CN113234838A - 高分辨率熔解曲线鉴定绵羊FecB基因型的引物对、产品和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种高分辨率熔解曲线鉴定绵羊FecB基因型的引物对、产品和方法。本发明提供的引物对，包括第一引物对和/或第二引物对，两种引物对均可实现目标产物的特异性扩增，FTA卡上的血液样本即可满足对样本的要求。利用该引物对制备的绵羊FecB基因型鉴定产品可以实现鉴定准确率100％，每个样本的鉴定成本约在4.8元左右。此外，该产品鉴定方法还可以实现由于质量较差，不能满足一般高分辨率熔解曲线样本要求而无法鉴定的待检测样本的准确快速鉴定，不需要重复采样。

Description

高分辨率熔解曲线鉴定绵羊FecB基因型的引物对、产品和 方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种高分辨率熔解曲线鉴定绵羊FecB基因型的引物对、产品和方法。
背景技术
繁殖性状是养殖业的重要经济性状之一，其中产仔数是影响生产效益的一个重要因素，直接影响肉、毛生产的经济效益。骨形态发生蛋白受体IB(BMPR-IB)基因(FecB基因)位于6号染色体上，编码区由10个外显子组成，共1509bp。该基因具有影响颗粒细胞分化、卵泡发育和促进排卵数增加的作用。该基因A746G碱基突变导致第249位的谷氨酸变化为精氨酸(Q-R)。FecB基因突变会增加排卵数，进而增加产羔数。该基因以加性方式发生作用，对胎产羔数呈部分显性效应。因此，在以最大杂合度为目标的育种计划中，对携带FecB的绵羊进行准确的基因分型是至关重要的。
目前，绵羊FecB基因分型的手段有：PCR-RFLP技术、PCR-SSCP和ARM PCR。然而，这些方法既耗时又昂贵，涉及到样本的PCR后处理，因此容易产生交叉污染和其他人为错误。同时，由于涉及凝胶电泳，该方法只能处理少量样本，没有高通量基因分型和自动化的潜力。此外，还有寡核苷酸芯片，然而，由于芯片的费用和操作的复杂性，这种技术对于数千个基因的基因分型是经济的，但对少数基因的基因分型并不适用。
高分辨率熔解分析(HRM)是一种准确、经济、快速的检测闭管系统中基因组核苷酸变化的方法。根据不同碱基序列构成的核苷酸熔解温度不同这一性质，利用荧光染料监控核苷酸的熔解过程，得到熔解曲线，根据熔解曲线的形态变化来判断核苷酸差异。由于不同核苷酸序列的DNA分子产生不同的熔解曲线，从而区分不同位点的基因型。然而，高分辨率熔解分析通常需要高质量的DNA，因为DNA质量差会导致PCR产物数量减少或非特异性扩增，从而导致熔解曲线不一致，从而导致基因分型不可靠。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种高分辨率熔解曲线鉴定绵羊FecB基因型的引物对。
本发明的第二目的在于提供上述引物对的应用。
本发明的第三目的在于提供一种通过高分辨率熔解曲线鉴定绵羊FecB基因型的产品。
本发明的第四目的在于提供一种绵羊FecB基因型的鉴定方法。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种高分辨率熔解曲线鉴定绵羊FecB基因型的引物对，包括第一引物对和/或第二引物对；
第一引物对：
FecB65F：5'-GCAGATGAAATGGGTCTGGGT-3'(SEQ ID NO.1)；
FecB65R：5'-GCATTCATCTGAGGAGCCCA-3'(SEQ ID NO.2)；
第二引物对：
FecB110F：5'-TCATTCAAATCAGAAAGTCAGCA-3'(SEQ ID NO.3)；
FecB110R：5'-GGCAATGAGAGCACCATCTT-3'(SEQ ID NO.4)。
上述引物对在鉴别绵羊FecB基因型或制备鉴定绵羊FecB基因型产品中的应用。
一种通过高分辨率熔解曲线鉴定绵羊FecB基因型的产品，包括上述引物对。
进一步地，还包括核酸扩增和杂交试剂；
优选地，染料为SYTOTM9绿色荧光核酸染料。
进一步地，还包括FTA血液采集卡。
进一步地，还包括标准品，所述标准品包括野生型纯合子和突变型纯合子。
一种绵羊FecB基因型的鉴定方法，先利用上述引物对对待检测样本进行扩增，再进行高分辨率熔解曲线分析；
结果只有一个峰，则待检测样本为纯合子，结果有两个峰，则待检测样本为杂合子。
进一步地，扩增程序为：95℃2min；95℃5s，62℃10s，72℃10s，共50个循环；72℃2min；
熔解曲线分析条件为：扩增产物95℃5s，50℃30s，以0.1℃/2s的速度70℃升温到85℃。
进一步地，利用引物对对标准品进行扩增，再进行高分辨率熔解曲线分析，其中，标准品包括野生型纯合子和突变型纯合子；
纯合子的待检测样本结果与野生型纯合子相同，则待检测样本为野生型纯合子，纯合子的待检测样本结果与突变型纯合子相同，则待检测样本为突变型纯合子相同；
优选地，将待检测样本与标准品混合后再利用引物对进行扩增；
与野生型纯合子混合的扩增结果为一个峰，与突变型纯合子混合的扩增结果为两个峰，则待检测样本为野生型纯合子；
与野生型纯合子混合的扩增结果为两个峰，与突变型纯合子混合的扩增结果为一个峰，则待检测样本为突变型纯合子；
与野生型纯合子和突变型纯合子分别混合的扩增结果均独立地为两个峰，则待检测样本为杂合子。
进一步地，待检测样本为FTA血卡提取的样本DNA。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供高分辨率熔解曲线鉴定绵羊FecB基因型用的引物对，包括第一引物对和/或第二引物对，两种引物对均可实现目标产物的特异性扩增，FTA卡上的血液样本即可满足对样本的要求。利用该引物对制备的绵羊FecB基因型鉴定产品可以实现鉴定准确率100％，可以用于研究和现场作业，既适用于少量样本的检测，也可以实现高通量分析，同时成本低，每个样本的鉴定成本约在4.8元左右。此外，该产品鉴定方法还可以实现由于待检测样本质量较差，不能满足一般高分辨率熔解曲线样本要求而无法鉴定的样本的准确快速鉴定，不需要重复采样。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例2中6只已知基因型的绵羊高分辨率熔解曲线分析结果图；
图2为实施例2中6只已知基因型的绵羊Sanger测序结果图；
图3为实施例4中低质量样本与已知样本混合的高分辨率熔解曲线分析结果图；
图4为实施例5中群体的高分辨率熔解曲线分析结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
本发明提供一种高分辨率熔解曲线鉴定绵羊FecB基因型的引物对，包括第一引物对和/或第二引物对；
第一引物对：
FecB65F：5'-GCAGATGAAATGGGTCTGGGT-3'(SEQ ID NO.1)；
FecB65R：5'-GCATTCATCTGAGGAGCCCA-3'(SEQ ID NO.2)；
第二引物对：
FecB110F：5'-TCATTCAAATCAGAAAGTCAGCA-3'(SEQ ID NO.3)；
FecB110R：5'-GGCAATGAGAGCACCATCTT-3'(SEQ ID NO.4)。
可以理解的是，FecB基因A746G碱基的突变杂合子对育种计划具有积极作用，能够将其与纯合子准确分开具有重要意义，上述第一引物对和第二引物对可以分别单独使用，均可实现目标产物的特异性扩增，FTA卡上的血液样本即可满足对样本的要求。也可二者结合使用，互为验证，使得鉴定结果更准确可信。两对引物均是发明人针对高分辨率熔解曲线方法设计，经优化和筛选得到，特异性强，灵敏度高，利用该引物对制备的绵羊FecB基因型鉴定产品可以实现鉴定准确率100％，可以用于研究和现场作业，既适用于少量样本的检测，也可以实现高通量分析，同时成本低，每个样本的鉴定成本约在4.8元左右。
上述引物对可以用于鉴别绵羊FecB基因型或制备鉴定绵羊FecB基因型产品。
本发明提供一种通过高分辨率熔解曲线鉴定绵羊FecB基因型的产品，包括上述引物对。由于该产品利用本发明提供的引物对进行高分辨率熔解曲线分析扩增，所以具有快速、准确、经济的优点。
在一些实施方式中，该产品中还包括核酸扩增和杂交所必需的其他试剂，例如缓冲液、聚合酶、dNTP等等。其中，染料优选为SYTOTM9绿色荧光核酸染料。此外，该产品还可以含有绵羊血液采集试剂，例如FTA卡。
在一些实施方式中，该产品还可以含有标准品，该标准品为野生型纯合子和突变型纯合子。当由于特殊原因采集的样本无法满足高分辨率熔解曲线分析的要求时，可以采用待检测样本与标准品混合后再进行检测的方式，实现待检测样本的基因型判定。可以提高产品的鉴定灵敏度并且扩大应用范围。可以理解的是，也可以将待检测样本与已知基因型的纯合子样本混合再进行检测，亦可实现低质量未知样本的基因型检测。当鉴定结果为纯合子时，亦可参照标准品的熔解曲线鉴定其为野生型纯合子或突变型纯合子。
本发明最后提供一种绵羊FecB基因型的鉴定方法，先利用本发明的引物对对待检测样本进行扩增，再进行高分辨率熔解曲线分析；
结果只有一个峰，则待检测样本为纯合子，结果有两个峰，则待检测样本为杂合子。
该方法简单直观，通过熔解曲线的形成峰数量可以直接区分杂合子和纯合子。
为了区分纯合子为野生型还是突变型，可以利用标准品进行鉴定，利用引物对对标准品进行扩增，再进行高分辨率熔解曲线分析，纯合子的待检测样本结果与野生型纯合子相同，则待检测样本为野生型纯合子，纯合子的待检测样本结果与突变型纯合子相同，则待检测样本为突变型纯合子相同。
在一些实施方式中，扩增程序为：95℃2min；95℃5s，62℃10s，72℃10s，共50个循环；72℃2min；
熔解曲线分析条件为：扩增产物95℃5s，50℃30s，以0.1℃/2s的速度70℃升温到85℃。针对本发明提供的引物对，发明人对反应条件进行了优化和筛选，最终得到上述条件，可以实现样本的有效扩增和准确鉴定。
在一些实施方式中，由于特殊情况待检测样本无法直接实现分型时，为了避免重复取样和提取DNA的操作，将待检测样本与标准品混合后再利用引物对进行扩增；
其中，标准品包括野生型纯合子和突变型纯合子；
与野生型纯合子混合的扩增结果为一个峰，与突变型纯合子混合的扩增结果为两个峰，则待检测样本为野生型纯合子；
与野生型纯合子混合的扩增结果为两个峰，与突变型纯合子混合的扩增结果为一个峰，则待检测样本为突变型纯合子；
与野生型纯合子和突变型纯合子分别混合的扩增结果均独立地为两个峰，则待检测样本为杂合子。
在一些实施方式中，待检测样本为FTA血卡提取的样本DNA。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1样本制备
绵羊的DNA来自4个不同的地方，运用耳部采血将绵羊的血液采集到
Figure BDA0003118266440000071
卡片上，然后将血液卡片在室温下干燥。血卡被送到实验室进行进一步处理。共290只羊采用本研究开发的高分辨率熔解曲线方法进行基因分型。其中，有46只羊的FecB基因型是运用PCR-RFLP方法事先确定的；选择确定基因型的样本中的6只，用于高分辨率熔解曲线方法分析和验证；另外40只用于重复验证。其余244只未知基因型的样本用于进一步分析。
DNA提取
干燥的血卡在无菌条件下完全剪碎，放置于1.5mL Eppendorf管中，然后将剪碎的血卡浸入10mm Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液中提取DNA。为了熔解缓冲液中的血液，将试管置于旋转器(Ratek,Boronia,VIC,Australia)上，在4℃下以20rpm的速度过夜。95℃孵育10分钟，10,000×g离心10分钟。将上清转移到新的试管中，作为后续PCR和HRM的DNA模板。DNA的质量和数量由NanoDrop 8000分光光度计(Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL,USA)估计。
实施例2引物设计和方法建立
根据UCSC基因组浏览器(https://genome.ucsc.edu)中绵羊基因组chr6:29315607-29315803序列，设计引物，从FecB突变位点侧扩增。两对引物设计的高分辨率熔解曲线分析，设计一对测序引物(表1)。分析引物扩增子的二级结构和扩增子融化为高分辨率熔解曲线进行NetPrimer(http://www.premierbiosoft.com/netprimer/netprimer.html,Premier,Biosoft International,Palo Alto,CA),和DINAMelt。
表1
Figure BDA0003118266440000081
PCR反应体积的20L包含：10μL ddH2O、4μL 5×MyTaq，上下游引物各300nM，1.5μMSyto 9荧光染料，1U MyTaq DNA聚合酶和4μL的DNA模板。
Real-time PCR扩增后，使用Rotor-Gene Q Real-time PCR循环器进行HRM分析。
PCR反应条件：95℃2min；95℃5s，62℃10s，72℃10s，共50个循环；72℃2min。HRM分析程序95℃ 5s，50℃ 30s形成杂合体。PCR产物从70℃上升到85℃，每2s增加0.1℃。
荧光数据分别在PCR扩增的每个退火/延伸步骤和HRM的每个步骤结束时获得。自动增益优化设置为荧光级获取。高分辨率熔解曲线分析采用德国Qiagen,Hilden公司的Rotor-Gene Q软件的高分辨率熔解曲线模块进行。通过将所有分析样本的起始和结束荧光信号分别调整到同一水平，将HRM的荧光水平归一化。差分图函数通过计算所有基因型的归一化荧光差异来分析数据，得到差异图。利用软件中的Melt分析模块对熔解数据进行分析。在这一分析中，从荧光与温度曲线中产生负的一阶导数熔解曲线，并通过检查这些衍生熔解曲线来确定基因型。
6只已知基因型的绵羊，FecB++、FecB+B和FecBBB各2只，分别用引物FecB65HRMF/R和FecB110HRMF/R进行HRM分析，其HRM分析图谱如图1所示。对绵羊FecB突变的HRM分析显示，纯合子基因型(野生纯合子FecB++和突变纯合子FecBBB)的荧光信号在熔解曲线上呈现单一的熔解曲线。在当前熔解条件下，引物FecB65HRMF/R和FecB110HRMF/R所形成基因型FecB++熔解曲线的温度范围分别位于75.0℃-80.0℃(图1的a图)和81.2℃-84.0℃之间(图1的b图)；而基因型FecBBB熔解曲线的温度范围分别位于76.0℃-81.5℃(图1的a图)和81.8℃-84.6℃(图1的b图)之间。杂合基因型(FecBB+)熔解曲线上有两个峰，引物FecB65HRMF/R在74.5℃-77.0℃和77.0℃-80.5℃之间有两个熔解峰(图1的a图)，引物FecB110HRMF/R在80.4℃-82.5℃和82.5℃-84.2℃之间有两个熔解峰(图1的b图)。以野生型FecB++作为两对引物的参考基因型，3种不同基因型的差异图谱显示出明显的分化，图1的c图引物为FecB65HRMF/R，图1的d图引物为FecB110HRMF/R。熔解曲线分析表明,野生纯合子FecB++和突变纯合子FecBBB为单峰，引物FecB65HRMF/R的峰值分别位于78.0℃和79.0℃(图1的e图),引物FecB110HRMF/R的峰值分别位于82.7℃和83.3℃(图1的f图)。相比之下，引物FecB65HRMF/R的杂合子(FecBB+)在75.8℃和78.5℃出现双峰值(图1的e图)，引物FecB110HRMF/R的杂合子(FecBB+)在81.6℃和82.9℃出现双峰值(图1的f图)。
为了确认HRM的结果，我们对这6个样本进行了Sanger测序，引物FecBseqF/R扩增出613bp的片段。测序结果证实已知的基因型,如图2所示,图中a,b,c为引物FecB65HRMF/R对应的三种基因型，a为野生型纯合子，b为杂合子，c为突变型纯合子；图中d,e,f为引物FecB110HRMF/R对应的的三种基因型，d为野生型纯合子，e为杂合子，f为突变型纯合子。FecB++突变位点核苷酸为纯合子a,FecBBB为纯合子G,FecBB+为杂合子a/G(或R)。扩增子的序列与所有已知FecB基因型的样本的预期序列相同。因此，验证了所建立的HRM分析对FecB突变个体的准确基因分型。
FecBseqF：5’-GATCGAACCCGAGTCTCTTG-3’(SEQ ID NO.5)；
FecBseqR：5’-TCAAGTCCACCATCCATTCA-3’(SEQ ID NO.6)。
实施例3方法验证
在通过测序确认HRM鉴定的基因型后，对采集的46只已知FecB基因型的样本进行HRM分析，即13只FecB++、19只FecBB+、14只FecBBB。高分辨率熔解曲线分析准确地识别了所有基因型，从而进一步验证了该方法的准确性。
实施例4低质量样本检测
由于一些样本中存在低质量的DNA，部分个体分型效果并不清晰，特别是对于纯合子基因型的样本。因此，采用混合样本策略来识别最初难以识别的基因型。其基本原理是任意两种不同纯合基因型的混合将产生与它们的杂合基因型相对应的熔解曲线。相反，两个具有相同基因型的样品的混合物将产生与该基因型相同的熔解曲线。在本研究中，一个样本的高分辨率熔解曲线图最初不能被准确识别，如图3的a图所示。因此，将该样本与两个已知基因型的样本FecB++和FecBBB分别混合，然后进行HRM分析。结果显示(图3的b图)，添加FecB++的未知样品产生了与同源FecB++基因型相同的HRM曲线，添加FecBBB的未知样品产生了与杂合子FecB+B相似的HRM曲线，表明未知样品为FecB++基因型。
实施例5繁殖群体分析
本研究采用高分辨率熔解曲线技术分析了来自3个不同群体的244只未知FecB基因型的绵羊。图4为一个群体的高分辨率熔解曲线分析结果，其中，a和c图引物为FecB65HRMF/R，b和d图引物为FecB110HRMF/R。所有的动物都有明确的基因型，结果与育种过程中基于其亲本记录的预期基因型一致。在所有基因分型的样本中，FecB++、FecB+B和FecBBB基因型分别为108、58和65。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
SEQUENCE LISTING
<110> 吉林省农业科学院
<120> 高分辨率熔解曲线鉴定绵羊FecB基因型的引物对、产品和方法
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcagatgaaa tgggtctggg t 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcattcatct gaggagccca 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tcattcaaat cagaaagtca gca 23
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggcaatgaga gcaccatctt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gatcgaaccc gagtctcttg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tcaagtccac catccattca 20

Claims (10)

1.一种高分辨率熔解曲线鉴定绵羊FecB基因型的引物对，其特征在于，包括第一引物对和/或第二引物对；
第一引物对：
FecB65F：5'-GCAGATGAAATGGGTCTGGGT-3'(SEQ ID NO.1)；
FecB65R：5'-GCATTCATCTGAGGAGCCCA-3'(SEQ ID NO.2)；
第二引物对：
FecB110F：5'-TCATTCAAATCAGAAAGTCAGCA-3'(SEQ ID NO.3)；
FecB110R：5'-GGCAATGAGAGCACCATCTT-3'(SEQ ID NO.4)。
2.权利要求1所述引物对在鉴别绵羊FecB基因型或制备鉴定绵羊FecB基因型产品中的应用。
3.一种通过高分辨率熔解曲线鉴定绵羊FecB基因型的产品，其特征在于，包括权利要求1所述的引物对。
4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，还包括核酸扩增和杂交试剂；
优选地，染料为SYTOTM 9绿色荧光核酸染料。
5.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，还包括FTA血液采集卡。
6.根据权利要求3-5任一项所述的产品，其特征在于，还包括标准品，所述标准品包括野生型纯合子和突变型纯合子。
7.一种绵羊FecB基因型的鉴定方法，其特征在于，先利用权利要求1所述的引物对对待检测样本进行扩增，再进行高分辨率熔解曲线分析；
结果只有一个峰，则待检测样本为纯合子，结果有两个峰，则待检测样本为杂合子。
8.根据权利要求7所述的鉴定方法，其特征在于，扩增程序为：95℃ 2min；95℃ 5s，62℃ 10s，72℃ 10s，共50个循环；72℃ 2min；
熔解曲线分析条件为：扩增产物95℃ 5s，50℃ 30s，以0.1℃/2s的速度70℃升温到85℃。
9.根据权利要求7所述的鉴定方法，其特征在于，利用引物对对标准品进行扩增，再进行高分辨率熔解曲线分析，其中，标准品包括野生型纯合子和突变型纯合子；
纯合子的待检测样本结果与野生型纯合子相同，则待检测样本为野生型纯合子，纯合子的待检测样本结果与突变型纯合子相同，则待检测样本为突变型纯合子相同；
优选地，将待检测样本与标准品混合后再利用引物对进行扩增；
与野生型纯合子混合的扩增结果为一个峰，与突变型纯合子混合的扩增结果为两个峰，则待检测样本为野生型纯合子；
与野生型纯合子混合的扩增结果为两个峰，与突变型纯合子混合的扩增结果为一个峰，则待检测样本为突变型纯合子；
与野生型纯合子和突变型纯合子分别混合的扩增结果均独立地为两个峰，则待检测样本为杂合子。
10.根据权利要求7-9任一项所述的鉴定方法，其特征在于，待检测样本为FTA血卡提取的样本DNA。
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