CN103981194A - 一种烟草镉转运基因NtHMA2及其克隆方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了烟草镉转运基因NtHMA2及其克隆方法与应用，烟草镉转运基因NtHMA2核苷酸序列如SEQID：No.1所示，编码的氨基酸序列如SEQID：No.2所示。本发明还公开了烟草镉转运基因NtHMA2的克隆方法，具体步骤包括：A、确定NtHMA2基因序列；B、提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；C、根据NtHMA2基因序列设计合成特异性引物，以cDNA作为模板，进行PCR扩增；D、回收和纯化PCR产物；E、纯化产物与载体连接，转化感受态细胞；F、筛选阳性克隆，对阳性克隆PCR扩增、测序。通过调控烟草镉转运基因NtHMA2的表达，可降低镉从烟草根部转运到叶片的转运率，从而降低烟叶的铬含量，为生产绿色优质烟叶提供了基因资源。

Description

一种烟草镉转运 基因 NtHMA2 及其克隆方法与应用

技术领域

本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及烟草镉转运基因NtHMA2及其克隆方法与应用。

背景技术

烟草（Nicotiana tabacum）是重要的经济作物，是茄科一年生草本植物。烟草属大约有60多种。重金属镉是烟草生长的非必须元素，但容易被吸收，并且通过食物链对人体产生危害。镉随水灌溉和污泥进入土壤中，被土壤吸附的镉一般在0~15cm的表层土壤中积累。土壤中过量的镉，不仅能在烟草体内残留，而且也会对烟草的生长发育起明显的危害作用，破坏叶绿体结构，降低叶绿素含量，叶片发黄，光合过程的减弱，生长缓慢，植株矮小，根系受到抑制，生长受阻，产量下降。镉污染对烟草种子出苗、烟草光合特性、烟草体内矿质元素含量、烟草组织结构、烟草酶活性、烟草生长量和烟叶品质均有较大影响。

Cd²⁺的吸收主要是通过一些对Cd²⁺具有低亲和性的多底物金属离子转运蛋白或通道蛋白进入植物细胞内。例如，小麦的LCTI蛋白在酿酒酵母中表达能够介导Cd²⁺流入细胞内，并使酵母细胞对Cd²⁺高度敏感，这种Cd²⁺高度敏感性可能是由于LCTI蛋白对Cd²⁺吸收所造成的。另外，金属转运蛋白的Nramp家族也具有能够将Cd²⁺转运至植物细胞内的功能。酿酒酵母Nramp家族成员SMF1和SMF2蛋白不但能够转运Mn²⁺而且能够转运Cu²⁺、Co²⁺和Cd²⁺。目前研究表明，镉元素从地下部向地上部的转运是借助于膜转运蛋白进行的，例如P_1B型ATPase亚家族成员HMA。 HMA蛋白家族可以根据转运功能分为两类，即Cu/Ag转运泵和Zn/Cd/Co/Pb转运泵。拟南芥AtHMA2蛋白属于Zn/Cd/Co/Pb转运泵。

国际上一些知名烟草公司和研究机构正采用生物技术和基因工程技术对烟草品种进行改良，以提高烟草对镉的抗性，减少烟草对土壤镉的吸收和转运。目前，我国也提出了无公害优质烟的开发计划，为烟草重金属危害的研究提供了新的契机。随着烟草镉污染研究的深入，必将使我国烟草镉污染控制迈上了新的台阶，为我国烟叶的健康和可持续发展奠定基础。因此，开发一种利用生物技术手段降低烟草镉转运率（叶片镉含量/根镉含量）的候选基因，通过基因操作减少烟叶镉含量是非常必要的。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种烟草镉转运基因NtHMA2；本发明的第二目的在于提供所述烟草镉转运基因NtHMA2的克隆方法；本发明的第三目的在于提供所述烟草镉转运基因NtHMA2的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的烟草镉转运基因NtHMA2核苷酸序列为SEQ ID：No.1所示。

本发明的第二目的是这样实现的，所述烟草镉转运基因NtHMA2的克隆方法包括以下步骤：

A、确定NtHMA2基因序列；

B、提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；

C、根据NtHMA2基因序列设计合成特异性引物，以cDNA作为模板，进行PCR扩增；

D、回收和纯化PCR产物；

E、纯化产物与载体连接，转化感受态细胞；

F、筛选阳性克隆，对阳性克隆PCR扩增、测序。

本发明的第三目的是这样实现的，所述的烟草镉转运基因NtHMA2用于降低镉从烟草根部转运到烟叶的转运率。

本发明利用RACE技术从烟草中得到一个烟草镉转运基因NtHMA2，具体步骤为：利用同源基因拟南芥At HMA2序列搜索NCBI烟草EST数据库，得到烟草NtHMA2的EST序列（NCBI号：FG135138.1）；利用此序列比对烟草基因组数据库（行业内部数据库），获得一个基因序列（Nsyl0129220），根据此序列设计RACE引物，RACE利用试剂盒Clontech Smart RACE cDNA Amplification Kit进行，反应参考试剂盒说明书；3’端扩增到600bp左右的片段，5’端扩增到500bp左右的片段；目标片段回收后进行测序，并与核心序列拼接获得NtHMA2全长cDNA序列，设计基因特异引物进行PCR反应，得到目的产物；对目的产物测序，得到NtHMA2基因序列；利用农杆菌介导的遗传转化方法获得NtHMA2基因的过表达和RNAi植株，对NtHMA2进行功能验证，结果表明NtHMA2基因具有将镉从烟草根部转运到叶片的功能。NtHMA2基因的发现，为通过调控基因的表达，控制烟叶重金属镉含量，为生产绿色优质烟叶提供了基因资源。

附图说明

图1为利用引物对NtHMA2F/NtHMA2R扩增NtHMA2基因结果，扩增产物4242bp；

图2为pBI121-NtHMA2载体PCR鉴定，所用引物对为NtHMA2F/NtHMA2R，扩增产物为4242bp；

图3为 pBI121-NtHMA2载体酶切鉴定，利用BamHI和SacI双酶切，可以获得4000bp左右的目的条带；

图4为 NtHMA2基因RNAi载体片段PCR扩增结果，所用引物对为HMARNAiF/HMARNAiR，扩增产物为369bp；

图5为RNAi 载体pBI121-pQLi-NtHMA2的酶切验证，XbalI和SacI双酶切后可以将1500bp左右的反向重复单元切下；

图6 为NtHMA2 RNAi烟草植株镉转移率，Vector Control为转空载体对照，其余为转基因植株；

图7为NtHMA2过表达烟草植株镉转移率，Vector Control为转空载体对照，其余为转基因植株。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的烟草镉转运基因NtHMA2核苷酸序列为SEQ ID：No.1所示，编码的氨基酸序列为SEQ ID：No.2所示。

所述的烟草镉转运基因NtHMA2来源于林烟草。

本发明所述所述的烟草镉转运基因NtHMA2的克隆方法，包括以下步骤：

A、确定NtHMA2基因序列；

B、提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；

C、根据NtHMA2基因序列设计合成特异性引物，以cDNA作为模板，进行PCR扩增；

D、回收和纯化PCR产物；

E、纯化产物与载体连接，转化感受态细胞；

F、筛选阳性克隆，对阳性克隆PCR扩增、测序。

所述的步骤A包括如下步骤：（1）利用同源基因拟南芥At HMA2序列搜索NCBI烟草EST数据库，得到烟草NtHMA2的EST序列（NCBI号：FG135138.1）；（2）利用此序列比对烟草基因组数据库（行业内部数据库），获得一个基因序列（Nsyl0129220），根据此序列设计RACE引物；（3）RACE利用试剂盒Clontech Smart RACE cDNA Amplification Kit进行，反应参考试剂盒说明书；3′端扩增到500~700bp左右的片段，5′端扩增到400~600bp左右的片段；（4）目标片段回收后进行测序，并与核心序列拼接获得NtHMA2全长cDNA序列，设计基因特异引物进行PCR反应，得到目的产物；对目的产物测序，得到NtHMA2基因序列；其中，步骤（2）所述的RACE基因特异引物为：

3′RACE基因特异引物：5′-AGAAACTGCTCATTGTGACAGCACA-3′；

5′RACE基因特异引物：5′-CAACTGCAACAGCTGCAAGTGCTA-3′

所述步骤C的特异性引物为：

正向引物NtHMA2F：5′-TCTTCTCCTCCTCCTTAGAGAAG-3′；

反向引物NtHMA2R：5′-CTACTCTATGACAATTTCTGATA-3′。

所述烟草镉转运基因NtHMA2的应用，主要通过调控该基因的表达，降低镉从烟草根部转运到烟叶的转运率，从而降低烟叶中重金属镉的含量。

所述的降低镉从烟草根部转运到烟叶的转运率的方法包括如下步骤：

A、构建RNAi载体；

B、农杆菌转化；

C、RNAi载体导入烟草；

D、培养转基因植株。

本发明的工作原理为利用RACE技术从烟草中得到一个烟草镉转运基因NtHMA2序列，具体步骤为：利用同源基因拟南芥At HMA2序列搜索NCBI烟草EST数据库，得到烟草NtHMA2的EST序列（NCBI号：FG135138.1）；利用此序列比对烟草基因组数据库（行业内部数据库），获得一个基因序列（Nsyl0129220），根据此序列设计RACE引物，RACE利用试剂盒Clontech Smart RACE cDNA Amplification Kit进行，反应参考试剂盒说明书；3′端扩增到600bp左右的片段，5′端扩增到500bp左右的片段；目标片段回收后进行测序，并与核心序列拼接获得NtHMA2全长cDNA序列，设计基因特异引物进行PCR反应，得到目的产物；对目的产物测序，得到NtHMA2基因序列，再对基因NtHMA2进行克隆，构建重组载体，利用农杆菌介导的遗传转化方法获得NtHMA2基因的过表达和RNAi植株，对NtHMA2进行功能验证，结果表明NtHMA2基因具有将镉从烟草根部转运到叶片的功能。理论上，可通过调控NtHMA2基因的表达，控制烟叶重金属镉含量，为生产绿色优质烟叶提供了基因资源。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：

1、NtHMA2基因的克隆，为降低烟叶镉含量分子育种提供新的基因资源，该基因资源的开发利用有利于生产低镉含量烟草和实现绿色优质烟叶的开发。

2、通过农杆菌介导的遗传转化方法获得该基因过表达和抑制表达的转基因植株，经生物学功能验证，表明本发明克隆的NtHMA2基因具有将镉从烟草根部转运到叶片的功能。

实施例1 ——NtHMA2基因的分离克隆

利用同源基因拟南芥At HMA2序列搜索NCBI烟草EST数据库，得到烟草NtHMA2的EST序列，具体步骤为：利用同源基因拟南芥At HMA2序列搜索NCBI烟草EST数据库，得到烟草NtHMA2的EST序列（NCBI号：FG135138.1）；利用此序列比对烟草基因组数据库（行业内部数据库），获得一个基因序列（Nsyl0129220），根据此序列设计RACE引物，RACE利用试剂盒Clontech Smart RACE cDNA Amplification Kit进行，反应参考试剂盒说明书；3′端扩增到600bp左右的片段，5′端扩增到500bp左右的片段；目标片段回收后进行测序，并与核心序列拼接获得NtHMA2全长cDNA序列，设计基因特异引物进行PCR反应，得到目的产物；对目的产物测序，得到NtHMA2基因序列；其中，RACE特异性引物为：

3′RACE基因特异引物：5′-AGAAACTGCTCATTGTGACAGCACA-3′；

5′RACE基因特异引物：5′-CAACTGCAACAGCTGCAAGTGCTA-3′

测序得到新基因NtHMA2，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，其中131～4342 bp为该基因的编码区，包含4212bp的开放阅读框；编码1404个氨基酸，如序列表SEQIDNO.2所示。

提取林烟草根部RNA，抽提使用Trizol试剂盒（Invitrogen,按该试剂盒提供的说明书操作）。

取2μg RNA进行反转录，利用PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser（TAKARA）试剂盒进行基因组DNA去除并反转录（按试剂盒操作手册操作）。

将反转录得到的第一链cDNA作为模板，用于PCR扩增NtHMA2基因全长，并设计特性行引物如下：

正向引物：NtHMA2F：5′-TCTTCTCCTCCTCCTTAGAGAAG-3′；

反向引物：NtHMA2R：5′-CTACTCTATGACAATTTCTGATA-3′。

PCR反应体系为50μL，包括：200ng cDNA，1×Phusion HF反应缓冲液，10mM dNTP，2U的Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase，上述引物各1μM。PCR反应在Mastercycler® pro（Eppendorf，德国）扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，10秒，60℃，20秒，72℃，2分钟，40个循环；72℃延伸7分钟。

产物经1%（g/mL）的琼脂糖凝胶电泳分离，扩增结果产生一条单一PCR条带，见图1。用QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN，德国）回收扩增条带，提取步骤参照试剂盒使用说明。回收纯化的DNA与TOPO载体（Invitrogen ZERO Blunt TOPO RCR Cloning kit）连接，按说明书操作。连接产物利用热激法转化大肠杆菌DH5，在含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，挑取5个克隆测序（大连宝生物工程有限公司）。

测序结果表明NtHMA2基因的全长为4489bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示，通过测序、比对确定是本发明需要的目的基因，申请人将该基因命名为NtHMA2。NtHMA2基因包括4212bp的开放阅读框；编码1404个氨基酸。推导的NtHMA2基因的氨基酸序列与拟南芥AtHMA2具有73%的相似性。

实施例2 ——植物转化载体构建

（1）过表达载体构建

根据pBI121载体序列酶切位点，利用Primer Premier5.0软件设计出构建NtHMA2基因过表达的引物对，其序列如下所示：

Forward primer：5′-GGGTGGATCCTCTTCTCCTCCTCCTTAGAGAAG-3′

Reverse primer：5′-TAATGAGCTCCTACTCTATGACAATTTCTGATA-3′

下划线所示为酶切位点。

以NtHMA2基因阳性克隆DNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增体系激扩增程序同实例1。双酶切体系：反应总体积为40μL，含PCR纯化后的产物10μL， 10×NEB Buffer1.1 4μL，BamHI和SacI各2μL，灭菌双蒸水22μL。37℃酶切过夜后纯化。pBI121载体的双酶切体系：反应总体积为40μL，含纯化的pBI121质粒DNA 10μL，10×NEB Buffer1.1 4μL，BamHI和SacI各2μL，灭菌双蒸水22μL。37℃酶切过夜后纯化。

连接反应体系中NtHMA2基因与pBI121载体的摩尔比为5:1，反应总体积为10μL，其中：10×连接Buffer 1μL，T4 DNA连接酶1μL，NtHMA2基因双酶切片段6μL，pBI121载体双酶切片段2μL。16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌菌种DH5α。

在含有卡那霉素（50mg/L）的LB固体培养基上筛选阳性克隆，抽提质粒后进行PCR（图2）及酶切鉴定（图3）。构建的载体命名为pBI121-NtHMA2。

（2）抑制表达（RNAi）载体构建

以pQLi载体为中间载体，pBI121为表达载体构建NtHMA2基因的RNAi 载体，构建引物为：

HMARNAiF：CATTCTAGA GAGCTC GGATCC GAATCAAGCAAGATTAGAAGCA

HMARNAiR：TCAACTAGT GATATCCTCGAGAGTGATGACATAGCAGCAGT

HMARNAiF中下划线分别为XbaI，SacI，BamHI酶切位点；HMARNAiR中下划线分别为SpeI，EcoRV酶切位点。

以NtHMA2基因阳性克隆DNA为模板进行PCR扩增（结果见图4）。PCR扩增体系激扩增程序同实例1。NtHMA2基因RNAi正向片段与pQLi载体连接：利用BamHI和EcoRV分别双酶切纯化的PCR产物和pQLi载体，反应体系同过表达载体的构建。酶切后回进行回收纯化并进行连接。连接反应体系中RNAi正向片段和pQLi的摩尔比为5:1，反应程序同过表达载体构建部分。连接产物转化大肠杆菌菌种DH5α后提取质粒进行酶切鉴定。NtHMA2基因RNAi反向片段与连接有正向片段的pQLi载体连接：SacI和SpeI分别双酶切RNAi反向片段与连接有正向片段的pQLi载体，酶切后回收纯化并进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α细胞，转化子抽提后进行酶切验证。构建的中间载体命名为pQLi-HMA2。

利用XbaI和SacI分别双酶切pBI121和pQLi-HMA2载体，回收pBI121大片段和pQLi-HMA2载体酶切后1000bp左右的片段，进行连接。连接后转化大肠杆菌DH5α，抽提质粒进行酶切验证（图5），程序同上。构建的载体命名为pBI121-pQLi-NtHMA2。

实施例3 ——烟草的遗传转化

（1）表达载体转化农杆菌

利用冻融法（参照萨姆布鲁克，拉塞尔著，黄培堂等译，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002 年）将重组载体pBI121-NtHMA2和pBI121-pQLi-NtHMA2转入农杆菌军中GV3101。

从-80℃冰箱中取出3管农杆菌感受态细胞，冰上溶解，分别加入重组表达载体pBI121-NtHMA2、pBI121-pQLi-NtHMA2和pBI121空载体。

将以上混合物放入液氮速冻1分钟，转入37℃水浴5分钟。

相混合物中加入1mL LB培养基，28℃，220rpm培养3～4小时。

培养物涂布于含有卡那霉素（50mg/L）和利福平（25mg/L）的LB固体培养基上，28℃倒置培养2～3天。可见含有目的载体的克隆。

（2）烟草转化

挑取含有目标载体的农杆菌在含有卡那霉素和利福平的LB平板上划线，28℃培养2～3天。

刮取划线菌斑接菌于含有卡那霉素和利福平的MS培养基中，28℃，220rpm震荡培养，菌液浓度达到OD=0.5～0.8时进行侵染。

将菌体收集到离心管中，6,000rpm离心分钟富集菌体，弃上清，再用约20ml液体MS培养基重悬菌体。

将叶片置于500mL广口瓶中，加入适量70％乙醇，漂洗1min。；倒掉乙醇，加入0.1％HgCl₂溶液（称取升汞0.1克，用少许酒精溶解，再加水至100毫升），置摇床上室温振荡15～30分钟； 倒掉溶液，用无菌水冲洗6遍；将叶片取出，用灭菌吸水纸洗去表面液体，取无菌叶片用剪刀切成1cm×1cm的小片，将切成小片的植物叶片放入无菌MS液体培养基悬浮的菌液中，静置15～20min。

取出材料，用无菌滤纸吸去多余菌液，于共培养培养基中（MS+6-BA 1.0mg/L + NAA 0.1mg/L ），25℃暗培养两天。

把材料转入分化培养基中（MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Kan 200mg/L + Carb（羧苄青霉素钠）500mg/L），切口接触培养基，于温室中分化培养，每2-3周将其转移到新的培养基中。切口处逐渐长出愈伤组织，最后分化出芽。

将长至3～5cm的芽切下，转入生根培养基（MS）诱导生根。

生根后的转基因植株由生根培养基中取出，用自来水净培养基，移植于灭菌的营养土中。

转基因植株经NPTII基因特异引物PCR验证扩增，鉴定转基因阳性植株。

实施例4 ——转基因植株镉吸收试验

转基因植株移栽到一次性花盆后，置于育苗池中，育苗池内10cm左右含的水（含4ppm氯化镉）。

生长30天后，取转基因植株叶片和根，60℃烘干，测定镉含量，计算转基因植株镉转移率（叶片镉含量/根镉含量），结果见图6、图7。RNAi植株NtHMA RNAi-6、NtHMA RNAi-41、NtHMA RNAi-43镉转移率比空载体对照Vector Control降低50%以上。NtHMA2过表达植株NtHMA2OE-5、NtHMA2OE-6、NtHMA2OE-19镉转移率比空载体对照Vector Control提高2倍以上，尤其NtHMA2OE-19比对照提高5倍以上。上述结果表明，NtHMA2基因负责烟草镉从根部向叶片的运输。通过对该基因的遗传操作，可以降低烟草叶片镉含量。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南省烟草农业科学研究院

<120> 一种烟草镉转运基因NtHMA2及其克隆方法与应用

<130> 2014

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 4489

<212> DNA

<213> NtH2MA

<400> 1

ttctctctgc atgttcttat aagagaaact catcacctct ttctaaaaca aaagtatatc 60

caatatattc cagaactaga aattcctttt tcatctatta tcttctcctc ctccttagag 120

aaggagaaaa atggtggaaa gtgaaaaaat gaatgaaaca aagaagttga gcaagagcta 180

ttttgatgtt ttgggaattt gctgtacttc agaagttgtt ctagttgaaa aaattctcaa 240

gaatcttgaa ggggttaaag aggtttcagt aattgtcaca acaaagactg tcattgttat 300

tcatgattct cttctcattt ctccgcaaca aattgttaaa gcattgaatc aagcaagatt 360

agaagcaagc ataagagtga aaggagagaa aaactaccaa aagaaatggc caagtccatt 420

tgcaattggc agtggaatat tgcttggact ctcatttttg aagtactttt ttgcaccttt 480

ccaatggtta gcacttgcag ctgttgcagt tgggattcct ccaattattt ttagaggtgt 540

ggctgccgtg cgaaacctca ctcttgacat caacattctt gttttaatag cagtggctgg 600

atcaattgtt ttacacgatt attgggaagc tggtactatt gtcttcttat tcgccattgc 660

agaatggcta gagtcaaggg caagtcacaa ggctaccgct gctatgtcat cactggtcaa 720

tatagtccct ccaacagcag ttttagctga aagcggagaa gtcgtaaatg ttgatgaagt 780

caaggtgaat agcattcttg ctgtgaaagc tggtgaaact atacctattg atggagttgt 840

agtggaaggg gaatgtgacg tggacgagaa aacactgaca ggcgagtcgt ttccagtttc 900

taagcaaaga gattcaacgg tctgggctgg cactacaaat ctaaatggct atatcagtgt 960

taagactacg gctttggctg aagattgtgc ggtggctagg atggcacagc ttgtcgaaga 1020

tgctcagaac aagaaatcaa aaacccaaag atacatcgac aagtgtgcta aatattatac 1080

accagcaatt gtggctatat cagcttcttt ggcaattgtt cctactgcat taagagttca 1140

caatcgaaat gaatggtatc gcttggcttt ggtcacattg gtgagtgcat gtccgtgtgc 1200

acttgttcta tctacaccag ttgccatgtg ttgcgcactt tcaaaagcag caacgtccgg 1260

tcttctgttt aaaggagcag agtaccttga gactctagct aaaatcaaaa tcatggcttt 1320

tgacaaaaca gggactataa ctaaaggaga atttatggtg accgagttca agtctctgat 1380

tgatggtttt agtctcaata cactgcttta ctgggtttca agcattgaga gcaagtcagg 1440

tcatccgatg gcagccgctc tggtggacta tgcacaatca aattccgttg agccaaagcc 1500

tgatagagtt gagcagtttc aaaattttcc tggtgaaggg atatttggaa gaattgatgg 1560

aatggaaatc tatgtcggga ataggaaaat ttcttcaaga gctggatgta ccacagtacc 1620

agaaatagag ggtgatagtt tcaaaggaaa gtctgttgga tacatatttt tgggatcatc 1680

tccagctgga attttcagtc tttccgatgt ttgtcgaatt ggtgtaaaag aagcaatgag 1740

agaactgaag cagatgggta tcaaaaccgc gatgcttact ggtgattgtt atgcagctgc 1800

caaccatgtg caggatcagt taggtggagc tttggatgaa tttcaagcag aactcctacc 1860

agaggacaag gcaacaatca tcaagggttt tcagaaggaa gctccaacag cgatgatagg 1920

cgacggcctt aatgatgctc ctgcattagc aacagctgac attggcatct caatgggcat 1980

ctctgggtca gctctcgcta aagaaacagg ccatgttata ctaatgacaa atgacatcgg 2040

aagaataccg aaagctgcac gtcttgctag aagagttcga aggaagattg ttgagaatat 2100

gattatatca gtcgttacaa aggctgccat agttgcattg gcaatagcag gttatccatt 2160

ggtttgggct gctgtcctcg cagatactgg gacatgcttg ctagtgattt tgaacagcat 2220

gctacttcta cgaggaggca cacgcagaca tgggaaaaaa tgttggagat cttctactcc 2280

ttcgcatgct ccccaccaca aagacaaagc ttcatgttgc aagtcggaaa atgctcccca 2340

gctgtgttgc tctgatattg agtcacaaaa gaaatgtaca agtcaatcat gctcgtccga 2400

ggtgtgtgtt ccaagatgtc aacctgtctc ctcaggatca aagtcatgtg gaaataatca 2460

gtgcccagac tccattgaaa atagtggttt tcattctcat ccccgtcctc aatgctgctc 2520

gtcgaagatg gctgctaaag catgccaatc tgcagtttca gaatcaaagt catgcggaaa 2580

taatcagtgc ccagactccg ttgaaaatag tggttttcat tctcatcccc gtcctgaatg 2640

ctgctcgtcg aagatggctg ctaaagcgtg ccaatctgca gtttcagaat caaagtcatg 2700

tggaaataat cagtgcccag actccgttga aaatagtggt tttcattctc atccccgtcc 2760

tcaatgctgt tcatcgaaga tggctgctaa agcaggccaa tctgcacttt cagaatcaaa 2820

gtcatgtgga aataacaatt gctcagactc cattcacaag agtaattgtc attctttaac 2880

taactctcta gtatgttctt ccaagatgtc tgctccacaa tgtcattctg ctacttcaag 2940

caacaaatca tgtggaagta ccaagtgctc cgacttcagt gacaaaaaat gttgtcaatc 3000

cgacaaaatt cctcaaacgt gctctaccaa gaagtctgct ccaggatgtc aatctgcagt 3060

ttctgggtct aaatcatgtg gaaatagcaa gtgttcagac tcaaaagaca atagtagcca 3120

tccttcacat cccgatcatc aaacatgcat gtctaagttg tgtgctccac aaagccaatc 3180

tgcaacttca agctccagga catgtggaaa tacaaagtgc tcggacacca atagcaagaa 3240

ttcttgttat tcacaaacca actctgaatc atgctcttca aagatgtctg gtccatcatg 3300

caaaactgct aattcaggtt caaggtcatg cagaaataag aagtgccagg actctgcaac 3360

cgagaacagt tttcattcac cacttactaa tccactcagt ggggaaaagc tttcggagca 3420

gaaaagcttg gatttagtcc gaaaagataa ggaatcaagt catgatcttc gtcatggctg 3480

ctctgacgag gaacatgatc atacaaattt agacaaggca tatgacagtt gtgccttaca 3540

agaatgttgt tattcggttc aaggcaataa aactgatgta tcagaaactg gaatccagga 3600

aactgctcat tgtgacagca ccaatcaaac atgccaaact gcaagttcag gatcgatgac 3660

atgcggaaat gataagatcc tggactctct aagcatccat ggttgtcatt cgcatgataa 3720

tccactccac gaggagaaca acttggagca gaaaatcttg gatgttgttg gagaaggtat 3780

aaaatcacct catgctgtcg gtcatggctg ttcggacaag gaacacgatc actcacatcc 3840

agaaaaggca tatgacagtt gtgcaacaga tgattgttgt ttttcagttc aagtccatgg 3900

cattgacgac gtatcaaaaa gtgaaattca agaaactgct cattgtgaca gcacaaagca 3960

gagcatggtc atctccagca gctgcaaaca tgaaccaaaa gatcaggtaa atcactgtgg 4020

acttcactct aaaactactc caactgatga agaactagcc aagctggtta gaagatgctg 4080

caaatacaaa ccatgccacg acgtccgttc tggctgcagg aagcatgctg cagaatgtgg 4140

tccaaccgtt cgatcaacca tcaatatctt acgggacaac catcatcatt acctagactg 4200

cagtggtcgt aaggtttgtt cgctgttgga gaagagacac atcggtggat gctgtgacag 4260

cttcagaaaa gaatgttgtg ccaagaaaaa acaccttgga gcaagttttg gaggaggttt 4320

atcagaaatt gtcatagagt agatgcaatc cgaagtgtac atatgttgta aacttcctac 4380

ctattttatc ttcaagaagt tgagctgcta atttgaacaa agctattgca atggcttgta 4440

tatttatcct aaaaaatggc ttgtataaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 4489

<210> 2

<211> 1403

<212> PRT

<213> NtHMA2 氨基酸序列

<400> 2

Met Val Glu Ser Glu Lys Met Asn Glu Thr Lys Lys Leu Ser Lys Ser

1 5 10 15

Tyr Phe Asp Val Leu Gly Ile Cys Cys Thr Ser Glu Val Val Leu Val

20 25 30

Glu Lys Ile Leu Lys Asn Leu Glu Gly Val Lys Glu Val Ser Val Ile

35 40 45

Val Thr Thr Lys Thr Val Ile Val Ile His Asp Ser Leu Leu Ile Ser

50 55 60

Pro Gln Gln Ile Val Lys Ala Leu Asn Gln Ala Arg Leu Glu Ala Ser

65 70 75 80

Ile Arg Val Lys Gly Glu Lys Asn Tyr Gln Lys Lys Trp Pro Ser Pro

85 90 95

Phe Ala Ile Gly Ser Gly Ile Leu Leu Gly Leu Ser Phe Leu Lys Tyr

100 105 110

Phe Phe Ala Pro Phe Gln Trp Leu Ala Leu Ala Ala Val Ala Val Gly

115 120 125

Ile Pro Pro Ile Ile Phe Arg Gly Val Ala Ala Val Arg Asn Leu Thr

130 135 140

Leu Asp Ile Asn Ile Leu Val Leu Ile Ala Val Ala Gly Ser Ile Val

145 150 155 160

Leu His Asp Tyr Trp Glu Ala Gly Thr Ile Val Phe Leu Phe Ala Ile

165 170 175

Ala Glu Trp Leu Glu Ser Arg Ala Ser His Lys Ala Thr Ala Ala Met

180 185 190

Ser Ser Leu Val Asn Ile Val Pro Pro Thr Ala Val Leu Ala Glu Ser

195 200 205

Gly Glu Val Val Asn Val Asp Glu Val Lys Val Asn Ser Ile Leu Ala

210 215 220

Val Lys Ala Gly Glu Thr Ile Pro Ile Asp Gly Val Val Val Glu Gly

225 230 235 240

Glu Cys Asp Val Asp Glu Lys Thr Leu Thr Gly Glu Ser Phe Pro Val

245 250 255

Ser Lys Gln Arg Asp Ser Thr Val Trp Ala Gly Thr Thr Asn Leu Asn

260 265 270

Gly Tyr Ile Ser Val Lys Thr Thr Ala Leu Ala Glu Asp Cys Ala Val

275 280 285

Ala Arg Met Ala Gln Leu Val Glu Asp Ala Gln Asn Lys Lys Ser Lys

290 295 300

Thr Gln Arg Tyr Ile Asp Lys Cys Ala Lys Tyr Tyr Thr Pro Ala Ile

305 310 315 320

Val Ala Ile Ser Ala Ser Leu Ala Ile Val Pro Thr Ala Leu Arg Val

325 330 335

His Asn Arg Asn Glu Trp Tyr Arg Leu Ala Leu Val Thr Leu Val Ser

340 345 350

Ala Cys Pro Cys Ala Leu Val Leu Ser Thr Pro Val Ala Met Cys Cys

355 360 365

Ala Leu Ser Lys Ala Ala Thr Ser Gly Leu Leu Phe Lys Gly Ala Glu

370 375 380

Tyr Leu Glu Thr Leu Ala Lys Ile Lys Ile Met Ala Phe Asp Lys Thr

385 390 395 400

Gly Thr Ile Thr Lys Gly Glu Phe Met Val Thr Glu Phe Lys Ser Leu

405 410 415

Ile Asp Gly Phe Ser Leu Asn Thr Leu Leu Tyr Trp Val Ser Ser Ile

420 425 430

Glu Ser Lys Ser Gly His Pro Met Ala Ala Ala Leu Val Asp Tyr Ala

435 440 445

Gln Ser Asn Ser Val Glu Pro Lys Pro Asp Arg Val Glu Gln Phe Gln

450 455 460

Asn Phe Pro Gly Glu Gly Ile Phe Gly Arg Ile Asp Gly Met Glu Ile

465 470 475 480

Tyr Val Gly Asn Arg Lys Ile Ser Ser Arg Ala Gly Cys Thr Thr Val

485 490 495

Pro Glu Ile Glu Gly Asp Ser Phe Lys Gly Lys Ser Val Gly Tyr Ile

500 505 510

Phe Leu Gly Ser Ser Pro Ala Gly Ile Phe Ser Leu Ser Asp Val Cys

515 520 525

Arg Ile Gly Val Lys Glu Ala Met Arg Glu Leu Lys Gln Met Gly Ile

530 535 540

Lys Thr Ala Met Leu Thr Gly Asp Cys Tyr Ala Ala Ala Asn His Val

545 550 555 560

Gln Asp Gln Leu Gly Gly Ala Leu Asp Glu Phe Gln Ala Glu Leu Leu

565 570 575

Pro Glu Asp Lys Ala Thr Ile Ile Lys Gly Phe Gln Lys Glu Ala Pro

580 585 590

Thr Ala Met Ile Gly Asp Gly Leu Asn Asp Ala Pro Ala Leu Ala Thr

595 600 605

Ala Asp Ile Gly Ile Ser Met Gly Ile Ser Gly Ser Ala Leu Ala Lys

610 615 620

Glu Thr Gly His Val Ile Leu Met Thr Asn Asp Ile Gly Arg Ile Pro

625 630 635 640

Lys Ala Ala Arg Leu Ala Arg Arg Val Arg Arg Lys Ile Val Glu Asn

645 650 655

Met Ile Ile Ser Val Val Thr Lys Ala Ala Ile Val Ala Leu Ala Ile

660 665 670

Ala Gly Tyr Pro Leu Val Trp Ala Ala Val Leu Ala Asp Thr Gly Thr

675 680 685

Cys Leu Leu Val Ile Leu Asn Ser Met Leu Leu Leu Arg Gly Gly Thr

690 695 700

Arg Arg His Gly Lys Lys Cys Trp Arg Ser Ser Thr Pro Ser His Ala

705 710 715 720

Pro His His Lys Asp Lys Ala Ser Cys Cys Lys Ser Glu Asn Ala Pro

725 730 735

Gln Leu Cys Cys Ser Asp Ile Glu Ser Gln Lys Lys Cys Thr Ser Gln

740 745 750

Ser Cys Ser Ser Glu Val Cys Val Pro Arg Cys Gln Pro Val Ser Ser

755 760 765

Gly Ser Lys Ser Cys Gly Asn Asn Gln Cys Pro Asp Ser Ile Glu Asn

770 775 780

Ser Gly Phe His Ser His Pro Arg Pro Gln Cys Cys Ser Ser Lys Met

785 790 795 800

Ala Ala Lys Ala Cys Gln Ser Ala Val Ser Glu Ser Lys Ser Cys Gly

805 810 815

Asn Asn Gln Cys Pro Asp Ser Val Glu Asn Ser Gly Phe His Ser His

820 825 830

Pro Arg Pro Glu Cys Cys Ser Ser Lys Met Ala Ala Lys Ala Cys Gln

835 840 845

Ser Ala Val Ser Glu Ser Lys Ser Cys Gly Asn Asn Gln Cys Pro Asp

850 855 860

Ser Val Glu Asn Ser Gly Phe His Ser His Pro Arg Pro Gln Cys Cys

865 870 875 880

Ser Ser Lys Met Ala Ala Lys Ala Gly Gln Ser Ala Leu Ser Glu Ser

885 890 895

Lys Ser Cys Gly Asn Asn Asn Cys Ser Asp Ser Ile His Lys Ser Asn

900 905 910

Cys His Ser Leu Thr Asn Ser Leu Val Cys Ser Ser Lys Met Ser Ala

915 920 925

Pro Gln Cys His Ser Ala Thr Ser Ser Asn Lys Ser Cys Gly Ser Thr

930 935 940

Lys Cys Ser Asp Phe Ser Asp Lys Lys Cys Cys Gln Ser Asp Lys Ile

945 950 955 960

Pro Gln Thr Cys Ser Thr Lys Lys Ser Ala Pro Gly Cys Gln Ser Ala

965 970 975

Val Ser Gly Ser Lys Ser Cys Gly Asn Ser Lys Cys Ser Asp Ser Lys

980 985 990

Asp Asn Ser Ser His Pro Ser His Pro Asp His Gln Thr Cys Met Ser

995 1000 1005

Lys Leu Cys Ala Pro Gln Ser Gln Ser Ala Thr Ser Ser Ser Arg

1010 1015 1020

Thr Cys Gly Asn Thr Lys Cys Ser Asp Thr Asn Ser Lys Asn Ser

1025 1030 1035

Cys Tyr Ser Gln Thr Asn Ser Glu Ser Cys Ser Ser Lys Met Ser

1040 1045 1050

Gly Pro Ser Cys Lys Thr Ala Asn Ser Gly Ser Arg Ser Cys Arg

1055 1060 1065

Asn Lys Lys Cys Gln Asp Ser Ala Thr Glu Asn Ser Phe His Ser

1070 1075 1080

Pro Leu Thr Asn Pro Leu Ser Gly Glu Lys Leu Ser Glu Gln Lys

1085 1090 1095

Ser Leu Asp Leu Val Arg Lys Asp Lys Glu Ser Ser His Asp Leu

1100 1105 1110

Arg His Gly Cys Ser Asp Glu Glu His Asp His Thr Asn Leu Asp

1115 1120 1125

Lys Ala Tyr Asp Ser Cys Ala Leu Gln Glu Cys Cys Tyr Ser Val

1130 1135 1140

Gln Gly Asn Lys Thr Asp Val Ser Glu Thr Gly Ile Gln Glu Thr

1145 1150 1155

Ala His Cys Asp Ser Thr Asn Gln Thr Cys Gln Thr Ala Ser Ser

1160 1165 1170

Gly Ser Met Thr Cys Gly Asn Asp Lys Ile Leu Asp Ser Leu Ser

1175 1180 1185

Ile His Gly Cys His Ser His Asp Asn Pro Leu His Glu Glu Asn

1190 1195 1200

Asn Leu Glu Gln Lys Ile Leu Asp Val Val Gly Glu Gly Ile Lys

1205 1210 1215

Ser Pro His Ala Val Gly His Gly Cys Ser Asp Lys Glu His Asp

1220 1225 1230

His Ser His Pro Glu Lys Ala Tyr Asp Ser Cys Ala Thr Asp Asp

1235 1240 1245

Cys Cys Phe Ser Val Gln Val His Gly Ile Asp Asp Val Ser Lys

1250 1255 1260

Ser Glu Ile Gln Glu Thr Ala His Cys Asp Ser Thr Lys Gln Ser

1265 1270 1275

Met Val Ile Ser Ser Ser Cys Lys His Glu Pro Lys Asp Gln Val

1280 1285 1290

Asn His Cys Gly Leu His Ser Lys Thr Thr Pro Thr Asp Glu Glu

1295 1300 1305

Leu Ala Lys Leu Val Arg Arg Cys Cys Lys Tyr Lys Pro Cys His

1310 1315 1320

Asp Val Arg Ser Gly Cys Arg Lys His Ala Ala Glu Cys Gly Pro

1325 1330 1335

Thr Val Arg Ser Thr Ile Asn Ile Leu Arg Asp Asn His His His

1340 1345 1350

Tyr Leu Asp Cys Ser Gly Arg Lys Val Cys Ser Leu Leu Glu Lys

1355 1360 1365

Arg His Ile Gly Gly Cys Cys Asp Ser Phe Arg Lys Glu Cys Cys

1370 1375 1380

Ala Lys Lys Lys His Leu Gly Ala Ser Phe Gly Gly Gly Leu Ser

1385 1390 1395

Glu Ile Val Ile Glu

1400

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> NtHMA2F

<400> 3

tcttctcctc ctccttagag aag 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> NtHMA2R

<400> 4

ctactctatg acaatttctg ata 23

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> HMAGSPF1

<400> 5

agaaactgct cattgtgaca gcaca 25

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> HMAGSPR2

<400> 6

caactgcaac agctgcaagt gcta 24

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> Forward primer

<400> 7

gggtggatcc tcttctcctc ctccttagag aag 33

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> Reverse primer

<400> 8

taatgagctc ctactctatg acaatttctg ata 33

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> HMARNAiF

<400> 9

cattctagag agctcggatc cgaatcaagc aagattagaa gca 43

<210> 10

<211> 41

<212> DNA

<213> HMARNAiR

<400> 10

tcaactagtg atatcctcga gagtgatgac atagcagcag t 41

Claims (9)

1.一种烟草镉转运基因NtHMA2，其特征在于所述的烟草镉转运基因NtHMA2核苷酸序列如SEQ ID：No.1所示。

2.根据权利要求1所述的烟草镉转运基因NtHMA2，其特征在于所述基因编码的氨基酸序列如SEQ ID：No.2所示。

3.一种权利要求1所述的烟草镉转运基因NtHMA2的克隆方法，其特征在于包括以下步骤：

A、确定NtHMA2基因序列；

B、提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；

C、根据NtHMA2基因序列设计合成特异性引物，以cDNA作为模板，进行PCR扩增；

D、回收和纯化PCR产物；

E、纯化产物与载体连接，转化感受态细胞；

F、筛选阳性克隆，对阳性克隆PCR扩增、测序。

4.根据权利要求3所述的烟草镉转运基因NtHMA2的克隆方法，其特征在于所述的步骤A包括如下步骤：

（1）利用同源基因拟南芥At HMA2序列搜索NCBI烟草EST数据库，得到烟草NtHMA2的EST序列；利用此序列比对烟草基因组数据库，获得一个基因序列（Nsyl0129220），根据此序列设计RACE引物，RACE利用试剂盒Clontech Smart RACE cDNA Amplification Kit进行，反应参考试剂盒说明书，3′端扩增到500~700bp的片段，5′端扩增到400~600bp的片段；

（2）目标片段回收后进行测序，并与核心序列拼接获得NtHMA2全长cDNA序列，设计基因特异引物进行PCR反应，得到目的产物；

（3）对目的产物测序，得到NtHMA2基因序列。

5.根据权利要求4所述的烟草镉转运基因NtHMA2的克隆方法，其特征在于步骤（1）所述的特异性引物为：

3′RACE基因特异引物：5′-AGAAACTGCTCATTGTGACAGCACA-3′；

5′RACE基因特异引物：5′-CAACTGCAACAGCTGCAAGTGCTA-3′。

6.根据权利要求3所述的烟草镉转运基因NtHMA2的克隆方法，其特征在于步骤C所述的特异性引物为：

正向引物NtHMA2F：5′-TCTTCTCCTCCTCCTTAGAGAAG-3′；

反向引物NtHMA2R：5′-CTACTCTATGACAATTTCTGATA-3′。

7.一种权利要求1所述的烟草镉转运基因NtHMA2的应用，其特征在于用于降低镉从烟草根部转运到烟叶的转运率。

8.根据权利要求7所述的烟草镉转运基因NtHMA2的应用，其特征在于所述的降低镉从烟草根部转运到烟叶的转运率的方法包括如下步骤：

A、构建RNAi载体；

B、农杆菌转化；

C、RNAi载体导入烟草；

D、培养转基因植株。

9.根据权利要求8所述的烟草镉转运基因NtHMA2的应用，其特征在于步骤A中所述的RNAi载体为pBI121-pQLi-NtHMA2。