CN112626258B - 一种与水稻镉低吸收基因OsNramp5相关的SNP位点及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种与水稻镉低吸收基因OsNramp5相关的SNP位点及其应用。所述SNP位点位于水稻第7号染色体9122158处，多态性为C/T。本发明针对该SNP位点设计相应的KASP引物组合对其进行检测，通过检测该SNP位点的多态性判断检测植株的基因OsNramp5是否缺失。本发明提供的SNP位点及其应用可以有效鉴别植株中基因OsNramp5是否缺失，进而实现对镉低积累的珞红3A或珞红4A水稻品种的鉴别，在镉低积累品种的选育中具有重要意义。

Description

一种与水稻镉低吸收基因OsNramp5相关的SNP位点及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种与水稻镉低吸收基因OsNramp5相关的SNP位点及其应用。

背景技术

水稻栽培历史悠长，发展至今，是现有的主要粮食作物之一，但是近年来由于工业污染的排放，土壤镉污染日益严重，随之带来了严重粮食安全问题。大米镉超标会严重威胁人类健康，引发多种疾病。

目前，针对大米镉超标的问题，现有技术提供了多种思路，其中降低水稻对镉的吸收转运，培育镉低吸收水稻品种，是降低水稻籽粒中镉含量的重要途径之一。水稻OsNramp5基因编码的蛋白是水稻根部细胞参与二价阳离子的主要转运蛋白，主要吸收Mn²⁺，Cd²⁺，Fe^{2 +}，同时负责这些离子从根部向地上部的运输，研究发现，对水稻 OsNramp5基因进行突变或抑制表达可显著减少根系对镉的吸收，降低秸秆和籽粒中镉的含量。Lv Q等对1143份水稻资源进行重测序分析发现，水稻品种珞红3A/B和珞红4A/B在7号染色体上存在408kb序列的天然缺失，该缺失包含整个OsNramp5基因，进一步分析发现该段序列缺失后，可显著降低珞红3A和珞红4A对镉的吸收。因此针对珞红3A与珞红4A缺失区域开发特异分子标记，对促进珞红3A、珞红4A 资源在镉低积累品种选育中的应用、加快镉低积累品种的选育以及保障粮食安全等具有重要意义。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种与水稻镉低吸收基因OsNramp5相关的SNP位点及其应用。

第一方面，本发明提供一种与水稻镉低吸收基因OsNramp5相关的SNP位点，所述SNP位点位于水稻7号染色体第9122158位处，多态性为C/T。

进一步地，所述SNP位点位于如SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第101位，SEQ IDNO.4中为C，其实际多态性为C/T。

进一步地，所述SNP位点为T的植物中基因OsNramp5缺失，所述 SNP位点为C的植物中基因OsNramp5未缺失。

第二方面，本发明提供一种KASP引物组合，所述KASP引物组合用于扩增所述SNP位点，所述KASP引物组合包括如下引物：

K_9122158_Fam：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAGA AAATGAGCAAAACTGAGGCC-3’；

K_9122158_Hex：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAAGA AAATGAGCAAAACTGAGGCT-3’；

K_9122158_Com：5’-AACAGCCCATAGTACACAAGTCAT-3’。

本发明进一步提供包括所述KASP引物组合的试剂盒。

第三方面，本发明提供一种检测植物中水稻镉低吸收基因 OsNramp5的方法，包括：

(1)获得待测植物的基因组DNA；

(2)使用所述KASP引物组合进行PCR检测；

(3)若检测得到所述SNP位点的多态性为T，则判断所述植物中水稻镉低吸收基因OsNramp5缺失，若检测得到所述SNP位点的多态性为C，则判断所述植物中水稻镉低吸收基因OsNramp5未缺失。

进一步地，步骤(2)中的PCR检测的反应体系以总体积2μL计包括：

1μL模板DNA，100μM的Fam和Hex引物各0.007μL，100μM的Com 引物0.015μL，余量为2×KASP Master Mix；

步骤(2)中的PCR检测的反应程序包括：

94℃预变性15分钟；

94℃变性20秒；65℃～57℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；

94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环。

进一步地，步骤(3)具体为：

若检测到Fam荧光信号，则所述待测植物的水稻镉低吸收基因OsNramp5未缺失，若检测到Hex荧光信号，则所述待测植物的水稻镉低吸收基因OsNramp5缺失。

本发明进一步提供所述SNP位点、所述KASP引物组合、所述试剂盒和所述方法在鉴定镉低积累水稻品种中的应用。

进一步地，所述水稻品种为珞红3A和/或珞红4A。

本发明进一步提供所述SNP位点、所述KASP引物组合、所述试剂盒和所述方法在镉低积累水稻选育中的应用。

本发明具备如下有益效果：

(1)本发明筛选得到的SNP位点是珞红3A与珞红4A独有的，能特异性区别珞红3A/珞红4A和其他非缺失型水稻品种或资源。

(2)本发明所选择的SNP位点位于珞红3A与珞红4A缺失区域内，且可共显性检测不同等位型。

(3)本发明提供的SNP位点可用于水稻未结实之前预测水稻籽粒镉含量高低，可以更准确地筛选低低镉含量的水稻，显著促进水稻低镉含量品种的培育。

(4)本发明提供的检测方法准确可靠，操作简便，可高效运用于水稻商业化育种中镉低积累品种的选育。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的多种生物材料的基因分型结果；

图2为本发明实施例2提供的珞红4A和95份水稻材料的基因分型结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1本发明标记在珞红4A组合F1及亲本间多态性鉴定

1、生物材料

本实施例对珞红4A，珞红4A/K991组合F1、以及24分亲本进行标记基因型初步鉴定，24份亲本包括：华占、9311、K991、 6723-B195、湘陵750S、华煜4127S、锦4128S、155S、湘陵628S、长早S、广占63-2S、株1S、润S、晶4155S、5418S、5423S、宣S、 638S、准S、深08S、陆18S、培矮64S、3158S、03S。

2、基因型检测

提取待测水稻基因组DNA作为模板，利用本发明的引物组合进行KASP反应检测。

PCR扩增反应体系以2μL计为：1μL模板DNA，100μM的Fam 和Hex引物各0.007μL，100μM的Com引物0.015μL，以2×KASP Master Mix补足至总体积2μL。

PCR扩增反应条件为：反应在水浴热循环仪中完成，Touchdown PCR反应条件为94℃预变性15分钟；

第一步扩增反应，94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60 秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；

第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26 个循环。

反应完成后利用IntelleQube进行KASP反应产物进行荧光扫描并进行基因分型。

3、结果分析

基因型鉴定结果如图1所示，珞红4A检测为T型碱基(缺失型)，珞红4A/K991杂交组合F1样品检测为T/C杂合型，其余亲本检测为C型碱基(非缺失型)，证明了本发明提供的分子标记及其引物组检测结果准确、且能有效区分不同等位基因型。

实施例2本发明标记在自然群体检测中的应用

1、生物材料

本实施例以珞红4A为对照，利用95份水稻材料对本发明标记进行自然群体验证。95份材料包括20份常见杂交稻和75份核心育种材料。

2、基因型检测

同实施例1基因型检测步骤。

3、结果分析

标记在自然群体分型结果如图2所示，检测结果分型明确，对照珞红4A检测结果为T型碱基(缺失型)，95份材料均为C型碱基(非缺失型)。结果表明珞红4A(或珞红3A)中OsNramp5缺失型在常规水稻品种中欠缺，该等位型在镉低积累品种选育中具有极大应用前景，同时也表明本发明的标记在亲本间特异性好，可用于以珞红3A或珞红4A为供体的镉低积累品种分子标记辅助选择育种中。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 袁隆平农业高科技股份有限公司 武汉大学 湖南亚华种业科学研究院

<120> 一种与水稻镉低吸收基因OsNramp5相关的SNP位点及其应用

<130> KHP201119755.1

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaaggtgacc aagttcatgc taagaaaatg agcaaaactg aggcc 45

<210> 2

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaggtcgga gtcaacggat taagaaaatg agcaaaactg aggct 45

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aacagcccat agtacacaag tcat 24

<210> 4

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aacataccat ctacacttgt tctttttggg ttttttcaac aagaacagac catctacact 60

tgttgttttt tttaggaaag aaaatgagca aaactgaggc caaacttatt acatgtcatg 120

acttgtgtac tatgggctgt tttgggtgat tttgagggaa atgggatgga tatgcatagg 180

cctgttatta aatgaagtta g 201

Claims (5)

1.一种检测植物中水稻镉低吸收基因OsNramp5的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)获得待测植物的基因组DNA；

(2)使用KASP引物组合进行PCR检测；

(3)若检测得到SNP位点的多态性为T，则判断所述植物中水稻镉低吸收基因OsNramp5缺失，若检测得到如所述SNP位点的多态性为C，则判断所述植物中水稻镉低吸收基因OsNramp5未缺失；

所述SNP位点位于水稻7号染色体如SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第101位，多态性为C/T；

所述KASP引物组合用于扩增所述SNP位点，

所述KASP引物组合包括如下引物：

K_9122158_Fam：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAGAAAATGAGCAAAACTGAGGCC-3’；

K_9122158_Hex：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAAGAAAATGAGCAAAACTGAGGCT-3’；

K_9122158_Com：5’-AACAGCCCATAGTACACAAGTCAT-3’。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中的PCR检测的反应体系以总体积2μL计，包括：

1μL模板DNA，100μM的Fam和Hex引物各0.007μL，100μM的Com引物0.015μL，余量为2×KASP Master Mix；和/或，

步骤(2)中的PCR检测的反应程序包括：

94℃预变性15分钟；

94℃变性20秒；65℃～57℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；

94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)具体为：

若检测到Fam荧光信号，则所述待测植物的水稻镉低吸收基因OsNramp5未缺失，若检测到Hex荧光信号，则所述待测植物的水稻镉低吸收基因OsNramp5缺失。

4.SNP位点，或权利要求1中所述KASP引物组合，或权利要求1-3任一项所述方法在鉴定镉低积累水稻品种中的应用；所述水稻品种为珞红3A和/或珞红4A；

所述SNP位点位于水稻7号染色体如SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第101位，多态性为C/T。

5.SNP位点，或权利要求1中所述KASP引物组合，或权利要求1-3任一项所述方法在镉低积累水稻选育中的应用；

所述SNP位点位于水稻7号染色体如SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第101位，多态性为C/T。

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