CN102162008A - 检测绵羊繁殖能力的试剂盒及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种可用于检测羊繁殖能力的试剂盒及其使用方法，其试剂盒内有序列表中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4的引物核苷酸序列，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的探针核苷酸序列，以及分别放置的FTA卡及相关的试剂。本发明试剂盒的使用方法是在待检羊DNA中加入试剂盒中的引物核苷酸序列和探针核苷酸序列以及相关的试剂，再进行PCR扩增，扩增产物在高分辨率熔解曲线分析仪中进行熔解曲线分析，根据熔解曲线中的G、A、T、C峰可预测待检羊只的产羔情况。

Description

检测绵羊繁殖能力的试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及一种检测试剂盒及其使用方法，特别是一种可用于检测羊繁殖能力的试剂盒及其使用方法。

背景技术

绵羊的繁殖性状是绵羊的重要经济性状，为数量性状，属低遗传力性状。它包括受胎率、多胎性及羔羊存活率3个方面，其中多胎性是决定养羊业效益的最主要的性状之一，也是绵羊业多产高产的基础。目前，世界主要绵羊生产国都十分重视绵羊多胎性性能的研究。通过对羊繁殖性状的检测将大大提提高养羊经济效益。

目前提高绵羊繁殖力的根本手段是遗传选择，但因绵羊多胎性的遗传力很低，只有0.01～0.03，传统的遗传选择技术进展缓慢，分子育种技术为加快遗传育种进展提供了新的途径。在我国小尾寒羊、湖羊等高繁殖力绵羊品种中都发现了存在影响多胎性状的主效基因：FecB(BMPR-IB A₇₄₆→G)(Liu S F，Jiang Y L and Du L X.2003.Studies of BMPR-IB and BMPI5 as candidate genes for～cundity in Litle Tailed Han sheep(J).Acta Genefica Sinica，30(8)：755-760)、FecX^G(BMP15 C₇₁₈→T)(Chu M X，Sang L H，Wang J Y，Fang L and Ye S C.2005.Study onBMPI5and GDF9 as candidate genes for prolificacy of Small Tail Han sheep(J).Acta Genetica Sinica，，32(1)：38-45)，且FecB和FecX^G基因对绵羊繁殖性能具有协同效应(ChuM X，LiuZH，JiaoC L，HeY Q，Fang L’Ye S C，Chen G H and Wang J Y.2007.Mutations in BMPR-1BandBMP-15genes are associated with liter size in Sma ll Tailed Han sheep(Ovis aries)(J).Journal of Animal Science，85(3)598-603)。其中FecB(GG)和FecB(AA)基因序列见基因序列表SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8，FecX^G(CC)和FecX^G(TT)基因序列见基因序列表SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10。依据已有研究结果当绵羊FecB和FecX^G基因的基因型分别为GG/CT、AG/CT、GG/TT、AG/TT、AA/CT、AA/TT，产羔数依次约为2.80±0.08、2.55±0.09、2.23±0.11、1.98±0.12、1.40±0.14、1.10±0.13只(ChuM X，LiuZH，JiaoC L，HeY Q，Fang  L，Ye S C，Chen G H and Wang J Y.2007.Mutations in BMPR-1Band BMP-15genes are associated with liter size in Sma ll Tailed Han sheep(Ovis aries)(J).Journal ofAnimal Science，85(3)598-603)，依据FecB和FecX^G基因分型结果，可优先选留含有GG/CT、AG/CT、GG/TT基因型的绵羊。但因绵羊产羔数不仅受遗传的影响，而且与其周围环境(营养、健康等因素)有关，因此基因分型结果可以作为绵羊产羔数提供一个中间信息，对以含有上述GG/CT、AG/CT、GG/TT基因型的绵羊提供充足的营养、维持良好的健康状况和饲养管理条件，将会提高绵羊的产羔数。因此通过测序、PCR-SSCP、PCR-RFLP等SNP分型技术对FecB和FecX^G基因分型即可以预测被测绵羊的繁殖能力。

现有技术中绵羊多胎性状FecB、FecX^G单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)检测技术是基因序列测序，参见Galloway，S.M.，McNatty，K.P.，Cambridge，L.M.，Laitinen，M.P.E.，Juengel，J.L.，Jokiranta，T.S.，McLaren，R.J.，Luiro，K.，Dodds，K.G.，Montgomery，G.W.，Beattie，A.E.，Davis，G.H.and Ritvos，O.2000.Mutations in an oocyte-derived growth factor gene(BMP15)cause increased ovulation rate and infertility in a dosage-sensitive manner.Nat.Genet.，25：279-283.，和PCR产物限制性片段长度多态性分析，参见Davis，G.H.2004.Fecundity genes in sheep.Anim.Reprod.Sci.，80：247-253.Kumar，S.，Kolte，A.P.，Mishra，A.K.，Arora，A.L.and Singh，V.K.2006.Identification of the FecB mutation in Garole×Malpura sheep and its effect on litter size.Small Rum.Res.，64：305-310.，以及PCR单链构象多态性分析，参见single-strand conformation polymorphism，SSCP)(Hanrahan，J.P.，Gregan，S.M.，Mulsant，P.，Mullen，M.，Davis，G.H.，Powell，R.and Galloway，S.M.2004.Mutation in the genes for oocyte-derived growth factors GDF9 and BMP 15 are associated with both increased ovulation rate and sterility in Cambridge and Belclare sheep(Ovis aries).Biol.Reprod.，70：900-909.。采用现有技术中每次仅能检测一种基因SNP，因此每一基因SNP检测成本很高，据测算一般成本约为13美元/羊。同时现有技术的方法操作复杂，检测周期长，需要1至2周的时间，且需要大型的仪器设备和熟练的实验技能，因此并不适合于在我国畜牧生产中应用，难以广泛的推广。

发明内容

本发明提供一种中可克服现有技术不足，可用于检测羊繁殖能力的试剂盒及其使用方法。

本发明检测绵羊繁殖能力的试剂盒内有序列表中SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4的引物核苷酸序列和SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的探针核苷酸序列。

为方便使用，本发明的试剂盒内还可以再分别放置的FTA卡、10X PCR缓冲液、d NTP混合液、Taq DNA聚合酶，以及LCGreen PLUS⁺饱和荧光染料。

本发明试剂盒的使用方法是在待检羊DNA中加入所述试剂盒中的引物核苷酸序列和探针核苷酸序列，以及PCR缓冲液、d NTP混合液、Taq DNA聚合酶、LCGreen PLUS⁺饱和荧光染料，再进行PCR扩增，PCR扩增产物在高分辨率熔解曲线分析仪中进行熔解曲线分析，得到熔解曲线中的G、A、T、C峰分布情况，根据熔解曲线中的G、A、T、C峰可预测待检羊只的产羔情况。

本发明试剂盒的最佳使用方法是：

在进行PCR扩增时，其扩增条件为：95℃5分钟，95℃1分钟，60.5℃25秒，72℃15秒，72℃10分钟，共进行50个循环；反应完成后，将PCR产物再进行2个95℃2分钟，25℃30秒的变性和复性的循环；

所得PCR产物在高分辨率熔解曲线分析仪中进行熔解曲线分析时将PCR产物以0.3℃/秒的速度从55℃升温到86℃过程中，获得样品的熔解曲线，依据熔解曲线获得FecB、FecX^G基因的基因型。

本发明是利用HRM(High Resolution Melt)技术进行检测。HRM中文译为“高分辨率熔解”是近几年来在国外兴起的最新的SNP及突变研究工具。HRM分析技术是2002年由犹他大学和爱德华科技公司合作开发，最初应用于单核苷酸多态(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)检测分析的一项新技术。它是在PCR结束后，根据不同碱基序列构成核苷酸熔解温度不同这一物理性质，在同一容器中直接进行高分辨率熔解，利用饱和染料监控核苷酸的熔解过程，得到特征性熔解曲线，再根据熔解曲线的形态变化来判断核苷酸性质的差异。目前，HRM的应用领域已经扩展到突变扫描、甲基化分析、基因分型、序列匹配等诸多方面，近年来已成为生命科学研究中的热点技术。

HRM利用PCR后扩增子的核苷酸序列和长度不同而引起的各碱基含量的差异，通过不同温度下实时检测升温过程的熔解曲线来反映DNA链中单个或多个位点的基因变化。可以说，核苷酸的排列和配对碱基不同是其熔解温度产生差异的根本原因。HRM通过这种实时检测技术，判断升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况。双链DNA如果某SNP位点不匹配，升温过程中就会先解开，其熔解温度反映在熔解曲线上就会相应降低，根据荧光强度与温度曲线就可以判断是否存在SNP，而且不同基因位点、杂合子与否等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM分析能有效区分不同位点的基因型。

HRM分析仅需要在反应体系中增加饱和荧光染料的消耗，仪器的价格也明显低于常用于基因突变检测的变性高效液相色谱仪器(dHPLC)(删除下面一句话)。该方法是在封闭的试管内进行，可降低污染；同时只需要一种试剂在一个平台上进行基因分型和突变扫描，因此，该技术具有操作简单、成本低廉、时间短、误差少、高通量检测等优点。

本发明即是一种利用高分辨率熔解曲线分析仪对FecB、FecX^G SNP进行分型鉴定的快速、简便、准确的新手段。本发明改进了现有技术中FecB、FecX^G SNP分型鉴定中的缺点。在本发明的FecB、FecX^G SNP分型鉴定过程中，应用FTA卡进行绵羊基因组DNA样品采集和提取的载体，较现有技术FecB、FecX^G SNP分型鉴定方法中需用氯仿-苯酚法或基因组DNA试剂盒提取DNA方法显著降低了DNA提取成本，提高了DNA提取速度，在30分钟内可以完成96个实验样本的基因组DNA提取工作；在实验样本基因组DNA应用本发明中试剂盒中的特异引物和探针进行扩增后，可直接应用高分辨率熔解曲线分析仪进行基因分型，而无需现有技术中FecB、FecX^G SNP分型鉴定方法在PCR扩增后还需要进行限制性酶切、琼脂糖凝胶电泳或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染等技术难度大、重复性差的技术环节，从而摆脱了对电泳仪、凝胶成像系统等大中型设备的依赖，使FecB或FecX^G的SNP分型简便易操作。现有技术中FecB、FecX^GSNP分型鉴定方法每次只能进行一个FecB或FecX^G的SNP分型鉴定，而本发明在一个PCR扩增中可实现同时FecB和FecX^G基因同时扩增，在应用高分辨率熔解曲线分析仪进行基因分型时也可以同时对FecB和FecX^G基因SNP分型鉴定，并且可在一个小时内完成60～600个样品的基因分型，因此应用本发明进行FecB、FecX^G SNP基因分型鉴定降低了每一基因鉴定的成本，提高了检测速度。总之，本发明较上述已有FecB、FecX^G SNP分型鉴定方法准确、快速、简便、成本低、实用，具有很好的实用价值和市场价值。

附图说明

图1分别为实测的.pMD19-T FecB(AA)、pMD19-T FecB(GG)、pMD19-TFecX^G(CC)和pMD 19-T FecX^G(TT)四个载体基因序列。

附图2为待检样品PCR扩增产物的熔解曲线，其中：样品1的FecB和FecX^G基因型分别为GG TT；样品；样品2的FecB和FecX^G基因型分别为GGCT；样品3的FecB和FecX^G基因型分别为GG CC；样品4的FecB和FecX^G基因型分别为AG TT；样品5的FecB和FecX^G基因型分别为AG TCT；样品6的FecB和FecX^G基因型分别为GG CC；样品7的FecB和FecX^G基因型分别为AA CC；样品8的FecB和FecX^G基因型分别为AA TT；样品9的FecB和FecX^G基因型分别为AA CT。

具体实施方式

以下为本发明的具体实施方式：

FecB和FecX^G基因克隆标准品的制备及基因分型检测

(1).以下表1与表2所列的本发明所使用的引物基因序列和探针序列均由上海生工生物工程科技发展有限公司合成。

表1.FecB和FecX^G基因克隆引物

(2)FecB和FecX^G基因构建及测序

将合成的FecB(AA)，FecB(GG)，FecX^G(CC)和FecX^G(TT)基因型双链核酸序列分别用F1/R1、F2/R2引物进行PCR扩增，进行1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶回收187bp、87bp片段，将回收的PCR产物用T4连接酶与pMD19-T克隆载体连接构建pMD19-T FecB(AA)、pMD19-T FecB(GG)、pMD19-T FecX^G(CC)和pMD19-T FecX^G(TT)载体，转化大肠杆菌(Escherichia.coli)感受态细胞JM109。蓝白斑筛选阳性克隆，小量抽提质粒后质粒测序鉴定(测序结果见图1)，其具体序列如下

FecB基因GG基因型核酸序列(SEQ ID NO：7)序列5′-3′

AGATTGGAAAAGGTCGCTATGGGGAAGTTTGGATGGGAAAGTGGCGTGGCGAAAAGGTAGCTGTGAAAGTGTTCTTCACTACAGAGGAGGCCAGCTGGTTCCGAGAGACAGAAATATATCGGACGGTGTTGATGAGGCATGAAAACATCTTGGGTGAGTATAAGTCTGTATTAGCGATGTTCAGGGT

其中下划线为引物F1、R1核酸序列，第121个碱基为G。

FecB基因AA基因型核酸序列(SEQ ID NO：8)序列5′-3′

AGATTGGAAAAGGTCGCTATGGGGAAGTTTGGATGGGAAAGTGGCGTGGCGAAAAGGTAGCTGTGAAAGTGTTCTTCACTACAGAGGAGGCCAGCTGGTTCCGAGAGACAGAAATATATCAGACGGTGTTGATGAGGCATGAAAACATCTTGGGTGAGTATAAGTCTGTATTAGCGATGTTCAGGGT

其中下划线为引物F1、R1核酸序列，第121个碱基为A。

FecX^G基因CC基因型核酸序列(SEQ ID NO：9)序列5′-3′

GGCACTTCATCATTGGACACTGTCTTCTTGTTACTGTATTTCAATGACACTCAGAGTGTTCAGAAGACCAAACCTCTCCCTAAAGGC

其中下划线为引物F2、R2核酸序列，第51个碱基为T。

FecX^G基因TT基因型核酸序列(SEQ ID NO：10)序列5′-3′

GGCACTTCATCATTGGACACTGTCTTCTTGTTACTGTATTTCAATGACACTTAGAGTGTTCAGAAGACCAAACCTCTCCCTAAAGGC

其中下划线为引物F2、R2核酸序列，第51个碱基为T。

经测序鉴定后确认为pMD19-T FecB(AA)、pMD19-T FecB(GG)、pMD19-TFecX^G(CC)和pMD19-T FecX^G(TT)载体，4个纯合子阳性克隆，作为基因分型检测的标准品。

(3)本发明的方法进行FecB和FecX^G基因分型检测

本发明所用的引物序列及探针序列见表2：

表2.FecB和FecX^G基因检测引物及探针

a.制备混合液：

第一组混合液是分别将2种质粒(pMD19-T FecB(AA)、pMD19-T FecB(GG)分别标记为模板A、模板B、)1ul分别作为各自的PCR扩增的模板，分别在其中加入13ul超纯水、2ul 10XPCR缓冲液、0.5ul 10m M d NTP混合液、0.5ul 1unit/ul Taq DNA聚合酶、1ul 1pmol/ul F1引物、2ul 5pmol/ul R1引物、2ul1XLCGreen PLUS+饱和荧光染料，及探针T1 1ul 5pmol/ul；

分别将2种质粒(pMD19-T FecX^G(CC)和pMD19-T FecX^G(TT)分别标记为模板C、模板D)1ul分别作为各自的PCR扩增的模板，分别在其中加入12ul超纯水、2ul 10XPCR缓冲液、0.5ul 10m M d NTP混合液、0.5ul 1unit/ul Taq DNA聚合酶、1ul 1pmol/ul F2引物、2ul 5pmol/ul R2引物、2ul 1XLCGreen PLUS+饱和荧光染料，以及探针T2 1ul 5pmol/ul；

按pMD19-T FecB(AA)/pMD19-T FecX^G(CC)、pMD19-T FecB(AA)/pMD19-T FecX^G(TT)、pMD19-T FecB(GG)/pMD19-T FecX^G(CC)、pMD19-TFecB(GG)/pMD19-T FecX^G(TT)两两混合，所得混合液分别标记为模板E、模板F、模板G、模板H，取E、F、G和H混合液各1ul，分别作为各自PCR扩增的模板，在其中各加入：9ul超纯水、2ul 10XPCR缓冲液、0.5ul 10m M d NTP混合液、0.5ul 1unit/ul Taq DNA聚合酶、1ul 1pmol/ul F1引物、2ul 5pmol/ul R1引物、1ul 1pmol/ul F2引物、2ul 5pmol/ul R2引物、2ul 1XLCGreen PLUS+饱和荧光染料、探针T1 1ul 5pmol/ul和探针T2 1ul 5pmol/ul。

b.将以上各模板进行PCR反应，PCR条件为：95℃5分钟，95℃1分钟，60.5℃25秒，72℃15秒，72℃10分钟，共50个循环；反应完成后，将PCR产物再进行2个变性和复性的循环：95℃2分钟，25℃30秒。

c.将以模板A、模板B、模板C、模板D为模板扩增的PCR产物分别按以下混合(模板A/模板B/模板C、模板A/模板B/模板D、模板A/模板C/模板D、模板B/模板C/模板D、模板A/模板B/模板C/模板D)分别标记为样品6、样品4、样品9、样品2、样品5，FecB和FecX^G基因基因型分别为AG/CC、AG/TT、AA/CT、GG/CT、AG/CT；将以模板E、模板F、模板G、模板H为模板扩增的PCR产物分别标记为样品7、样品8、样品3、样品1，FecB和FecX^G基因基因型分别为AA/CC、AA/TT、GG/CC、GG/TT。

d.将步骤(c)中的产物样品分别在Light scanner^TM HR-I中进行熔解曲线分析。通过仪器以0.3℃/秒的速度从55℃升温到86℃，获得样品的熔解曲线。

e.多态性分型：依据熔解曲线可准确判断样品基因型，Fec B基因：如果曲线峰的Tm值为72.61℃，则为G等位基因；如果曲线的Tm值为70.71℃，则为A等位基因；两峰都有则为杂合子A/G。FecXG基因如果曲线峰的Tm值为59.71℃，则为T等位基因；如果曲线的Tm值为66.61℃，则为C等位基因；两峰都有则为杂合子C/T。样品1～9依据上述判型条件，FecB和FecX^G基因型分别为GG/TT、GG/CT、GG/CC、AG/TT、AG/CT、AG/CC、AA/CC、AA/TT、AA/CT。

实际检测

(1)羊基因组DNA提取

分别对98只甘肃高山细毛羊、98只小尾寒羊、121只无角道赛特X小尾寒羊F2、234只波德代X小尾寒羊F2，和132只波德代X蒙古羊F2采集血样、并进行繁殖性状的记录。

采集羊颈静脉血液，每只2mL，不加任何抗凝剂滴在FTA采样卡(Whatman，Middlesex，UK)上，陈旧血样(非肝素抗凝剂抗凝，采集后-80℃保存3～5a)也按照新鲜血样的方法滴在FTA采样卡上，在干净的环境中避光晾干后室温保存，DNA提取所用试剂为50mmol/L NaOH，TE-1缓冲液(10mmol Tris-HCl，0.1mmol EDTA，p H8.0)，将这2种试剂高压灭菌后4℃保存备用。用取样器(punch)在FTA采样卡上取若干直径为1.2mm的圆盘，每个0.2mL的PCR管中放入1个圆盘备用。在上述放入圆盘的离心管中加入80μL 50mmol/L的NaOH，在98℃下孵育10分钟，在孵育过程中可以翻转离心管，孵育结束后，弃去液体部分。然后在管中加入100μL的TE^-1缓冲液，静置2min后，尽量弃尽液体部分，室温下风干圆盘备用。

(2)Fec B和FecX^G基因PCR扩增

通过PCR扩增Fec B和FecX^G基因特异基因序列，先制备混合液，加入含有DNA的FTA卡、9ul超纯水、2ul 10XPCR缓冲液、0.5ul 10m M d NTP混合液、0.5ul 1unit/ul Taq DNA聚合酶、1ul 1pmol/ul F1引物、2ul 5pmol/ul R1引物、1ul 1pmol/ul F2引物、2ul 5pmol/ul R2引物、2ul 1XLCGreen PLUS+饱和荧光染料、探针：1ul 5pmol/ul T1、1ul 5pmol/ul T1；

PCR条件：95℃5分钟，95℃1分钟，60.5℃25秒，72℃15秒，72℃10分钟，共50个循环；反应完成后，将PCR产物再进行2个变性和复性的循环：95℃2分钟，25℃30秒。

(3)将步骤(2)中PCR产物在Light scanner TMHR-I中进行熔解曲线分析。通过仪器以0.3℃/秒的速度从55℃升温到86℃，获得样品的熔解曲线，根据样品熔解曲线进行基因型判定。

(4)FecB和FecX^G基因基因型检测结果统计分析见表3。

表3.Fec B和FecX^G基因在5个绵羊群体中基因频率、基因型频率分布

从表中结果可以看出，Fec B基因(GG)、(AG)基因型出现在小尾寒羊、无角道赛特X小尾寒羊F2、波德代X小尾寒羊F2中，在甘肃高山细毛羊、波德代X蒙古羊F2没有检出，在小尾寒羊群体中B基因型频率达0.648，说明在定西引进的小尾寒羊品种比较纯，无角道赛特X小尾寒羊F2、波德代X小尾寒羊F2中仅检测出Fec B基因杂合子基因(AG)，这一结果可用于分子标记辅助选择育种，但是在检测的甘肃高山细毛羊、小尾寒羊、无角道赛特X小尾寒羊F2、波德代X小尾寒羊F2、波德代X蒙古羊F25个品种共683个个体中都未发现FecX^G基因的突变。经对比采用基因测序的方式进行检测，结果表明，本发明的检测与现有技术的检测结果一致。

Claims (4)

1.检测绵羊繁殖能力的试剂盒，其特征是试剂盒内有序列表中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4的引物核苷酸序列和SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的探针核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是试剂盒内还有分别放置的FTA卡、10XPCR缓冲液、d NTP混合液、Taq DNA聚合酶，以及1XLCGreen PLUS+饱和荧光染料。

3.权利要求1或2所述的试剂盒的使用方法，其特征是在待检羊DNA中加入所述试剂盒中的引物核苷酸序列和探针核苷酸序列，以及PCR缓冲液、dNTP混合液、Taq DNA聚合酶、LCGreen PLUS⁺饱和荧光染料，再进行PCR扩增，PCR扩增产物在高分辨率融解曲线分析仪中进行溶解曲线分析，得到溶解曲线中的G、A、T、C峰分布情况，根据溶解曲线中的G、A、T、C峰预测待检羊只的产羔情况。

4.根据权利要求3所述的试剂盒的使用方法，其特征是：

PCR条件：95℃5分钟，95℃1分钟，60.5℃25秒，72℃15秒，72℃10分钟，共进行50个循环；反应完成后，将PCR产物再进行2个95℃2分钟，25℃30秒的变性和复性的循环；

所得PCR产物在高分辨率融解曲线分析仪中进行溶解曲线分析时将PCR产物以0.3℃/秒的速度从55℃升温到86℃，获得样品的溶解曲线。

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