CN104419709A - 烟草中一个钾转运体基因及其编码蛋白与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物分子生物学与转基因技术领域，具体涉及烟草中一个钾转运体基因及其编码蛋白与应用。该转运体基因的碱基序列如序列表SEQ ID NO:1所示，该转运体蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。该转运体蛋白在钾营养缺陷酵母R5421中表达后，能够恢复该酵母在低钾培养基上生长功能，说明该钾转运体具有高效转运钾离子的功能。

Description

烟草中一个钾转运体基因及其编码蛋白与应用

技术领域

 本发明属于植物分子生物学与转基因技术领域，具体涉及烟草中一个钾转运体基因及其编码蛋白与应用，以及该基因在培育钾高效植物新品种中的应用。

背景技术

在植物所需的三大营养元素中，钾直接参与植物的生长发育，能量代谢和各种生理功能。在农业生产中，耕地中土壤缺钾是一个非常严重问题，因此克隆耐低钾和钾营养高效的基因，并利用转基因技术培育钾高效的植物新品种是解决这一问题的重要途径之一。

  烟草是典型喜钾作物，钾能促进烟草光合作用和呼吸效率，还能提高烟草的根系活力与养分吸收、运输效率和抗逆性等。国外优质烟叶的钾含量一般都高于2.5%，而我国烟叶钾含量一般低于2%，因此，生产优质烟叶必须大量补充钾肥。

到目前为止，已克隆的植物K⁺转运体基因有两大类，一类是K⁺离子通道基因，另一类是高亲和K⁺吸收转运体基因。高亲和K⁺吸收转运体基因也可分为两个家族，其一是KUP/HAK/KT家族，另一个是HKT家族。在拟南芥中发现的AKT1（Sentenac H, et al, 1992）和KAT1（Anderson JA, et al, 1992）是植物中最先发现的K⁺转运体，这两个基因都是利用酵母钾营养缺陷体的功能互补法而克隆得到的。

 发明内容

本发明提供一个烟草钾转运体基因序列，以及该基因编码的蛋白能够互补酵母钾营养缺陷的功能。

为了实现上述目的，本发明的第一个方面提供了钾转运体的碱基序列，它的碱基序列为序列表SEQ  ID  NO:1。

本发明第二方面提供了该基因编码蛋白序列，它的氨基酸序列为序列表SEQ ID  NO:2。 

本发明的第三个方面提供了包含上述多核苷酸序列的表达载体，其中优选的表达载体是P416GPD。

 本发明通过试验研究发现，该转运体蛋白在钾营养缺陷酵母R5421中表达后，能够恢复该酵母在低钾培养基上生长功能。

附图说明

  图1烟草钾转运体克隆的PCR电泳结果。

  图2 烟草钾转运体功能鉴定

左图显示阳性对照、阴性对照和含有钾转运体酵母在正常培养基上生长情况，右图显示阳性对照、阴性对照和含有钾转运体酵母在低钾培养基上生长情况。

具体实施方式

下面结合具体实验方法进一步阐述本发明。

 烟草叶片RNA提取和RT-PCR

先用试剂盒（购置Takara公司，日本）提取烟草品种K326叶片总 RNA，具体过程参见说明书，然后用反转录试剂盒（购自TOYOBO公司，日本）将mRNA反转录为cDNA，具体过程参见说明书。

本发明基因的克隆与序列分析：本发明基因是根据电子克隆的方法，利用Primer Premier 5.0 设计引物，从烟草品种K326中克隆该基因。通过PCR方法获得该基因的编码序列，所使用的正向引物序列为（5′ATGGGAATAGATGAAGGA3），反向引物序列为（5′TTATACATAGAAAATTTGTCC3′）。PCR反应体系包括 10×PCR buffer  2.5 μl，两个引物（10 mM）各0.5 μl，dNTPMixture (2.5 mM each) 2.0 μl，cDNA 1.0μl， TaKaRa Ex Taq 0.5 μl，ddH₂O 16 μl。PCR反应程序为 94℃变性 5 min，94℃30 s，58℃30 s，72℃ 3 min，共计30 cycles，72℃延伸10 min，4℃保温，然后通过1%琼脂糖凝胶电泳的方法检测该基因的长度。

  钾转运体克隆载体构建：PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测为单一条带后，用凝胶回收试剂盒（天根公司，中国）回收目标条带，具体过程参见说明书。然后克隆至pMD19-T 载体（购置Takara公司，日本），取5μL连接产物采用热击法转化大肠杆菌DH5ɑ感受态，涂布于含有氨苄青霉素的LB固体平板上，37℃培养过夜，采用PCR方法检测阳性克隆，然后选取3个阳性克隆送到华大基因技术公司进行测序。测序结果显示，克隆基因的全长为2367 bp，编码789氨基酸。

钾转运体表达载体构建和转化酵母细胞：在扩增目的基因的引物两侧分别加上BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点，随后用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切把目的基因从pMD19-T 载体切割下来，凝胶电泳后利用凝胶回收试剂盒进行回收，同时对P416GPD载体进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切和回收，然后将目的基因片段与P416GPD载体大片段以3:1的比例混合，加入T₄连接酶（购自Takara公司，日本）1U，1×反应缓冲液，无菌水补充至10μL体系，16℃连接16小时，然后把全部连接产物进行热击法转化大肠杆菌DH5ɑ，涂布于含有氨苄青霉素的LB固体平板上，37℃培养过夜，采用PCR方法检测阳性克隆，然后选取5个阳性克隆摇菌提质粒，进行酶切鉴定。对获得的重组质粒利用PEG方法转化酵母R5421，用营养缺陷型固体平板筛选转化阳性菌落，采用PCR方法检测阳性克隆。

 钾转运体功能鉴定

对于获得含有重组质粒的酵母R5421进行低钾培养基上划线培养，同时用拟南芥中的钾转运体AKT1作为阳性对照，用未转化外源质粒的酵母R5421作为阴性对照。实验结果表明阳性对照、含有重组质粒的酵母R5421和阴性对照能够在正常培养基上生长，该培养基的配方是在100 mL培养基中加入W/O  0.67 g，-Trp-Leu-His-Ura 0.064 g， KCl  0.74 g，琼脂 1.5 g，葡萄糖 2 g，混匀后调pH 值至5.8，117℃高压灭菌17 min。待冷却到40-50℃加入已灭菌的50 ×Leu  2 mL，50 × His 2 mL，50 ×Trp 2 mL。同时阳性对照和转化有钾转运体的酵母R5421能够在低钾培养基上生长，而未转化外源质粒的酵母R5421不能生长，该培养基的配方是上述培养基的配方中去掉KCl。说明本发明克隆的烟草钾转运体具有高效转运钾离子的功能。 

[0001] 烟草一个钾转运体的碱基序列和氨基酸序列如下：

碱基序列SEQ ID No.1:

1    ATGGGAATAGATGAAGGAAGTGGGGATGAAACTAAAGGAGGGATGTGGGA

51  ATTAGACCAAAAGCTTGATCAGCCTATGGATGAGGAGGCTGGTAGACTCA

101 GAAATATGTATAGAGAAAAGAAATTCTCAGCATTGTTGCTTCTGCGGCTT

151 GCTTTTCAGAGTCTAGGAGTGGTTTATGGAGACTTGGGAACTTCTCCTTT

201 GTATGTGTTCTACAATACATTTCCCCATGGAATTGATGATACAGAGGATG

251 TCGTTGGCGCGCTTTCATTAATTATATATTCCCTCACACTTATCCCTCTC

301 CTCAAGTATGTTTTCATTGTTTGTAGAGCGAATGACAATGGCCAAGGTGG

351 GACTTTTGCTCTTTATTCTTTACTATGCCGGCATGCTAAGATAAAGACAA

401 TCCCCAACCAACATCGGACAGATGAGGAGCTGACAACTTATAGCCGTAGC

451 ACATTCCATGAGCATTCATTTGCTGCAAAAACAAAAAGATGGTTGGAGGC

501 ATATCCATTCAGGAAGAACGCACTTCTTATTATTGTAATTGTTGGCACTT

551 GCACGGTAATAGGTGATGGAATTCTCACTCCGGCTATATCAGTTCTTTCA

601 GCTTCTGGTGGGATAAAGGTGGACCATCCAAAGATGAGTAATGATGTAGT

651 AGTGGTTGTTGCTGTCATTATATTGGTTGGTCTGTTTAGCTTACAACACT

701 ATGGCACAGACAGGGTTGGTTGGCTGTTTGCTCCCATTGTGCTGCTTTGG

751 TTTCTATTAGTAGGAGGTATTGGCATCTTCAACATCTGGAAGTACGATAG

801 CTCTGTTTTGAGGGCTTTTTCTCCTGTGTGCATATATAGGTATTTTAGGA

851 GGAGAAAGAAAGAGGCTTGGACATCCCTGGGAGGAATAATGCTCAGCATT

901 ACAGGGACAGAGGCACTTTTTGCTGATCTTGCTCATTTTCCAGTGTCAGC

951 AATACAGCTTGCTTTCACAGTCATTGTTTTCCCTTGCCTTCTTTTAACCT

1001 ATACGGGGCAAGCAGCGTACCTCATGCAAAATAAGGAACATGTTGTCGAT

1051GCATTCTACCGTTCTATTCCAGGCATCATATACTGGCCAGTTTTTGTCAT

1101TGCAACTTTAGCTGCTATCGTTGCAAGTCAAGCAACCATTTCTGCTACAT

1151TTTCGATAATCAAGCAAGCTCTGGCACTTGGCTGTTTTCCAAGAGTTAAG

1201GTTGTACATACATCAAAGAAGTTCATTGGGCAGATTTATATTCCTGATAT

1251AAATTGGATACTTATGATTCTTTGCATCGCTGTAACTGCTGGATTCAGAA

1301ATCAAAGTCAAATTGGCAACGCATATGGAACGGCGGTCGTGATAGTCATG

1351TTGGTGACCACGCTCCTCATGACCTTAATAATGTTACTGGTTTGGCGCTG

1401TCATTGGGTTCTTGTCCTTGTCTTCACTGTCTTATCTCTGGTGGTTGAAT

1451GTACCTACTTCTCTGCAGTGCTATTTAAAGTTGATCAGGGTGGTTGGGTT

1501CCGCTTGTGATTGCTGCAGCTTTTCTTGTCGTCATGTATGTCTGGCATTA

1551CGGAACTGTGAAACGTTATGAATTTGAGATGCACAGCAAGGTGTCTATGG

1601CATGGATTCTTGGGCTTGGCCCCAGTTTAGGACTGGTACGTGTCCCGGGG

1651ATAGGACTTGTCTACACCGAGCTGGCTAGTGGGGTGCCACACATCTTTTC

1701TCACTTCATTACAAATCTGCCAGCTATACATTCAGTTGTGGTATTTGTCT

1751GTGTGAAGTATCTTCCAGTTTACACAGTTCCAGAAGATGAGAGGTTCCTC

1801GTGAAACGCATAGGACCCAAGACTTTTCACATGTTCCGCTGTGTTGCAAG

1851GTATGGTTACAAAGACCTCCATAAGAAAGATGAGGAGTTCGAGAGAAAGC

1901TCTTTGATAATCTCTTCCTATTTGTCCGGCTGGAGAATATGATGGAAGGC

1951TGCTCTGACTCTGATGAATACAGCTTATACGGACAGCAAACGCAGAATTC

2001GATGGATTATTTACTGCAAAATAAGAGCAACCCAACTACAGGAAATAATA

2051CATGTTCGTCGATGGAATCAATAGTACCCGTAAAATCTCCCACTCAAGGA

2101AGCAATACAGTCACATCATCATCAGGCCGTGAGAGCAGCCAGGCAGAAGT

2151GGACGAATTGGAATTCTTGAATCGTTGTCGAGATGCTGGGGTTGTACACA

2201TTCTTGGAAACACTGTAGTTAGAGCAAGGAGAGACTCTAGGTTCTATAAG

2251AAAATTGCTATCGACTATATATATGCGTTTCTTAGGAGAATATGCAGGGA

2301AAATAGTGTGATCTTCAACGTACCTCATGAGAGCCTCTTGAACGTTGGAC

2351AAATTTTCTATGTATAA

 [0002]氨基酸序列SEQ ID No.2:

 

1         MGIDEGSGDE TKGGMWELDQ

21        KLDQPMDEEA GRLRNMYREK

41        KFSALLLLRL AFQSLGVVYG

61        DLGTSPLYVF YNTFPHGIDD

81        TEDVVGALSL IIYSLTLIPL

101       LKYVFIVCRA NDNGQGGTFA

121       LYSLLCRHAK IKTIPNQHRT

141       DEELTTYSRS TFHEHSFAAK

161       TKRWLEAYPF RKNALLIIVI

181       VGTCTVIGDG ILTPAISVLS

201       ASGGIKVDHP KMSNDVVVVV

221       AVIILVGLFS LQHYGTDRVG

241       WLFAPIVLLW FLLVGGIGIF

261       NIWKYDSSVL RAFSPVCIYR

281       YFRRRKKEAW TSLGGIMLSI

301       TGTEALFADL AHFPVSAIQL

321       AFTVIVFPCL LLTYTGQAAY

341       LMQNKEHVVD AFYRSIPGII

361       YWPVFVIATL AAIVASQATI

381       SATFSIIKQA LALGCFPRVK

401       VVHTSKKFIG QIYIPDINWI

421       LMILCIAVTA GFRNQSQIGN

441       AYGTAVVIVM LVTTLLMTLI

461       MLLVWRCHWV LVLVFTVLSL

481       VVECTYFSAV LFKVDQGGWV

501       PLVIAAAFLV VMYVWHYGTV

521       KRYEFEMHSK VSMAWILGLG

541       PSLGLVRVPG IGLVYTELAS

561       GVPHIFSHFI TNLPAIHSVV

581       VFVCVKYLPV YTVPEDERFL

601       VKRIGPKTFH MFRCVARYGY

621       KDLHKKDEEF ERKLFDNLFL

641       FVRLENMMEG CSDSDEYSLY

661       GQQTQNSMDY LLQNKSNPTT

681       GNNTCSSMES IVPVKSPTQG

701       SNTVTSSSGR ESSQAEVDEL

721       EFLNRCRDAG VVHILGNTVV

741       RARRDSRFYK KIAIDYIYAF

761       LRRICRENSV IFNVPHESLL

781       NVGQIFYV*

 

 

Claims (3)

1.烟草一个钾转运体，其碱基序列如SEQ  ID  NO:1。

2.权利要求1所述的烟草一个钾转运体基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ  ID  NO:2。

3.权利要求1所述的烟草一个钾转运体基因在钾高效转基因植物中的应用。