CN110257489A

CN110257489A - 一种基于二代测序的30个Multiple-allele SNP位点的检测技术体系

Info

Publication number: CN110257489A
Application number: CN201910519003.9A
Authority: CN
Inventors: 朱波峰; 刘艳芳; 靳小业; 解通
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2019-06-17
Filing date: 2019-06-17
Publication date: 2019-09-20

Abstract

本发明属于法医遗传学应用研究领域，具体涉及一种基于二代测序（Next Generation Sequencing，NGS）的用于法医学个体识别和亲缘关系鉴定的30个Multiple‑allele SNP位点的检测技术体系的研发及其检测技术方法。本发明应用NGS平台（illumina NOVASEQ）对30个Multiple‑allele SNP位点进行深度平行测序，可实现同时对多个样本的30个目标区域的测序分析，节约人力、物力和财力，提到了检测效率；PCR产物片段分布在58‑139 bp，体系适用于法医降解样本的检测；根据Multiple‑allele SNP位点非二等位基因的特点及基于序列内部碱基深度的读取判断，可提高对法医混合检材的分析能力。该检测体系在法医学领域具有较高的应用价值。

Description

一种基于二代测序的30个Multiple-allele SNP位点的检测技术体系

技术领域

本发明属于法医遗传学应用研究领域，具体涉及一种基于二代测序的30个Multiple-allele SNP位点的分型检测技术体系的研发及其检测技术方法。

背景技术

单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）在人类基因组含量丰富，具有扩增片段短、遗传稳定、突变率低等特点，已被广泛应用于法医遗传学研究。目前，关于SNP位点的法医遗传学应用试剂盒的研究主要聚焦于二等位基因SNP位点。二等位基因SNP位点因等位基因数目仅为两个，位点的个体识别力相对较低，通常需要40～60个SNP位点的组合，才能达到法医学个体识别或亲权鉴定的效能要求，且其在检测混合样本检材方面存在一定的局限性。多等位基因SNP（Multiple-allele SNP）是指在基因组的特定核苷酸位置存在两种以上的碱基变异，其中频率最低的等位基因的基因频率大于1%，可以分为三等位基因SNP和四等位基因SNP位点。Multiple-allele SNP位点遗传稳定性好、突变率低；与二等位基因SNP位点相比，位点的多态性相对较高，只需要相对较少的Multiple-alleleSNP位点便能获得与现有STR体系大致相同的鉴识效能；另外，可根据在一个Multiple-allele SNP位点上检测的第三或第四等位基因来提示外源DNA的存在，也有利于对混合样本的鉴别研究。

基于一代测序技术，通常通过毛细管电泳平台，检测单碱基延伸反应产物，来进行SNP位点分型，目前仍是应用较广泛的SNP分析方法之一。但应用一代测序平台进行SNP检测存在一定的局限性，如在同一反应体系中可检测的SNP位点数量有限；可供选择的用于标记的荧光染料数量有限；设计引物时需要特意添加不同长度的“加尾”的重复序列，以此来区分不同的SNP位点等。综上所述，一代测序方法难以实现对大批量样本和大量位点的并行检测。二代测序（Next Generation Sequencing, NGS）又称大规模平行测序（MassivelyParallel Sequencing，MPS）技术，可实现同时对多个样本多个目标区域进行高通量测序分析，可有效节约人力、物力和财力。NGS进行文库构建时，无需电泳及荧光素标记，所以可将扩增产物设计成尽可能短的片段，这有助于提高对高度降解检材检测的成功率；通过分析获得的碱基序列的测序深度，可提高对法医混合检材的分析能力。以往针对Multiple-allele SNP位点在中国人群法医遗传学相关研究，主要集中在基于一代平台对不超过20个Multiple-allele SNP位点构建检测试剂盒。

随着基因组学技术特别是NGS技术的快速发展，多种高通量、快速、自动化、低成本的高通量测序技术已被广泛应用于基因组测序研究的各个领域。基于高通量测序技术的优势，开发基于NGS的30个Multiple-allele SNP位点的检测技术体系，将在法医亲缘关系鉴定，尤其是降解、混合等特殊环境下生物检材的个体识别方面，发挥比传统的SNP试剂盒更好的优势。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于NGS平台的可用于法医个体识别（尤其是降解、混合检材）和亲缘关系鉴定的30个Multiple-allele SNP位点的检测技术体系的研发及其检测技术方法。

为了实现本发明，本发明采用了以下技术方案：

（1）Multiple-allele SNP位点的甄选原则

基于千人基因组第三阶段数据库和以往关于Multiple-allele SNP位点的文献报道，按照如下要求筛选符合条件的Multiple-allele SNP位点。本发明以千人基因组第三阶段数据库中的中国北京汉族人群（Han Chinese in Beijing, China, CHB）作为参考群体，对Multiple-allele SNP位点进行甄选和法医学效能的预评估，位点的甄选标准为：1）位于基因组中非编码区域；2）在CHB人群内频率最低的等位基因的基因频率大于1%；3）在CHB群体中观察杂合度大于0.5；4）各位点间的物理距离大于10Mb，且所有位点在该群体中处于连锁平衡状态；5）各位点的基因型频率分布在群体中符合Hardy-Weinberg平衡（经过Bonferroni校正）；6）可设计出适宜于NGS测序的PCR引物；7）具有人源的种属特异性。本发明甄选的30个Multiple-allele SNP位点相关信息如表1所示，包括26个三等位基因SNP和4个四等位基因SNP位点。

表1：本体系中所包含的30个Multiple-allele SNP位点信息

编号	SNP位点（rs#）	染色体	位置	等位基因
					1	rs7529107	1	179543495	G/A/T
2	rs10910445	1	232421037	A/T/C
					3	rs2012372	2	75157464	G/C/T
4	rs697826	2	115449746	G/C/T
					5	rs6752726	2	141518055	G/C/T
6	rs4684081	3	1203846	A/C/T
					7	rs76507337	3	24907134	G/A/C/T
8	rs6812234	4	5752628	A/C/T
					9	rs1914740	4	57073711	G/C/T
10	rs325482	5	104704964	G/A/T
					11	rs357613	5	151463926	G/A/T
12	rs9272608	6	32639960	G/A/C/T
					13	rs2008003	7	30668923	G/A/C
14	rs2550989	7	133815560	G/A/T
					15	rs4872345	8	25730272	G/A/C/T
16	rs1283683	8	107430762	G/A/T
					17	rs2307055	9	62868164	G/A/T
18	rs11496601	9	126413181	G/A/T
					19	rs11523905	11	2477029	G/A/T
20	rs200088812	14	106643447	G/A/C/T
					21	rs140676	15	27480527	A/C/T
22	rs281288	15	47389506	G/A/T
					23	rs8030566	15	83885524	A/C/T
24	rs12716851	16	78154757	G/C/T
					25	rs3859194	17	39969543	G/C/T
26	rs632464	18	11877865	G/A/T
					27	rs11082989	18	53392433	G/A/C
28	rs1965767	19	10749539	A/C/T
					29	rs7259949	19	45478699	G/A/C
30	rs3827115	20	61934329	G/A/T

（2）文库构建

文库的构建主要包括如下三个步骤：1）第一步PCR扩增及其扩增产物的纯化；2）第二步PCR扩增及其产物的纯化；3）第二步PCR产物纯化后的定量分析。首先，第一步PCR反应主要是用于富集目的片段，反应体系为50μL，反应条件为：98℃预变性2 min；98℃变性30 sec，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共32个循环；最后，72℃延伸5 min。用2%的琼脂糖凝胶电泳检测多重PCR产物，并采用Agencourt AMPure XP核酸纯化试剂盒（Beckman Coulter,USA）对多重PCR产物进行纯化。其次，对纯化后的多重PCR产物进行第二步PCR反应用于连接测序引物和标签序列，PCR反应体系为50μL，反应条件为：98℃预变性2 min；98℃变性30sec，65℃退火30 sec，72℃延伸30 sec，共12个循环；72℃延伸5 min。用2%的琼脂糖凝胶电泳检测加接头的PCR产物，并采用Agencourt AMPure XP核酸纯化试剂盒（BeckmanCoulter, USA）对PCR产物进行纯化。最后，纯化后的PCR产物用Qubit dsDNA HS核酸定量分析试剂盒（Thermo Fisher Scientific, USA）进行文库定量。

（3）NGS测序与数据分析

定量后的PCR产物在illumina NOVASEQ上进行测序，获得Multiple-allele SNP位点的测序结果，采用序列分析软件进行分析：将原始测序数据通过cutadapt软件低质量碱基和接头序列后，利用BWA软件将过滤后的序列比对到NCBI数据库人类基因组参考序列UCUSGRCh37（hg19）上，再利用GATK软件和VarScan软件分析位点的相关信息。

与现有的技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明提供一种基于NGS的30个Multiple-allele SNP位点的检测技术体系及其检测技术方法，包括甄选的30个Multiple-allele SNP位点及其引物对组成的引物混合物、NGS测序文库的构建、测序质控和结果分析等。本发明基于NGS构建Multiple-allele SNP位点的检测体系，其相比基于一代平台构建的二等位基因SNP检测体系，具有如下优势：位点多态性高、NGS技术的使用更易于检测降解、混合检材等。本发明甄选的Multiple-allele SNP位点位于非编码区域，避开了与疾病相关的功能位点；在CHB人群内频率最低的等位基因的基因频率大于1%，位点观察杂合度大于0.5，具有较高的个人识别能力；所设计的引物PCR产物大小分布在58-139 bp，适用于法医降解样本的检测；另外，所选的位点在群体中均符合Hardy-Weinberg平衡（经过Bonferroni校正）；同一条染色体上的各位点间的物理距离大于10 MB，各位点不连锁，并处于连锁平衡状态。本发明基于NGS测序平台进行检测，其相比传统的一代测序平台，具有通量高、时间短等优势，节约了时间成本和人力成本；无需电泳及荧光物质标记，将扩增产物尽可能设计成更短的片段，提高了对降解样本的检测成功率；根据Multiple-allele SNP位点非二等位基因的特点及基于序列碱基测序深度的读取判断，有利于对法医混合检材的分析。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施步骤进一步地详细说明。需要指出的是，以下实施举例仅对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。

检测方法：

（1）本发明文库构建的多重聚合酶链式反应体系组成：

组成	体积（μL）/浓度
		5×Phusion HF Buffer	10 μL
dNTPs（2.5 mM）	4.8 μL
		Each Forward primer	终浓度20 nM
Each Reverse primer	终浓度20 nM
		Phusion HotStart ⅡDNA Polymerase	1 μL
gDNA	10 ng
		ddH2O	up to 50 μL
Total	50 μL

反应条件为：

（2）用2%的琼脂糖凝胶电泳检测多重PCR产物，并采用Agencourt AMPure XP核酸纯化试剂盒（Beckman Coulter, USA）对多重PCR产物进行纯化。

（3）接头及测序引物的连接反应。

PCR反应体系为：

组成	体积（μL）
		5×Phusion HF Buffer	10 μL
dNTPs（2.5 mM）	4.8 μL
		Barcode（50 μM）	2 μL
PE 1.0（50 μM）	2 μL
		Phusion HotStart ⅡDNA Polymerase	1μL
上述纯化的PCR 产物	4 μL
		ddH<sub>2</sub>O	up to 50 μL
Total	50 μL

PCR反应条件为：

（4）用2%的琼脂糖凝胶电泳检测加接头的PCR产物，并采用Agencourt AMPure XP核酸纯化试剂盒（Beckman Coulter, USA）对加接头PCR产物进行纯化。

（5）使用Qubit dsDNA HS核酸定量分析试剂盒进行文库定量；定量后的PCR产物在illumina NOVASEQ二代测序平台上进行测序反应，最后用序列分析软件cutadapt、BWA、GATK及VarScan软件分析检测结果，成功确定30个Multiple-allele SNP位点的测序分型。

Claims

1.一种基于二代测序的30个Multiple-allele SNP位点的检测技术体系，其特征在于甄选的30个Multiple-allele SNP位点；30个Multiple-allele SNP位点的引物序列；30个Multiple-allele SNP位点的引物对组成的引物混合物；30个位点构建的扩增体系组分开发。

2.根据权利要求书1所述，技术体系中30个Multiple-allele SNP位点文库构建的扩增体系组分为5×Phusion HF Buffer、dNTPs（2.5 mM）、30个Multiple-allele SNP位点的引物混合物、Phusion HotStartⅡDNA Polymerase、ddH2O、待测样本DNA（可为标准品DNA9947A、标准品DNA9948）。

3.一种基于二代测序的30个Multiple-allele SNP位点的检测技术体系，其特征在于包括如下步骤：步骤（1）：取待测样本于扩增体系中，采用聚合酶链式反应富集文库；步骤（2）：对步骤（1）中的PCR产物进行质量检测与纯化；步骤（3）：对步骤（2）纯化后的PCR产物进行测序引物与接头的连接；步骤（4）：对步骤（3）中加接头的文库进行质量检测与纯化；步骤（5）：对步骤（4）对纯化后的文库进行定量后，在NGS平台上完成Multiple-allele SNP位点的测序；步骤（6）：对步骤（5）获取的测序文件进行质控和结果分析，确定Multiple-alleleSNP位点分型。

4.根据权利要求3所述，其特征在于步骤（1）中的待测样本为人源性的DNA样本。

5.根据权利要求书3所述，其特征在于步骤（1）中的聚合酶链式反应体系包括5×Phusion HF Buffer、dNTPs（2.5 mM）、30个Multiple-allele SNP位点的引物混合物、Phusion HotStart ⅡDNA Polymerase、ddH2O；反应条件为：98℃预变性2 min；98℃变性30sec，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共32个循环；72℃延伸5 min。

6.根据权利要求书3所述，其特征在于步骤（2）、（4）中使用2%的琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物检测，使用Agencourt AMPure XP核酸纯化试剂盒进行纯化。

7.根据权利要求书3所述，其特征在于步骤（5）使用Qubit dsDNA HS核酸定量分析试剂盒对纯化后的加接头PCR产物进行定量。

8.根据权利要求书3所述，其特征在于步骤（5）中使用NGS平台（illumina NOVASEQ）对30个Multiple-allele SNP位点进行测序分型。