CN105463116A

CN105463116A - 一种基于20个三等位基因snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒及检测方法

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Publication number: CN105463116A
Application number: CN201610027645.3A
Authority: CN
Inventors: 扎拉嘎白乙拉; 廖慧丹; 蔡继峰; 刘颖; 刘艳芳; 郭亚东; 闫杰; 丁艳君
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2016-01-15
Filing date: 2016-01-15
Publication date: 2016-04-06
Anticipated expiration: 2036-01-15
Also published as: CN105463116B

Abstract

本发明属法医学技术领域，具体涉及一种基于20个三等位基因SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒及检测方法。本发明试剂盒由分离包装的复合扩增引物混合物、多重单碱基延伸反应引物混合物、等位基因分型标准物混合物、复合扩增反应混合液、单碱基延伸反应混合液构成。本发明还公开了利用该试剂盒进行检测的方法，包括提取样品核酸、配置反应体系进行扩增、电泳分析步骤。本发明通过单管内的复合扩增反应和多重单碱基延伸反应，利用通用的毛细管电泳平台，可一次性快速、准确地获得生物检材的20个三等位基因SNP遗传标记的分型，确定检材的个体来源，为法医个人识别提供一种新的技术手段。该试剂盒在法医学领域具有良好的应用前景。

Description

一种基于20个三等位基因SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于法医遗传学领域，具体涉及一种用于法医个体识别的基于20个三等位基因SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒。

背景技术

单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism，SNP)作为第三代遗传标记，具有含量丰富、遗传稳定、突变率低的特点，在法医学中有特殊的应用价值。目前有若干种二等位基因SNP的法医试剂盒已经市场化并应用于法医个人识别或亲子鉴定，大量的实验和实际应用结果显示二等位基因SNP的法医试剂盒可以解决很多法医学实际问题。

但是，二等位基因的SNP有其局限性，比如信息量与具有较多等位基因的STR遗传标记差距较大，至少需要50－60个SNP位点才能达到13－15个常用STR的累计个人识别率和非父排除率。而大量二等位基因SNP的复合扩增，不仅增加了检测成本，且大大增加了复合检测和数据分析的难度。二等位基因SNP的另一个局限性在于无法用于混合样本的分析。混合样本，尤其是混合血痕，是暴力犯罪和意外事故中常见的生物性检材。二等位基因SNP无法提示混合样本中多个来源个体的存在，因而对混合样本的分析无能为力。

三等位基因单核苷酸多态性(Tri－allelicSingleNucleotidePolymorphism，Tri－allelicSNP)是指在一个群体中基因的特定核苷酸位置上出现三种碱基，其中最少的一种在群体中的频率大于1％。理论上，三等位基因SNP具有低突变率、只需扩增很短DNA片段就可以包含SNP位点等特点，而且由于等位基因数量增加，因此可以用比二等位基因SNP少的位点数就可获得和现有STR系统大致相同的个人识别率和非父排除率。然而，目前有关三等位基因SNP在法医物证领域的研究还属于起步阶段。2004年，Phillips等首次提出了三等位基因SNP在法医物证领域应用的可能性，并在欧洲和非洲人群中发现了9个三等位基因SNP。而Westen等在2009年通过在荷兰人和欧美混血人群中共发现了11个具有三等位基因的SNP，并证实它们可以有效地分型降解样本。Antoinette等同时采用DNA修饰酶法﹑miniSTR系统和三等位基因SNP系统对降解样本进行分型，结果显示三等位基因SNP非常适合鉴定降解样本。

目前为止，可以应用于法医学个人识别的三等位基因SNP数量有限，尚无法构建可以与现有STR系统媲美的高识别能力的体系。如何从庞大的SNP数据库中筛选到一组三等位基因SNP，构建一种基于现有法医遗传实验室通用的毛细管电泳平台进行分析检测的试剂盒，可对痕量、降解检材的DNA进行个人识别、能对混合检材进行分析，以达到确定检材个体来源的目的，已经成为法医遗传界有待解决的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是实现利用三等位基因SNP遗传标记对未知来源的人类生物学检材进行法医学个人识别，从而能确定所述样本的个体来源。

本发明解决该技术问题的方案是提供一种基于20个三等位基因SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒。该基于20个三等位基因SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒由分离包装的复合扩增引物混合物、多重单碱基延伸反应引物混合物、等位基因分型标准物混合物、复合扩增反应混合液和单碱基延伸反应混合液、扩增产物纯化试剂组成。

本发明试剂盒中的复合扩增反应混合液、单碱基延伸反应混合液、扩增产物纯化试剂可按本领域常用的配方或按分子生物学手册进行配制，也可直接使用商业化的产品，优选的，为商业化产品。其中所述的复合扩增反应混合液含有PCR缓冲溶液、氯化镁、dNTPs、DNA聚合酶；所述的扩增产物纯化试剂含有核酸外切酶1及其缓冲溶液、虾碱性磷酸酶及其缓冲溶液；所述的单碱基延伸反应混合液含有DNA聚合酶、缓冲液、氯化镁、荧光标记双脱氧核糖核酸。

本发明提供的复合扩增引物混合物含40条引物，各条引物的核苷酸序列分别为下表中SEQIDNo.1至SEQIDNo.40所示：

表1单管内复合扩增引物对

所述复合扩增引物混合物能在单管内对含有20个三等位基因SNP遗传标记的所有DNA片段一次性同时扩增。

本发明中的多重单碱基延伸引物混合物能利用上述复合扩增引物混合物的扩增产物为模板，在单管内进行20个三等位基因SNP遗传标记的多重单碱基延伸反应。多重单碱基延伸反应引物混合物包含20个三等位基因SNP遗传标记的共计20条单碱基延伸引物，这些单碱基延伸反应引物的核苷酸序列为下表2中SEQIDNo.41至SEQIDNo.60所示。

表2单碱基延伸反应引物序列

所述多重单碱基延伸引物前端“－”符号前为加尾序列，阿拉伯数字表示某一个脱氧核糖核苷酸的重复数。

本发明中的等位基因分型标准物混合物由20个三等位基因SNP遗传标记的等位基因分型标准物构成；各个SNP遗传标记的等位基因分型标准物是利用其单碱基延伸引物对该SNP在群体中观察到的三个等位基因进行单碱基延伸反应得到的产物；所述的等位基因分型标准物混合物包括60个荧光素标记DNA片段，对应20个三等位基因SNP遗传标记的所有已知60个等位基因；所述60个荧光素标记DNA片段各自所对应的SNP基因座的RS号、核苷酸序列及标记的荧光素类型如表3所示：

表320个三等位基因SNP的等位基因分型标准物核苷酸序列及所加荧光标记

所述各序列中“－”符号前为加尾序列；阿拉伯数字表示其后跟的那个脱氧核糖核苷酸的重复数。

本发明还公开了利用该试剂盒进行检测的方法，包括：提取样品核酸、配置反应体系进行扩增、结果判读等步骤，具体为：

A、提取待检测样本的DNA，作为扩增模板，所述的提取样本DNA方法为常用的通用方法，优选为Chelex－100法；

B、利用复合扩增引物混合物和复合扩增反应混合液对步骤1提取的DNA进行单管内复合扩增；

所述的复合扩增反应体系为20μL，其中复合扩增引物混合物4μL、复合扩增反应混合液10μL、10ng/μL的DNA模版1μL去离子水补齐到20μL；

所述复合扩增PCR的反应得循环参数为：94℃，5分钟；94℃，30秒，60℃，30秒，72℃，30秒，30个循环；然后72℃，10分钟；

C、纯化步骤B所得的复合扩增产物，并以它为模版，利用多重单碱基延伸引物混合物和单碱基延伸反应混合液进行单管内多重单碱基延伸反应；

所述的纯化步骤为取4μL复合扩增PCR产物，加入10IU的核酸外切酶1，2IU的虾碱性磷酸酶，1μL的10倍浓度虾碱性磷酸酶缓冲液、1μL的10倍浓度核酸外切酶缓冲液，用去离子水补充到10μL，混匀后进行纯化反应，反应程序为37℃，80分钟，85℃，15分钟，4℃保存；

所述的单碱基延伸反应体系为10μL，其中3μL单碱基延伸反应混合液，3μL纯化后复合扩增PCR产物，3μL多重单碱基延伸引物混合物，1μL去离子水，混匀后进行单碱基延伸反应；

所述单碱基延伸反应的循环参数为：94℃，10秒，50℃，5秒，60℃，30秒，25个循环后4℃保存；

D、纯化步骤C所得的单碱基延伸反应的产物后进行毛细管电泳分析，根据电泳结果进行个人识别；

所述的纯化反应体系为取7μL单碱基延伸反应产物，1IU的虾碱性磷酸酶，1μL的10倍浓度虾碱性磷酸酶缓冲液，用去离子水补充到10μL；混匀后进行纯化反应，反应程序为37℃，80分钟，85℃，15分钟，4℃保存；

E、毛细管电泳分析，分别取1.5μL步骤D中得到的纯化后的延伸产物和1.5μL等位基因分型物混合物并分别加入7.5μL的Hi－Di甲醇胺和0.5μLGS－120LIZ内标混匀；然后95℃下变性3min，4℃下迅速冷却后，用美国AB公司的DNA自动分析仪进行电泳检测。

检测条件：1500V电压，36cm毛细管，POP4凝胶，电泳20min；应用DataCollection3.0软件收集数据，GenemappeV3.2软件进行结果分析。

本发明三等位基因SNP检测试剂盒的有益效果为：本发明试剂盒可以快速，准确的获得20个三等位基因SNP位点基因分型，对人类生物检材进行个体识别；该试剂盒复合扩增产物长度不超过200bp，故本试剂盒可以用于检测200bp以上降解样本；由于本试剂盒针对的所有SNP位点均分布于不同染色体或染色体臂上，所以SNP位点之间不存在连锁不平衡；由于本试剂盒针对的所有SNP位点均有三个等位基因，所以本试剂盒还可以提示样本来源于两个或以上不同的个体；由于本试剂盒大部分SNP的个人识别率高于二等位基因SNP最高个人识别率(即0.65)，所以只需要20个三等位基因SNP就已达到较高的累计个人识别率；本试剂盒由于包括了特有的等位基因分型标准物混合物，因此可以快速、准确地对20个三等位基因SNP进行分型；由于本试剂盒是基于法医遗传实验室通用的毛细管电泳平台建立的，所以具有广泛推广和应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明对100号生物检材的毛细管电泳检测结果。图中的横坐标数值表示DNA链长度，纵坐标数值表示荧光强度，1－20代表不同的三等位基因SNP编号(与表1的编号对应)。

图中所标的GS－120LIZ表示内标(购自AB公司，AppliedBiosystems)。A、T、C、G代表四种脱氧核糖核苷酸。从图中看可以清晰地观察到所有二十个三等位基因SNP的分型结果，证明本发明三等位基因SNP检测试剂盒可以准确检测生物学样本。

图2为等位基因分型标准物的毛细管电泳检测结果。图中的横坐标数值表示DNA链长度纵坐标数值表示荧光强度，1－20代表不同的三等位基因SNP编号(与表1的编号对应)。

图中所标的GS－120LIZ为内标；A、T、C、G代表四种脱氧核糖核苷酸。该图证明了本发明涉及的20个三等位基因SNP的所有已知等位基因单碱基延伸反应产物都被包括在等位基因分型标准物中。

具体实施方式

下列实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

本发明是一种新的基于三等位基因SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒，是基于筛选得到的20个三等位基因，利用法医学上目前常用的毛细管电泳体系构建的。该试剂盒由分离包装的复合扩增引物混合物、多重单碱基延伸反应引物混合物、等位基因分型标准物混合物、复合扩增反应混合液和单碱基延伸反应混合液构成。

该试剂盒的工作原理是首先通过复合扩增引物混合物和复合扩增反应混合液，在单管内同时扩增并获得所有含有20个三等位基因SNP的DNA片段。然后以此20个DNA片段为模板，利用单碱基延伸反应混合液和多重单碱基延伸反应引物混合物进行单碱基延伸反应以获得多重单碱基延伸反应产物。最后将单碱基延伸反应产物和等位基因分型标准物混合物一同进行毛细管电泳，并利用等位基因分型标准物混合物分析待测样本多重单碱基延伸反应产物，确定分型结果。

在本发明中，三等位基因SNP的选择对复合检测试剂盒的构建极其关键。目前已报道的具有法医学应用价值的三等位基因SNP位点极其有限，所以要开发三等位基因SNP的复合检测试剂盒就必须首先从庞大的SNP数据库中筛选出可应用于法医学个人识别的三等位基因SNP遗传标记。本发明中新建立的三等位基因SNP的筛选标准为：1)最小等位基因频率(minorallelefrequency，MAF)大于5％；2)至少在两个或两个以上世界主要人群中具有三等位基因；3)可以设计出合适的多重单碱基延伸引物和单管内复合扩增引物；4)与自然选择和疾病不相关；5)不在基因组重复序列内。

根据建立的上述标准，本发明共筛选出20个三等位基因SNP用于建立法医学个人识别的复合检测体系。经过群体调查实验证明，本发明的三等位基因SNP复合检测体系具有较高的个人识别率，累积个人识别率达到0.99999999999以上，即无关个体中不可分辨率小于全球人口总数的倒数，且基因座间没有相关性，呈连锁不连锁遗传，这意味着利用该试剂盒可以将全球所有无关个体区分开。试剂盒中所涉及的20个三等位基因SNP位点信息如表4。

表420个三等位基因SNP位点

No.	SNP基因座	染色体	染色体臂	核苷酸定位	多态性
						1	RS2236296	14	q	54691706	T/G/C
2	RS1150911	1	q	228494382	T/G/C
						3	RS3780889	10	p	35010787	A/G/C
4	RS1280098	4	q	187538942	A/G/T
						5	RS3824168	8	p	2133379	C/G/T
6	RS2012214	2	q	173044918	C/G/A
						7	RS13958	19	q	27821418	T/C/G
8	RS2031237	13	q	98457065	A/G/T
						9	RS2253872	2	q	119463905	A/G/T
10	RS2075731	19	q	55237616	A/C/T
						11	RS3801732	7	q	82157653	A/C/T
12	RS2291982	15	q	70058118	C/G/T
						13	RS3120715	1	q	246567435	T/G/C
14	RS1527875	6	q	107655333	A/G/C
						15	RS2072899	6	p	29724845	G/C/T
16	RS3761334	21	q	28340778	A/G/T
						17	RS462698	21	q	42816066	A/C/T
18	Rs2292234	4	p	41015823	A/G/T
						19	Rs423710	22	q	17809025	A/G/C
20	RS2071071	12	p	7014962	A/G/C

本发明试剂盒正是在上述筛选到的20个三等位基因的基础上进行设计构建的。试剂盒中使用到的复合扩增技术是用多对引物同时扩增基因组内几条DNA片段。该技术具有方便、快捷、节约样本和成本的优点，但其难点在于如何设计复合扩增引物。本发明所设计的复合扩增引物是根据NCBI的dbSNP数据库提供的DNA序列进行设计、分析、并多次优化后再合成的。优化后得到的扩增引物长度在18－25bp之间，扩增产物在76－191bp之间，退火温度在60±1℃，GC含量在40－50％之间，所有引物、引物之间、引物与模板之间无明显的发卡结构、错配和二聚体结构。

本发明试剂盒中还需利用到的单碱基延伸反应是一种基于四种荧光素标记的双脱氧核糖核苷酸进行等位基因特异性引物延伸的反应。其特点在于，通过设计不同长度的单碱基延伸引物，可以同时分析多个SNP位点，即根据单碱基延伸反应产物长度的不同区分不同的SNP位点，根据双脱氧核糖核苷酸所标记荧光素的不同区分SNP的不同等位基因。在本试剂盒中，为了在毛细管电泳中区分20个三等位基因SNP，多重单碱基延伸引物5’端分别根据各自情况连接了不同长度的重复序列(Poly－C)或非人源DNA序列，其最终序列长度在16－90bp之间，退火温度在50±3℃之间，且还要保证所有引物、引物之间、引物与模板之间无明显的发卡结构、错配和二聚体结构。所有20个三等位基因SNP位点复合扩增引物和多重单碱基延伸引物的序列参见表5(各序列的序列号分别在表1和表2中)。多重单碱基延伸引物各条序列“－”符号前为加尾序列，阿拉伯数字表示其后跟的那个脱氧核糖核苷酸的重复数。

表520个三等位基因SNP位点复合扩增引物和多重单碱基延伸引物参照表

本发明试剂盒中引入等位基因分型标准物混合物是为了准确的分析未知样本基因型，本发明中提供的等位基因分型标准物混合物包括本发明涉及的所有20个三等位基因SNP已知等位基因单碱基延伸反应产物作为各自的标准物。对未知样本进行毛细管电泳分析时，并列的进行等位基因分型标准物混合物的毛细管电泳分析，通过未知样本和已知等位基因分型标准物混合物的电泳结果比较，可以确定未知样本的基因分型。本发明中具体对三等位基因SNP的等位基因分型标准物混合物中的各等位基因分型标准物的荧光标记情况可见表3。

使用本发明试剂盒进行最后的结果分析需在毛细管电泳平台上使用。毛细管电泳是指以毛细管为分离通道、高压电场为驱动力的电泳分离分析法。毛细管电泳法具有效率高，速度快等优点，已被广泛的用于法医DNA实验室的短串连重复序列(STR)分析。本发明选择复合扩增和单碱基延伸技术，并建立等位基因分型标准物的目的在于使用法医遗传学实验室通用的毛细管电泳平台进行三等位基因SNP的分析。因此本发明建立的基于三等位基因SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒可以直接应用于任何一个有毛细管电泳平台的法医遗传实验室，具有普适性。

以下结合附图并通过具体实施方式对本发明进行详细说明，其中所用试剂无特殊说明均为常规生化试剂和设备。

实施例一：本发明试剂盒的制备

用于检测的三等位基因SNP复合检测试剂盒可包括分别包装的以下试剂：

A、复合扩增引物混合物。由表1所示的扩增引物混合得到，将合成好的20对扩增引物用水溶解后按照表6的浓度混合而成。

B、复合扩增反应混合液。本实施例中使用TaKaRaBiotechnology公司的PCR反应混合液OneshotLaPCR^TMMix。

C、多重单碱基延伸反应引物混合物。由表2所示的单碱基延伸反应引物混合得到，将合成好的20个单碱基延伸反应引物用水溶解后按照表7的浓度混合而成。

D、单碱基延伸反应混合液。使用ABI公司的SNaPshotreadyreactionmix单碱基延伸反应混合液。

E、等位基因分型标准物混合物。由按表3所示的60条等位基因分型标准物组成，标记等位基因分型标准物的绿色、黄色、蓝色和红色荧光标记物分别为dR6G、dTAMRA^TM、dR110和dROX^TM，由ABI公司提供并按其手册标记。

为了更方便操作，试剂盒中还有独立包装的扩增产物纯化试剂：由分离包装的核酸外切酶1及其缓冲溶液、虾碱性磷酸酶及其缓冲溶液组成。

为了方便检测分析，试剂盒中还可以有独立包装的毛细管电泳用试剂：如Hi－Di甲酰胺、作为内标的Genescan^TMSizeStandardGS－120LIZ。

将上述试剂分别按各自常规要求包装后即制得基于三等位基因SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒，用于后继的实验。

表6复合扩增引物的浓度

表7多重单碱基延伸引物的浓度

实施例二：使用本发明方法鉴别100个无关汉族个体检材

使用上述基于三等位基因SNP遗传标记的法医学复核检测混合物，我们进行了100个无关个体检材的检测，具体的鉴别过程按如下进行：

A、从100个无关汉族个体血样提取基因组DNA，获得基因组DNA作为模板。

B、分别配制每组单管复合扩增体系中的扩增引物池，把20对扩增引物用超纯水稀释至50pM/μL，按照表6中的比例混合，作为引物池，其中每条引物的终浓度如表6所示。

以步骤A中的DNA模板，利用步骤B中的引物池和复合扩增反应混合液将每个个体的样本单独在下述扩增体系中进行复合PCR扩增。

扩增的热循环参数

从第2步到第4步循环30次

5、72℃10分钟

C、多重PCR产物的纯化，下列为每一个样品扩增产物的纯化体系

扩增产物纯化反应条件：

37℃80分钟

85℃15分钟

4℃保存

D、以上一步纯化得到的产物为模板，以表7中给出参数配成多重单碱基延伸引物池进行单碱基延伸反应。

单碱基延伸反应的热循环参数：

96℃10秒

50℃5秒

60℃30秒

循环25次。

E、纯化上一步单碱基延伸反应产物。

单碱基延伸反应产物纯化体系：

单碱基延伸反应产物纯化反应条件：

37℃80分钟

85℃15分钟

4℃保存。

F、毛细管电泳分析、产物的检测、验证。

分别取1.5μL步骤E中得到的纯化后的延伸产物和等位基因分型标准物混合物(每次加入1.5ul)并分别加入7.5μL的Hi－Di甲醇胺和0.5μL内标(GS－120LIZ)混匀；然后95℃下变性3min，4℃下迅速冷却后，用美国AB公司的DNA自动分析仪(自动激光荧光毛细管电泳DNA测序仪，310型)进行电泳检测。

得到的所部分结果由第一代测序法－sanger测序法和第二代测序法－Pyrosequencing测序法进行验证，结果一致，说明使用该试剂盒进行分型是正确而且稳定的。

所得的所有100个样本的结果见表8，表8的纵轴NO代表样本编号，横轴代表SNP编号，最终显示的是测得的所有100个样本的基因型。

表8检测样本基因型

从表中可以看到没有任何两个样本的基因型是相同的。说明本发明采用的扩增引物和延伸引物可以完全分辨此100个不相关个体。

由于检测了100个样本，以100号样本为例，参见附图1、图2。图1表示第100号样本的分析结果，可以清晰的分辨所有等位基因；图2为等位基因分型标准物混合物的结果，可以清晰的分辨所有已知等位基因在毛细管电泳中的迁移情况。

以上结果还使用sanger测序法(双脱氧链终止法)和Pyrosequencing测序法(焦磷酸测序法)进行测序验证，结果也都是准确的。说明本发明试剂盒及方法可以准确的进行个人识别，且其累积个人识别率为0.999999999994363，即无关个体中不可分辨率小于全球人口总数的倒数。

Claims

1.一种基于20个三等位基因SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒，包括由分离包装的复合扩增引物混合物、多重单碱基延伸反应引物混合物、等位基因分型标准物混合物、复合扩增反应混合液和单碱基延伸反应混合液及扩增产物纯化试剂；所述的复合扩增反应混合液含有PCR缓冲溶液、氯化镁、dNTPs、DNA聚合酶；所述的扩增产物纯化试剂含有核酸外切酶1及其缓冲溶液、虾碱性磷酸酶及其缓冲溶液；所述的单碱基延伸反应混合液含有DNA聚合酶、缓冲液、氯化镁、荧光标记双脱氧核糖核酸；其特征在于：所述的复合扩增引物混合物包含了20个三等位基因SNP遗传标记的共计40条扩增引物，各条引物的核苷酸序列分别为下表中SEQIDNo.1至SEQIDNo.40所示：

所述多重单碱基延伸反应引物混合物含有20个三等位基因SNP遗传标记的单碱基延伸引物，其核苷酸序列为下表中SEQIDNo.41至SEQIDNo.60所示：

序号 SNP基因座的RS号各多重单碱基延伸引物序列序列表中的序号 1 RS2236296 CCCAGCATTGGCTGGC SEQ ID No.41 2 RS1150911 CCCAGGATATAGCGCAGTTC SEQ ID No.42 3 RS3780889 TTACATTAGCATGCACTGAAGGAAA SEQ ID No.43 4 RS1280098 12C－ATGGCAATCACCCCACCT SEQ ID No.44 5 RS3824168 8C－GTTTCAATAGCGCTGTGGTGTC SEQ ID No.45 6 RS2012214 19C－GAGTAATCAGACACTCCCCC SEQ ID No.46 7 RS13958 24C－CCGCAGCACACACAGTGAGA SEQ ID No.47 8 RS2031237 26C－ATTCTTGGCCTGTCTGTTCCT SEQ ID No.48 9 RS2253872 28C－CCGGTCATGTAGGAGAGAAGCTC SEQ ID No.49 10 RS2075731 34C－TCGCTCTCGTCTTGGGTTTAA SEQ ID No.50 11 RS3801732 37C－CCTAGCCAAAGAAGCAGGCTTA SEQ ID No.51 12 RS2291982 40C－CATGGGCTGGGTTAATCTGATTG SEQ ID No.52 13 RS3120715 41C－CCGTGTTTCAGGATCAAACTTAGAG SEQ ID No.53 14 RS1527875 47C－TTCATCGATTCCAGAGTCTTTTCCT SEQ ID No.54 15 RS2072899 50C－TCCTTGGAAAGTTAGAGTCTCTGAG SEQ ID No.55 16 RS3761334 60C－CCCCCAGCGTAGCCAAAGTTA SEQ ID No.56 17 RS462698 58C－AGAAAGGAAGAGTTAGTAGCTTGTG SEQ ID No.57 18 RS2292234 63C－TTTGGTTTCTGCAGCAGCAAATC SEQ ID No.58 19 RS423710 60T－CCCCCCCCCCCCACACGAGGGGAAACA SEQ ID No.59 20 RS2071071 69T－CCCGGTCCTAGGGCTGAAGG SEQ ID No.60

所述各序列中“－”符号前为加尾序列，阿拉伯数字表示其后跟的那个脱氧核糖核苷酸的重复数；

所述的等位基因分型标准物混合物由20个三等位基因SNP遗传标记的等位基因分型标准物构成，包括60个荧光素标记DNA片段，对应20个三等位基因SNP遗传标记的所有已知60个等位基因；所述60个荧光素标记DNA片段各自所对应的SNP基因座的RS号、核苷酸序列及标记的荧光素类型如下表所示：

所述各序列中“－”符号前为加尾序列；阿拉伯数字表示其后跟的那个脱氧核糖核苷酸的重复次数。

2.权利要求1所述的基于20个三等位基因SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒，其特征在于，所述的各等位基因复合扩增引物的浓度如下表所示：

3.权利要求1所述的基于20个三等位基因SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒，其特征在于，所述的各等位基因多重单碱基延伸引物的浓度如下表所示：

4.一种利用权利要求1－3所述的基于20个三等位基因SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒进行检测的方法，包括以下步骤：

A、提取待检测样本的DNA，作为扩增模板；

C纯化步骤B所得的复合扩增产物，并以它为模版，利用多重单碱基延伸引物混合物和单碱基延伸反应混合液进行单管内多重单碱基延伸反应；

5.一种利用权利要求4所述的基于20个三等位基因SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒进行检测的方法，其特征在于，所述的提取样本DNA方法为Chelex－100法。