CN104120123A - 与绵羊双肌臀性状相关的snp标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记及其应用，其位于绵羊CLPG基因如SEQ ID NO.1所示序列的232bp处，此处碱基为T的绵羊具有双肌臀性状，此处碱基为C的绵羊无双肌臀性状。采用聚合酶链式反应(PCR)和测序技术筛选到与绵羊双肌臀性状状相关的SNP标记，并通过限制片段多态性(RFLP)方法来检测待测绵羊的基因型，根据基因型进行双肌臀性状绵羊优势品种的选育，从而加快绵羊的育种进程。

Description

与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及一种与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记及其应用。

背景技术

自20世纪80年代末以来，中国已成为世界上绵羊、山羊饲养量、出栏量、羊肉产量最多的国家。随着国民消费理念的变化和对羊肉营养价值的认识，羊肉的市场需求量日益增加。然而，我国肉羊生产落后于世界先进水平，肉羊育种技术集成创新力度不足，育种的技术水平和效率低下，致使拥有自主知识产权的优质肉羊品种匮乏，现有良种贡献率低，市场竞争力差。

Callipyge基因是近年来备受关注的动物“双肌臀”性状的候选基因，简写为CLPG(Cockett N E,Jackson S P,Shay T L,etal.Chromosomallocalizationof the callipyge gene in sheep(Ovisaries)using bovine DNAmarkers[A].Proc Natl Acad.Sci USA[C],1994,91:3019～3023.)。具有CLPG表型的绵羊最初于1983年发现于美国，此种绵羊肌肉特别发达，背最长肌大且通常突出于棘突之上，以致在背中线形成一凹槽结构，后腿肌肉厚实。

发明内容

本发明的目的是提供一种与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记及其应用。

为了实现本发明目的，本发明提供一种与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记，其位于绵羊CLPG基因如SEQ ID NO.1所示序列的232bp处，此处碱基为T的绵羊具有双肌臀性状，此处碱基为C的绵羊无双肌臀性状。

本发明还提供用于检测所述与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记的引物，包括正向引物F5’-TGAAAACGTGAACCCAGAAGC-3’和反向引物R5'-GGCAGGAGAGACGGTTAAT-3'。

本发明还提供所述与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记在鉴定具有双肌臀性状的优势绵羊品种中的应用，其包括步骤：

1)提取待测绵羊的基因组DNA；

2)以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用所述引物F和R，通过PCR反应扩增出绵羊CLPG基因493bp片段；

3)检测PCR扩增产物，如果扩增产物序列中232bp处的碱基为T，则待测绵羊属于具有双肌臀性状的优势绵羊品种。

步骤2)中PCR反应使用的扩增体系以25μl计为：40ng/μl模板DNA2μl，10μmol引物F和R各1μl，2.5mmol dNTPs2μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.5μl，10×PCR反应缓冲液2.5μl，余量为ddH₂O。

步骤2)中PCR反应使用的扩增程序为：94℃5分钟；94℃40秒，55℃30秒，72℃50秒，33个循环；72℃10分钟。

步骤3)中检测PCR扩增产物采用RFLP法，具体为：用内切酶HhaⅠ对PCR扩增产物进行酶切，并对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果检测结果为两条带(232bp和261bp)，则待测绵羊属于普通品种，且基因型为纯和CC型；检测结果仅为一条带(493bp)，则待测绵羊属于具有携带双肌臀性状基因的优势品种，且基因型为纯和TT型；检测结果为三条带(493bp、232bp和261bp)，则待测绵羊属于具有双肌臀性状的优势品种，且基因型为杂合CT型。

本发明还提供含有上述引物F和R的用于检测绵羊双肌臀性状的试剂盒。

优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液等中的一种或多种。

更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明进一步提供所述与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记在绵羊分子标记辅助育种中的应用。

本发明提供了一种与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记及其应用，既采用聚合酶链式反应(PCR)和测序技术筛选到与绵羊双肌臀性状状相关的SNP标记，并通过限制片段多态性(RFLP)方法来检测待测绵羊的基因型，根据基因型进行双肌臀性状绵羊优势品种的选育，从而加快绵羊的育种进程。

本发明具有以下优点：

(一)本发明提供的分子遗传标记不受绵羊的年龄、性别等限制，可用于绵羊的早期选育，甚至在绵羊刚出生时就可准确地进行筛选，可大大加快绵羊的育种进程；

(二)可快速准确地对绵羊CLPG基因进行SNP位点检测，可以快速检测每个绵羊个体在SNP位点的遗传变异情况，可快捷获得该引物对绵羊多态性图谱，所得结果可直观地检测出绵羊每个个体的基因型，以期找到与该SNP位点连锁的性状，为后续与传统方法结合进行育种工作奠定基础；

(三)进行SNP基因检测实现了低成本、高精度、高通量的闭管操作，大大降低了实验过程中由污染可能导致的误差。

附图说明

图1为本发明实施例2中对F1代绵羊样本进行PCR检测结果。

图2为本发明实施例2中PCR-RLFP酶切检测结果。

图3为本发明实施例2中对20个绵羊样本CLPG基因扩增产物测序的结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1  与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记的获得

1.1澳洲白绵羊血液DNA提取

本实施例中使用的澳洲白绵羊血样为加入抗凝剂于-20℃保存的绵羊全血，解冻后用购自天根生化科技(北京)有限公司的血液DNA提取试剂盒从血液中提取基因组DNA，具体步骤如下：

(1)血样置冰上融化，取300μl至一高压灭菌后的离心管中，按照血液基因组DNA提取试剂盒说明书操作。

(2)加裂解液CL900μl，颠倒或振荡混匀，室温静置5min，期间再多次颠倒混匀。10000rpm离心1min，吸去上清液体，保留白色沉淀。若裂解不彻底，即重复操作一次。

(3)加缓冲液GS200μl，彻底振荡至混匀。

(4)加Proteinase K20μl溶液并混匀。

(5)加缓冲液GB200μl，颠倒数次充分混匀，在56℃水浴锅中放置10min，期间应多次颠倒混匀，直至溶液颜色彻底清亮。

(6)加无水乙醇200μl，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

(7)将上一步所得溶液与絮状沉淀全部加入到一个吸附柱中，离心机12000rpm离心30sec，吸去废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(8)向吸附柱中加入缓冲液GD500μl(已用无水乙醇配比)，12000rpm离心30sec，吸去弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(9)向吸附柱中加缓冲液PW600μl(已用无水乙醇配比)，12000rpm离心30sec，吸去废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(10)重复步骤9。

(11)将吸附柱12000rpm空离2min，倒掉废液。打开吸附柱上盖，室温静置5分钟，彻底晾干，以防漂洗液残留物影响后续PCR或酶切反应。

(12)将吸附柱转入另一高压洁净的离心管中，向吸附膜中间部分悬空滴加80μl洗脱液TB，室温放置5min，12000rpm离心2min。重复此操作一次，DNA即收集于离心管中。经1％琼脂糖凝胶电泳检测、核酸蛋白浓度测定仪检测DNA纯度后，置于-20℃冰箱保存。

1.2目的片段和SNP位点的获得以及PCR-RFLP分型

(1)扩增含SNP位点的核苷酸片段

根据GenBank数据库提供的绵羊CLPG基因序列(登录号：AF533009.1)设计引物，正向引物F5’-TGAAAACGTGAACCCAGAAGC-3’和反向引物R5'-GGCAGGAGAGACGGTTAAT-3’，扩增出待测SNP所在的核苷酸片段，该SNP位点位于该PCR扩增片段的232bp处，该处碱基可以为C或T，当该处碱基为C时，可被HhaⅠ内切酶(识别序列为CATG)识别。

其中，PCR反应使用的扩增体系以25μl计为：40ng/μl模板DNA2μl，10μmol引物F和R各1μl，2.5mmol dNTPs2μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.5μl，10×PCR反应缓冲液2.5μl，余量为ddH₂O。

PCR反应使用的扩增程序为：94℃5分钟；94℃40秒，55℃30秒，72℃50秒，33个循环；72℃10分钟。

(2)针对第232位碱基的不同选择适当的内切酶进行PCR-RFLP

该PCR产物用HhaⅠ内切酶酶切，反应体系以25μl计为：20000U/ml酶HhaⅠ0.8μl，酶切缓冲液3μl，PCR扩增产物4μl，ddH₂O17.2μl。37℃水浴锅中过夜酶切。用3％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，用凝胶成像系统拍照，根据带型判断基因型。

3、基因型判定及关联分析

根据PCR-RFLP的结果判定该位点在检测群体中的基因型。若为检测结果为两条带(232bp和261bp)，则待测F1代绵羊属于普通品种，且基因型为纯和CC型；检测结果仅为一条带(493bp)，则待测F1代绵羊属于具有携带双肌臀性状基因的优势品种，且基因型为纯和TT型；检测结果为三条带(493bp、232bp和261bp)，则待测F1代绵羊属于具有双肌臀性状的优势品种，且基因型为杂合CT型。即，该位点可分为3种基因型：TT:493，CT:493/232/261，CC:232/261。

实施例1  绵羊不同基因型与双肌臀性状的关联分析及检测应用

包括：1、准备阶段；2、DNA检测；3、检测结果分析。具体步骤如下：

1、准备阶段

1.1采集78只澳洲白绵羊和173只杜泊羊的F1代杂种绵羊血液样本，用购自天根生化科技(北京)有限公司的DNA提取试剂盒提取绵羊血液中的DNA。

1.2根据SNP标记位于绵羊CLPG基因上的位置，设计并合成引物，引物序列如下：正向引物F5’-TGAAAACGTGAACCCAGAAGC-3’和反向引物R5'-GGCAGGAGAGACGGTTAAT-3'，扩增产物片段大小为498bp。

2、DNA检测

2.1PCR扩增

采用普通PCR扩增方法，反应体系以25μl计为：40ng/μl模板DNA2μl，10μmol引物F和R各1μl，2.5mmol dNTPs2μl，5U/μl TaqDNA聚合酶0.5μl，10×PCR反应缓冲液2.5μl，余量为ddH₂O。

反应程序：94℃预变性5min；94℃变性40s，55℃复性30s，72℃延伸50s，33个循环；72℃延伸10min。产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像系统拍照，与DNA Marker比较。

2.2PCR-RLFP检测

用购自BioLabs公司的限制性内切酶HhaⅠ对PCR扩增产物进行酶切，酶切反应体系为25μl，包括：20000U/ml酶HhaⅠ0.8μl，酶切缓冲液3μl，PCR扩增产物4μl，ddH₂O17.2μl。37℃水浴锅中过夜酶切。用3％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，用凝胶成像系统拍照，根据带型判断基因型。

3、PCR产物及PCR-RFLP酶切检测结果

3.1PCR产物检测

对173个F1代绵羊样本进行PCR检测，成功获得493bp(SEQ IDNO.1)的扩增产物，如图1所示。

3.2PCR-RLFP酶切检测

用限制性内切酶HhaⅠ对PCR产物进行酶切。若为检测结果为两条带(232bp和261bp)，则待测F1代绵羊属于普通品种，且基因型为纯和CC型；检测结果仅为一条带(493bp)，则待测F1代绵羊属于具有携带双肌臀性状基因的优势品种，且基因型为纯和TT型；检测结果为三条带(493bp、232bp和261bp)，则待测F1代绵羊属于具有双肌臀性状的优势品种，且基因型为杂合CT型。酶切结果如图2所示。

选取20个绵羊样本CLPG基因扩增产物测序，结果如图3所示。

对本实验中发现的突变位点为GCTGAGAG[C→T]GCAGGAA的SNP位点进行验证。从纯种杜泊羊和澳洲白羊群中挑选10只含有[C→T]突变Callipyge基因(T)的父本,和不含突变的200只野生型等位基因(C)母本杜泊羊和澳洲白,杂交后获得F1代，杂合绵羊(CT)在6月龄时体重明显高于TT型和CC型。且6月龄背膘厚低于TT型和CC型(表1)。

表1 杂交试验结果验证

澳(T)♂×澳(C)♀

CT	58.9±0.9	31.0±0.23	0.41±0.39	58±0.54
					TT	50.6±0.28	26.8±0.36	0.49±0.45	53±0.39
CC	50.7±0.17	22.3±0.26	0.48±0.39	49.8±0.32

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记，其特征在于，其位于绵羊CLPG基因如SEQ ID NO.1所示序列的232bp处，此处碱基为T的绵羊具有双肌臀性状，此处碱基为C的绵羊无双肌臀性状。

2.用于检测权利要求1所述与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记的引物，其特征在于，包括正向引物F5’-TGAAAACGTGAACCCAGAAGC-3’和反向引物R5'-GGCAGGAGAGACGGTTAAT-3'。

3.权利要求1所述与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记在鉴定具有双肌臀性状的优势绵羊品种中的应用，其包括步骤：

1)提取待测绵羊的基因组DNA；

2)以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述引物F和R，通过PCR反应扩增出大小为493bp的绵羊CLPG基因片段；

3)检测PCR扩增产物，如果扩增产物序列中232bp处的碱基为T，则待测绵羊属于具有双肌臀性状的优势绵羊品种。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤2)中PCR反应使用的扩增体系以25μl计为：40ng/μl模板DNA2μl，10μmol引物F和R各1μl，2.5mmol dNTPs2μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.5μl，10×PCR反应缓冲液2.5μl，余量为ddH₂O。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤2)中PCR反应使用的扩增程序为：94℃5分钟；94℃40秒，55℃30秒，72℃50秒，33个循环；72℃10分钟。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤3)中检测PCR扩增产物采用RFLP法，具体为：用内切酶HhaⅠ对PCR扩增产物进行酶切，并对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果检测结果为两条带，则待测绵羊属于普通品种，且基因型为纯和CC型；检测结果仅为一条带，则待测绵羊属于携带双肌臀性状基因的优势品种，且基因型为纯和TT型；检测结果为三条带，则待测绵羊属于具有双肌臀性状的优势品种，且基因型为杂合CT型。

7.含有权利要求2所述引物的用于检测绵羊双肌臀性状的试剂盒。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的一种或多种。

9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

10.权利要求1所述与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记在绵羊分子标记辅助育种中的应用。