CN113322329B

CN113322329B - 一种用于全集成微流控芯片的dip快速扩增检测试剂及其应用

Info

Publication number: CN113322329B
Application number: CN202110526224.6A
Authority: CN
Inventors: 李彩霞; 韩俊萍; 赵蕾
Original assignee: Institute of Forensic Science Ministry of Public Security PRC
Current assignee: Institute of Forensic Science Ministry of Public Security PRC
Priority date: 2021-05-14
Filing date: 2021-05-14
Publication date: 2023-03-14
Anticipated expiration: 2041-05-14
Also published as: CN113322329A

Abstract

本发明公开了一种用于全集成微流控芯片的DIP快速扩增检测试剂及其应用。本发明基于国内首台自主研发的全集成式DNA现场快速检验仪器Quick TargSeq，构建了一套包含40个位点的可用于全集成微流控芯片的DIP快速扩增试剂，该试剂既可用于族群推断，也可用于个体识别。通过实验证明：该扩增试剂采用冻干方式可在微流控芯片卡盒中长期储存，对口腔拭子、血卡、唾液卡等样本可在90min内完成细胞裂解、PCR扩增、电泳分离全部流程，实现“样本进‑结果出”式快速自动化InDel分型，与传统实验室方法相比，结果准确可靠，操作步骤简化，污染风险降低，能够通过未知样本快速一体化的DNA检测为案件提供侦查线索。

Description

一种用于全集成微流控芯片的DIP快速扩增检测试剂及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于全集成微流控芯片的DIP快速扩增检测试剂及其应用。

背景技术

法医DNA检验中常用的短串联重复序列(STR)遗传标记可实现个体识别，但STR的突变率高，检测片段长，对降解检材无法检测，同时对于STR分型入库无比中，无目标嫌疑人，也没有其他线索的某些案件，STR分型则无法发挥作用。插入/缺失多态性(insertion-deletion polymorphism，InDel)在基因组中含量广泛，由于其结合了SNPs和STRs的有利特征：突变率较低且相当稳定、表现为二等位基因，本质上仍属于长度多态性遗传标记，可通过常规PCR-CE实现检测，利用该遗传标记，可以检测降解DNA用于个体识别，也可以获取族群信息，以进一步缩小侦查范围。

传统的DNA检验技术包括DNA提取、DNA定量、PCR扩增、毛细管电泳检测，整个过程耗时耗力，且对人员技能和设备要求较高。自20世纪90年代逐渐兴起的微流控芯片技术，由于其具有体积小、样本和试剂消耗少、分析成本低、分析速度快、易于实现操作流程集成化和自动化等诸多优势，已广泛应用于各个领域，也为实现法医DNA分析检测的快速、便携、自动化、集成化开辟了一条新途径。目前，已有诸多学者基于微流控芯片技术，对快速DNA检验开展了研究，例如微流控芯片PCR技术、微流控芯片电泳技术、集成式芯片技术等。在此基础上，一系列DNA快速检验仪器也相继研发生产并得到应用。目前国外的快检仪主要有：

200、单通道的

ID和ANDE^TM6C，以上几款快检仪均是配套使用STR试剂盒以进行个体识别，尚未有报道将族群推断体系用于快检设备。

发明内容

本发明的一个目的是提供用于检测人基因组中40个位点的引物对组；所述40个位点由38个InDel位点、1个性别位点AMEL和1个Y染色体上的DYS439位点组成；

所述38个InDel位点分别为：rs3054057、rs6481、rs1160852、rs145415095、rs2308036、rs10656283、rs35851958、rs2308101、rs16416、rs1610878、rs140847、rs60422579、rs5900168、rs33948716、rs1555809480、rs5877023、rs2307998、rs2307930、rs3831551、rs3045215、rs16715、rs5789229、rs1610859、rs1160953、rs2308116、rs67071679、rs3083306、rs71425754、rs2307832、rs34122827、rs2308067、rs140708、rs16711、rs3071043、rs3991155、rs112109748、rs3031245和rs1610963。

上述引物对组由如下(1)-(40)组成：

(1)用于检测rs3054057的引物对1，由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成；

(2)用于检测rs6481的引物对2，由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成；

(3)用于检测rs1160852的引物对3，由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成；

(4)用于检测rs145415095的引物对4，由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成；

(5)用于检测rs2308036的引物对5，由序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA组成；

(6)用于检测rs10656283的引物对6，由序列表中序列11和序列12所示的两条单链DNA组成；

(7)用于检测rs35851958的引物对7，由序列表中序列13和序列14所示的两条单链DNA组成；

(8)用于检测rs2308101的引物对8，由序列表中序列15和序列16所示的两条单链DNA组成；

(9)用于检测rs16416的引物对9，由序列表中序列17和序列18所示的两条单链DNA组成；

(10)用于检测rs1610878的引物对10，由序列表中序列19和序列20所示的两条单链DNA组成；

(11)用于检测rs140847的引物对11，由序列表中序列21和序列22所示的两条单链DNA组成；

(12)用于检测rs60422579的引物对12，由序列表中序列23和序列24所示的两条单链DNA组成；

(13)用于检测rs5900168的引物对13，由序列表中序列25和序列26所示的两条单链DNA组成；

(14)用于检测rs33948716的引物对14，由序列表中序列27和序列28所示的两条单链DNA组成；

(15)用于检测rs1555809480的引物对15，由序列表中序列29和序列30所示的两条单链DNA组成；

(16)用于检测rs5877023的引物对16，由序列表中序列31和序列32所示的两条单链DNA组成；

(17)用于检测rs2307998的引物对17，由序列表中序列33和序列34所示的两条单链DNA组成；

(18)用于检测rs2307930的引物对18，由序列表中序列35和序列36所示的两条单链DNA组成；

(19)用于检测rs3831551的引物对19，由序列表中序列37和序列38所示的两条单链DNA组成；

(20)用于检测rs3045215的引物对20，由序列表中序列39和序列40所示的两条单链DNA组成；

(21)用于检测rs16715的引物对21，由序列表中序列41和序列42所示的两条单链DNA组成；

(22)用于检测rs5789229的引物对22，由序列表中序列43和序列44所示的两条单链DNA组成；

(23)用于检测rs1610859的引物对23，由序列表中序列45和序列46所示的两条单链DNA组成；

(24)用于检测rs1160953的引物对24，由序列表中序列47和序列48所示的两条单链DNA组成；

(25)用于检测rs2308116的引物对25，由序列表中序列49和序列50所示的两条单链DNA组成；

(26)用于检测rs67071679的引物对26，由序列表中序列51和序列52所示的两条单链DNA组成；

(27)用于检测rs3083306的引物对27，由序列表中序列53和序列54所示的两条单链DNA组成；

(28)用于检测rs71425754的引物对28，由序列表中序列55和序列56所示的两条单链DNA组成；

(29)用于检测rs2307832的引物对29，由序列表中序列57和序列58所示的两条单链DNA组成；

(30)用于检测rs34122827的引物对30，由序列表中序列59和序列60所示的两条单链DNA组成；

(31)用于检测rs2308067的引物对31，由序列表中序列61和序列62所示的两条单链DNA组成；

(32)用于检测rs140708的引物对32，由序列表中序列63和序列64所示的两条单链DNA组成；

(33)用于检测rs16711的引物对33，由序列表中序列65和序列66所示的两条单链DNA组成；

(34)用于检测rs3071043的引物对34，由序列表中序列67和序列68所示的两条单链DNA组成；

(35)用于检测rs3991155的引物对35，由序列表中序列69和序列70所示的两条单链DNA组成；

(36)用于检测rs112109748的引物对36，由序列表中序列71和序列72所示的两条单链DNA组成。

(37)用于检测rs3031245的引物对37，由序列表中序列73和序列74所示的两条单链DNA组成；

(38)用于检测rs1610963的引物对38，由序列表中序列75和序列76所示的两条单链DNA组成；

(39)用于检测AMEL位点的引物对39，由序列表中序列77和序列78所示的两条单链DNA组成；

(40)用于检测DYS439位点的引物对40，由序列表中序列79和序列80所示的两条单链DNA组成。

进一步的，所述引物对组中，所述引物对1、所述引物对2、所述引物对3、所述引物对4、所述引物对5、所述引物对6、所述引物对7、所述引物对8、所述引物对9、所述引物对10、所述引物对11、所述引物对12、所述引物对13、所述引物对14、所述引物对15、所述引物对16、所述引物对17、所述引物对18、所述引物对19、所述引物对20、所述引物对21、所述引物对22、所述引物对23、所述引物对24、所述引物对25、所述引物对26、所述引物对27、所述引物对28、所述引物对29、所述引物对30、所述引物对31、所述引物对32、所述引物对33、所述引物对34、所述引物对35、所述引物对36、所述引物对37、所述引物对38、所述引物对39和所述引物对40的摩尔比为0.53：0.33：0.27：0.45：0.5：0.67：0.33：0.67：0.33：0.9：0.76：0.57：0.28：0.27：0.67：1：1：1：0.57：0.67：0.77：0.27：0.67：0.53：0.67：0.83：0.67：0.53：0.67：0.93：0.67：0.67：0.67：0.67：1：0.67：0.67：0.67：0.67：0.67；每个引物对中两条引物的摩尔比均为1：1。

本发明的另一个目的是提供用于检测人基因组中上述40个位点的扩增试剂。

所述扩增试剂包括引物混合液和扩增预混液；

所述引物混合液包括上述引物对组；

所述扩增预混液包括扩增所需的酶、原料和缓冲液。

进一步的，所述扩增试剂为冻干扩增试剂；所述冻干扩增试剂的制备方法包括如下步骤：

1)将含有海藻糖和葡聚糖的溶液作为冻干辅料与所述扩增预混液混匀，得到液体试剂甲；

将甘露醇溶液和海藻糖溶液的混合液作为冻干辅料与所述引物混合液混匀，得到液体试剂乙；

2)将所述液体试剂甲和所述液体试剂乙均进行冷冻干燥，分别得到冻干小球，即为冻干扩增试剂。

所述冻干扩增试剂可储存于全集成芯片卡盒中。

更进一步的，所述1)中，所述含有海藻糖和葡聚糖的溶液由海藻糖、葡聚糖和水(去离子水)混匀得到，所述海藻糖在所述溶液中的质量分数为20％，所述葡聚糖在所述溶液中的质量分数为10％；

所述含有海藻糖和葡聚糖的溶液与所述扩增预混液按照体积比为2：3的比例混匀；

所述甘露醇溶液和海藻糖溶液的混合液由质量分数为15％的甘露醇溶液与质量分数为15％的海藻糖溶液按照体积比为8：1的比例混匀得到；

所述甘露醇溶液和海藻糖溶液的混合液与所述引物混合液按照体积比为1：1的比例混匀。

所述2)中，所述冷冻干燥的程序如下：预冻：-55℃30min；升华干燥：-45℃240min，-35℃360min，-25℃240min；解析干燥：20℃360min；保温：4℃。

在本发明的具体实施例中，所述扩增预混液为2.5×S10 PCR Mix，是苏州新海生物科技股份有限公司的产品。所述引物混合液由上述40个引物对和TE组成，所述引物对1、所述引物对2、所述引物对3、所述引物对4、所述引物对5、所述引物对6、所述引物对7、所述引物对8、所述引物对9、所述引物对10、所述引物对11、所述引物对12、所述引物对13、所述引物对14、所述引物对15、所述引物对16、所述引物对17、所述引物对18、所述引物对19、所述引物对20、所述引物对21、所述引物对22、所述引物对23、所述引物对24、所述引物对25、所述引物对26、所述引物对27、所述引物对28、所述引物对29、所述引物对30、所述引物对31、所述引物对32、所述引物对33、所述引物对34、所述引物对35、所述引物对36、所述引物对37、所述引物对38、所述引物对39和所述引物对40在所述引物混合液中的终浓度分别为0.53μM、0.33μM、0.27μM、0.45μM、0.5μM、0.67μM、0.33μM、0.67μM、0.33μM、0.9μM、0.76μM、0.57μM、0.28μM、0.27μM、0.67μM、1μM、1μM、1μM、0.57μM、0.67μM、0.77μM、0.27μM、0.67μM、0.53μM、0.67μM、0.83μM、0.67μM、0.53μM、0.67μM、0.93μM、0.67μM、0.67μM、0.67μM、0.67μM、1μM、0.67μM、0.67μM、0.67μM、0.67μM和0.67μM，每个引物对中的两条引物在所述引物混合液中的终浓度相同。

本发明又有一个目的是提供用于检测人基因组中上述40个位点的试剂盒；所述试剂盒包括上述引物对组和上述扩增试剂。

进一步的，所述试剂盒还可包括如下试剂：直扩处理液Ⅰ和直扩处理液Ⅱ。

更进一步的，所述试剂盒还可包括甲酰胺与AS 250内标混合液(二者体积比2：1)。

本发明还有一个目的是提供用于检测人基因组中上述40个位点的成套系统；所述成套系统包括全集成式DNA现场快速检验仪器Quick TargSeq和与其配套使用的上述扩增试剂。

本发明的最后一个目的是提供用于检测人基因组中上述40个位点的物质的新用途。

本发明提供了用于检测人基因组中上述40个位点的物质在如下任一种中的应用：

(a)InDel分型；

(b)族群推断；

(c)个体识别。

上述应用中，所述用于检测人基因组中上述40个位点的物质包括上述引物对组或上述扩增试剂或上述试剂盒或上述成套系统。

在上述族群推断的应用中，基于全集成式DNA现场快速检验仪器Quick TargSeq使用上述引物对组或上述扩增试剂或上述试剂盒对待测样本进行全集成检测，得到InDel分型；然后基于已建立的人群db参考库，使用自主开发的种族推断软件DAA v1.0计算待测样本的祖先成分比例、群体匹配概率(Population assignment match probability，AMP)和似然比(Likelihood ratio，LR)，综合分析AMP值和祖先成分进行最终判断，当LR＞100时，AMP值排第一位的族群为未知个体的来源族群，当LR≤100时，AMP的前两位族群均不排除。所述待测样本包括口腔拭子样本、血卡样本和唾液卡样本。

在上述个体识别的应用中，基于全集成式DNA现场快速检验仪器Quick TargSeq使用上述引物对组或上述扩增试剂或上述试剂盒对待测样本进行全集成检测，得到InDel分型，根据InDel分型结果即可进行个体识别。所述待测样本包括口腔拭子样本、血卡样本和唾液卡样本。

本发明的冻干扩增试剂具有如下优点：首先，方便保存与运输，可以4℃保存，冰袋运输(短期甚至可以常温运输)，简化了运输方式；如果是相应的液体试剂，则需要-20℃保存。其次，性能稳定，不需低温保存盒或冰盒；常规做液体PCR时，DNA聚合酶是最后加入，且需要-20℃保存，对温度比较敏感，而本发明中的冻干小球就不存在这一问题，即使温度波动，性质也稳定，不需冰盒，操作时直接拿出，并可稳定存储在全集成芯片卡盒内。

本发明基于国内首台自主研发的全集成式DNA现场快速检验仪器Quick TargSeq，构建了一套包含38个InDel位点、1个Y-STR位点和1个Amelo性别鉴定位点的可用于全集成微流控芯片的DIP(Deletion-insertion polymorphism)快速扩增试剂—AIDIP38，该试剂既可用于族群推断，也可用于个体识别。通过实验证明：该AIDIP38扩增试剂采用冻干方式可在微流控芯片卡盒中长期储存，对口腔拭子、血卡、唾液卡等样本可在90min内完成细胞裂解、PCR扩增、电泳分离全部流程，实现“样本进-结果出”式快速自动化InDel分型，与传统实验室方法相比，结果准确可靠，同时简化了操作步骤，降低了污染风险，能够通过未知样本快速一体化的DNA检测为案件提供侦查线索。

附图说明

图1为AIDIP38芯片扩增试剂体系的位点排布图。

图2为冻干小球。(A)冻干成形较差的小球。(B)冻干成形较好的小球。

图3为AIDIP38芯片扩增试剂。(A)冻干前(液体)，左侧为Primer Mix，右侧为S10PCR Mix。(B)冻干后(固体)，左侧白色小球为S10 PCR Mix，右侧粉色小球为Primer Mix。

图4为AIDIP38芯片扩增试剂的分型比较。(A)液体试剂分型。(B)冻干试剂分型。

图5为某一口腔拭子样本在常规实验室PCR-CE平台和在快检仪的全集成检测结果。(A)某一口腔拭子在常规实验室PCR-CE平台的检测结果。(B)同一口腔拭子在快检仪的全集成检测结果。

图6为口腔拭子刮取次数灵敏度测试结果。

图7为不同刮取次数口腔拭子的检测结果。A：等位基因检出率；B：杂合子峰高比值。

图8为某一口腔拭子样本的全集成检测结果。

图9为某一血卡样本的全集成检测结果。

图10为某一唾液卡样本的全集成检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、引物的设计及AIDIP38芯片扩增体系的构建

一、引物设计与合成

本发明参考相关文献报道和dbSNP库，筛选得到38个InDel位点(各位点信息如表1所示)。采用Primer premier 5.0根据上述筛选得到的38个InDel位点，及1个性别位点AMEL与1个Y染色体上的位点DYS439设计和优化引物序列，并采用FAM、HEX、FRET-TAMRA和FRET-ROX在每个位点的正向引物F的5’端进行荧光素标记。最终得到针对每个位点设计的引物序列，所有引物序列均由苏州新海生物科技股份有限公司合成和标记。引物序列和荧光标记的具体信息见表2，位点排布见图1。

表1、各位点信息

表2、引物信息表

二、AIDIP38芯片扩增试剂的构建及制备

本发明基于国内首台自主研发的全集成式DNA现场快速检验仪器Quick TargSeq，构建了一套包含38个InDel位点、1个Y-STR位点和1个Amelo性别鉴定位点的微流控芯片快速扩增检测试剂—AIDIP38(简称AIDIP38扩增试剂)。AIDIP38扩增试剂分为AIDIP38液体扩增试剂和AIDIP38冻干扩增试剂。

1、AIDIP38液体扩增试剂

AIDIP38液体扩增试剂由2.5×S10 PCR Mix(苏州新海生物科技股份有限公司，货号为NH9345)和5×Primer Mix组成。5×Primer Mix由表2中的40个引物对和TE(溶剂为TE)组成，每个引物对在5×Primer Mix中的终浓度分别为rs3054057(0.53μM)、rs6481(0.33μM)、rs1160852(0.27μM)、rs145415095(0.45μM)、rs2308036(0.5μM)、rs10656283(0.67μM)、rs35851958(0.33μM)、rs2308101(0.67μM)、rs16416(0.33μM)、rs1610878(0.9μM)、rs140847(0.76μM)、rs60422579(0.57μM)、rs5900168(0.28μM)、rs33948716(0.27μM)、rs1555809480(0.67μM)、rs5877023(1μM)、rs2307998(1μM)、rs2307930(1μM)、rs3831551(0.57μM)、rs3045215(0.67μM)、rs16715(0.77μM)、rs5789229(0.27μM)、rs1610859(0.67μM)、rs1160953(0.53μM)、rs2308116(0.67μM)、rs67071679(0.83μM)、rs3083306(0.67μM)、rs71425754(0.53μM)、rs2307832(0.67μM)、rs34122827(0.93μM)、rs2308067(0.67μM)、rs140708(0.67μM)、rs16711(0.67μM)、rs3071043(0.67μM)、rs3991155(1μM)、rs112109748(0.67μM)、rs3031245(0.67μM)、rs1610963(0.67μM)、AMEL(0.67μM)、DYS439(0.67μM)。每个引物对中的两条引物在5×Primer Mix中的终浓度相同。

2、AIDIP38冻干扩增试剂

采用真空冷冻干燥(简称冻干)的方式对AIDIP38液体扩增试剂进行芯片存储，得到AIDIP38冻干扩增试剂。具体冻干方法如下：

1)冻干辅料的筛选

为达到更好的冻干效果，对含DNA聚合酶的PCR Mix和Primer Mix拟采用不同种类的保护剂(减少酶等蛋白质物质在冻干过程中受到的损害，以保证冻干试剂的活性)和赋形剂(使冻干试剂具有一定的硬度和韧性，以保证冻干试剂有一个较好的骨架结构便于转移)，即冻干辅料进行冻干实验，分别筛选效果最好的冻干辅料。

对含DNA聚合酶的PCR Mix的冻干辅料共设置五个实验组，分别编号为Mix1～Mix5，具体如下：

Mix1：将海藻糖、葡聚糖和去离子水混匀，得到含有20％(质量分数)海藻糖和10％(质量分数)葡聚糖的混合溶液；

Mix2：将海藻糖、葡聚糖、BSA和去离子水混匀，得到含有20％(质量分数)海藻糖、10％(质量分数)葡聚糖和5％(质量分数)BSA的混合溶液；

Mix3：将海藻糖、葡聚糖和去离子水混匀，得到含有10％(质量分数)海藻糖和12％(质量分数)葡聚糖的混合溶液；

Mix4：将海藻糖、葡聚糖、PVP和去离子水混匀，得到含有10％(质量分数)海藻糖、15％(质量分数)葡聚糖和5％(质量分数)PVP的混合溶液；

Mix5：将海藻糖、葡聚糖和去离子水混匀，得到含有15％(质量分数)海藻糖和15％(质量分数)葡聚糖的混合溶液。

分别将上述五组获得的混合溶液作为PCR Mix的冻干辅料与2.5×S10 PCR Mix按照体积比为2：3的比例混匀，得到液体试剂1-5。

对Primer Mix的冻干辅料共设置七个实验组，分别编号为Primer1～Primer 7，具体如下：

Primer1：将质量分数为15％的甘露醇溶液(溶剂为去离子水)、质量分数为15％的海藻糖溶液(溶剂为去离子水)与质量分数为15％的BSA溶液(溶剂为去离子水)按照体积比为1:1:1的比例混匀，得到混合溶液；

Primer2：将质量分数为15％的甘露醇溶液(溶剂为去离子水)与质量分数为15％的海藻糖溶液(溶剂为去离子水)按照体积比为1：1的比例混匀，得到混合溶液；

Primer3：将质量分数为15％的甘露醇溶液(溶剂为去离子水)与质量分数为15％的海藻糖溶液(溶剂为去离子水)按照体积比为2：1的比例混匀，得到混合溶液；

Primer4：将质量分数为15％的甘露醇溶液(溶剂为去离子水)与质量分数为15％的海藻糖溶液(溶剂为去离子水)按照体积比为4：1的比例混匀，得到混合溶液；

Primer5：将质量分数为15％的甘露醇溶液(溶剂为去离子水)与质量分数为15％的海藻糖溶液(溶剂为去离子水)按照体积比为6：1的比例混匀，得到混合溶液；

Primer6：将质量分数为15％的甘露醇溶液(溶剂为去离子水)与质量分数为15％的海藻糖溶液(溶剂为去离子水)按照体积比为8：1的比例混匀，得到混合溶液；

Primer7：将质量分数为15％的甘露醇溶液(溶剂为去离子水)、质量分数为15％的海藻糖溶液(溶剂为去离子水)与质量分数为15％的BSA溶液(溶剂为去离子水)按照体积比为8:1:1的比例混匀，得到混合溶液。

分别将上述七组混合溶液作为Primer Mix冻干辅料与5×Primer Mix按照体积比为1：1的比例混匀，得到液体试剂6-12。

分别将液体试剂1-12冻干成小球，利用0.4ng/μL的K562标准DNA溶液60μL分别复溶不同比例冻干的小球，比较其冻干成形状况、速溶性、快速复水性以及扩增效果。

结果发现，Mix2、Mix4、Primer1～Primer3、Primer 7小球无法成型或成型差，Mix5、Primer 4成型尚可但超过48小时小球粘连无法使用，Mix1、Mix3、Primer5和Primer6成型较好。冻干小球的状态如图2所示。

采用正交实验法，利用这4种成型较好的小球，使用0.4ng/μL的9947A标准DNA溶液60μL分别复溶(4个PCR Mix小球+2个Primer Mix小球)，放于扩增芯片上进行芯片PCR，对比复溶效果和扩增效果，结果发现Mix1和Primer6组合的小球可快速复溶且扩增效果最好，即最终筛选出PCR Mix的冻干辅料为20％海藻糖与10％葡聚糖，Primer Mix的冻干辅料为15％甘露醇与15％海藻糖(体积比8:1)。

2)冻干小球的制备

将海藻糖、葡聚糖和去离子水混匀，得到含有20％(质量分数)海藻糖和10％(质量分数)的混合溶液，然后将该混合溶液作为PCR Mix的冻干辅料与2.5×S10 PCR Mix按照体积比为2：3的比例混匀，得到液体试剂甲。

将质量分数为15％的甘露醇溶液(溶剂为去离子水)与质量分数为15％的海藻糖溶液(溶剂为去离子水)按照体积比为8：1的比例混匀，得到混合溶液，然后将该混合溶液作为5×Primer Mix冻干辅料与5×Primer Mix按照体积比为1：1的比例混匀，得到液体试剂乙。

分别将液体试剂甲和液体试剂乙按照如下方法进行冻干：取大小为10cm×10cm不锈钢块作为冻干点样板，冻干开始前将其放于液氮中预冷30min，取出后使用10μL移液器悬空向点样板上滴加液体试剂，试剂触板后凝结成球状，然后将点样板放入真空冷冻干燥机(博医康Pilot3-6E真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司)，冻干工艺流程的设定如表3所示，开始冻干，全过程真空度＜60Pa。

表3、冻干工艺流程

3)AIDIP38冻干扩增试剂的成型效果

图3展示了AIDIP38液体扩增试剂冻干前后对比图，可以看到冻干小球外形饱满，表面较平整不萎缩、色泽均匀、多孔性良好。冻干后的小球平均直径大小为2mm。

实施例2、AIDIP38扩增试剂的应用

一、实验材料与方法

1、实验材料

1)实验样本

由志愿者提供的血卡样本2份、唾液卡样本2份、口腔拭子样本4份。具体制备方法如下：

口腔拭子样本：使用采样拭子在志愿者左右两颊粘膜各刮擦8次。

血卡样本：取志愿者指尖血2滴，每滴直径约为1cm，滴于采血卡标记圈内。

唾液卡样本：取志愿者左右两颊粘膜擦拭物，转移至唾液卡上，以上样本采集后阴干备用。

DNA标准品9947A(初始质量浓度为10ng/μL)是美国Thermo Fisher Scientific公司的产品。

2)实验仪器

Quick TargSeq全集成式DNA现场快速检验仪和全集成芯片卡盒由北京博奥生物技术有限公司提供。

2、实验方法

1)全集成芯片卡盒制备

在扩增芯片样本处理池中预埋AIDIP38冻干扩增试剂，包括4个PCR Mix冻干小球和2个Primer Mix冻干小球；同时将6μL甲酰胺与AS 250内标混合液(二者体积比2：1)埋于电泳芯片进样孔槽下方，将55μL 5×TTE至于芯片各缓冲液孔，并用铝箔封装，组装卡盒后备用。

2)加样

在1.5mL离心管中加入200μL直扩处理液Ⅰ(苏州新海生物科技股份有限公司，货号为NH9866)，放入1枚口腔拭子，或4片直径2mm圆形血卡/唾液卡，晃动5～10次，洗脱口腔上皮细胞或血细胞，然后取20μL上述直扩处理液Ⅰ与30μL直扩处理液Ⅱ(苏州新海生物科技股份有限公司，货号为NH9867)混合，加样至样本处理池复溶冻干试剂。

3)全集成检测

将全集成芯片卡盒插入Quick TargSeq DNA现场快速检验仪进样仓，输入样本信息，选择预先设定的程序，点击运行键后，仪器自动完成样本裂解、PCR扩增、电泳分离全部流程。全集成主要流程及各流程重要参数如下：

样本裂解：提取进液至扩增芯片，95℃裂解10min。

PCR扩增：裂解完成后开始扩增，热循环参数为95℃10min；95℃10s，58℃1min，28个循环；62℃15min。

电泳分离：PCR扩增产物出液，开始电泳，进样电压480V，进样时间180s；分离电压4600V，分离时间900s；电泳温度59℃。

收集数据，使用配套软件BioStrGenotyping v2.0对结果进行分析。

二、冻干试剂扩增效果检测

使用10ng/μL DNA标准品9947A测试AIDIP38冻干扩增试剂的扩增效果，并与AIDIP38液体扩增试剂进行比较。全集成检测操作步骤参照步骤一中的2。

冻干扩增试剂复溶液体积为50μL，由4个PCR Mix冻干小球、2个Primer Mix冻干小球、30μL直扩处理液Ⅱ，2μL 9947A和18μL去离子灭菌水组成。

液体扩增试剂体系(50μL)由20μL S10 PCR Mix，10μL Primer Mix，2μL 9947A和18μL去离子灭菌水组成。

设置等位基因峰高≥200RFU为分析阈值。

结果显示，以DNA标准品9947A为模板，AIDIP38液体扩增试剂和冻干扩增试剂均可获得完整分型，分型图见图4。与AIDIP38液体扩增试剂相比，冻干扩增试剂分型图中等位基因峰高较低(RFU值)，但不影响分型判断。整体来看，AIDIP38冻干扩增试剂体系扩增效果良好，满足实验需求。

三、AIDIP38冻干扩增试剂的准确性检测

对来源于5名志愿者的口腔拭子样本按照步骤一的2中的方法进行全集成检测，同时设置常规实验室PCR-CE平台检测作阳性对照，以验证AIDIP38冻干扩增试剂在快检仪上的准确性。PCR-CE平台检测采用10μL反应体系，由2.5×S10 PCR Mix 4μL，5×Primer Mix2μL，模板DNA 1μL和灭菌水3μL组成。热循环参数与芯片扩增一致。

对5名志愿者的口腔拭子样本进行全集成检测的结果如图5所示，结果显示，5份样本的全集成检测结果分型完整，无等位基因缺失，且与常规结果完全一致。

四、AIDIP38冻干扩增试剂的灵敏度检测

取同一名志愿者的口腔拭子样本，分别在其口腔内壁左右各刮擦3次、5次、8次、10次，收集样品按照步骤一的2中的方法进行全集成检测。每种收集方式重复3次，测试AIDIP38冻干扩增试剂体系在快检仪上的灵敏度。

检测结果如图6所示。结果显示，刮取次数少(3次、5次)的口腔拭子样本，可能由于DNA模板不足，会出现位点缺失的现象；刮取次数为8次的口腔拭子样本，分型最完整且均衡性好；刮取次数多(10次)的口腔拭子样本，杂合子峰均衡性会变差，但分型相对完整。

统计并计算不同刮取次数样本的平均等位基因检出率和平均杂合子峰高比值，结果如图7A和7B所示。随着刮取次数从3次增加到8次，平均等位基因检出率分别为91.67％、96.67％、99.33％，而刮取次数10次时平均等位基因检出率为97.50％；不同刮取次数的平均杂合子峰高比分别为0.88、0.87、0.89、0.84。

由此可见等位基因检出率和扩增效果并不与刮取次数成正比，分析原因可能是随着刮取次数增加，口腔中的粘蛋白量也增多，而后者可能会抑制DNA扩增，故推荐后续口腔拭子采样方式为左右各刮取8次。

五、AIDIP38冻干扩增试剂的检材适应性检测

对3种来自不同志愿者的不同检材，包括口腔拭子、血卡和唾液卡样本按照步骤一的2中的方法进行全集成检测，以验证AIDIP38冻干扩增试剂对不同类型检材的检测能力。

对口腔拭子、血卡、唾液卡进行全集成检测分型结果如图8～10所示，以等位基因峰高值≥200RFU为分析阈值，3种样本均可获得完整InDel分型，均未出现等位基因丢失。

六、法医遗传学参数

利用构建的AIDIP38芯片扩增体系对来源于516名中国汉族无关个体的全血样本进行常规PCR-CE平台检测，得到InDel分型，并利用Modified-Power states软件包计算38个InDel基因座的等位基因频率(Allelic Frequency，AF)、个体识别率(discriminationpower，DP)、累积个体识别率(Cumulative Discrimination Power，CDP)、期望杂合度(expected heterozygosity，He)、非父排除率(Power of Exclusion，PE)、累积非父排除率(Cumulative Probability of Exclusion，CPE)、随机匹配概率(Random MatchingProbability，RMP)等法医学参数，以验证本发明AIDIP38芯片扩增体系的个体识别能力。

结果表明：本研究中的516份中国汉族无关个体的遗传多态性信息如表4所示，平均杂合度(He)为0.321，多态信息含量(PIC)最大为0.37，系统无关个体随机匹配概率为3.36×10^-11，累积个体识别能力为0.99999999997，累积非父排除率为0.965447。本发明AIDIP38芯片扩增体系与Qiagen公司的

DIPplex试剂盒(Qiagen.

DIPplex.Handbook:http://www.qiagen.com/knowledge-and-support/resource-center/resource-downlo ad.aspx？id＝97ae8219-edbf-495b-b6d5-a33b9df6a687□＝en.)的系统效能相当，由于InDel是二等位基因遗传标记，若要达到与STR试剂盒同等的个体识别能力，则要50个以上的位点(Gill P.An assessment of theutility of single nucleotide polymorphisms(SNPs)for forensic purposes[J].International Journal of Legal Medicine,2001,114(4-5):204-210)。本研究中的38个InDel位点，扩增产物长度均小于210bp，虽然增加标记数受限，但却提高了对降解检材的检测成功率，因而能够成为STR分型技术的有效补充。

表4、38个InDel位点在中国汉族人群中的法医遗传学参数

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 公安部物证鉴定中心

<120> 一种用于全集成微流控芯片的DIP快速扩增检测试剂及其应用

<160> 80

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

caaagtaggc aagttcaaaa tcac 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gtacttggta catggtaggt actc 24

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gtggggaggg cgactataaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

aaaagctcac tgaccctggt 20

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

atagcacaag ccagtattta ttcaa 25

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

aggtcccttc tgcctcta 18

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

actgctttta cttgttggcc t 21

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

accatcttct aaagtaggaa aaacg 25

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

ggggatcatc tggacctgtg 20

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

agattaaagg gaacctcaga gc 22

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

tggcaaaatg aagtggaaag gt 22

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

ttggcagact aaattattgg catga 25

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

acacacttca tggtgagagg g 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

actgcatctg tgtgtgccta 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

aggcgctggg tactcttagc 20

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

gcatcagtga ccagggttat tg 22

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

tgccagcttt cctacagcc 19

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

ccacccacaa aattggacat a 21

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

agggtattcc tttcactcgg c 21

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

gtgttgctgt ggctctaggt 20

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 21

ataagaagga gaagcaaggg g 21

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 22

cgtgatatcg tcaacaatca ca 22

<210> 23

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 23

ttggacttca gttgactcta agtagc 26

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 24

aattttaact aggatttggg attca 25

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 25

cagggacata gaggatggaa tg 22

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 26

tggctgcctt aaagatgctc t 21

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 27

tgaactgtct tttgttcacc acac 24

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 28

cctcgcacca ttccagtaac 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 29

acagcccacc agagcactac 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 30

gagtatggcc tcctccacag 20

<210> 31

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 31

aatatgtgct gtagtaacaa ataagcc 27

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 32

ccaaatgact gagcagagcc t 21

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 33

acggtcaact ttgtagctcc aat 23

<210> 34

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 34

tcaagaggga aagacatctt cct 23

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 35

aaataatgta tcgctccaaa ctca 24

<210> 36

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 36

agaagattcc cctgacgaga ct 22

<210> 37

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 37

atcattcata atcctatcaa agaagca 27

<210> 38

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 38

acacacaccg agagagaatt ct 22

<210> 39

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 39

tctgttgtat aaatgtgtat ctaggcac 28

<210> 40

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 40

gttgtaacat ctgtgaggtc aaattc 26

<210> 41

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 41

agtgtgtcag aaaggaagcc a 21

<210> 42

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 42

accactctgt tatctgcaac tct 23

<210> 43

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 43

aacctcattg ctgtagtccc c 21

<210> 44

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 44

ttctgtactt tgccccatct tg 22

<210> 45

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 45

tgcagtagtt tacgatcaaa atggt 25

<210> 46

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 46

tgttctcctc catccttctg c 21

<210> 47

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 47

atatcattct taaaggaaga ggcttt 26

<210> 48

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 48

aagctaagtg tacaggatca aatttc 26

<210> 49

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 49

aatctttgtg taagctctgc aat 23

<210> 50

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 50

tgcaggaata ccaagccaga a 21

<210> 51

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 51

ttctgaatca taagacagct caataga 27

<210> 52

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 52

cttcatttac actttgattg attcg 25

<210> 53

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 53

ccatttaccg tacaatcagt gtaga 25

<210> 54

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 54

agaaaaggaa gtgtagctgg attt 24

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 55

ttccaatcca tgagcaaggg 20

<210> 56

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 56

atcaatctga aaacgaaagc aat 23

<210> 57

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 57

ttgccttcaa gaaatttatg gtgac 25

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 58

ggcctagctc aaatgccatc 20

<210> 59

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 59

ctaacacaat gtcttgatta ctgttac 27

<210> 60

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 60

agaacaaagt aggagaccac tcac 24

<210> 61

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 61

atgtttgttg gtgggagg 18

<210> 62

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 62

gagaccgaag aacgaggg 18

<210> 63

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 63

tcaacaataa aatcacatgg ctaca 25

<210> 64

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 64

tgatgtctag gcttcttcag aaatac 26

<210> 65

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 65

gtaagatttg atgcgctgtc c 21

<210> 66

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 66

acagaagctg attttggttg g 21

<210> 67

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 67

ccaggaggat gtgctttatg c 21

<210> 68

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 68

ttcagaagtt gccattctcc ac 22

<210> 69

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 69

aagaatgaaa tgagtttcac tgaaga 26

<210> 70

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 70

gatagataaa atatccctga tacatgttaa 30

<210> 71

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 71

tttccaagtc tattctcttt cttagc 26

<210> 72

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 72

agtgaccttt ggagaaaatc caga 24

<210> 73

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 73

atatccgagg catcatttct tg 22

<210> 74

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 74

ttcagcatct aaacaattaa aactga 26

<210> 75

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 75

ttgtcccttt cctgtctccc t 21

<210> 76

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 76

ttaggccact gtaaatggct gc 22

<210> 77

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 77

ccctgggctc tgtaaagaa 19

<210> 78

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 78

atcagagctt aaactgggaa gctg 24

<210> 79

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 79

acataggtgg agacagatag atgat 25

<210> 80

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 80

gcctggcttg gaattctttt 20

Claims

1.用于检测人基因组中40个位点的成套系统，其包括全集成式DNA现场快速检验仪器Quick TargSeq和与其配套使用的冻干扩增试剂；所述冻干扩增试剂包括扩增预混液和引物混合液；

所述扩增预混液包括扩增所需的酶、原料和缓冲液；

所述引物混合液包括用于检测人基因组中40个位点的引物对组；所述40个位点由38个InDel位点、1个性别位点AMEL和1个Y染色体上的DYS439位点组成；

所述38个InDel位点分别为：rs3054057、rs6481、rs1160852、rs145415095、rs2308036、rs10656283、rs35851958、rs2308101、rs16416、rs1610878、rs140847、rs60422579、rs5900168、rs33948716、rs1555809480、rs5877023、rs2307998、rs2307930、rs3831551、rs3045215、rs16715、rs5789229、rs1610859、rs1160953、rs2308116、rs67071679、rs3083306、rs71425754、rs2307832、rs34122827、rs2308067、rs140708、rs16711、rs3071043、rs3991155、rs112109748、rs3031245和rs1610963；

所述冻干扩增试剂的制备方法包括如下步骤：

2)将所述液体试剂甲和所述液体试剂乙均进行冷冻干燥，分别得到冻干小球，即为冻干扩增试剂；

所述1)中，所述含有海藻糖和葡聚糖的溶液由海藻糖、葡聚糖和水混匀得到，所述海藻糖在所述溶液中的质量分数为20％，所述葡聚糖在所述溶液中的质量分数为10％；所述含有海藻糖和葡聚糖的溶液与所述扩增预混液按照体积比为2：3的比例混匀；

所述甘露醇溶液和海藻糖溶液的混合液由质量分数为15％的甘露醇溶液与质量分数为15％的海藻糖溶液按照体积比为8：1的比例混匀得到；所述甘露醇溶液和海藻糖溶液的混合液与所述引物混合液按照体积比为1：1的比例混匀；

所述2)中，所述冷冻干燥的程序如下：预冻：-55℃30min；升华干燥：-45℃240min，-35℃360min，-25℃240min；解析干燥：20℃360min；保温：4℃；

所述引物对组由如下(1)-(40)组成：

(1)用于检测rs3054057的引物对1，由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA 组成；

(36)用于检测rs112109748的引物对36，由序列表中序列71和序列72所示的两条单链DNA组成；

(40)用于检测DYS439位点的引物对40，由序列表中序列79和序列80所示的两条单链DNA组成；

所述引物对组中，所述引物对1、所述引物对2、所述引物对3、所述引物对4、所述引物对5、所述引物对6、所述引物对7、所述引物对8、所述引物对9、所述引物对10、所述引物对11、所述引物对12、所述引物对13、所述引物对14、所述引物对15、所述引物对16、所述引物对17、所述引物对18、所述引物对19、所述引物对20、所述引物对21、所述引物对22、所述引物对23、所述引物对24、所述引物对25、所述引物对26、所述引物对27、所述引物对28、所述引物对29、所述引物对30、所述引物对31、所述引物对32、所述引物对33、所述引物对34、所述引物对35、所述引物对36、所述引物对37、所述引物对38、所述引物对39和所述引物对40的摩尔比为0.53：0.33：0.27：0.45：0.5：0.67：0.33：0.67：0.33：0.9：0.76：0.57：0.28：0.27：0.67：1：1：1：0.57：0.67：0.77：0.27：0.67：0.53：0.67：0.83：0.67：0.53：0.67：0.93：0.67：0.67：0.67：0.67：1：0.67：0.67：0.67：0.67：0.67；每个引物对中两条引物的摩尔比均为1：1。

2.权利要求1所述的系统在如下任一种中的应用：

(a)InDel分型；

(b)族群推断；

(c)个体识别。