, aproximadamente 50-75 nucleótidos, aproximadamente 75-100 nucleótidos, aproximadamente 100-150 nucleótidos, aproximadamente 150-200 nucleótidos, y aproximadamente 200-300 nucleótidos.
Se proporcionan, además, métodos para obtener polinucleótidos y polipéptidos NtMRP mutantes. Cualquier planta de interés, lo que incluye una célula vegetal o material vegetal puede modificarse genéticamente por diversos métodos conocidos para inducir mutagénesis, lo que incluye mutagénesis dirigida a un sitio, mutagénesis dirigida a un oligonucleótido, mutagénesis dirigida químicamente, mutagénesis dirigida por radiación, mutagénesis que usa bases modificadas, mutagénesis que usa ADN híbrido con brechas, mutagénesis por ruptura de la doble cadena, mutagénesis que usa cepas huéspedes deficientes en la reparación, mutagénesis por síntesis génica total, barajado de ADN y otros métodos equivalentes.
Alternativamente, el direccionamiento a los genes NtMRP puede ser por inactivación mediante la introducción de transposones (por ejemplo, elementos IS) en los genomas de plantas de interés. Estos elementos genéticos móviles pueden introducirse por fecundación cruzada sexual y los mutantes por inserción pueden tamizarse para determinar la pérdida de la actividad de proteína NtMRP, tal como una reducción del transporte de cadmio. El gen NtMRP interrumpido en una planta parental puede introducirse en otras plantas mediante el cruzamiento de la planta parental con una planta no sujeta a mutagénesis inducida por transposones mediante, por ejemplo, fertilización cruzada sexual. Puede usarse cualquier técnica de mejoramiento estándar conocida por los expertos en la técnica.
En una modalidad, uno o más genes relacionados con NtMRP pueden inactivarse mediante la inserción de uno o más transposones. Las mutaciones pueden resultar en interrupción homocigótica de uno o más genes NtMRP, en interrupción heterocigótica de uno o más genes NtMRP, o una combinación de ambas interrupciones homocigótica y heterocigótica si se interrumpe más de un gen NtMRP. Los elementos transponibles adecuados pueden seleccionarse de dos amplias clases, designadas como Clase I y Clase II. Los elementos transponibles de Clase I adecuados incluyen retrotransposones, retroposones, y elementos similares a SINE. Tales métodos se conocen por los expertos en la técnica.
Alternativamente, el direccionamiento a los genes NtMRP puede ser por inactivación mediante la introducción de ribozimas derivadas a partir de un número de ARN circulares pequeños que son capaces de autoescindirse y replicarse en plantas. Estos ARN pueden replicarse lo mismo solos (ARN viroides) o con un virus auxiliar (ARN satélites). Los ejemplos de ARN adecuados incluyen los derivados del viroide del veteado marrón rojizo del aguacate y ARN satélites derivados de virus de la mancha de anillo del tabaco, virus del veteado transitorio de la alfalfa, virus del moteado del tabaco suave, virus del moteado nodoso de flor del género Solanum, y virus del moteado del trébol subterráneo. Varias ribozimas específicas de ARN objetivo se conocen por los expertos en la técnica.
En algunas modalidades, la expresión de un polipéptido NtMRP se modula, reduce o inhibe por medios no transgénicos, tales como la creación de una mutación en un gen NtMRP, lo que incluye un gen NtMRP3 y/o NtMRP4. Los métodos que introducen una mutación de manera aleatoria en una secuencia génica pueden incluir mutagénesis química, mutagénesis EMS y mutagénesis por radiación. Los métodos que introducen una o más mutaciones dirigidas en una célula incluyen, pero no se limitan a tecnología de edición de genomas, particularmente la mutagénesis mediada por nucleasas con dedos de zinc, direccionamiento a lesiones locales inducidas en genomas (tilling), recombinación homóloga, mutagénesis dirigida a oligonucleótidos, y mutagénesis mediada por meganucleasas.
Algunos ejemplos de mutaciones son deleciones, inserciones y mutaciones sin sentido de al menos un nucleótido, polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) y una repetición de una secuencia simple. Después de la mutación, puede realizarse el tamizaje para identificar deleciones que crean codones de parada prematuros o de cualquier otra manera genes no funcionales de NtMRP. El tamizaje de mutantes puede llevarse a cabo mediante secuenciación, o mediante el uso de una o más sondas o cebadores específicos para el gen o proteína NtMRP. Además, pueden crearse mutaciones específicas en polinucleótidos NtMRP que pueden dar como resultado una expresión disminuida del gen NtMRP, disminución de la estabilidad del ARNm de NtMRP o disminución de la estabilidad de la proteína NtMRP. Dichas plantas se refieren en la presente descripción como plantas "de origen no natural" o plantas mutantes.
Las plantas mutantes y de origen no natural pueden tener cualquier combinación de una o más mutaciones que da como resultado niveles de polipéptido NtMRP reducidos. Por ejemplo, las plantas pueden tener una única mutación en un solo gen NtMRP o mutaciones múltiples en un solo gen NtMRP. En consecuencia, se describen plantas mutantes o de origen no natural (por ejemplo, plantas de tabaco mutantes, de origen no natural o transgénicas y similares, como se describen en la presente descripción) que comprenden las variantes de polipéptidos mutantes de NtMRP, NtMRP3 y NtMRP4.
Se describe que se produce mutagénesis en semillas de plantas y después se cultivan para obtener plantas mutantes de la primera generación. Después, se deja que las plantas de la primera generación se autopolinicen y las semillas de la planta de la primera generación se cultivan para obtener plantas de la segunda generación, que después se analizan en busca de mutaciones en sus loci de NtMRP. Aunque el material vegetal con mutaciones puede analizarse en busca de mutaciones, una ventaja del análisis de las plantas de la segunda generación es que todas las mutaciones somáticas corresponden a mutaciones de la línea germinal. Un experto en la técnica comprenderá que una variedad de materiales vegetales, lo que incluye pero no se limita a, semillas, polen, tejido vegetal o células vegetales, puede someterse a mutagénesis con el objetivo de crear las plantas mutadas de NtMRP. Sin embargo, el tipo de material vegetal que se somete a mutagénesis puede afectar cuando el polinucleótido vegetal se analiza en busca de mutaciones. Por ejemplo, cuando el polen se somete a mutagénesis antes de la polinización de una planta sin mutaciones, las semillas que resultan de esa polinización se cultivan para obtener plantas de la primera generación. Cada célula de las plantas de la primera generación contendrán mutaciones creadas en el polen; así estas plantas de la primera generación pueden analizarse después en busca de mutaciones de NtMRP en lugar de esperar hasta la segunda generación.
Los mutágenos que crean principalmente mutaciones puntuales y deleciones, inserciones, transversiones, y/o transiciones cortas, lo que incluye mutágenos químicos o radiación, pueden usarse para crear las mutaciones. Los mutágenos incluyen, pero no se limitan a, metanosulfato de etilo (e Ms ), sulfonato de metilmetano (MMS), N-etil-N-nitrosourea (ENU), trietilmelamina (TEM), N-metil-N-nitrosourea (MNU), procarbazina, clorambucil, ciclofosfamida, sulfato de dietilo, monómero de acrilamida, melfalano, mostaza de nitrógeno, vincristina, dimetilnitrosamina, N-metil-N'-nitro-nitrosoguanidina (MNNG), nitrosoguanidina, 2-aminopurina, 7,12 dimetil-benz(a)antraceno (DMBA), óxido de etileno, hexametilfosforamida, bisulfano, diepoxialcanos (diepoxioctano (DEO), diepoxibutano (BEB), y similares), dihidrocloruro 2-metoxi-6-cloro-9[3-(etil-2-cloro-etil)aminopropilamino]acridina (ICR-170) y formaldehído. Además, se contemplan las mutaciones espontáneas en el locus de NtMRP que pueden no haber sido causadas directamente por el mutágeno siempre y cuando resulten en el fenotipo deseado descrito en la presente descripción. Los agentes mutagénicos adecuados incluyen además, por ejemplo, radiación ionizante - tal como rayos X, rayos gamma, radiación con neutrones rápidos y radiación UV.
Cualquier método de preparación de polinucleótidos vegetales, conocido por los expertos en la técnica, puede usarse para preparar el polinucleótido vegetal para el tamizaje de mutaciones de NtMRP.
El polinucleótido preparado a partir de plantas individuales puede mezclarse opcionalmente para acelerar el tamizaje de mutaciones en el gen NtMRP de toda la población de plantas que se originan a partir del tejido vegetal sometido a mutagénesis. Pueden tamizarse una o más generaciones posteriores de plantas, células vegetales o material vegetal. El tamaño del grupo mezclado opcionalmente depende de la sensibilidad del método de tamizaje usado.
Después que las muestras de polinucleótidos se agrupan opcionalmente, pueden someterse a técnicas de amplificación específicas de polinucleótidos NtMRP, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Pueden usarse cualquiera o más cebadores o sondas específicos para el gen NtMRP o las secuencias adyacentes inmediatamente al gen NtMRP para amplificar las secuencias de NtMRP dentro de la muestra de polinucleótidos mezclada. Preferentemente, el uno o más cebadores o sondas se diseñan para amplificar las regiones del locus NtMRP donde es más probable que surjan mutaciones útiles. Con la máxima preferencia, el uno o más cebadores o sondas se diseñan para detectar mutaciones dentro de las regiones exónicas del polinucleótido NtMRP. Además, se prefiere que el uno o más cebadores o sondas eviten los sitios polimórficos conocidos para facilitar el tamizaje de las mutaciones puntuales. Para facilitar la detección de los productos de amplificación, el uno o más cebadores o sondas pueden marcarse con el uso de cualquier método de marcaje convencional. Uno o más cebadores o sondas pueden diseñarse en base a las secuencias de NtMRP descritas en la presente descripción mediante el uso de métodos que se conocen bien en la técnica. Los polimorfismos pueden identificarse por medios conocidos en la técnica.
En un aspecto adicional se proporciona un método para preparar una planta mutante. El método implica proporcionar al menos una célula de una planta que comprende un gen que codifica un polipéptido NtMRP funcional. Seguidamente, al menos una célula de la planta se trata en condiciones eficaces para modular la actividad del gen NtMRP. La al menos una célula vegetal mutante se propaga después para obtener una planta mutante, donde la planta mutante tiene un nivel modulado del (de los) polipéptido(s) de NtMRP en comparación con el de una planta control. En una modalidad de este método para crear una planta mutante, la etapa de tratamiento implica someter al menos una célula a un agente mutagénico químico como se describió anteriormente y en condiciones efectivas para obtener al menos una célula vegetal mutante. En otra modalidad de este método, la etapa de tratamiento implica someter al menos una célula a una fuente de radiación en condiciones efectivas para obtener al menos una célula vegetal mutante. El término "planta mutante" incluye plantas mutantes en las cuales el genotipo se modifica en comparación con una planta control, convenientemente por medios diferentes a la ingeniería genética o modificación genética.
En ciertas modalidades, la planta mutante será la misma o sustancialmente la misma que la planta antes de la mutagénesis.
En ciertas modalidades, las plantas mutantes pueden tener una o más mutaciones localizadas en más de una región de la planta - tal como dentro de la secuencia del polinucleótido NtMRP y en una o más regiones adicionales del genoma. De conformidad con esta modalidad, la secuencia genómica restante de la planta mutante no será la misma o no será esencialmente la misma que la planta antes de la mutagénesis. En ciertas modalidades, las plantas mutantes pueden no tener una o más mutaciones en uno o más, dos o más, tres o más, cuatro o más o cinco o más exones del polinucleótido NtMRP; o puede no tener una o más mutaciones en uno o más, dos o más, tres o más, cuatro o más o cinco o más intrones del polinucleótido NtMRP; o puede no tener una o más mutaciones en un promotor del polinucleótido NtMRP; o puede no tener una o más mutaciones en la región 3' no traducida del polinucleótido NtMRP; o puede no tener una o más mutaciones en la región 5' no traducida del polinucleótido NtMRP; o puede no tener una o más mutaciones en la región de codificación del polinucleótido NtMRP; o puede no tener una o más mutaciones en la región no codificante del polinucleótido NtMRP; o cualquier combinación de dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más; o seis o más de partes de estos.
Las proteínas con dedos de zinc pueden usarse para modular (por ejemplo, reducir o inhibir) la expresión o la actividad de NtMRP. En varias modalidades, una secuencia de polinucleótido genómico que comprende una parte o toda la secuencia codificante del polinucleótido NtMRP se modifica por mutagénesis mediada por nucleasas con dedos de zinc. En la secuencia de polinucleótido genómico se busca un sitio único para la unión de proteínas con dedos de zinc. Alternativamente, en la secuencia de polinucleótido genómico se buscan dos sitios únicos para la unión de proteínas con dedos de zinc en donde ambos sitios están en cadenas opuestas y muy juntos, por ejemplo, separados por 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más pares de bases. En consecuencia, se proporcionan las proteínas con dedos de zinc que se unen a los polinucleótidos NtMRP. Un dominio o motivo de unión a ADN del dedos de zinc consiste en aproximadamente 30 aminoácidos que se pliegan en una estructura beta-beta-alfa de la cual la hélice alfa (a-hélice) se inserta en la doble hélice del a Dn . Una “hélice alfa” se refiere a un motivo en la estructura secundaria de una proteína que se enrolla a la derecha o a la izquierda en la cual el hidrógeno de cada grupo N-H de un aminoácido se une al grupo C=O de un aminoácido en la posición -4 con relación al primer aminoácido. Un “barril beta” (barril p) como se usa en la presente se refiere a un motivo en la estructura secundaria de una proteína que comprende dos cadenas beta (cadenas p) en las cuales la primera cadena se une por hidrógeno a una segunda cadena para formar una estructura cerrada. Una “estructura beta-beta-alfa” como se usa en la presente se refiere a una estructura en una proteína que consiste en un barril p que comprende dos cadenas p antiparalelas y una hélice a. El término “dominio con dedos de zinc de unión al ADN” se refiere a un dominio de proteína que comprende un ion de zinc y es capaz de unirse a una secuencia específica de ADN de tres pares de bases. El término “dominio con dedos de zinc de unión al ADN, de origen no natural” se refiere a un dominio con dedos de zinc de unión al ADN que no se produce en la célula u organismo que comprende el ADN que se modificará.
Los aminoácidos clave dentro de un dominio o motivo con dedos de zinc de unión al ADN que se unen a la secuencia de tres pares de bases dentro del ADN objetivo, son aminoácidos -1, 1, 2, 3, 4, 5 y 6 con relación al comienzo de la hélice alfa (a-hélice). Los aminoácidos en la posición -1, 1, 2, 3, 4, 5 y 6 con relación al comienzo de la hélice a de un dominio o motivo con dedos de zinc de unión al ADN pueden modificarse mientras se mantenga la cadena principal de barril-beta (barril-p) para generar nuevos dominios o motivos de unión a ADN que se unen a una secuencia de tres pares de bases diferente. Dicho nuevo dominio de unión a ADN puede ser un dominio con dedos de zinc de unión al ADN, de origen no natural. Además del reconocimiento de la secuencia de tres pares de bases por los aminoácidos en la posición -1, 1, 2, 3, 4, 5 y 6 con relación al comienzo de la ahélice, algunos de estos aminoácidos pueden también interactuar con un par de bases fuera del sitio de reconocimiento de la secuencia de tres pares de bases. Mediante la combinación de dos, tres, cuatro, cinco, seis o más dominios o motivos con dedos de zinc de unión a ADN, puede generarse una proteína con dedos de zinc que se une específicamente a una secuencia de ADN más larga. Por ejemplo, una proteína con dedos de zinc que comprende dos dominios o motivos con dedos de zinc de unión a ADN puede reconocer una secuencia de seis pares de bases específica y una proteína con dedos de zinc que comprende cuatro dominios o motivos con dedos de zinc de unión a ADN puede reconocer una secuencia específica de doce pares de bases. Una proteína con dedos de zinc puede comprender dos o más dominios o motivos con dedos de zinc de unión a ADN naturales o dos o más dominios o motivos con dedos de zinc de unión a ADN no naturales derivados de una proteína con dedos de zinc naturales o de tipo silvestre mediante truncamiento o expansión o proceso de mutagénesis dirigida a sitio acoplado a un método de selección tal como, pero no limitado a, selección de presentación de fagos, selección de dos híbridos bacterianos o selección de un híbrido bacteriano o cualquier combinación de dominios de dedos de zinc de unión a ADN naturales y no naturales. "Truncamiento" como se usa dentro de este contexto se refiere a una proteína con dedos de zinc que contiene menos del número completo de dominios o motivos con dedos de zinc de unión a ADN que se encuentran en la proteína natural de dedos de zinc. Expansión, como se usa dentro de este contexto se refiere a una proteína con dedos de zinc que contiene más del número completo de dominios o motivos con dedos de zinc de unión a ADN que se encuentran en la proteína natural con dedos de zinc. Las técnicas para seleccionar una secuencia de polinucleótidos dentro de una secuencia genómica para la unión a proteínas con dedos de zinc se conocen en la técnica.
En la técnica se conocen métodos para el diseño de dominios de proteínas con dedos de zinc que se unen a secuencias de nucleótidos específicas que son únicas para un gen objetivo. Se ha calculado que una secuencia que comprende 18 nucleótidos es suficiente para especificar una localización única en el genoma de organismos superiores. Típicamente, por lo tanto, los dominios de proteína con dedos de zinc contienen 6 dedos de zinc, cada uno con su hélice alfa diseñada específicamente para la interacción con un triplete en particular. Sin embargo, en algunos casos, puede ser conveniente una secuencia objetivo de nucleótidos más corta o más larga. Por lo tanto, los dominios de dedos de zinc en las proteínas pueden contener de 2 a 12 dedos - tal como 3 a 8 dedos, 5 a 7 dedos o 6 dedos.
Las proteínas con dedos de zinc de uso pueden comprender al menos un polipéptido con dedos de zinc unido a través de un enlazador, preferentemente un enlazador flexible, a al menos un segundo dominio de unión a ADN, que opcionalmente es un segundo polipéptido con dedos de zinc. La proteína con dedos de zinc puede contener más de dos dominios de unión al ADN, así como también uno o más dominios reguladores. Los polipéptidos con dedos de zinc pueden modificarse genéticamente para reconocer un sitio objetivo seleccionado en el gen de elección.
En una modalidad, la proteína con dedos de zinc comprende un marco (o cadena principal) derivado de una proteína con dedos de zinc de origen natural. Puede usarse un marco (o cadena principal) derivado de cualquier proteína con dedos de zinc que se produce de manera natural. Por ejemplo, puede usarse la proteína con dedos de zinc que comprende un marco (o cadena principal) derivado de una proteína con dedos de zinc que comprende un motivo C2H2.
En otra modalidad específica, la proteína con dedos de zinc comprende un marco (o cadena principal) derivado de una proteína con dedos de zinc que es funcional naturalmente en células vegetales. Por ejemplo, la proteína con dedos de zinc puede comprender un dedos de zinc C3H, un motivo QALGGH, un motivo de dedos de zinc RING-H2, un motivo C2H2 de 9 aminoácidos, un motivo de dedos de zinc de Arabidopsis LSD1 y un motivo de dedos de zinc del dominios de proteínas BBF/Dof.
La proteína con dedos de zinc puede proporcionarse a las células vegetales mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, la proteína con dedos de zinc puede añadirse exógenamente a las células vegetales y las células vegetales se mantienen en condiciones tales que la proteína con dedos de zinc se une a la secuencia nucleotídica objetivo y regula la expresión del gen objetivo en las células vegetales. Alternativamente, una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína con dedos del zinc puede expresar las células vegetales y las células vegetales se mantienen en condiciones de manera que la proteína con dedos de zinc se expresa en la secuencia de los nucleótidos objetivo y regula la expresión del gen objetivo en las células vegetales.
El gen de dedos de zinc puede expresarse en una planta mediante el uso de cualquier vector de expresión de planta adecuado. Los vectores típicos útiles para la expresión de genes en plantas superiores se conocen bien en la técnica. Además de los dominios reguladores, a menudo la proteína con dedos de zinc puede expresarse como una proteína de fusión con proteína de unión a maltosa ("MBP"), glutatión S transferasa (GST), hexahistidina, c-myc o el epítopo FLAG, para facilitar la purificación, monitoreo de expresión o monitoreo de localización celular y subcelular. En una modalidad, se produce una planta mutada o de origen no natural o una célula vegetal mutada o de origen no natural mediante mutagénesis mediada por nucleasa con dedos de zinc.
En modalidades específicas, una secuencia de ADN genómico que comprende una parte o toda la secuencia codificante del polinucleótido NtMRP se modifica por mutagénesis mediada por nucleasas con dedos de zinc. En la secuencia de ADN genómico se busca un sitio único para la unión de proteínas con dedos de zinc. Alternativamente, en la secuencia de ADN genómico se buscan dos sitios únicos para la unión de proteínas con dedos de zinc en donde ambos sitios están en cadenas opuestas y muy juntos. Los dos sitios objetivo de proteína con dedos de zinc pueden separarse por 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más pares de bases. El sitio de unión de proteína con dedos de zinc puede estar en la secuencia codificante de la secuencia del gen NtMRP o un elemento regulador que controla la expresión del gen NtMRP, tal como, pero sin limitación, a la región promotora del gen NtMRP. Particularmente, una o ambas proteínas con dedos de zinc son proteínas con dedos de zinc no naturales.
En consecuencia, la presente descripción proporciona proteínas con dedos de zinc que se unen a los polinucleótidos NtMRP.
Se contempla que un método para mutar una secuencia génica, tal como una secuencia de ADN genómico, que codifica el gen NtMRP mediante mutagénesis mediada por nucleasa con dedos de zinc comprende opcionalmente una o más de las etapas siguientes: (i) proporcionar al menos dos proteínas con dedos de zinc que se unen selectivamente a diferentes sitios objetivo en la secuencia del gen; (ii) construir dos constructos de expresión que codifican cada uno una nucleasa con dedos de zinc diferente que comprende una de las dos proteínas con dedos de zinc no naturales diferentes de la etapa (i) y una nucleasa, unida operativamente a secuencias de control de expresión operables en una célula vegetal; (iii) introducir los dos constructos de expresión en una célula vegetal en donde se producen las dos nucleasas con dedos de zinc diferentes, de manera que se introduce una rotura bicatenaria en la secuencia de ADN genómico en el genoma de la célula vegetal, en o cerca de al menos uno de los sitios objetivo. La introducción de los dos constructos de expresión en la célula vegetal puede llevarse a cabo de forma simultánea o secuencial, lo que incluye opcionalmente la selección de las células que tomaron el primer constructo.
Una ruptura bicatenaria (DSB) como se usa en la presente, se refiere a una ruptura en ambas cadenas del ADN o ARN. La ruptura bicatenaria puede producirse en la secuencia de ADN genómico en un sitio que es de no más de entre 5 pares de bases y 1500 pares de bases, particularmente no más de entre 5 pares de bases y 200 pares de bases, particularmente no más de entre 5 pares de bases y 20 pares de bases eliminados de uno de los sitios objetivo. La rotura bicatenaria puede facilitar la unión de extremos no homólogos que conduce a una mutación en la secuencia de ADN genómico en o cerca del sitio objetivo. "Unión de extremos no homólogos (NHEJ)" como se usa en la presente se refiere a un mecanismo de reparación que repara una rotura bicatenaria mediante ligadura directa sin la necesidad de un molde homólogo, y puede ser por lo tanto mutágeno con relación a la secuencia antes de que se produzca la rotura bicatenaria.
El método puede comprender opcionalmente, además, la etapa de (iv) introducir en la célula vegetal un polinucleótido que comprende al menos una primera región de homología con una secuencia de nucleótidos aguas arriba de la ruptura bicatenaria y una segunda región de homología con una secuencia de nucleótidos aguas abajo de la ruptura bicatenaria. El polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de polinucleótido NtMRP que contiene una deleción o una inserción de secuencias de nucleótidos heterólogas. El polinucleótido puede por lo tanto facilitar la recombinación homóloga en o cerca del sitio objetivo, lo que da como resultado la inserción de una secuencia heteróloga en el genoma o la deleción de la secuencia de ADN genómico del genoma. La secuencia de ADN genómico resultante en la célula vegetal puede comprender una mutación que interrumpe la actividad enzimática de una proteína de NtMRP mutante expresada, un codón de terminación de la traducción temprana o un motivo de secuencia que interfiere con el procesamiento adecuado de pre-ARNm en un ARNm que da como resultado expresión reducida o inactivación del gen. Los expertos en la técnica conocen métodos para alterar la síntesis de proteínas mediante la mutación de una secuencia genética que codifica una proteína.
Puede construirse una nucleasa con dedos de zinc mediante la creación de una fusión de un primer polinucleótido que codifica una proteína con dedos de zinc que se une a un polinucleótido NtMRP, y un segundo polinucleótido que codifica una endonucleasa inespecífica tal como, pero no se limita a, aquellas endonucleasas de Tipo IIS. Una endonucleasa de tipo IIS es una enzima de restricción que tiene un dominio de reconocimiento separado y un dominio de escisión de endonucleasa en donde la enzima escinde ADN en sitios que se eliminan del sitio de reconocimiento. Los ejemplos no limitantes de endonucleasas tipo IIS pueden ser, pero no se limitan a, AarI, BaeI, CdiI, DrdII, EciI, FokI, FauI, GdiII, HgaI, Ksp632I, MboII, Pfl1108I, Rle108I, RleAI, SapI, TspDTI o UbaPI.
Se conocen en la técnica métodos para el diseño y construcción de proteínas de fusión, métodos para la selección y separación del dominio de endonucleasa del dominio de reconocimiento de secuencia de una endonucleasa de tipo IIS, métodos para el diseño y construcción de una nucleasa con dedos de zinc que comprende una proteína de fusión de una proteína con dedos de zinc y una endonucleasa. En una modalidad específica, el dominio de nucleasa en una nucleasa con dedos de zinc es FokI. Una proteína de fusión entre una proteína con dedos de zinc y la nucleasa de FokI puede comprender un espaciador que consiste de dos pares de bases o alternativamente, el espaciador puede consistir en tres, cuatro, cinco, seis, o más pares de bases. En una modalidad, se describe una proteína de fusión con un espaciador de siete pares de bases de manera que la endonucleasa de una primera nucleasa con dedos de zinc puede dimerizarse tras entrar en contacto con una segunda nucleasa con dedos de zinc, en donde las dos proteínas con dedos de zinc que forman dichas nucleasas con dedos de zinc pueden unirse aguas arriba y aguas abajo de la secuencia de ADN objetivo. Tras la dimerización, una nucleasa con dedos de zinc puede introducir una ruptura bicatenaria en una secuencia de nucleótidos objetivo que puede seguirse por la unión de extremos no homólogos o recombinación homóloga con una secuencia de nucleótidos exógena que tiene homología con las regiones que flanquean ambos lados de la rotura bicatenaria.
En aún otra modalidad, se proporciona una proteína de fusión que comprende una proteína con dedos de zinc y una proteína potenciadora lo que da como resultado un activador con dedos de zinc. Un activador con dedos de zinc puede usarse para regular o activar la transcripción del gen NtMRP, lo que comprende las etapas de (i) diseñar una proteína con dedos de zinc que se une a una región dentro de un promotor o una secuencia unida operativamente a una secuencia de codificación del gen NtMRP, (ii) producir una proteína de fusión entre dicha proteína con dedos de zinc y un activador de transcripción, (iii) producir un constructo de expresión que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica dicho activador con dedos de zinc bajo el control de un promotor activo en una célula, tal como una célula vegetal, (iv) introducir dicho constructo génico en la célula, y (v) cultivar la célula y permitir la expresión del activador con dedos de zinc, y (vi) caracterizar la célula que tiene una expresión incrementada de proteína NtMRP.
En aún otra modalidad, la descripción proporciona una proteína de fusión que comprende una proteína con dedos de zinc y un represor de gen lo que da como resultado un represor con dedos de zinc. Un represor con dedos de zinc puede usarse para regular negativamente o reprimir la transcripción del polinucleótido NtMRP , lo que comprende las etapas de (i) diseñar genéticamente una proteína con dedos de zinc que se une a una región dentro de un promotor o una secuencia unida operativamente al polinucleótido NtMRP, y (ii) preparar una proteína de fusión entre dicha proteína con dedos de zinc y un represor de transcripción, y (iii) desarrollar un constructo génico que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica dicho represor con dedos de zinc bajo el control de un promotor activo en una célula, tal como una célula vegetal, e (iv) introducir dicho constructo génico en la célula, y (v) proporcionar la expresión del represor con dedos de zinc, y (vi) caracterizar la célula que tiene una transcripción reducida del polinucleótido NtMRP.
En aún otra modalidad, la descripción proporciona una proteína de fusión que comprende una proteína con dedos de zinc y una metilasa lo que da como resultado una metilasa con dedos de zinc. La metilasa con dedos de zinc puede usarse para regular negativamente o inhibir la expresión del polinucleótido NtMRP en una célula, tal como una célula vegetal, mediante la metilación de una región dentro de la región promotora del polinucleótido NtMRP, lo que comprende las etapas de (i) diseñar una proteína con dedos de zinc que puede unirse a una región dentro de un promotor de polinucleótido NtMRP, y (ii) producir una proteína de fusión entre dicha proteína con dedos de zinc y una metilasa, y (iii) desarrollar un constructo génico que contiene un polinucleótido que codifica dicha metilasa con dedos de zinc bajo el control de un promotor activo en la célula, e (iv) introducir dicho constructo génico en la célula, y (v) permitir la expresión de la metilasa con dedos de zinc, y (vi) caracterizar la célula que tiene expresión reducida o esencialmente nula de proteína NtMRP en la célula.
En diversas modalidades, puede seleccionarse una proteína con dedos de zinc de acuerdo con los métodos descritos en la presente descripción para unirse a una secuencia reguladora de polinucleótidos NtMRP. Más específicamente, la secuencia regulatoria puede comprender un sitio de iniciación de la transcripción, un codón de iniciación, una región de un exón, un límite de un exón-intrón, un terminador, o un codón de parada. La proteína con dedos de zinc puede fusionarse con una nucleasa, un activador o una proteína represora.
En diversas modalidades, una nucleasa con dedos de zinc introduce una ruptura bicatenaria en una región reguladora, una región codificante, o una región no codificante de una secuencia de ADN genómico del polinucleótido NtMRP, y conduce a una reducción, una inhibición o una inhibición sustancial del nivel de expresión del polinucleótido NtMRP, o una reducción, una inhibición o una inhibición sustancial de la actividad de la proteína codificada de esta manera.
La descripción proporciona, además, un método para modificar una célula, tal como una célula vegetal, en donde el genoma de la célula vegetal se modifica por mutagénesis mediada por nucleasa con dedos de zinc, que comprende (a) identificar y producir al menos dos proteínas con dedos de zinc no naturales que se unen selectivamente a diferentes sitios objetivo para la modificación en la secuencia de nucleótidos genómica; (b) expresar al menos dos proteínas de fusión que comprenden cada una nucleasa y una de las al menos dos proteínas con dedos de zinc no naturales en la célula vegetal, de manera que se introduce una ruptura bicatenaria en la secuencia de nucleótidos genómica en el genoma de la planta, particularmente en o cerca de un sitio objetivo en la secuencia de nucleótidos genómicos; y, opcionalmente (c) introducir en la célula un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende una primera región de homología con una secuencia aguas arriba de la rotura bicatenaria y una segunda región de homología con una región aguas abajo de la rotura bicatenaria, de manera que el polinucleótido se recombina con ADN en el genoma. Además, se describen células que comprenden uno o más constructos de expresión que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican una o más de las proteínas de fusión.
En otro aspecto, la descripción proporciona además métodos para producir plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas o modificadas genéticamente de cualquier otra manera mediante el uso de meganucleasas, tales como I-CreI. Las meganucleasas de origen natural así como también las meganucleasas recombinantes pueden usarse para provocar de manera específica una ruptura de la doble cadena en un solo sitio o en relativamente pocos sitios en el ADN genómico de una planta para permitir la interrupción de un gen NtMRP. La meganucleasa puede ser una meganucleasa diseñada genéticamente con propiedades de reconocimiento al ADN alteradas. Las proteínas meganucleasas pueden suministrarse a las células vegetales mediante una variedad de mecanismos diferentes conocidos en la técnica.
La meganucleasa puede ser una meganucleasa diseñada genéticamente con propiedades de reconocimiento al ADN alteradas. Esta cita describe métodos para el diseño genético basado en la estructura de meganucleasas derivadas de la meganucleasa I-CreI de origen natural. Estas meganucleasas diseñadas genéticamente pueden hacerse para reconocer y cortar secuencias de ADN de 22 pares de bases predeterminadas que se encuentran en los genomas de las plantas. Las proteínas meganucleasas pueden suministrarse a las células vegetales mediante una variedad de mecanismos diferentes conocidos en la técnica.
Los aspectos de la descripción permiten el uso de meganucleasas para inactivar el polinucleótido NtMRP en una célula o planta vegetal. Los aspectos se refieren, además, a un método para inactivar el polinucleótido NtMRP en una planta mediante el uso de una meganucleasa lo que comprende: (a) proporcionar una célula vegetal que comprende un polinucleótido NtMRP; (b) introducir una meganucleasa o un constructo que codifica una meganucleasa en dicha célula vegetal; y (c) permitir que la meganucleasa inactive el polinucleótido NtMRP.
Las meganucleasas pueden usarse para escindir sitios de reconocimiento de meganucleasas dentro de las regiones codificantes de un polinucleótido NtMRP. Dicha escisión resulta frecuentemente en la deleción de ADN en el sitio de reconocimiento de la meganucleasa después de la reparación mutagénica del ADN por unión de extremos no homólogos. Dichas mutaciones en la secuencia codificante de genes son suficientes típicamente para inactivar el gen. Este método implica, primero, el suministro de un casete de expresión de meganucleasa a una célula vegetal mediante el uso de un método de transformación adecuado. Para lograr la mayor eficiencia, es conveniente unir el casete de expresión de la meganucleasa a un marcador de selección y seleccionar las células transformadas exitosamente en presencia de un agente de selección. Este enfoque resultará en la integración del casete de expresión de meganucleasa en el genoma, sin embargo, podría no ser conveniente si es probable que la planta requiera aprobación regulatoria. En dichos casos, el casete de expresión de meganucleasa (y el gen marcador de selección unido) puede segregarse en posteriores generaciones de plantas mediante el uso de técnicas de mejoramiento convencionales. Alternativamente, las células vegetales pueden transformarse inicialmente con un casete de expresión de meganucleasa que carece de un marcador de selección y pueden cultivarse en medios que carecen de un agente de selección. En tales condiciones, una fracción de las células tratadas adquirirá el casete de expresión de meganucleasa y expresará la meganucleasa diseñada genéticamente de manera transitoria sin integrar el casete de expresión de meganucleasa en el genoma. Debido a que no tiene en cuenta la eficiencia de transformación, este último procedimiento de transformación requiere que se examine un mayor número de células tratadas para obtener la modificación deseada del genoma.
Después del suministro del casete de expresión de meganucleasa, las células vegetales se cultivan, inicialmente, en condiciones que son típicas para el procedimiento de transformación particular que se usó. Esto puede significar cultivar las células transformadas en los medios a temperaturas por debajo de 26 grados C, frecuentemente en la oscuridad. Dichas condiciones estándar pueden usarse durante un período de tiempo, preferentemente 1-4 días, para permitir que la célula vegetal se recupere del proceso de transformación. En cualquier punto después de este período de recuperación inicial, puede aumentarse la temperatura de cultivo para estimular la actividad de la meganucleasa diseñada genéticamente para escindir y mutar el sitio de reconocimiento de la meganucleasa.
Para ciertas aplicaciones, puede ser conveniente eliminar de manera precisa el polinucleótido NtMRP del genoma de la planta. Dichas aplicaciones son posibles mediante el uso de un par de meganucleasas diseñadas genéticamente, cada una de las cuales escinde un sitio de reconocimiento de meganucleasa a cada lado de la deleción deseada.
Los constructos recombinantes proporcionados en la presente descripción pueden usarse para transformar plantas o células vegetales para modular (por ejemplo, reducir o inhibir) los niveles de expresión de la proteína NtMRP. Un constructo de polinucleótidos recombinante puede comprender un polinucleótido que codifica un polipéptido NtMRP como se describe en la presente descripción, unido operativamente a una región reguladora adecuada para expresar el polipéptido NtMRP en la planta o célula. Por lo tanto, un polinucleótido puede comprender una secuencia codificante que codifica el polipéptido NtMRP como se describe en la presente descripción o una variante de esta.
El polipéptido NtMRP codificado por un polinucleótido recombinante puede ser un polipéptido NtMRP nativo, o puede ser heterólogo a la célula. En algunos casos, el constructo recombinante contiene un polinucleótido que reduce o inhibe la expresión de un (unos) polipéptido(s) que modula NtMRP, unido operativamente a una región reguladora. En la presente descripción se describen ejemplos de regiones regulatorias adecuadas.
Se proporcionan, además, vectores que contienen constructos de polinucleótidos recombinantes tales como los descritos en la presente descripción. Las cadenas principales adecuadas del vector incluyen, por ejemplo, las usadas habitualmente en la técnica tales como plásmidos, virus, cromosomas artificiales, BAC, YAC o PAC. Los vectores de expresión adecuados incluyen, sin limitarse a, plásmidos y vectores virales derivados de, por ejemplo, bacteriófago, baculovirus, y retrovirus. Numerosos vectores y sistemas de expresión están disponibles comercialmente.
Los vectores pueden incluir además, por ejemplo, orígenes de replicación, regiones de unión al armazón (SARs) o marcadores. Un gen marcador puede conferir un fenotipo seleccionable en una célula vegetal. Por ejemplo, un marcador puede conferir resistencia a biocidas, tal como resistencia a un antibiótico (por ejemplo, kanamicina, G418, bleomicina, o higromicina), o a un herbicida (por ejemplo, glifosato, clorosulfuron o fosfinotricina). Adicionalmente, un vector de expresión puede incluir una secuencia etiqueta diseñada para facilitar la manipulación o detección (por ejemplo, purificación o localización) del polipéptido expresado. Las secuencias etiquetas, tales como luciferasa, beta-glucuronidasa (GUS), proteína fluorescente verde (GFP), glutatión S-transferasa (GST), polihistidina, secuencias c-myc o hemaglutinina se expresan típicamente como una fusión con el polipéptido codificado. Dichas etiquetas pueden insertarse en cualquier lugar dentro del polipéptido, lo que incluye lo mismo en el carboxilo terminal que en el amino terminal.
Diversas modalidades se dirigen a plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas que se modifican para reducir el nivel de expresión del gen NtMRP mediante diversos métodos que pueden usarse para reducir o silenciar la expresión del gen NtMRP, y de esta manera, producir plantas en las cuales el nivel de expresión de los transportadores NtMRP pueden reducirse dentro de los tejidos vegetales de interés. Las tasas de transporte de metales pesados y los patrones de distribución del transporte de metales pesados, en particular, el transporte de cadmio, pueden alterarse en plantas producidas de acuerdo con los métodos y composiciones descritos.
Diversas modalidades se dirigen a plantas mutantes, plantas de origen no natural o plantas transgénicas modificadas para modular (por ejemplo, reducir o inhibir) los niveles de expresión del gen NtMRP, lo que produce de esta manera plantas - tales como plantas de tabaco - en las cuales se reduce el nivel de expresión de NtMRP dentro de los tejidos vegetales de interés en comparación con una planta control. Las composiciones y los métodos descritos pueden aplicarse a cualquier especie del género Nicotiana, lo que incluye N. rustica y N. tabacum (por ejemplo, La B21, lN KY171, TI 1406, Basma, Galpao, Perique, Beinhart 1000-1, y Petico). Otras especies incluyen N. acaulis, N. acuminata, N. acuminata var. multiflora, N. africana, N. alata, N. amplexicaulis, N. arentsii, N. attenuata, N. benavidesii, N. benthamiana, N. bigelovii, N. bonariensis, N. cavicola, N. clevelandii, N. cordifolia, N. corymbosa, N. debneyi, N. excelsior, N. forgetiana, N. fragrans, N. glauca, N. glutinosa, N. goodspeedii, N. gossei, N. hybrid, N. ingulba, N. kawakamii, N. knightiana, N. langsdorffii, N. linearis, N. longiflora, N. maritima, N. megalosiphon, N. miersii, N. noctiflora, N. nudicaulis, N. obtusifolia, N. occidentalis, N. occidentalis subsp. hesperis, N. otophora, N. paniculata, N. pauciflora, N. petunioides, N. plumbaginifolia, N. quadrivalvis, N. raimondii, N. repanda, N. rosulata, N. rosulata subsp. ingulba, N. rotundifolia, N. setchellii, N. simulans, N. solanifolia, N. spegazzinii, N. stocktonii, N. suaveolens, N. sylvestris, N. thyrsiflora, N. tomentosa, N. tomentosiformis, N. trigonophylla, N. umbratica, N. undulata, N. velutina, N. wigandioides, y N. x sanderae.
El uso de cultivares de tabaco y cultivares de tabaco élite se contemplan, además, en la presente descripción. La planta transgénica, de origen no natural o mutante puede ser, por lo tanto, una variedad de tabaco o un cultivar de tabaco élite que comprende uno o más transgenes, o una o más mutaciones genéticas o sus combinaciones. La(s) mutación(es) genética(s) (por ejemplo, uno o más polimorfismos) pueden ser mutaciones que no existen naturalmente en la variedad de tabaco individual o cultivar de tabaco (por ejemplo, cultivar de tabaco élite) o pueden ser mutación(es) genética(s) que se producen naturalmente siempre y cuando la mutación no se produzca naturalmente en la variedad de tabaco individual o cultivar de tabaco (por ejemplo, cultivar de tabaco élite).
Las variedades particularmente útiles de Nicotiana tabacum incluyen los tabacos tipo Burley, tipo oscuro, tipo curado en atmósfera artificial, y tipo Oriental. Los ejemplos no limitantes de variedades o cultivares son: BD 64, c C 101, CC 200, CC 27, CC 301, CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 800, CC 900, Coker 176, Coker 319, Coker 371 Gold, Coker 48, CD 263, DF911, DT 538 LC Galpao tobacco, GL 26H, GL 350, GL 600, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, HB 04P LC, HB3307PLC, Híbrido 403LC, Híbrido 404LC, Híbrido 501 LC, K 149, K 326, K 346, K 358, K394, K 399, K 730, KDH 959, KT 200, KT204LC, KY10, KY14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, KY907LC, KTY14xL8 LC, Little Crittenden, McNair 373, McNair 944, msKY 14xL8, Narrow Leaf Madole, Narrow Leaf Madole LC, NBH 98, N-126, N-777LC, N-7371LC, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC7, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, NC 2002, Neal Smith Madole, OXFORD 207, PD 7302 LC, PD 7309 LC, PD 7312 LC, tabaco "Perique", PVH03, PVH09, PVH19, PVH50, PVH51, R 610, R 630, R 7-11, R 7-12, RG 17, RG 81, RG H51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, Speight 168, Speight 172, Speight 179, Speight 210, Speight 220, Speight 225, Speight 227, Speight 234, Speight G-28, Speight G-70, Speight H-6, Speight H20, Speight NF3, TI 1406, TI 1269, TN 86, TN86LC, TN 90, TN 97, TN97LC, TN D94, TN D950, TR (Tom Rosson) Madole, VA 309, VA359, AA 37-1, B 13P, Xanthi (Mitchell-Mor), Bel-W3, 79-615, Samsun Holmes NN, KTRDC número 2 Híbrido 49, Burley 21, KY 8959, KY 9, MD 609, PG 01, PG 04, PO1, PO2, PO3, RG 11, RG 8, VA 509, AS44, Banket A1, Basma Drama B84/31, Basma I Zichna ZP4/B, Basma Xanthi BX 2A, Batek, Besuki Jember, C104, Coker 347, Criollo Misionero, Delcrest, Djebel 81, DVH 405, Galpao Comum, HB04P, Hicks Broadleaf, Kabakulak Elassona, Kutsage E1, LA BU 21, NC 2326, NC 297, PVH 2110, Red Russian, Samsun, Saplak, Simmaba, Talgar 28, Wislica, Yayaldag, Prilep HC-72, Prilep P23, Prilep PB 156/1, Prilep P12-2/1, Yaka JK-48, Yaka JB 125/3, TI-1068, KDH-960, TI-1070, TW136, Basma, TKF 4028, L8, TKF 2002, GR141, Basma xanthi, GR149, GR153, Petit Havana. Se contemplan, además, subvariedades de baja conversión de lo anterior, incluso si no se identifican específicamente en la presente descripción.
En un aspecto adicional, se proporciona una planta mutante, de origen no natural o transgénica como se describe en la presente descripción que se ha modificado adicionalmente de manera que también se reduce la expresión de transportadores de NtHMA que puede reducir aún más el contenido de cadmio en la planta. El uso de transportadores de NtHMA para reducir el contenido de cadmio en la planta se describe en el documento WO2009074325. Esto, de acuerdo con una modalidad, se proporciona una célula vegetal mutante, de origen no natural o transgénica que comprende un polinucleótido NtMRP aislado, un gen quimérico NtMRP, un constructo de polinucleótido NtMRP, un ARN bicatenario de NtMRP, un conjugado de NtMRP y/o un vector de expresión de NtMRP conjuntamente con un polinucleótido NtHMA aislado, un gen quimérico de NtHMA, un constructo de polinucleótido NtHMA, un ARN bicatenario de NtHMA, un conjugado de NtHMA y/o un vector de expresión de NtHMA.
Las modalidades se dirigen, además, a composiciones y métodos para producir plantas mutantes, plantas de origen no natural, plantas híbridas o plantas transgénicas que se han modificado para modular (por ejemplo, reducir o inhibir) la expresión o actividad de NtMRP de modo que se acumulen cantidades menores de cadmio en ellas en comparación con un control. En ciertas modalidades, las plantas que se obtienen son similares o iguales sustancialmente en apariencia general (por ejemplo, fenotipo) a las plantas control. Varias características fenotípicas tales como grado de madurez, número de hojas por planta, altura del rabillo, ángulo de inserción de las hojas, tamaño de las hojas (ancho y longitud), distancia de internudos, y relación lámina-nervadura pueden evaluarse mediante observaciones de campo. En una modalidad preferida, la altura o el peso, o la altura y el peso de las plantas, es el mismo sustancialmente que el de las plantas control. En otra modalidad preferida, no se encuentran diferencias significativas en las hojas secas recogidas de las plantas en comparación con un control, lo que indica que la modulación de los transcritos de NtMRP no tiene un efecto relevante estadísticamente sobre la biomasa seca.
Un aspecto es una semilla de la planta mutante, la planta de origen no natural, la planta híbrida o la planta transgénica. Preferentemente, la semilla es una semilla de tabaco. Otro aspecto es el polen o un óvulo de la planta mutante, la planta de origen no natural, la planta híbrida o la planta transgénica. Además, se describe una planta mutante, una planta de origen no natural, una planta híbrida, una planta transgénica que comprende además un polinucleótido que confiere esterilidad masculina.
La descripción proporciona además un cultivo de tejidos de células regenerables de la planta mutante, planta de origen no natural, planta híbrida, o planta transgénica o una parte de estas, cuyo cultivo regenera plantas capaces de expresar todas las características morfológicas y fisiológicas del parental. Las células regenerables incluyen, pero no se limitan a, células de hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocótilos, raíces, extremos de raíces, anteras, flores y una parte de estas, óvulos, brotes, tallos, rabillos, médula y cápsulas o callos o protoplastos derivados de ellos.
En algunas modalidades, una planta en la cual la expresión del polinucleótido NtMRP se modula (por ejemplo, se reduce o inhibe) puede tener niveles disminuidos de metal pesado - tal como cadmio - especialmente en las hojas. El nivel de cadmio puede reducirse en al menos aproximadamente 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o más - tal como 100 %, 125 %, 150 % o 200 % o más en comparación con el nivel de cadmio en una planta control correspondiente en la cual la expresión del polinucleótido NtMRP no se ha modulado (por ejemplo, reducido o inhibido). En algunas modalidades, una planta en la cual la expresión del polinucleótido NtMRP se modula (por ejemplo, se reduce o inhibe) puede tener niveles aumentados o disminuidos de cadmio en las raíces. En algunas modalidades, una planta en la cual la expresión del polinucleótido NtMRP se modula (por ejemplo, se reduce o inhibe) puede tener niveles disminuidos o aumentados de cadmio en las raíces y niveles disminuidos de cadmio en las hojas. En algunas modalidades, una planta en la cual la expresión del polinucleótido NtMRP se modula (por ejemplo, se reduce o inhibe) puede tener niveles disminuidos de cadmio en biomasa cosechable.
La expresión puede evaluarse mediante el uso de métodos que incluyen, por ejemplo, RT-PCR, transferencias de Northern, protección de RNasa, extensiones de cebadores, transferencias Western, electroforesis en gel de proteínas, inmunoprecipitación, inmunoensayos ligados a enzimas, ensayos de chips y espectrometría de masas. Debe señalarse que si un polipéptido se expresa bajo el control de un promotor con preferencia tisular o de amplia expresión, la expresión puede evaluarse en toda la planta o en un tejido seleccionado. De manera similar, si un polipéptido se expresa en un momento particular, por ejemplo, en un momento particular del desarrollo o tras la inducción, la expresión puede evaluarse selectivamente en un periodo de tiempo deseado.
Una población de plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas puede tamizarse o seleccionarse en busca de los miembros de la población que tienen un rasgo o fenotipo deseado. Por ejemplo, una población de la progenie de un solo evento de transformación puede tamizarse para detectar las plantas que tienen un nivel deseado de la expresión del polipéptido o polinucleótido NtMRP. Pueden usarse métodos físicos y bioquímicos para identificar los niveles de expresión. Estos incluyen análisis de Southern o amplificación por PCR para la detección de un polinucleótido; transferencias tipo Northern, protección de S1 RNasa, extensión de cebadores, o amplificación por RT-PCR para detectar transcritos de ARN; ensayos enzimáticos para detectar la actividad de enzima o ribozima de polipéptidos y polinucleótidos; y electroforesis en gel de proteínas, transferencias tipo Western, inmunoprecipitación, e inmunoensayos con unión a enzimas para detectar polipéptidos. Otras técnicas tales como hibridación in situ, tinción enzimática, e inmunotinción pueden usarse además para detectar presencia o expresión de polipéptidos o polinucleótidos.
Una población de plantas puede tamizarse para aquellas plantas que tienen un rasgo deseado, tal como un nivel modulado (por ejemplo, reducido o inhibido) de cadmio. La selección o selección puede llevarse a cabo durante una o más generaciones, o en más de una localización geográfica. En algunos casos, las plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas pueden cultivarse y seleccionarse en condiciones que inducen un fenotipo deseado o son necesarias de cualquier otra manera para producir un fenotipo deseado en una planta mutante, de origen no natural o transgénica. Además, la selección o tamizaje puede aplicarse durante una etapa de desarrollo particular en la cual se espera que el fenotipo sea exhibido por la planta. La selección o tamizaje puede llevarse a cabo para elegir aquellas plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas que tienen una diferencia significativa estadísticamente en su contenido de cadmio en relación con una planta control en la cual la expresión o actividad del polinucleótido o proteína NtMRP no se ha modulado (por ejemplo, reducido o inhibido).
Las plantas y células vegetales mutantes, de origen no natural o transgénicas que se describen en la presente descripción comprenden uno o más polinucleótidos recombinantes - tales como el polinucleótido aislado, el gen quimérico, el constructo polinucleotídico, el ARN bicatenario, el conjugado o el vector de expresión. Una planta o célula vegetal puede transformarse al tener el polinucleótido recombinante integrado en su genoma para convertirse en transformada de manera estable. Las células transformadas de manera estable típicamente retienen el polinucleótido introducido con cada división celular. Una planta o célula vegetal puede, además, transformarse transitoriamente de manera que el polinucleótido recombinante no se integra en su genoma. Las células transformadas de manera transitoria pierden típicamente todo o alguna porción del polinucleótido recombinante introducido con cada división celular, de manera que el polinucleótido recombinante introducido no puede detectarse en las células hijas después de un número suficiente de divisiones celulares.
Las técnicas para introducir polinucleótidos en plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, transformación mediada por Agrobacterium, transformación mediada por vector viral, electroporación y transformación con pistola de partículas. El sistema de Agrobacterium para la integración de polinucleótido foráneo en cromosomas de plantas se ha estudiado, modificado, y explotado extensamente para la ingeniería genética de plantas. Las moléculas de polinucleótido recombinante desnudo que comprenden secuencias de polinucleótido que corresponden a la proteína purificada objetivo unida operativamente, en la orientación sentido o antisentido, a secuencias regulatorias, se unen a secuencias de T-ADN apropiadas mediante métodos convencionales. Estas se introducen en protoplastos de tabaco mediante técnicas con polietilenglicol o mediante técnicas de electroporación, las cuales son estándar. Alternativamente, dichos vectores que comprenden moléculas de polinucleótido recombinante que codifican la proteína objetivo purificada se introducen en células vivas de Agrobacterium, las que después transfieren el polinucleótido dentro de las células vegetales. La transformación por polinucleótido desnudo sin secuencias acompañantes del vector de T-ADN puede llevarse a cabo mediante la fusión de protoplastos con liposomas que contienen polinucleótido o mediante electroporación. El polinucleótido desnudo no acompañado por secuencias del vector de T-ADN puede usarse, además, para transformar células mediante microproyectiles inertes, de velocidad alta.
Si se usa una célula o tejido en cultivo como el tejido recipiente para la transformación, las plantas pueden regenerarse a partir de cultivos transformados si se desea, mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica.
La elección de incluir regiones regulatorias en un constructo recombinante depende de varios factores, lo que incluye, pero no se limita a, eficiencia, selectividad, inducibilidad, nivel de expresión deseado, y expresión preferencial en células o tejidos. Para un experto en la técnica es un asunto de rutina modular la expresión de una secuencia codificante mediante la selección y ubicación apropiada de las regiones regulatorias con relación a la secuencia codificante. La transcripción de un polinucleótido puede modularse de manera similar. Algunas regiones regulatorias adecuadas inician la transcripción solo, o predominantemente, en ciertos tipos celulares. Los métodos para identificar y caracterizar regiones regulatorias en polinucleótidos genómicos de plantas se conocen en la técnica.
Los promotores adecuados incluyen promotores específicos de tejidos reconocidos por factores específicos de tejidos presentes en diferentes tejidos o tipos celulares (por ejemplo, promotores específicos de la raíz, promotores específicos de brotes, promotores específicos de xilema), o presentes durante diferentes etapas del desarrollo, o presentes en respuesta a diferentes condiciones ambientales. Los promotores adecuados incluyen promotores constitutivos que pueden activarse en la mayoría de los tipos celulares sin requerir inductores específicos. Los ejemplos de promotores adecuados para controlar la producción de polipéptidos de ARNi de NtMRP incluyen los promotores de 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV/35S), SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos o los promotores de ubiquitina o faseolina. Los expertos en la técnica son capaces de generar variaciones múltiples de promotores recombinantes.
Los promotores específicos de tejidos son elementos de control transcripcional que solo son activos en células o tejidos particulares en momentos específicos durante el desarrollo de la planta, tal como en tejidos vegetativos o tejidos reproductivos. La expresión específica de tejidos puede ser ventajosa, por ejemplo, cuando se prefiere la expresión de polinucleótidos en ciertos tejidos. Los ejemplos de promotores específicos de tejidos bajo control del desarrollo incluyen promotores que pueden iniciar la transcripción solo (o solo fundamentalmente) en ciertos tejidos, tales como tejidos vegetativos, por ejemplo, raíces u hojas, o tejidos reproductivos, tales como frutos, óvulos, semillas, polen, pistilos, flores, o cualquier tejido embrionario. Los promotores específicos de tejidos reproductivos pueden ser, por ejemplo, específicos de anteras, específicos de óvulos, específicos de embriones, específicos del endospermo, específicos del tegumento, específicos de la cubierta de semillas y de semillas, específicos del polen, específicos de pétalos, específicos de sépalos, o sus combinaciones.
Los promotores específicos de hojas adecuados incluyen el promotor de piruvato, ortofosfato diquinasa (PPDK) de plantas C4 (maíz), promotor cab-m1Ca+2 del maíz, el promotor del gen relacionado con myb de Arabidopsis thaliana (Atmyb5), los promotores de ribulosa bifosfato carboxilasa (RBCS) (por ejemplo, los genes de tomate RBCS 1, RBCS2 y RBCS3A expresados en hojas y plántulas cultivadas a la luz, RBCS1 y RBCS2 expresados en frutos de tomate en desarrollo o el promotor de ribulosa bisfosfato carboxilasa expresado casi exclusivamente en células del mesófilo en las láminas y las vainas foliares en niveles altos).
Los promotores adecuados específicos de la senescencia incluyen un promotor de tomate activo durante la maduración de los frutos, la senescencia y la abscisión de las hojas, un promotor de maíz del gen que codifica una cisteína proteasa. Pueden usarse promotores específicos de anteras adecuados. Pueden seleccionarse promotores adecuados con preferencia por la raíz conocidos por los expertos en la técnica. Los promotores adecuados con preferencia por las semillas incluyen tanto los promotores específicos de semillas (aquellos promotores activos durante el desarrollo de la semilla tales como los promotores de proteínas de almacenamiento en semillas) y promotores de la germinación de semillas (aquellos promotores activos durante la germinación de semillas). Dichos promotores con preferencia por las semillas incluyen, pero no se limitan a, Cim1 (mensaje inducido por citoquinina); cZ19B1 (zeína de 19 kDa de maíz); milps (mio-inositol-1-fosfato sintasa); mZE40-2, conocido además como Zm-40; nuclc; y celA (celulosa sintasa). Gama-zeína es un promotor específico del endospermo. Glob-1 es un promotor específico del embrión. Para las dicotiledóneas, los promotores específicos de semillas incluyen, pero no se limitan a, beta-faseolina de frijol, napin, pp-conglicinina, lectina de frijol de soja, cruciferina, y similares. Para las monocotiledóneas, los promotores específicos de semillas incluyen, pero no se limitan a, un promotor de zeína de 15 kDa de maíz, un promotor de zeína de 22 kDa, un promotor de zeína de 27 kDa, un promotor de g-zeína, un promotor de YY-zeína de 27 kDa (tal como el promotor gzw64A, ver número de acceso al banco de genes S78780), un promotor ceroso, un promotor shrunken 1, un promotor shrunken 2, un promotor de globulina 1 (ver el número de acceso al banco de genes L22344), un promotor Itp2, promotor cim1, promotores de maíz end1 y end2, promotor nuc1, promotor Zm40, eep1 y eep2; promotor lec1, tioredoxina H; promotor mlip15, promotor PCNA2; y el promotor shrunken-2.
Los ejemplos de promotores inducibles incluyen promotores que responden al ataque de patógenos, condiciones anaeróbicas, temperatura elevada, luz, sequía, temperatura fría, o concentración alta de sales. Los promotores inducibles por patógenos incluyen aquellos de las proteínas relacionadas con la patogénesis (proteínas PR), las cuales se inducen después de una infección por un patógeno (por ejemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1,3-glucanasa, quitinasa).
Adicionalmente a los promotores de plantas, otros promotores adecuados pueden derivarse de un origen bacteriano por ejemplo, el promotor de octopina sintasa, el promotor de nopalina sintasa y otros promotores derivados de plásmidos Ti), o pueden derivar de promotores virales (por ejemplo, promotores de ARN 35S y 19S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), promotores constitutivos del virus del mosaico del tabaco, promotores 19S y 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), o el promotor 35S del virus del mosaico de la escrofularia).
Los ejemplos de restos conjugados incluyen compuestos macromoleculares tales como proteínas (por ejemplo, anticuerpos), cadenas de ácidos grasos, residuos de azúcar, glicoproteínas, polímeros (por ejemplo, polietilenglicol) o sus combinaciones. Un oligonucleótido puede conjugarse con un resto que aumenta la captación celular del oligonucleótido.
Los ejemplos no limitantes de restos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos, polipéptidos, restos lipídicos tales como un resto de colesterol, ácido cólico, un tioéter, por ejemplo, hexil-s-tritiltiol, un tiocolesterol, una cadena alifática, por ejemplo, restos de dodecandiol o undecilo, un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o trietilamonio 1-di-o-hexadecil-rac-glicero-S-h-fosfonato, una poliamina o una cadena de polietilenglicol, un ácido acético adamantano, un resto de palmitilo, un resto de octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol.
El resto puede ser un polímero cargado positivamente, tal como un péptido cargado positivamente que tiene, por ejemplo, aproximadamente 1 a 50 restos de aminoácidos de longitud u óxido de polialquileno tal como polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicol. Adecuadamente, el polímero cargado positivamente, tal como un óxido de polialquileno, puede unirse al oligómero a través de un enlazador tal como un enlazador liberable.
Cuando se mide la expresión del polipéptido NtMRP, la detección de la cantidad de ARNm que codifica un polipéptido NtMRP en la célula puede cuantificarse mediante, por ejemplo, PCR o transferencia de Northern. Cuando se mide un cambio en la cantidad de polipéptido NtMRP en la muestra, la detección de NtMRP mediante el uso de anticuerpos anti-NtMRP puede usarse para cuantificar la cantidad de polipéptido NtMRP en la célula mediante el uso de técnicas conocidas. Alternativamente, la actividad biológica (por ejemplo, el transporte de metales pesados - tales como el cadmio) puede medirse antes y después del contacto con el agente de prueba.
En otra modalidad, en la presente descripción se proporcionan anticuerpos que son inmunorreactivos con los polipéptidos. Los polipéptidos NtMRP, fragmentos, variantes, polipéptidos de fusión, y similares, como los que se expone en la presente descripción, pueden emplearse como "inmunógenos" en la producción de anticuerpos inmunorreactivos con ellos. Dichos anticuerpos se unen específicamente a los polipéptidos mediante los sitios de unión al antígeno del anticuerpo. Los anticuerpos de unión específica son aquellos que reconocerán específicamente y se unirán con polipéptidos de la familia NtMRP, homólogos y variantes, pero no con otras moléculas. En una modalidad, los anticuerpos son específicos para polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos de NtMRP como se expone en la presente descripción y no reaccionan de manera cruzada con otros polipéptidos.
Más específicamente, los polipéptidos, fragmentos, variantes, polipéptidos de fusión, y similares contienen determinantes antigénicos o epítopos que provocan la formación de anticuerpos. Estos determinantes antigénicos o epítopos pueden ser lineales o conformacionales (discontinuos). Los epítopos lineales se componen de una sola sección de aminoácidos del polipéptido, mientras que los epítopos conformacionales o discontinuos se componen de secciones de aminoácidos de diferentes regiones de la cadena del polipéptido que quedan en una proximidad cercana tras el plegamiento del polipéptido. Los epítopos pueden identificarse mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Adicionalmente, los epítopos de los polipéptidos pueden usarse como reactivos de investigación, en ensayos, y para purificar anticuerpos de unión específica a partir de sustancias tales como sueros policlonales o sobrenadantes a partir de hibridomas cultivados. Dichos epítopos o variantes de estos pueden producirse mediante el uso de técnicas conocidas en la técnica tales como síntesis en fase sólida, escisión química o enzimática de un polipéptido, o con el uso de la tecnología de ADN recombinante.
Tanto los anticuerpos policlonales como monoclonales para los polipéptidos pueden prepararse mediante técnicas convencionales. Las líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales específicos para los polipéptidos también se abarcan en la presente descripción. Dichos hibridomas pueden producirse e identificarse mediante técnicas convencionales. Para la producción de anticuerpos, varios animales huésped pueden inmunizarse mediante inyección con un polipéptido NtMRP, fragmento, variante, o mutantes de estos. Dichos animales huéspedes pueden incluir, pero no se limitan a, conejos, ratones, y ratas, por nombrar algunos. Pueden usarse varios adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica. En dependencia de la especie huésped, tales adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, el adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensoactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones en aceite, hemocianina de lapa californiana, dinitrofenol, y adyuvantes útiles potencialmente en humanos tales como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Los anticuerpos monoclonales pueden recuperarse mediante técnicas convencionales. Dichos anticuerpos monoclonales pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina lo que incluye IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, y cualquier subclase de estas.
Los anticuerpos pueden usarse, además, en ensayos para detectar presencia de los polipéptidos o fragmentos, ya sea in vitro o in vivo. Los anticuerpos pueden emplearse además en la purificación de polipéptidos o fragmentos mediante cromatografía de inmunoafinidad.
Diversas modalidades proporcionan plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas, así como también biomasa y semillas en las cuales el nivel de expresión del polinucleótido NtMRP se reduce sustancialmente para reducir o impedir el transporte de cadmio hacia la lámina foliar. La lámina foliar puede incorporarse en diversos productos consumibles - tales como varios artículos fumables, tales como puros, cigarrillos y productos de tabaco sin humo (es decir, no combustibles).
La reducción del % de cadmio en estos artículos fumables y productos sin humo puede ser un valor de al menos aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %, 200 % o 300 % menos, cuando se comparan con los productos consumibles derivados de contrapartes no mutantes, de origen no natural o no transgénicos. En algunas modalidades, el contenido de cadmio de estos artículos fumables y productos sin humo es un valor de un intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,05 partes por millón (ppm), de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,1 ppm, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,5 ppm, desde de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1,0 ppm, o de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5 ppm. En algunas modalidades, el contenido de cadmio de estos artículos fumables y productos sin humo es aproximadamente 0,001 ppm o menos, aproximadamente 0,01 ppm o menos o aproximadamente 0,05 ppm o menos, o aproximadamente 0,49 ppm o menos o aproximadamente 0,5 ppm o menos.
El grado de acumulación de cadmio en las plantas puede variar sustancialmente en dependencia de varios parámetros atribuidos a la complejidad del genotipo y al ambiente de cultivo. Por ejemplo, las concentraciones de cadmio en hojas de tabaco cultivado en el campo pueden variar mucho en dependencia de factores tales como el agroclima, la calidad del suelo, los cultivares, y el tipo y origen del fertilizante usado. Además, los patrones relativos de la distribución de cadmio dentro de diferentes porciones de una planta de tabaco pueden variar de acuerdo con la especie, el órgano/tejido, y las condiciones de cultivo (es decir, cultivado en el campo frente a cultivado en hidropónico). Como promedio, las concentraciones de cadmio medidas en hojas de tabaco cultivado en el campo (lo que incluye nervaduras y venas) pueden estar en el intervalo de aproximadamente 0,5 a 5 ppm (partes por millón, o microgramos/gramo de peso seco de hojas de tabaco). Sin embargo, muchos niveles de cadmio publicados no definen típicamente la etapa de madurez del tabaco, la variedad de tabaco, o las porciones de la hoja particulares (es decir, remoción a partir de la posición del tallo de la hoja) cosechadas para el análisis. En algunas variedades, las hojas inferiores pueden acumular niveles de cadmio más altos que las hojas medias y superiores. A nivel intracelular, el cadmio puede encontrarse en diversos componentes celulares de una célula vegetal, lo que incluye la pared celular, citoplasma, cloroplastos, núcleo y vacuolas.
Además, el contenido de cadmio medido en las hojas de tabaco puede variar sustancialmente en dependencia de los niveles de cadmio en el ambiente del suelo donde las plantas de tabaco se cultivaron. Las hojas de tabaco cultivadas en zonas contaminadas con cadmio pueden acumular cadmio de aproximadamente 35 ppm o superior, en comparación con las hojas de las contrapartes idénticas genéticamente cultivadas en zonas no contaminadas, que pueden acumular cadmio en un intervalo de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 8 ppm. Las vacuolas dentro de las hojas de plantas cultivadas en zonas contaminadas con cadmio pueden acumular concentraciones de cadmio muy altas. Los expertos en la técnica conocen los métodos para aplicar las composiciones descritas para que sean adecuadas para una especie de planta dada de interés.
El contenido de metales pesados en las plantas puede medirse mediante el uso de diversos métodos conocidos en la técnica. Un método preferido comprende el uso de espectrofotometría de masa con plasma acoplado inductivamente ("ICP-MS", Agilent 7500A, Agilent Technologies, Palo Alto, CA).
Las plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas que se describen en la presente descripción pueden tener otros usos, por ejemplo, en la agricultura. Por ejemplo, las plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas descritas en la presente descripción pueden usarse para producir alimentación animal y productos para la alimentación humana.
Las semillas de las plantas descritas en la presente descripción pueden acondicionarse y empacarse en material de empaque por medios conocidos en la técnica para conformar un artículo de fabricación. Los materiales de empaque tales como papel y tela se conocen bien en la técnica. Un empaque de semilla puede tener una identificación, por ejemplo, una etiqueta o marcador asegurado al material de empaque, un marcador impreso en el material de empaque, o un marcador insertado dentro del empaque, que describe la naturaleza de las semillas en él.
Una planta portadora de un alelo mutante de NtMRP puede usarse en un programa de mejoramiento de plantas para crear líneas, variedades e híbridos útiles. En particular, el alelo mutante de NtMRP se introgresa en las variedades comercialmente importantes descritas anteriormente. Así, se proporcionan métodos para el mejoramiento de plantas, que comprenden cruzar una planta mutante, una planta de origen no natural o una planta transgénica como se describe en la presente descripción con una planta que comprende una identidad genética diferente. El método puede comprender, además, cruzar la planta de la progenie con otra planta, y repetir opcionalmente el cruzamiento hasta que se obtenga una progenie con los rasgos genéticos o fondo genético conveniente. Un propósito ofrecido por dichos métodos de mejoramiento es introducir un rasgo genético conveniente en otras variedades, líneas de mejoramiento, híbridos o cultivares, particularmente los que son de interés comercial. Otro propósito es facilitar el apilamiento de modificaciones genéticas de diferentes genes en una sola variedad de planta, líneas, híbridos o cultivares. Se contemplan apareamientos intraespecíficos así como también interespecíficos. Las plantas de la progenie que surgen de dichos cruces, también referidas como líneas de mejoramiento, son ejemplos de plantas de origen no natural.
La huella genética, el polimorfismo de nucleótido único, los marcadores microsatélites, o tecnologías similares pueden usarse en un programa de mejoramiento por selección asistida por marcadores (MAS) para transferir o cruzar alelos mutantes de los genes de NtMRP para otros tabacos, como se describe en la presente descripción. Por ejemplo, un genetista puede crear poblaciones segregantes a partir de hibridaciones de un genotipo que contiene un alelo mutante con un genotipo conveniente agronómicamente. Las plantas en las generaciones F2 o de retrocruzamiento pueden tamizarse mediante el uso de un marcador desarrollado a partir de una secuencia genómica de NtMRP o un fragmento de esta, con el uso de una de las técnicas enumeradas en la presente descripción. Las plantas identificadas por poseer el alelo mutante pueden retrocruzarse o autopolinizarse para crear una segunda población a tamizar. En dependencia del patrón de herencia esperado o la tecnología MAS usada, puede ser necesario autopolinizar las plantas seleccionadas antes de cada ciclo de retrocruzamiento para ayudar en la identificación de las plantas individuales deseadas. El retrocruzamiento u otro procedimiento de mejoramiento pueden repetirse hasta que se recupere el fenotipo deseado del parental recurrente.
De conformidad con la descripción, en un programa de mejoramiento, los cruces exitosos producen plantas F1 que son fértiles. Las plantas F1 seleccionadas pueden cruzarse con uno de los parentales, y las plantas de la primera generación del retrocruzamiento se autopolinizan para producir una población que se tamiza de nuevo en busca de una expresión génica variante de NtMRP (por ejemplo, la versión nula del gen NtMRP). El proceso de retrocruzamiento, autopolinización, y tamizaje se repite, por ejemplo, al menos 4 veces hasta que el tamizaje final produce una planta que es fértil y similar razonablemente al parental recurrente. Esta planta, si se desea, se autopoliniza y la progenie se tamiza de nuevo subsecuentemente para confirmar que la planta exhibe una expresión génica variante de NtMRP. En algunas modalidades, una población de plantas en la generación F2 se tamiza para detectar la expresión de un gen variante de NtMRP, por ejemplo, se identifica una planta que no expresa NtMRP debido a la ausencia de un gen NtMRP de conformidad con métodos estándar, por ejemplo, mediante el uso de un método de PCR con cebadores basados en la información de la secuencia nucleotídica para NtMRP descrita en la presente descripción.
Las variedades híbridas pueden producirse al evitar la autopolinización de plantas parentales femeninas (es decir, parentales de semillas) de una primera variedad, lo que permite que el polen de plantas parentales masculinas de una segunda variedad fecunden a las plantas parentales femeninas, y permite que se formen semillas híbridas F1 en las plantas femeninas. La autopolinización de plantas femeninas puede evitarse mediante la emasculación de las flores en una etapa temprana del desarrollo de las flores. Alternativamente, la formación de polen puede evitarse en las plantas parentales femeninas mediante el uso de una forma de esterilidad masculina. Por ejemplo, la esterilidad masculina puede producirse por esterilidad masculina citoplasmática (CMS), o esterilidad masculina transgénica en donde un transgén inhibe la microsporogénesis y/o la formación de polen, o autoincompatibilidad. Las plantas parentales femeninas que contienen CMS son útiles particularmente. En modalidades en las cuales las plantas parentales femeninas son CMS, el polen se cosecha a partir de plantas fértiles masculinas y se aplica manualmente a los estigmas de las plantas parentales femeninas CMS, y se cosecha la semilla F1 resultante.
Las variedades y líneas descritas en la presente descripción pueden usarse para formar híbridos F1 de un cruce simple. En dichas modalidades, las plantas de las variedades parentales pueden cultivarse como poblaciones adyacentes homogéneas esencialmente para facilitar la polinización cruzada natural de las plantas parentales masculinas a las plantas parentales femeninas. La semilla F1 formada sobre las plantas parentales femeninas se cosecha selectivamente por medios convencionales. Además, las dos variedades de plantas parentales pueden cultivarse de manera masiva y cosecharse una mezcla de semillas híbridas F1 formadas en el parental femenino y la semilla formada en el parental masculino como el resultado de la autopolinización. Alternativamente, pueden llevarse a cabo cruces de tres vías en donde un híbrido F1 de un cruce simple se usa como un parental femenino y se cruza con un parental masculino diferente. Como otra alternativa, pueden crearse híbridos de cruces dobles en donde la progenie F1 de dos cruces simples diferentes se cruzan entre ellas.
Una población de plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas puede tamizarse o seleccionarse en busca de los miembros de la población que tienen un rasgo o fenotipo deseado. Por ejemplo, una población de la progenie de un solo evento de transformación puede tamizarse para detectar las plantas que tienen un nivel deseado de la expresión del polipéptido o polinucleótido NtMRP. Pueden usarse métodos físicos y bioquímicos para identificar los niveles de expresión. Estos incluyen análisis de Southern o amplificación por PCR para la detección de un polinucleótido; transferencias tipo Northern, protección de S1 RNasa, extensión de cebadores, o amplificación por RT-PCR para detectar transcritos de ARN; ensayos enzimáticos para detectar la actividad de enzima o ribozima de polipéptidos y polinucleótidos; y electroforesis en gel de proteínas, transferencias tipo Western, inmunoprecipitación, e inmunoensayos con unión a enzimas para detectar polipéptidos. Otras técnicas tales como hibridación in situ, tinción enzimática, e inmunotinción pueden usarse además para detectar presencia o expresión de polipéptidos o polinucleótidos.
En la presente descripción se describe que las células vegetales o plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas comprenden uno o más polinucleótidos recombinantes, tal como uno o más polinucleótidos NtMRP aislados, una o más constructos de polinucleótidos, uno o más ARN bicatenarios, uno o más conjugados o uno o más vectores/vectores de expresión.
La expresión de NtMRP puede evaluarse mediante el uso de métodos que incluyen, por ejemplo, RT-PCR, transferencias Northern, protección de RNasas, extensiones de cebadores, transferencias Western, electroforesis en gel de proteínas, inmunoprecipitación, inmunoensayos ligados a enzimas, ensayos con chips y espectrometría de masa. Debe señalarse que si un polipéptido se expresa bajo el control de un promotor con preferencia tisular o de amplia expresión, la expresión puede evaluarse en toda la planta o en un tejido seleccionado. De manera similar, si un polipéptido se expresa en un momento particular, por ejemplo, en un momento particular del desarrollo o tras la inducción, la expresión puede evaluarse selectivamente en un periodo de tiempo deseado.
Sin limitación, las plantas descritas en la presente descripción pueden modificarse para otros propósitos lo mismo antes que después de que se ha modulado la expresión o la actividad de NtMRP (por ejemplo, reducida o inhibida). Una o más de las siguientes modificaciones genéticas pueden presentarse en las plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas. En una modalidad, se modifican además uno o más genes que se involucran en la captación de metales pesados o el transporte de metales pesados lo que resulta en plantas o partes de plantas (tales como hojas) que tienen un menor contenido de metales pesados que las plantas control o partes de estas sin la(s) modificación(es). Los ejemplos no limitantes incluyen genes en la familia de facilitadores de la difusión de cationes (CDF), la familia de proteínas similares a Zrt, Irt (ZIP), la familia de intercambiadores de cationes (CAX), la familia de transportadores de cobre (COPT), la familia de ATPasas tipo P de metales pesados (HMA, como se describe en el documento WO2009074325), la familia de homólogos de proteínas de macrófagos asociadas a la resistencia natural (NRAMP), y otro miembro de la familia de transportadores de casetes de unión al ATP (ABC) que participan en el transporte de metales pesados, tal como cadmio. El término metal pesado como se usa en la presente descripción incluye metales de transición. En otra modalidad, se modifican uno o más genes que se implican en la conversión de intermediarios metabólicos nitrogenados lo que da como resultado plantas o partes de plantas (tal como hojas) que cuando se calientan, producen niveles menores de al menos una nitrosamina específica del tabaco (por ejemplo, 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanona, N-nitrosonornicotina, N-nitrosoanatabina, y N-nitrosoanabasina) que las plantas control o partes de estas. Los ejemplos no limitantes de genes que puede modificarse incluyen genes que codifican una nicotina desmetilasa, tales como CYP82E4, CYP82E5 y CYP82E10 las cuales participan en la conversión de nicotina a nornicotina y se describen en los documentos WO2006091194, WO2008070274, WO2009064771 y PCT/US2011/021088.
Los ejemplos de otras modificaciones incluyen la tolerancia a herbicidas, por ejemplo, el glifosato es un ingrediente activo de muchos herbicidas de amplio espectro. Las plantas transgénicas resistentes a glifosato se han desarrollado mediante la transferencia del gen aroA (una glifosato EPSP sintetasa de Salmonella typhimurium y E. coli). Las plantas resistentes a la sulfonilurea se han producido mediante la transformación del gen de ALS (acetolactato sintetasa) mutante de Arabidopsis. La proteína OB del fotosistema II del híbrido Amaranthus mutante se ha transferido a plantas para producir plantas transgénicas resistentes a la atrazina; y se han producido plantas transgénicas resistentes a bromoxinilo mediante la incorporación del gen bxn de la bacteria Klebsiella pneumoniae. Otra modificación ilustrativa resulta en plantas que son resistentes a insectos. Las toxinas de Bacillus thuringiensis (Bt) pueden proporcionar una manera efectiva de retrasar la emergencia de pestes resistentes a Bt, como se ilustró recientemente en brócoli donde los genes de Bt cry1Ac y cry1C piramidales controlaron las polillas de dorso de diamante resistentes a cada proteína individual y retrasaron significativamente la evolución de insectos resistentes. Otra modificación ilustrativa resulta en plantas que son resistentes a enfermedades causadas por patógenos (por ejemplo, virus, bacterias, hongos). Se han diseñado genéticamente plantas que expresan el gen Xa21 (resistencia a tizón bacteriano) con plantas que expresan tanto un gen de fusión de Bt y un gen de quitinasa (resistencia al barrenador amarillo del tallo y tolerancia a la vaina). Otra modificación ilustrativa resulta en la capacidad reproductiva alterada, tal como la esterilidad masculina. Otra modificación ilustrativa resulta en plantas que son tolerantes a estrés abiótico (por ejemplo, sequía, temperatura, salinidad), y se han producido plantas transgénicas tolerantes mediante la transferencia de la enzima de acil glicerol fosfato de Arabidopsis; los genes que codifican manitol deshidrogenasa y sorbitol deshidrogenasa que se implican en la síntesis de manitol y sorbitol mejoran la resistencia a la sequía. Otra modificación ilustrativa resulta en plantas que producen proteínas que tienen propiedades inmunogénicas favorables para el uso en seres humanos. Por ejemplo, pueden usarse plantas capaces de producir proteínas que carecen sustancialmente de residuos de fucosa con unión alfa-1,3, residuos de xilosa con unión beta-1,2, o ambos, en su N-glicano. Otras modificaciones ilustrativas pueden resultar en plantas con almacenamiento mejorado de proteínas y aceites, plantas con mejor eficacia fotosintética, plantas con prolongada durabilidad, plantas con mayor contenido de carbohidratos, y plantas resistentes a hongos; plantas que codifican una enzima implicada en la biosíntesis de alcaloides. Se contemplan, además, plantas transgénicas en las cuales se ha modulado la expresión de S-adenosil-L-metionina (SAM) y/o cistationina gamma-sintasa (CGS).
Sin limitación, las plantas descritas en la presente descripción pueden modificarse adicionalmente. Ejemplos de tales modificaciones adicionales incluyen, pero no se limitan a: (a) Plantas que pueden tolerar herbicidas. Por ejemplo, el glifosato es un ingrediente activo de muchos herbicidas de amplio espectro. Se han desarrollado plantas transgénicas resistentes al glifosato mediante la transferencia del gen aroA (una glifosato EPSP sintetasa de Salmonella typhimurium y E. coli); las plantas resistentes a sulfonilurea se han producido mediante la transformación del gen mutante ALS (acetolactato sintetasa) de Arabidopsis; la proteína OB del fotosistema II del mutante Amaranthus hybridus se ha transferido a las plantas para producir plantas transgénicas resistentes a la atrazina; y plantas transgénicas resistentes a bromoxinilo se han producido mediante la incorporación del gen bxn de la bacteria Klebsiella pneumoniae; (b) Plantas que son resistentes a los insectos. Las toxinas de Bacillus thuringiensis (Bt) pueden proporcionar una manera efectiva de retrasar la emergencia de pestes resistentes a Bt, como se ilustró recientemente en brócoli donde los genes de Bt crylAc y crylC piramidales controlaron las polillas de dorso de diamante resistentes a cada proteína individual y retrasaron significativamente la evolución de insectos resistentes; (c) Plantas que son resistentes a los virus. Las plantas del virus del mosaico del tabaco se han producido mediante la introducción de proteínas de la cubierta viral. Otras plantas transgénicas resistentes a virus incluyen plantas de patata resistentes al virus de la patata, arroz resistente al RSV y gramo negro y gramo verde resistentes al YMV; (d) Plantas que son resistentes a las bacterias. Se han diseñado genéticamente plantas que expresan el gen Xa21 (resistencia a tizón bacteriano) con plantas que expresan tanto un gen de fusión de Bt y un gen de quitinasa (resistencia al barrenador amarillo del tallo y tolerancia a la vaina); (e) Plantas transgénicas tolerantes al estrés: Se han producido plantas transgénicas tolerantes al frío mediante la transferencia de la enzima acil glicerol fosfato de Arabidopsis; los genes que codifican manitol deshidrogenasa y sorbitol deshidrogenasa que se implican en la síntesis de manitol y sorbitol mejoran la resistencia a la sequía; (f) Plantas que producen proteínas que tienen propiedades inmunogénicas favorables para su uso en humanos. Por ejemplo, pueden ser útiles las plantas capaces de producir proteínas que carecen sustancialmente de residuos fucosa con enlaces alfa-1,3, residuos de xilosa con enlaces beta-1,2, o ambos, en su N-glicano; y (g) otros ejemplos de plantas transgénicas son plantas con proteínas y aceites de almacenamiento mejorados, plantas con eficiencia fotosintética mejorada, plantas con vida útil prolongada, plantas con contenido de carbohidratos mejorado y plantas resistentes a hongos; plantas que codifican una enzima implicada en la biosíntesis de alquiloides; los genes para una vía de desintoxicación de mercurio orgánico bacteriano (reductasa mercúrica, merA) y liasa organomercúrica, merB se combinaron mediante el cruzamiento en Arabidopsis, y las plantas que expresaron ambos genes pudieron crecer en concentraciones de metilmercurio 50 veces mayores que las plantas de tipo silvestre.
Uno o más de dichos rasgos pueden introgresarse en las plantas de tabaco mutantes, de origen no natural o transgénicas a partir de otro cultivar de tabaco o pueden transformarse directamente en ellas. La introgresión del(de los) rasgo(s) en las plantas mutantes de tabaco, de origen no natural o transgénicas puede lograrse mediante cualquier método de mejoramiento de plantas conocida en la técnica, por ejemplo, mejoramiento por pedigrí, retrocruzamiento, mejoramiento por haploides dobles, y similares (ver, Wernsman, E. A., y Rufty, R. C. 1987. Capítulo Diecisiete. Tobacco. Páginas 669-698 En: Cultivar Development. Crop Species. W. H. Fehr (ed.), MacMillan Publishing Co, Inc., Nueva York, N.Y 761 pp.). Las técnicas basadas en biología molecular descritas anteriormente, en particular RFLP y marcadores microsatélites, pueden usarse en tales retrocruzamientos para identificar las progenies que tienen el mayor grado de identidad genética con el parental recurrente. Esto permite acelerar la producción de variedades que tienen al menos 90 %, preferentemente, al menos 95 %, con mayor preferencia, al menos 99 % de identidad genética con el parental recurrente, aún con mayor preferencia, idénticas genéticamente al parental recurrente, y que comprenden, además, el(los) rasgo(s) introgresado(s) a partir del parental donante. Dicha determinación de identidad genética puede basarse en marcadores moleculares conocidos en la técnica.
La última generación de retrocruzamiento puede autofecundarse para proporcionar progenie de mejoramiento pura para el(los) polinucleótido(s) que se transfiere(n). Generalmente, las plantas resultantes tienen esencialmente todas las características morfológicas y fisiológicas de las plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas, además del (de los) rasgo(s) transferido(s) (por ejemplo, uno o más rasgos de un solo gen). El protocolo de retrocruzamiento exacto dependerá del rasgo que se altera para determinar un protocolo de prueba apropiado. Aunque los métodos de retrocruzamiento se simplifican cuando el rasgo que se transfiere es un alelo dominante, también puede transferirse un alelo recesivo. En este caso, puede ser necesario introducir una prueba de la progenie para determinar si el rasgo deseado se ha transferido exitosamente.
Diversas modalidades proporcionan plantas mutantes, plantas de origen no natural o plantas transgénicas, así como también biomasa en las cuales el nivel de expresión del polinucleótido NtMRP se reduce de modo que se acumulan cantidades menores de cadmio en la misma.
Las partes de dichas plantas, particularmente plantas de tabaco, y más particularmente la lámina y la nervadura de las hojas de plantas de tabaco, pueden incorporarse o usarse para producir diversos productos consumibles que incluyen, pero no se limitan a, materiales formadores de aerosol, dispositivos formadores de aerosol, artículos para fumar, artículos fumables, productos sin humo, y productos de tabaco. Ejemplos de materiales formadores de aerosol incluyen, pero no se limitan a, composiciones de tabaco, tabacos, extracto de tabaco, tabaco cortado, relleno cortado, tabaco curado, tabaco expandido, tabaco homogeneizado, tabaco reconstituido, y tabacos para pipas. Los artículos para fumar y los artículos fumables son tipos de dispositivos formadores de aerosol. Los ejemplos de artículos para fumar o artículos fumables incluyen, pero no se limitan a, cigarrillos, puritos y puros. Los ejemplos de productos sin humo comprenden tabacos de mascar, y rapé. En ciertos dispositivos formadores de aerosol, en lugar de la combustión, una composición de tabaco u otro material formador de aerosol se calienta mediante uno o más elementos de calentamiento eléctrico para producir un aerosol. En otro tipo de dispositivo formador de aerosol calentado, el aerosol se produce por la transferencia de calor de un elemento combustible carburante o fuente de calor a un material formador de aerosol separado físicamente, que puede localizarse dentro, cerca o aguas abajo de la fuente de calor. Los productos de tabaco sin humo y los diversos materiales formadores de aerosol que contienen tabaco pueden contener tabaco en cualquier forma, lo que incluye partículas secas, trizas, gránulos, polvos, o una suspensión, depositados, mezclados, rodeados por, o combinados de cualquier otra manera con otros ingredientes en cualquier formato, tales como hojuelas, capas, lengüetas, espumas, o perlas. Como se usa en la presente descripción, el término "humo" se usa para describir un tipo de aerosol que se produce por los artículos de fumar, tales como cigarrillos, o por combustión de un material formador de aerosol.
En una modalidad, se proporciona además material curado a partir de las plantas de tabaco mutantes, transgénicas y de origen no natural descritas en la presente descripción. Los procesos de curado de hojas verdes de tabaco se conocen por los expertos en la técnica e incluyen sin limitación curado al aire, curado al fuego, curado al humo y curado al sol. El proceso de curado de hojas verdes de tabaco depende del tipo de tabaco cosechado. Por ejemplo, el tabaco Virginia de humo (brillante) se cura típicamente al humo, Burley y ciertas cepas oscuras usualmente, se curan al aire, y el tabaco para pipa, el tabaco de mascar, y el rapé usualmente, se curan al fuego.
En otra modalidad, se describen productos de tabaco que incluyen materiales formadores de aerosol que contienen tabaco, que comprenden, hojas, preferentemente hojas curadas, a partir de las plantas de tabaco mutantes, las plantas de tabaco transgénicas o las plantas de tabaco de origen no natural descritas en la presente descripción. Los productos de tabaco descritos en la presente descripción pueden ser un producto de tabaco mezclado que puede comprender, además, tabaco no modificado.
Las plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas pueden tener otros usos, por ejemplo, en la agricultura. Por ejemplo, las plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas descritas en la presente descripción pueden usarse para producir alimentación animal y productos para la alimentación humana.
La descripción proporciona, además, métodos para producir semillas que comprenden cultivar la planta mutante, planta de origen no natural, o planta transgénica descrita en la presente descripción, y recolectar las semillas de las plantas cultivadas. Las semillas de las plantas descritas en la presente descripción pueden acondicionarse y empacarse en material de empaque por medios conocidos en la técnica para conformar un artículo de fabricación. Los materiales de empaque tales como papel y tela se conocen bien en la técnica. Un empaque de semilla puede tener una identificación, por ejemplo, una etiqueta o marcador asegurado al material de empaque, un marcador impreso en el material de empaque, o un marcador insertado dentro del empaque, que describe la naturaleza de las semillas en él.
Las composiciones, métodos y kits para genotipar plantas para la identificación, selección o mejoramiento se abarcan en la descripción y pueden comprender un medio para detectar la presencia de un polinucleótido NtMRP en una muestra de polinucleótido. En consecuencia, se describe una composición que comprende uno de más cebadores para amplificar específicamente al menos una porción del polinucleótido NtMRP y opcionalmente una o más sondas y opcionalmente uno o más reactivos para llevar a cabo la amplificación o detección.
En consecuencia, se describen cebadores o sondas de oligonucleótidos específicos de genes que comprenden aproximadamente 10 o más polinucleótidos contiguos que corresponden al polinucleótido NtMRP. Dichos cebadores o sondas pueden comprender o consistir en aproximadamente 15, 20, 25, 30, 40, 45, 50 o más polinucleótidos contiguos que hibridan (por ejemplo, hibridan específicamente) con el polinucleótido NtMRP. En algunas modalidades, los cebadores o sondas pueden comprender o consistir en aproximadamente 10 a 50 nucleótidos contiguos, aproximadamente 10 a 40 nucleótidos contiguos, aproximadamente 10 a 30 nucleótidos contiguos o aproximadamente 15 a 30 nucleótidos contiguos que pueden usarse en los métodos dependientes de secuencias para la identificación de genes (por ejemplo, hibridación Southern) o aislamiento (por ejemplo, hibridación in situ de colonias bacterianas o placas de bacteriófagos) o detección de genes (por ejemplo, como uno o más cebadores de amplificación en la amplificación o detección de polinucleótidos). El uno o más cebadores o sondas específicos pueden diseñarse y usarse para amplificar o detectar una parte o todo el polinucleótido NtMRP. A manera de ejemplo específico, pueden usarse dos cebadores en un protocolo de reacción en cadena de la polimerasa para amplificar un fragmento de polinucleótido que codifica un polinucleótido NtMRP - tal como ADN o ARN. La reacción en cadena de la polimerasa puede realizarse, además, mediante el uso de un cebador que se deriva de una secuencia de polinucleótido NtMRP y un segundo cebador que hibrida con la secuencia aguas arriba o aguas abajo de la secuencia de polinucleótido NtMRP - tal como una secuencia promotora de NtMRP, el extremo 3' del ARNm precursor o una secuencia derivada de un vector. Ejemplos de técnicas térmicas e isotérmicas útiles para la amplificación de polinucleótidos in vitro se conocen bien en la técnica. La muestra puede ser o puede derivarse de una planta, una célula vegetal o material vegetal o un producto fabricado o derivado de la planta, la célula vegetal o el material vegetal como se describe en la presente descripción.
Por lo tanto, en otro aspecto, se proporciona, además, un método para detectar un polinucleótido NtMRP en una muestra que comprende las etapas de: (a) proporcionar una muestra que comprende, o se supone que comprende, un polinucleótido; (b) poner en contacto dicha muestra con uno de más cebadores o una o más sondas para detectar específicamente al menos una porción del polinucleótido NtMRP; y (c) detectar la presencia de un producto de amplificación, en donde la presencia de un producto de amplificación indica la presencia del polinucleótido NtMRP en la muestra. En un aspecto adicional, se proporciona además el uso de uno de más cebadores o sondas para detectar específicamente al menos una porción del polinucleótido NtMRP. Se proporcionan, además, kits para detectar al menos una porción del polinucleótido NtMRP, los cuales comprenden uno de más cebadores o sondas para detectar específicamente al menos una porción del polinucleótido NtMRP. El kit puede comprender reactivos para la amplificación de polinucleótidos, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), o reactivos para la tecnología de detección por hibridación de sondas de polinucleótidos, tales como transferencias Southern, transferencias Northern, hibridación in situ, o microarreglo. El kit puede comprender reactivos para la tecnología de detección por unión de anticuerpos tal como membrana de Western, ELISA, espectrometría de masas SELDI o tiras de pruebas. El kit puede comprender reactivos para la secuenciación de ADN. El kit puede comprender reactivos y/o instrucciones para determinar el contenido de metales pesados - tales como el cadmio. En algunas modalidades, un kit puede comprender instrucciones para uno o más de los métodos descritos. Los kits descritos pueden ser útiles para la determinación de la identidad genética, estudios filogenéticos, determinación del genotipo, determinación del haplotipo, análisis de la genealogía o mejoramiento de plantas particularmente con puntuación co-dominante.
La presente descripción proporciona, además, un método para genotipar una planta, una célula vegetal o material vegetal que comprende un polinucleótido NtMRP. El genotipado proporciona un medio para distinguir homólogos de un par cromosómico y puede usarse para diferenciar segregantes en una población de plantas. Los métodos de marcadores moleculares pueden usarse para estudios filogenéticos, caracterización de relaciones genéticas entre variedades de cultivo, identificación de cruces o híbridos somáticos, localización de segmentos cromosómicos que afectan rasgos monogénicos, clonación basada en mapas, y el estudio de herencia cuantitativa. El método específico de genotipado puede emplear cualquier número de técnicas analíticas de marcadores moleculares lo que incluye polimorfismos en la longitud de los fragmentos amplificados (AFLP). Los AFLP son el producto de diferencias alélicas entre los fragmentos amplificados causadas por la variabilidad de secuencias de nucleótidos. Por lo tanto, se describe un medio para seguir la segregación de NtMRP así como también las secuencias cromosómicas unidas genéticamente a estos genes o polinucleótidos mediante el uso de técnicas tales como el análisis de AFLP.
La invención se describirá adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no se destinan a limitar el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan como una ilustración y no como una limitación. A menos que se indique de cualquier otra manera, la presente invención emplea técnicas y métodos convencionales de la biología molecular, la biología de las plantas, bioinformática y cultivo de plantas.
Ejemplo 1: Identificación de la secuencia genómica del ADN de NtMRP3
Biblioteca BAC de tabaco. Se prepara una biblioteca de Cromosoma Artificial Bacteriano (BAC) de la siguiente manera: los núcleos se aíslan de hojas de plantas cultivadas en invernadero de la variedad Hicks Broad Leaf de Nicotiana tabacum. El ADN de peso molecular alto se aísla de los núcleos de acuerdo con protocolos estándar y se digiere parcialmente con BamHI y HindIII y se clona en los sitios BamHI o HindIII del vector BAC pINDIGO5. Se obtienen más de 320 000 clones con una longitud de inserto promedio de 135 mega pares de bases lo que cubre aproximadamente 9,7 veces el genoma del tabaco.
Ensamble de la secuencia del genoma del tabaco. Un gran número de clones de BAC seleccionados al azar se someten a la secuenciación mediante el uso del método de Sanger lo que genera más de 1780000 secuencias en bruto de una longitud promedio de 550 pares de bases. El filtrado de metilo se aplica mediante el uso de una cepa Mcr+ de Escherichia coli para la transformación y se aisló solo el ADN hipometilado. Todas las secuencias se ensamblan mediante el uso del ensamblador de genoma CELERA lo que produce más de 800000 secuencias que comprenden más de 200 000 cóntigos y 596 970 secuencias únicas. Los tamaños de cóntigos están entre 120 y 15300 pares de bases con una longitud promedio de 1100 pares de bases.
La secuencia genómica del ADN de NtMRP3 se identifica mediante la secuenciación de un BAC que contiene una parte del genoma que incluye ADN de NtMRP3. La secuencia se expone en la Figura 6.
Ejemplo 2: Transformación de variedades de tabaco con vectores de expresión de ARNi de NtMRP3
Las semillas de tabaco se esterilizan y germinan en una placa Petri que contiene medio basal MS suplementado con 5 ml/l de mezcla de conservante de plantas (PPM). Las plántulas, aproximadamente a los 7 a 10 días posteriores a la germinación, se seleccionan para la transformación con diversos vectores de expresión de ARNi de NtMRP3. Una sola colonia de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 se inocula en un medio LB líquido que contiene kanamicina a 50 mg l-1 (mono sulfato de kanamicina), y se incuba durante 48 h a 28 °C con agitación recíproca (150 ciclos min-1).
Las células cultivadas se colectan mediante centrifugación (6000*g, 10 minutos), y se suspenden a una densidad final de 0,4-0,7 OD600, con 20 ml de medio MS líquido que contiene sacarosa a 20 g-1. Los explantes de plántula de 7-10 días se sumergen en una suspensión bacteriana durante 5 minutos, y se transfieren a papeles de filtro estériles. Cincuenta explantes se colocan en alícuotas de 40 ml de medio de agar REG (medio basal MS suplementado con ácido 1-naftalenoacético (NAA) 0,1 mg l-1 y bencilaminopurina (BAP) 1 mg l-1) en placas Petri de 100 mm X 20 mm. Los explantes se cocultivan con Agrobacterium a 25 °C. Después de 3 días de cocultivo, los explantes se lavan y se transfieren a medio RCPK (medio REG con kanamicina 100 mg-1, carbenicilina 500 mg l-1, y 5 ml de PPM) para seleccionar los transformantes. Los explantes se subcultivan cada 2 semanas. Después de 8-12 semanas de cultivo en condiciones selectivas, las plantas supervivientes, que representan los transformantes que han integrado los constructos de expresión de ARNi de NtMRP3 en sus genomas, se transfieren a un medio de enraizamiento (medio basal MS suplementado con kanamicina 100 mg l-1). Las plantas con raíces se transfieren a macetas para promover un crecimiento adicional.
Ejemplo 3: Expresión del polinucleótido NtMRP3 en plantas de tabaco
Para determinar la expresión del polinucleótido NtMRP3, se aísla el ARN celular total de diversas partes de las plantas. El ARN total se aísla mediante el uso del Reactivo TRI® (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Para eliminar las impurezas de ADN, el ARN purificado se trata con ADNasa libre de ARNasa (TURBO ADN-free, Ambion, Austin TX). Para sintetizar la primera cadena de ADNc, aproximadamente 10 pg del ARN total se retrotranscriben mediante el uso del kit High Capacity ADNc Archive (Applied Biosystems, Foster City, CA). Para medir el nivel de transcritos de NtMRP3 en las muestras, se lleva a cabo una RT-PCR cuantitativa de 2 etapas de acuerdo con la química basada en sondas Taqman MGB. La mezcla de RT contiene una mezcla de dNTP 4 pM, cebadores aleatorios 1X, tampón de RT 1X, 10 g de ADNc, 50 U de transcriptasa inversa Multiscribe (Applied Biosystems), 2 U del Inhibidor de ARNasa Superase-In (Ambion), y agua libre de nucleasas. La mezcla de pCr contiene la mezcla Taqman Universal PCR Master Mix 1X (Applied Biosystems, Foster City, CA), cebador directo 400 nM, cebador inverso 400 nM, sonda Taqman MGB 250 nM, 2 ng de ADNc, y agua libre de nucleasas. La RT-PCR se lleva a cabo mediante el uso de un sistema en tiempo real ABI 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA) y en condiciones de amplificación: 50 °C durante 2 minutos; 95 °C durante 10 minutos; 40 ciclos de 95 °C durante 15 segundos; y 60 °C durante 1 minuto.
Ejemplo 4: Silenciamiento de la expresión de polinucleótidos NtMRP3 en plantas de tabaco
Se encuentra una primera secuencia parcial que codifica un transcrito de NtMRP3 putativo mediante el uso de anotaciones de la Iniciativa del Genoma del Tabaco (TGI). A partir de esta secuencia particular, se generan cebadores para silenciar la expresión de polinucleótidos NtMRP3 en tabaco mediante el uso de un enfoque de ARNi. La secuencia de ARNi de NtMRP3 correspondiente se amplifica a partir del ADNc mediante RT-PCR y después se inserta en el vector Gateway pB7GWIWG2 (II) mediante un vector de entrada, exactamente como se detalla por el fabricante (Invitrogen). Este vector contiene un promotor para la expresión constitutiva (el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor CaMV) del transgén en todos los tejidos de la planta y el gen bar para la selección de herbicidas con BASTA en placas de agar (30 mg/ml). El constructo se inserta después en el genoma del tabaco Burley KY14 a través de Agrobacterium tumefasciens mediante el uso de un procedimiento clásico de disco de hoja. A partir de los callos, se regeneran líneas individuales y se seleccionan en Basta. Las líneas de silenciamiento de a Rní se controlan mediante RT-PCR y se cultivan para la producción de semillas. Las semillas T1 se recogen, se vuelven a cultivar en placas de agar que contienen Basta para su selección y las plantas resistentes se cultivan en bandejas flotantes antes del cultivo en el campo.
Se pesan aproximadamente 500 mg de la planta y se digieren en 10 ml de HNO3 concentrado mediante un sistema de reacción acelerado por microondas, sistema de digestión 5 (CEM corporation, Mathews, NC). Las concentraciones de los metales pesados se analizan mediante el uso de espectrofotometría de masa con plasma acoplado inductivamente ("ICP-MS," Agilent 7500A; Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Como control de tabaco no transgénico, una muestra que consiste en hojas de tabaco Virginia, certificado en Polonia, CTA-VTL-2, se prepara en condiciones comparables.
Ejemplo 5: Identificación de la secuencia genómica del ADN NtMRP4
La secuencia genómica del ADN de NtMRP4 se identifica mediante la secuenciación de un BAC que contiene una parte del genoma que incluye ADN de NtMRP4. La secuencia se expone en la Figura 1.
Ejemplo 6: Transformación de variedades de tabaco con vectores de expresión de ARNi de NtMRP4
Las semillas de tabaco se esterilizan y germinan en una placa Petri que contiene medio basal MS suplementado con 5 ml/l de mezcla de conservante de plantas (PPM). Las plántulas, aproximadamente a los 7 a 10 días posteriores a la germinación, se seleccionan para la transformación con diversos vectores de expresión de ARNi de NtMRP4. Una sola colonia de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 se inocula en un medio LB líquido que contiene kanamicina a 50 mg l-1 (mono sulfato de kanamicina), y se incuba durante 48 h a 28 °C con agitación recíproca (150 ciclos min-1). Las células cultivadas se colectan mediante centrifugación (6000*g, 10 minutos), y se suspenden a una densidad final de 0,4-0,7 OD600, con 20 ml de medio MS líquido que contiene sacarosa a 20 g-1. Los explantes de plántula de 7-10 días se sumergen en una suspensión bacteriana durante 5 minutos, y se transfieren a papeles de filtro estériles. Cincuenta explantes se colocan en alícuotas de 40 ml de medio de agar REG (medio basal MS suplementado con ácido 1-naftalenoacético (NAA) 0,1 mg l-1 y bencilaminopurina (BAP) 1 mg l-1) en placas Petri de 100 mm X 20 mm. Los explantes se cocultivan con Agrobacterium a 25 °C. Después de 3 días de cocultivo, los explantes se lavan y se transfieren a medio RCPK (medio REG con kanamicina 100 mg-1, carbenicilina 500 mg l-1, y 5 ml de PPM) para seleccionar los transformantes. Los explantes se subcultivan cada 2 semanas. Después de 8­ 12 semanas de cultivo en condiciones selectivas, las plantas supervivientes, que representan los transformantes que han integrado los constructos de expresión de ARNi de NtMRP4 en sus genomas, se transfieren a un medio de enraizamiento (medio basal MS suplementado con kanamicina 100 mg l-1). Las plantas con raíces se transfieren a macetas para promover un crecimiento adicional.
Ejemplo 7: Expresión del polinucleótido NtMRP4 en plantas de tabaco
Para determinar la expresión del polinucleótido NtMRP4, se aísla el ARN celular total de diversas partes de las plantas. El ARN total se aísla mediante el uso del Reactivo TRI® (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Para eliminar las impurezas de ADN, el ARN purificado se trata con ADNasa libre de ARNasa (TURBO ADN-free, Ambion, Austin TX). Para sintetizar la primera cadena de ADNc, aproximadamente 10 pg del ARN total se retrotranscriben mediante el uso del kit High Capacity ADNc Archive (Applied Biosystems, Foster City, CA). Para medir el nivel de transcritos de NtMRP4 en las muestras, se lleva a cabo una RT-PCR cuantitativa de 2 etapas de acuerdo con la química basada en sondas Taqman MGB. La mezcla de RT contiene una mezcla de dNTP 4 pM, cebadores aleatorios 1X, tampón de RT 1X, 10 g de ADNc, 50 U de transcriptasa inversa Multiscribe (Applied Biosystems), 2 U del Inhibidor de ARNasa Superase-In (Ambion), y agua libre de nucleasas. La mezcla de pCr contiene la mezcla Taqman Universal PCR Master Mix 1X (Applied Biosystems, Foster City, CA), cebador directo 400 nM, cebador inverso 400 nM, sonda Taqman MGB 250 nM, 2 ng de ADNc, y agua libre de nucleasas. La RT-PCR se lleva a cabo mediante el uso de un sistema en tiempo real ABI 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA) y en condiciones de amplificación: 50 °C durante 2 minutos; 95 °C durante 10 minutos; 40 ciclos de 95 °C durante 15 segundos; y 60 °C durante 1 minuto.
El polinucleótido NtMRP4 se expresa en tejidos de tabaco, según se determina mediante RT-PCR mediante el uso de ADNc de pétalos, estambres, pistilos, sépalos, cápsulas, tallos, hojas y raíces.
Cuando las plantas de tabaco se cultivan en una solución hidropónica, la expresión del polinucleótido NtMRP4 se regula positivamente ligeramente por cadmio en las plántulas de raíz y hoja de N. tabacum (TN90, ver Figura 2). Sin embargo, aunque se encuentra que el polinucleótido NtMRP4 también se induce en la hoja de N. rustica, se observan datos opuestos en las raíces de N. rustica (regulación negativa) en comparación con N. tabacum, lo que sugiere que el polinucleótido NtMRP4 puede jugar un papel en la acumulación de cadmio en la raíz y la tolerancia alta al cadmio de N. rustica.
Ejemplo 8: Silenciamiento de la expresión de polinucleótidos NtMRP4 en plantas de tabaco
Se encuentra una primera secuencia parcial (CHO_SL022xb24f1.ab1) que codifica un transcrito de NtMRP4 putativo (no mostrado) mediante el uso de anotaciones de la Iniciativa del Genoma del Tabaco (TGI). A partir de esta secuencia particular, se generan cebadores para silenciar la expresión de polinucleótidos NtMRp4 en tabaco mediante el uso de un enfoque de ARNi (Figura 1). La secuencia ARNi de MRP4 correspondiente se amplifica a partir de ADNc mediante RT-PCR y después se inserta en el vector Gateway pB7GWIWG2 (II) a través de un vector de entrada, exactamente como lo detalla el fabricante (Invitrogen). Este vector contiene un promotor para la expresión constitutiva (el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor CaMV) del transgén en todos los tejidos de la planta y el gen bar para la selección de herbicidas con BASTA en placas de agar (30 mg/ml). El constructo se inserta después en el genoma del tabaco Burley KY14 a través de Agrobacterium tumefasciens mediante el uso de un procedimiento clásico de disco de hoja. A partir de los callos, se regeneran líneas individuales y se seleccionan en Basta. Las líneas de silenciamiento de ARNi se controlan mediante RT-PCR y se cultivan para la producción de semillas. La Figura 3 muestra que el silenciamiento de NtMRP4 es eficaz en líneas transgénicas, lo que incluye las líneas 1 y 2. Las semillas T1 se recogen, se vuelven a cultivar en placas de agar que contienen Basta para su selección y las plantas resistentes se cultivan en bandejas flotantes antes del cultivo en el campo.
Se pesan aproximadamente 500 mg de la planta y se digieren en 10 ml de HNO3 concentrado mediante un sistema de reacción acelerado por microondas, sistema de digestión 5 (CEM corporation, Mathews, NC). Las concentraciones de los metales pesados se analizan mediante el uso de espectrofotometría de masa con plasma acoplado inductivamente ("ICP-MS," Agilent 7500A; Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Como control de tabaco no transgénico, una muestra que consiste en hojas de tabaco Virginia, certificado en Polonia, CTA-VTL-2, se prepara en condiciones comparables.
La Figura 4 muestra una reducción de cadmio en la hoja cercana al 20 % en las dos líneas de ARNi de NtMRP4 probadas (líneas 1 y 2) después de dos experimentos de campo sucesivos en dos años consecutivos. En cada caso, las unidades experimentales consisten en cuatro réplicas independientes de 4 plantas recolectadas (peso, líneas 1 y 2 y vector control de plantas en el experimento de campo de segundo año) que se asignan al azar dentro de bloques. Además, las muestras control se añaden a los bloques para usar como control para tendencias espaciales. Los análisis de las líneas de ARNi de NtMRP4 demuestran un efecto fuerte y significativo estadísticamente en la reducción del nivel medio de cadmio.
Ejemplo 9: Análisis de altura y peso en plantas derivadas de plantas de tabaco en las cuales se silencia la expresión del polinucleótido NtMRP4.
La altura y el peso de las líneas de NtMRP4 silenciadas se afecta ligeramente en comparación con las plantas control. Sin embargo, no se encuentran diferencias significativas en las hojas secas recolectadas entre las plantas de ARNi de NtMRP4 y las plantas de tipo silvestre o vector control, lo que indica que la degradación de las transcripciones de NtMRP4 no tiene efecto relevante estadísticamente en la biomasa seca. Estos datos se confirman por otro experimento de campo que muestra que la sobreexpresión de AtMRP4 (homólogo al polinucleótido NtMRP4) en el mismo fondo de tabaco (KY14) conduce a un 10-30 % más de acumulación de cadmio en las hojas (en dependencia de las líneas transgénicas). Es evidente que la degradación del ARNm que codifica la proteína NtMRP4 reduce significativamente el nivel de cadmio en la hoja de tabaco.
Ejemplo 10: Identificación de mutantes inducidos por EMS en NtMRP4
Una biblioteca de ADN se hace de plantas Nicotiana tabacum que se han expuesto al metanosulfonato de etilo (EMS) y se examinan en busca de mutantes en el exón 1 y el exón 2 del polinucleótido NtMRP4 mediante la secuenciación de la parte relevante del gen NtMRP4 de plantas individuales.
Para el exón 1
NtMRP4Exon1FW (5'-CATCTCCTTACGAAGGATACTACC-3') y NtMRP4Exon1REV(5'-GCTGCAAGCTCTCCTTTT CTAA-3')
se usan para la secuenciación, y para el exón 2, NtMRP4Exon2FW (5'-GTGCAATCTGGCAAATATAGTGAG-3') y NtMRP4Exon2REV (5'-AAAAT GACAT AGGAGCAT GCAGT A-3')
se usan para la secuenciación.
En la Tabla 1 se presenta una visión general de todos los mutantes encontrados para el exón 1 y el exón 2 del polinucleótido NtMRP4. Se indican el codón original (codón ori) y el codón mutado (codón mut) así como también el aminoácido original (AS ori) y la sustitución de aminoácidos (AS mut) o el codón de parada.
Ejemplo 11: Protocolo de búsqueda para la selección de sitios objetivo de nucleasa con dedos de zinc
Este ejemplo ilustra cómo buscar el gen NtMRP4 para detectar la aparición de sitios objetivo únicos dentro de la secuencia de gen dada en comparación con una base de datos de genoma dada para desarrollar herramientas para modificar la expresión del gen. Los sitios objetivo identificados por los métodos de la descripción, lo que incluye aquellos descritos más abajo, los motivos de secuencia, y el uso de cualquiera de los sitios o motivos para modificar la secuencia génica correspondiente en una planta, tal como tabaco, se abarcan en la descripción.
Algoritmo de búsqueda.
Se desarrolla un programa de computadora que permite seleccionar una secuencia de nucleótidos de consulta de entrada (objetivo) para la aparición de dos motivos de ADN de subcadena de longitud fija separados por un tamaño de espaciador dado mediante el uso de un arreglo de sufijos dentro de una base de datos de ADN, tal como por ejemplo el ensamble de secuencia de genoma de tabaco del Ejemplo 1. La construcción del arreglo de sufijos y la búsqueda usan la biblioteca de código abierto libdivsufsort-2.0.0 (http://code.google.com/p/libdivsufsort/) que convierte cualquier cadena de entrada directamente en una cadena transformada de Burrows-Wheeler. El programa escanea la secuencia de nucleótidos de entrada completa (objetivo) y devuelve todas las combinaciones de subcadenas que se producen menos de un número seleccionado de veces en la base de datos de ADN seleccionada.
Selección del sitio objetivo para la mutagénesis mediada por nucleasa con dedos de zinc de una secuencia de consulta.
Un dominio con dedos de zinc de unión a ADN reconoce una secuencia de nucleótidos de tres pares de bases. Una nucleasa con dedos de zinc comprende una proteína con dedos de zinc que comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más dominios con dedos de zinc de unión a ADN, y la nucleasa no específica de una enzima de restricción de tipo IIS. Las nucleasas con dedos de zinc pueden usarse para introducir una ruptura bicatenaria en una secuencia objetivo. Para introducir una ruptura bicatenaria, se requiere un par de nucleasas con dedos de zinc, una de las cuales se une a la hebra más (superior) de la secuencia objetivo y la otra a la hebra menos (inferior) de la misma secuencia objetivo separadas por 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más nucleótidos. Mediante el uso de plurales de 3 para cada uno de los dos motivos de ADN de subcadena de longitud fija, el programa puede usarse para identificar dos sitios objetivo de proteína con dedos de zinc separados por una longitud de espaciador dada.
Entradas del programa:
1. La secuencia de ADN de consulta objetivo
2. La base de datos de ADN a examinar
3. El tamaño fijado del primer motivo de ADN de subcadena
4. El tamaño fijado del espaciador
5. El tamaño fijado del segundo motivo de ADN de subcadena
6. El número umbral de apariciones de la combinación de entradas de programa 3 y 5 separadas por la entrada de programa 4 en la base de datos de ADN elegida de la entrada de programa 2
Salida del programa:
1. Una lista de secuencias de nucleótidos con, para cada secuencia, la cantidad de veces que aparece la secuencia en la base de datos de ADN con un máximo del umbral de entrada del programa 6.
Ejemplo 12: Expresión de perfiles de transcritos de NtMRP3 y NtMRP4 en tabaco
Desarrollo y análisis de matriz de exones de tabaco. Mediante el uso de los clones de BAC obtenidos como se describió en el Ejemplo 1, se identifican 272342 exones mediante la combinación y comparación de los datos EST de tabaco y las secuencias filtradas con metilo obtenidas de la secuenciación de BAC. Para cada uno de estos exones, se diseñan cuatro oligonucleótidos de 25 mer y se usan para construir una matriz de exones de tabaco. La matriz de exones se fabrica por Affymetrix (Santa Clara, EE.UU.) mediante el uso de protocolos estándar.
Expresión de NtMRP3 y NtMRP4 en tabaco. El ARN se aísla de especies de Nicotiana cultivadas en suelos Cd+ (contaminados con Cd) y Cd-(deficientes en Cd), y se analizan mediante el uso de protocolos de hibridación estándar y herramientas analíticas. El perfil de expresión se realiza para identificar conjuntos de genes relacionados con la acumulación de Cd y para determinar la influencia del Cd del suelo sobre la variación de los transcritos de NtMRP3 y NtMRP4. Las sondas NtMRP3 y NtMRP4 usadas se encuentran en el primer y el último exón así como también en la región 3' UTR. Los resultados que se muestran en la Tabla 2 indican que las hojas de plantas de N. tabacum cultivadas en un suelo contaminado con Cd acumulan más Cd que las plantas de N. rustica cultivadas en el mismo suelo. Las raíces de plantas de N. tabacum acumulan menos Cd que las raíces de plantas de N. rustica. Curiosamente, tanto NtMRP3 como NtMRP4 no se regulan por Cd, pero su expresión es diferente en las dos especies de Nicotiana, lo que sugiere que ambos genes conducen de forma diferente la captación, translocación y acumulación de Cd en las accesiones de Nicotiana (los datos están en log 2 y corresponden a la media de tres repeticiones biológicas). Como controles, se muestra la expresión de tres genes de mantenimiento (UBP12, exones 1 y 2), a-tubulina y la proteína ribosomal S16.
Tabla 1
Codón AS Codón AS Amplicón sec f sec r ori ori mut mut Exón 1 NtMRP4-1 gaagctggaatg attttaaagag gau asp aau asn Exón 1 NtMRP4-1 atgcttatt gatcgacact cga arg uga stop Exón 1 NtMRP4-1 aggttgtcatg tcagctagac ugc cys ugu cys Exón 1 NtMRP4-1 tgctcagcta acaggctcatg aga arg aaa lys Exón 1 NtMRP4-1 acaggctcatg tgttggacag ggu gly gau asp Exón 1 NtMRP4-1 caggctcatg tgttggacag ggu gly gau asp Exón 1 NtMRP4-1 tgttggaca attgtaaattat cag gln caa gln Exón 1 NtMRP4-1 ccgtagatgct agcagctttc cag gln uag stop Exón 1 NtMRP4-1 gcagctgtcc atatgatgcta gau asp aau asn Exón 1 NtMRP4-1 gctacagcta attccatttg cau his uau tyr Exón 1 NtMRP4-1 attccatttg ctcatgccatt ugg trp uga stop Exón 1 NtMRP4-1 tgccattgcaa tttctgtggc guu val auu Ile Exón 1 NtMRP4-1 ctttagccatc tttatactta cuu leu uuu phe Exón 1 NtMRP4-1 ttcaactgtt taacactagc gua val aua ile Exón 1 NtMRP4-1 tggacttgca cagtgatggta gca ala aca thr Exón 1 NtMRP4-1 aggcaacaaat agatgctta gag glu aag lys Exón 1 NtMRP4-1 ttataaagtt caggcatggg uuc phe uuu phe Exón 1 NtMRP4-1 ttataaagtt caggcatggga uuc phe uuu cys Exón 1 NtMRP4-1 attgaatcttt cgcgagtccga uuc phe uuu phe Exón 1 NtMRP4-1 aatctttccgc agtccgagt gag glu aag lys
Exón 1 NtMRP4-1 agtacggatg ttgtccaagtt ugg trp uga stop Exón 1 NtMRP4-1 agttcttgtact aatagctggt uca ser uua leu Exón 1 NtMRP4-1 cattgtcttgt gagcactcct ugg trp uag stop Exón 1 NtMRP4-1 ttgtcttgtg agcactcctc ugg trp uga stop Exón 1 NtMRP4-1 tggagcactc tcttctagt ccu pro cuu leu Exón 1 NtMRP4-1 tcttctagttg tacgctcactt gcu ala guu val Exón 1 NtMRP4-1 atcccgcttg cgcaggaaca gcg ala acg thr Exón 1 NtMRP4-1 atcccgcttg cgcaggaaca gug val aug met Exón 1 NtMRP4-1 gaaccgatca ggctttccct agg arg aag lys Exón 1 NtMRP4-1 aaccgatcag gctttccctc agg arg aga arg Exón 1 NtMRP4-1 catgatctca tttcacaagca cuu leu uuu cys Exón 1 NtMRP4-1 atctcttgata attggacaaat aga arg aaa lys Exón 2 NtMRP4-2 tattagaagct gaatggatttt gga gly aga arg Exón 2 NtMRP4-2 ttcaccgcga atctctcttc aca thr aua ile Exón 2 NtMRP4-2 aaacaaccaaa agagcaatgc gag gly aag lys Exón 2 NtMRP4-2 ccttgaagaat aaaatcttctc uca ser uua leu Exón 2 NtMRP4-2 agaatcaaaat ttctcgaagat ucu ser uuu phe Exón 2 NtMRP4-2 tatctaaggaa aaaacggaga gaa glu aaa lys Exón 2 NtMRP4-2 tcaacagtcta atctga aca thr aua ile Exón 2 NtMRP4-2 atctgatagg gggattctaaa ggg gly agg arg Exón 2 NtMRP4-2 acttataaag aagaagaaag gaa glu aaa lys Exón 2 NtMRP4-2 aacttataaag aagaagaaag gaa glu aaa lys Exón 2 NtMRP4-2 aaggaagaa aaagagaaactg gaa glu aaa lys Exón 2 NtMRP4-2 gctatatatta tgaagcttttg acu thr auu ile Exón 2 NtMRP4-2 gctatatatta tgaagcttttg acu thr auu ile Exón 2 NtMRP4-2 gaagcttttg atggtgggg gga gly gaa glu Exón 2 NtMRP4-2 ttggatggtg ggcgtagtgct ugg trp uga stop Exón 2 NtMRP4-2 ttgtggcaaa ttctctaatg agu ser aau asn Exón 2 NtMRP4-2 gttctctaat gcaagtga aug leu aua leu Exón 2 NtMRP4-2 gcaaagttct taatggcaag cua leu uua leu Exón 2 NtMRP4-2 tattggctg catatgaaac gca ala aca thr Exón 2 NtMRP4-2 caacaaatga atgcttaatt gag glu gaa glu Exón 2 NtMRP4-2 cttcagcrgay gtgccatgtcct cgu arg ugu cys Exón 2 NtMRP4-2 tgtccttcaat cttctctgtt ccu pro ucu ser Exón 2 NtMRP4-2 ggcatgggaa aacattttaa gaa glu aaa lys
Tabla 2
Figure imgf000045_0001
Figure imgf000046_0001
Secuencias (el sombreado indica la posición de los exones)
Sec. con núm. de ident.: 1 (secuencia de ADN de NtMRP4 con 5' y 3' UTR)
t c c t a g t a c t g t a a g t g a a c c a g c a a g g a a a c t g c a a a g t a g a t t t c t t g t t c a t c a a a t a a a t c c t t g a g c t g a g a g a t a t g a t t t t t t c t a a g g a a t t t c t c t t t g g c t c t c t g t a g t g g t g a g t t t g a t t c a t a t t t c a a t c t a g t t t t t a g c t t t g c t t a a a a g c t t c t t c t t g c c a c t a g a c c a a a t c c t t t t c c t t t t t g c a t g a c a c t t t t t t g a g t t t c a t t t c t c t t a t t t a t a g a g a a a a t c t t t t g a t g g g g a t g g t t t t t t t t c t c t t t t g c a t t a a t g a t t a g a a t t t a t c a t t g t t a a a t g g t a c t c c c t c a a t a a c t t t t t g a t t t a a a a a a a a a a c t g t c c t t t c a t t c a t a a t c a t c a t c t c c t t t a t t a t a t t a c t c t a a a c t g t t g c t a a a g t t c c t t t t t g t a t a t t t t c c c t a c a t g a a c t e t t g c t g t a c t g t g a a a g t t g a t g a a c t t t t a t t g t a c a a t g t t t t g g t c c a g t a g c t a a c a g c c c t t t t a t t t a a t t c t g a g a g g t c t c t t t c t c t t t c t c t t c a c a c t t t c a c a t g t t t c c g t t t c c t g t a g a t t t c t c c t t t c t c t t t c c t t g g t t c t t t t t c c a a c t c a t a a t c t t c a t g t g a t t t c a a t t t t t g t t t g t t t t t a t t c c a t c c t t t g t c t c t t t t g a t a t g g g t g a c a a a c a t c t t c t c t t g c t g a a t a a a a a t t t c a c c t t t t t t c a g t g t a t g c a g a t t c a g g g g a t a t a a a g a c a t a a a g g a t g a a t c t t t t a t g g t a t a a c a t g g a t a t g a g g a a c a g t a t g t c t t c a g a a t c t t g t t t a g c a t c a c t t t c t t g t t c t g c c t c c a c a t t t c a a t c g t c a g a g g a t t c a g c a g t t g t t a a a t g g t t a a g a t t c a t t t t c c t c t c t c c a t g t c c a c a a a g g a c t c t t c t a t c t t c c a t t g a t g t g c t g c t t t t g c t t a c t t t c a t t g t a t t t g c a g t a c a a a a g t t g t a c t c a a a g t t g a g g t c c a a t g a g c a c t c t a c t t c t a g c a t t g a t a a g c c t c c a a t t g c a c a c a a c a g g a c t t c t g t t a g a a c c a a t c t t t g g t t t a a g c t g t c t c t g a t t t t g t c a g c t a t t t t a g c c t t a t c t t c t a t a g t t t t a t g c a t t t t g g t t a t t g t g g g a a a t t c c c a g t c g c c t t g g a a a g t c a t a g a t g g a c t g t a t t g g t t g t t t c a g g c g a c t a c a c a t g t t g t a a t c a c t a t a c t a a t a g t t c a t g a g a a a a g a t t t c a c g c t a t t t c c c a t c c a c t g t c c c t g c g c g t g t t t t g g a t t g c a a a c t t t g t a g t t a t g a g t t t g t t c t t t g g t t g t g g g a t c a c a a g g c t t g t g t c a c t t a a g g a a a t t g a t c c t a a t t t a a g a a t g g a t g a t a t a a g t t c a t t a g t t t c a t t t c c t a t t t c t g t t g t t c t c t t c a t t g t t g c c a t t a a a g g t t c g a c c g g a g t t g c t g t a a t t a g t g a t t c t g a a t c t c a c t t a a g t g a t g a a a c c a a t g g t t a t g a a c t c c t g g a t a a a t c c a g t g t g a g t g g c t t t g c t t c a g c t t c t c t a a t a t c g a a a g c c t t t t g g a t t t g g a t g a a c c c t t t a c t g c a a a a a g g t t a c a a g t c a c c t c t c a a g a t t g a t g a a g t t c c t t c a c t t t c c c c a c t g c a t a g a g c a g a g a a a a t g t c t c a a c t t t t c g a a a g a a a t t g g c c t a a a c c t g a a g a a a t a t c a a a g c a t c c t g t c c g a a c a a c a t t g c t g c g t t g c t t t t g g a a g g a a g t t a t t t t t a c t g c c a t t c t t g c a g t a a t t a g g g t a t g t g t t a t g t a t g t a g g g c c a a c a c t c a t a c a a a g a t t t g t t g a t t a c a c a g c a g g a a a g a g g a c a t c t c c t t a t g a a g g a t a c t a c c t t a t a g g a a c t c t c c t a a t a g c c a a a t t t g t g g a a g t c c t a a c c t c t c a t c a g t t c a a c t t t a a c t c c c a a a a g c t t g g c a t g c t t a t t c g a g c g a c a c t t c t c a c t t c t t t g t a t a a g a a g g g g t t a a g g t t g t c a t g c t c a g c t a g a c a g g c t c a t g g t g t t g g a c a g a t t g t a a a t t a t a t g g c c g t c g a t g c t c a g c a g c t g t c c g a t a t g a t g c t a c a g c t a c a t t c c a t t t g g c t c a t g c c a t t g c a a g t t t c t g t g g c t t t a g g c a t c c t t t a t a c t t a c c t c g g t g c t t c a a c t g t t g t a a c g c t a g c t g g a c t t g c a g c a g t g a t g g t a t t t g t g g t g t t t g g a a c t a a a a g a a a c a a c a g g t t t c a a t t t a a c a t c a t g a a g a a t c g t g a t t c t a g a a t g a a a g c g a c a a a t g a g a t g c t t a a t t a t a t g c g c g t t a t a a a g t t c c a g g c a t g g g a a g a a c a t t t t a a c a a a a g a a c t g a a t c c t t c c g c g a a t c c g a g t a t g g a t g g t t g t c c a a g t t c t t g t a c t c a a t c g c t g g g a a t a t c a t t g t c t t g t g g a g c a c t c c t c t t c c a g t g g c t a c a c t c a c t t t t g g a a g t g c a a t c t t g t t g g g a a t c c c g c t t g g t g c a g g g a c a g t g t t c a c t g c a a c a t c t c t c t t c a a g a t g t t g c a g g a a c c g a t c a g g g c t t t c c c t c a a t c c a t g a t c t c a c t t t c a c a a g c a a t g a t a t c t c t t g a t a g a t t g g a c a a a t a t a t g a t g a g t a a g g a g t t a g t g g a t a a a g c t g c g g a a a g a c t a g a a g g t t g t g g g g g t a c a a t t g c t a t g c a g g t g a a a g a t g g a g c t t t t t g c t g g g a t g a t g a a a a c a g t a a a g a a g a a t tg a a a a a tg ta a a c t t t g a g a t t a g a a a a g g a g a g c t t g c a g c a g c a g t g g g g a c a g t t g g g g c g g g g a a g t c t t c c c t c c t t g c a t c t g t a c t t g g t g a g a t g c a c a a g t t g t c g g g t c a g g t a t g g c t c t c a t c c t t c t g t t t g t t t g a t t a a t a c a a a c t t t g c t g c c a a t t a c c t t t t g c c c c t t g t t g c t a c c t c t t t t c t g t g g t a t a a a a a a t t a a t g t a g g c t a a t g t g t a g a g t g g a g g t a t t a t a t g c a g a a c a a t t g c a a t c a a g c a a t t a c c t g t g a g a t a c t a t t t t g t t t t c a t a t t a g t g g a c t g g t a c a t t c t c a t t g g t g t a t c g t t t g a t c t c c a c c a a a g c a g a g g t t t t a c t g g c c g a c a g a g t c a a a c t a c t g t g c t t c a c t c c t t t t a c t c c a a t c c t t a g t a g t c t t t g c t t c t a a t g a a c t t c a a g c g t g t a a t a g a a a c a c c a t t a t a t t a t t a g c t g a t t a g t t a c t t t a c a a t t c c a g a g c a t a t t t a c a t t t t c t g c t t g g t t g t c t a t t a c t c t g g a t a a c a g t c c t a a a t g c a a g c a a a a t c a a c t g t g t t t t c a g t c t t g a g c t g a c c a a t t a g t t c a t g a t g t c c t c a g c t t g t c c a a g c t g g t g c c t c a c c g g a a t t a t g t g g g a c c t t c g t a c t t a a t c a a c t a g t t c a c c t t c t t c t t a a a a a t a t t g a a t g a t t t g a t t g g c t a a t a g t t c c t c a a a t g t a g t a a t t a t t t g c t a a c t t a c t t t a c c a a c c c c t t g t c c a a c a g g t c a c a a t t t g t g g t t c a a c t g c c t a t g t t g c a c a a a c a t c g t g g a t t c a g a a t g g c a c g a ta c a a g a a a a t a t c c t g t t t g g t a t g c c a a t g a a c a g a g a c a g a t a c a a g g a a g t g a t c c g g g t t t g c t g c t t g g a g a a g g a c t t g g a a a t a a t g g a g t t t g g a g a c c a g a c t g a a a t a g g a g a a c g t g g c a tc a a c c tc a g tg g tg g tc a g a a g c a g c g a a tc c a g c t tg c a a g a g c t g t t t a c c a g g a c t g t g a t a t t t a t c t t c t a g a t g a t g t a t t c a g t g c a g t t g a t g c t c a c a c t g g c t c t g a a a t c t t c a a g g t t a g a a g t c c a c a a t g t c a t g t g t c a t t g a a g a t t t a a t t t a a g a t a g a a a t t a c a t t g t t t c a t t c t g c a a a t t a t g g a c c t a t c a g a g a a a a a t c a t g g a t t t t g a a t g g c t a c t t t c c c c a g t g a a g a c a c a t a t c a t t t c c t g g g a g g a a g a t g t g a a a g t g g c a a g c t a t t t a c t c c a a a a a g t a t a a t c t a a a a g a c t t t t a t t a a g t t t g g a a g g c t t a a t c c a t c a t t t g t t a t c t g t t g t c t a c t t g t c t t t a t t a a a a t t c t t c t t a g t c c a a t c a c t t t c g a t g a a g t t g a c t a g t c t t a g t c a c c t g a a t a c t t t a a a t c t t t g c c t t g g t g t c t c t a t a t t t t c a g c c a t c t c a a t t c c g a a g c t c a t a t t t g t t t t c t c t t t g t a a t g t c c a t c t g a a a g t t t c a t g c t t t t t t g c a g g a a t g t g t g a g g g g a a t t c t t a a a g a t a a a a c c a t t t t g c t t g t c a c a c a c c a a g t t g a c t t c t t g c a t a a t g t t g a c c t g a t c c t t g t a a g t t t c a g a g t g t t t t a t c a a c c c c t t t g g a a c c a a g t g t c a a g a g t a g t g t t t c t t g g t t g t t a a a t g a t t c a c a t g t g t g t t g g t t t c t a t a a a a c c t g a a c t t t a t g t t t t a t c a g a g t g t t t t g c t t t c t t g a a g g t c a t g c g a g a t g g g a t g a t c g t g c a a t c t g g c a a a t a t a a t g a g a t a t t a g a a g c t g g a a t g g a t t t t a a a g a g c t a g t a g c t g c a c a t g a g a c c c c t t t a g a a c t t g t t g a c g t g g a a a c a a c c a a a g a g a g c a a t g c c t c c c t t g a a g a a t c a a a a t c t t c t c g a a g a t t a t c t a a g g a a g a a a a c g g a g a t g a t a a a t c t c a a c a g t c t a c a t c t g a t a g g g g g g a t t c t a a a c t t a ta a a g g a a g a a g a a a g a g a a a c t g g a a a a g t c a g t c c t c g t g t g t a c a a g c t a t a t a t t a c t g a a g c t t t t g g a t g g t g g g g t g t a g t g c t a g t t a t c t t g t t t t c g t t c t t g t g g c a a a g t t c t c t a a t g g c a a g t g a t t a t t g g c t g g c a t a t g a a a c t t c a g c g g a t c g t g c c a t g t c c t t c a a t c c t t c t c t g t t t a t t g g g a t a t a c g g t g t t a t t g c a g t t g t t t c t t c g t t g c t g a t a g t g a t c a g g a t g t a t t t t g t g a c a c t t a t g g g g c t c a a g a c t g c c c a a a t a t t t t t c g g a c a g a t t c t t t a c a g c a t a c t g c a t g c t c c t a t g t c a t t t t t t g a c a c a a c a c c t t c c g g a a g a a t t c t g a g t c g g g t a a a t t t c t g a g g a c a a g t t t t t c c t t t t g c a t g t a a a t t c a a a c t t t g c t g c t t a g a t g a t t a a a t a a t g a a a a a t a t c c a t t g c a t g t t t t a a t g t g t a t g a c a t g t t a g a a t t t t g a a t a g a a g t t c a t t c a c t g a t g t t g a g a t g t t t t g t t t t t t t t c t g c a g g c a t c t a a t g a t c a g a c c a a c a t t g a t g t c t t c c t c c c g t t t t t t a t g a a t c t c a c t t t g g c c a t g t t t a t c a c a c t g c t c g g c a t c a t c a t c a t c a c a t g c c a a t a t t c t t g g c c t a c c g t a c t a c t t t t g a t t c c t c t g g g t t g g c t t a a t a t c t g g t a c c g g g t a t g a g c a c t g t t t a t a a c a g c c g t c c t t t t t t c t t t t c t t g t c t g a a c t c a a a t t t g a a t c c t t t g t t t a g a g g c a a t t a g t c t g c t c t g a g c a t t t t g g c t g a c a g t t a t t a t g t a t a t t a a a a g g c a a c t t t t t t a t t c g t t c t g t c c a g c t a a a a c t t t t t a c t t a a a a t g t g g t t a a c t g c a t a t t t c t g t g t c t c c t a t t t t t t g a t t a t t t g c a a c t c t g a t c a a t c t a g a t t t g g g g a a g g c t t g t t g t t a g t t g a t g a c t a g a t a c t a a g c t c a c a t c t a c a t t g g t t g c a a g t a g a a t t t t c a a g t t g t c a t t c a c t t a t a t t g t t t g a a c t a g g a g a t t a g c a t t c t t c t g c a a g g a g c c c t g a a t g c t t g a a a a g t t a a a c a g a a a a g a a a a a g t t c a g g g c a g a t a g a c a t a a t g t g t t a a a g t a a t t c a a t t g g a g c a c a g a t a t a t g a c a t g t g t t a t t t g g g a g c t a c g a a a a a g a t a a g g a c t a C t a t g t a g a c t a c a a t t g a a a t a a c a g g t a a t t c a t t t c t g g t t t a c a g g g a t a t c a t c t t g c a a c a t c t c g t g a a t t g a c t c g g c t t g a c t c a a t t a c a a a a g c a c c t g t t a t t c a t c a t t t c t c t g a a a g c a t c t c a g g t g t t a t g a c t a t a c g t t g c t t t a g g a a g c a g g a g a t g t t t t g t a a c g a g a a t g t a a a c c g a g t g a a t t c c a a t c t g c g a a t g g a t t t c c a c a a c a a t g g a t c c a a t g a a t g g t t g g g c t t t c g a c t g g a a t t g a t g g g a a g c t t a c t t c t t t g t g t t t c t g c a a t g t t c a t g a t t g t c t t a c c t a g c a g c a t c a t c a a g c c a g g t a t a a c a c c g t c c a a t g c t c a t t t a t g g g a a t t a t a a a t t c t a g t a t t t g a t a a t c c t t c t g t a c t t t a g a t c t a c c t g c t c t a c t g a a a a a t g a a a t g a g t a t g a g g a a a t a g a a t a t c c g t t g a g c a t t t a t g t c t t t c t a t t a a a a a t t t g c a t t c t a t c t t c t t g t t t c a a g t c a a a a t c t t g a a c a a c t a t a t c t a g a g a a t t t t c c t t c t t g t g a a g t a a t g c a t a t a t a c a t c a a g a g a a g t c a g a g t t g c t g a a t g a a a t a g t a g a t c a a a t t t a a g t g t t g t g c c t a t a a a g a a t t g t a t g g t g a g a t t g a a t a t a g t g g t c a t a t t a t t t t c t c a a t c t t a g t g a t t a a a g t a t t e c a t a c a a a c a g a c a a g c a t t t a g c c g t g c a t t c a t t g g c a c t a c a a a a t t a t c a a c c a a g a g t a a t a t t c t t t c a g c t t t c c t c t g t a t a t g c g t g c t c t a t t c t g g a g c t g a a g a t a a c t a a t a t t c t t t t t t a t t t c t a c a g a a a a t g t t g g t t t g t c a c t a t c a t a t g g c t t g t c t c t t a a t a g t g t c c t a t t c t g g t c c a t c t t t g t g a g t t g c t t t g t g g a a a a t a a a a t g g t t t c t g t c g a a a g a t t a a a a c a g t t c t c a g a a a t a c c a t c a g a a g c a g a g t g g a g a a a g a t g g a t t t t c t c c c a c c t t c a a g t t g g c c a a g c c g t g g g a a t g t t g a g c t t g a a a a c g t g c a g g t a a t a a t t c t a a c t a a t t c t g t g g t t g c t a t t t g c t a g c a t t t g c a c a a a a g g a a a a c t a t a a a a a g t t c a t a g t a a g g a a g a g a g g g t a g c t g t a t t a a c a a g c c t a c a g a t t c t t t a a t t t c a a a t a t g t t a c g t t g a a t c t c t a t a t t g c t t g t t c t a c t g g t c a a c a g g t t a g a t a t c g t c c g a a c a c t c c t c t a g t g c t t a a a g g a g t t a c t c t c a g c a t t a g a g g g g g a g a g a a g a t a g g t g t t g t t g g t c g t a c a g g g g g t g g a a a a t c a a c a t t a a t t c a a g t t t t c t t t c g t t t g g t g g a g c c t g c a g c t g g a a g a a t a a t c a t t g a t g a c g t a g a t a t a t c c a g a c t t g g g c t t c a t g a t c t t a g a t c t c g c t t c g g g a t c a t t c c c c a a g a g c c a g t c c t t t t t g a a g g a a c t g t g a g a a g c a a c a t t g a c c c c a t t g g a c a a t a t t c a g a t g a t g a a a t t t g g a a g g t a a t c t a a c t t g c t g a c t g a a a t a a t t t a c a a a a a t c t c a a a a t a t a g t a c a g a g t t a g c c a a a c a t g t c t t c t g a g t g c t g a g a t c t t t t t g g a t t a t a a a t t c t g t a a g a g c a a c a t a c t a t t t g t t a g t g a g a a g a a a a g c a t a t a c t c c a g t g t t t t g t t a t c t c c c a g a a t g t c t c t a a c a t g a a a t c g t g t a c a t t g c a g a g c c t c g a a c g c t g c c a a c t c a a a g a t g t g g t g t c t t t a a a a c c c g a a a a a c t t g a t t c a c c a g g t a a a t t t t c c t c c t c t a c g t c a t c c t t g t g g t t c t t t g c g g a a t t a t g c a a c c a a c t t t t t a t g t g t t t c a a a t a t a t a t a c t g a t a a c t g a a t a c t g t c a t t g g t a a a t c a t a g t t g t t g a t a a c g g a g a t a a c t g g a g t g t c g g a c a g a g g c a g c t t c t t t g c t t g g g a a g a g t g a t g c t a a a a c g t a g c a g a c t t c t a t t t a t g g a t g a g g c a a c t g c c t c t g t t g a t t c a c a g a c a g a t g c a g t g a t t c a g a a a a t c a t c c g c g a g g a c t t t g c g g c c t g t a c t a t a a t c a g c a t t g c c c a c a g a a t a c c a a c a g t c a t g g a c t g t g a t a g a g t t c t t g t t a t a g a t g c a g g t g c t g a t t t c t c t c c t t t t a c t t t g t a c c t t a t t t t g a a t c t g g t a a a t g a t t a t t t a t c t g t a t g t g a t g g t t t c c a a c c a a t c a t a g t c a g t a c c t t t a t g a a g a a a t t g c c t a a t g t t a g c c a a g t a g t a g t a a a t g c a t g a a g t c a t t a g c c t a t t t g t t t t g g a t t t t g t g a g t t t c a t a c t t c a a a c t g g a a g c t t a t g c t a t a c t a t c t g a t c c c t t g t t t g t a t a g a t t g c t t t c t t t t c c t t t t t c t c g g a t t t a t c t t a t a t a t a a g c g g a c a g a g t a a a a g a a t g t a a a c a t g c g t a a t t t g a c c t a t t a t a g c a g a t t a t t t g t c t t a t t t t c c a g g t c g c t g a t t c c a c t t a t t a g g a g t a g t t a c a c g t a t t t a t c t t t t a a g t g a a a t a a t a g t g t a a a g t t t c t t t t g g c a c t g t c g g t g t a a a g a a g t t a a a c t c c t t t c t t t a a c c c c g g c a t t t c t t a t t c a t g c a g g a a t a g c a a a a g a g t t t g a c a a a c c a t c t c g t t t g c t t g a a a g g c c t t c a c t t t t t g g g g c t c t g g t t c a a g a a c a c g c c a a c c g a t c c t c t g a g c t c t a a c c a c a c t a t t t t g g c t t t c a t g c c t t t t g c t g t a a a t t g c a g c t a t c t t g g a g g a t a g g t g a a a c a g g a a a a a t a c c t a t c c a a a t g t t a c a t a g a t t t c c a a a t a g t g t t a t c t c c t a c t a a g c t a t c c a g t a g a t t t t t g g a a a t g t a a c a a t a t t g g g a t t a a c a a t t g t a a t t g a t g a a t c t a t t a a t c a a a t a c a a t g a t t a t t c t g t t a t a g a t g t a g t c t g t g c a a t g t t a t a t a g a c t g a t t t c
Sec. con núm. de ident.: 2 (secuencia de ADN de NtMRP4 sin 5' y 3' UTR)
a t g g a t a t g a g g a a c a g t a t g t c t t c a g a a t c t t g t t t a g c a t c a c t t t c t t g t t c t g c c t c c a c a t t t c a a t c g t c a g a g g a t t c a g c a g t t g t t a a a t g g t t a a g a t t c a t t t t c c t c t c t c c a t g t c c a c a a a g g a c t c t t c t a t c t t c c a t t g a t g t g c t g c t t t t g c t t a c t t t c a t t g t a t t t g c a g t a c a a a a g t t g t a c t c a a a g t t g a g g t c c a a t g a g c a c t c t a c t t c t a g c a t t g a t a a g c c t c t a a t t g c a c a c a a c a g g a c t t c t g t t a g a a c c a a t c t t t g g t t t a a g c t g t c t c c g a t t t t g t c a g c t a t t t t a g c c t t a t c t t c t a t a g t t t t a t g c a t t t t g g t t a t t g t g g g a a a t t c c c a g t c g c c t t g g a a a g t c a t a g a t g g a c t g t a t t g g t t g t t t c a g g c g a t t a c a c a t g t t g t a a t c a c t a t a c t a a t a g t t c a t g a g a a a a g a t t t c a c g c c a c c c c c c a t c c a c t g t c c c t g c g c g c g t t c t g g a t t g c a a a c t t c g c a g t t a t g a g t t t g t t c t t t g g t t g t g g g a t c a c a a g g c t t g t g t c a c t t a a g g a a a t t g a t c c t a a t t t a a g a a t g g a t g a t a t a a g t t c a t t a g t t t c a t t t c c t a t t t c t g t t g t t c t c t t c a t t g t t g c c a t t a a a g g t t c g a c c g g a g t t g c t g t a a t t a g t g a t t c t g a a t c t c a c t t a a g t g a t g a a a c c a a t g g t t a t g a a c t c c t g g a t a a a t c c a g t g t g a g t g g c t t t g c t t c a g c t t c t c t a a t a t c g a a a g c c t t t t g g a t t t g g a t g a a c c c t t t a c t g c a a a a a g g t t a c a a g t c a c c t c t c a a g a t t g a t g a a g t t c c t t c a c t t t c c c c a c t g c a t a g a g c a g a g a a a a t g t c t c a a c t t t t c g a a a g a a a t t g g c c t a a a c c t g a a g a a a t a t c a a a g c a t c c t g t c c g a a c a a c a t t g c t g c g t t g c t t t t g g a a g g a a g t t a t t t t t a c t g c c a t t c t t g c a g t a a t t a g g g t a t g t g t t a t g t a t g t a g g g c c a a c a c t c a t a c a a a g a t t t g t t g a t t a c a c a g c a g g a a a g a g g a c a t c t c c t t a t g a a g g a t a c t a c c t t a t a g g a a c t c t c c t a a t a g c c a a a t t t g t g g a a g t t c t a a c c t c t c a t c a g t t c a a c t t t a a c t c c c a a a a g c t t g g c a t g c t t a t t c g a g c g a c a c t t c t c a c t t c t t t g c a t a a g a a g g g g t t a a g g t t g t c a t g c t c a g c t a g a c a g g c t e a t g g t g t t g g a c a g a t t g t a a a t t a t a t g g c c g t c g a t g c t c a g c a g c t g t c c g a t a t g a t g c t a c a g c t a c a t t c c a t t t g g c t c a t g c c a t t g c a a g t t t c t g t g g c t t t a g g c a t c c t t t a t a c t t a c c t c g g t g c t t c a a c t g t t g t a a c g c t a g c t g g a c t t g c a g c a g t g a t g g t a t t t g t g g t g t t t g g a a c t a a a a g a a a c a a c a g g t t t c a a t t t a a c a t c a t g a a g a a t c g t g a t t c t a g a a t g a a a g c g a c a a a t g a g a t g c t t a a t t a t a t g c g c g t t a t a a a gt t c c a g g c a t gggaagaac a t t t t aac a a a a g a a ttg a a t c c t t ccgcga& tccgagta t g s a tg g r tg tC c a a g t t c t tg r a c tc ñ a ü c g c tg g g a a ta tc a t tg tc tc g tg g a g c ü C t c c t c t t c t a g t g g c t a c a c t c a c t t t t g g a a g t g c a a t c L t g t tg g g a a tc c c g c t t g g tg c ag gga ca g t g t t c a c t gcaa ca t c t c t C11 caa ga c g 11 ge ag ga ac: cgatca ggg c t t t c c c t c a a C c c a t g a t c t c a c t t t c a c a a g c a a t g a t a t c t c ¡ t t g a t a g a t t g g a c a a a t a t a t ga tga gt a aggagt t ag tg ga t aa agetg t gga aa ga c t a ga a g g t t gtggggg ta c a a c c g c ta tg c a g g tg a a a g a tg g a g c t t t t tg c tg g g a tg a tg a a a a c a g ta a a g a a g a a tc g a aa aa tg taaac tt tg ag a tcag aaaa g g a g ag c ttg cag cag t iag ^ g g g g ac a g t tg g g g c g g g g a a g tc t t c c c tc c t tg c a t t tg ta c t t9 g tg a g a t9 C a c a a g t tg tC g g g t c a g g t a t g g c c c t c a t c c c t c t g t t t g t t t g a t t a a t a c a a a c t t t g c t g c c a a t t a c c t t t L g c c c c t t g t t g c t a e c t c t t t t c t g t g g t a t a a a a a a t t a a t g t a g g c t a a t g tg ta g a g tg g ig g ta t ta t & t g c a g a a c a a t t g c a a t c a a g c a a t t a c c t g t g a g a t a c t a t t t t g t t t t c a t a t t a g t g g a c t g g t a c a t t c t c a t t g g t g t a t e g t t t g a t e t c c a c c a f la g c a g a g g c c t ta c tg g c c g a c a g a g tc a a a c ta c tg tg c t tc f lc r tc c t t t ta c te c a a t c c t tA í j t a g tC t t tg c tE C t f lA tg a a e t tc a a g a g tg ta a ta g a a a c a c c a t ta ta C t a t t a g c t g a t t a g t t a c t t t a c a a t t c c a g a g c a t a t t t a c a t t t t c t g c t t g g t t g t c t a t ta c tc tg g a c a a c a g tc c c a a a c g e a a g e a a a a tc a a c tg tg t t t tc a g tc t tg a g c i : g a c c a a tc a g ttC a C -g a tg c e e te a g e ttg tc c a a g c tg g tg c c C c a c c g g a a tta c g tg g g a c c t t c g t a c t t a a t c a a c t a g t t c a c c t t c t t c t t a a a a a t a t t g a a t g a t t t g a t t g g t c a a t a g t t e c t t a a a t g t a g t a a t t a t t t g c t a a e t t i c t t t a d c a a c e c í t t g t C C aacag g tcae aa t L t g t g g t t c a a c t g c c t a t g t t g c a c a a a c a t c g t g g a t t r a g a a t g g c a c g a ta c a a g a a a a ta tc e tg t t tg g ta tg c c a a tg a a c a g a g a c a g a ta c a a g g a a g tg a tc c g g g t t tg c c g e t tg g a g a d g g a c t tg g a a a ta a tg g a g t t tg g agaccagactg a a a ta g g ag aa cg E g g ca tcaacc tcag tg g tg g tcag aag ca g c g aa tccag c ttg eaa g a g ? t g t t t a c c a g g a c t g t g a t a t t t a £ C C t C l : a g a t g a t g t a t t c a g t g e a g t t g a t g c tc a c a c tg g c tc tg a a a t c t t c a a g g t t a g a a g t c c a c a a t g tc a t g t g t c a t t g a a g a t t t a a t t t a a g a t a g a a a t t a c a t t g t t t c a t t c t g c a a a t t a t g g a c c t a t c a g a g a a a aa t c a t g g a t t t t g a a tg g f l ta c c t tc c e c a g tg a a g a c a e a ta tc a tL te g tg g g a g g A a g a t g t g a a a g t g g c a a g c ta t t ta c tc c a a a a a g ta ta a tc ta a a a g a c t t t t a t t a a g t t L 9 g a a g 9 e t t a a t c c a t e a t t t g t t a t c t g t t g t c t a c t c g t c t t c a t t a a a a t t c t t : c t t a g t c c a s t c a c t t t c g a t g a a g t t g a c t a g t c t t a g t c a c c t g a a t a c t t t a a a t e t t t g c c t m g g t g t c t e t a t a t t t t c a g c c a t c r t e a a t t e e g a a g e t c a t a t t t g t t c t c t c t t t g c a a t g t c c a t c t g a a a g t t t c a t g c t t t t t t g c a g g a a t g t g t g a g g g g a a t t e r t t s a a g a t a a s a c c a t t t t g c t t g t C a c a c a c e a a g t t g a c t t c t t g c a t a a t g t t g a c c t g a t c c t t g t a a g t t t c a g a g t g t t t t a t c a a c c c c t t t g g a a c c a a g t g t c a a g a g c a g t g t t t c t t g g t t g t t a a a t g a t t c s c a t g t g t g t c g g t t t c t a t a a a a c c t g a a c t t t a t g t c t ta E c a g a g tg t t tu g c t t tc r t tg a a g g tc a tg c g a g a rg g g a tg a tc g tg c a ñ tc tg g c a a a t a t a a tg a g a ta t ta g a a g c tg g a a tg g a tc t ta a a g a g c ta g ta g c tg c a c a tg a g a c e t e t t t a gAa e t tg 11 ga e g tg g a a i ta a cea aa gaga g esa t g cc t cc c t tgaa ga a tc a a a a tc t tc tc g a a g a t ta tc ta a g g a a g a a a a c g g a g a tg a ta a a te tc a a c a g tc caca tc tg ac ag g g gg g a c tc taaac ttacaaag g aa g aag aaag ag aaac tg g aa aag t C a g t c c t c g t g t g t a c a a g e t a t a t a t t a c t g a a g e t t t eg g o tg g tg g g g tg ta g tg e t a g t t a t c t t g t - t c t c g c t c t t g t g g c a a a g t t c t c t a a t g g c a a g t g a t t a t t g 9 ctggc 4 t a t g a a a c L t c a g c g g a t c g t g c c a t g t c c t t c a a t c e t t c t c t g t t t a t t g g g a t a t a c g g t g t t a t t g c a g t t g t t t c t t c g t t g c t g a t a g t g a t c a g g a t g t a t t t c g t g a c a c t t a tgggg c tcaagac tg c CCaa a t a 1 1 t t t c g g a c a g a t t c t t t a c agea t a c t g c atg c t c c t a t g t c a t t t t t tg a c a c a a e a c c t t e e g g a a g a a t t c t g a g t c g g g t a a a t t t c t g a g g a c a a g t t t t C C C t t t t g c a t g t a a a t t c a a a c t t t g c t g c t t a g a t g a t t a a a t a a t g a a a a a t a t c c a t t g c a t g t t t t a a t g t g t a t g a c a t g t t a g a a t t t t g a a t a g a a g t t c a t t e a c t g a t g t t g a g a t g t t t t g t t t t t t t t c t g c a g g e a tc ta a tg a tc A g a c c s s c a t t g a t g t c t t c e t c e c g t t t t t t a t g a a t c t c a c t t t g g c c a t g t c t a t c a c a c t g c t c g g c a t c a t c a t c a t c a c a t g c c a a t a t t c t t g g c c t a c c g t a c t a c t t t t g a t t C C t e t g g g t t g g c t t a a 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c a a g t c a a a a c c t t g a a c a a c t a t a t c t a g a g a a c t t t c c t t c t t g t g a & g t a a t g e & t a t a t a c a t c a a g a g a a g t c a g a g t t g c t g a a t g a a a t a g t a g a t c a a a t t t a a g t g t t g t g c c t a t a a a g a a t t g t a t g g t g a g a t t g a a t a t a g j i g g t c a t a t t a t t t t c t c a a t e t t a g t g a t t a a a g t a t t c c a t a c a a a c a g a c a a g c a t t t a g t c g t g c a t t c a t t g g c a c t a c a a a a t t a t c a a c c a a g & g t a a t a t c c t t t c a g c t c t c c t t : t g t a t a t g t g t g t t c t a t t c t g g a g c t g a * g a t a a c t a a t a t t c t t t t t t a c t t c t a c a g a a a a t g t t g g t t t g t c a c t a t a a t a t g g c t t g t C t c t t a a t a g t g t t C t a t t c t g g t c c a t c t t t g t g a g t t g c t t t g t g g a a a a t a a a a t g g t t t c t g t c g a a a g a t t a a a a e a g t t C t ta g a a a ta c c a tc & g a a g c a g a g tg g a g a a a g a tg g a t t tL c tc c c a c c t tc a a g t tg g c c a a g c c g t g g g * * t g t i : g a g í t t g a a a a c g t g c a g g t a a t a a t t c t a a c t a a t t í : t g t g g t tg c ta tn tg c ta g ta t t t g c a c a a a a g g & a a d e t a t a a a a a g b t c a t a g t a a g g a a g a g a g g g t a g c t g t a t t a a c a a g c c t a c a g a t t c t t t a a t t t c a a a t a t g t t a c g t t g a a t c t e t a t a t t g t L t g t t e t a e t g g te a a eragg 11 a g a ta t c g t o c gaa c a c t c c t c t a g t g c t t a a a g g a g t t a c tc tc a g c a t ta g a g g g g g a g a g a a g a ta g g tg t tg t tg g tc g ta c a g g g g g t g g a a a a t c a a c a t c a a t t e a a g t c t t c c t t c g t t t g g t ggag e c tg c a g c tg g a a g a a t a a t e * t t g a t g a c g t a g a t a t a t C C i g a c t t g g g c t t c a t g a t c t t a g a t t : t c g c t t c g g g a t c a t t c c c c a a g a g e e a g tc e t t t t tg a a g g a a e tg tg a g a a g e a a c a t tg a e c c c a t t g g a c a a t a t t c a g s t g a t g a a a t t t g g a a g g t a a t c t a a c t t g c t g a c t g a a a t a a t t t a c a a a a a t c t c a a a a t a t a g t a c a g a g t t a g c c a a a c a t g t c t t c t g a g t g c t g a g a t c t t t t t g g a t t a t a a f l t t c t g t a a g a g c a a c a t a c t a t t t g t t a g t g a g a f l g a a a a g c a t a t a e t e e a g t g t t t t g t t a t c t c c c a g a a t g t c t c t a a c a t g a a a t c g t g t a c a t t g c a g a g c c tc g a a c g c tg c c a a e tc a a a g a tg tg g tg tc t t ta a a a e e c g a a a a a c t tg a t tc a c c a g g t a a a t t t t c c t C c t c t a c g t c a t c c t t g t g g t t c t t t g c g g a a t t a t g c a a c c a a c t t t t t a t g t g t t t c a a a t a t a t a t a e r g a t a a c t g a a t a c t g t c a t t g g t a a a t c a t a g t t g t t g a t a a c g g a g a t a a c t g g a g t g t c g g a c a g a g g c a g c t t c t t t g c t t g g g a a g i g tg a tg crta aa a e g t agea g a e t t c t a t t t a t g g a tgaggcaa c tg c c t c t g c t g a t t c a c a g a c a g a tg c a g tg a t t c a g a a a a tc a tc c g c g a g g a c t t L g c g g c c tg r ta t ta ta a tc a g c a t tg C C C a C a g a a ta c c a a c a g tc a tg g a c tg tg a ta g a g t tc t tg t ta r a g a tg e a g g t g e t g a t t t c r t e t e i t t t t a c t t t g t a t c t t a t t t t g a a t c t g g t a a a t g a t t a t t t a t c t g t a t g t g a t g g t t t c c a a c c a a t c a t a g t c a g t a c c t t t a t g a a g a a a t t g e e t a a t g t t a g c c a a g t a g t a g t a a a tg e a t g a
Sec. con núm. de ident.: 3 (Intrón 1)
gttagaaccaatctttggtttaagctgtctctgattttgtcagctattttagccttatcttctatagttttatgcat tttggttattgtgggaaattcccag
Sec. con núm. de ident.: 4 (Intrón 2)
g t a t g g c t c t c a t c c t t c t g t t t g t t t g a t t a a t a c a a a c t t t g c t g c e a a t t a c c t t t t g c c c c t t g t t g c t a c c t c t t t tc tg tg g ta ta a a a a a t ta a tg ta g g c ta a tg tg ta g a g tg g a g g ta t ta ta tg c a g a a c a a t tg c a a tc a a g c a a t t a c c t g t g a g a t a c t a t t t t g t t t t c a t a t t a g c g g a c t g g t a c a t t c t c a t t g g t g t a t c g t t t g a t c t c c a c c a a a g c a g a g g t t t ta c tg g c c g a c a g a g tc a a a c ta c tg tg c t tc a c tc c t t t ta c tc c a a tc c t ta g ta g tc t t tg c t tc ta a tg a a c t t c a a g c g t g t a a t a g a a a c a c c a t t a t a t t a t t a g c t g a t ta g t t a c t t t a c a a t t c c a g a g c a t a t t t a c a t t t t c t g c t t g g t t g t c t a t t a c t c t g g a t a a c a g t c c t a a a t g c a a g c a a a a t c a a c t g t g t t t t c a g tc t tg a g c tg a c c a a tta g t tc a tg a tg tc c tc a g c t tg tc c a a g c tg g tg c c tc a c c g g a a tta tg tg g g a c c t t c g t a c t t a a t c a a c t a g t t c a c c t t c t t c t t a a a a a t a t t g a a t g a t t t g a t t g g t t a a t a g t t c c t t a a a t g t a g t a a t t a t t t g c t a a c t t a c t t t a c c a a c c c c t t g t c c a a c a g
Sec. con núm. de ident.: 5 (Intrón 3)
g 11 agaa g t cea ca atgtcatcft g t ca t tgaa ga 111 aa 11 ta 3 ga t agaaa t t a ca t t g t t t c a t t ctgca aa 11 a tggacctatcagagaaaaatcatggattttgaatggctactttCcccagtgaagacacataCcaCttcetgggagga a g a tg tg a a a g tg g c a a g c ta tt ta c tc c a a a a a g ta ta a tc ta a a a g a c i: t t ta tta ñ g ttc g g a a g g c i: t f la tc c
a tc a t t tg t t& c c tg tc g t¿ ta c t tg tc l : t ta t ta a a a t tc t t c t ta g c c c a a tc a c c t tc g a tg a 3 g t tg f lc ta g t c t ta g tc a c e tg a a ta c t t ta a a tc t t tg c c t tg g tg tc tc ta ta t t tc c a g c c a c c d c a a t tc c g a a g c tc a ta t t t .g t t t te tc t t tg ta a tg tc q f l tc tg a a a g t t tc a tg c t t t t t tg c a g
Sec. con núm. de ident.: 6 (Intrón 4)
g ta a g t t tc a g a g tg t t t ta tc a a c c c c t t tg g a a c c ñ a g c ( jtc a a g a g ta g tg t - t tc t tg g t tg t ta a a tg a t tc a c a tg t g t g t t g g t t t c t a t a a a a c c t g a a c t t t a t 9 t t t t i t c a g a g t g t t t t g c t t t e t t g a a g
Sec. con núm. de ident.: 7 (Intrón 5)
g c a a a tte e tg a g g a c a a g tt t t td C tt t tg c a tg ta a a t tc a a a c t tC g c tg c t ta g a tg a t ta a a ta a tg a a a a a ta tc c a t tg e a tg t t t ta a tg E g ta tg a c a tg t t& g a a t t t tg a a ta g a a g t tc a t tc a c tg a tg i : tg a g a tg tc t t g c t t t t t t t e t g c a g
Sec. con núm. de ident.: 8 (Intrón 6)
g ta tg ag cactg ttta taacag c cg tcc t C t t t t c t t t t c t t g t c t g a a c t c a a a t t t g a a t c c t t t g t t t a g a g g c a a tta g t c tg c tc tg ag catt t tg g c tg a c a g tta t ta tg E a ta t ta a a a g g c a a c ttL t fc ta t tc g t tc tg tc c a g c t a ü ja c t t t t t a c t t a a a a t g t g g t t a a t t g o a t a t t t c t g t g t c t c c t a t t t t t t g a t t a C t t g c a a c t c e g a t o aatccagatttggggaaggcttgttgttagttgatgactagatactaagctcaeatctaC^ttggtitgcaagtagaa t t t tc a a g t tg tc a t tc a c t ta ta c tg t t tg a a c ta g g a g a e c a g c a t tc t tc tg c a a g g a g c c c tg a itg c t tg a a aagttaaacagaaaagaaaaagttcagggcagatagacat a a tg tg t ta a a g ta a t tc a a t t ggageacagatat*t g aeatg tg tta tt tgggagctaegaaaaaga taaggacta tta tg t3gactacaa ttgaaa taacaggtaa t t c a t t te tg g tt ta c a g
Sec. con núm. de ident.: 9 (Intrón 7)
g ta ta a c a c c g tc c a a tg c tc a t t ta tg g g a a t ta ta a a t tc ta g ta tc tg a ta a tC C t tC tg t f te t t t * g a tC ta c c tg c tc ta c tg a a a a f l tg f la a tg a g ta tg a g g a a a ta g a a ta tc c g ttg a g c a tC ta tg tc t t tc ta t ta a a a a t t t g c a t tc ta tc t tc t tg t t tc a a g tc a a a a tc t tg a a e a a c ta t3 tC ta g a g a a tt t tC c t tc t tg tg a a g ta a tg c a ta ta taca tca ag ag aag tcag ag ttg c tg aa tg aaa tag tag a tcaa a tt taag tg tcg tgc c ta taaag aa ttg t a tg g tg a g a ttg a a ta ta g tg g tc a ta t ta t t t tc tc a a tc t ta g tg a t ta a a g ta t tc c a ta c a a a c a g a c a a g c a t t ta g tc g tg c a t tc a t tg g e a c ta e a a a a t ta E c a a c c a a g a g ta a ta t tc t t tc a g c t t tc c tc tg ta ta tg tg t g t tc ta t tc tg g a g c tg a a g a fc a a c ta a ta t tc t t t t t ta t t tc ta c a g
Sec. con núm. de ident.: 10 (Intrón 8)
gtaataattctnactaattctgtggttgctatttgcbagcatttgcacaaaaggaaaactataaaaagttc&tatfta a g g a a g a g a g g g ta g c tg ta t ta a c a a g c c ta c a g a ttc t t ta a c t tc a a a ta tg tta c g ttg a a tc tc ta ta . t tg L t tg ttc tac tg g ccaacag
Sec. con núm. de ident.: 11 (Intrón 9)
gt aazct & acttgctgactgaaataatt cacaaaaatctcaaaatatagtacagagt tagccaeacatg tc ttc tga g tg c tg a g a tc t t t t tg g a t ta ta a a t tc tg t aagagc&acatactatttgttagtg-agaagaaaagC&C&taCtíC a g tg t t t tg t ta tc tc c c a g a a tg tc tc ta a c a tg & a a tc g tg ta c a t tg c a g
Sec. con núm. de ident.: 12 (Intrón 10 )
g ta a a t t t tc c tC C C C ta tg te a tc c t tg tg g tc e t t tg e g g a a t ta tg c a a c c a a c t t t t ta tg tg t t tc a a a ta t a ta ta e tg a ta a c tg a a ta c tg tc a t tg g ta a a tc a ta g
Sec. con núm. de ident.: 13 (Exón 1)
a tg g a ta tg a g g a a c a g ta tg tc t t - c ^ a a te t tg t t ta g c a tc a c t t te t tg t te tg c e - te c í ta t t t tA iE c jtC a g a g g & ttq a g c a g ttg t ta a a tg g tta a g a ttc a tt t tc e tc tC tc e a tg tC C íC a a a g g a c tc ttc ta tc ttc c a t tg a tg tg c tg c c t t tg c t ta c t t tc a t tg ta t t tg c a g ta c a a a a g t tg ta c tc :a ñ a g t tg a g g tc c a a tg a g c a c tctac" tccagcat tga taagccLct aal: t:gcacacaacaqgacttct
Sec. con núm. de ident.: 14 (Exón 2)
t c:gcc11ggaaagt« t agatgga,Ptgt at t gg11gt CtCíggcgat t acacatgt tgt aatea cta t act aa tagttcatgagao.aagattteaegctatttcceateeaetgtecc'tgc-gcgtgttttggattgcaaactttgt A g tta tg a g tt tg t tc t t tg g tC g C g g g a tc a c a a g g c ttg tg tc a c t ta a g g a a a ttg a tc c ta a t t ta a g a a tg g a tg a t * ta a g t tc a t ta g t t tC 4 t t tC C ta t t tc tg l ; tg t tc tc t tC £ t tg t tg C C i t ta ü s g g t tc :g a ccg g ag ttg c tg taa ttag tg a ttc tg aa tc teac tta ag tg a tg a aaecaa tg g 1 ;ta tg aac tcc tg g íitaa atccag tg tg ag tg g c tt tg c t tc a g c t tc tc ta a ta tc g a a a g c c t t t tg g a t t tg g a tg a a c c c t t ta c tg caa&aAggttacaagtcacctttCapgat tgatgaagtt.ee ttcactttC C C cictgcatagagcagagaaaa c g tc tc a a c t t t tc g a a a g a a a ttg g c c ta a a c c tg a a g ia ita E ía a a g c a tc c tg to e g a a c a a ú it tg e t ge-gttgcttftgqaaggaagt ta t t t t t a C tg c c a t t c t t g c a g t a a t t a g g g t a t g t g t t a t g t a t g t a g g g ccaacactcatacaaagatttg ttgattacacagC aggaaagaggscatC tc títta tgSaggatactacc ttñ ta g g a a c tc tc c ta a ta g c c a a a tt tg tg g a a g ttc ta a c c te tc a tc a g ttc a a c t t ta a c tc c c a a a a g c t C g g ca tg c tta t tcgagcgacac ttcccactcc tc tg ta tñagaaggggttñaggttg tca tgc tcagctaga cag g ctc fttg g tg ttg g acag a ttg taaa tta t icg g ccg teg a tg c tca gc ag c tg tccg a ta tg a tg c iac a g tta c a c tc c a tc c g g c tc g tg c c a ttg c a a g tc tc tg tg g c tc ta g g c a tc tT tt ta ta c tta c c tc g g tg c t tcaac tg ttg taacgctagctggac ttgcagcag tga tgg ta ttcg tggcgc ttggaactaaaagaaacaac a g g tt tcaa tt taaca tca cg aag ñ a tcg tg a ttc tag aa tg aaag cg aca aa tg ag a tg c ttaa tta taE g c gcgEtataaagttcc:aggcatgggaagaacaEtttaacaaaaga3Ctgaatccctccgcgaatccgagtatgg a tg g t tg tc c a s g t tc t tg ta c tc s a tc g c tg g g a a ta tc a t tg tc t tg tg g a g a a c tc e tc t tc ta g tg g e t a c a c tc a c tt t tg g a a g tg c a a tc ttg ttg g g a a tc c c g c ttg g tg c a g g g a c a g tg ttc a c tg c a a c a te tc tc t tc a a g a tg ttg c a g g a a c c g a tc a g g g c tt tc c c tc a a tc c a c g a tc tc a ttc te a e a s g c a a tg a ta tc tc t tg a ta g a ttg g acaaa ta ta tg a tg a g ta ag g ag tta g tg g ^ ta sag c tg tg g aaag ac tag aag g ttg t gggggtñcaattgcta tgcaggtgaaagatggagcttt t tgc tgggatga tgaaaacag taa *gaaga*ttga a a a a tg ra a a o tttg a g a tta g a a a a g g a g a g c rttg c iA g ca g ta g E g g g g a ca g ttg g g g cg g g g a a g tc ttc c c tc c ttg c a tc tg ta c ttg g tg a g a tg c a c a a g ttg tc g g g tc a g
Sec. con núm. de ident.: 15 (Exón 3)
g tc a c a a tttg tg g ttc a a c tg c c ta tg ttg c a c a a c a tc g tg g a C tc & g a a tg g c a c g a ta c a a g a a a a ta tc c tg tttggtatgCcaatgaacagagacagatacaaggaagtgatccgggttLgctgCttggagaaggacttggaaataat ggag 11 tgga gaccaga c t g a aa t agga ga acgt ggc a t c a a cct c agt g g tg g t e a ga age ag cgaat C c a g c t tg d a a g a g c tg tt ta c c a g g a c tg tg a ta C tta tc ttc ta g a C g a tg ta ttc a g tg c a g ttg a tg e te a e a c tg g C tc c g&aatcttcaag
Sec. con núm. de ident.: 16 (Exón 4)
gaatgtgtgaggggaattC ttaaagataaaaccattttgcttgtCSCacaccaagttgacttctCgcataatgttga c c tg a tc e tt
Sec. con núm. de ident.: 17 (Exón 5)
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Sec. con núm. de ident.: 18 (Exón 6)
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Sec. con núm. de ident.: 19 (Exón 7)
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tg a a a g ca tc tca g g tg tta tg a c ta ta cg ttg c ttta g g a a g ca g g a g a tg ttttg ta a cg a g fla tg t& a a ce g a g tgaittceaatetgcgaatggat 11ccacaaeaatggatceaatgaatgg11ggget11cgactggaa11gatggga agcttacttctttgtgtttctgtaatgttcatgattgtcttacctagcagcatcatcaagccag
Sec. con núm. de ident.: 20 (Exón 8)
a a a a tg t tg g t t tg tc a c c a tc a ta tg g c t tg tc tc t ta a ta g tg tc c ta t tc tg g tc c a tc t t tg tg a g t tg c t t t g tggaaaataaaatggtttc tg tcgaaagattaaaacagttc teaga&ataccatcagaagcagagtggagaaagat
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Sec. con núm. de ident.: 21 (Exón 9)
g11 agacaccgtccgascactcctctagtgcttaaaggag 11 actetcageattagagggggagagaagataggegt tgttggtcgtaeagggggtggaaaatcaaeattaattcaagttttetttcgtttggtggagcctgcagctggaflgaa
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Sec. con núm. de ident.: 22 (Exón 10)
agcctcgaacgctgccaactcaaagatgtggtgtctttaaaacccgaaaaacttgattcaccag
Sec. con núm. de ident.: 23 (Secuencia de ARNi) aagagccagtcctttttgaaggaactgtgagaagcaacattgaccc
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Sec. con núm. de ident.: 24 (secuencia de proteína de NtMRP4; 5'-3' marco 1; - denota el codón de parada putativo)
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Sec. con núm. de ident.: 25 (secuencia de proteína de NtMRP4; 5'-3' marco 2; - denota el codón de parada putativo)
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Sec. con núm. de ident.: 26 (secuencia de proteína de NtMRP4; 5'-3' marco 3; - denota el codón de parada putativo)
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Sec. con núm. de ident.: 27 (secuencia de ADNc de NtMRP4 derivada de la secuenciación directa de ADNc)
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Sec. con núm. de ident.: 28 (secuencia de ADN de NtMRP3 con 5' y 3' UTR)
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gttacacatcaagtggagtttttgcctgctgcggatttgatcttggtactctttcctttcagtaattatggtttgct taatatcatatatagacttaactcatttaactatgatatttctcttcaggtcatgaaagatggaaggatcagtgaaa ctgggaaatacaatgatcttctcaaattaggtagtgacttcatggaacttgtgggtgctcaccaagaagctttaaca gcaattgacacagttaagggagaagcattgagaaagagtgaggaaatgactggtgataatacaaatgtacagaagga taaaaatatttcagatggccaaaatggtaaagtggatgatattgttggaacaaagggacaaattgttcaggaggagg aaagagagaaaggtagtgttggtttttcagtttactggaaatatataacaactgcatatggaggtgctcttgtgcca tttatgctgttggcacaagttggttttcagctccttcaaattggaagcaattattggatggcgtgggcaactcccgt ctcaaagagtgagccacctcctgttgggagttctactctcatcattgtctatgttgctttaggaattgcaagtgctt tatgcatccttgctagaaccatgtttcttgttaccgctggatataagacagcctctttgcttttccataaaatgcat ctttgcattttccgtgctccaatgtccttcttcgatgccacaccgagtgggcggattctaaacagagtaagtgaatg attacattttctttatttagccccttttttttccttattagtgtcaatctttctgttacatgactaatcaatgtttt gtgaaaattagctagtaatttcagaattaactcaaatgtactttggtatgaaaacaggcatcgacagatcaaagtgc aattgatctgaatgttcccattcaagttggatcctttgccttcacaataatacagcttttagggattattggagtaa tgtcacaagttgcatggcaggtcttcattgtctttattccggtcattgcagtttgcatctggttggaggttgctacg accacctttttcgtgttctttgccttcacaattattctactatatgctttttcacaaagtgagtcataactttagcg acattcataaacgtgagttacatttaagtggtgagtttgttttcattgcagcaatattacataccatcagcacgaga actggcacggctaaatgggacatgcaaagctccagtaatacagcactttgccgagacaatttcaggatcaagcacaa ttagaagtttcgatcaggaatctagattccaggacacaagtatgaaattgatagacaattattctcggcctaagttt cacatcgctgctgcaatggagtggctttgtttgcgtttggatatgttatctctgatcacttttgctttctctttaat tttcttgatctctcttcctgttggaacaattgacccaagtaagttctctatcttcatgttttctttccttgaagttt gttgtgttgaataactcttaagagcacattttctccgtttcttgatttacaggtgttgctggcttagctgttacata tgggcttaatctgaacataatacaagctcgggttgtttggaatctttgtatgatggaaaataaaattatttctgttg aaagaatacttcagtatactgctcttccaagtgaatctcctcttatcatagaatccaacagaccagaccctaactgg ccatcttgtggagaggttgattttagcaatcttcaggtaaattaagttattctctggtgttaattatgcaggttaat ttgttggtatgggttggtatatctgaaaacttttaataggtccgatatgctcctcacatgcctctcgtgttgcgagg ccttacatgcactttctttggtggaaagaagactggaattgtcggtaggacaggcagcggtaaatctactctaatac agaccctcttccgcatagttgaaccagctgctggacaaataaaaatagatggtatcagcatctcctcaattggtttg catgatctacggtctagattgagtataattccacaggatccaactatgtttgagggaacagttcgcagcaacctaga cccgcttgaagagtattcagatgaacaaatttgggaggtgacagcttggttttgcctatttttggatttattttgtt tcagataggaaaatgacaaattttattttattgagaaactttgtttgatgttatgcttcaggcgctcgataagtgtc agctaggagaagaagtgaggaagaaagaaggcaaactttattctacaggtaacttcaagaaccacatcattttctga tgatttccacttttagagctgtaataatcatcttcattgcgttgctgcagtatctgagaatggagagaactggagtg taggccaaaggcagctggtctgccttggccgtgtgctactgaaaaagagcaaggtcctggtccttgacgaggctaca gcatctgtcgacactgcaactgataatcttattcagcaaactctaaggctgcacttctctgattccacggttataac cattgctcataggattacatctgtgcttgacagtgatatggtcctactattagatcatggtaagaatcatcgtttat gttctggagcaagcggagaaggaaattcttggtagttaccttttttttatgctatgctgcagggctcattgctgaat acggcactccagccaggttgttagagaacgaatcctcattgtttgctaagctcgtggcagagtatagtatgaggtca aattcaagttttgagaatgtttcagacatgtgagtctcagaaactaatcttcgttaataatgttacacgacgatgat gatgaaaattaggggactctagactagtaccttagtcgatagtgttttgagtttccatctgtggacaccatagcttg aacaagaaccagcgaaatgcaggtcatgcctgtggcttgagggaaactgcaacaatcctatggcagggaaagaaacc tacatctagtgatgcaatattgattgtgaagtggcatttgtttttgtttagactttttgatgagaaaatgtatacgt aactttgtgtttacaataatttgaatgtatgttgagtcaagtgattagttagttaagagtgcacggattttgctact tctgggtaaaagaagtaaaccttgttgttgagagttgaaagtgaaattactagtgtcgaattttgccgcataagcta aatgaaacacttttacgataaactcctagtgcaacaaaggaaaaattcattggcaagactagctgtttatgtttcac gac
Sec. con núm. de ident.: 29 (secuencia de ADN de NtMRP3 sin 5' y 3' UTR)
atggaaattgcaaagggcatgtctgtgtttcaatctttgaggtatgttggcgttgatgaatccctccgaaaccccat tttcttacgtgtcattagttgttctttgcacctgggattgttccttgtaattcttgggttgtgttgttggaatacaa tcaggagggacaataatgctggccacaaacagagtagtactaggaatgctaggttcttgtactacaaatcaaccttg ttttgttcaataggtctagccatctttagctttgtgttatgtttgttagctcatttttattggtatagaaatggttg gtcagaagaaaaaattataacccttttggattttgcattaaagttgctagcttggttgtcaatctctgttttcttgc acacccagttccttaattcttgtgaaaccaaataccctcttgttttaagagtttggtgggggcttttcttctttgtt tcttgttattgccttgttatagaccttgtttatggggaaaagaaccaatctttaccaactcaattttgtatacctga tgttgttttcactcttatggggttattcttctgttttgttgggtttattgttaaaacagagagtgaggagaatatgc ttcaggaacccctcttaaatggtagtgttgccaatggcatggactcaaagaagtctactggggatcaaactgtcacc ccttatgccaatgctaacatttttagtctctttactttctcttggatgggtcccctaatttctgttggcaacaagaa accattagaccttgaggatgttcctcagcttcactttgatgatagtgtcaaagggagttttcctatttttagagaaa aactagaatctgtgggtgggggaaatagtaaccgtgtgactaccttcatgctggtgaaggctttggttttcacagca cggaaggagatagtgttatcggctctcttcgtgcttctttacgctctggcgtcttttgttggcccgtacctcattga taccttagttcagtatctgaatggaaaacgagactttgataatgaaggttatgtcttagtggctgcattcttcgttg caaagttggtggagtgtttggcgcaaaggcattggtttttcaaggtgcagcagggagggtatcgggcacgggcagca ctggtttccaaaatctacaacaagggtttaaccctctcctgtcagtcaaagcaaagccacactagtggagagatcat caattttatgacagttgatgccgagaggattggtgacttcggttggtatatgcatgatccttggatggtaatcatac aagttgctctggcattggtgatactctataaaaatcttggcctagctgctatcgccgcgtttgttgctacaataata gtgatgttggcaaacatccctttagggagtttgcaggagaagtttcaggagaaactcatggaatcgaaagatagaag gatgaaggctacatctgaagtcttaaggaatatgagaatactcaagcttcaagcttgggagatgaagtttctgtcta ggatcttggacctcaggactacagaggcaggatggttgatgaaatatgtgtacacatcagctatgactacttttgtc ttctgggttgctcctacatttgtttctgtgacgacctttggcgctgcaatgcttatgggaatcccacttgaatctgg gaagatattgtctgcacttgcgacatttagaattcttcaagagcccatctacaatctcccagatacaatttcaatga ttgctcaaaccaaagtttctcttgatcgtattgcatctttcctttctcttgatgacttgcagcctgatgtcatagag aagcttccaaaaggtagttctgatgaagcaattgagattgtaggtgggaacttcgcttgggatgcatccacctcgac tccacttctaaaggatgtaaatcttagagtgcttaatggcatgagagttgccatttgtggtacagttggttcaggaa aatcaagcttactgtctagcattttaggagagatgcccaaattatcagggactattaaacttagtggaacgaaggct tatgttgcacagtcgccctggatacagagtggaaagatagaggagaacatattatttggtaaagagatgcagaggga gaagtatgataaagttcttgaagcgtgctccttaaagaaagacctggaaattctctcttttggcgatcaaacagaaa taggggagaggggcattaatttgagcggtggacagaagcagagaatacagattgctcgtgctctttaccaagatgct gatgtttacctatttgatgatccgttcagtgctgtggatgctcataccggatcccatctcttcagtgtaagtccttt catatatatgctttattttcatgcttgatatattttacctagccacttgattgacccatcctttaattgcaggaatg tataatggggctattgaattcaaaaacagttttatatgttacacatcaagtggagtttttgcctgctgcggatttga tcttggtactctttcctttcagtaattatggtttgcttaatatcatatatagacttaactcatttaactatgatatt tctcttcaggtcatgaaagatggaaggatcagtgaaactgggaaatacaatgatcttctcaaattaggtagtgactt catggaacttgtgggtgctcaccaagaagctttaacagcaattgacacagttaagggagaagcattgagaaagagtg aggaaatgactggtgataatacaaatgtacagaaggataaaaatatttcagatggccaaaatggtaaagtggatgat attgttggaacaaagggacaaattgttcaggaggaggaaagagagaaaggtagtgttggtttttcagtttactggaa atatataacaactgcatatggaggtgctcttgtgccatttatgctgttggcacaagttggttttcagctccttcaaa ttggaagcaattattggatggcgtgggcaactcccgtctcaaagagtgagccacctcctgttgggagttctactctc atcattgtctatgttgctttaggaattgcaagtgctttatgcatccttgctagaaccatgtttcttgttaccgctgg atataagacagcctctttgcttttccataaaatgcatctttgcattttccgtgctccaatgtccttcttcgatgcca caccgagtgggcggattctaaacagagtaagtgaatgattacattttctttatttagccccttttttttccttatta gtgtcaatctttctgttacatgactaatcaatgttttgtgaaaattagctagtaatttcagaattaactcaaatgta ctttggtatgaaaacaggcatcgacagatcaaagtgcaattgatctgaatgttcccattcaagttggatcctttgcc ttcacaataatacagcttttagggattattggagtaatgtcacaagttgcatggcaggtcttcattgtctttattcc ggtcattgcagtttgcatctggttggaggttgctacgaccacctttttcgtgttctttgccttcacaattattctac tatatgctttttcacaaagtgagtcataactttagcgacattcataaacgtgagttacatttaagtggtgagtttgt tttcattgcagcaatattacataccatcagcacgagaactggcacggctaaatgggacatgcaaagctccagtaata cagcactttgccgagacaatttcaggatcaagcacaattagaagtttcgatcaggaatctagattccaggacacaag tatgaaattgatagacaattattctcggcctaagtttcacatcgctgctgcaatggagtggctttgtttgcgtttgg atatgttatctctgatcacttttgctttctctttaattttcttgatctctcttcctgttggaacaattgacccaagt aagttctctatcttcatgttttctttccttgaagtttgttgtgttgaataactcttaagagcacattttctccgttt cttgatttacaggtgttgctggcttagctgttacatatgggcttaatctgaacataatacaagctcgggttgtttgg aatctttgtatgatggaaaataaaattatttctgttgaaagaatacttcagtatactgctcttccaagtgaatctcc tcttatcatagaatccaacagaccagaccctaactggccatcttgtggagaggttgattttagcaatcttcaggtaa attaagttattctctggtgttaattatgcaggttaatttgttggtatgggttggtatatctgaaaacttttaatagg tccgatatgctcctcacatgcctctcgtgttgcgaggccttacatgcactttctttggtggaaagaagactggaatt gtcggtaggacaggcagcggtaaatctactctaatacagaccctcttccgcatagttgaaccagctgctggacaaat aaaaatagatggtatcagcatctcctcaattggtttgcatgatctacggtctagattgagtataattccacaggatc caactatgtttgagggaacagttcgcagcaacctagacccgcttgaagagtattcagatgaacaaatttgggaggtg acagcttggttttgcctatttttggatttattttgtttcagataggaaaatgacaaattttattttattgagaaact ttgtttgatgttatgcttcaggcgctcgataagtgtcagctaggagaagaagtgaggaagaaagaaggcaaacttta ttctacaggtaacttcaagaaccacatcattttctgatgatttccacttttagagctgtaataatcatcttcattgc gttgctgcagtatctgagaatggagagaactggagtgtaggccaaaggcagctggtctgccttggccgtgtgctact gaaaaagagcaaggtcctggtccttgacgaggctacagcatctgtcgacactgcaactgataatcttattcagcaaa ctctaaggctgcacttctctgattccacggttataaccattgctcataggattacatctgtgcttgacagtgatatg gtcctactattagatcatggtaagaatcatcgtttatgttctggagcaagcggagaaggaaattcttggtagttacc ttttttttatgctatgctgcagggctcattgctgaatacggcactccagccaggttgttagagaacgaatcctcatt gtttgctaagctcgtggcagagtatagtatgaggtcaaattcaagttttgagaatgtttcagacatgtga
Sec. con núm. de ident.: 30 (Intrón 1 de NtMRP3)
gtatgttggcgttgatgaatccctccgaaaccccattttcttacgtgtcattagttgttctttgcacctgggattgttcctt gtaattcttgggttgtgttgttggaatacaatcag
Sec. con núm. de ident.: 31 (Intrón 2 de NtMRP3)
gtaagtcctttcatatatatgctttattttcatgcttgatatattttacctagccacttgattgacccatcctttaa ttgcag
Sec. con núm. de ident.: 32 (Intrón 3 de NtMRP3)
gtactctttcctttcagtaattatggtttgcttaatatcatatatagacttaactcatttaactatgatatttctct tcag
Sec. con núm. de ident.: 33 (Intrón 4 de NtMRP3)
gtaagtgaatgattacattttctttatttagccccttttttttccttattagtgtcaatctttctgttacatgacta atcaatgttttgtgaaaattagctagtaatttcagaattaactcaaatgtactttggtatgaaaacag
Sec. con núm. de ident.: 34 (Intrón 5 de NtMRP3)
gttgctacgaccacctttttcgtgttctttgccttcacaattattctactatatgctttttcacaaagtgagtcata actttagcgacattcataaacgtgagttacatttaagtggtgagtttgttttcattgcag
Sec. con núm. de ident.: 35 (Intrón 6 de NtMRP3)
gtaagttctctatcttcatgttttctttccttgaagtttgttgtgttgaataactcttaagagcacattttctccgt ttcttgatttacag
Sec. con núm. de ident.: 36 (Intrón 7 de NtMRP3)
gtaaattaagttattctctggtgttaattatgcaggttaatttgttggtatgggttggtatatctgaaaacttttaa tag
Sec. con núm. de ident.: 37 (Intrón 8 de NtMRP3)
gtgacagcttggttttgcctatttttggatttattttgtttcagataggaaaatgacaaattttattttattgagaa actttgtttgatgttatgcttcag
Sec. con núm. de ident.: 38 (Intrón 9 de NtMRP3)
gtaacttcaagaaccacatcattttctgatgatttccacttttagagctgtaataatcatcttcattgcgttgctgc ag
Sec. con núm. de ident.: 39 (Intrón 10 de NtMRP3)
gtaagaatcatcgtttatgttctggagcaagcggagaaggaaattcttggtagttaccttttttttatgctatgctg cag
Sec. con núm. de ident.: 40 (Exón 1 de NtMRP3)
Atggaaattgcaaagggcatgtctgtgtttcaatctttgag
Sec. con núm. de ident.: 41 (Exón 2 de NtMRP3)
gagggacaataatgctggccacaaacagagtagtactaggaatgctaggttcttgtactacaaatcaaccttgtttt gttcaataggtctagccatctttagctttgtgttatgtttgttagctcatttttattggtatagaaatggttggtca gaagaaaaaattataacccttttggattttgcattaaagttgctagcttggttgtcaatctctgttttcttgcacac ccagttccttaattcttgtgaaaccaaataccctcttgttttaagagtttggtgggggcttttcttctttgtttctt gttattgccttgttatagaccttgtttatggggaaaagaaccaatctttaccaactcaattttgtatacctgatgtt gttttcactcttatggggttattcttctgttttgttgggtttattgttaaaacagagagtgaggagaatatgcttca ggaacccctttaaatggtagtgttgccaatggcatggactcaaagaagtctactggggatcaaactgtcacccctta tgccaatgctaacatttttagtctctttactttctcttggatgggtcccctaatttctgttggcaacaagaaaccat tagaccttgaggatgttcctcagcttcactttgatgatagtgtcaaagggagttttcctatttttagagaaaaacta gaatctgtgggtgggggaaatagtaaccgtgtgactaccttcatgctggtgaaggctttggttttcacagcacggaa ggagatagtgttatcggctctcttcgtgcttctttacgctctggcgtcttttgttggcccgtacctcattgatacct tagttcagtatctgaatggaaaacgagactttgataatgaaggttatgtcttagtggctgcattcttcgttgcaaag ttggtggagtgtttggcgcaaaggcattggtttttcaaggtgcagcagggagggtatcgggcacgggcagcactggt ttccaaaatctacaacaagggtttaaccctctcctgtcagtcaaagcaaagccacactagtggagagatcatcaatt ttatgacagttgatgccgagaggattggtgacttcggttggtatatgcatgatccttggatggtaatcatacaagtt gctctggcattggtgatactctataaaaatcttggcctagctgctatcgccgcgtttgttgctacaataatagtgat gttggcaaacatccctttagggagtttgcaggagaagtttcaggagaaactcatggaatcgaaagatagaaggatga aggctacatctgaagtcttaaggaatatgagaatactcaagcttcaagcttgggagatgaagtttctgtctaggatc ttggacctcaggactacagaggcaggatggttgatgaaatatgtgtacacatcagctatgactacttttgtcttctg ggttgctcctacatttgtttctgtgacgacctttggcgctgcaatgcttatgggaatcccacttgaatctgggaaga tattgtctgcacttgcgacatttagaattcttcaagagcccatctacaatctcccagatacaatttcaatgattgct caaaccaaagtttctcttgatcgtattgcatctttcctttctcttgatgacttgcagcctgatgtcatagagaagct tccaaaaggtagttctgatgaagcaattgagattgtaggtgggaacttcgcttgggatgcatccacctcgactccac ttctaaaggatgtaaatcttagagtgcttaatggcatgagagttgccatttgtggtacagttggttcaggaaaatca agcttactgtctagcattttaggagagatgcccaaattatcagggactattaaacttagtggaacgaaggcttatgt tgcacagtcgccctggatacagagtggaaagatagaggagaacatattatttggtaaagagatgcagagggagaagt atgataaagttcttgaagcgtgctccttaaagaaagacctggaaattctctcttttggcgatcaaacagaaataggg gagaggggcattaatttgagcggtggacagaagcagagaatacagattgctcgtgctctttaccaagatgctgatgt ttacctatttgatgatccgttcagtgctgtggatgctcataccggatcccatctcttcagt
Sec. con núm. de ident.: 42 (Exón 3 de NtMRP3)
gaatgtataatggggctattgaattcaaaaacagttttatatgttacacatcaagtggagtttttgcctgctgcgga tttgatcttg
Sec. con núm. de ident.: 43 (Exón 4 de NtMRP3)
tgtgggtgctcaccaagaagctttaacagcaattgacacagttaagggagaagcattgagaaagagtgaggaaatga ctggtgataatacaaatgtacagaaggataaaaatatttcagatggccaaaatggtaaagtggatgatattgttgga acaaagggacaaattgttcaggaggaggaaagagagaaaggtagtgttggtttttcagtttactggaaatatataac aactgcatatggaggtgctcttgtgccatttatgctgttggcacaagttggttttcagctccttcaaattggaagca attattggatggcgtgggcaactcccgtctcaaagagtgagccacctcctgttgggagttctactctcatcattgtc tatgttgctttaggaattgcaagtgctttatgcatccttgctagaaccatgtttcttgttaccgctggatataagac agcctctttgcttttccataaaatgcatctttgcattttccgtgctccaatgtccttcttcgatgccacaccgagtg ggcggattctaaacaga
Sec. con núm. de ident.: 44 (Exón 5 de NtMRP3)
gcatcgacagatcaaagtgcaattgatctgaatgttcccattcaagttggatcctttgccttcacaataatacagct tttagggattattggagtaatgtcacaagttgcatggcaggtcttcattgtctttattccggtcattgcagtttgca tctggttggag
Sec. con núm. de ident.: 45 (Exón 6 de NtMRP3)
caatattacataccatcagcacgagaactggcacggctaaatgggacatgcaaagctccagtaatacagcactttgc cgagacaatttcaggatcaagcacaattagaagtttcgatcaggaatctagattccaggacacaagtatgaaattga tagacaattattctcggcctaagtttcacatcgctgctgcaatggagtggctttgtttgcgtttggatatgttatct ctgatcacttttgctttctctttaattttcttgatctctcttcctgttggaacaattgacccaa
Sec. con núm. de ident.: 46 (Exón 7 de NtMRP3)
gtgttgctggcttagctgttacatatgggcttaatctgaacataatacaagctcgggttgtttggaatctttgtatg atggaaaataaaattatttctgttgaaagaatacttcagtatactgctcttccaagtgaatctcctcttatcataga atccaacagaccagaccctaactggccatcttgtggagaggttgattttagcaatcttcag
Sec. con núm. de ident.: 47 (Exón 8 de NtMRP3)
gtccgatatgctcctcacatgcctctcgtgttgcgaggccttacatgcactttctttggtggaaagaagactggaat tgtcggtaggacaggcagcggtaaatctactctaatacagaccctcttccgcatagttgaaccagctgctggacaaa taaaaatagatggtatcagcatctcctcaattggtttgcatgatctacggtctagattgagtataattccacaggat ccaactatgtttgagggaacagttcgcagcaacctagacccgcttgaagagtattcagatgaacaaatttgggag
Sec. con núm. de ident.: 48 (Exón 9 de NtMRP3)
gcgctcgataagtgtcagctaggagaagaagtgaggaagaaagaaggcaaactttattctacag
Sec. con núm. de ident.: 49 (Exón 10 de NtMRP3)
tatctgagaatggagagaactggagtgtaggccaaaggcagctggtctgccttggccgtgtgctactgaaaaagagc aaggtcctggtccttgacgaggctacagcatctgtcgacactgcaactgataatcttattcagcaaactctaaggct gcacttctctgattccacggttataaccattgctcataggattacatctgtgcttgacagtgatatggtcctactat tagatcatg
Sec. con núm. de ident.: 50 (Exón 11 de NtMRP3)
ggctcattgctgaatacggcactccagccaggttgttagagaacgaatcctcattgtttgctaagctcgtggcagag tatagtatgaggtcaaattcaagttttgagaatgtttcagacatgtga
Sec. con núm. de ident.: 51 (secuencia de ADNc de NtMRP3 como se predijo a partir de la secuencia del clon de BAC)
atggaaattgcaaagggcatgtctgtgtttcaatctttgaggagggacaataatgctggc cacaaacagagtagtactaggaatgctaggttcttgtactacaaatcaaccttgttttgt tcaataggtctagccatctttagctttgtgttatgtttgttagctcatttttattggtat agaaatggttggtcagaagaaaaaattataacccttttggattttgcattaaagttgcta gcttggttgtcaatctctgttttcttgcacacccagttccttaattcttgtgaaaccaaa taccctcttgttttaagagtttggtgggggcttttcttctttgtttcttgttattgcctt gttatagaccttgtttatggggaaaagaaccaatctttaccaactcaattttgtatacct gatgttgttttcactcttatggggttattcttctgttttgttgggtttattgttaaaaca gagagtgaggagaatatgcttcaggaacccctcttaaatggtagtgttgccaatggcatg gactcaaagaagtctactggggatcaaactgtcaccccttatgccaatgctaacattttt agtctctttactttctcttggatgggtcccctaatttctgttggcaacaagaaaccatta
gaccttgaggatgttcctcagcttcactttgatgatagtgtcaaagggagttttcctatt
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gacatgtga
Sec. con núm. de ident.: 52 (secuencia de proteína de NtMRP3; 5'-3'; - denota el codón de parada putativo)
MEIAKGMSVFQSLRRDNNAGHKQSSTRNARFLYYKSTLFCSIGLAIFSFVLCLLAHFYWY RNGWSEEKIITLLDFALKLLAWLSISVFLHTQFLNSCETKYPLVLRVWWGLFFFVSCYCL VIDLVYGEKNQSLPTQFCIPDVVFTLMGLFFCFVGFIVKTESEENMLQEPLLNGSVANGM DSKKSTGDQTVTPYANANIFSLFTFSWMGPLISVGNKKPLDLEDVPQLHFDDSVKGSFPI FREKLESVGGGNSNRVTTFMLVKALVFTARKEIVLSALFVLLYALASFVGPYLIDTLVQY LNGKRDFDNEGYVLVAAFFVAKLVECLAQRHWFFKVQQGGYRARAALVSKIYNKGLTLSC QSKQSHTSGEIINFMTVDAERIGDFGWYMHDPWMVIIQVALALVILYKNLGLAAIAAFVA TIIVMLANIPLGSLQEKFQEKLMESKDRRMKATSEVLRNMRILKLQAWEMKFLSRILDLR TTEAGWLMKYVYTSAMTTFVFWVAPTFVSVTTFGAAMLMGIPLESGKILSALATFRILQE PIYNLPDTISMIAQTKVSLDRIASFLSLDDLQPDVIEKLPKGSSDEAIEIVGGNFAWDAS TSTPLLKDVNLRVLNGMRVAICGTVGSGKSSLLSSILGEMPKLSGTIKLSGTKAYVAQSP WIQSGKIEENILFGKEMQREKYDKVLEACSLKKDLEILSFGDQTEIGERGINLSGGQKQR IQIARALYQDADVYLFDDPFSAVDAHTGSHLFSECIMGLLNSKTVLYVTHQVEFLPAADL ILVMKDGRISETGKYNDLLKLGSDFMELVGAHQEALTAIDTVKGEALRKSEEMTGDNTNV QKDKNISDGQNGKVDDIVGTKGQIVQEEEREKGSVGFSVYWKYITTAYGGALVPFMLLAQ VGFQLLQIGSNYWMAWATPVSKSEPPPVGSSTLIIVYVALGIASALCILARTMFLVTAGY KTASLLFHKMHLCIFRAPMSFFDATPSGRILNRASTDQSAIDLNVPIQVGSFAFTIIQLL GIIGVMSQVAWQVFIVFIPVIAVCIWLEQYYIPSARELARLNGTCKAPVIQHFAETISGS STIRSFDQESRFQDTSMKLIDNYSRPKFHIAAAMEWLCLRLDMLSLITFAFSLIFLISLP VGTIDPSVAGLAVTYGLNLNIIQARVVWNLCMMENKIISVERILQYTALPSESPLIIESN RPDPNWPSCGEVDFSNLQVRYAPHMPLVLRGLTCTFFGGKKTGIVGRTGSGKSTLIQTLF RIVEPAAGQIKIDGISISSIGLHDLRSRLSIIPQDPTMFEGTVRSNLDPLEEYSDEQIWE ALDKCQLGEEVRKKEGKLYSTVSENGENWSVGQRQLVCLGRVLLKKSKVLVLDEATASVD TATDNLIQQTLRLHFSDSTVITIAHRITSVLDSDMVLLLDHGLIAEYGTPARLLENESSL FAKLVAEYSMRSNSSFENVSDM-
Sec. con núm. de ident.: 53 (Exon 11 de NtMRP4)
ttgttgataacggagataactggagtgtcggacagaggcagcttctttgcttgggaaga gtgatgctaaaacgtagcagacttctatttatggatgaggcaactgcctctgttgattca cagacagatgcagtgattcagaaaatcatccgcgaggactttgcggcctgtactataatc agcattgcccacagaataccaacagtcatggactgtgatagagttcttgttatagatgca ggtgctgatttctctccttttactttgtaccttattttgaatctggtaaatgattattta tctgtatgtgatggtttccaaccaatcatagtcagtacctttatgaagaaattgcctaat gttagccaagtagtagtaaatgcatga
Secuencias (el sombreado indica la posición de los exones)
Sec. con núm. de ident.: 1 (secuencia de ADN de NtMRP4 con 5' y 3' UTR) o tg g a ta L g a g g a a c a y t d t g t e t t C * g & í i t c t L g t t L a g c a L c a c t t t e t t g L t c t g c c t c c a c a t t t c a a t c g t c a g a g g a t t c a g c a g t t g t t a a a t g g t t a a g a r L c a t t t t c e t e t c t e c a t y t e c a c a a a g g a c t c t t c t a t c t t e e a t E g a t g t g c t g c t L t t g c t c a e t t t c d 11 y t a 111 g cag t ac aa a ag 11 g t a t t cu aag t tg a g g t ce a a t gag c a c t c t a c t t C t a g c a e t g a t a age c t c t a a c t g c a caca ac agga e t t c t g t t aya a c í a a t c t t tg g 11 t a agecg t c t e t g a t t t tg c ca g c t a t t 11 a gee t t f i t c 11 c t a T . a g t t c t a L g c a t e t t g g c ta c c g c g g g a a a t cecea g t e g e c c t g g a a u g t c a t a g a t g g a c i ig t a t L g g t t g L t t c aggcga 11 a ca c a t g t L y t a a t c a c t a t a c t a a ta g e t ca t gagaaa ag a 111 C-& tg C t a n t t c c c a t c c a c 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Sec. con núm. de ident.: 2 (secuencia de ADN de NtMRP4 sin 5' y 3' UTR)
a tggata tyaggantag tdtgtceteagpa tcctgt ttageatcactttcttgttctgí: c11cnea tEtennLcytcagaggu ttengeagt tgttaaatgg ttpaga11en1111cct □tctccatgtccacaa aggactcttctatctt ccattgatgtgc tgctt11yet tact11 cattgta 111yeaytacaaaagt tyeacteaaayttgagytccaa tgagcacectacttc ttgu ttgataaycctc taattgcacacaa cayyacti.ctgttagaacca atc 11 iggtt tnnyct gtctctgnttt tgtengctnt111 ogeett* tettctatpgt t£Cacgcatttt yy11a11 gtygyaaattce cagtcycct tgyaaagtca tagatygnctgtategy11gtt tcayycya 11acacatgttytaatcacta tactaatag tteatgagaaa ayacctcacgc tatttetc &tecactgteí ctgcgtgtg tttcgga ttgtaaac 11tgtagttntyagttt y11c11 tggttytygga tcacnayycttg tgtcacttaaggaaa ttgateetnattt aag aatyga tgatataagtc cattay111ca ttLcctat 11etgttgttete11cactyl1ge oalt=uay yttcyaccggag ttgctgiaa 11aytgattetgaateteae 11aagegacga aaceaa Lygttatyaae tCCtgyut aAA tcc&5 tgtgagtggCtteget tL-Hgíttcttt antatcgn angee1111ggn 1ttggatgaa ceqttta ctgeaaannggttnenayteses tctcaa ya11gatyaag 11ccttcact ttecccactg eatagagcagayaaaatytctca acetrecgaaagaaa Ltggcct aaacctga agaaa tateaaagcatcctgtccgaacaae pttgttgcyttgc ttttggaaggaageta 11cttac tgcca 11CttgcagtaatT-agggt ntgtyl1 ptytstgtaggg teapcpetcat acadaga tttgttga11pcp cnyenyyaaa yaygacat ctcct tatgaayyaeactacete atagg aacLctcct■atayccaaat ttgt ggaagíc ctaaec teteatcayetcaac tteaaetee caaaágeteyyc atgcttatteg ,iy-y,ic*ettetCaCtte tCrgtatadgAp yyrjyttapggttgtodtgctcagc tayaca yyctca tgytq11gqacagp 11ytnaattatntggc cgtcgatgeEengengctgtctga tatyae yetacagetaca 11ccn111gg□tcatgccattg caay111ctytyyc 111Agg caecct teatact tacetcgyeycetcaac tyttgta aegetayctyya cttycagcagt gPtggt dtttgtgytg 11L.ggaaetaaa¿gaaacaa caggttt w t ttaacatcatgaa y aa tcytg*t tetagaatgt±nagcgaea natgagatycttanttat atgcycgt tataaa yetccagycat gggaag aaenttttaacaaaagaa 11yaatccetccycya atccgag ta tggatyy11 gtccaag 11ccegtactcaa tcgetggya atatca11yecttgtgyagcae tcetct t-CtagtggctataCtcac ttttgySagtgea atCttgCtyyyaat cccgcttgg tyeayyyn engtgttea ctyen-aentetcdcttcaagn tg11yc«ggfiaetgntcnggge tctccct caatccatga tctcactitcaca□gcaatga tatctcttgnCaya11ygacan acacae yatyaytaaggagt taytygataaayctgtggaaaga ctngnnyy11ytygggg tayaattgc tatgcaggtgaaaga tggayttt11cgctggga eyatyoaaacagtaaaga ngnatt ganaba tgtnanctttgaga ttagnaaagg□gagt11gtaycagt aytggygac agttggggcggggaag tct K ccctcct tgcatctgtn 11tggegayntyen*aayt tgtt yyytcagyta tggctc tcatccttetg 111y11tga ttaatacaaacC11 gctgccaa tt accttt tycccct tgttgctacctctt tteegtggtataaaaaactaatgc aggctaa tg i.yi.agaytayayg tattataegcayaacaa ctgeaa teaagcpattacetytyayatact n1111yttttídta 11ag tygattyytacat teteat tg^tgtnteg 11tgatetecaee oaagcagngg 111tactgyttgntagag tennaetnttgtyctttasttett ttaete ca aece teagtagte11tgcttctaatgaa c11caagc gtgtaataganngnccattata 11 ateagctyan tag11ac11eacaattccaga gcata11tacatctccigct tyy11gtet 1^ 1 actcrgg« t-hacógt.eccaaa Lgc;nrigeaísatcaa 2Lgcje 111 r-Dgtctt t gaccaaciagttcBtgní ytcetC4gt:LLgtccaagcitggtgtctcaccyyaat tatgeg gga tftteg LactLaatcu3ct3 gtt eaccttcitet t 43430 caicgaacgaet cga rL ggt ta3tag lll:clLaaatgeagtaa LtnCtLgct □act caeL11 acc:0atccct tgtcc aacaggtcacaPCLtgtagíLcaaeLgcctaLytcycacaaaeaccytggsttcagaatg gcacg aiaeaagam U t cctgt f-tggcatgena cgouag agacagaiacaaggaag tya tccggg LltgcLgcicggagaagga cttgyaaa t-33tggp gLtcyyayaccay tg 3a 313ggagaa cgtggfaccaacc tcag fgg i-gyc cbgaagea gcg 331-crayettgea a qagciytt LacEaygncLgvgítí-tttateLtcLagaL.gaLgtaLicEi-y'Lycagtigatg cteacaciggí: LlLgaaaCcLtcaagg LLaga agttcacaa iglc 0CjLge cati.gaaga I t i 03 t t t a a g i Lagaa aL c a c a n g L t tc íi t C C7C gc3 an t ta t gg n Ce t n t es gagaaa aatcaC ggat tttg a a tg g c ts c tttC íJ c c a g tg B n g a c a c a t a tcB tLC cctyggagga ag & ig cg aaag tg g -caag G ta it1.o c tc c a a a a a g c a ia a tc L a a a a g a c c c iia i eaag 11.1 ggddggc t ta a t CciL C4 C L t g t La te t g t t g t 3Ct t g t Cl 1L0113333t t C11 c i t. a gt- cima, tcac 1 ttrg n t. ga a g t hg nc ta g t ce 13 g t cae c Cga a t a c t i t a a a t c t I I gee11ggt gLeLeLaLatL11 cagcca Lctcaaciccgaag ctcacacccg 11 ttCLe I I I 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ttttgeatgi aaattcaaacti t^ctcicLtaga Lgattaaaiaac. gaaüaaiütccattgeaLgtttLaacgtgLaLgacaLgtLagaaLtLtgaatagaagttC a11 L-aCtgatyLtydigaLyLLLLy Itl.r.ttLtrt.y[,:aggcp.tetflfltga LtilgilCC33C1 cegaigttttcctcícgttttttatgao-teLeacCttggccatgtCtaLeanactgctcg gcítcntcatcatcacatgceaatattcttggcetaccgtaetacLLLLgaLtcccccgg gttggcctaaLatctggLacegggcargageacLgLit&ta&eagccgtCCtcecttCtt ttcLtgcctgaactcaaaLLLgaaccctttytttagpggcaACtpgtCtgcLcLgngcat 1119 gCtg*C4g 11*ttatgté>tflL133aagg canc1111tta Ltcgt tetgtceaget a aBarLttttacttaaaatgtggLCaactgcaLatCtcCgigtcLccLaLLLLLCgattat iLgcaactctgateaatetagaLttggggaaggeLLgLcgtL¿gtcgaLgacC490t&Ct ajijcecacatctaca Ltgg ttgea ugiaya.a 111 teajgetyt-attCíCttoLlttgtt tga nrt.aggayett3gcat tet tctgc33ggage c-ctg331gct tgaaaag ttaaacaga BBaqBaBaagticagggcagataqacacaatgtgttaaagtaaLLeaattggagcacaga Lata Cga catgigttat ttgggagctacgaaaaagataaggacLaLLaLgtagactec&é. LCgaaacaaeaggtaattcfltLtCtggcttiCSgggfltflttatCttgcaaeatetcgLga 0tLgactcggcttg4CtC4att4C000&gC4CCtgttflCCc3teattteteLgaaagent ctcaggtgttatyactatiieg tLgcLttsggaagcaggagstgttttgtüacgagaacgc aaacegageyaattceaatctgegaatggatttccaca-acaatggaLeeaatgaatggtc gggcLLtcgaccggaditgatgggaagcttacLtcLtrgtgtttcLgcaatgtteatgac tgte ttaCCC&gt4gicatcateaag ccagg q 4 ctgt eeB atgetcat ttatgggn aL tataflPtCetagt3tttgatiaLctetctgtaetCtagatetaceLgetetacL gaaa 4*tg paa tgn gtatg3gg343-t0ga« tntccgttgagea L11 atgtctt teta Ltaaaaa tLtg ca 11 ceatettetty 11 tcaag tcaaaate Ltga-acaacta LaLeLagagaa 1111 cettel tg19aagtaatgcatatatacaícaagagaagl cagayttgety^a. t y »tng caga tCHAactiaagi gttgtgoq taLaaagaat.tg tatggtgagattgaatatagtggt L:at.:j.1.13111 tetciSúttt Ld.yLydL.Luddytattee* L 3ca 33C4gaC33 geat ttagt eqtgeatLcatiqgeaetae3 44 4tt4 CC3íceaagagLaataitctttcagett Lcccc tgtaLatgtgcgttctBttctggagetqaBgataactaatacccttLtttatttetacag iaa atgttggc tegtcí -tatca canggeCtít ctcttaatagtgt ectatte tggtcea tctttgtgagct qct11gt ggaaaa taanac ggctcctq tegadaga ttanaaca gtcct cag asaLacea tcagaagea gag tggagaaagacggartt tCtcrea terrcaag LLggc Cía gccgtggga atgt tgagcetgaaa ícgt geaggtaa taatrctaae taattChg tgg ttgctfttttgct agca 11Lgcacaasígg an nnciataaaaagt cea tagtaaggaa gng aggg tagctge□t raacaag cct9caga LLctct aatctcaaaeacg tta cgtigaa tce cLüLdLLgn. c^LtetacLggecaaeaggrLugatdtcgtecgíPcactiCtCLagrgce cag caceagagg^gga gngnngptaggt gttg ttggtcgta-cngg 999-93n3aatcaneattaattcaagttLtctttcgtccggtggageeLgcagctggaaq aataaLcattgatgacgtagataiatccagacttgggcttcaegptCítagptcccgctt cggga lcalc ccecaagagc cagccc Lk.11tgaaggaact gtgagaagea aca 11 gacec ta ttggataa títtCigd tgatga *atttgga aggtaatct aacttgct ga□tgaaa taa 11 Lacaaaaa Cctcaaaa tatagt acagagL Lagee-aaaeatgcccte tgagegcl-gígd tet ttLLggat taeaaar retgra agageíí carachatttgct agtcaganga aaagea ta taitítígtge 111gttí tctcccagaa tgt ctcta¡ncatgaaatcgtgt acat Lgea gag ceLegaa cgctgccaac tcaa agaLgLggLgc ctctaaaa cccgaaaaa et tga1c.c accaggtaaattttcctcctctacgteatectgetetttíe&íaattítgcaacca actttttatgtgt ttoaaatatac atactga taactgaaeactgtcatt ggtaa ateata gtt gt.t.gatascggagatasetgga gtgtcgga cagaggeageetct11 getLg ggaaga gtgatgctaaaacgiagcagaettetattLatggaL-gaggcaactgcctcLgLtgat tea cagacagatgeagtgattcagaaaatcatecgcgaggattttgeggtttitíctataate agca tLgecea tagdatucea ícagt títggí ctgtgntagagttctt gttaLa gatgca ggtgttgítttttttcCttttactttgtaccttattttgaatctggtaaatgattattta tct gtíitgtgatggLttccaaccaaccat ag teaqtacccttacgaaydddLLy cevtiaL gctagccaagtagtagLdaaLgeagagttattagettatttgttttggattttgtgag tttcatacttcaaacCggnagcttntgctatactatctgatcecttgLttgtatagat Lg ctt tetttLcctttttct cggaLt L□tct.tataLaLaagcggacagagt aaaagaatgta aaca tgcgLa aLLLgacctat Laca gcagaLta LLLgLct lateteccdyg tcg ttgs-11 ccactrattaggagcagttacacgtatttate11 1tíPgegaPfitíatagtgtada gttt cttttggcac Lgtcggtgt.aaagn bgttn-aíCteCt11Ct 11aa□cccggcat 11Ct tat tcatgcaggaatagcaaaagagtttjacaaaccatetcgectgcttgaaaggeetcfiet LLttggggeLLLggtLcaagaaLaLgccaaccgateetcegígetetííC
Sec. con núm. de ident.: 3 (Intrón 1)
gtacgg-ctctcatccttctgt ttgLttgattafltaeaaactttgctgccaattaccttttgccccttgttgctaect cttttctgtggtataaaaaattaatgtaggctaaLgtgtagagtggaggtattaiiaLgcíigaíiciiíittccaatcasg caattacetgtgagatactattttgttercaLattagtggactggtacflttctcattggtgtatcgtttgatcteca ccaaagcagaggttttactggccgaeagagtcflaaetactgtgcttC&ctccttCtactccaatccttagtagtctC tgeetetaatgaa-cttcaagcgLgtaatagaaacaccattatattattagctgaetagttactttacasttccagag catatttacflttttctgettggttgtCtattactctggataacagtccCaaatgcaagcaaaatcaaet'gtgttttC agtCttgagctgaccaattagt tcatgatgtcctcagcttgcccaagctggtgcctcaccggaattfltgtgggaccC Lcgtaettaatcaactpgtteaccttcttettaaaaatat tgaatgat ttgattggttaatagttccttaaatgtag taattatttgctaacttactt taecaaccecttgtceaaeag
Sec. con núm. de ident.: 4 (Intrón 2) gttagaagtccacaaLgtcaLgtgLcflttgflagatttaatttaagatsgaaattacattgtttcattctgcaaatta tggpcctatcagageaaaatcfttggattttgaatggcEactttceecflgtgaagacacatatcatttcctgggagga a g a tg tg a a a g tg g c a a g c c a tt ta c tc e a a a a a g ta ta a tc tñ a a a g a c tt t ta t ta a g tt tg g a a g g c tta .a c c 'c atcatttgttatctgtCgtctacttgtctttattaaaattettCttagtccaatcactttcgatgaagttgactagt cttpgtcacetgaatactttaaatctttgccttggtgLctctatattttcagecstctcaattccgaagctcacatt tgttttctctttgtaatgtceatetgaaagtt ícatgcttttttgcag
Sec. con núm. de ident.: 5 (Intrón 3)
g ts a g t t tc íg a g tg t t t ta tc a a c C M tt tg g a a c c a a g c e jC e a a g a g ta g tg L t tc t tg g t tg t ta a a tg a t tc a cítgtgtgttggtttccataaaacctgaactctatgttttatcagagtgttttgc;tttetcgaag
Sec. con núm. de ident.: 6 (Intrón 4)
gcaaat tcetgagga,caa.g-tttttCCtttcgeatgtaaattcaaactttgctgct tagatgattaaataatgaaaaa ta tc c a t tg c a tg t t t c a a tg tg L a tg a c ^ tg t t& g a a t t t tg a a ta g a a g t tq a t tc a c tg ^ tg c tg a g a tg tc t t gctctttttetgcag
Sec. con núm. de ident.: 7 (Intrón 5)
gtatgagcactgtttataacagccgtcct tttttcttttcttgtctgaactcaaatttgaatcctttgt ttagaggc aattagt ctgctctgagcatt ttggctgacagttattatguatattaaaaggcaacttLtfctattcgttctgtccag ctaajactt tttacttaaaiJtgtgg ttaa.ctgoa tatttctgtgtctcctatt ttttgat teCtt-gcaactccgaec a a tc c a g a t t tg g g g a a g g c ttg t tg t ta g t tg a tg a c ta g a ta c ta a g c tc a tíA tc ta c a ttg g ttg c á a g ta g a a ttttcaagttgtcattcacttatactgtttgaactaggagatcagcattcttctgcaaggagceetgaatgcttgaa aagttaaaeagaaaagaaaaagttcagggcagatagacataatgtgttaaagtaattcaattggagcacagatatAt gaeatgtgttattCgggagctaegaaaaagataaggactattatgt3gactacaatCgaaataacaggtaat tcatt tctggtttacag
Sec. con núm. de ident.: 8 (Intrón 6)
gtataacaccgtccaatgctcatttatgggaattataaattGtagtat ttgataatqrcttctgtACtttagAtCt-ac ctgctctactgaaaaatgaaatgagtatgaggaaatagaataíLccgttgagcatttatgtctttctattaaaaattt gcattetatcttcttgt ttcaagteaaaatcttgaacaactatd tCtagagaattttCcttctCgCgaagtaatgca tatatacateaagagaagtcagagttgctgaatgaaatagtagatcaaatttaagtgtcgtgectataaagaattgt atggtgagattgñatst&gtggteatattattttctcaatcttagtgaetaaagtattccatflcaBacagacaagea tttagtcgtgcatteattggeaetaeaaaattatcaaccaagagtaatattctttcagctttcctctgtatatgtgt gttctattctggagctgaagataactaatattcttttttatttctacag
Sec. con núm. de ident.: 9 (Intrón 7)
g ta a ta a t tc ta e c ta a tE e t< jtg g tc g c ta t t tg c ta g c a tt tg c a c a a a a g g a a a a c ta ta a a a a g ttc a ta g ta aggaagagagggtagctgta ttaacaagcctacagat tetttaatctcaaatatgttacgttgüatctcta t&ttgt ttgttctactggtcaacag
Sec. con núm. de ident.: 10 (Intrón 8)
gtaatctaacttgetgactgaaataatttaeaaaaatcttaaaaLaLagLac&gagttagecaaacatgtcttctga gtgctgagatctttttggattataaattctgtaagagcaacataet atttgttagtgagaagaaaagcatatactcc agtgttttgttatctcccagdstgtctetsacatgaaatcgtgtacattgea
Sec. con núm. de ident.: 11 (Intrón 9 ) agtcattagcctatttgttttggattttgtgagtttcatacttcaaactggaagcttatgctatactatctgatccc ttgtttgtatagattgctttcttttcctttttctcggatttatcttatatataagcggacagagtaaaa
Sec. con núm. de ident.: 12 (Intrón 10)
□gt-cattagectatttgttttggat 111 gtgagttteatacttca3-a.Ctggaagcttfttgttatíittatetgit£cC 11gCttgtaLagattgc 111ct111cc11tt t-ctcgga11tatcttatatataagcggácagag taaaa
Sec. con núm. de ident.: 13 (Exón 1)
tggatatgaggaacagtatgtctteaga atcttgtttageatcac11tett g11ctgcctceaea 111caatcgtea gaggattcagcagctgttaaacggtca agatteattttcctctctccat gt,ceaeaaaggactcttctatcttccat tgatgzgctgettttgcttactttcattgtattt gcagtaenaangttgta ctcaaagtt-gfaegtccaatgageact Ctacttetagcactgataageetetaat tgcacacaacaggacttetgt tagaacea*tC111ggCttaag ctgtet c t g a t t t t g t c f t g c t a t t t t i g e c t t a t c t t c t i t i 'g t t t t a t g c A t t t t s s t t f l t ts jtgggA M tcccca ig tcgcc CtnjgaaagteatagatggactgLatcggttgttteaggcgactacacatgtLgtaattattStactaatagtteatg *ige.aE i.,agaLttcacgcL£ i.c ttcccaccc3-C tg tccctgcgcgcgctttggat.tgcaaüctttg o«g tU itg fl.g ttLg ttetttggttgtgggatcflcnaggct tgcgtcae11naggoaa11gatcctaatttangetttggatgatataagttc a11ag111ca111-cet-a111etg11gttetc11C-Attgttgcca11aaaggLtcgaccgga-gttgetgtaA11£gtg attc 13aatctca-cttaagtgatgaeíceaatgg 11 atgaactcer.ggatB.aat.ceagtgtgagtggctttgc 11 ca gctt-ctetaatatírgan&gccttctgga11tggatgaaceec11aetgcaaaaagettacaagt cacotetcaagat tgatgaagLtce11Cae 111ceccactgcatagageaga gnaaatgtCtcaac1111cgd&ag aaa11ggcCtaaa C Ctgaagaaatatcaaag catcetgtcegsacaaCa11ge tgcgttgc1111ggaacgaagt ta 1111 Lactgcca 11 cttgcagcaattagggtatgigitaLgtatgtagggecaacactcetflcaaagatttgttgatLac&cagcaggaaa gttggatatttcct 1atgaaggatactaccttataggaactCCcctaatagceaaatttgt9gaflgttCtaacctctC atcagLtcaactttaa.eteccaaaagcLtggestgcCta 11 egageg-acarttctcac 11C11 tgtataaaaagggg tteaggttgtcatgetc&gctagacsggctcatggtgttggacagatcgtaaattatatggecgtcgatgcccagca gctgtccgatatgatgctacagctaeat teca LttggctcaCge-categcaagtttctgtggctttaggeatecttt atact Laceteggtgettcaactgttgtaaegetígctgga cttgeageagtgatggta 11 tgtggtgtttggaact a a e a g a a a e a a e a g iittte a a ttra a ca te a tg a a a a a tcg tg a ttc ta g a a tg a a a g cg sca ^a tg a g a cg e tta a 11.a.L&Lgegcgttataaag11ccaggeatgggaagaac^1111daClaaagaatcgaatC CtCccgegantcegagt atggatggttgtccaag 11cttgtacteaategctgggB.atatCattgtcttgtggagenC tCCt□11ctagtggct aca.ctc-acttttggsagtgcaalc11gtt-gggaa.teeegc 11ggtgcagggacagtgttcactgeaacatCtCtC11 caegatgttgcaggaaccg atcagggc111 ecctcaatceatgatcteac111caeaegcae tgetetctcttgete gattggaeaaatatatgatgagt□aggagttagtggataaagctgtggaeagactagaaggtcgtgggggtacaatt gctatgcaggtgaaagatggagct1111gCtgggatg*tgaaaaeiigtaaagaagaa11gaaaaatgtaaact11ga gattegaaaaggegage ttgcagCagtagtggggaeng11 ggggcggggaagtcttecctcet tgcatctgtactcg gtgogatffcacaajttgteggHjteafl
Sec. con núm. de ident.: 14 (Exón 2)
g tc a c a a tttg tg g ttc a a c tg c c ta tg ttg c a c a a c a tc g tg g a C te a < ja a tg g e a e g a ta c a a g a a a a ta tc c tg tttggtatgCc&atgaacagagacagatacaaggaagtgatccgggt ttgetgcttggagaaggacttggaaataat ggagtttggagaceagactgaaataggagaacgtggcatcaacctcagtggtggteagaagcagcgaatCcagcttg eaagagetgtttaccaggactgtgatatttatcttctagatgatgtattcagtgcagttgatjeteas*ctggttCt gumtcttcaag
Sec. con núm. de ident.: 15 (Exón 3)
gaatgtgtgaggggaatttttaaagataaaaceattttgettgtCSCacaccaagttgact tcttgcataatgttga ectgatcctt
Sec. con núm. de ident.: 16 (Exón 4)
gtcatgcgagatgggatgatcgtgcaatctggciaatat4atgagatattagaagctggaatggattttaaagagct a g ta g e tg c a e a tg a g a c c tc tt ta g a a c ttg ttg a e g tg g a a a e a a e c a a a g íig ñ g C fla tg e c tc c c ttg a a g a a t caaaatcttctcgaagattat:cLaaggaagaaaacggagatgata£iatcteaacagtctacatctgetaggggggñt te ta a a c tta ta a a g g a a g a a g a a a g a g a a a c tg g a a a a g tc a g tc a tc g tg tg ta c a a g c ta ta ta tta c tg a a g c t t t t g g a tg g tg g g g tg ta g tg c te g t ta t c t t g t t t t c g t t c t t g tg g c : a a a g t t c t c ! t a a tg g c a a g tg a tc a t t 39ct33Gatatgaaaettcagcggatcgtgccatgtcctccaatccttctetgtttattgggatatacggtgttatt gcagttgtttcttcgttgctgatagtgatcaggatgtattttgtgacacttatggggctcaagactgcccaaatatt tttcggacagattctttacagcatactgcatgctcctatgtcattttttgacaí;aacaccttccggaagaattctga
Sec. con núm. de ident.: 17 (Exón 5)
gcatctflatgatcagaccaacattgacgtEittectcccgttttttatgaatctcactttggccatgttEatcaract ge t c g g c a tc a te a tc a t caca t g e c a a ta t t c t t g g í r C ta c c g ta c ta c t t t t g a t t c c t c t g g g t t g g e t t s a ta tctggtaccgg
Sec. con núm. de ident.: 18 (Exón 6)
ggata.ctatettgcaacatctcgtgaattgactcggcttgacteaattacaaaagcacctgttattcatcatttctc tg a a a g e & tc tca g g tg tta tg a c ta ta cg ttg c ttta g g a a g ca g g a g A tg ttttg ta a cg a g fla tg t& a a ce g a g tgaittceaatctgcgaatggat 11ccacaaeaatggatceaatgaatgg11ggget11cgactggaa11gatggga a g c c ta c ttc t t tg tg t t tc tg c a a tg t tc a tg a ttg rc t ta c c ta g c a g c a tc a tc a a g c c a g
Sec. con núm. de ident.: 19 (Exón 7)
a a a a tg t tg g t t tg tc a c c a tc a c a L g g c t tg tc tc t ta a ta g tg tc c ta t tc tg g tc c a tc t t tg tg a g t tg c t t t g tggaaaataaaatggtttctg tcgaaagattaaaacagttctcaga&ataccatcagaagcagagtggagfaaagat
ggat LLtctcceaCCtteaagttggccaagccgtgggaatgt tgagcttgaa aacgtgcag
Sec. con núm. de ident.: 20 (Exón 8)
S tta g a ta tc g tc c g a a c a c tc c tc ta g tg c ttM a g g a g ttK rto tc a g c a tta g a g g tjg g íig a g a a g a ta g g tg t tg ttg g tc jtíie a g c fg g g tg g a a a a tc a a c a L ta a ttc a a g tttte tttc ! jtc tg g ty ífa gcctgcagetggaagaa ta a tc a t tg a c g a c g ta g a ta ta tc c a g a c t tg g g c t tc a tg a tc t ta g a tc t tg í t tc g g g a tc a t tc c c c a a g a g e e a g tc c tttttg a a g g a a c tg tg a g a a g c a a c a ttg a c c c c a ttg g a c a a ta ttc a g a tg a tg a a a tttg g a a g
Sec. con núm. de ident.: 21 (Exón 9)
agcctcgaacgctgccaactcaaagatgtggtgtctttaaaacccgaaaaacttgattcaccag
Sec. con núm. de ident.: 21 (Exón 10) tLgttgataacggagaLaaotggagLgteggacagaggcagcttCtttgíttgggflígagtgatgCtSdaacgtage agacttctñttcatggatgaggcaactgcctccgctgatteacagacagatgcagtgattcagaaaatcatecgcga ggactttgcggcctgtactataatcagcattgcececagaataceaac^gccaCggactgtgatagagttcttgtta taga tgeng
Sec. con núm. de ident.: 22 (Exón 11)
g aacag ea aaag ag tttg acaaacca tc ccg tttg c ttg a aag g eeC tcae ttLt tggggc t t t g g t tca&gaataC gccaaccgatcctc tgagctc taa
Sec. con núm. de ident.: 23 (Secuencia de ARNi)
aa na g ccag t c c t t t t t g a aggaac t g tg ag a age n a c a ttg a c c c
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Sec. con núm. de ident.: 24 (secuencia de proteína de NtMRP4; 5'-3' marco 1; - denota el codón de parada putativo) KDWIRN5M5 SESCLASOSCSASTFQS SEDSAWttWLRP 3FLS PCPQRTLLS SIDVLLLLT F 3VFAVQKLY gKLR5 NER 5TS ÉILKPL3AH NRTSS PWKVIDGLYWLFQAI T H W I TILI VH EKEFFAIS H FLSLRVFW3ANF W M 5 LFFGCG TTRLVS LÜE Ifl&NLfcKiDDISSLVS FPrSV VLFIVAIKG STGVftV1SDS E5HL SDETNGYELLDK5SVSG FASASL3S EAFWI WMNPLLQ
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LGI PIjGAGTVFTATSLF KM LQEPI RAF PQSttlSLSQAMl SLÜRLDKY MMS KELVDKAVER LEGCGGTIAttgVKGGAFCWEDEN 3RE ELKNVN FE3RKG3 LAAWGTVGAG KSS LLASVLG
EMHKL 5GQVTI CGSTAYVAjQTSHI QWGTIQEtfIOFGM PtfNRDRYKEVIR VCCbERDLEI M
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iLtíCK'TILUT’HÜVDFL.H^ VDLILVMR=>GM EVQSG KYNSl L&AGMDFKE0VAAKET5LEL VDVETTK ESNAS LEES KSS RRLSKEBNGDDKSQQSTSDRGPS KLIK EEERETGKVSPRVY KOY TTEA FGWHGVVLVTLFS PLUQ5SLHASDYWLAYffTSADRAM SFNPSLFIGIYG VIAV
VS SOI.IVIRHY FVTLWG OKTACIPFGQILYSILHAPM SFFÜTTP ÉGRILS RASHDQTFQ D
VFLPF FMIÍLITLAHFITLLGIIIITCQY5 WPTVLLLIP LCWLHIWYRGYY LATSRELTR C.R STTKAPV1HII ESES 3SGWIT 3RCFF KOIÍMFCHE^VNi!VNSHLRWDFHNMGSNEVLGFRLE OHGSOLLCVSAH FMIVL FS S3IKPEMVGLSLEYGLSLN5VLFWSIFVS CFVENKMVS VER LKQFSEIP3 EAEWREÍMOFLP PSSWPSRGNVELEHVQVRYÍt PHTPGVOkGVTLS IRGGEKI
GWG STÜ GG ESTO EQVF FRLVEPñAGRIIIDDVEIS3LGLH DLRSRFG1rPQBPVLFEGT
VR SHIDPIGQYSDDEIWKE PRTL prqRCGVFKTF KT -FTSC --RR-LECRTEAAS LLGKS
DAKT ■QT5IYG -GHCLC -FTDRCSDS EífflPRC LOCLYYNQH CPQNTNSHCO £StYRí R
C -FLS FYFVPY FE5GK -LFICK -WFPTNU SQYLY 5ElA-C -PSSSKCM
Sec. con núm. de ident.: 25 (secuencia de proteína de NtMRP4; 5'-3' marco 2; - denota el codón de parada putativo)
WI-GTVCLQNLV -HÜFLVL PPHFríFÜRlÜOLLKG -D£ FSSLRYH KGLFYLP LMCCFCOEjS LYUgYKSCTQS-GPMSTLLOAOISL-LHTTGLLRLGKS-MDCIGCFRRLHML-SOY--RKDFTLFPIHCPCACFOLQTL- L-VCSLWGSQQLCHLEIKLILI ■EHHI 'VH- FHPLPLL
fssl lplkvr pell-l vilml t-vhjcphvmhs hihpv-val lülo-yr kpfgf g-tlyck
KVI'SHLERLH KFLHFPJTCIEQH KC1.NFSKETGLHLKKYÍ3SIOSEQHCtT^AFCRKLFLOPF
Lg -LGWLGH -GOHSY KPLOTTgOERGHLOHKDrTL -EL5 --PULWÍÍF-Ptl SETLTFKS LACLFBRUFSLLCIRRG-GCHAQLDRLHVLDRL-IIWPSMLSSCPI-CYSYIPFGSCHGK
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3CAL -SSR][GKNILTKELN PSANPSHD&C PSSCTQ5LGT5LS0GALLF _WLH gLLEV<>3C HESROVQQQCSLQHIiS SKCCENRSCOSLN P-SHFHKQ-YOL3 DWTNI -’-VRS-UIKLWKD
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SLETRLK -ÉPTVñSTSWV B SS E5ELQELPTRTVIFIF -MMYSVgLWOTOALiESS RNV -GE
FLK3 KPFCLEHTRLTSCIWLT -SL3CEMG ■3GHLAWIWRY ’ELEWI LES --LHF.RPL ■HL LTWKgrRRAH ?PLRNttNLLEDY LRRKT3MINL-YSLEiLIGGILM L-RRKKÉ ELEESVLVCT SYILLKLLDGGV -C-LECFRS CGY7SL- WQVT 3GWRríKLQR3VPCPE tLLCLLGYTVLLQL
FLEC---EGCIO -HLWGS RLPK YFSDRF FTAYCMLLCH FLTQHLPEEP-VGHLKIRPTLM
SSSRFL-1SLWPCLSHGSASSSSHAHILGLPYYF■FLÍT^GLISGTGDIILQHLVN LGLT
íLCEHLLF 31SLKASQVL -LYVADaSRRCFVTRH -TE -1£■!CE'rfISTTM3 PMNGWAFDWCf
-WüftYFFVFLgcS -LSYLAAS S5QKM0VCH Y][MACLLrVS YSG FSL VALWK3Kw FLS KD
-NS SgKYtigHgSGEKWf FSHLgV&gA VGHLS rjKTCRLDIV3tTLL-CLKELL3ALEGERR -VLLWQGYENQH -FK.FSPVWWSLQLEE -SLMT -IYPDOGFM J.LDLASGSF PKSGS FLKEL
EATLT PLDN10H>11íFGItSLERCDLKDW S LEPEKLDS PVTONG2)NWSVCÜRQLLCLGRV
MLEIÍSRLLFMDFJ^TASVDSQTDAV3 QKI1H RDFAACTI ESIñiíftlPl’VMDCÜRVLVlDAG
AlJFSPFTLYL 3LWLVNÜY LSVCDG F0FT3 VSTFí1KKLPNVSÜ'>,WhlA-
Sec. con núm. de ident.: 26 (secuencia de proteína de NtMRP4; 5'-3' marco 3; - denota el codón de parada putativo) GYEEQYVF RIL F5 iT FLFCLHISíVRG F33 C-MVK113PFL5M STRESSI FH -CAAFAYFK CICSTKWLTÍVFVG- ALYF- H --A5MCTgGPFFAljESHR*JTVLVv£2DYTCCNHYrNSS -EftTSRYFPSTVPARYIiDCKLCSY E FVLW LHDHKACVT- GH -S -FKN3 -YKF1SFl SYFCC S t.HCCFÍ-J?FDS 5CCN --F -1SLK --IÍGWL-T PG -1QCEWLCPS FStíIESLLDLD EPPTASÍ RLQVTSQD - -SE FIF'FTA -3RÉNVSTFJtKKLA -T -RflIK A BC t ™ IAALLL ECS YFYeH S Ge n -GWCWCftAKTH TKIC- LHSFKEDISL-RLLPY RKS ?W3Q ICGESflLEEVQ L-LPKA vnIAY5 SDT5H FFV -EGVKW M LS -TGSlíCHTDCK LYGK HCSAAVRYDATAT FHLAHAIA S FCGFRFt PLYLPF CFWCCWAS HTCSSDGICG VWN -KKQQVSI -HH EES -F-NE5DEÍ'DA -L YARY KV PGMGRTF -QKN -1LPF rFVWNWOVLVLNRWEYHCL VEKS ESSGYTHFttKCIÍLV
GNFAWCRCSWCNISLQE'VACTL'QGFPSIHDLTFTSHDI5- -IGÍJIYD3-GVEG-5CGKT
RR LWGYfJCVAGEKWS FLLG --KQ -R.R.1EICCKL -P -KRRACS SSGDSUQGEVF PPCICTW -D A Q W G 3 GHNLWFNCLCCTJíIVDSEWHDTR KYPVWYANSQRO I CCS DPÜLL LGeGLíGNNÜ VWR PtJ-h-RRrWHQPQWUS EAANPACKSCLPGL -YLS SR -c tOCS -C5HWL -N UgGMC BíjH S- R -tfHFRCHTPS -LIA-C-PDPCKARW^DRAIWQI --DIRSWMGF-RASSCT’ DLFRTC
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P.YOK -PH HTT FK --KL EGA3WAANS :<HWCL- NPRNÍ.THQ LEI TR TTCVSDRGS FFAHEE -
C-NVftDFYLHMRQPL LTHFQWQ-FRKSSARTLRPVL-SALPTEYQOS WTVIEFLL- MOV LT SLLLLCTLF -IW -H 11YLYVKVS NQS -SVPL -RHCLMUUÍ MR
Sec. con núm. de ident.: 27 (secuencia de ADNc de NtMRP4 derivada de la secuenciación directa de ADNc)
a t ggstatg-agga.acflgcíitgtcttcagn.a.tcEtgett.atjcatc.a.ctttcrtjctctgcctccaratttcaatcgtc agaggatLeagcagtLgttaaaLggttaaga11 tttteCtctctCCñtptCcacaaaggacCCtlCtat C311CCS ttgatgt getgettttget tac111catcgta tttgcagtaca aaagttgtacteaang ttgaggtctaatgagcac tetacLtctageactgacaagectctaattgcacacaacaggacctctgttagaaccaatctttggtttaagctgtC tecgattctgctagecatEt EageCttatcttctatagLtttatgcatÉttggLtattgtgggaaattcccagtcgc cttgganagtcatagat ggaetgt a11ggttg 11tcaggcgat tacacatgttgt&atcactatactaACagttcat g a g a a a a g a t t tc a c g c ta t t tc c c a tc c a c tg tc e e tg c g irg tg tc tc g g a t tg c a f la c t t tg ta g t ta tg a g tE t gttcrttggttgcgggatcacaaggcttgtgLcac¡ttaaggaaattgatcctaatttaagaatggatqfltatsagtt eac tagtttcatttcctatt tctgttgttctcttcattgttgccattsíaggttcgaccggagt tgctgtaatcagt gatcccgaaLctcacctaagtgatgaaaceaatggttaCgflñCtcctggflcaaatceagtgtgagtggctttgcttc agcLLctctaatatcgaaagccttLtggít ttggfttgftflccctLtaetgcüMaaaggtCflcaagtcaccCetcaaga ttgatg 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Sec. con núm. de ident.: 28 (secuencia de ADN de NtMRP3 con 5' y 3' UTR)
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Sec. con núm. de ident.: 29 (secuencia de ADN de NtMRP3 sin 5' y 3' UTR)
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Sec. con núm. de ident.: 30 (Intrón 1 de NtMRP3)
gtatgttggcgttgatgaatccctccgaaaccccattttcttacgtgtcattagttgttctttgcacctgggattgttcctt gtaattcttgggttgtgttgttggaatacaatcag
Sec. con núm. de ident.: 31 (Intrón 2 de NtMRP3)
gtaagtcctttcatatatatgctttattttcatgcttgatatattttacctagccacttgattgacccatcctttaa ttgcag
Sec. con núm. de ident.: 32 (Intrón 3 de NtMRP3)
gtactctttcctttcagtaattatggtttgcttaatatcatatatagacttaactcatttaactatgatatttctct tcag
Sec. con núm. de ident.: 33 (Intrón 4 de NtMRP3)
gtaagtgaatgattacattttctttatttagccccttttttttccttattagtgtcaatctttctgttacatgacta atcaatgttttgtgaaaattagctagtaatttcagaattaactcaaatgtactttggtatgaaaacag
Sec. con núm. de ident.: 34 (Intrón 5 de NtMRP3)
gttgctacgaccacctttttcgtgttctttgccttcacaattattctactatatgctttttcacaaagtgagtcata actttagcgacattcataaacgtgagttacatttaagtggtgagtttgttttcattgcag
Sec. con núm. de ident.: 35 (Intrón 6 de NtMRP3)
gtaagttctctatcttcatgttttctttccttgaagtttgttgtgttgaataactcttaagagcacattttctccgt ttcttgatttacag
Sec. con núm. de ident.: 36 (Intrón 7 de NtMRP3)
gtaaattaagttattctctggtgttaattatgcaggttaatttgttggtatgggttggtatatctgaaaacttttaa tag
Sec. con núm. de ident.: 37 (Intrón 8 de NtMRP3)
gtgacagcttggttttgcctatttttggatttattttgtttcagataggaaaatgacaaattttattttattgagaa actttgtttgatgttatgcttcag
Sec. con núm. de ident.: 38 (Intrón 9 de NtMRP3)
gtaacttcaagaaccacatcattttctgatgatttccacttttagagctgtaataatcatcttcattgcgttgctgc ag
Sec. con núm. de ident.: 39 (Intrón 10 de NtMRP3)
gtaagaatcatcgtttatgttctggagcaagcggagaaggaaattcttggtagttaccttttttttatgctatgctg cag
Sec. con núm. de ident.: 40 (Exón 1 de NtMRP3)
Atggaaattgcaaagggcatgtctgtgtttcaatctttgag
Sec. con núm. de ident.: 41 (Exón 2 de NtMRP3)
gagggacaataatgctggccacaaacagagtagtactaggaatgctaggttcttgtactacaaatcaaccttgtttt gttcaataggtctagccatctttagctttgtgttatgtttgttagctcatttttattggtatagaaatggttggtca gaagaaaaaattataacccttttggattttgcattaaagttgctagcttggttgtcaatctctgttttcttgcacac ccagttccttaattcttgtgaaaccaaataccctcttgttttaagagtttggtgggggcttttcttctttgtttctt gttattgccttgttatagaccttgtttatggggaaaagaaccaatctttaccaactcaattttgtatacctgatgtt gttttcactcttatggggttattcttctgttttgttgggtttattgttaaaacagagagtgaggagaatatgcttca ggaacccctttaaatggtagtgttgccaatggcatggactcaaagaagtctactggggatcaaactgtcacccctta tgccaatgctaacatttttagtctctttactttctcttggatgggtcccctaatttctgttggcaacaagaaaccat tagaccttgaggatgttcctcagcttcactttgatgatagtgtcaaagggagttttcctatttttagagaaaaacta gaatctgtgggtgggggaaatagtaaccgtgtgactaccttcatgctggtgaaggctttggttttcacagcacggaa ggagatagtgttatcggctctcttcgtgcttctttacgctctggcgtcttttgttggcccgtacctcattgatacct tagttcagtatctgaatggaaaacgagactttgataatgaaggttatgtcttagtggctgcattcttcgttgcaaag ttggtggagtgtttggcgcaaaggcattggtttttcaaggtgcagcagggagggtatcgggcacgggcagcactggt ttccaaaatctacaacaagggtttaaccctctcctgtcagtcaaagcaaagccacactagtggagagatcatcaatt ttatgacagttgatgccgagaggattggtgacttcggttggtatatgcatgatccttggatggtaatcatacaagtt gctctggcattggtgatactctataaaaatcttggcctagctgctatcgccgcgtttgttgctacaataatagtgat gttggcaaacatccctttagggagtttgcaggagaagtttcaggagaaactcatggaatcgaaagatagaaggatga aggctacatctgaagtcttaaggaatatgagaatactcaagcttcaagcttgggagatgaagtttctgtctaggatc ttggacctcaggactacagaggcaggatggttgatgaaatatgtgtacacatcagctatgactacttttgtcttctg ggttgctcctacatttgtttctgtgacgacctttggcgctgcaatgcttatgggaatcccacttgaatctgggaaga tattgtctgcacttgcgacatttagaattcttcaagagcccatctacaatctcccagatacaatttcaatgattgct caaaccaaagtttctcttgatcgtattgcatctttcctttctcttgatgacttgcagcctgatgtcatagagaagct tccaaaaggtagttctgatgaagcaattgagattgtaggtgggaacttcgcttgggatgcatccacctcgactccac ttctaaaggatgtaaatcttagagtgcttaatggcatgagagttgccatttgtggtacagttggttcaggaaaatca agcttactgtctagcattttaggagagatgcccaaattatcagggactattaaacttagtggaacgaaggcttatgt tgcacagtcgccctggatacagagtggaaagatagaggagaacatattatttggtaaagagatgcagagggagaagt atgataaagttcttgaagcgtgctccttaaagaaagacctggaaattctctcttttggcgatcaaacagaaataggg gagaggggcattaatttgagcggtggacagaagcagagaatacagattgctcgtgctctttaccaagatgctgatgt ttacctatttgatgatccgttcagtgctgtggatgctcataccggatcccatctcttcagt
Sec. con núm. de ident.: 42 (Exón 3 de NtMRP3)
gaatgtataatggggctattgaattcaaaaacagttttatatgttacacatcaagtggagtttttgcctgctgcgga tttgatcttg
Sec. con núm. de ident.: 43 (Exón 4 de NtMRP3)
gtcatgaaagatggaaggatcagtgaaactgggaaatacaatgatcttctcaaattaggtagtgacttcatggaact tgtgggtgctcaccaagaagctttaacagcaattgacacagttaagggagaagcattgagaaagagtgaggaaatga ctggtgataatacaaatgtacagaaggataaaaatatttcagatggccaaaatggtaaagtggatgatattgttgga acaaagggacaaattgttcaggaggaggaaagagagaaaggtagtgttggtttttcagtttactggaaatatataac aactgcatatggaggtgctcttgtgccatttatgctgttggcacaagttggttttcagctccttcaaattggaagca attattggatggcgtgggcaactcccgtctcaaagagtgagccacctcctgttgggagttctactctcatcattgtc tatgttgctttaggaattgcaagtgctttatgcatccttgctagaaccatgtttcttgttaccgctggatataagac agcctctttgcttttccataaaatgcatctttgcattttccgtgctccaatgtccttcttcgatgccacaccgagtg ggcggattctaaacaga
Sec. con núm. de ident.: 44 (Exón 5 de NtMRP3)
gcatcgacagatcaaagtgcaattgatctgaatgttcccattcaagttggatcctttgccttcacaataatacagct tttagggattattggagtaatgtcacaagttgcatggcaggtcttcattgtctttattccggtcattgcagtttgca tctggttggag
Sec. con núm. de ident.: 45 (Exón 6 de NtMRP3)
caatattacataccatcagcacgagaactggcacggctaaatgggacatgcaaagctccagtaatacagcactttgc cgagacaatttcaggatcaagcacaattagaagtttcgatcaggaatctagattccaggacacaagtatgaaattga tagacaattattctcggcctaagtttcacatcgctgctgcaatggagtggctttgtttgcgtttggatatgttatct ctgatcacttttgctttctctttaattttcttgatctctcttcctgttggaacaattgacccaa
Sec. con núm. de ident.: 46 (Exón 7 de NtMRP3)
gtgttgctggcttagctgttacatatgggcttaatctgaacataatacaagctcgggttgtttggaatctttgtatg atggaaaataaaattatttctgttgaaagaatacttcagtatactgctcttccaagtgaatctcctcttatcataga atccaacagaccagaccctaactggccatcttgtggagaggttgattttagcaatcttcag
Sec. con núm. de ident.: 47 (Exón 8 de NtMRP3)
gtccgatatgctcctcacatgcctctcgtgttgcgaggccttacatgcactttctttggtggaaagaagactggaat tgtcggtaggacaggcagcggtaaatctactctaatacagaccctcttccgcatagttgaaccagctgctggacaaa taaaaatagatggtatcagcatctcctcaattggtttgcatgatctacggtctagattgagtataattccacaggat ccaactatgtttgagggaacagttcgcagcaacctagacccgcttgaagagtattcagatgaacaaatttgggag
Sec. con núm. de ident.: 48 (Exón 9 de NtMRP3)
Sec. con núm. de ident.: 49 (Exón 10 de NtMRP3)
tatctgagaatggagagaactggagtgtaggccaaaggcagctggtctgccttggccgtgtgctactgaaaaagagc aaggtcctggtccttgacgaggctacagcatctgtcgacactgcaactgataatcttattcagcaaactctaaggct gcacttctctgattccacggttataaccattgctcataggattacatctgtgcttgacagtgatatggtcctactat tagatcatg
Sec. con núm. de ident.: 50 (Exón 11 de NtMRP3)
ggctcattgctgaatacggcactccagccaggttgttagagaacgaatcctcattgtttgctaagctcgtggcagag tatagtatgaggtcaaattcaagttttgagaatgtttcagacatgtga
Sec. con núm. de ident.: 51 (secuencia de ADNc de NtMRP3 como se predijo a partir de la secuencia del clon de BAC)
atggaaattgcaaagggcatgtctgtgtttcaatctttgaggagggacaataatgctggc cacaaacagagtagtactaggaatgctaggttcttgtactacaaatcaaccttgttttgt tcaataggtctagccatctttagctttgtgttatgtttgttagctcatttttattggtat agaaatggttggtcagaagaaaaaattataacccttttggattttgcattaaagttgcta gcttggttgtcaatctctgttttcttgcacacccagttccttaattcttgtgaaaccaaa taccctcttgttttaagagtttggtgggggcttttcttctttgtttcttgttattgcctt gttatagaccttgtttatggggaaaagaaccaatctttaccaactcaattttgtatacct gatgttgttttcactcttatggggttattcttctgttttgttgggtttattgttaaaaca gagagtgaggagaatatgcttcaggaacccctcttaaatggtagtgttgccaatggcatg gactcaaagaagtctactggggatcaaactgtcaccccttatgccaatgctaacattttt agtctctttactttctcttggatgggtcccctaatttctgttggcaacaagaaaccatta gaccttgaggatgttcctcagcttcactttgatgatagtgtcaaagggagttttcctatt tttagagaaaaactagaatctgtgggtgggggaaatagtaaccgtgtgactaccttcatg ctggtgaaggctttggttttcacagcacggaaggagatagtgttatcggctctcttcgtg cttctttacgctctggcgtcttttgttggcccgtacctcattgataccttagttcagtat ctgaatggaaaacgagactttgataatgaaggttatgtcttagtggctgcattcttcgtt gcaaagttggtggagtgtttggcgcaaaggcattggtttttcaaggtgcagcagggaggg tatcgggcacgggcagcactggtttccaaaatctacaacaagggtttaaccctctcctgt cagtcaaagcaaagccacactagtggagagatcatcaattttatgacagttgatgccgag aggattggtgacttcggttggtatatgcatgatccttggatggtaatcatacaagttgct ctggcattggtgatactctataaaaatcttggcctagctgctatcgccgcgtttgttgct acaataatagtgatgttggcaaacatccctttagggagtttgcaggagaagtttcaggag aaactcatggaatcgaaagatagaaggatgaaggctacatctgaagtcttaaggaatatg agaatactcaagcttcaagcttgggagatgaagtttctgtctaggatcttggacctcagg actacagaggcaggatggttgatgaaatatgtgtacacatcagctatgactacttttgtc ttctgggttgctcctacatttgtttctgtgacgacctttggcgctgcaatgcttatggga atcccacttgaatctgggaagatattgtctgcacttgcgacatttagaattcttcaagag cccatctacaatctcccagatacaatttcaatgattgctcaaaccaaagtttctcttgat cgtattgcatctttcctttctcttgatgacttgcagcctgatgtcatagagaagcttcca aaaggtagttctgatgaagcaattgagattgtaggtgggaacttcgcttgggatgcatcc acctcgactccacttctaaaggatgtaaatcttagagtgcttaatggcatgagagttgcc atttgtggtacagttggttcaggaaaatcaagcttactgtctagcattttaggagagatg cccaaattatcagggactattaaacttagtggaacgaaggcttatgttgcacagtcgccc tggatacagagtggaaagatagaggagaacatattatttggtaaagagatgcagagggag aagtatgataaagttcttgaagcgtgctccttaaagaaagacctggaaattctctctttt ggcgatcaaacagaaataggggagaggggcattaatttgagcggtggacagaagcagaga atacagattgctcgtgctctttaccaagatgctgatgtttacctatttgatgatccgttc agtgctgtggatgctcataccggatcccatctcttcagtgaatgtataatggggctattg aattcaaaaacagttttatatgttacacatcaagtggagtttttgcctgctgcggatttg atcttggtcatgaaagatggaaggatcagtgaaactgggaaatacaatgatcttctcaaa ttaggtagtgacttcatggaacttgtgggtgctcaccaagaagctttaacagcaattgac acagttaagggagaagcattgagaaagagtgaggaaatgactggtgataatacaaatgta cagaaggataaaaatatttcagatggccaaaatggtaaagtggatgatattgttggaaca aagggacaaattgttcaggaggaggaaagagagaaaggtagtgttggtttttcagtttac tggaaatatataacaactgcatatggaggtgctcttgtgccatttatgctgttggcacaa gttggttttcagctccttcaaattggaagcaattattggatggcgtgggcaactcccgtc tcaaagagtgagccacctcctgttgggagttctactctcatcattgtctatgttgcttta ggaattgcaagtgctttatgcatccttgctagaaccatgtttcttgttaccgctggatat aagacagcctctttgcttttccataaaatgcatctttgcattttccgtgctccaatgtcc ttcttcgatgccacaccgagtgggcggattctaaacagagcatcgacagatcaaagtgca attgatctgaatgttcccattcaagttggatcctttgccttcacaataatacagctttta gggattattggagtaatgtcacaagttgcatggcaggtcttcattgtctttattccggtc attgcagtttgcatctggttggagcaatattacataccatcagcacgagaactggcacgg ctaaatgggacatgcaaagctccagtaatacagcactttgccgagacaatttcaggatca agcacaattagaagtttcgatcaggaatctagattccaggacacaagtatgaaattgata gacaattattctcggcctaagtttcacatcgctgctgcaatggagtggctttgtttgcgt ttggatatgttatctctgatcacttttgctttctctttaattttcttgatctctcttcct gttggaacaattgacccaagtgttgctggcttagctgttacatatgggcttaatctgaac ataatacaagctcgggttgtttggaatctttgtatgatggaaaataaaattatttctgtt gaaagaatacttcagtatactgctcttccaagtgaatctcctcttatcatagaatccaac agaccagaccctaactggccatcttgtggagaggttgattttagcaatcttcaggtccga tatgctcctcacatgcctctcgtgttgcgaggccttacatgcactttctttggtggaaag
aagactggaattgtcggtaggacaggcagcggtaaatctactctaatacagaccctcttc
cgcatagttgaaccagctgctggacaaataaaaatagatggtatcagcatctcctcaatt ggtttgcatgatctacggtctagattgagtataattccacaggatccaactatgtttgag ggaacagttcgcagcaacctagacccgcttgaagagtattcagatgaacaaatttgggag gcgctcgataagtgtcagctaggagaagaagtgaggaagaaagaaggcaaactttattct acagtatctgagaatggagagaactggagtgtaggccaaaggcagctggtctgccttggc cgtgtgctactgaaaaagagcaaggtcctggtccttgacgaggctacagcatctgtcgac actgcaactgataatcttattcagcaaactctaaggctgcacttctctgattccacggtt ataaccattgctcataggattacatctgtgcttgacagtgatatggtcctactattagat catgggctcattgctgaatacggcactccagccaggttgttagagaacgaatcctcattg tttgctaagctcgtggcagagtatagtatgaggtcaaattcaagttttgagaatgtttca
gacatgtga
Sec. con núm. de ident.: 52 (secuencia de proteína de NtMRP3; 5'-3'; - denota el codón de parada putativo)
MEIAKGMSVFQSLRRDNNAGHKQSSTRNARFLYYKSTLFCSIGLAIFSFVLCLLAHFYWY RNGWSEEKIITLLDFALKLLAWLSISVFLHTQFLNSCETKYPLVLRVWWGLFFFVSCYCL VIDLVYGEKNQSLPTQFCIPDVVFTLMGLFFCFVGFIVKTESEENMLQEPLLNGSVANGM DSKKSTGDQTVTPYANANIFSLFTFSWMGPLISVGNKKPLDLEDVPQLHFDDSVKGSFPI FREKLESVGGGNSNRVTTFMLVKALVFTARKEIVLSALFVLLYALASFVGPYLIDTLVQY LNGKRDFDNEGYVLVAAFFVAKLVECLAQRHWFFKVQQGGYRARAALVSKIYNKGLTLSC QSKQSHTSGEIINFMTVDAERIGDFGWYMHDPWMVIIQVALALVILYKNLGLAAIAAFVA TIIVMLANIPLGSLQEKFQEKLMESKDRRMKATSEVLRNMRILKLQAWEMKFLSRILDLR TTEAGWLMKYVYTSAMTTFVFWVAPTFVSVTTFGAAMLMGIPLESGKILSALATFRILQE PIYNLPDTISMIAQTKVSLDRIASFLSLDDLQPDVIEKLPKGSSDEAIEIVGGNFAWDAS TSTPLLKDVNLRVLNGMRVAICGTVGSGKSSLLSSILGEMPKLSGTIKLSGTKAYVAQSP WIQSGKIEENILFGKEMQREKYDKVLEACSLKKDLEILSFGDQTEIGERGINLSGGQKQR IQIARALYQDADVYLFDDPFSAVDAHTGSHLFSECIMGLLNSKTVLYVTHQVEFLPAADL ILVMKDGRISETGKYNDLLKLGSDFMELVGAHQEALTAIDTVKGEALRKSEEMTGDNTNV QKDKNISDGQNGKVDDIVGTKGQIVQEEEREKGSVGFSVYWKYITTAYGGALVPFMLLAQ VGFQLLQIGSNYWMAWATPVSKSEPPPVGSSTLIIVYVALGIASALCILARTMFLVTAGY KTASLLFHKMHLCIFRAPMSFFDATPSGRILNRASTDQSAIDLNVPIQVGSFAFTIIQLL GIIGVMSQVAWQVFIVFIPVIAVCIWLEQYYIPSARELARLNGTCKAPVIQHFAETISGS STIRSFDQESRFQDTSMKLIDNYSRPKFHIAAAMEWLCLRLDMLSLITFAFSLIFLISLP VGTIDPSVAGLAVTYGLNLNIIQARVVWNLCMMENKIISVERILQYTALPSESPLIIESN RPDPNWPSCGEVDFSNLQVRYAPHMPLVLRGLTCTFFGGKKTGIVGRTGSGKSTLIQTLF RIVEPAAGQIKIDGISISSIGLHDLRSRLSIIPQDPTMFEGTVRSNLDPLEEYSDEQIWE ALDKCQLGEEVRKKEGKLYSTVSENGENWSVGQRQLVCLGRVLLKKSKVLVLDEATASVD TATDNLIQQTLRLHFSDSTVITIAHRITSVLDSDMVLLLDHGLIAEYGTPARLLENESSL FAKLVAEYSMRSNSSFENVSDM

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Un vector de expresión para inhibir la traducción de ARNm de NtMRP4 cuando se expresa en una planta de tabaco, que comprende un promotor unido operativamente a:
(a) un polinucleótido, la secuencia del polinucleótido que consiste de cualquiera de secs. con núms. de ident.: 13­ 23 o 53, ubicadas en orientación antisentido con respecto al promotor; o
(b) un constructo de polinucleótidos de 15 a 100 nucleótidos de longitud que es al menos 80 % idéntico a una región de sec. con núm. de ident.: 1, ubicado en orientación antisentido con respecto al promotor; o
(c) un polinucleótido que codifica un polinucleótido de ARNi capaz de autoaparearse para formar una estructura de horquilla que comprende:
una primera secuencia de 15 a 300 nucleótidos que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con sec. con núm. de ident.: 1;
una segunda secuencia que codifica un elemento espaciador que forma un lazo de la estructura en horquilla; y
una tercera secuencia que tiene una secuencia complementaria inversa de la primera secuencia, ubicada en la misma orientación que la primera secuencia, en donde la segunda secuencia se ubica entre la primera secuencia y la tercera, y la segunda secuencia se une operativamente a la primera secuencia y a la tercera secuencia.
2. Una planta de tabaco transgénico o una planta de tabaco que comprende un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la inducción del vector de expresión da como resultado la expresión de un polinucleótido de ARNi de NtMRP4 y una reducción en la concentración de cadmio de al menos 5 % en al menos una parte de la planta transgénica en comparación con una planta control en la cual la expresión o actividad del gen NtMRP4 y/o la actividad de la proteína codificada de esta manera no se ha reducido.
3. Material de planta de tabaco, lo que incluye biomasa, semilla u hojas, que comprende células o tejido de la planta de conformidad con la reivindicación 2 que comprende un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 1.
4. Un producto de tabaco que comprende material vegetal de conformidad con la reivindicación 3 o una parte de la planta de la reivindicación 2 que comprende un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 1.
5. Un método para reducir los niveles de cadmio en al menos una parte de una planta de tabaco que comprende la etapa de inducir la expresión del ARN de interferencia de NtMRP4 a partir de un polinucleótido transgénico seleccionado del grupo que consiste en:
(i) un polinucleótido, la secuencia del polinucleótido que consiste de cualquiera de secs. con núms. de ident.: 13­ 23 o 53; o
(ii) un constructo de polinucleótido de 15 a 100 nucleótidos de longitud que es al menos 80 % idéntico a una región de sec. con núm. de ident.: 1; o
(iii) un polinucleótido que codifica un polinucleótido de ARNi capaz de autoaparearse para formar una estructura de horquilla que comprende:
una primera secuencia de 15 a 300 nucleótidos que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con sec. con núm. de ident.: 1;
una segunda secuencia que codifica un elemento espaciador que forma un lazo de la estructura en horquilla; y
una tercera secuencia que tiene una secuencia complementaria inversa de la primera secuencia, ubicada en la misma orientación que la primera secuencia,
en donde la segunda secuencia se ubica entre la primera secuencia y la tercera secuencia, y la segunda secuencia se une operativamente a la primera secuencia y a la tercera secuencia.
6. Un polinucleótido de ARNi de NtMRP4 capaz de autoaparearse para formar una estructura en horquilla que comprende:
una primera secuencia de 15 a 300 nucleótidos que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con sec. con núm. de ident.: 1;
una segunda secuencia que codifica un elemento espaciador que forma un lazo de la estructura en horquilla; y
una tercera secuencia que tiene una secuencia complementaria inversa de la primera secuencia, ubicada en la misma orientación que la primera secuencia,
en donde la segunda secuencia se ubica entre la primera secuencia y la tercera secuencia, y la segunda secuencia se une operativamente a la primera secuencia y a la tercera secuencia.
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