CN113215276B - 用于吉富罗非鱼亲子鉴定的ssr标记引物组及其应用 - Google Patents
用于吉富罗非鱼亲子鉴定的ssr标记引物组及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113215276B CN113215276B CN202110528962.4A CN202110528962A CN113215276B CN 113215276 B CN113215276 B CN 113215276B CN 202110528962 A CN202110528962 A CN 202110528962A CN 113215276 B CN113215276 B CN 113215276B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gift tilapia
- ssr
- tilapia
- reagent
- paternity test
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了用于吉富罗非鱼亲子鉴定的SSR标记引物组及其应用。本发明首先提供了一种用于吉富罗非鱼亲子鉴定的试剂，所述试剂为检测吉富罗非鱼10个SSR标记的引物组，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～20所示，并基于该引物组建立了一种基于毛细管电泳四色荧光基因分型技术的包含10对SSR标记引物组的亲子鉴定试剂盒，并成功应用于吉富罗非鱼亲子鉴定的分析。本发明提供的吉富罗非鱼亲子鉴定分析试剂盒具有简便、可靠、低成本及高通量的优点，在吉富罗非鱼新品系选育中具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明分子标记技术领域，更具体地，涉及用于吉富罗非鱼亲子鉴定的SSR标记引物组及其应用。
背景技术
SSR(Simple Sequence Repeats)标记是一种以PCR为基础的分子标记技术，广泛用于遗传多样性评价、种质资源鉴定、遗传图谱的构建、目标基因的标定等研究。SSR标记且多态性高、共显性以及种属特异性较强等特点，传统上主要以聚丙烯酰胺凝胶电泳和单色毛细管电泳等技术进行基因分型，但具有时间较长及成本较高等缺点。
罗非鱼具有生成快、产量高、食性杂、疾病少、繁殖力强等特点，是我国主要的养殖水产品。罗非鱼的微卫星分子标记数据已有多个图谱发表，如已发布的尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus和奥利亚罗非鱼Oreochromis aureus杂交F2代群体微卫星遗传连锁图谱(PMCID:PMC1449707)。然而，前人已发表的基于其他罗非鱼种或群体开发的SSR标记在吉富罗非鱼品种中的应用可能存在适用性问题。因此，规模化基因型分析前必需要对微卫星分子标记的种群适应性进行筛选和优化。
吉富罗非鱼是遗传性状改良后的罗非鱼。该鱼是1993年以来在菲律宾利用尼罗罗非鱼的四个亚洲品系和四个非洲品系等广泛的种质资源选育而成的新品系。近年来的研究显示，国内外对吉富罗非鱼品系的不断遗传选育可能污染其他罗非鱼的种质资源。通过微卫星分子标记技术进行亲子鉴定是罗非鱼育种中重要的技术环节。罗非鱼亲子鉴定要求的遗传标记应具备多态性高、突变率低、检测条件简单、且标记分布于各个染色体等特点。在现有技术中，专利CN103555847A提供了一种仅针对所有群体罗非鱼亲子鉴定的方法，其缺点一是缺乏适用罗非鱼物种的准确描述，罗非鱼种类繁多，但微卫星标记存在种群适应性差异问题，所以该标记或方法在其他罗非鱼种群如吉富罗非鱼品系的适应性并不清楚；缺点二是该系统仅基于传统的PCR标记和电泳检测技术，相对目前多色毛细管电泳基因分型技术而言，具有时间较长、成本较高、不容易规模化快速分析等缺点。而其他针对罗非鱼开发的SSR标记多是遗传多样性分析或者对尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交种的微卫星标记亲权鉴定(专利CN110331217A)。因此，目前亟需开发一套低成本高效率的吉富罗非鱼亲子鉴定SSR标记组合系统。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中吉富罗非鱼亲子鉴定技术的缺陷和不足，筛选多态性高的吉富罗非鱼适用性标记，并提供一种用于吉富罗非鱼亲子鉴定的试剂，所述试剂包含检测吉富罗非鱼10个SSR标记的引物组，进而开发一套低成本高效率的吉富罗非鱼亲子鉴定SSR标记系统。
本发明的第一个目的在于提供一种吉富罗非鱼亲子鉴定试剂。
本发明的第二个目的在于提供所述试剂在吉富罗非鱼亲子鉴定中的应用。
本发明的第三个目的在于提供所述试剂在制备吉富罗非鱼亲子鉴定试剂盒中的应用。
本发明的第四个目的在于提供一种吉富罗非鱼亲子鉴定试剂盒。
本发明的第五个目的在于提供一种吉富罗非鱼亲子鉴定的方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
本发明提供了一种吉富罗非鱼亲子鉴定试剂，所述试剂通过检测10个SSR标记的基因型对吉富罗非鱼进行亲子鉴定，所述10个SSR标记为UNH719、GM222、GM526、UNH207、GM560、UNH911、UNH166、GM276、UNH942、UNH974。
优选地，所述试剂包括用于吉富罗非鱼亲子鉴定的SSR标记引物组，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～20所示。
优选地，所述的SSR标记引物组包括正向引物和反向引物，所述正向引物标记有不同的荧光基团，其中每种荧光基团标记1～4条正向引物。
优选地，SSR标记UNH719、GM222、GM526的正向引物标记同一种荧光基团，SSR标记UNH207、GM560的正向引物标记同一种荧光基团，SSR标记UNH911、UNH166、GM276的正向引物标记同一种荧光基团，SSR标记UNH942、UNH974的正向引物标记同一种荧光基团。
优选地，所述荧光基团为FAM、HEX、TAMRA、ROX。
更优选地，SSR标记UNH719、GM222、GM526的正向引物标记FAM，SSR标记UNH207、GM560的正向引物标记HEX，SSR标记UNH911、UNH166、GM276的正向引物标记同TAMRA，SSR标记UNH942、UNH974的正向引物标记ROX。
进一步更优选地，荧光基团FAM标记核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQID NO.5所示的正向引物；荧光基团HEX标记核苷酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9所示的正向引物；荧光基团TAMRA标记核苷酸序列如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ IDNO.15所示的正向引物；荧光基团ROX标记核苷酸序列如SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19所示的正向引物。
以下应用也应属于本发明的保护范围之内：
以上任一所述试剂在吉富罗非鱼亲子鉴定中的应用。
以上任一所述试剂在制备吉富罗非鱼亲子鉴定试剂盒中的应用。
本发明要求保护一种吉富罗非鱼亲子鉴定试剂盒，所述试剂盒包含以上任一所述试剂。
优选地，还包含2×Taq PCR MasterMix。
本发明还要求保护一种吉富罗非鱼亲子鉴定的方法，提取待测吉富罗非鱼的基因组DNA，利用所述SSR标记引物组进行PCR扩增，对PCR扩增后的产物进行基因型分析，鉴定各子代的亲本来源，对子代和亲本进行匹配。
优选地，FAM荧光标记中，当检测到等位基因大小为114、116、122bp时，说明检测到的SSR位点为UNH719；当检测到等位基因大小为154、166、168、202bp时，说明检测到的SSR位点为GM222；当检测到等位基因大小为220、238、242、248bp时，说明检测到的SSR位点为GM526；
HEX荧光标记中，当检测到等位基因大小为106、138、144、154时，说明检测到的SSR位点为UNH207；当检测到等位基因大小为186、188、190bp时，说明检测到的SSR位点为GM560；
TAMRA荧光标记中，当检测到等位基因大小为140、146、148bp时，说明检测到的SSR位点为UNH911；当检测到等位基因大小为156、164、166、168bp时，说明检测到的SSR位点为UNH166；当检测到等位基因大小为248、254、256、258bp时，说明检测到的SSR位点为GM276；
ROX荧光标记中，当检测到等位基因大小为94、102、116bp时，说明检测到的SSR位点为UNH942；检测到等位基因大小为180、192bp时，说明检测到的SSR位点为UNH974。
优选地，所述PCR扩增的反应体系为：模板DNA 3μL，正向引物和反向引物各1μL，2×Taq PCR MasterMix 10μL，H2O 5μL，共20μL。
优选地，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃再延伸7min，4℃保存。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明对分布于不同染色体的40个微卫星标记进行分析，筛选得到10个特异性好、等位基因数目多且在吉富罗非鱼品系群体中具有高多态性的标记。基于这10个SSR标记，本发明设计合成了10对不同的SSR标记引物组，通过条件优化，最终建立了一种基于毛细管电泳四色荧光基因分型技术的包含10对SSR标记引物组的亲子鉴定试剂盒，并成功应用于吉富罗非鱼亲子鉴定的分析。
本发明的亲子鉴定试剂盒利用不同荧光标记引物进行PCR扩增，将多个PC R产物混合测定基因型数据，从而达到在一个测序反应中得到多个基因型数据进行吉富罗非鱼亲子鉴定，大大减少了测序所花的时间和成本。本发明提供的吉富罗非鱼亲子鉴定试剂盒具有简便、可靠、低成本及高通量的优点，在吉富罗非鱼新品系选育中具有广泛的应用前景。
附图说明
图1是SSR标记UNH719、GM222、GM526、UNH207和GM560的聚苯烯酰胺凝胶电泳图(M表示Marker)。
图2是SSR标记UNH911、UNH166、GM276、UNH942和UNH974的聚苯烯酰胺凝胶电泳图(M表示Marker)。
图3是2个吉富罗非鱼样本FAM荧光标记的毛细管电泳基因分型示图。
图4是2个吉富罗非鱼样本HEX荧光标记的毛细管电泳基因分型示图。
图5是2个吉富罗非鱼样本TAMRA荧光标记的毛细管电泳基因分型示图。
图6是2个吉富罗非鱼样本ROX荧光标记的毛细管电泳基因分型示图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1吉富罗非鱼亲子鉴定SSR标记的筛选
一、实验方法
1、样品来源及DNA提取
在广东冠利达海洋生物有限责任公司养殖基地自繁的F1代及F2代耐盐吉富罗非鱼品系中进行取样。剪取鳍条样品置于无水乙醇中，于4℃保存。
(1)取一浅孔96孔板，每孔加入300μL set buffer，50μg proteinase K；
(2)将鱼鳍条用剪刀剪下3×3mm2左右大小，放在滤纸上，按压吸干组织上残留的乙醇，剪碎后放入对应孔中；放好组织后，稍微离心确保组织完全浸没；
(3)将96孔板放入摇床中，设置温度为55℃，速度为70～100r/min，时长>3h；
(4)取96孔硅胶垫，每孔加入240μL 6M NaI，下面使用旧的96孔板接滤液；
(5)每孔加入80μL裂解液，平衡后2000g离心1min，倒去滤液；
(6)每孔加入240μL wash buffer，平衡，2000g离心3min，倒去滤液，静止干燥2～5min；
(7)更换下面承接滤液的96孔板，每孔加入120μL纯水，静止2min后，平衡，2000g离心2min；
(8)跑胶检测：裂解液1％琼脂糖凝胶，DNA 0.8％琼脂糖凝胶电泳，用Na nodrop检测浓度；
(9)将提取的DNA用ddH2O稀释5倍后用于后续的PCR扩增反应，原液于-20℃保存。
2、吉富罗非鱼适用性SSR标记的筛选
(1)PCR反应
为了筛选适用于吉富罗非鱼的分子标记，首先从已发布的尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus和奥利亚罗非鱼Oreochromis aureus杂交F2代群体微卫星遗传连锁图谱中，选择了分布于不同染色体的33个微卫星标记，并利用NCBI在线引物设计工具设计了7个新的微卫星标记，共40个标记。由艾基生物(广州)贸易有限公司合成引物后，对6尾吉富罗非鱼的基因组DNA进行PCR扩增和检测，PCR扩增的反应体系如表1所示：
表1 PCR扩增反应体系
PCR扩增反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃再延伸7min，4℃保存。
(2)PCR产物检测
采用8％PAGE凝胶电泳及银染显色对PCR产物进行检测，具体步骤如下：
①制胶：将玻璃板固定在制胶架上，用夹子夹紧，旋紧底座；每块胶取纯水25mL，5×TBE 4mL，30％Acr-bis 10.7mL，TEMED 26μL，10％APS 280μL,用玻璃棒充分搅拌混匀，将混匀后的凝胶注入组装好的两块玻璃板之间，轻轻插入梳子，静止30～60min使其凝固；
②电泳：待胶凝固后，将胶连同玻璃板一块取下，放置在电泳槽中，拔出梳子，按照顺序依次点样，每孔加入3μLPCR产物，盖好上盖，电压200V电泳10min，随后将电压调到600V继续电泳1.5h；
③银染：电泳结束后，排出缓冲液，将玻璃板从电泳槽中取出，用刀片或薄板将玻璃板撬开，取下凝胶放入装有染色液(新配制1‰AgNO3)的盘中，染色5min；将凝胶转移到装有纯水的盘中，漂洗5～10s，倒掉纯水，加入显色液(20g NaOH+0.5g Na2CO3+4mL 37％甲醛溶液溶于1L纯水中，使用前置于冰上预冷)，显色约5～10min至开始呈现出条带，倒掉显色液，加入纯水浸泡至条带清晰，观察条带并拍照。
二、实验结果
PCR产物经过8％PAGE凝胶电泳及银染检测后，发现所筛选的SSR标记种属特异性较强，有38个SSR标记能被扩增，32个SSR标记的带型清晰，其中，有27个标记在吉富罗非鱼品系群体中具有多态性并且能稳定扩增，这27个SSR标记的序列信息如表2所示。
表2.27个SSR标记及其引物序列信息
基于这27个SSR标记的基因组位置、PCR产物大小和在群体中的标记多态性水平，从中挑选10个SSR标记，对其进行PCR扩增和聚苯烯酰胺凝胶电泳分析(图1～2)。结合预测扩增片段大小对不同SSR标记引物进行了不同荧光标记组合，每种荧光标记2或3个SSR标记引物。具体标记和分类如表3所示，引物均由艾基生物(广州)贸易有限公司合成。
表3.10个SSR标记的染色体分布与标记引物信息
实施例2一种吉富罗非鱼亲子鉴定试剂盒
一、组成
包括实施例1表3中序列如SEQ ID NO.1～20所示的10对SSR标记引物，2×Taq PCRMasterMix和ddH2O。
二、使用方法
提取待测吉富罗非鱼的基因组DNA为样本，利用试剂盒中的SSR标记引物组进行PCR扩增；PCR扩增的反应体系为：模板DNA 3μL，正向引物和反向引物各1μL，2×Taq PCRMasterMix 10μL，ddH2O 5μL，共20μL；PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃再延伸7min，4℃保存。
对PCR扩增后的产物利用多色毛细管电泳技术进行分析，所检测位点的等位基因大小范围为：80～300bp。采用PAPA软件(http://www2.bio.ulaval.ca/louisbernatchez/downloads.htm)做基因型亲子分析。PAPA,version 2.0软件参数设置：①选择可靠(基因型读数准确)的基因位点；②等位基因的分配误差水平：选择0误差水平进行分析。
根据如图3～6所示的毛细管电泳四色荧光标记基因型检测图谱，对每个样本的每个标记进行等位基因读数，每个样本中每个标记会有2种(杂合)或1种(纯合)等位基因。同种荧光标记下的等位基因根据预测扩增片段大小范围来判断其属于哪个标记位点。最后根据亲本和子代的基因型读数对样本进行亲子鉴定。
具体分析步骤如下：
1.样本10个标记等位基因读数
根据10个标记的预测产物片段大小和标记筛选过程中观察到的PAGE胶图条带大小(图3-6)可以判断：
FAM荧光标记中，当检测到等位基因大小为114、116、122bp时，说明检测到的SSR位点为UNH719；当检测到等位基因大小为154、166、168、202bp时，说明检测到的SSR位点为GM222；当检测到等位基因大小为220、238、242、248bp时，说明检测到的SSR位点为GM526。
HEX荧光标记中，当检测到等位基因大小为106、138、144、154时，说明检测到的SSR位点为UNH207；当检测到等位基因大小为186、188、190bp时，说明检测到的SSR位点为GM560。
TAMRA荧光标记中，当检测到等位基因大小为140、146、148bp时，说明检测到的SSR位点为UNH911；当检测到等位基因大小为156、164、166、168bp时，说明检测到的SSR位点为UNH166；当检测到等位基因大小为248、254、256、258bp时，说明检测到的SSR位点为GM276。
ROX荧光标记中，当检测到等位基因大小为94、102、116bp时，说明检测到的SSR位点为UNH942；检测到等位基因大小为180、192bp时，说明检测到的SSR位点为UNH974。
2.样本10个标记基因型统计
根据等位基因读数统计样本的基因型，在每个标记下，每个样本都具有两个等位基因，等位基因相同的为纯合，等位基因不同的为杂合。
3.亲本和子代基因型文件输出
将亲本个体根据表型性别分为父本组和母本组，所有样本按照软件要求格式准备基因型文件，所有文件均为文本文件格式。如10个标记按照基因型对应顺序单独生成一个文件，格式如下：
P1A1 114122 166168 242258 138144 186188 140140 164166 000000 102102192192 P1A2 114116 156156 220242 138154 186188 140146 164164 248258 102102192192
每行中第一项是检测样本的编号，每个标记的基因位点用6位数字表示(94则写为094)，000000表示该标记下基因型数据不准确或为空白值。
4.PAPA软件进行亲子鉴定
选择性别分配方式，分别输入F1父本和母本的基因型文件、子代F2的基因型文件和标记的位点文件，输出文件查看配对结果，当10个SSR标记的基因型均与父本、母本一致时，则判定为配对成功，样本和父本、母本具有亲缘关系。
实施例3吉富罗非鱼亲子鉴定试剂盒在吉富罗非鱼亲子鉴定中的应用
一、实验方法
1、样品来源及DNA提取
以广东冠利达海洋生物有限责任公司养殖基地自繁的F1吉富罗非鱼群体(54尾：26M 28F)作为亲本，繁育得到F2子代群体。从F2子代群体中取样544尾，采用实施例1的方法用96孔板提取亲本和子代群体样本DNA，原液稀释5倍用于PCR扩增实验，保存于-20℃。
2、PCR扩增与电泳检测
以提取的样本DNA为模板，使用实施例2的亲子鉴定试剂盒进行PCR扩增。根据PCR扩增结果，吸取每对SSR标记引物扩增的PCR产物6μL于0.5mL离心管中，用排枪吹打混匀，适当离心后用锡箔纸避光待上机分析。
3、基因型阅读与亲子鉴定分析
利用多色毛细管电泳技术对上述的PCR产物进行分析，使用实施例2的试剂盒使用方法进行亲子鉴定分析。
二、实验结果
10个标记的检测样本和等位基因结果如表4～5所示，等位基因数即该标记在吉富罗非鱼F1、F2中扩增表现出的等位基因大小的种类(例：UNH719在扩增中得到的等位基因大小有114、116和122bp3种，则等位基因数为3)。亲子鉴定结果显示亲本F1(52尾：26M、26F)和子代F2(544尾)成功匹配的个体有474个(87.13％)，每个家系的子代个数范围在0～31，部分匹配结果如表6所示。以上分析结果证实这10个吉富罗非鱼的SSR标记以及10对SSR标记引物可以应用于吉富罗非鱼亲子鉴定的分析。
表4.样本中10个SSR标记基因型检测结果
表5.10个标记在吉富罗非鱼F1、F2样本中的基因型统计
表6.吉富罗非鱼F1、F2样本亲子鉴定的部分结果
注：表中Female1-Female5表示F1亲代母本编号；Male1-Male6表示F1亲代父本编号；PA～PH等表示F2子代个体编号。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 中山大学
广东冠利达海洋生物有限责任公司
<120> 用于吉富罗非鱼亲子鉴定的SSR标记引物组及其应用
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaaccattca tccttcactc 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaatgcttag tgcccatcaa t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aacggtgaca tcttcgcaac t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gatttggcta tctggcgtgt g 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcttcctcag cccatctgtt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caactgttgg cagtgacagg 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acacaacaag cagatggaga c 21
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caggtgtgca agcagaagc 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caggtgtgca agcagaagc 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tcgctgagat tacaccatcg 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aagaggagag cacggaaaca 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gtcacaaacc acagccaaga 20
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ccctcacaca cactctt 17
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gataacgaca cgacagtac 19
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cgcaggaggc tttaccaca 19
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tcaagttgcg tctctgtcac c 21
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gacaacagaa accacctaat tgc 23
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
acctctgatt ccgagcagtg 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gcacgtctga gagtgtggaa 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cagctttcac accagcctaa 20
Claims (10)
1.一种吉富罗非鱼亲子鉴定试剂，其特征在于，所述试剂通过检测10个SSR标记的基因型对吉富罗非鱼进行亲子鉴定，所述10个SSR标记为UNH719、GM222、GM526、UNH207、GM560、UNH911、UNH166、GM276、UNH942、UNH974。
2.根据权利要求1所述试剂，其特征在于，所述试剂包括用于吉富罗非鱼亲子鉴定的SSR标记引物组，所述引物组的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～20所示。
3.根据权利要求2所述试剂，其特征在于，所述SSR标记引物组包括正向引物和反向引物，所述正向引物标记有不同的荧光基团，其中每种荧光基团标记1～4条正向引物。
4.权利要求1～3任一所述试剂在吉富罗非鱼亲子鉴定中的应用。
5.权利要求1～3任一所述试剂在制备吉富罗非鱼亲子鉴定试剂盒中的应用。
6.一种吉富罗非鱼亲子鉴定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1～3任一所述试剂。
7.根据权利要求6所述试剂盒，还包含2×Taq PCR MasterMix。
8.一种吉富罗非鱼亲子鉴定的方法，其特征在于，提取待测吉富罗非鱼的基因组DNA，利用权利要求3所述SSR标记引物组进行PCR扩增，对PCR扩增后的产物进行基因型分析，鉴定各子代的亲本来源，对子代和亲本进行匹配。
9.根据权利要求8所述吉富罗非鱼亲子鉴定的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：模板DNA 3μL，正向引物和反向引物各1μL，2×Taq PCR MasterMix 10μL，H2O 5μL，共20μL。
10.根据权利要求8所述吉富罗非鱼亲子鉴定的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃再延伸7min，4℃保存。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110528962.4A CN113215276B (zh) | 2021-05-14 | 2021-05-14 | 用于吉富罗非鱼亲子鉴定的ssr标记引物组及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110528962.4A CN113215276B (zh) | 2021-05-14 | 2021-05-14 | 用于吉富罗非鱼亲子鉴定的ssr标记引物组及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113215276A CN113215276A (zh) | 2021-08-06 |
| CN113215276B true CN113215276B (zh) | 2022-05-10 |
Family
ID=77092054
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110528962.4A Active CN113215276B (zh) | 2021-05-14 | 2021-05-14 | 用于吉富罗非鱼亲子鉴定的ssr标记引物组及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113215276B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102094069A (zh) * | 2009-12-10 | 2011-06-15 | 李思发 | 吉鲡鱼遗传特性甑别方法及其应用 |
| CN102533751A (zh) * | 2012-02-20 | 2012-07-04 | 西南大学 | 尼罗罗非鱼性染色体特异分子标记 |
-
2021
- 2021-05-14 CN CN202110528962.4A patent/CN113215276B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102094069A (zh) * | 2009-12-10 | 2011-06-15 | 李思发 | 吉鲡鱼遗传特性甑别方法及其应用 |
| CN102533751A (zh) * | 2012-02-20 | 2012-07-04 | 西南大学 | 尼罗罗非鱼性染色体特异分子标记 |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| DNA指纹技术鉴定尼罗罗非鱼各家系父本;党广成等;《山东农业大学学报(自然科学版)》;20140704;第45卷(第1期);第030-035页 * |
| Evaluation of the genetic diversity of microsatellite markers among four strains of Oreochromis niloticus;M A D Dias等;《ANIMAL GENETICS 》;20160301;第47卷(第3期);第345-353页 * |
| Sex determination in the GIFT strain of tilapia is controlled by a locus in linkage group 23;Khanam Taslima等;《BMC Genetics》;20200429;第1-15页 * |
| 五个红罗非鱼群体的遗传多样性分析;何金钊等;《水生生物学报》;20170306;第41卷(第2期);第326-333页 * |
| 利用微卫星标记分析两个吉富罗非鱼群体的遗传差异;李建林等;《南方农业学报》;20150302;第46卷(第1期);第138-143页 * |
| 吉富罗非鱼不同选育群体的遗传多样性;李莉好等;《南方水产》;20071005;第3卷(第5期);第40-48页 * |
| 橙色莫桑比克罗非鱼微卫星遗传多样性分析及其与尼罗罗非鱼差异位点的筛选;宋红梅等;《中国水产科学》;20080515;第15卷(第3期);第400-406页 * |
| 罗非鱼4个选育群体遗传结构SSR分析;蒋家金等;《广东海洋大学学报》;20080815;第28卷(第4期);第10-14页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113215276A (zh) | 2021-08-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109055571B (zh) | 黄鳍棘鲷微卫星标记的特异性引物及应用 | |
| CN109825598B (zh) | 一种与澳洲白绵羊毛发粗细极显著相关的snp标记、分子标记及应用 | |
| CN108374054B (zh) | 适用于毛细管电泳检测技术的一组水稻ssr分子标记及其应用 | |
| CN107354211B (zh) | 林麝四碱基微卫星遗传标记位点及其筛选方法 | |
| CN108060240B (zh) | 一种用于插入缺失多态性检测的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用 | |
| CN105886642A (zh) | 与中国绵羊尾型性状相关的snp分子标记及其应用 | |
| CN109457035B (zh) | 卵形鲳鲹亲子鉴定的ssr荧光标记引物及应用 | |
| CN110622920A (zh) | 一种纯黑毛色猪种的选育方法 | |
| CN110438242B (zh) | 一种三疣梭子蟹微卫星标记的引物及其应用 | |
| CN112176091A (zh) | 一种与茄子萼片颜色性状基因紧密连锁的caps分子标记及制备方法 | |
| CN108823294B (zh) | 基于20个单倍群d的y-snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒 | |
| CN110541041A (zh) | 与中国家马矮小性状相关的snp标记及其应用 | |
| CN108220473B (zh) | 利用叶绿体InDel标记鉴别玉米S型胞质不育材料 | |
| CN107988385B (zh) | 一种检测肉牛PLAG1基因Indel标记的方法及其专用试剂盒 | |
| CN107142326B (zh) | 一种杜泊羊snp标记及其筛选方法和应用 | |
| CN110527743B (zh) | 用于鉴别新疆彩色棉品种的多态性分子标记及应用 | |
| CN113215276B (zh) | 用于吉富罗非鱼亲子鉴定的ssr标记引物组及其应用 | |
| CN116179657B (zh) | 鉴定鳢的引物组合、微卫星标记组合、多重pcr体系及其方法和应用 | |
| CN106167825A (zh) | 一种黄颡鱼生长特性相关的微卫星标记及其检测和应用 | |
| CN106701930B (zh) | 利用pcr-sscp检测绵羊fth-1基因插入缺失多态性的方法及其应用 | |
| CN112029868B (zh) | 三疣梭子蟹微卫星标记及在生长性状关联分析中的应用 | |
| CN108642190B (zh) | 基于14个常染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒 | |
| CN110016510B (zh) | 一种用于罗氏沼虾遗传选育的分子标记 | |
| CN107988386B (zh) | 一种用于翘嘴鳜亲子鉴定的ssr荧光标记引物及应用 | |
| CN108913784B (zh) | 一种脊尾白虾ec12 snp标记的检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |