CN112342298A

CN112342298A - 与猪达100kg体重日龄相关的SNP标记、检测方法及应用

Info

Publication number: CN112342298A
Application number: CN201910731563.0A
Authority: CN
Inventors: 唐中林; 刘思远; 杨亚岚; 姚一龙
Original assignee: Agricultural Genomics Institute at Shenzhen of CAAS
Current assignee: Shenzhen Institute Of Agricultural Genome Chinese Academy Of Agricultural Sciences Shenzhen Branch Of Guangdong Provincial Laboratory Of Lingnan Modern Agricultural Science And Technology
Priority date: 2019-08-08
Filing date: 2019-08-08
Publication date: 2021-02-09
Anticipated expiration: 2039-08-08
Also published as: CN112342298B

Abstract

本发明公开了一种与猪达100kg体重日龄相关的SNP标记，其中，所述SNP标记位于MYO18B基因内，包括位于猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46299640处的SNP标记，具有G/A多态性，该标记的基因型为GG的猪具有较低的达100kg体重日龄；和位于猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46512175处的SNP标记，具有T/C多态性，该标记的基因型为TT的猪具有较低的达100kg体重日龄。本发明所述与猪达100kg体重日龄相关的SNP标记的确定，可用于辅助选择达100kg体重日龄低的猪优势品种，缩短了育种周期，提高了育种效率和育种精度。

Description

与猪达100kg体重日龄相关的SNP标记、检测方法及应用

技术领域

本发明属于猪育种技术领域，具体涉及与猪达100kg体重日龄相关的SNP标记、检测方法及应用。

背景技术

我国是养猪大国，也是猪肉的主要消费国家，养猪业是国民经济的基础产业和农村经济的支柱产业，是我国畜牧业生产的重中之重。猪的生长是饲养以及生产过程中的关键，影响整个养猪业的经济效益。

猪的生产性能一直是饲养过程中的重要影响因素，直接关系到经济效益。猪达100kg体重日龄是一个重要的生产性状，该性状代表了猪饲养过程中的生长速度。为了提升猪的生产性能，加快猪遗传改良的速度，基因组选择技术愈来愈广泛应用到猪的育种中。1980-1996年间，通过遗传育种评估大白猪生长到100kg体重所需要的时间减少了大约23天，这大大降低了饲养和管理成本，间接提高了经济效益。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)标记是第三代分子标记，是指在基因组DNA序列上由单个碱基的突变而产生的一种多态性，这种突变包括单碱基的颠换、转换、插入和缺失。随着组学时代的到来，遗传学得到了巨大的发展和推进，发现了许多影响猪100kg体重背膘厚、30-100kg体重日增重和平均日采食量等猪生长性状相关的SNPs，还报道了大量的候选基因。为了提高育种效率，T.H,Meuwissen等利用第三代分子标记SNP估算每个QTL的效应，从而获得个体的全基因组估计育种值，并提出了全基因组选择育种(Genomic selection,GS)概念。但是，目前缺少功能明确、效应显著且可直接用于育种的与猪达100kg体重日龄相关的SNP标记。

因此，发掘一种与猪达100kg体重日龄相关的基因，并提供与猪达100kg体重日龄相关的SNP标记、该分子标记的鉴定及应用，对猪生产和育种具有重要意义。

发明内容

为了克服上述问题，本发明人进行了锐意研究，首次在猪MYO18B基因中发现了与猪达100kg体重日龄相关的SNP标记，丰富了影响猪生产性状的SNP位点，所述SNP标记用于辅助选择达100kg体重日龄低的猪优势品种，缩短了育种周期，提高了育种效率和育种精度，从而完成了本发明。

具体来说，本发明的目的在于提供以下方面：

第一方面，提供一种与猪达100kg体重日龄相关的SNP标记，其中，所述SNP标记位于MYO18B基因内，包括位于猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46299640处的SNP标记，具有G/A多态性；和

位于猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46512175处的SNP标记，具有T/C多态性。

第二方面，提供一种第一方面所述SNP标记的获取方法，其中，所述方法包括以下步骤:

步骤1，获取猪的基因组DNA；

步骤2，以步骤1获得的基因组DNA为模板，扩增含SNP标记的核苷酸片段；

步骤3，获得SNP标记并进行基因型判定；

步骤4，将SNP标记的基因型数据与猪达100kg体重日龄的表型数据进行关联分析，判定基因型对表型的影响效应。

第三方面，提供一种鉴定或辅助鉴定猪达100kg体重日龄的方法，所述方法包括确定猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46299640处SNP标记的基因型或确定猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46512175处SNP标记的基因型的步骤。

第四方面，提供一种第一方面所述SNP标记或第二方面所述方法获得的SNP标记在鉴定或辅助猪达100kg体重日龄方面的用途。

第五方面，提供一种第一方面所述SNP标记或第二方面所述方法获得的SNP标记在猪分子标记辅助育种方面的应用。

本发明所具有的有益效果包括：

(1)本发明提供的与猪达100kg体重日龄相关的SNP标记，在猪的遗传改良中，可以通过鉴定该SNP标记来选择猪达100kg体重日龄低的种猪个体，以提高种猪的产肉性能和养猪效益，具有重要的经济效益和社会价值；

(2)本发明提供的与猪达100kg体重日龄相关的SNP标记，可用于猪的早期选育，降低育种成本，缩短育种周期，促进猪的育种进程；

(3)本发明提供的鉴定或辅助鉴定猪达100kg体重日龄的方法，操作简单，鉴定准确；

(4)本发明提供的与猪达100kg体重日龄相关的SNP标记，为猪生产性状的分子标记辅助选择提供了科学依据。

具体实施方式

下面通过优选实施方式和实施例对本发明进一步详细说明。通过这些说明，本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。

在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

本发明人经过研究发现，MYO18B(Myosin-XVIIIB)基因是从人肺癌细胞染色体22q12区域中纯合子缺失区域分离出来的一种新的非典型肌球蛋白家族基因，其是候选肿瘤抑制基因，编码MYO18B蛋白。而MYO18B蛋白对于维持肌纤维的结构至关重要，主要在心肌和骨骼肌细胞中表达。作为非典型肌球蛋白，MYO18B和其它作为马达蛋白的肌球蛋白一样，可以将ATP水解产生的能量转化为细胞运动的动力，由于MYO18B蛋白在肌动蛋白微丝上有表达，肌球蛋白家族能与肌动蛋白细胞骨架蛋白相结合，MYO18B蛋白可能通过调节细胞运动和维持细胞结构来影响肿瘤的转移和进展。

基于上述原因，发明人认为MYO18B基因与动物骨骼肌细胞相关，会对猪骨骼肌生长发育和产肉性状产生影响。

因此，本发明中选择MYO18B基因作为目的基因，进而筛选该基因上与猪达100kg体重日龄相关的SNP标记。

本发明的第一方面，提供了一种与猪达100kg体重日龄相关的SNP标记，所述SNP标记位于MYO18B基因内，包括位于猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46299640(14号染色体第46299640位碱基)处的SNP标记和位于猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46512175(14号染色体第46512175位碱基)处的SNP标记。

其中，所述位于猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46299640处的SNP标记的NCBI参考编号为rs337368291，具有G/A多态性；

所述位于猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46512175处的SNP标记的NCBI参考编号为rs320713713，具有T/C多态性。

根据本发明一种优选的实施方式，所述位于猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46299640处的SNP标记对应于SEQ ID NO.1所示核苷酸片段一序列中的第451bp处，

所述位于猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46512175处的SNP标记对应于SEQID NO.2所示核苷酸片段二序列中的第250bp处。

根据本发明一种优选的实施方式，猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46299640处的SNP标记(rs337368291)的基因型为GG的猪相较于基因型为GA的猪有更低的达100kg体重日龄，即具有更快的生长速度。

猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46512175处的SNP标记(rs320713713)的基因型为TT的猪相较于基因型为CT的猪有更低的达100kg体重日龄，即具有更快的生长速度。

其中，GG基因型为猪该SNP标记位点的脱氧核糖核苷酸为G的纯合体，GA基因型为猪该SNP标记位点的脱氧核糖核苷酸为G和A的杂合体；TT基因型为猪该SNP标记位点的脱氧核糖核苷酸为T的纯合体，CT基因型为猪该SNP标记位点的脱氧核糖核苷酸为C和T的杂合体。

为获得与猪达100kg体重日龄相关的基因型类型，首先需要获得猪该SNP位点的基因分型信息。在本发明中，优选采用SequenomMassARRAY技术进行基因分型，该技术利用的是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术，其主要步骤为：首先PCR扩增目标序列，然后加入SNP序列特异延伸引物，在SNP位点上延伸1个碱基。将制备的样品分析物与芯片基质共结晶后在质谱仪的真空管经瞬时纳秒(10^-9s)强激光激发，核酸分子解吸附并转变为亚稳态离子，电场中离子飞行时间与离子质量成反比，通过飞行时间检测器检测核酸分子在真空管中的飞行时间而获得样品分析物的精确分子量，从而检测出SNP位点信息。

由上述可知，在对SNP位点进行基因分型的过程中，涉及PCR扩增反应和单碱基延伸反应。

根据本发明一种优选的实施方式，所述猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46299640处SNP标记的PCR扩增引物为P1和P2，所述P1和P2的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示；

猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46512175处SNP标记的PCR扩增引物为P3和P4，所述P3和P4的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

在进一步优选的实施方式中，猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46299640处SNP标记的单碱基延伸引物为P5、P6和P7，所述P5、P6和P7的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；

猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46512175处SNP标记的单碱基延伸引物为P8、P9和P10，所述P8、P9和P10的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12所示。

在本发明中，每个SNP标记的单碱基引物具有3条，分别为UEP、EXT1和EXT2，其中，UEP为延伸引物，EXT1和EXT2为针对位点不同基因型设计的检测引物。

根据本发明一种优选的实施方式，所述与猪达100kg体重日龄相关的SNP标记的基因分型采用基因分型试剂盒进行，

所述基因分型试剂盒包括PCR扩增引物和单碱基延伸引物。

其中，所述PCR扩增引物包括猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46299640处SNP标记的PCR扩增引物P1和P2；

或猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46512175处SNP标记的PCR扩增引物P3和P4。

所述单碱基延伸引物包括猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46299640处SNP标记的单碱基延伸引物P5、P6和P7；

或猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46512175处SNP标记的单碱基延伸引物P8、P9和P10。

在进一步优选的实施方式中，所述基因分型试剂盒还包括PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶、SAP缓冲液和SAP(碱性磷酸酶。

本发明的第二方面，提供了用于检测第一方面所述的与猪达100kg体重日龄相关的SNP标记的引物对，其中，

检测猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46299640处SNP位点的引物对为P1和P2，所述P1和P2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，

检测猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46512175处SNP位点的引物对为P3和P4，所述P3和P4的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

在本发明中，采用上述引物对待测个体的基因组DNA进行扩增，能够获得含有上述SNP标记位点的核苷酸片段(如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列)，进而能够判定相应SNP位点的碱基类型。

本发明的第三方面，提供了一种第一方面所述SNP标记的获取方法，所述方法包括以下步骤:

步骤1，获取猪的基因组DNA。

其中，采用现有技术中常用的方法或试剂盒提取猪的基因组DNA，优选采集实验群体的猪耳组织进行基因组DNA的提取。

步骤2，以步骤1获得的基因组DNA为模板，扩增含SNP标记的核苷酸片段。

在本发明中，优选采用引物对P1、P2(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示序列)和引物对P3、P4(SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示序列)对基因组DNA进行PCR扩增，分别获得含猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46299640处SNP标记的核苷酸片段和含猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46512175处SNP标记的核苷酸片段。

其中，上述引物对优选采用Sequenomgon公司的引物设计软件Assay design 3.1，参考猪MYO18B基因序列，综合考虑引物设计的各项原则设计得到。

根据本发明一种优选的实施方式，所述PCR扩增的体系包括10×PCR Buffer(15mMMgCl₂)、MgCl₂(25mM)、dNTP mix(25mM)、引物混合物(0.5μM)、Hotstar Taq(5U/μl)和水(HPLC grade)。

在进一步优选的实施方式中，所述PCR扩增的反应条件为：94℃900s；94℃20s，56℃30s，72℃60s，45个循环；72℃180s。

步骤3，获得SNP标记并进行基因型判定。

其中，对扩增得到的PCR产物进行Sanger测序分析，判定SNP标记位点的碱基类型。

进一步地，对获得的SNP标记位点进行基因型判定，所述判定包括以下步骤：

步骤3-1，对步骤2中得到的扩增产物进行碱性磷酸酶处理。

其中，对PCR扩增产物进行碱性磷酸酶(SAP)处理，是为了除去游离的dNTP和剩余扩增引物。

在本发明中，所述进行碱性磷酸酶处理的体系包括超纯水、10×SAP Buffer、SAP(1.7U/μl)。

将上述体系混匀、离心后加入PCR反应监测板中，置于PCR仪，反应条件为：37℃孵育40min使SAP酶充分发挥作用，85℃孵育5min使SAP酶失活，4℃维持。

步骤3-2，向步骤3-1处理后的产物中加入单碱基延伸引物，进行延伸反应。

其中，进行单碱基延伸反应能够检测单碱基或插入/缺失多态性。

在本发明中，所述基因分型优选采用基因分型试剂盒进行，如基因分型384孔试剂盒Complete iPLEX Gold Genotyping Reagent Set 384Kit。

所述单碱基延伸的体系包括超纯水、10×iPLEX Buffer plus、iPLEXterminator、引物混合物(0.6～1.3μM)和iPLEX酶。

所述单碱基延伸的反应条件为：94℃30s；94℃5s，(56℃5s，72℃5s，5个循环)，40个循环；72℃180s。

其中，所述猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46299640处SNP标记的单碱基延伸引物为P5、P6和P7(如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示序列)；猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46512175处SNP标记的单碱基延伸引物为P8、P9和P10(如SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示序列)。

步骤3-3，将延伸产物进行质谱检测，获得SNP标记在检测群体中的基因型。

在本发明中，将延伸引物稀释后，使用树脂进行脱盐，以降低质谱仪的背景噪声；然后将样品点在样品靶上，自然结晶，采用MassArray质谱仪进行质谱检测，收集数据，获得SNP标记的基因型。

步骤4，将SNP标记的基因型数据与猪生产性状关联分析，判定基因型对表型的影响效应。

在本发明中，优选采用PopGene 3.2计算SNP标记位点的基因型频率和等位基因频率，过滤掉只有一种基因型的单态SNP位点和等位基因频率＜1％的SNPs。同时，对群体进行哈迪温伯格平衡(Hardy-Weinberg)检验，以过滤掉偏离Hardy-Weinberg平衡的位点。

根据本发明一种优选的实施方式，采用R语言进行基因型与猪生产性状的关联分析，所述猪生产性状优选为猪达100kg体重日龄。

在进一步优选的实施方式中，所述关联分析采用的分析模型为：

Y_ijnkl＝u_i+G_j+B_k+D_l+e_ijkl

其中，Y_ijnkl为猪达100kg体重日龄；u_i代表平均值；G_j代表第j个SNP的基因型固定效应；B_k是第k个批次固定效应；D_l是协变量；e_ijkl为残差。

通过上述分析模型，能够获得与猪达100kg体重日龄显著相关的SNP标记，以及达100kg体重日龄低的基因型。

本发明的第四方面，提供了一种鉴定或辅助鉴定猪达100kg体重日龄的方法，所述方法包括确定猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46299640处SNP标记的基因型或确定猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46512175处SNP标记的基因型。

具体为：检测猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46299640处基因型为GG或为GA，根据基因型预测猪达100kg体重日龄的高低，其中，基因型为GG的猪相较于基因型为GA的猪具有更低的达100kg体重日龄，即具有更快的生长速度。

或者，检测猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46512175处基因型为CT或为TT，根据基因型预测猪达100kg体重日龄的高低，其中，基因型为TT的猪相较于基因型为CT的猪具有更低的达100kg体重日龄，即具有更快的生长速度。

猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46299640处基因型为GG的猪，以及猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46512175处基因型为TT的猪，具有更低的达100kg体重日龄，即具有更快的生长速度。

本发明的第五方面，提供了一种第一方面所述SNP标记或第三方面所述方法获得的SNP标记在鉴定或辅助猪达100kg体重日龄方面的用途。

本发明的第六方面，提供了一种第一方面所述SNP标记或第三方面所述方法获得的SNP标记在猪分子标记辅助育种方面的应用，所述应用包括以下步骤：

步骤I，提取待测猪的基因组DNA；

步骤II，检测待测猪的基因型；

步骤III，根据基因型选育达100kg体重日龄低的猪优势品种。

其中，步骤II中，优选采用Sequenom MassARRAY技术进行基因分型，分型过程中，采用P1和P2作为猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46299640处SNP位点的扩增引物，P5～P7作为单碱基延伸引物；采用P3和P4作为猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46512175处SNP位点的扩增引物，P8～P10作为单碱基延伸引物。

步骤III中，选择猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46299640处的基因型为GG的猪作为生长速度快(达100kg体重日龄低)的优势品种；或者

选择猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46512175处的基因型为TT的猪作为生长速度快(达100kg体重日龄低)的优势品种。

实施例

以下通过具体实例进一步描述本发明，不过这些实例仅仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1

1、试验动物来源

河北衡水种猪场的384头约克夏纯种猪，逐个采集猪耳组织样，置于75％的酒精中并于-20℃保存备用。

2、猪基因组DNA的提取与质量检测

采用天根生物科技公司组织DNA提取试剂盒进行提取，按照提取说明书操作：

(1)先在缓冲液GD和漂洗液PW中分别加入68mL和200mL无水乙醇，充分混匀；

(2)采集组织样约100mg置于2mL EP管内，完全剪碎后加200μL缓冲液GA，振荡至彻底悬浮；

(3)加入20μL蛋白酶K溶液，混匀后放在56℃金属浴中消化过夜，直至耳样组织溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠；

(4)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，放在70℃金属浴10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；

(5)加人200μL无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；

(6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，吸附柱放入收集管中，随后以12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；

(7)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

(8)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，以12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

(9)重复操作步骤(8)；

(10)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

(11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12,000rpm离心2min将溶液收集到离心管中；

(12)待DNA充分溶解后，吸取1μLDNA，用Nanodrop-100超微量分光光度计检测DNA浓度和OD260/OD280值，若OD260/OD280值大于1.9，表明有RNA污染；若OD260/OD280值小于1.6，则表明可能存在酚或蛋白污染；若OD260/OD280值≈1.8，则为纯DNA。

将检测质量符合要求的DNA统一稀释到50ng/μL，置于-20℃下保存备用。

3、SNP分型检测

采用基因分型384孔试剂盒Complete iPLEX Gold Genotyping Reagent Set384Kit进行分析检测。

(1)以提取的384个约克夏纯种猪的DNA为模板，分别用扩增引物对P1、P2，以及扩增引物对P3和P4进行PCR扩增，其中，P1～P4的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3～SEQ IDNO.6所示；

采用的PCR扩增体系为：

扩增的反应条件为：

94℃900s；94℃20s，56℃30s，72℃60s，45个循环；72℃180s；4℃维持。

(2)对PCR扩增产物进行SAP消化处理，采用的体系如下：

将上述体系混匀、离心后加入PCR反应监测板中，置于PCR仪，反应条件为：37℃孵育40min，85℃孵育5min，4℃维持。

(3)向消化处理后的体系中加入单碱基延伸引物，进行延伸反应，反应体系如下：

其中，猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46299640处SNP标记的单碱基延伸引物为P5、P6和P7(如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示序列)；猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46512175处SNP标记的单碱基延伸引物为P8、P9和P10(如SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示序列)。

单碱基延伸的反应条件为：94℃30s；94℃5s，(56℃5s，72℃5s，5个循环)，40个循环；72℃180s。

(4)将反应产物共9μL稀释3倍，实用树脂(SpectroCLEAN树脂)进行脱盐；将脱盐处理后的样品点在样品靶上，自然结晶；采用MassArray质谱仪进行质谱检测，收集数据，获得猪MYO18B基因SNP位点的基因型。

采用PopGene 3.2计算SNP标记位点的基因型频率和等位基因频率，结果如表1所示：

表1

对上述位点检测卡方适合性检验，显示2个位点在群体中均处于Hardy-Weinberg平衡状态。

由表1可知，在rs337368291位点检测到2个基因型：GG和GA(其中，rs337368291位点不包含AA型)，并且GG为优势基因型；在rs320713713位点检测到2个基因型：CT和TT(其中，rs320713713位点不包含CC型)，并且TT为优势基因型。

4、采用R语言对上述两个SNP标记位点的基因型对猪达100kg体重日龄的影响效应进行分析，采用的模型如下：

Y_ijnkl＝u_i+G_j+B_k+D_l+e_ijkl

关联分析结果如表2所示，其中，数据以基因型平均值±标准差表示，P值＜0.05代表差异显著。

表2

由表2可知，在rs337368291、rs320713713位点的两种基因型均与猪达100kg体重日龄显著相关(P<0.05)。其中在rs337368291突变个体中GA型个体达100kg体重日龄显著高于GG型(P<0.05)；在rs320713713突变个体中CT型个体达100kg体重日龄显著高于TT型个体。由此可见，在猪群体中，rs337368291位点的GG型、rs320713713位点的TT型个体均具有较快的生长速度，可以作为选择达100kg体重日龄优秀种猪的分子标记。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院深圳农业基因组研究所

<120> 与猪达100kg体重日龄相关的SNP标记、检测方法及应用

<130> 2019

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 902

<212> DNA

<213> 核苷酸片段一（Sus scrofa）

<400> 1

ccccaggaac tcctcatggc ccccaggcca gcaccgagga tgcatcccca aaggctgaga 60

agacccagac tgagggtctc agggatctgg gaactgtgcc actgacaaaa ggcgagaagg 120

atgaagtggg gaaagggggt ggggcccccc aaacccaagg ggtgaaaggg ggtgagcccc 180

agggcaaaga ggggccaggt gagggggggc agccagggac agtggagaaa gcgggagggg 240

acctttcaaa caaggtggcc aaggggaatc tctccaagga tgcagcaggt gaagggaagt 300

gggcgggagc ccaaacccag gtgagaaagt ggggagcttc cctgggcaga aggagcaagt 360

gggaaggtcc ccagagtagg aaggacaaag aaggggtcct aagtcaggca gacaagacac 420

acggacttca gagcaaggca gagaaggcgg gcgcagtgca gggaaagggt ggaaagttgg 480

gggaggctcc ccgagccgtg gagaaagcag gtgagcggca gagcttgact ggaaaggcag 540

gtgagcccca gggtgaggtg ggaaaggtgg ggcaagctca gagtgagtct tggggaggca 600

ggtaaagcca ggagtaagac agagaagggc tctaaagctc ccaaggaggt ggatgcacat 660

gagcagcccc gggcagcaac cggcaaggag gacaaggcgg ggagcagaga gcaggaagca 720

gaagggacct gcactagagc aggtgatggg gccagggccc taggggtgga gccagaagga 780

ccaaggcagc ctggtctgga gagccctgcg ggaaggcagc aggggcagga ggagagccct 840

gcggagaggc tgcaggaggc gagcagagga ggccagagtg cagtcttgga ccaggtgagg 900

gg 902

<210> 2

<211> 501

<212> DNA

<213> 核苷酸片段二（Sus scrofa）

<400> 2

atgggggacc ccctggacag cgacccgttc agctggaagc tcccaagcct caactacgaa 60

cgtaaaacca aagtggattt tgatgacttc ctccctgcca tccggaagcc cgagactccc 120

acgtccttgg ccggagctgc caaagatggg cgagacagtt cacagcattc aagcgtccac 180

tttgagacag aagaggccga caggggcttt ctgtcaggga taaccaccat tttgaaaaag 240

agcccagagc tcaaggagga ccccgctcac ttctctgact catcctcctc ctccagctcc 300

atcgtgtctt tcaaaagcgc tgacagcatc aagagtcggc cgagaatccc ccgagtggag 360

ggcgatggtg gggagcaaac gtccctggag aacagagagc tgggagcaag gaggaaagac 420

gaggatgttg agagcatcat gaagaaatac ctgcagaagt aggaaccagc tcaggtacaa 480

gcagcaggct gggaccatgc c 501

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 扩增引物P1（人工序列）

<400> 3

acgttggatg aagtcaggca gacaagacac 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 扩增引物P2（人工序列）

<400> 4

acgttggatg aactttccac cctttccctg 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 扩增引物P3（人工序列）

<400> 5

acgttggatg gatgagtcag agaagtgagc 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 扩增引物P4（人工序列）

<400> 6

acgttggatg ggctttctgt cagggataac 30

<210> 7

<211> 15

<212> DNA

<213> 单碱基延伸引物P5（人工序列）

<400> 7

tttccctgca ctgcg 15

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> 单碱基延伸引物P6（人工序列）

<400> 8

tttccctgca ctgcgc 16

<210> 9

<211> 16

<212> DNA

<213> 单碱基延伸引物P7（人工序列）

<400> 9

tttccctgca ctgcgt 16

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 单碱基延伸引物P8（人工序列）

<400> 10

cattttgaaa aagagcccag agc 23

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 单碱基延伸引物P9（人工序列）

<400> 11

cattttgaaa aagagcccag agcc 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 单碱基延伸引物P10（人工序列）

<400> 12

cattttgaaa aagagcccag agct 24

Claims

1.一种与猪达100kg体重日龄相关的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记位于MYO18B基因内，包括位于猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46299640处的SNP标记，具有G/A多态性；和

2.根据权利要求1所述的SNP标记，其特征在于，所述位于猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46299640处SNP标记的基因型为GG的猪具有较低的达100kg体重日龄；

所述位于猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46512175处SNP标记的基因型为TT的猪具有较低的达100kg体重日龄。

3.根据权利要求2所述的SNP标记，其特征在于，用以检测所述SNP标记基因型的方法中涉及PCR扩增反应和单碱基延伸反应，其中，

猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46299640处SNP标记的PCR扩增引物为P1和P2，所述P1和P2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；

4.根据权利要求3所述的SNP标记，其特征在于，猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46299640处SNP标记的单碱基延伸引物为P5、P6和P7，所述P5、P6和P7的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；

猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46512175处SNP标记的单碱基延伸引物为P8、P9和P10，所述P8、P9和P10的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。

5.一种权利要求1至4之一所述SNP标记的获取方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤:

步骤1，获取猪的基因组DNA；

步骤3，获得SNP标记并进行基因型判定；

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3包括以下子步骤：

步骤3-1，对步骤2中得到的扩增产物进行碱性磷酸酶处理；

步骤3-2，向步骤3-1处理后的产物中加入单碱基延伸引物，进行延伸反应；

7.一种鉴定或辅助鉴定猪达100kg体重日龄的方法，其特征在于，所述方法包括确定猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46299640处SNP标记的基因型或确定猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr 14：46512175处SNP标记的基因型的步骤。

8.一种权利要求1至4之一所述SNP标记或权利要求5或6所述方法获得的SNP标记在鉴定或辅助猪达100kg体重日龄方面的用途。

9.一种权利要求1至4之一所述SNP标记或权利要求5或6所述方法获得的SNP标记在猪分子标记辅助育种方面的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：

步骤I，提取待测猪的基因组DNA；

步骤II，检测待测猪的基因型；

步骤III，根据基因型选育达100kg体重日龄低的猪优势品种。