CN111748560B

CN111748560B - 水稻OsNRT2.1基因在提高水稻籽粒中的锰元素含量中的应用

Info

Publication number: CN111748560B
Application number: CN202010657309.3A
Authority: CN
Inventors: 范晓荣; 陈景光
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2017-12-28
Filing date: 2017-12-28
Publication date: 2022-03-29
Anticipated expiration: 2037-12-28
Also published as: CN109971764A; CN109971764B; CN111748560A

Abstract

本发明公开了水稻OsNRT2.1基因在提高水稻籽粒中的锰元素含量中的应用。水稻OsNRT2.1基因在增加水稻苗期锰离子的吸收和积累量，增加成熟期种子中锰元素浓度方面的应用。水稻OsNRT2.1基因在干湿交替种植环境中提高水稻籽粒中的锰元素浓度和/或提高水稻产量中的应用。本发明首次提供了水稻基因OsNRT2.1的生物学功能，在0.5mM NO₃ ^‑条件下，能够显著提高水稻苗期对硝酸盐的吸收和积累。过量表达水稻基因OsNRT2.1，可以增加水稻在淹水，干湿交替环境下水稻籽粒中的锰元素浓度。过量表达水稻基因OsNRT2.1，可以增加水稻在干湿交替环境中提高水稻产量。

Description

水稻OsNRT2.1基因在提高水稻籽粒中的锰元素含量中的应用

分案说明

本案是申请日为2017年12月28日，申请号为2017114634862，发明名称为“水稻OsNRT2.1基因在提高水稻籽粒中的锰元素含量中的应用”的分案申请。

技术领域

本发明属于农业基因工程领域，涉及水稻OsNRT2.1基因在提高水稻籽粒中的锰元素含量中的应用。

背景技术

植物生长和发育过程中，不仅需要大量元素而且微量元素也起着至关重要的作用。其中锰元素是植物代谢必需的微量元素并且参与多个生物途径。当锰缺乏，植物更容易受到冷害和病菌感染，从而降低作物产量(Hebbern,C.A.,Pedas,P.,Schjoerring,J.K.,Knudsen,L.,Husted,S.(2005).Genotypic differences in manganese efficiency:field experiments with winter barley(Hordeum vulgare L.).Plant and Soil.272,233–244.)。在水稻中，锰元素的转运体对锰的吸收、转运和锰元素的稳态扮演着重要的角色。为适应土壤中不同的硝酸盐浓度，植物具有两种不同的硝酸盐吸收系统包括高亲和硝酸转运家族和低亲和硝酸盐转运家族。尤其高亲和硝酸盐转运家族OsNRT2基因对硝酸盐的吸收和转运起着关键作用。但尚未有文献报道OsNRT2基因在不同形态氮素处理下对籽粒锰元素的吸收和积累的影响。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供水稻OsNRT2.1基因在提高水稻籽粒中的锰元素含量中的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

水稻OsNRT2.1基因在增加水稻苗期锰离子的吸收和积累量，增加成熟期种子中锰元素浓度方面的应用；所述的水稻OsNRT2.1基因其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，共1928bp；该基因表达产物为水稻高亲和硝酸盐运输蛋白OsNRT2.1，其氨基酸序列为SEQ IDNO.2,共533个氨基酸。

水稻OsNRT2.1基因在干湿交替种植环境中提高水稻籽粒中的锰元素浓度和/或提高水稻产量中的应用；所述的水稻OsNRT2.1基因其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

有益效果：

1、通过系统研究，本发明首次提供了水稻基因OsNRT2.1的生物学功能，在0.5mMNO₃ ^-条件下，能够显著提高水稻苗期对硝酸盐的吸收和积累。

2、过量表达水稻基因OsNRT2.1，可以增加水稻在淹水，干湿交替环境下水稻籽粒中的锰元素浓度。

3、过量表达水稻基因OsNRT2.1，可以增加水稻在干湿交替环境中提高水稻产量。

附图说明

图1水稻过量表达OsNRT2.1基因载体示意图。

图2不同氮素处理下，水稻对锰元素的吸收

图3OsNRT2s和OsNAR2.1在转基因株系根中的表达

图4在不同形态氮素处理条件下，转基因株系中根部和地上部锰元素和氮素的含量(A)(C)(E)在0.5mM NH₄ ⁺处理下，(B)(D)(F)在0.5mM NO₃ ^-处理下

图5不同灌溉条件对水稻籽粒中氮元素和锰元素的影响

图6在干湿交替条件下，相关基因在各个株系中的表达(A)(E)穗柄,(B)(F)旗叶叶片,(C)(G)旗叶叶柄(D)(H)穗下第一节

图7过量表达OsNRT2.1可以提高水稻在干湿交替环境下水稻籽粒产量。WL：淹水；AWD：干湿交替。

具体实施方式

实施例1、

一、水稻基因OsNRT2.1序列的克隆

1)总RNA的提取

水稻(日本晴)幼苗长至3叶期，用0.2mM硝态氮进行处理6小时后立即取根迅速置于液氮中冷冻保存，称取0.1g左右根，用液氮研碎，研磨充分加入1.5ml离心管，迅速加入1ml Trizol试剂(购自Invitrogen,USA)，充分摇匀振荡后，抽提总RNA。

2)OsNRT2.1基因全长的克隆

利用NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的基因数据库中检索到水稻的NRT2.1基因系列OsNRT2.1(AB008519)。设计引物(如下)从组织cDNA库中钓出OsNRT2.1的全长序列。

P1:5’-CCAAGGTACCATGGACTCGTCGACGGTGGGC-3’

P2:5’-GGCCACTAGTTTAGGCGTGCTCCGGCGAG-3’

以步骤1)获得的总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，用高保真酶(PrimeStarHS DNA polymerase购自Takara公司)进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性2min，94℃变性30s，53℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃5min，4℃恒温。琼脂糖电泳分离、切胶回收后克隆至pMD-19载体(购自Takara公司)，获得pOsNRT2.1-T质粒，测序正确后就获得具有完整编码区的水稻高亲和硝酸盐运输蛋白基因OsNRT2.1的全长序列(SEQ IDNO.1)。

二、过量表达水稻基因OsNRT2.1转基因株系的获得

1)水稻过量表达OsNRT2.1载体的构建

根据步骤一中获得的水稻基因OsNRT2.1基因全长序列，见SEQ ID NO.1的序列，设计PCR引物，其PCR产物包含完整的水稻基因OsNRT2.1基因全长序列，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点BamH I和Spe I，引物序列为：

OverOsNRT2.1-F：5’-CCAAGGTACCATGGACTCGTCGACGGTG-3’BamH I

OverOsNRT2.1-R：5’-GCCACTAGTTTAGGCGTGCTCCGGCGAG-3’Spe I

用以上获得的pOsNRT2.1-T质粒为模板，PCR程序如下：94℃预变性4min，98℃变性10s,68℃复性延伸2min，30个循环后，72℃10min，扩增的PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物大小为2200bp。将目的PCR产物经琼脂糖电泳分离后切胶回收，回收产物用限制性内切BamHⅠ和Spe I双酶切，同时用BamHⅠ和Spe I双酶切植物过量表达载体pTCK303质粒，然后分别回收酶切过的PCR片段和载体，将载体进行去磷酸化后再次回收；回收后通过T4连接酶将线性化的载体与酶切过的PCR片段在4℃下连接过夜，转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中，涂在含有卡那霉素50μgmL^-1的LB固体培养基上生长12h后，挑取阳性菌落,提取质粒经BamHⅠ和Spe I双酶切验证片段大小无误后，将该菌液进行DNA测序，将含有测序正确克隆的菌液加入等体积30％甘油于-70℃保存，提取阳性克隆质粒命名为pUbiquitin-OsNRT2.1，载体示意图见图1。

2)转基因植株的获得

获得的转有上述载体的农杆菌，侵染水稻愈伤组织，共培养60小时，经过选择培养、分化、生根、炼苗得到T₀代转基因植株。对所有转基因材料都进行了两次扩繁，得到了稳定遗传的T1代和T2代材料。

实施例2不同氮素处理下锰元素的吸收

首先，我们将水稻野生型株系(WT)培养在0.5mM NH₄ ⁺(0.5A)、2.5mM NH₄ ⁺(2.5A)、0.5mM NO₃ ^-(0.5N)和2.5mM N0₃ ^-(2.5N)为氮素的营养液中。0.5mM NO₃ ^-能促进水稻根系生长并且要好于其它条件下的水稻根系(见图2)。地上部和根部的总氮浓度在正常氮素处理下要显著高于0.5mM处理下的水稻，并且以2.5mM的NH₄ ⁺处理条件下的根部和地上部积累更多的总氮。不同于总氮浓度，在0.5mM NO₃ ^-条件下，根部反而吸收更多的锰元素，在2.5mM NH₄ ⁺条件下的地上部锰元素的积累显著低于其它氮素处理条件下的水稻。从水稻整体来看，硝酸盐处理的水稻体内锰元素积累要高于铵盐处理的水稻，并且随着处理的硝酸盐浓度的增加水稻体内积累越多的锰元素。从图2，我们可以得出硝酸盐可以直接影响锰元素的积累并且正向调控锰元素的吸收。

实施例3 OsNRT2s和OsNAR2.1在转基因株系根中的表达模式

由于OsNRT2.1属于高亲和硝酸盐转运体，所以我们将OsNRT2.1超表达的三个转基因株系(OE1/2/3)和野生型(WT)水稻培养在0.5mM NH₄ ⁺/NO₃ ^-为氮源的营养液中，我们发现OsNRT2.1在超表达株系的根中的表达与野生型相比分别上调4.5倍和5.7倍，并不受到氮素形态的影响。并且OsNRT2.3a和OsNRT2.4在超表达株系的根中的表达与野生型相比并没有显著性差异。而OsNAR2.1在超表达根系中仅在硝酸盐处理的条件下表达上调80％(图3)。

实施例4在不同形态氮素处理条件下，转基因株系中根部和地上部锰元素和氮素的含量

锰元素作为微量元素其移动性很差，我们将水稻分别培养在0.5mM NH₄ ⁺/0.5mMNO₃ ^-的营养液中并分别测了各个株系的生物量，锰元素含量和总氮含量。我们发现在0.5mMNH₄ ⁺处理下，超表达株系与野生型之间不管是根部还是地上部，它们的生物量，锰浓度和总氮浓度都没有显著性差异。而在0.5mM NO₃ ^-条件下，超表达株系的根部和地上部都显著高于野生型的生物量，并且锰元素的浓度具有相同的趋势。在总氮浓度方面，超表达株系仅在根中显著高于野生型，而地上部没有显著性差异(图4)。这说明在0.5mM NO₃ ^-处理下，OsNRT2.1超表达不仅能够提高硝酸盐的吸收从而提高总氮浓度而且能够促进锰元素的吸收。

实施例5不同灌溉条件对水稻籽粒中锰元素和总氮的影响

我们都知道水稻一般生长在长期缺氧以铵盐为主的淹水土壤中，为了模拟水培条件下不同氮素形态的处理的田间实验，我们通过田间不同的水分管理去探究OsNRT2.1对水稻籽粒的影响。我们将三个超表达株系和野生型水稻分别种植在长期灌水(WL，每天浇水，以保持水生长在淹水状态下)和干湿交替(AWD，每周浇一次水，保持土壤湿润)的土壤中。比较两个不同水分处理下的野生型植株，在干湿交替下的野生型植株的单株穗重与长期淹水条件下的野生型相比显著降低31％，超表达株系在不同处理条件下的单株穗重并没有发生变化(图5)。千粒重与单株穗重具有相似的趋势。比较籽粒中总氮浓度，我们发现在干湿交替条件下的各个株系都显著高于长期淹水条件下的各个株系并且在干湿交替条件下的超表达株系与野生型相比要提高大约26％。同时，超表达株系中籽粒中锰元素的浓度都高于野生型。只是长期淹水条件下的超表达株系籽粒里锰元素浓度与野生型相比仅仅提高了30％，干湿交替条件下的超表达株系籽粒里锰元素比野生型增加了60％。此外，在分子水平方面，我们分别采了不同处理条件下的各个株系地上部的RNA去检测OsNRT2.1和OsNAR2.1的相对表达。我们发现在不同处理条件下，在超表达株系中OsNRT2.1表达都显著提高。而OsNAR2.1仅在干湿交替条件下的超表达株系中提高2.8倍(图5)。因此，在以硝酸盐为氮源的干湿交替的土壤中OsNRT2.1超表达能够提高硝酸盐的吸收从而诱导提高OsNAR2.1的表达。由于在干湿交替条件下，OsNRT2.1与OsNAR2.1同时表达上调，硝酸盐将被更好地从转运、吸收，进一步的促进了锰元素的吸收。

实施例6在干湿交替条件下，相关基因在各个株系中的表达

为了去探究在干湿交替处理下OsNRT2.1超表达株系。籽粒中总氮和锰含量增加的原因。所以我们采了在干湿交替条件下各个株系不同部位的RNA样品去检测与硝酸盐转运蛋白和锰转运蛋白相关基因的表达。我们发现硝酸盐转运体OsNRT2.1与伴侣蛋白OsNAR2.1在超表达株系的穗颈，倒一叶，倒一叶鞘表达与野生型相比均上调。并且我们知道穗颈是连接生殖器官和营养器官的关键部位，倒一叶在属于功能叶片在生长后期主要参与营养物质向籽粒里的运输。因此，硝酸盐转运体OsNRT2.1和伴侣蛋白在这些功能部位的表达上调有利于水稻在生长后期硝酸盐向籽粒里的转运从而更好的提高籽粒里总氮的含量进一步提高产量。同时，我们发现锰转运体OsNRAMP3，OsNRAMP5，OsNRAMP6基因的表达。由于基因之间本身存在有差异所以在各个部位的表达并不是很一致。但是，OsNRAMP3和OsNRAMP6在转基因株系的NodeⅠ部位的表达分别上调87％和311％(图6)。NodeⅠ是连接叶片，茎秆和穗部的维管系统的结合点。这说明OsNRAMP3和OsNRAMP6表达的上调有利于锰元素从地下部向上部和穗部的运输。这三个锰转运体基因同时在超表达株系的倒一叶中表达上调。从RNA水平上，阐释了超表达株系籽粒中总氮含量和锰元素含量增加的原因。

实施例7

三个超表达株系和野生型水稻分别种植在长期灌水(WL，每天浇水，以保持水生长在淹水状态下)和干湿交替(AWD，每周浇一次水，保持土壤湿润)的土壤中，分别进行比较。在干湿交替种植条件下，与野生型相比，过量表达株系的产量平均增加了20％左右。野生型干湿交替后产量与淹水相比下降35％，但是过量表达株系的产量维持不变(图7)。

本发明人发现过量表达水稻基因OsNRT2.1能显著增加水稻苗期对锰离子的吸收和积累，增加成熟期水稻种子中锰元素的浓度；过量表达株系可以达到节水稳产的效果，可以在节水农业中进行工程应用。可利用本发明过量表达OsNRT2.1表达载体，该表达载体中必要时可包括增强子，不论是转录增强子或翻译增强子。为了简化转化细胞的鉴定可使用选择性标记包括对抗生素抗性的酶，也可利用颜色变化(例如B-葡糖醛酸糖苷酶GUS)或发光(例如荧光素酶)来识别的化合物的酶类，也可用无标记选择。所用的表达载体可使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体等。转化方法可用经农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法或其它方法转化植物。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 水稻OsNRT2.1基因在提高水稻籽粒中的锰元素含量中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1928

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 1

aattgcatcc gagctcacct agcttctctc ttgcaaccag cgattcgatc gattccatct 60

ccaagaagca gcggctagca gcagctagta gttgccatgg actcgtcgac ggtgggcgct 120

ccggggagct cgctgcacgg cgtgacgggg cgcgagccgg cgttcgcgtt ctcgacggag 180

gtgggcggcg aggacgcggc ggcggcgagc aagttcgact tgccggtgga ctcggagcac 240

aaggcgaaga cgatcaggtt gctgtcgttc gcgaacccgc atatgaggac gttccaccta 300

tcatggatct ccttcttctc ctgcttcgtc tccaccttcg ccgccgcccc tctcgtcccc 360

atcatccgcg acaacctcaa cctcaccaag gccgacatcg gcaacgccgg cgtcgcctcc 420

gtctccggct ccatcttctc caggctcgcc atgggcgcca tctgcgacat gctcggcccg 480

cgctacggct gcgccttcct catcatgctc gccgcgccca ccgtcttctg catgtcgctc 540

atcgactccg ccgcggggta catcgccgtg cgcttcctca tcggcttctc cctcgccacc 600

ttcgtgtcat gccagtactg gatgagcacc atgttcaaca gcaagatcat cggcctcgtc 660

aacggcctcg ccgccgggtg gggaaacatg ggcggcggcg cgacgcagct catcatgccg 720

ctcgtctacg acgtgatccg caagtgcggc gcgacgccgt tcacggcgtg gaggctggcc 780

tacttcgtgc cggggacgct gcacgtggtg atgggcgtgc tggtgctgac gctggggcag 840

gacctccccg acggcaacct gcgcagcctg cagaagaagg gtgacgtcaa cagggacagc 900

ttctccaggg tgctctggta cgccgtcacc aactaccgca cctggatctt cgtcctcctc 960

tacggctact ccatgggcgt cgagctcacc accgacaacg tcatcgccga gtacttctac 1020

gatcgcttcg acctcgacct ccgcgtcgcc ggcatcatcg ccgcatcctt cggcatggcc 1080

aacatcgtcg cgcgccccac cggcggcctc ctctcggacc tcggcgcgcg ctacttcggc 1140

atgcgcgccc gcctctggaa catttggatc ctccagaccg ccggcggcgc gttctgcctc 1200

ctgctcggcc gcgcatccac cctccccacc tccgtcgtct gcatggtcct cttctccttc 1260

tgcgcgcagg ccgcctgcgg cgccatcttc ggcgtcatcc ccttcgtctc ccgccgctcg 1320

ctcggcatca tctccggcat gaccggcgcc ggcggcaact tcggcgccgg gctcacgcag 1380

ctgctcttct tcacgtcgtc gaggtactcc acgggcacgg ggctggagta catgggcatc 1440

atgatcatgg cgtgcacgct gccggtggtg ctcgtccatt tcccgcagtg gggctccatg 1500

ttcctcccgc ccaacgccgg cgccgaggag gagcactact acggctccga gtggagcgaa 1560

caggagaaga gcaagggcct ccacggtgca agtctcaagt tcgccgagaa ctcccgctcc 1620

gagcgtggcc gccgcaacgt catcaacgcc gccgccgccg ccgccacgcc gcccaacaac 1680

tcgccggagc acgcctaagg cgtaaacaat tctgcgaccg agaccagcaa tacgctggag 1740

ttcgactcga tgataacacg ccggagcacg tccttgttgc aaacggtgat gaaattaaga 1800

gtgaaatatt tccttaggaa ttgaatcctt tgaaattaat tcctttggaa tttctccgat 1860

acaaacggag gtataataag ggagaggcat ttatacctat gtacatgtta cacttttttg 1920

aaaaaaaa 1928

<210> 2

<211> 533

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

Met Asp Ser Ser Thr Val Gly Ala Pro Gly Ser Ser Leu His Gly Val

1 5 10 15

Thr Gly Arg Glu Pro Ala Phe Ala Phe Ser Thr Glu Val Gly Gly Glu

20 25 30

Asp Ala Ala Ala Ala Ser Lys Phe Asp Leu Pro Val Asp Ser Glu His

35 40 45

Lys Ala Lys Thr Ile Arg Leu Leu Ser Phe Ala Asn Pro His Met Arg

50 55 60

Thr Phe His Leu Ser Trp Ile Ser Phe Phe Ser Cys Phe Val Ser Thr

65 70 75 80

Phe Ala Ala Ala Pro Leu Val Pro Ile Ile Arg Asp Asn Leu Asn Leu

85 90 95

Thr Lys Ala Asp Ile Gly Asn Ala Gly Val Ala Ser Val Ser Gly Ser

100 105 110

Ile Phe Ser Arg Leu Ala Met Gly Ala Ile Cys Asp Met Leu Gly Pro

115 120 125

Arg Tyr Gly Cys Ala Phe Leu Ile Met Leu Ala Ala Pro Thr Val Phe

130 135 140

Cys Met Ser Leu Ile Asp Ser Ala Ala Gly Tyr Ile Ala Val Arg Phe

145 150 155 160

Leu Ile Gly Phe Ser Leu Ala Thr Phe Val Ser Cys Gln Tyr Trp Met

165 170 175

Ser Thr Met Phe Asn Ser Lys Ile Ile Gly Leu Val Asn Gly Leu Ala

180 185 190

Ala Gly Trp Gly Asn Met Gly Gly Gly Ala Thr Gln Leu Ile Met Pro

195 200 205

Leu Val Tyr Asp Val Ile Arg Lys Cys Gly Ala Thr Pro Phe Thr Ala

210 215 220

Trp Arg Leu Ala Tyr Phe Val Pro Gly Thr Leu His Val Val Met Gly

225 230 235 240

Val Leu Val Leu Thr Leu Gly Gln Asp Leu Pro Asp Gly Asn Leu Arg

245 250 255

Ser Leu Gln Lys Lys Gly Asp Val Asn Arg Asp Ser Phe Ser Arg Val

260 265 270

Leu Trp Tyr Ala Val Thr Asn Tyr Arg Thr Trp Ile Phe Val Leu Leu

275 280 285

Tyr Gly Tyr Ser Met Gly Val Glu Leu Thr Thr Asp Asn Val Ile Ala

290 295 300

Glu Tyr Phe Tyr Asp Arg Phe Asp Leu Asp Leu Arg Val Ala Gly Ile

305 310 315 320

Ile Ala Ala Ser Phe Gly Met Ala Asn Ile Val Ala Arg Pro Thr Gly

325 330 335

Gly Leu Leu Ser Asp Leu Gly Ala Arg Tyr Phe Gly Met Arg Ala Arg

340 345 350

Leu Trp Asn Ile Trp Ile Leu Gln Thr Ala Gly Gly Ala Phe Cys Leu

355 360 365

Leu Leu Gly Arg Ala Ser Thr Leu Pro Thr Ser Val Val Cys Met Val

370 375 380

Leu Phe Ser Phe Cys Ala Gln Ala Ala Cys Gly Ala Ile Phe Gly Val

385 390 395 400

Ile Pro Phe Val Ser Arg Arg Ser Leu Gly Ile Ile Ser Gly Met Thr

405 410 415

Gly Ala Gly Gly Asn Phe Gly Ala Gly Leu Thr Gln Leu Leu Phe Phe

420 425 430

Thr Ser Ser Arg Tyr Ser Thr Gly Thr Gly Leu Glu Tyr Met Gly Ile

435 440 445

Met Ile Met Ala Cys Thr Leu Pro Val Val Leu Val His Phe Pro Gln

450 455 460

Trp Gly Ser Met Phe Leu Pro Pro Asn Ala Gly Ala Glu Glu Glu His

465 470 475 480

Tyr Tyr Gly Ser Glu Trp Ser Glu Gln Glu Lys Ser Lys Gly Leu His

485 490 495

Gly Ala Ser Leu Lys Phe Ala Glu Asn Ser Arg Ser Glu Arg Gly Arg

500 505 510

Arg Asn Val Ile Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Pro Pro Asn Asn

515 520 525

Ser Pro Glu His Ala

530

Claims

1.水稻OsNRT2.1基因在干湿交替种植环境中提高水稻籽粒中的锰元素浓度中的应用；所述的水稻OsNRT2.1基因其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.水稻OsNRT2.1基因在干湿交替种植环境中提高水稻籽粒中的锰元素浓度和提高水稻产量中的应用；所述的水稻OsNRT2.1基因其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。