CN104447971B - 一种重金属转运蛋白及其编码基因PtHMA5与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重金属转运蛋白及其编码基因PtHMA5与应用。该蛋白质是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物重金属转运能力相关的蛋白质。通过实验证明：本发明提供的蛋白具有提高植物重金属转运的功能，可以为植物富集重金属基因工程育种提供重要的基因资源。

Description

一种重金属转运蛋白及其编码基因PtHMA5与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重金属转运蛋白及其编码基因PtHMA5与应用。
背景技术
随着城市化、工业化、汽车尾气排放以及农业集约化经营的加剧，重金属污染问题越来越受到人们的关注。重金属污染不仅导致土壤退化、农作物产量和品质降低，而且能通过直接接触、食物链传递等途径危及人类的生命和健康。镉(Cd)是重要的重金属之一，在工农业生产中具有广泛的应用，如制造合金、颜料、塑料稳定剂、荧光粉、杀菌剂、油漆、电镀、电池、电器等，也因此成为全球性的五大重金属污染源之一。近几年来国内外陆续有镉污染的报道，如2009年湖南浏阳镉污染事件、2011年云南曲靖镉污染事件、2012年广西龙江镉污染事件和2013年湖南镉超标大米事件等。相比于镉在食物、大气、水体中污染的情况，土壤镉污染情况更为严重，且影响深远。土壤中的镉不但可以被水载带进行迁移，而且可以释放到大气中与大气颗粒物结合进行长距离传输。因此，镉污染土壤的修复和治理成为近年来人们关注的热点问题。
植物修复(phytoremediation)是近年来国际上兴起的一种治理重金属污染土壤的新技术，其基本思想是将利用植物对土壤重金属的吸收和富集作用，达到降低土壤重金属含量的目的。由于该技术具有高效、低耗、保持水土、工程小、无二次污染、能减少土壤侵蚀、美化景观等优点，被誉为廉价的绿色修复技术，因此在清除土壤重金属污染方面有着广泛的应用前景，已经成为业界研究的热点。
研究显示，大多数植物品种吸收的镉多位于地下部分，转运至地上部分的含量较少，不能有效地去除土壤中的镉。近年来，随着分子生物学技术的发展，利用基因工程技术培育高效的镉富集转基因植株成为可能，为短期内获得目标品种提供了有效的途径。目前，此类研究成果非常有限，主要原因在于缺乏高效的基因资源，对其相应的结构、功能认识较为浅显，发掘更多的基因资源已成为必然。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种蛋白质。
本发明提供的蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：
a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物顶端优势相关的蛋白质。
本发明提供的所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B6)中的任一种：
B1)编码上述所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组质粒、或含有B2)所述表达盒的重组质粒；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组菌、或含有B2)所述表达盒的重组菌、或含有B3)所述重组载体的重组菌；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系。
上述相关生物材料中，B1)所述的核酸分子如序列表中序列1的DNA分子所示。
本发明的另一个目的是提供上述所述蛋白质或上述所述相关生物材料在提高植物重金属转运能力中的应用。
上述应用中，所述重金属具体为镉。
本发明的最后一个目的是提供一种构建转基因植物的方法。
本发明提供的构建转基因植物的方法包括如下步骤：使上述所述蛋白质在出发植物中过表达，进而使植物的重金属转运能力提高。
上述方法中，所述使上述所述蛋白质在出发植物中过表达的方法为：向出发植物中导入上述所述蛋白质的编码基因，得到转基因植物；转基因植物与出发植物相比，重金属转运能力提高。
上述方法中，所述蛋白质的编码基因如序列表中序列1的DNA分子所示。
上述方法中，所述重金属具体为镉。
上述方法中，所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体为烟草。
本发明提供了一种重金属转运蛋白及其编码基因PtHMA5与应用。本研究从毛白杨中获得了一个重金属转运相关基因PtHMA5，该基因在茎中高表达，根中表达较弱，具有典型的重金属转运酶蛋白P1B-ATPase的基本元件，将该基因导入烟草中，通过镉转运试验证明，转基因烟草由地下部分转运镉至地上部分的效率明显高于野生型烟草，可以为植物富集重金属基因工程育种提供重要的基因资源。
附图说明
图1为利用简并引物Pt2-F/Pt2-R扩增毛白杨HMA基因片段。其中，M：100bpDNALadder；1：水；2：叶片；3：茎；4：根。
图2为利用引物PtHMAF/PtHMAR扩增毛白杨HMA基因片段。其中，1：茎；2：根；M：500bp DNA Ladder。
图3为PtHMA5蛋白高级结构的模式图。其中，箭头所指为氨基酸的N端。
图4为植物表达载体PEZR(K)-LC-PtHMA5的构建。
图5为PEZR(K)-LC-PtHMA5重组表达质粒的检测。其中，a为利用基因特异引物PtHMAF/PtHMAR扩增转化农杆菌克隆；b为SalⅠ/AvrⅡ双酶切鉴定阳性重组表达质粒。
图6为转基因的烟草组培苗。
图7为转PtHMA5基因烟草阳性株系PCR电泳检测。其中，M：100bp DNA Ladder；1：PtHMA5质粒；2-6：转基因烟草株系T1-T4；7：水。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实验材料：毛白杨(Populus tomentosa Carr.)，基因型为TC152，公众可从山东省冠县苗圃毛白杨基因库获得。
烟草(Nicotiana tabacum)在文献“Liu Jie,Xu Xiao,Xu Qian,Wang Shuhui,XuJichen.Transgenic tobacco plants expressing PicW gene from Picea wilsoniiexhibit enhanced freezing tolerance.Plant Cell,Tissue and Organ Culture(PCTOC),2014,118(3):391-400.”中公开过，公众可从北京林业大学获得。
PEZR(K)-LC质粒在文献“Eirini Kaiserli,Stuart Sullivan,Matthew A.Jones,Kevin A.Feeney and John M.Christie.Domain Swapping to Assess the MechanisticBasis of Arabidopsis Phototropin 1Receptor Kinase Activation and Endocytosisby Blue Light(2009).The Plant Cell.21(10):3226-3244.”中公开过，公众可从北京林业大学获得。
实施例1、毛白杨PtHMA5基因的获得
1、镉转运相关HMA基因的筛选
本研究以TC152基因型的毛白杨作为实验材料，将其幼苗分别置于氯化镉浓度为0mg/L、50mg/L和100mg/L的1/2Hoagland营养液中处理1天，分别提取叶片、茎和根的RNA，逆转录成cDNA。
分别以上述获得的镉处理的毛白杨的叶片、茎和根的cDNA样本为模板，采用Pt2-F和Pt2-R引物进行PCR扩增，获得一个长度600bp左右的基因片段，该片段只在茎、根中表达，叶中不表达，且茎中表达量明显高于根(图1)，推测与镉的转运有关。引物序列如下：
Pt2-F：5’-WCCNACHGCWGTVMTGGTTG-3’；
Pt2-R：5’-YCBWDYTRTCMCCWGWSAMCATG-3’。
回收PCR扩增的特异片段，克隆到pEASY-Blunt载体上，转化大肠杆菌得到阳性克隆，并对阳性克隆进行测序。
2、PtHMA5基因全序列克隆及序列分析
以镉处理的毛白杨茎、根的cDNA为模板，采用PtHMAF和PtHMAR进行扩增，获得3000bp左右的特异条带(图2)。引物序列如下：
PtHMAF：5’-CTTTATTTCATGGCAACCAAATTCTTG-3’；
PtHMAR：5’-GTAATTATTGATCACTCGATCATTATTC-3’。
对该片段回收、克隆，测序显示包含完整的基因结构，全长cDNA大小为2964bp(如序列表中序列1所示)，可编码一个987个氨基酸的肽链(如序列表中序列2所示)。蛋白相对分子量107kD，等电点(pI)为6.5，包含全部20种氨基酸，含量较高的氨基酸有Ala(9.20％)、Ile(8.90％)、Val(8.70％)、Ser(8.30％)、Leu(8.20％)等，含量较少的包括Cys(1.00％)、Trp(1.00％)、His(1.10％)等。
由Phyre2在线服务软件预测PtHMA5蛋白的二级结构，其α螺旋所占比例为49％，β折叠所占比例为17％。利用在线蛋白三维结构模拟软件预测，得到PtHMA5蛋白高级结构(图3)，可以看出，PtHMA5蛋白是由N端的重金属离子结合域、多个α跨膜螺旋组成的跨膜结合域以及包含ATP结合位点、磷酸化位点的亲水结构域三部分组成。
实施例2、转PtHMA5基因烟草的获得及镉含量的检测
1、植物表达载体构建
以实施例1中得到的阳性克隆质粒为模板，采用Pt1-F和Pt1-R引物PCR扩增获得PtHMA5基因的开放阅读框全序列。引物序列如下(下划线为酶切位点)：
Pt1-F：5’-CGCGTCGACATGGCAACCAAATTCTTGGC-3’；
Pt1-R：5’-CGCCCTAGGTCACTCGATCATTATTCC-3’。
利用限制性内切酶SalⅠ/XbaⅠ分别双酶切扩增片段和PEZR(K)-LC表达载体，回收后连接，得到重组质粒PEZR(K)-LC-PtHMA5(图4)。对重组质粒PEZR(K)-LC-PtHMA5进行测序验证，结果表明：在PEZR(K)-LC表达载体的SalⅠ和XbaⅠ酶切位点间插入的PtHMA5基因序列如序列表中序列1所示，表明载体正确。PtHMA5基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。利用电击转化技术将重组质粒导入农杆菌中，利用PCR及双酶切检测，鉴定阳性的重组菌株(图5)。
2、转PtHMA5基因烟草的获得
挑取含有重组质粒PEZR(K)-LC-PtHMA5的农杆菌单菌落，接种于含利福平(Rif,50mg/L)和卡那霉素(Kan,50mg/L)的LB液体培养基中，28℃摇菌36-48h。吸取适量菌液于不含抗生素的LB液体培养基中，摇菌3-12h至菌液OD600＝0.4。选取烟草(Nicotiana tabacum)无菌苗幼嫩叶片剪2-3刀，放入菌液中浸泡10min。将侵染过的叶片接种到芽分化培养基(MS+2mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+3％蔗糖+0.8％琼脂)上，28℃暗培养2d后，把叶片转移到筛选分化培养基(MS+2mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+50mg/L Kan+200mg/L Cef+3％蔗糖+0.8％琼脂)上，约20-40d分化出抗性芽。待不定芽达到1-2cm时，转接到(MS+0.1mg/L NAA+50mg/LKan+200mg/L Cef+3％蔗糖+0.8％琼脂)生根培养基上，7-15d后长出不定根(图6)。
提取再生烟草苗的RNA，逆转录成cDNA。利用PtHMA5基因的特异引物PtHMAF/PtHMAR进行PCR扩增，发现有4个株系已成功导入并表达PtHMA5基因(图7)，即得到转PtHMA5基因烟草。
3、转PtHMA5基因烟草镉含量的测量
对转PtHMA5基因株系及野生株系进行无性扩繁，待幼苗长到3-4片叶，开瓶炼苗2天，移植于含蛭石的培养钵中(直径10cm，高8.5cm)。培养箱中恢复生长2周后，选大小相近(每株约10个叶片)、长势一致的转PtHMA5基因烟草及野生型各三盆，一次性施加50ml镉溶液(50mg/L)处理，10天后分别收集植株地上部分、地下部分样本杀青、烘干。利用DigiBlock消解仪消解植物组织，利用7500a ICP-MS仪器(Agilent Technologies)进行镉含量的测定，利用ANOVA软件进行数据的方差分析。
结果表明：不同株系地下部分镉含量差异不大，而转PtHMA5基因株系地上部分的镉含量显著高于野生型。其中，T2株系地上部分镉含量最高，达到114.3mg/kg，而野生型株系仅为81.9mg/kg，提高了1.4倍。比较不同株系的转运系数(地上部分/地下部分)，转基因株系的镉转运系数显著高于野生型，平均提高达28％，其中T2株系提高了42.3％(表1)。由此可见，PtHMA5基因能显著提高重金属镉由地下部分向地上部分转运的能力。
表1、转PtHMA5基因烟草(T1～T4)与野生型(CK)的镉含量
注：表中镉含量为3次重复的平均值±标准误；“*”和“**”分别表示转基因株系与野生型株系间差异显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)。

Claims (9)

1.蛋白质，是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B6)中的任一种：
B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组质粒、或含有B2)所述表达盒的重组质粒；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组菌、或含有B2)所述表达盒的重组菌、或含有B3)所述重组载体的重组菌；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系。
3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子的核苷酸序列如序列表中序列1的DNA分子所示。
4.权利要求1所述蛋白质、或权利要求2或3所述相关生物材料在提高植物重金属转运能力中的应用；所述重金属为镉。
5.一种构建转基因植物的方法，包括如下步骤：使权利要求1所述蛋白质在出发植物中过表达，进而使植物的重金属转运能力提高；所述重金属为镉。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述使权利要求1所述蛋白质在出发植物中过表达的方法为：向出发植物中导入权利要求1所述蛋白质的编码基因，得到转基因植物；转基因植物与出发植物相比，重金属转运能力提高。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因如序列表中序列1的DNA分子所示。
8.根据权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于：所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述双子叶植物为烟草。
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