CN108060240B - 一种用于插入缺失多态性检测的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用 - Google Patents
一种用于插入缺失多态性检测的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于插入缺失多态性检测的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用，试剂盒中包括34个InDel多态性位点和一个性别基因座(Amelogenin)，本发明试剂盒是可以同时检测34个插入缺失多态性位点和一个性别基因座(Amelogenin)的荧光标记复合扩增试剂盒，用上述试剂盒，对来自全国各地不同民族的456个无关个体进行检测和基因分型，其累计的个人识别率达到0.99999985，累积非父排除率为0.9989，结果表明该试剂盒的分型结果准确、重复性好、灵敏度高、分型结果准确，可为亲缘关系鉴定、同胞鉴定、个体识别以及医学诊断等提供一种新的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于插入缺失多态性检测的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用，属于生物学检测领域。
背景技术
DNA分子标记技术研究始于19世纪80年代，是指能够反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段，是DNA水平上遗传多态性的直接反映，大多数DNA分子标记以电泳谱带的形式表现个体之间的DNA差异，是生物分类学、育种学、遗传学和物种起源与进化等研究的重要技术指标之一。
法医遗传学通过对生物检材进行DNA遗传标记的检测来实现亲子鉴定和个人识别。插入缺失多态性(Insertion-Deletion，InDel)，是一段DNA片段因插入或缺失所形成的特殊类型的二等位基因多态性，是同源序列比对产生空位(gap)的现象，但大多数情况下无法获知祖先序列，很难判断空位位点是哪个序列发生了插入突变，或哪个序列发生了缺失突变，所以一般统称它们为插入缺失突变。Mills等于2006年创建了第一个人类基因组的插入/缺失图谱，InDel长度变化很大，平均长度为36bp，最长可达10,000bp，但99％以上的InDel长度小于50bp。InDel在基因组中分布广泛、数目众多，其分布密度仅次于单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)。
InDel标记是基于基因组中插入/缺失位点两侧的序列设计特异引物进行PCR扩增的标记。从法医学应用的角度来看，InDel标记具有许多的优点：(1)更低的突变率(代间突变率STR 10-3、SNP 2.3×10-8、InDel 2.3×10-9)，且发生后较稳定不易再突变；(2)扩增片段长度可以极大缩短有利于多个位点进行复合扩增，适用于DNA高度降解的检材；(3)InDel的两个等位基因表现为片段长度多态性，可利用法医DNA实验室现有的仪器设备进行基因分型；(4)InDel位点存在显著的人群和种族差异，可作为始祖信息位点判断地域来源。由于其兼具了STR和SNP两种遗传标记的双重优点且能够与普遍使用的STR分型技术平台相兼容，受到了国内外法医学者的关注。例如：Pereira等(2009)利用38个位于常染色体的InDel位点对来自非洲、欧洲及亚洲的人类群体进行遗传分析，结果显示所有的InDel位点均能够正确的分型，且随机匹配概率在10-14到10-15之间，表明InDel标记能有效地进行人类个体识别。
目前，InDel成熟的商品化试剂盒为DIP，能够检测30个InDel位点，已经在国外进行了大量的群体遗传学和法庭科学有效性验证研究。而国内有关InDel的研究较少，还未见有商品化的InDel试剂盒。
发明内容
本发明提供一种用于插入缺失多态性检测的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用，是可以快速检测人类基因组中34个InDel位点多态性和一个性别基因座(Amelogenin)的荧光复合扩增试剂盒，为亲缘关系鉴定、同胞鉴定、个体识别以及医学诊断等提供了一种新的方法。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种用于插入缺失多态性检测的荧光标记复合扩增试剂盒，包括如下35个基因座的复合扩增引物：rs1611001(F1)、rs2307959(F2)、rs16388(F3)、rs2307652(F4)、rs1610905(F5)、rs1305047(F6)、rs1610937(F7)、M117(F8)、rs2308292(F9)、rs28369942(H1)、rs16438(H2)、rs201771066(H3)、rs201771066(H4)、rs2308163(H5)、rs8190570(H6)、rs1305056(H7)、rs2307433(H8)、rs2308072(H9)、rs6481(H10)、rs1611048(T1)、Amelogenin(X/Y)、rs8178524(T2)、rs3081400(T3)、rs397832668(T4)、rs2307581(T5)、rs2307689(T6)、rs16363(T7)、rs2067235(R1)、rs17878444(R2)、rs146044344(R3)、rs2307924(R4)、rs17238892(R5)、rs17879936(R6)、rs1610963(R7)、rs140847(R8)。
上述试剂盒是可以同时检测34个插入缺失多态性位点和一个性别基因座(Amelogenin)的荧光标记复合扩增试剂盒。申请人经研究法发现，用上述试剂盒，对来自全国各地不同民族的456个无关个体进行检测和基因分型，其累计的个人识别率达到0.99999985，累积非父排除率为0.9989，结果表明该试剂盒的分型结果准确、重复性好、灵敏度高，可满足实际案例的需要。
为了进一步提高检测的方便性和准确性，复合扩增引物分为下列四组：
第一组：rs1611001(F1)、rs2307959(F2)、rs16388(F3)、rs2307652(F4)、rs1610905(F5)、rs1305047(F6)、rs1610937(F7)、M117(F8)、rs2308292(F9)；
第二组：rs28369942(H1)、rs16438(H2)、rs201771066(H3)、rs201771066(H4)、rs2308163(H5)、rs8190570(H6)、rs1305056(H7)、rs2307433(H8)、rs2308072(H9)、rs6481(H10)；
第三组：rs1611048(T1)、Amelogenin(X/Y)、rs8178524(T2)、rs3081400(T3)、rs397832668(T4)、rs2307581(T5)、rs2307689(T6)、rs16363(T7)；
第四组：rs2067235(R1)、rs17878444(R2)、rs146044344(R3)、rs2307924(R4)、rs17238892(R5)、rs17879936(R6)、rs1610963(R7)、rs140847(R8)。
上述四组引物是用不同的荧光染料进行标记的，第一组到第四组分别用FAM色、HEX色、TAMRA色和ROX色荧光染料进行标记。
本申请试剂盒包括有如下表1中34个InDel位点和一个性别基因座(Amelogenin)的引物：
表1 34个InDel位点和性别基因座的引物序列
本发明依据美国国家生物信息中心(National Center for BiotechnologyInformation,NCBI)，并结合现有相关成品试剂盒及文献报道，筛选InDel位点：InDel位点在人群中的最低等位基因频率大于0.1；插入/缺失的碱基介于3～22bp之间；散布于21对染色体上，同一染色体上的两个InDel位点间距不小于5MB；在中国汉族人群中的分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡。
本发明复合扩增系统的34个InDel位点和一个性别基因座分别采用FAM、HEX、TAMRA和ROX色荧光素进行标记(具体的荧光标记信息见表1)，分子量内标使用橙色的荧光染料Orange-500进行标记。本发明扩增的34个InDel位点和一个性别基因座的片段长度均在199bp以内。
上述用于插入缺失多态性检测的荧光标记复合扩增试剂盒内还包括反应混合液和热启动Taq酶。
进一步，本发明试剂盒的组份如下：
上述组份中，2.5×PCR Mix的成分及浓度：MgCl2 5mM,Tris-HCl 125mM(pH8.3,25℃)，KCl 125mM，dNTPs 0.5mM，BSA 1.5g/L；dNTPs是四种脱氧核糖核苷酸(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)的等摩尔混合物。反应所需的DNA聚合酶为热启动耐热DNA聚合酶，抗体封闭修饰或化学修饰，本申请所用的热启动Taq酶为宝生物工程(大连)有限公司的TaKaRa TaqTMHot Start Version(HS-Taq)。
本发明用于插入缺失多态性检测的荧光标记复合扩增试剂盒可用于亲缘关系鉴定、同胞鉴定、个体识别或医学诊断等。
用于插入缺失多态性检测的荧光标记复合扩增试剂盒的应用，包括如下步骤：
(1)从生物检材提取基因组DNA，作为DNA模板；或直接以血滤纸或唾液卡为模板，无需提取；
(2)配制PCR反应液：将反应缓冲液、热启动Taq DNA聚合酶、复合引物、sdH2O和DNA模板混合，采用三步扩增法，对待检测的多态性位点进行PCR扩增；
(3)对扩增产物进行荧光凝胶电泳分析和基因分型。
sdH2O为去离子超纯水。
上述采用五色荧光标记技术，特异性荧光引物扩增结合荧光凝胶电泳检测，以FAM、HEX、TAMRA、ROX和SIZ荧光信号为检测信号，通过遗传分析仪对荧光信号的收集来检测InDel位点的基因型，建立了一种快速、高效、可靠的InDel荧光检测系统。
上述步骤(1)中，从生物检材提取的基因组DNA，作为DNA模板；所述的生物检材可以是血液、毛发、唾液、精斑、脱落细胞和骨骼等，以上的DNA提取方法可以是磁珠法、Chelex-100法等经简单定量后稀释到合适的浓度，DNA模板量优选在0.5ng/μl至2ng/μl的范围内能够得到较好的扩增结果。
上述步骤(2)中，优选采用将34个InDel位点和一个性别基因座的引物混合物混于一管中进行PCR扩增；
步骤(2)中，PCR扩增中的程序依次是：(1)预变性、95℃3min；(2)热循环、94℃30s，60℃1min，共30个循环；(3)终延伸、68℃20min；(4)保温、4℃。
上述步骤(3)中，在遗传分析仪上进行毛细管电泳检测时，扩增产物与分子量内标、甲酰胺按照一定比例混合，进入仪器毛细管或凝胶中电泳分离。分子量内标是由多条已知长度的荧光标记DNA片段组成，用来计算PCR扩增产物片段长度，从而可以计算等位基因大小，与等位基因阶梯进行比对从而推测等位基因分型。
电泳后的数据可以再GeneMapper、GeneMarker、GeneScan等数据分析软件上分析，得到相应位点的基因分型图谱和数据。
反应缓冲液：MgCl2 5mM,Tris-HCl 125mM(pH8.3，25℃)，KCl 125mM，dNTPs(dATP、dTTP、dCTP和dGTP的等摩尔混合物)0.5mM，BSA(牛血清蛋白)1.5g/L。
本发明的创新点在于收集并筛选国内外研究较多的InDel多态性位点，并加入一个Y-InDel(M117)位点和一个性别决定基因座，分别设计各位点的特异性引物，组成引物混合物后对来自人体样本的基因组DNA进行荧光标记复合扩增和毛细管电泳检测，为法医学亲缘关系鉴定、同胞鉴定、个体识别以及医学诊断等领域提供一种新的检测方法。
本发明未提及的技术均参照现有技术。
有益效果：
1)经过实践验证，本发明该试剂盒的准确性强、灵敏度高、重复性好，分型结果准确，可满足实际需要；
2)本发明所研制的34个InDel位点和一个性别基因座的荧光复合扩增系统在模板量为200pg时仍可检出全部的35个位点；
3)本发明所筛选的34个InDel位点综合了国内外研究较热的位点，并加入一个Y-InDel(M117)位点，既可作为性别鉴定的补充又是可作为种族起源的参考依据；
4)本发明所涉及的特异性引物，具有较强的扩增特异性及温度耐受性(退火温度耐受范围56～62℃)，保证了再使用不同品牌或质量的PCR扩增仪时均能得到较好的扩增效果；
5)本发明的试剂盒不仅可单独使用也可作为STR荧光检测试剂盒的补充，对狗、猪、牛、羊、猫、鸡、鼠、兔、鱼和大肠杆菌DNA，10种不同种属物种进行检测，没有扩增峰，表明本发明具有良好的种属特异性；
6)本发明所需样本的适应性强，如血液、毛发、唾液、精斑、脱落细胞和骨骼等都能得到较好的扩增；
7)本发明的试剂盒可应用于法医学亲缘关系鉴定、个体识别，以及疾病诊断、生物分类学、育种学、物种起源与进化等领域。
附图说明
图1为实施例中基因分型标准物图；
图2为实施例2试剂盒的灵敏度检测(DNA模板量为125pg时的电泳图谱)；
图3为实施例3中父亲(a)、母亲(b)和儿子(c)的电泳图谱。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1：引物的设计、浓度的优化以及反应体系的建立
1.引物的设计及筛选
1.1序列下载
模板序列下载，从NCBI genebank上下载了InDel位点的基因序列，具体的序列信息如下表所示：
表2 34个InDel位点序列信息
表2中InDel标签与表1中的对应。
1.2引物的设计及筛选
确定好上述34个InDel位点和性别基因座的基因序列后，遵循引物设计的一般原则，利用Oligo7.0软件进行引物的设计，为了后续引物浓度的优化，在此设计的引物Tm值均在58～62℃之间，扩增产物长度的范围为95～199bp。对每对引物进行扩增测试，得到峰形锋利、峰高较高的扩增峰，再经过复合扩增测试，不产生非特异扩增峰、引物二聚体，不发生其他相互作用或交叉反应。本发明的所有引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。
引物筛选的具体方法如下：(1)首先对34个InDel位点和一个性别基因座位点的引物进行单扩测试，若有非特异性扩增峰即更改相应位点的引物；(2)然后进行单色复扩测试，若有非特异性扩增峰则需找出产生非特异性峰的标记和非标记引物并更改相应位点的引物；(3)最后进行引物的复合扩增，若有非特异性扩增峰则需找出产生非特异性峰的标记和非标记引物并更改相应位点的引物。
本发明经过多次实验，对引物进行反复筛选，最终确定了各InDel位点的引物序列，具体的引物序列及信息见发明内容中的表1。
2.引物浓度的优化
由于每条引物的效率以及不同荧光素的信号强度之间的差异，致使每条引物要达到同样的扩增峰值时在体系中的加量不同。在确定好引物序列后，对每对引物的浓度进行优化测试。具体的方法如下：(1)首先将所有位点的引物组成复合引物进行扩增，使FAM色和HEX色所有位点的引物在扩增体系中的终浓度均为0.05μM，TAMRA色和ROX色所有位点的引物在扩增体系中的终浓度均为0.1μM；(2)将步骤(1)中的扩增产物进行毛细管电泳检测，根据检测的各位点扩增峰值的高低调整各位点引物的加入量，使各位点峰值整体均衡性达到50％以上。本发明经过引物浓度的多次微调实验，最终确定了各位点引物在扩增体系中的最适浓度。具体的浓度见下表：
表3 各位点引物在扩增体系中的终浓度
表3中的SEQ ID NO与表1中的对应。
3.扩增及产物检测的实验过程
(1)扩增体系
首先完成除模板外的PCR反应体系的配制，最后加入扩增模板；提取基因组DNA时，先用紫外风光光度计测量浓度，再稀释使其终浓度在0.5-2ng/μl左右，在实际操作中，一般取1～2μl的DNA模板进行扩增。体系中各组分的加样量如表4所示。
表4 试剂盒扩增体系
上述组份中，2.5×Reaction Mix的成分及浓度：MgCl2 5mM,Tris-HCl 125mM(pH8.3,25℃)，KCl 125mM，dNTPs 0.5mM，BSA 1.5g/L；dNTPs是四种脱氧核糖核苷酸(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)的等摩尔混合物。热启动DNA聚合酶为宝生物工程(大连)有限公司的TaKaRa TaqTM Hot Start Version(HS-Taq)。
(2)扩增程序
上述体系配置好后立即用掌式离心机离心，后将PCR管置于热循环仪上，选择表5的程序进行扩增，扩增后的产物应立即进行荧光凝胶电泳检测或是避光保存。
表5 试剂盒扩增程序
(3)扩增产物在遗传分析仪上荧光检测
由去离子甲酰胺与试剂盒中分子量内标Orange-500组成上样混合物(按体积比9.5:0.5混合)。将10μl上样混合物与1μl扩增产物混合，离心，避免产生气泡。95℃变性3分钟，冰浴3分钟，用遗传分析仪3130xl(美国应用生物系统公司)检测分析。
实施例2：试剂盒灵敏度检测
应用本发明的试剂盒对扩增DNA模板的灵敏度进行检测，分别配制不同浓度的中国汉族男性基因组DNA(1ng、500pg、250pg、125pg、62.5pg和31.25pg)，按照实施例1中表4的扩增体系和表5的扩增程序进行扩增检测。检测结果显示：本发明试剂盒的灵敏度可达125pg，且色间峰高的均衡性较好。附图2为125pg样本的扩增结果电泳图谱。
实施例3：试剂盒的应用(亲子鉴定)
本发明的试剂盒已经在发明人的实验室对来自全国各地不同民族的456个无关个体进行检测和基因分型，其累计的个人识别率达到0.99999985，累积非父排除率为0.9989，结果表明该试剂盒的分型结果准确、重复性好、灵敏度高，可满足实际案例的需要。
下面列举一本发明的试剂盒用于亲子鉴定的实际案例。
样本为宿迁子渊司法鉴定所提供，
1、收集亲子鉴定案件中的血斑：亲子鉴定样本由宿迁子渊司法鉴定中心提供。
2、各种检材的基因组DNA提取：参考《GA/T 383-2002法庭科学DNA实验室检验规范》进行。
3、扩增检测：按实施例1的扩增条件及检测条件进行。
附图3(a)、(b)、(c)为该案例中父亲、母亲和儿子的基因分型图谱，表6为该案例中疑似父亲、母亲和儿子的基因型。
表6 本实施例中父亲、母亲和儿子的基因型
结果显示疑似父-母-子33个SNP基因座的检测结果符合孟德尔遗传规律。与用常染色体STR检测结果一致。此方法可以作为亲子鉴定的补充手段。
序列表
<110> 江苏苏博生物医学股份有限公司
江苏苏博生物医学科技南京有限公司
<120> 一种用于插入缺失多态性检测的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用
<140> 2018101462646
<141> 2018-02-12
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gagaaattaa attcaaatgt ccaactgatg 30
<210> 20
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
atttagacaa atttcacttg taaagctg 28
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
caccagagca ctacagcctt ttat 24
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gccccagtgg ccaactaggg 20
<210> 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ctatatccat cctctcccaa tgtgt 25
<210> 24
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
atatattaaa ttttgcatct ttcctttaca gc 32
<210> 25
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ttattttgtc ttcagtggct ttacttcc 28
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tgtttgaagg tgtagagatg catca 25
<210> 27
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tctgtactta taaggcgatc tgctcc 26
<210> 28
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
attggaatgg gttttgttgt ggttctt 27
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cgccttaaac agagagaagc at 22
<210> 30
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
atgagctgag aaagtgtcac aagacc 26
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
atggcagaga ctgaaggatg aa 22
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
atcccaaagt cacatgattc aacag 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
agcctggaag acaagcagga gt 22
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gactcccaag agctgtggat t 21
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agtcagaata ctcctttgtt cctcc 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
agttaattat ttgcccccac atttt 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tgtgctataa tggcagaact gggta 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
attccccacc actggagctg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
ctgcatcctt gctgacgaaa t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ccacttctct agggtctatc cag 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaccatcaga gcttaaactg ggaa 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggctctgtaa agaatagtgt gttgat 26
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtgctggtcc attctcttgt aac 23
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggctgga gaaggagcga 20
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acatgtctga ctttgttgct agttt 25
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<212> DNA
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<212> DNA
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aaaggcatct gaaatagtgg agctaaat 28
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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actgataaag aagaagctga gatctagag 29
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<212> DNA
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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ccttggtaat tcagcaacaa tctaaaggta 30
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<212> DNA
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<400> 59
caggtcacat cccatcagct tc 22
<210> 60
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<212> DNA
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agccgggttc tcgtctagta 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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taatcttctc tcattatggt taccaccaag 30
<210> 62
<211> 25
<212> DNA
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<400> 62
ctaggggaat atgtgtcttc tgtgg 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaccaagata gcaccattgc ac 22
<210> 64
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caaaacccat ttctttccac aattcctc 28
<210> 65
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
ctagtccagg ttttgctttt cagtc 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atcattcata atcctatcaa agaagcattg 30
<210> 67
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<212> DNA
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tccaagtaag cattagctgt aagtattt 28
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<212> DNA
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ctttaggcca ctgtaaatgg ctg 23
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<212> DNA
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actggcaaat cagcaggttg tg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
tagcattcaa cagtttgagg gaaataag 28
Claims (9)
1.一种用于插入缺失多态性检测的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：包括34个InDel位点和一个性别基因座的复合扩增引物，所述34个InDel位点和一个性别基因座为：rs1611001、rs2307959、rs16388、rs2307652、rs1610905、rs1305047、rs1610937、M117、rs2308292、rs28369942、rs16438、rs201771066、rs150042219、rs2308163、rs8190570、rs1305056、rs2307433、rs2308072、rs6481、rs1611048、Amelogenin(X/Y)、rs8178524、rs3081400、rs397832668、rs2307581、rs2307689、rs16363、rs2067235、rs17878444、rs146044344、rs2307924、rs17238892、rs17879936、rs1610963、rs140847；
所述34个InDel位点和一个性别基因座的复合扩增引物的序列如下表中SEQ ID NO.01～SEQ ID NO.70所示：
2.根据权利要求1所述的用于插入缺失多态性检测的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：复合扩增引物分为下列四组：
第一组：SEQ ID NO.01～02、SEQ ID NO.03～04、SEQ ID NO.05～06、SEQ ID NO.07～08、SEQ ID NO.09～10、SEQ ID NO.11～12、SEQ ID NO.13～14、SEQ ID NO.15～16、SEQ IDNO.17～18；
第二组：SEQ ID NO.19～20、SEQ ID NO.21～22、SEQ ID NO.23～24、SEQ ID NO.25～26、SEQ ID NO.27～28、SEQ ID NO.29～30、SEQ ID NO.31～32、SEQ ID NO.33～34、SEQ IDNO.35～36、SEQ ID NO.37～38；
第三组：SEQ ID NO.39～40、SEQ ID NO.41～42、SEQ ID NO.43～44、SEQ ID NO.45～46、SEQ ID NO.47～48、SEQ ID NO.49～50、SEQ ID NO.51～52、SEQ ID NO.53～54；
第四组：SEQ ID NO.55～56、SEQ ID NO.57～58、SEQ ID NO.59～60、SEQ ID NO.61～62、SEQ ID NO.63～64、SEQ ID NO.65～66、SEQ ID NO.67～68、SEQ ID NO.69～70。
3.根据权利要求2所述的用于插入缺失多态性检测的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：四组引物是用不同的荧光染料进行标记的，第一组到第四组分别用FAM色、HEX色、TAMRA色和ROX色荧光染料进行标记。
4.根据权利要求1所述的用于插入缺失多态性检测的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：试剂盒内还包括反应缓冲液和热启动Taq酶。
5.权利要求1～4任一项所述的一种用于插入缺失多态性检测的荧光标记复合扩增试剂盒的应用，其特征在于：用于亲缘关系鉴定、同胞鉴定、个体识别。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：包括如下步骤：
(1)从生物检材提取基因组DNA，作为DNA模板；或直接以血滤纸或唾液卡为模板，无需提取；
(2)配制PCR反应液：将反应缓冲液、热启动Taq DNA聚合酶、复合引物、sdH2O和DNA模板混合，采用三步扩增法，对待检测的多态性位点进行PCR扩增；
(3)对扩增产物进行荧光凝胶电泳分析和基因分型。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：反应缓冲液的组成为：MgCl2 5mM,Tris-HCl125mM，KCl 125mM，dNTPs0.5mM，BSA 1.5g/L，其中，dNTPs是四种脱氧核糖核苷酸dATP、dTTP、dCTP和dGTP的等摩尔混合物。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：步骤(2)中，PCR扩增中的程序依次是：(1)预变性：95℃3min；(2)热循环：94℃30s，60℃1min，共30个循环；(3)终延伸：68℃20min；(4)保温：4℃。
9.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：步骤(1)中，生物检材为血液、毛发、唾液、精斑、脱落细胞或骨骼；提取基因组DNA的方法为磁珠法或Chelex-100法，模板浓度为0.5-2ng/μl。
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