CN107828795A - 一种提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1‑2及其克隆方法与应用 - Google Patents

一种提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1‑2及其克隆方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1‑2及其克隆方法与应用，提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1‑2核苷酸序列如SEQ ID：No.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID：No.2所示。本发明还公开了提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1‑2的克隆方法，具体步骤包括：A、确定NtIPT1基因序列；B、提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；C、根据NtIPT1基因序列设计合成特异性引物，以cDNA作为模板，进行PCR扩增；D、回收和纯化PCR产物；构建了含NtNHX1‑2基因的过表达载体。将过表达载体通过农杆菌介导的转化在烟草中过表达，制备转基因植株。获得的转基因植株钾含量比对照提高20%以上。说明烟草NtNHX1‑2基因在培育高钾含量的烟草方面具有重大的应用前景。

Description

一种提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2及其克隆方法与 应用
技术领域
本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2及其克隆方法与应用。
背景技术
植物主要通过位于细胞膜或液泡膜上的Na+/H+反向转运蛋白来维持细胞质内Na+和K+的浓度。拟南芥AtNHX1基因的克隆及功能验证表明，NHX1在植物中发挥Na+/H+反向转运功能（Apse et al.,1999，Science,285:1256-1258）。由于NHX蛋白在平衡细胞内Na+浓度的作用，目前对其生物学功能的研究主要集中在植物耐盐胁迫方面，过表达AtNHX1基因后，可以显著提高拟南芥（Apse et al., 1999，Science,285:1256-1258））、油菜（Zhang et al.,2001， Proc. Natl. Acad. Sci. USA,98:12832-12836）和番茄（Zhang and Blumwald.,2001，Nat. Biotechnol. 19:765-768）的耐盐性。在过表达AtNHX1的转基因番茄中，AtNHX1也表现了K+/H+转运体功能（Zhang and Blumwald., 2001，Nat. Biotechnol. 19:765-768）。AtNHX1和AtNHX2基因双突变株系不能将K+泵入液泡，同时使胞液K+浓度升高（Barragán et al., 2012，Plant Cell, 24(3):1127-42）。表明AtNHX1和AtNHX2两个转运体在K+从胞液泵入液泡中起着关键作用。
钾被认为是烟草的品质元素，钾含量是评价烟叶品质优劣的重要指标之一。烟叶钾含量提高可以改善烟叶的组织结构，使烟叶结构细腻，而且还能提高烟叶外观色泽，使烟叶呈深橘黄色，香气足，吃味好，富有弹性和韧性，填充性增强。另外钾还可以增强烟叶糖类、色素类、芳香类物质的合成积累。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2；第二目的在于提供所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2的克隆方法；第三目的在于提供所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：
A、确定NtNHX1-2基因序列；
根据水稻NHX1基因的蛋白序列搜索NCBI数据库得到烟草中同源基因NtNHX1-2序列，利用此序列设计基因克隆引物：
正向引物：NtNHX1-2F：GGATCCATGGCGTCTGAGCTGGCTTCT；
反向引物：NtNHX1-2R：CTCGAGTCATGGTTCCTGTTCCGTTGG；
B、提取烟草叶组织RNA，反转录得到第一链cDNA；
C、以反转录得到的第一链cDNA作为模板，用引物NtNHX1-2F/ NtNHX1-2R进行PCR扩增，回收和纯化PCR产物；
D、纯化产物与载体连接，连接体系与过程如下：4μL纯化产物、1μL salt solution、1μLPCR®-BluntⅡ-TOPO（Invitrogen）混匀，25℃，水浴30min；将连接好的载体通过热激转化大肠杆菌DH5a，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/L 卡那霉素的LB平板上过夜培养，挑取菌落进行菌液培养，质粒提取和PCR检测。筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序。
本发明的第三目的是这样实现的，所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2用于获得叶片高钾含量的转基因植株中的应用。
本发明通过植物基因工程技术，利用同源克隆法及PCR技术，分离鉴定烟草钾转运体基因NtNHX1-2序列信息，并通过农杆菌侵染法将该基因在烟草云烟87中过表达，经过qPCR检测筛选NtNHX1-2过表达的转基因T1代植株进行种植，对收获的烟叶进行钾含量检测，获得钾含量提高的烟草植株。获得的转基因植株钾含量比对照提高20%以上。说明烟草NtNHX1-2基因在培育高钾含量的烟草方面具有重大的应用前景。
附图说明
图1为NtNHX1-2基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图，NtNHX1-2大小为1611bp；
图2 为NtNHX1-2连接载体TOPO后，利用BamHI和XhoI进行酶切鉴定，切出1611bp和3500bp左右两条片段；
图3为NtNHX1-2连接入门克隆载体pENTR™2B后，利用BamHI和XhoI进行酶切鉴定，切出1611bp和3800bp两条片段；
图4为植物表达载体pK2GW7-NtNHX1-2的酶切鉴定，利用BamHI和XhoI进行酶切鉴定，切出1611bp和11kb左右两条片段；
图5为过表达NtNHX1-2基因转基因T1代株系qPCR分析，PN1-5，PN1-15，PN1-18为转基因株系，VC为转空载体对照；
图6为转基因烟草株系T1代烟叶钾含量，PN1-5，PN1-15，PN1-18为转基因株系，VC为转空载体对照。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2的核苷酸序列如序列表SEQID NO：1所示。
所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2的克隆方法，包括以下步骤：
A、确定NtNHX1-2基因序列；
根据水稻NHX1基因的蛋白序列搜索NCBI数据库得到烟草中同源基因NtNHX1-2序列，利用此序列设计基因克隆引物：
正向引物：NtNHX1-2F：GGATCCATGGCGTCTGAGCTGGCTTCT；
反向引物：NtNHX1-2R：CTCGAGTCATGGTTCCTGTTCCGTTGG；
B、提取烟草叶组织RNA，反转录得到第一链cDNA；
C、以反转录得到的第一链cDNA作为模板，用引物NtNHX1-2F/ NtNHX1-2R进行PCR扩增，回收和纯化PCR产物；
D、纯化产物与载体连接，连接体系与过程如下：4μL纯化产物、1μL salt solution、1μLPCR®-BluntⅡ-TOPO（Invitrogen）混匀，25℃，水浴30min；将连接好的载体通过热激转化大肠杆菌DH5a，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/L 卡那霉素的LB平板上过夜培养，挑取菌落进行菌液培养，质粒提取和PCR检测。筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序。
C步骤中PCR扩增的反应体系是选用Phusion高保真扩增酶反应体系，体系总体积50μL，包括：200ng cDNA，5×Phusion HF反应缓冲液10μL，10mM dNTP 1μL，2U的Phusion®High-Fidelity DNA Polymerase，10μM的正反向引物各1μL，补水至50μL。
C步骤中PCR扩增的反应条件是在Mastercycler® pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒，58℃，30秒，72℃，30秒，35个循环；72℃延伸7分钟；
本发明所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2的过表达载体为pK2GW7-NtNHX1-2。
本发明所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2的应用为所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2用于获得叶片高钾含量的转基因植株中的应用。
用于获得叶片高钾含量的转基因植株的方法包括以下步骤：
A、过表达载体构建：
一、克隆的NtNHX1-2连接TOPO载体
（1）以云烟87叶片的cDNA为模板，利用NtNHX1-2基因特异引物进行扩增，得到大小约为1.6kb的基因片段，纯化回收；
（2）将回收的NtNHX1-2基因片段进行TOPO克隆，连接到PCR®-BluntⅡ-TOPO（3.5kb）载体后转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，提取质粒进行PCR检测，挑选扩增产物大小约为1.6kb的质粒提取DNA，构建的载体命名为pTOPO-NtNHX1-2；
（3）由于基因正反游引物分别带有BamH I、Xho I的识别位点，因此选择这两个酶对质粒DNA样品进行双酶切检测，酶切结果产生两条片段，大小分别为3.5kb和1.6kb左右，说明目的片段已插入TOPO载体；
二、植物过表达载体的构建
a、入门克隆pENTR™2B-NtNHX1-2的构建
（1）BamH I/Xho I酶切pTOPO- NtNHX1-2和pENTR™2B得到目的基因片段NtNHX1-2和载体pENTR™2B线性化片段，胶回收后进行连接、转化感受态细胞DH5a；
（2）挑取转化DH5a后的克隆，提取质粒DNA，BamH I/Xho I酶切，酶切结果为3.8kb的载体片段和1.6kb左右的片段为正确的克隆，正确的克隆命名为pENTR™2B-NtNHX1-2；
b、通过LR反应得到植物表达载体
入门克隆pENTR™NtNHX1-2和表达载体pK2GW7 LR反应后转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，得到植物表达载体pK2GW7-NtNHX1-2。利用BamH I/Xho I酶切鉴定pK2- NtNHX1-2，正确的克隆可以切出两条片段大约1.6kb和11kb。
上述LR反应体系：构建成功的入门载体pENTR™NtNHX1-2 (50-150ng )1-7μL，0.5μL Destination Vector， TE Buffer至总体积8μL；混匀，冰浴2min，轻弹2次；加入2μL LRCloneaseTMⅡ enzyme Mix，轻弹，混匀，离心，25℃水浴1h；然后加入1μL Proteinase K 轻弹，混匀，37℃水浴10min；
B、烟草的遗传转化：
（1）表达载体转化农杆菌
从-80℃冰箱中取出农杆菌感受态细胞，放置冰上溶解后加入重组表达载体pK2GW7-NtNHX1-2 4μL；液氮速冻1分钟，转入37℃水浴5分钟，再冰浴2分钟，向混合物中加入1mL LB液体培养基，28℃、220rpm培养3~4小时；培养物涂布于含有壮观霉素100mg/L和利福平25mg/L的LB固体培养基上，28℃倒置培养2~3天，可见含有目的载体的农杆菌克隆；
（2）烟草转化
a、挑取含有目标载体的农杆菌克隆，在含有壮观霉素和利福平的LB平板上划线，28℃培养2~3天；刮取划线菌斑接菌于含有壮观霉素和利福平的MS培养基中，28℃，220rpm振荡培养，菌液浓度达到OD=0.5~0.8时6,000rpm离心5分钟富集菌体，弃上清，再用20mL液体MS培养基重悬菌体，得到含目标载体的农杆菌悬浮菌液；
b、将烟草叶片置于500mL广口瓶中，加入适量75%乙醇，漂洗1min；弃乙醇，加入0.1%的HgCl2溶液，置摇床上室温振荡15~30分钟；弃HgCl2溶液，用无菌水冲洗6遍；
c、将烟草叶片取出，用无菌吸水纸吸去表面液体，使用剪刀将无菌叶片切成约1cm×1cm的小片，将切成小片的烟草叶片放入含目标载体的无菌MS液体培养基悬浮菌液中，静置15~20min；取出烟草叶片，使用无菌滤纸吸去多余菌液，于含有6-BA （0.02mg/L）、NAA（2mg/L）的MS培养基中25℃暗培养两天；随后，把烟草叶片转入分化培养基中，切口接触培养基，于温室条件下分化培养；分化培养基为含有6-BA （0.5mg/L）、NAA （0.1mg/L）、卡那霉素（100mg/L）、头孢霉素（500mg/L）的MS培养基，每2~3周继代培养1次，切口处逐渐长出愈伤组织，最终分化出芽；
d、将长至3~5cm的芽切下，转入MS培养基诱导生根，取出生根后的转基因植株用自来水洗净培养基，移植于灭菌的营养土中；
e、转基因植株经NPTII基因特异引物（NPTII-F:TCGGCTATGACTGGGCACAACAGA ，NPTII-R:AAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCG) PCR验证扩增，鉴定转基因阳性植株。
所述的0.1%的HgCl2溶液配制方法为称取升汞0.1克，用少许酒精溶解，再加水定容至100毫升。
下面以具体实施例对本发明做进一步说明：
实施例1
NtNHX1-2基因的分离克隆，包括以下几个步骤：
1、确定NtNHX1-2基因序列；
根据水稻NHX1基因的蛋白序列（GenBank 登录号 Q68KI4.2），搜索NCBI数据库得到烟草中同源基因NtNHX1-2序列。利用此序列设计基因克隆引物：
正向引物：NtNHX1-2F：GGATCCATGGCGTCTGAGCTGGCTTCT
反向引物：NtNHX1-2R：CTCGAGTCATGGTTCCTGTTCCGTTGG
为了构建过表达载体，在上述引物中引物酶切位点（下划线所示）BamH I和Xho I
2、利用RNAiso Plus（Takara）提取烟草叶组织RNA，利用PrimeScript RT reagent Kitwith gDNA Eraser(Perfect Real Time)（Takara）反转录得到第一链cDNA；
3、以反转录得到的第一链cDNA作为模板，用引物NtNHX1-2F/ NtNHX1-2R对进行PCR扩增，选用Phusion高保真扩增酶反应体系，体系总体积50μL，包括：200ng cDNA，5×PhusionHF反应缓冲液10μL，10mM dNTP 1μL，2U的Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase，10μM的正反向引物各1μL，补水至50μL。 PCR反应在Mastercycler® pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒，58℃，30秒，72℃，30秒，35个循环；72℃延伸7分钟；回收和纯化PCR产物；
4、纯化产物与载体连接：连接体系与过程如下： 4μL纯化产物、1μL salt solution、1μL PCR®-BluntⅡ-TOPO（Invitrogen）混匀，25℃，水浴30min；将连接好的载体通过热激转化大肠杆菌DH5a，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/L 卡那霉素的LB平板上过夜培养，挑取菌落进行菌液培养，质粒提取和PCR检测。筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序。
步骤4中所述的培养基配方及制备方法是称取胰蛋白胨8~12g，酵母提取物5g，NaCl 10g溶解于1L蒸馏水中，121℃灭菌25min得到。
实施例2
过表达载体构建
1、克隆的NtNHX1-2连接TOPO载体
（1）以云烟87叶片的cDNA为模板，利用NtNHX1-2基因特异引物进行扩增，得到大小约为1.6kb的基因片段，纯化回收；
（2）将回收的NtNHX1-2基因片段进行TOPO克隆，连接到PCR®-BluntⅡ-TOPO（3.5kb）载体后转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，提取质粒进行PCR检测，挑选扩增产物大小约为1.6kb的质粒提取DNA，构建的载体命名为pTOPO-NtNHX1-2；
（3）由于基因正反游引物分别带有BamH I、Xho I的识别位点，因此选择这两个酶对质粒DNA样品进行双酶切检测，酶切结果产生两条片段，大小分别为3.5kb和1.6kb左右，说明目的片段已插入TOPO载体；
2、植物过表达载体的构建
a、入门克隆pENTR™2B-NtNHX1-2的构建
（1）BamH I/Xho I酶切pTOPO- NtNHX1-2和pENTR™2B得到目的基因片段NtNHX1-2和载体pENTR™2B线性化片段，胶回收后进行连接、转化感受态细胞DH5a；
（2）挑取转化DH5a后的克隆，提取质粒DNA，BamH I/Xho I酶切，酶切结果为3.8kb的载体片段和1.6kb左右的片段为正确的克隆，正确的克隆命名为pENTR™2B-NtNHX1-2；
b、通过LR反应得到植物表达载体
（1）入门克隆pENTR™NtNHX1-2和表达载体pK2GW7 LR反应后转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，得到植物表达载体pK2GW7-NtNHX1-2。利用BamH I/Xho I酶切鉴定pK2- NtNHX1-2，正确的克隆可以切出两条片段大约1.6kb和11kb。
上述LR反应体系：构建成功的入门载体pENTR™NtNHX1-2 (50-150ng )1-7μL，0.5μL Destination Vector， TE Buffer至总体积8μL；混匀，冰浴2min，轻弹2次；加入2μL LRCloneaseTMⅡ enzyme Mix，轻弹，混匀，离心，25℃水浴1h；然后加入1μL Proteinase K 轻弹，混匀，37℃水浴10min。
实施例3
烟草的遗传转化
（1）表达载体转化农杆菌
从-80℃冰箱中取出农杆菌感受态细胞，放置冰上溶解后加入重组表达载体pK2GW7-NtNHX1-2 4μL；液氮速冻1分钟，转入37℃水浴5分钟，再冰浴2分钟，向混合物中加入1mL LB液体培养基，28℃、220rpm培养3~4小时；培养物涂布于含有壮观霉素100mg/L和利福平25mg/L的LB固体培养基上，28℃倒置培养2~3天，可见含有目的载体的农杆菌克隆；
（2）烟草转化
a、挑取含有目标载体的农杆菌克隆，在含有壮观霉素和利福平的LB平板上划线，28℃培养2~3天；刮取划线菌斑接菌于含有壮观霉素和利福平的MS培养基中，28℃，220rpm振荡培养，菌液浓度达到OD=0.5~0.8时6,000rpm离心5分钟富集菌体，弃上清，再用20mL液体MS培养基重悬菌体，得到含目标载体的农杆菌悬浮菌液；
b、将烟草叶片置于500mL广口瓶中，加入适量75%乙醇，漂洗1min；弃乙醇，加入0.1%的HgCl2溶液，置摇床上室温振荡15~30分钟；弃HgCl2溶液，用无菌水冲洗6遍；
c、将烟草叶片取出，用无菌吸水纸吸去表面液体，使用剪刀将无菌叶片切成约1cm×1cm的小片，将切成小片的烟草叶片放入含目标载体的无菌MS液体培养基悬浮菌液中，静置15~20min；取出烟草叶片，使用无菌滤纸吸去多余菌液，于含有6-BA （0.02mg/L）、NAA（2mg/L）的MS培养基中25℃暗培养两天；随后，把烟草叶片转入分化培养基中，切口接触培养基，于温室条件下分化培养；分化培养基为含有6-BA （0.5mg/L）、NAA （0.1mg/L）、卡那霉素（100mg/L）、头孢霉素（500mg/L）的MS培养基，每2~3周继代培养1次，切口处逐渐长出愈伤组织，最终分化出芽；
d、将长至3~5cm的芽切下，转入MS培养基诱导生根，取出生根后的转基因植株用自来水洗净培养基，移植于灭菌的营养土中；
e、转基因植株经NPTII基因特异引物（NPTII-F:TCGGCTATGACTGGGCACAACAGA ，NPTII-R:AAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCG) PCR验证扩增，鉴定转基因阳性植株。
实施例4
转基因植株分析
温室盆栽种植PN1-5，PN1-15和PN1-18及空载体对照VC。每株按5g纯氮使用烟草专用复合肥（氮﹕磷﹕钾=10﹕10﹕15），分5次施入。 现蕾期取中部叶（9-12位叶），杀青后检测钾含量，结果见下表，转基因株系PN1-5钾含量比对照提高43.94%，PN1-15比对照提高23.64%，PN1-18比对照提高88.48%。
单位：%
注：“*”表示该株系钾含量与VC在0.05水平上差异显著，“**”表示该株系钾含量与VC在0.01水平上差异极显著。
SEQUENCE LISTING
<110> 云南省烟草农业科学研究院
<120> 一种提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2及其克隆方法与应用
<130> 2017
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1611
<212> DNA
<213> NtNHX1-2的核苷酸序列
<400> 1
atggcgtctg agctggcttc tatgtttcca aaactgggct ctttgggtac ttcagatcat 60
ggttctgttg tatccatcaa cctctttgtg gcactccttt gcgcttgcat tgtcattggt 120
catctgctgg aggagaaccg ctggataaat gagtccatta ccgccctcat aattggcttg 180
ggtgtaggag ttgttatctt gctcataagt gggggaaaga gctcacacgt tctggtcttc 240
agtgaagatc tctttttcat atatctactt cctccaatca tatttaatgc agggtttcag 300
gtaaaaaaga agcaattttt cgtaaacttc attactataa tgctgttcgg agccattggt 360
acactgatct catgtgccat tatatcatta ggtgccatta aattcttcaa gaagttggac 420
attggatttc tagatattgg ggattatctc gcaattggag caatatttgc tgccacagac 480
tccgtctgca cgttgcaggt cctacatcag gatgagacac ccctccttta cagtcttgta 540
tttggagaag gagttgttaa tgatgctaca tcggtggtgc ttttcaatgc tattcaaaac 600
tttgaccttt cgagcgtgaa tcccactatt gcccttcgtt tcattggcaa cttcttatat 660
ctgttccttg ctagcacttt actgggagca gcaactggtc ttcttagtgc ttacattgtc 720
aagaagctgt attttggcag gcattccaca gatcgcgagg ttgcacttat gatgctcatg 780
gcttacttat catacatgtt ggctgaacta ttctatttca gtgggattct cactgtattt 840
ttctgtggta ttgtaatgtc ccattacact tggcacaatg tgactgagag ttcaagagtc 900
actacaaggc acacttttgc aactttgtca tttcttgctg agactttcct cttcctctat 960
gtcggtatgg atgccttgga tatcgagaag tggaaatttg ttagtgatag tcctggatta 1020
tccgttgcag taagttcgat actgatggga ctaatcttgc tagggagagc tgcctttgtt 1080
tttccattat cattcttatc caacttgatg aagaaatcct cagaggaaaa aattaccttt 1140
aggcagcaag tgataatatg gtgggcaggt ttgatgagag gtgcagtgtc catggcactg 1200
gcatataata agttcactcg tttgggacac actcaattgc aagacaacgc aataatgatc 1260
accagcacca ttaccattgt tcttttcagc acagtggtat ttggtttaat gacaaaacct 1320
cttataagtc tcctgctgcc accgcagagg cagttaagta cagtgtcatc agatgcaaat 1380
actccaaaat ctcttacagc accacttcta ggcagtcaag agggttctga agtcgattta 1440
aatagtcaag atcttcctca cccacccagt ttgaggatgc tactttctgc gccaactcat 1500
aaggtgcata ggtactggcg caagtttgat gattcattca tgcgcccggt gtttggtggt 1560
cgggggttta ctcctgttgc tcctggttct ccaacggaac aggaaccatg a 1611
<210> 2
<211> 536
<212> PRT
<213> NtNHX1-2编码的氨基酸序列
<400> 2
Met Ala Ser Glu Leu Ala Ser Met Phe Pro Lys Leu Gly Ser Leu Gly
1 5 10 15
Thr Ser Asp His Gly Ser Val Val Ser Ile Asn Leu Phe Val Ala Leu
20 25 30
Leu Cys Ala Cys Ile Val Ile Gly His Leu Leu Glu Glu Asn Arg Trp
35 40 45
Ile Asn Glu Ser Ile Thr Ala Leu Ile Ile Gly Leu Gly Val Gly Val
50 55 60
Val Ile Leu Leu Ile Ser Gly Gly Lys Ser Ser His Val Leu Val Phe
65 70 75 80
Ser Glu Asp Leu Phe Phe Ile Tyr Leu Leu Pro Pro Ile Ile Phe Asn
85 90 95
Ala Gly Phe Gln Val Lys Lys Lys Gln Phe Phe Val Asn Phe Ile Thr
100 105 110
Ile Met Leu Phe Gly Ala Ile Gly Thr Leu Ile Ser Cys Ala Ile Ile
115 120 125
Ser Leu Gly Ala Ile Lys Phe Phe Lys Lys Leu Asp Ile Gly Phe Leu
130 135 140
Asp Ile Gly Asp Tyr Leu Ala Ile Gly Ala Ile Phe Ala Ala Thr Asp
145 150 155 160
Ser Val Cys Thr Leu Gln Val Leu His Gln Asp Glu Thr Pro Leu Leu
165 170 175
Tyr Ser Leu Val Phe Gly Glu Gly Val Val Asn Asp Ala Thr Ser Val
180 185 190
Val Leu Phe Asn Ala Ile Gln Asn Phe Asp Leu Ser Ser Val Asn Pro
195 200 205
Thr Ile Ala Leu Arg Phe Ile Gly Asn Phe Leu Tyr Leu Phe Leu Ala
210 215 220
Ser Thr Leu Leu Gly Ala Ala Thr Gly Leu Leu Ser Ala Tyr Ile Val
225 230 235 240
Lys Lys Leu Tyr Phe Gly Arg His Ser Thr Asp Arg Glu Val Ala Leu
245 250 255
Met Met Leu Met Ala Tyr Leu Ser Tyr Met Leu Ala Glu Leu Phe Tyr
260 265 270
Phe Ser Gly Ile Leu Thr Val Phe Phe Cys Gly Ile Val Met Ser His
275 280 285
Tyr Thr Trp His Asn Val Thr Glu Ser Ser Arg Val Thr Thr Arg His
290 295 300
Thr Phe Ala Thr Leu Ser Phe Leu Ala Glu Thr Phe Leu Phe Leu Tyr
305 310 315 320
Val Gly Met Asp Ala Leu Asp Ile Glu Lys Trp Lys Phe Val Ser Asp
325 330 335
Ser Pro Gly Leu Ser Val Ala Val Ser Ser Ile Leu Met Gly Leu Ile
340 345 350
Leu Leu Gly Arg Ala Ala Phe Val Phe Pro Leu Ser Phe Leu Ser Asn
355 360 365
Leu Met Lys Lys Ser Ser Glu Glu Lys Ile Thr Phe Arg Gln Gln Val
370 375 380
Ile Ile Trp Trp Ala Gly Leu Met Arg Gly Ala Val Ser Met Ala Leu
385 390 395 400
Ala Tyr Asn Lys Phe Thr Arg Leu Gly His Thr Gln Leu Gln Asp Asn
405 410 415
Ala Ile Met Ile Thr Ser Thr Ile Thr Ile Val Leu Phe Ser Thr Val
420 425 430
Val Phe Gly Leu Met Thr Lys Pro Leu Ile Ser Leu Leu Leu Pro Pro
435 440 445
Gln Arg Gln Leu Ser Thr Val Ser Ser Asp Ala Asn Thr Pro Lys Ser
450 455 460
Leu Thr Ala Pro Leu Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ser Glu Val Asp Leu
465 470 475 480
Asn Ser Gln Asp Leu Pro His Pro Pro Ser Leu Arg Met Leu Leu Ser
485 490 495
Ala Pro Thr His Lys Val His Arg Tyr Trp Arg Lys Phe Asp Asp Ser
500 505 510
Phe Met Arg Pro Val Phe Gly Gly Arg Gly Phe Thr Pro Val Ala Pro
515 520 525
Gly Ser Pro Thr Glu Gln Glu Pro
530 535
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> NtNHX1-2F
<400> 3
ggatccatgg cgtctgagct ggcttct 27
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> NtNHX1-2R
<400> 4
ctcgagtcat ggttcctgtt ccgttgg 27
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> NPTII-F
<400> 5
tcggctatga ctgggcacaa caga 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> NPTII-R
<400> 6
aagaaggcga tagaaggcga tgcg 24

Claims (9)

1.一种提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2，其特征在于所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2，其特征在于所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.一种权利要求1所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2的克隆方法，其特征在于包括以下步骤：
A、确定NtNHX1-2基因序列；
根据水稻NHX1基因的蛋白序列搜索NCBI数据库得到烟草中同源基因NtNHX1-2序列，利用此序列设计基因克隆引物：
正向引物：NtNHX1-2F：GGATCCATGGCGTCTGAGCTGGCTTCT；
反向引物：NtNHX1-2R：CTCGAGTCATGGTTCCTGTTCCGTTGG；
B、提取烟草叶组织RNA，反转录得到第一链cDNA；
C、以反转录得到的第一链cDNA作为模板，用引物NtNHX1-2F/ NtNHX1-2R进行PCR扩增，回收和纯化PCR产物；
D、纯化产物与载体连接，连接体系与过程如下：4μL纯化产物、1μL salt solution、1μLPCR®-BluntⅡ-TOPO（Invitrogen）混匀，25℃，水浴30min；将连接好的载体通过热激转化大肠杆菌DH5a，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/L 卡那霉素的LB平板上过夜培养，挑取菌落进行菌液培养，质粒提取和PCR检测，筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序。
4.根据权利要求3所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2的克隆方法，其特征在于C步骤中PCR扩增的反应体系是选用Phusion高保真扩增酶反应体系，体系总体积50μL，包括：200ng cDNA，5×Phusion HF反应缓冲液10μL，10mM dNTP 1μL，2U的Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase，10μM的正反向引物各1μL，补水至50μL。
5.根据权利要求3所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2的克隆方法，其特征在于C步骤中PCR扩增的反应条件是在Mastercycler® pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒，58℃，30秒，72℃，30秒，35个循环；72℃延伸7分钟。
6.一种权利要求1或2所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2的过表达载体，其特征在于所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2的过表达载体为pK2GW7-NtNHX1-2。
7.一种权利要求1或2所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2的应用，其特征在于所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2用于获得叶片高钾含量的转基因植株中的应用。
8.根据权利要求7所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2的应用，其特征在于用于获得叶片高钾含量的转基因植株的方法包括以下步骤：
A、过表达载体构建：
一、克隆的NtNHX1-2连接TOPO载体
（1）以云烟87叶片的cDNA为模板，利用NtNHX1-2基因特异引物进行扩增，得到大小约为1.6kb的基因片段，纯化回收；
（2）将回收的NtNHX1-2基因片段进行TOPO克隆，连接到PCR®-BluntⅡ-TOPO（3.5kb）载体后转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，提取质粒进行PCR检测，挑选扩增产物大小约为1.6kb的质粒提取DNA，构建的载体命名为pTOPO-NtNHX1-2；
（3）由于基因正反游引物分别带有BamH I、Xho I的识别位点，因此选择这两个酶对质粒DNA样品进行双酶切检测，酶切结果产生两条片段，大小分别为3.5kb和1.6kb左右，说明目的片段已插入TOPO载体；
二、植物过表达载体的构建
a、入门克隆pENTR™2B-NtNHX1-2的构建
（1）BamH I/Xho I酶切pTOPO- NtNHX1-2和pENTR™2B得到目的基因片段NtNHX1-2和载体pENTR™2B线性化片段，胶回收后进行连接、转化感受态细胞DH5a；
（2）挑取转化DH5a后的克隆，提取质粒DNA，BamH I/Xho I酶切，酶切结果为3.8kb的载体片段和1.6kb左右的片段为正确的克隆，正确的克隆命名为pENTR™2B-NtNHX1-2；
b、通过LR反应得到植物表达载体
入门克隆pENTR™NtNHX1-2和表达载体pK2GW7 LR反应后转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，得到植物表达载体pK2GW7-NtNHX1-2；
利用BamH I/Xho I酶切鉴定pK2- NtNHX1-2，正确的克隆可以切出两条片段大约1.6kb和11kb；
上述LR反应体系：构建成功的入门载体pENTR™NtNHX1-2 (50-150ng )1-7μL，0.5μLDestination Vector， TE Buffer至总体积8μL；混匀，冰浴2min，轻弹2次；加入2μL LRCloneaseTMⅡ enzyme Mix，轻弹，混匀，离心，25℃水浴1h；然后加入1μL Proteinase K 轻弹，混匀，37℃水浴10min；
B、烟草的遗传转化：
（1）表达载体转化农杆菌
从-80℃冰箱中取出农杆菌感受态细胞，放置冰上溶解后加入重组表达载体pK2GW7-NtNHX1-2 4μL；液氮速冻1分钟，转入37℃水浴5分钟，再冰浴2分钟，向混合物中加入1mL LB液体培养基，28℃、220rpm培养3~4小时；培养物涂布于含有壮观霉素100mg/L和利福平25mg/L的LB固体培养基上，28℃倒置培养2~3天，可见含有目的载体的农杆菌克隆；
（2）烟草转化
a、挑取含有目标载体的农杆菌克隆，在含有壮观霉素和利福平的LB平板上划线，28℃培养2~3天；刮取划线菌斑接菌于含有壮观霉素和利福平的MS培养基中，28℃，220rpm振荡培养，菌液浓度达到OD=0.5~0.8时6,000rpm离心5分钟富集菌体，弃上清，再用20mL液体MS培养基重悬菌体，得到含目标载体的农杆菌悬浮菌液；
b、将烟草叶片置于500mL广口瓶中，加入适量75%乙醇，漂洗1min；弃乙醇，加入0.1%的HgCl2溶液，置摇床上室温振荡15~30分钟；弃HgCl2溶液，用无菌水冲洗6遍；
c、将烟草叶片取出，用无菌吸水纸吸去表面液体，使用剪刀将无菌叶片切成约1cm×1cm的小片，将切成小片的烟草叶片放入含目标载体的无菌MS液体培养基悬浮菌液中，静置15~20min；取出烟草叶片，使用无菌滤纸吸去多余菌液，于含有6-BA （0.02mg/L）、NAA（2mg/L）的MS培养基中25℃暗培养两天；随后，把烟草叶片转入分化培养基中，切口接触培养基，于温室条件下分化培养；分化培养基为含有6-BA （0.5mg/L）、NAA （0.1mg/L）、卡那霉素（100mg/L）、头孢霉素（500mg/L）的MS培养基，每2~3周继代培养1次，切口处逐渐长出愈伤组织，最终分化出芽；
d、将长至3~5cm的芽切下，转入MS培养基诱导生根，取出生根后的转基因植株用自来水洗净培养基，移植于灭菌的营养土中；
e、转基因植株经NPTII基因特异引物（NPTII-F:TCGGCTATGACTGGGCACAACAGA ，NPTII-R:AAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCG) PCR验证扩增，鉴定转基因阳性植株。
9.根据权利要求8所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2的应用，其特征在于所述的0.1%的HgCl2溶液配制方法为称取升汞0.1克，用少许酒精溶解，再加水定容至100毫升。
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