CN110241234B

CN110241234B - 一种荧光标记的32-plex InDels复合扩增系统及其应用

Info

Publication number: CN110241234B
Application number: CN201910656653.8A
Authority: CN
Inventors: 黄代新; 黄钰洁; 刘聪; 肖超; 易少华
Original assignee: Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2019-07-19
Filing date: 2019-07-19
Publication date: 2020-07-21
Anticipated expiration: 2039-07-19
Also published as: CN110241234A

Abstract

本发明属于生物学检测技术领域，尤其涉及一种荧光标记的32‑plex InDels复合扩增系统及其应用。本发明构建的复合扩增系统包括32个InDel位点和一个性别位点，选取了在中国汉族人群中最小等位基因频率(MAF)≥0.4的InDel标记，扩增片段范围从70bp到160bp。使用上述复合扩增系统对中国汉族204个无关个体进行基因分型，累积个人识别概率为0.999999999999966，累积非父排除概率为0.9982。研究表明，本发明构建的复合扩增系统对中国汉族人群具有高度识别能力，同时能对低至31.25pg的DNA模板正确分型，并对降解DNA的扩增分型有显著优势。

Description

一种荧光标记的32-plex InDels复合扩增系统及其应用

技术领域

本发明属于生物学检测技术领域，尤其涉及一种荧光标记的32-plex InDels复合扩增系统及其应用，该复合扩增系统为包含32个插入缺失位点的复合扩增系统。

背景技术

在法医遗传学领域，个人识别和亲子鉴定问题主要通过DNA遗传标记的基因分型来解决。短串联重复序列(STR)已经成为最常用的遗传标记，这是由于它们的高多态性和在不同国家人群中已知的等位基因频率数据。然而，STR扩增系统的扩增片段较长，面对高度降解的DNA样品分辨力低下，并且存在突变率高的缺陷。

单核苷酸多态性(SNP)具有扩增子短、突变率低、人类基因组密度高的特点，弥补了STR的不足。然而，目前的SNP的分型技术复杂多样，限制了其在法医实验室的推广应用。插入/缺失多态性标记(InDels)是SNP标记的特殊类型，它结合了STR和SNP的优点。InDel在人类基因组中广泛分布，平均密度为每7.2kb一个InDel。InDel的扩增片段长度约在50-150bp，这意味着突变率较低，以及对小片段的DNA模板(如高度降解的DNA)有更好的分型效果。此外，与SNP相比，InDel的分析过程更为简化，更易于应用于实践。因此，InDel在司法实践中面临挑战性案件时发挥着重要作用。

自InDel被发现以来，已有许多研究报道使用InDel构建复合扩增系统。根据已发表的研究，InDels已被应用于个人识别、亲子鉴定、祖先推断以及特殊检材的基因分型，如尸检材料、人类肿瘤组织、骨骼残骸和石蜡包埋组织。目前已有Investigator

试剂盒(Qiagen，德国)可以一次扩增30个InDel标记和amelogenin性别位点。多个验证研究已经证明它对世界各地的许多人口都有较强的鉴别能力。然而研究表明，与欧洲人群相比，Investigator

试剂盒对中国人群的识别力较低，而国内尚没有针对中国人开发的InDel商品化试剂盒。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种荧光标记的32-plex InDels复合扩增系统及其应用。

本发明是这样实现的，一种荧光标记的32-plex InDels复合扩增系统，包括如下32个InDel标记和amelogenin性别位点的复合扩增引物：rs6481、Amelogen、rs2307976、rs35851958、rs3837647、rs2307433、rs3841948、rs35248926、rs71305406、rs34843628、rs10590424、rs3038530、rs2307561、rs1610905、rs5789826、rs1799734、rs2308292、rs2307930、rs16458、rs140397390、rs17515041、rs2307661、rs34511541、rs35149698、rs35605984、rs1160886、rs3042783、rs1611048、rs61124555、rs25552、rs2308189、rs199726575、rs2308112；所述32个InDel位点和一个性别位点的复合扩增引物序列见SEQID NO:1-SEQ ID NO:66。

进一步，使用4种荧光素染料标记32个InDel位点和一个性别位点：6-FAM标记rs6481、rs2307976、rs35851958、rs3837647、rs2307433、rs3841948、rs35248926、rs71305406和Amelogen性别位点；VIC标记rs34843628、rs10590424、rs3038530、rs2307561、rs1610905、rs5789826、rs1799734、rs2308292；NED标记rs2307930、rs16458、rs140397390、rs17515041、rs2307661、rs34511541、rs35149698、rs35605984；PET标记rs1160886、rs3042783、rs1611048、rs61124555、rs25552、rs2308189、rs199726575、rs2308112。

进一步，所述32个InDel标记和Amelogen标记可以在一个复合扩增体系中同时扩增。

进一步，所述扩增系统PCR体系总体积为20μL，其中包含10μL的PCR反应缓冲液、4μL的引物混合物、1μL的2μg/μL的牛血清蛋白溶液和0.5ng基因组DNA，用无核酸水补充至20μL；所述引物混合物为权利要求1中所述引物的混合物。

进一步，所述扩增系统PCR程序为：95℃预变性2min；95℃30s，60℃90s，72℃60s，共32个循环；60℃延伸30min。

如权利要求1-5任一所述的一种荧光标记的32-plex InDels复合扩增系统在中国汉族法医鉴定中的应用。

如权利要求1-5任一所述的一种荧光标记的32-plex InDels复合扩增系统在降解DNA分析检测中的应用。

如权利要求1-5任一所述的一种荧光标记的32-plex InDels复合扩增系统在亲子鉴定中的应用。

如权利要求1-5任一所述的一种荧光标记的32-plex InDels复合扩增系统在个体识别中的应用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明建立了一个由32个InDel遗传标记和amelogenin性别位点组成的复合扩增系统，选取了在中国汉族人群中最小等位基因频率(MAF)≥0.4的InDel标记，所有的InDel标记在一个简单的PCR系统中被扩增，其扩增片段长度从70bp到160bp不等。本发明在204个中国汉族无关个体间对该InDel复合扩增系统进行了评估。所有的InDel标记均被证明具有高度多态性，平均观测杂合度(H_obs)为0.4885。累计个人识别概率(CPD)和累计非父排除概率(CPE)分别为0.99999999999996和0.9982。进一步的验证研究表明，32-plex InDels复合扩增系统能对低至31.25pg的DNA模板进行正确分型，并对降解DNA的扩增分型有显著优势。

附图说明

图1是0.5ng某男性DNA模板的毛细管电泳分型图谱；

图2是使用32-plex InDels复合扩增系统对不同浓度梯度的DNA 9947A扩增得到的分型图谱；DNA浓度从250pg到15.625pg；

图3是使用EX22STR试剂盒对降解DNA进行扩增分型所得图谱；

图4是使用本32-plex InDels复合扩增系统对降解DNA进行扩增分型所得图谱；

图5是使用32-plex InDels复合扩增系统对五种动物进行检验，从上至下分别是鸡、兔、牛、猪和鼠。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明披露了一种荧光标记的32-plex InDels复合扩增系统及其应用，具体如下各实施例所示。

实施例1构建32-plex InDels复合扩增系统

1.DNA样本

共采集204例中国南方汉族无关个体的口腔拭子或血样，其中女性78例，男性126例。采用Chelex-100法提取基因组DNA。使用Nanodrop 2000分光光度计(ThermoScientific，美国)对DNA产物进行定量。本研究经华中科技大学同济医学院医学伦理委员会批准。

2.InDel标记的选择和引物设计

InDel标记是从千人基因组计划数据(the 1000Genomes Project)或已发表的文章中选择的。所有候选的InDel标记都符合以下标准：(1)插入缺失标记均位于常染色体上；(2)在中国汉族人群中，每个标记的最小等位基因频率(MAF)必须≥0.4；(3)每个InDel标记的插入/缺失长度在3-6bp，个别少数超过6bp；(4)InDel标记位于非编码区或内含子区；(5)候选标记附近不存在STR或其他InDel标记；(6)位于同一染色体上的InDel标记均不连锁。最后，我们选择了32个二等位基因InDel标记和amelogenin性别位点构成本32-plexInDels复合扩增系统，遗传标记的详细信息见表1。

表1 32个InDel标记的详细信息

注：从DBSNP(152版)中获得所选32个InDel标记的染色体位置。

为了避免引物二聚体对基因分型的干扰，所有扩增片段均设计为大于65bp，同时为了提高对降解DNA的检测能力，设计的最大扩增片段不超过160bp。使用Primer3软件(http://bioinfo.ut.ee/primer3/)进行引物设计，并使用AutoDimer软件检测引物二聚体结构。所获得的引物通过BLAST工具进行引物特异性检验。同时，对于每对引物，我们在未标记荧光的引物的5'端添加一个碱基G，以促进扩增中的完全腺苷酸化，但对于5'端原本是G的引物，则不额外添加G。在每个位点的正向或反向引物的5'端标记一种荧光染料(6-FAM、VIC、NED或PET)。最后，根据等位基因大小的范围将32个InDel分成4组，形成一个复合扩增系统，每个色道上相邻的等位基因之间间隔至少4bp，以便于电泳分离。引物序列及引物浓度见表2。

表2引物序列及引物浓度

注：小写字母g是添加的碱基

3.扩增和基因分型

PCR扩增总体积20μL，其中包含10μL的2×

Multiplex PCR Master Mix(Thermo Fisher Scientific，美国)，4μL的引物混合物(详细的引物序列和浓度见表2)、1μL的2μg/μL的牛血清蛋白(BSA)溶液(生工，中国上海)和0.5ng基因组DNA，最后用无核酸水补充至20μL。使用GeneAmp2720(Thermo Fisher Scientific，美国)进行PCR扩增，热循环条件为：95℃预变性2min；95℃30s，60℃90s，72℃60s，共32个循环；60℃延伸30min。

毛细管电泳之前，将1μL的PCR产物添加到9μL的Hi-Di^TM去离子甲酰胺(Thermo-Fisher Scientific，美国)和Genescan^TM 500

(Thermo-Fisher Scientific，美国)的混合物中(混合比例19：1)，然后在95℃变性3分钟，并立即置于冰上3分钟。使用ABI 3130基因分析仪(Thermo Fisher Scientific，美国)通过毛细管电泳分离扩增产物。使用GeneMapper ID v3.2软件(Thermo Fisher Scientific，美国)对电泳结果进行分析。

9947A DNA(Thermo Fisher Scientific，美国)被常规用作扩增的阳性对照，并用于测试该复合扩增系统的总体性能。

4.32-Plex InDels多重分析法的构建

在InDel标记选择、引物设计和PCR条件后，我们构建了一个32-plex InDels复合扩增系统。32个InDel标记和Amelogen标记可以同时扩增，所有基因座峰型均衡。图1展示了0.5ng某男性样本的示例图。

实施例2灵敏度研究和降解DNA研究

1.灵敏度

为了确定32-plex InDels复合扩增系统的灵敏度，使用对照DNA 9947A进行试验。将对照标准品DNA 9947A梯度稀释至500pg、250pg、125pg、62.5pg、31.25pg和15.625pg，按实施例1中的条件进行PCR和毛细管电泳。

分型图谱结果如图2所示(其中500pg浓度的DNA分型图谱未展示)。当DNA量大于或等于31.25pg时，可以检测到完整分型结果；而DNA量在15.625pg时，少数位点的峰高低于检测阈值。尽管31.25pg DNA量足以进行检测，我们推荐在法医学实践中使用0.5-1ng之间的DNA模板量进行PCR。

2.降解DNA

为了验证该方法对降解检材的检测能力，分别使用32-plex InDels扩增系统和EX22 STR试剂盒(AGCU，中国无锡)对降解后的DNA进行了分析，降解DNA检材取自福尔马林溶液固定3周的肾组织，同时使用同一个体的未降解DNA作为对照。琼脂糖凝胶电泳结果表明，从福尔马林固定组织中提取的DNA在500bp以下呈弥漫性分布，证实DNA发生片段化。

两种分型方法的基因分型结果如图3、图4所示。对于EX22STR试剂盒(图3)，扩增片段小于200bp的等位基因可以分型成功。然而，许多超过200bp的位点发生等位基因丢失或峰高低于检测阈值(50rfu)。相比之下，32-plex InDels扩增系统得到了完整的分型图谱(图4)，这表明该方法可以成为分析降解DNA的很好的工具。

实施例3物种特异性试验

在法医学应用中使用的复合扩增系统还需要具有人属特异性。我们采用Chelex-100法提取大鼠、兔、猪、牛、鸡等5种犯罪现场常见动物的DNA进行扩增和电泳，对该32-plexInDels复合扩增系统进行验证。

结果显示，在大鼠、兔和鸡中未检测到任何扩增产物，而在牛和猪的DNA中检测到一个基因座(rs3042783)在87bp处的插入片段，见图5。经过primer blast后，证实了rs3042783位点的一对引物确实可以扩增这两个物种的DNA片段。然而，总体来说，这些动物都不能使用该复合扩增系统获得完整的DNA图谱，这证明了32-plex InDels复合扩增系统可以提供人类DNA检测所需的物种特异性。

实施例4群体数据和法医学参数

统计分析：使用Powerstats v1.2(Promega)计算等位基因频率、个体识别能力(DP)、非父排除概率(PE)；使用Arlequin v3.5软件计算观测杂合度(H_obs)、期望杂合度(H_exp)、Hardy-Weinberg平衡(HWE)，以及对位于同一染色体上的基因座进行了连锁不平衡(LD)精确检验；利用SPSS v20.0软件计算了皮尔逊卡方检验以评估群体间差异。所有检验结果均经过Bonferroni校正。

本发明对来自中国南方汉族人群的204名无关个体(78名女性和126名男性)进行了32-plex InDels分型。32个InDel位点的等位基因频率和法医学参数如表3所示。

表3 32个InDel标记的等位基因频率和在中国汉族人群中的法医学参数

注：H_obs，观测杂合度；H_exp，期望杂合度；PIC，多态信息含量；PD，个人识别概率；PE：非父排除概率；HWE-p：偏离Hardy–Weinberg平衡的概率。

统计结果表明，除3个位点rs3841948(0.3799)、rs16458(0.3995)和rs35149698(0.2941)之外，其余所有基因座的最小等位基因频率(MAF)均大于0.400。其中，rs35149698的MAF远未达到预期。需要指出的是，rs35149698最初筛选时命名为rs397897230(chr20:7691487-7691493)，是参考了Liu等人发表的研究(MAF＝0.500)。然而，发明人发现在最近的dbSNP更新后，rs397897230的等位基因在旧版本和新版本之间不一致，dbSNP 151版中rs397897230的插入/缺失片段为delCAACTA(6个碱基)，而dbSNP152版中为dupCTAAA(5个碱基)。同时，发明人注意到dbSNP新版本(152版)中的rs35149698的等位基因是delCAACTA，它与rs397897230仅相邻一个碱基。为了确定引物实际扩增的多态性位点，发明人对扩增产物进行了测序，结果表明缺失片段为CTAAA，说明发明人扩增的InDel实际是rs35149698。因此，发明人在最终的32-plex InDels复合扩增系统中将rs397897230改为rs35149698，后续的人群频率比较也同样采用rs35149698的基因频率。

除两个标记rs35851958(p＝0.0497)和rs5789826(p＝0.0472)外，所有标记均处于0.05显著水平的Hardy–Weinberg遗传平衡(HWE)。然而，经Bonferroni校正后，所有InDel标记物均达到遗传平衡(α＝0.05/32＝0.0015625)。经Bonferroni校正后，位于同一染色体上的InDel位点之间未发现连锁不平衡(LD)(α＝0.05/13＝0.0038)，表明32个InDel位点相互不连锁，适用于个人识别和亲权鉴定。

观测杂合度(H_obs)在0.4265(rs5789826)和0.5490(rs34843628)之间，平均值为0.4885。与Investigator DIPplex试剂盒在上海汉族(0.4133)、成都汉族(0.4054)、广东汉族(0.4060)和北京汉族(0.4118)的表现相比，本发明的32-plex InDels复合扩增系统显示出较高的H_obs平均值。个人识别概率(PD)范围在0.5644(rs35149698)和0.6522(rs35851958)之间，非父排除概率(PE)范围在0.1308(rs5789826)和0.2341(rs34843628)之间。累计个人识别概率(CPD)和累计非父排除概率(CPE)分别为0.999999999999966和0.9982，这意味着本32-plex InDels复合扩增系统可以成为中国汉族法医鉴定的有力工具。

实施例5不同人群的频率比较

本发明从NCBI数据库中收集了来自非洲、东亚、欧洲、南亚和美洲的32个个体的频率数据，并将本研究在中国汉族群体获得的等位基因频率与这5个群体进行了比较，见表4。

卡方检验显示，在这6个群体之间，所有InDel位点的基因频率在α＝0.05显著性水平表现出显著差异，P值均小于0.001。随后对中国汉族人群和其他5个人群进行两两配对比较，经Bonferroni校正后显著性水平为0.01(α＝0.05/5＝0.01，5代表进行比较的次数)。对于P值接近0.01的位点，采用Fisher精确检验法进行了重新计算，两种统计方法结果没有差别。统计结果显示，中国汉族人群和非洲人群在23个indel位点的等位基因频率具有显著差异，中国汉族人群与南亚、欧洲、美洲人群表现出显著差异的基因座数量分别为21个、23个和17个。中国汉族人群与东亚人群的比较显示，仅有5个基因座有显著差异，数目最少，符合预期。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

表4 32个InDel标记在中国汉族和其他五个民族的等位基因频率和群体间比较

注：CH：中国汉族；AF：非洲；EAS：东亚；EU：欧洲；SAS：南亚；AM：美洲；频率数据收集自千人基因组计划phase3。小于0.01的P值以粗体显示。符号“–”表示在这些人群中没有报告等位基因频率，并且由于缺乏频率数据，不能进行成对比较。

在千人基因组计划phase3中找不到rs35149698的频率数据，这些数据来自基因组聚合数据库(GnomAD)。非洲、东亚、欧洲和美国的rs35149698位点样本量分别为4329、487、911、416。

序列表

<110> 华中科技大学

<120> 一种荧光标记的32-plex InDels复合扩增系统及其应用

<160> 66

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(rs6481-F)

<400> 1

gtggggaggg cgactataaa 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(rs6481-R)

<400> 2

aaaaagctca ctgaccctgg 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Amelogenin-F)

<400> 3

ccctttgaag tggtaccaga g 21

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Amelogenin-R)

<400> 4

gcatgcctaa tattttcagg gaata 25

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(rs2307976-F)

<400> 5

catcgaaacc gcagatatta gc 22

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(rs2307976-R)

<400> 6

gctgaaaatt taaagagact caggag 26

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(rs35851958-F)

<400> 7

gagtgaggca gaagattaaa gaaaat 26

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(rs35851958-R)

<400> 8

ctgctctgag ataaaattta cttcatca 28

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(rs3837647-F)

<400> 9

gtccttctca aggtctccac a 21

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(rs3837647-R)

<400> 10

aaaatggttt gtcaaaatgc tg 22

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(rs2307433-F)

<400> 11

cagctcagga acattctgcc 20

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(rs2307433-R)

<400> 12

ggagacgccc actttgcc 18

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(rs3841948-F)

<400> 13

gacatggccc acaagttaaa att 23

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(rs3841948-R)

<400> 14

acattccagt gtgcaaagga 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(rs35248926-F)

<400> 15

gaccaaagta gctggcatga 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(rs35248926-R)

<400> 16

gcttgttcag gacgttcaca 20

<210> 17

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(rs71305406-F)

<400> 17

aatggaatac aaaagagaac tcacaa 26

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(rs71305406-R)

<400> 18

ggtattcttc tgcatctggt agc 23

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(rs34843628-F)

<400> 19

tcattttgca tcctctctct gaat 24

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(rs34843628-R)

<400> 20

gtttctcacc agctctttac ct 22

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(rs10590424-F)

<400> 21

gttgagtttc ctgagcctgc 20

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(rs10590424-R)

<400> 22

tgcaaattct ttacttcagt gcc 23

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(rs3038530-F)

<400> 23

tgcagaaatc gctttgtaaa tcag 24

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(rs3038530-R)

<400> 24

ggcgtatgtc tttggttggg 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(rs2307561-F)

<400> 25

cctgcactgc tccttattca 20

<210> 26

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(rs2307561-R)

<400> 26

gttttatagt ttccatagga tccaca 26

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(rs1610905-F)

<400> 27

ataacataga accccgggcc 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(rs1610905-R)

<400> 28

gtacctctga gctcatccca 20

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(rs5789826-F)

<400> 29

tccctcattt atccagtgac tct 23

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(rs5789826-R)

<400> 30

gccacggtct caataggaaa t 21

<210> 31

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(rs1799734-F)

<400> 31

gtgagtcatc cagattatcg agtga 25

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(rs1799734-R)

<400> 32

tgctgcactt tagtcttcct g 21

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(rs2308292-F)

<400> 33

cttttactct gtctccactg gg 22

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(rs2308292-R)

<400> 34

gatctgttag gcrcactgtg t 21

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(rs2307930-F)

<400> 35

gtgcatccca tacaactgac t 21

<210> 36

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(rs2307930-R)

<400> 36

actgtttcct tggagcatga tc 22

<210> 37

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(rs16458-F)

<400> 37

caaagacatg gttaatcttc ccc 23

<210> 38

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(rs16458-R)

<400> 38

gtcataagag agtttggaaa tgaagga 27

<210> 39

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(rs140397390-F)

<400> 39

aaaagcttga gaagacacag ca 22

<210> 40

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(rs140397390-R)

<400> 40

gtgtgacaga gagaggacag tt 22

<210> 41

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(rs17515041-F)

<400> 41

gtgttctgtg gttgaaatgc aa 22

<210> 42

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(rs17515041-R)

<400> 42

acttgctcta ttctacattc taatcact 28

<210> 43

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(rs2307661-F)

<400> 43

tttagggatc acgcagaaag ag 22

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(rs2307661-R)

<400> 44

gacactggcc tctctttcat 20

<210> 45

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(rs34511541-F)

<400> 45

actttagtag aagaggaaaa taccaca 27

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(rs34511541-R)

<400> 46

gttacattcc cctgccttgc 20

<210> 47

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(rs35149698-F)

<400> 47

gaatctccaa tcccacctca tt 22

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(rs35149698-R)

<400> 48

cctcactggc tcttgttgat 20

<210> 49

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(rs35605984-F)

<400> 49

gcacaaagaa gcttatgtca tagta 25

<210> 50

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(rs35605984-R)

<400> 50

ggtttcacaa atagttttcc tgca 24

<210> 51

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(rs1160886-F)

<400> 51

gtcccattgt gcttaaaact cct 23

<210> 52

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(rs1160886-R)

<400> 52

ccagtctacc caaatgtatt cca 23

<210> 53

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(rs3042783-F)

<400> 53

gttgtggtta ggagggatat tgac 24

<210> 54

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(rs3042783-R)

<400> 54

cactgagcga ttctgaatgt tg 22

<210> 55

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(rs1611048-F)

<400> 55

gtccttgctg acgaaattgc a 21

<210> 56

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(rs1611048-R)

<400> 56

ccactccact tctctagggt c 21

<210> 57

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(rs61124555-F)

<400> 57

ggcttatcag ggaagaagtg g 21

<210> 58

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(rs61124555-R)

<400> 58

tgaaggtgta gagatgcatc ag 22

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(rs25552-F)

<400> 59

gtgaggacca agattctggc 20

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(rs25552-R)

<400> 60

aagaagaacg cccaggtgag 20

<210> 61

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(rs2308189-F)

<400> 61

catcctgctc ctttcacctg 20

<210> 62

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(rs2308189-R)

<400> 62

gaaagggatg ttcaaggaag gag 23

<210> 63

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(rs199726575-F)

<400> 63

gaattgatca ctttgtttct tgctc 25

<210> 64

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(rs199726575-R)

<400> 64

atcaactaac ctagaacatg cca 23

<210> 65

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(rs2308112-F)

<400> 65

gaaccatagg cttgcaggga t 21

<210> 66

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(rs2308112-R)

<400> 66

agaagaggcg gtgctgatg 19

Claims

1.一种荧光标记的32-plex InDels复合扩增系统，其特征在于：包括如下32个InDel标记和amelogenin性别位点的复合扩增引物：rs6481、Amelogen、rs2307976、rs35851958、rs3837647、rs2307433、rs3841948、rs35248926、rs71305406、rs34843628、rs10590424、rs3038530、rs2307561、rs1610905、rs5789826、rs1799734、rs2308292、rs2307930、rs16458、rs140397390、rs17515041、rs2307661、rs34511541、rs35149698、rs35605984、rs1160886、rs3042783、rs1611048、rs61124555、rs25552、rs2308189、rs199726575、rs2308112；所述32个InDel位点和一个性别位点的复合扩增引物序列见SEQ ID NO:1-SEQID NO:66。

2.根据权利要求1所述的一种荧光标记的32-plex InDels复合扩增系统，其特征在于：使用4种荧光素染料标记32个InDel位点和一个性别位点：6-FAM标记rs6481、rs2307976、rs35851958、rs3837647、rs2307433、rs3841948、rs35248926、rs71305406和Amelogen性别位点；VIC标记rs34843628、rs10590424、rs3038530、rs2307561、rs1610905、rs5789826、rs1799734、rs2308292；NED标记rs2307930、rs16458、rs140397390、rs17515041、rs2307661、rs34511541、rs35149698、rs35605984；PET标记rs1160886、rs3042783、rs1611048、rs61124555、rs25552、rs2308189、rs199726575、rs2308112。

3.根据权利要求1所述的一种荧光标记的32-plex InDels复合扩增系统，其特征在于：所述32个InDel标记和Amelogen标记可以在一个复合扩增体系中同时扩增。

4.根据权利要求1所述的一种荧光标记的32-plex InDels复合扩增系统，其特征在于：所述扩增系统PCR体系总体积为20μL，其中包含10μL的PCR反应缓冲液、4μL的引物混合物、1μL的2μg/μL的牛血清蛋白溶液和0.5ng基因组DNA，用无核酸水补充至20μL；所述引物混合物为权利要求1中所述引物的混合物。

5.根据权利要求4所述的一种荧光标记的32-plex InDels复合扩增系统，其特征在于：所述扩增系统PCR程序为：95℃预变性2min；95℃30s，60℃90s，72℃60s，共32个循环；60℃延伸30min。

6.如权利要求1-5任一所述的一种荧光标记的32-plex InDels复合扩增系统在中国汉族法医鉴定中的应用。

7.如权利要求1-5任一所述的一种荧光标记的32-plex InDels复合扩增系统在非诊断目的的降解DNA分析检测中的应用。

8.如权利要求1-5任一所述的一种荧光标记的32-plex InDels复合扩增系统在亲子鉴定中的应用。

9.如权利要求1-5任一所述的一种荧光标记的32-plex InDels复合扩增系统在个体识别中的应用。