CN111793623A - 62个多等位snp-ngs的分型遗传标记组合物、试剂盒、鉴定体系以及分型方法 - Google Patents

62个多等位snp-ngs的分型遗传标记组合物、试剂盒、鉴定体系以及分型方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及62个多等位SNP‑NGS的分型遗传标记组合物、试剂盒、鉴定体系以及分型方法。该遗传标记组合物包括62个多等位SNPs以及至少两个Y‑SNPs，其多态性较高，且同时兼具灵敏度高、突变率低等优势。本发明还提供了一种下一代测序分型试剂盒，包括用于扩增上述62个多等位SNPs位点和Y‑SNPs的引物，该试剂盒用于NGS‑SNPs技术，能够在一次反应体系中检测更多的SNP基因座；同时，该引物与NGS技术相结合，不仅能够获得SNPs的长度信息，还能获得完整的序列信息。利用上述试剂盒构成的鉴定体系以及进而形成的鉴定方法能够准确检测降解检材和混合生物检材，可用于个人识别和亲缘关系鉴定。

Description

62个多等位SNP-NGS的分型遗传标记组合物、试剂盒、鉴定体 系以及分型方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种62个多等位SNP-NGS的分型遗传标记组合物、试剂盒、鉴定体系以及分型方法。
背景技术
短串联重复序列(short tandem repeats,STRs)在法医遗传学个人识别和亲子鉴定方面的应用极其广泛并在国际上通用，是法医DNA实验室的主流遗传标记。STRs分型方法基本能够解决大部分鉴定案例，但对于陈旧、高度降解等疑难样检材仍不能有效解决。SNPs因具有更短的检测片段及更高的检测灵敏度，在解决上述疑难样本较STRs更胜一筹。而且，STRs的高突变率往往对亲缘关系鉴定造成困扰，需要应用一些突变率低的多态性标记辅助鉴定，SNPs恰恰有这样的优势，具有较好的遗传稳定性，突变率远远低于STRs。但基因组中的大多数SNPs为二等位基因，这种二等位基因SNPs多态性较低，需要复合更多的位点才能达到与STRs相同的鉴定能力，为分型体系的构建带来巨大难度，限制了其实际应用。基因组中存在一些多等位SNP位点，多态性增加的同时，兼具灵敏度高、突变率低、适用于降解检材等优势，是法医学理想的遗传标记。
一代测序受限于复合位点的数量，而以高通量为优势的下一代测序技术(nextgeneration sequencing,NGS)正迅速发展并有望代替一代测序技术，目前，NGS逐渐被应用于法医学个人识别和亲子鉴定。但现有检测方法需要多个试剂盒联合应用，对于降解检材和混合生物检材仍不能准确检测，使下一代测序分型(NGS-SNPs)技术受限。
发明内容
针对现有检测方法需要多个试剂盒联合应用，降解检材和混合生物检材仍不能准确检测的技术问题，本发明提供了一种62个多等位SNP-NGS的分型遗传标记组合物、试剂盒、鉴定体系以及分型方法。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一方面，本发明实施例提供了一种遗传标记组合物，包括62个多等位SNPs以及至少两个Y-SNPs，所述62个多等位SNPs在SNP数据库(美国国立生物技术信息中心)中的rs号分别为：rs2490541、rs4656384、rs6665748、rs11687477、rs2705772、rs2187012、rs4973360、rs404753、rs4683078、rs9879721、rs4525830、rs62409414、rs1377902、rs10014519、rs12520142、rs12187324、rs1974790、rs1549226、rs9368129、rs752761、rs12669779、rs11975827、rs9691758、rs4872939、rs2122705、rs2634525、rs2035637、rs2002299、rs6478720、rs3006953、rs76149384、rs10837608、rs4938084、rs3107631、rs11045217、rs2172244、rs709237、rs8001988、rs9558636、rs7317569、rs4322570、rs1074004、rs34751254、rs10131888、rs4904514、rs4779204、rs8028205、rs8032485、rs7179436、rs1010351、rs12596775、rs9797242、rs12940150、rs2931275、rs72863906、rs9304194、rs1303783、rs10406637、rs2143705、rs6062145、rs1850106、rs7280955。
基因组中存在一些多等位SNP位点，本发明中的62个多等位SNPs整体而言，其多态性较二等位SNP更高，并且，在多态性增加的同时，兼具灵敏度高、突变率低等优势。除此之外，本发明中的62个多等位SNPs的SNP基因座的片段短，相较于STR更适合PCR扩增，通过复合多个SNP位点提高了SNP标记的能力，从而提高了系统效能。因此，对于现有试剂盒不能有效分析降解DNA的情况，本发明提供的遗传标记组合物能够有效分析降解DNA，可准确检测降解检材和混合生物检材，是更理想的遗传标记，可用于个人识别和亲缘关系鉴定。
其中Y-SNPs用于区分性别，从常规Y-SNPs中选取2～4个即可。
第二方面，本发明实施例还提供了一种下一代测序分型试剂盒，所述下一代测序分型试剂盒包括用于扩增上述62个多等位SNPs以及至少两个Y-SNPs的引物。
可选地，扩增权利要求1所述62个多等位SNPs的所述引物为63条PCR扩增单端特异性引物以及与所述63条PCR扩增单端特异性引物构成常规PCR的正反向引物，所述63条PCR扩增单端特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.63所示。
将本试剂盒中的63条PCR扩增单端特异性引物以及与之构成常规PCR的正反向引物用于NGS-SNPs技术，能够在同一反应体系中同时检测62个SNP基因座；同时，上述引物与NGS技术相结合，不仅能够获得SNPs的长度信息，还能获得完整的序列信息。
可选地，所述下一代测序分型试剂盒还包括MiSeq上机测序试剂，使该试剂盒能够在MiSeq平台进行下一代测序分型。
可选地，所述下一代测序分型试剂盒还包括10×酶切反应缓冲液(FragmentationBuffer，10×)、FERA缓冲液(FERA Solution)、酶切反应中酶混合物(FragmentationEnzyme Mix)、5×连接反应缓冲液(Ligation Buffer，5×)、连接接头、DNA连接物(DNALigase)、连接溶液(Ligation solution)、5×靶向PCR反应缓冲液(TEPCR buffer，5×)、与所述63条PCR扩增单端特异性引物构成常规PCR的正反向引物(IL-Forward primer)、与扩增所述Y-SNPs的引物构成常规PCR的正反向引物、Taq DNA聚合酶(HotStarTaq DNAPolymerase)和5×常规PCR反应缓冲液(UPCR Buffer，5×)。其中连接接头可选自IL-N7系列接头(IL-N7##adapter)和IL-S5系列接头(IL-S5##adapter)，用以在测序过程中区分样本。
第三方面，本发明实施例还提供了一种用于个体识别的鉴定体系，所述鉴定体系包括上述下一代测序分型试剂盒。
可选地，所述鉴定体系还包括血液DNA提取试剂盒、Qubit dsDNA HS定量试剂盒、Labchip质检分析试剂盒和KAPA文库定量试剂盒。
第四方面，本发明实施例还提供了一种下一代测序分型方法，所述方法中用上述鉴定体系进行样品检测。
优选地，所述下一代测序分型方法至少包括以下操作步骤：
步骤a、提取待测血液的DNA，定量，采用上述试剂盒中的63条PCR扩增单端特异性引物以及扩增所述Y-SNPs的引物构建文库，定量；
步骤b、对所述文库进行片段检测，定量；
步骤c、根据步骤b的定量结果，对文库中的样本进行均一化，然后变性、稀释，测序；
步骤d、将测序结果与hg19参考基因进行序列对比，得到分型结果。
本方法利用上述63条单端特异性引物作为PCR扩增引物，能够在同一反应体系中实现62个SNPs位点下一代测序分型，突破了一代测序对位点数量的限制，系统多态性增加，提高了该检测方法排除非生物学父亲的能力。
可选地，步骤a中构建文库的操作包括DNA片段化、末端加A、连接接头、清洗、靶向富集、清洗富集产物、常规PCR扩增、清洗扩增产物；所述靶向富集的引物为63条所述PCR扩增单端特异性引物以及扩增所述Y-SNPs的引物。
优选地，所述靶向富集的PCR反应循环参数为：95℃，13min；98℃，2min；98℃，15s，68℃，10min，8次循环；72℃，5min；4℃，5min。该参数条件能确保使用上述63条单端特异性引物以及扩增所述Y-SNPs的引物进行PCR扩增的顺利进行，实现靶向富集。
步骤c中，测序的操作在Illumina MiSeq FGx平台进行。
步骤c中变性使用的试剂为0.2N-NaOH。该变性试剂更适用于Illumina MiSeq FGx平台。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明实施例提供了一种遗传标记组合物，包括62个多等位SNPs以及3个Y-SNPs，所述62个多等位SNPs在SNP数据库(美国国立生物技术信息中心)中的rs号分别为：rs2490541、rs4656384、rs6665748、rs11687477、rs2705772、rs2187012、rs4973360、rs404753、rs4683078、rs9879721、rs4525830、rs62409414、rs1377902、rs10014519、rs12520142、rs12187324、rs1974790、rs1549226、rs9368129、rs752761、rs12669779、rs11975827、rs9691758、rs4872939、rs2122705、rs2634525、rs2035637、rs2002299、rs6478720、rs3006953、rs76149384、rs10837608、rs4938084、rs3107631、rs11045217、rs2172244、rs709237、rs8001988、rs9558636、rs7317569、rs4322570、rs1074004、rs34751254、rs10131888、rs4904514、rs4779204、rs8028205、rs8032485、rs7179436、rs1010351、rs12596775、rs9797242、rs12940150、rs2931275、rs72863906、rs9304194、rs1303783、rs10406637、rs2143705、rs6062145、rs1850106、rs7280955。3个Y-SNPs在SNP数据库中的rs号分别为：13447361、17269816、17316592。
实施例2
本发明实施例提供了一种下一代测序分型试剂盒，包括用于扩增上述实施例1中62个多等位SNPs位点的63条PCR扩增单端特异性引物以及3个Y-SNPs的3条PCR扩增单端特异性引物，并包括与该66条PCR扩增单端特异性引物构成常规PCR的正反向引物。该66条PCR扩增单端特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.66所示。
该试剂盒还包括10×酶切反应缓冲液(Fragmentation Buffer,10×)、FERA缓冲液(FERA Solution)、酶切反应中酶混合物(Fragmentation Enzyme Mix)、5×连接反应缓冲液(Ligation Buffer，5×)、连接接头、DNA连接物(DNA Ligase)、连接溶液(Ligationsolution)、5×靶向PCR反应缓冲液(TEPCR buffer，5×)、与所述66条PCR扩增单端特异性引物构成常规PCR的正反向引物(IL-Forward primer)、Taq DNA聚合酶(HotStarTaqDNAPolymerase)和5×常规PCR反应缓冲液(UPCR Buffer，5×)。
实施例3
本发明实施例提供了一种用于个体识别的鉴定体系，包括实施例2中的下一代测序分型试剂盒，以及血液DNA提取试剂盒、Qubit dsDNA HS定量试剂盒、实时荧光定量试剂盒、Labchip质检分析试剂盒和MiSeq上机测序试剂。
实施例4
本发明实施例提供了一种62个SNPs位点的下一代测序分型方法，该方法用实施例3中的鉴定体系进行样品检测。包括以下操作步骤：
1、提取待测血液的DNA
应用血液DNA提取试剂盒(OMEGA公司)提取2mL待测血液样本的DNA，应用核酸蛋白定量仪对所提取的DNA进行检测，并记录下每个样本DNA的纯度，分装于-20℃保存，作为样本DNA。
2、血液DNA定量
用Qubit dsDNA HS定量试剂盒对步骤1所得的样本DNA进行浓度测定，并稀释至20ng/μL，作为模板DNA。
3、构建文库
用下一代测序定制panel试剂盒构建文库。
3.1DNA片段化、末端加A
将步骤2所得模板DNA进行DNA片段化、末端加A。片段化反应体系(25μL)包括以下成分：1μL步骤2所得模板DNA，2.5μL 10×酶切反应缓冲液，0.75μL FERA溶液，15.75μL无核酶水，酶切反应中酶混合物。
反应参数为：4℃，1min；32℃，24min；72℃，30min；4℃保温。
3.2连接接头
将步骤3.1所得DNA与IL-N7系列接头连接。
制备接头连接反应体系(50μL)，其中包含以下组份：25μL步骤3.1所得DNA，10μL 5×连接反应缓冲液，2.8μL IL-N7系列接头，5μL DNA连接物，7.2μL连接液。将该反应体系置于PCR仪孵育：20℃，15min。
3.3清洗DNA
3.3.1将3.2所得的孵育后的混合液加入到1.5mL的EP管中，加入50μL无核酶水，使每个样本变成100μL；
3.3.2向步骤3.3.1所得100μL样本中加100μL磁珠，用移液枪吹打混匀，室温孵育5min；
3.3.3将步骤3.3.2装有孵育后样品的EP管放到磁力架上10min至澄清，弃上清；
3.3.4向步骤3.3.3所得样品中加入200μL 80％(v/v)的乙醇水溶液(每次使用为最新配制)，旋转EP管2～3次清洗磁珠，至澄清、弃上清；
3.3.5重复步骤3.3.4，之后置于磁力架上室温干燥10min；
3.3.6将步骤3.3.5装有干燥后样品的EP管从磁力架上移下，加入52μL无核酶水洗脱磁珠上结合的DNA；
3.3.7将步骤3.3.6装有完成洗脱的样品的EP管放到磁力架上至澄清，转移50μL上清至新的EP管中；
3.3.8向步骤3.3.7装有上清的新的EP管中加50μL磁珠，用移液枪吹打混匀，室温孵育5min；
3.3.9将步骤3.3.8装有孵育后样品的EP管放到磁力架上5min至澄清，弃上清；
3.3.10向步骤3.3.9弃去上清的EP管中加入200μL 80％(v/v)的乙醇水溶液(每次使用为最新配制)，旋转EP管2～3次清洗磁珠，至澄清、弃上清；
3.3.11重复步骤3.3.10，之后置于磁力架上室温干燥15min；
3.3.12从步骤3.3.11完成干燥的EP管从磁力架上移下，加入12μL无核酶水洗脱磁珠上结合的DNA；
3.3.13将步骤3.3.12装有完成洗脱的样品的EP管放到磁力架上至澄清，转移9.4μL上清DNA至新的200μL EP管中。
3.4靶向富集
PCR反应体系(20μL)包括以下成分：9.4μL步骤3.3.13所得DNA，4μL5×靶向PCR反应缓冲液，5μL 66条单端特异性引物作为PCR扩增引物，0.8μL与所述66条PCR扩增单端特异性引物构成常规PCR的正反向引物，0.8μL Taq DNA聚合酶。
反应循环参数为：95℃，13min；98℃，2min；98℃，15s，68℃，10min，8次循环；72℃，5min；4℃，5min后保温。
3.5清洗靶向富集产物
3.5.1将3.4所得的富集产物加入到1.5mL的EP管中，加入80μL无核酶水，使每个样本变成100μL；
3.5.2按3.3.2～3.3.5的操作方法进行清洗；
3.5.3将装有清洗后样品的EP管从磁力架上移下，加入16μL无核酶水洗脱磁珠上结合的DNA；
3.5.4将步骤3.5.3装有完成洗脱的样品的EP管放到磁力架上至澄清，转移13.4μL上清至新的200μL EP管中。
3.6常规PCR
PCR反应体系(20μL)包括以下成分：13.4μL步骤3.5.4所得DNA，4μL5×常规PCR反应缓冲液，1μL Taq DNA聚合酶，1.6μL无核酶水。将上述体系加入到对应的带有IL-S5系列接头的EP管中。
反应循环参数如下：95℃，13min；98℃，2min；98℃，15s，60℃，2min，24次循环；72℃，5min；4℃，5min后保温。
3.7清洗常规PCR产物
3.7.1按3.5.1～3.5.2的操作方法进行清洗；
3.7.2将装有清洗后样品的EP管从磁力架上移下，加入30μL无核酶水洗脱磁珠上结合的DNA；
3.7.3将步骤3.7.2装有完成洗脱的样品的EP管放到磁力架上至澄清，转移28μL上清至新的200μL EP管中，得到文库。
4、对所述文库进行片段检测、定量
使用PerkinElmer公司的Labchip质检分析试剂盒(内含24DNAExtended RangeLabchip和DNAHigh Sens Reagent Kit)进行文库的片段检测分析。
5、应用实时荧光定量试剂盒(美国Promega公司的KAPA Library Quant Kit)定量试剂盒对文库进行定量：文库起始浓度为1nM左右；试剂盒含有6个1:10梯度稀释的DNA标准品；文库按1:2000和1:20000两个梯度稀释至定量；PCR荧光定量体系(20μL)包括以下成分：3.6μL无核酶水，10μL SYBR Fast qPCR Mastermix(2×)，2μL Primer Premix(10×)，0.4μL Rox Low(50×)和4μL模板或DNA标准品。
20μLPCR体系放入相应的3个副孔内，简短离心至气泡去除。
PCR荧光定量循环参数设置为：95℃，5min；95℃，30s，60℃，45s，35次循环；65-95℃。
将结果中的Quantity mean拷贝到表格中，乘以稀释的倍数即得到文库最终浓度。
6、对文库中的样本进行均一化、变性、稀释
使用MiSeq上机测序试剂盒，按照步骤5的实时荧光定量结果，将步骤4所得样品进行均一化，将样本稀释至2nM。
取5μL文库(2nM)和5μL的0.2N-NaOH混匀，得到10μL变性文库。280×g离心1min，室温孵育5min；用990μL已预冷的杂交缓冲液(Hybridization Buffer，HT1)和10μL变性文库混匀，得到10pM的变性稀释文库1mL。
7、测序
使用Illumina Experiment Manager(IEM)进行上机测序参数设置；将597μL的HT1和3μL的QIASeq ARead1 Custom PrimerⅠ混匀，得到终浓度为0.5μM的样品，加入上机板18号孔；将600μL的10pM变性稀释文库加入load sample孔。使用Research use only Run模式进行MiSeq上机测序。
将MiSeq平台下机的Fastq文件格式原始数据上传至Qiagen官网进行数据分析，通过统计挖掘出各样本的基因座序列信息。之后用焦磷酸测序和sanger测序验证二代测序分型的准确性，将NGS所得分型结果与二者分型结果进行对比。
8、实验结果
预实验包括66个DNA样本，其中包括1个阳性对照2800M Control DNA，1个阴性对照样本及64个河北汉族无关健康个体样本。通过二代测序下机数据求得62个多等位SNPs位点的法医学参数(见表1)。
表1河北汉族人群62个多等位SNP基因座的法医学参数(n＝64)
Figure BDA0002605948320000101
Figure BDA0002605948320000111
Figure BDA0002605948320000121
上述实验结果表明本发明提供的62个多等位SNPs位点已经达到并超过目前法医学应用效能的基本要求。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北医科大学
<120> 62个多等位SNP-NGS的分型遗传标记组合物、试剂盒、鉴定体系以及分型方法
<130> 2020.7.27
<160> 66
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> rs2490541引物
<400> 1
gccaattgca aataagctct ctacaaacat tcac 34
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> rs4656384引物
<400> 2
gttaggcaca aaaccaacaa acatgtacct gtt 33
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> rs6665748引物
<400> 3
tttttatgag tacacacaaa cacaggaagt acgg 34
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> rs11687477引物
<400> 4
ccgctcaata acctttatct cccacaagat tcc 33
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> rs2705772引物
<400> 5
atttgagtgg tatgtcaacc cccttgataa ttacag 36
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> rs2187012引物
<400> 6
ctgcttgaat atccatatgt ttattcctga gtctctacc 39
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> rs4973360引物
<400> 7
gagcacaaag atgagcaaaa tcaaaggaaa ttgc 34
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> rs404753引物
<400> 8
ggctgatttt attccccact ataagctctt taaggaaag 39
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> rs4683078引物
<400> 9
ggctttggga atacaggttt gttagtcact tctt 34
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> rs9879721引物
<400> 10
ctcatctcct cctaaacatt tgttttaaac ccaagg 36
<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> rs4525830引物
<400> 11
aatgactcag agagtatact agttgactta gaggg 35
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> rs62409414引物
<400> 12
agtgtacaca aatgtcactc atccaattca ttgg 34
<210> 13
<211> 37
<212> DNA
<213> rs1377902引物
<400> 13
tctgggcatt tattaaaaca cagattcttc aaccata 37
<210> 14
<211> 35
<212> DNA
<213> rs10014519引物
<400> 14
gcctgtatcc actttaatcc tgtttcctgt catag 35
<210> 15
<211> 33
<212> DNA
<213> rs12520142引物
<400> 15
ggaggatgaa agaagcataa aaaccctcct ctc 33
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> rs12187324引物
<400> 16
gaatatccca ggcctcttga actcgctaa 29
<210> 17
<211> 34
<212> DNA
<213> rs1974790引物
<400> 17
cctttagaga ggagcagtct tcagtctata gtgt 34
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> rs1549226引物
<400> 18
tcagtgttca ggtttccatt tgcaaaagac aag 33
<210> 19
<211> 28
<212> DNA
<213> rs9368129引物
<400> 19
gatgactccc actgacgtag gttgtgat 28
<210> 20
<211> 31
<212> DNA
<213> rs752761引物
<400> 20
gcaattccac atggctcaat ggaatacttc c 31
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> rs12669779引物
<400> 21
tcctctcgga aaatggagag aaggataact 30
<210> 22
<211> 31
<212> DNA
<213> rs11975827引物
<400> 22
ggtctgtgag gcaattgtca aaaacttgct a 31
<210> 23
<211> 32
<212> DNA
<213> rs9691758引物
<400> 23
cctccaaaag gcattatctc tcaatgctat cg 32
<210> 24
<211> 36
<212> DNA
<213> rs4872939引物
<400> 24
tgacttgaat gtaaacctcc ctaagatgtt ccttag 36
<210> 25
<211> 31
<212> DNA
<213> rs2122705引物
<400> 25
ccctgccctc agaatgaact tgtacttgtt t 31
<210> 26
<211> 36
<212> DNA
<213> rs2634525引物
<400> 26
caagccattc tttagtaggt ccctcagtga tttaac 36
<210> 27
<211> 36
<212> DNA
<213> rs2035637引物
<400> 27
ccaaacatta gtgatggaga aaagcagaat cctttg 36
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> rs2002299引物
<400> 28
gcaagggaga gagggatgga gaaatagaac 30
<210> 29
<211> 36
<212> DNA
<213> rs6478720引物
<400> 29
ttgacacccc ttaaattttg tctcactcta atcctc 36
<210> 30
<211> 33
<212> DNA
<213> rs3006953引物
<400> 30
gcaattgcag gtgaaaaaca gagaaagttt gtg 33
<210> 31
<211> 37
<212> DNA
<213> rs76149384引物
<400> 31
cacatctgtc tttctctctt gacctctaga tctacta 37
<210> 32
<211> 29
<212> DNA
<213> rs10837608引物
<400> 32
tcacagcctg gccagttcta aatctgaac 29
<210> 33
<211> 39
<212> DNA
<213> rs4938084引物
<400> 33
ccccagtttc tacagattat accagatgaa taacctagg 39
<210> 34
<211> 36
<212> DNA
<213> rs3107631引物
<400> 34
cattcctaag agccatcctt ccagatcatc tatttc 36
<210> 35
<211> 31
<212> DNA
<213> rs11045217引物
<400> 35
agggtggagg tagtagctga gtcttttgtt a 31
<210> 36
<211> 27
<212> DNA
<213> rs2172244引物
<400> 36
cagaggaagc atcaggtctg catttgt 27
<210> 37
<211> 34
<212> DNA
<213> rs709237引物
<400> 37
tggtgacctt aggcttactg aatcagcatt taac 34
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> rs8001988引物
<400> 38
gcagctccgg taagccacat cag 23
<210> 39
<211> 36
<212> DNA
<213> rs9558636引物
<400> 39
aagagtcaga gtgttcatga tatagaaaag tctggt 36
<210> 40
<211> 24
<212> DNA
<213> rs7317569引物
<400> 40
gtgggaggag tggaagggag ttgt 24
<210> 41
<211> 33
<212> DNA
<213> rs4322570引物
<400> 41
cccaatgaga gaaaattgta tccagtggtc cag 33
<210> 42
<211> 39
<212> DNA
<213> rs1074004引物
<400> 42
cagcactaag agggaaaatt atagctttaa gtacctagg 39
<210> 43
<211> 32
<212> DNA
<213> rs34751254引物
<400> 43
gccagcatgc acatttttca agctcaaatt tg 32
<210> 44
<211> 39
<212> DNA
<213> rs10131888引物
<400> 44
gatgggaggc atcttttctg agaaagtata gttagattc 39
<210> 45
<211> 31
<212> DNA
<213> rs4904514引物
<400> 45
atgtggcaga atgttgaaag tgcatgtctt g 31
<210> 46
<211> 33
<212> DNA
<213> rs4779204引物
<400> 46
tttttgtaga tacaggttct tacaccatgt tgc 33
<210> 47
<211> 33
<212> DNA
<213> rs8028205引物
<400> 47
gcccagccga catgttttat ttaaatcaag gag 33
<210> 48
<211> 33
<212> DNA
<213> rs8032485引物1
<400> 48
ccctggattg agagtaaagg tagtacagtc aac 33
<210> 49
<211> 36
<212> DNA
<213> rs8032485引物2
<400> 49
tgttggatta gaagttagct gatcatcagg agatca 36
<210> 50
<211> 33
<212> DNA
<213> rs7179436引物
<400> 50
aaacgcagaa ctttgagaac cactacaaaa cag 33
<210> 51
<211> 36
<212> DNA
<213> rs1010351引物
<400> 51
agtggaacta gagctactat atcacgtatt tcaggc 36
<210> 52
<211> 27
<212> DNA
<213> rs12596775引物
<400> 52
caccgtgccc agcttacaaa tcaagtt 27
<210> 53
<211> 30
<212> DNA
<213> rs9797242引物
<400> 53
cactgttggc ccagatctgt agaaaggaat 30
<210> 54
<211> 34
<212> DNA
<213> rs12940150引物
<400> 54
catcacctgt ggagcttttg aaaaatagga catc 34
<210> 55
<211> 29
<212> DNA
<213> rs2931275引物
<400> 55
ggcgaaagac tgtgcaagtg caataacaa 29
<210> 56
<211> 36
<212> DNA
<213> rs72863906引物
<400> 56
tctaaatgtc ctacatctct gagctgagct tcataa 36
<210> 57
<211> 39
<212> DNA
<213> rs9304194引物
<400> 57
accttctaag acaggtatta gaatcttgac tgtgtagac 39
<210> 58
<211> 36
<212> DNA
<213> rs1303783引物
<400> 58
ttttctgaga aactgctttg tttaactctc acagag 36
<210> 59
<211> 36
<212> DNA
<213> rs10406637引物
<400> 59
cagattttcc cattagatat gctcatcctg taatgg 36
<210> 60
<211> 39
<212> DNA
<213> rs2143705引物
<400> 60
gttttcctta tactctattg gataatcctg tgttccctc 39
<210> 61
<211> 33
<212> DNA
<213> rs6062145引物
<400> 61
gagggatgtt tcctgcaaaa ttctaacacc aac 33
<210> 62
<211> 29
<212> DNA
<213> rs1850106引物
<400> 62
tccatctccc gggtttgagt gatttcttg 29
<210> 63
<211> 39
<212> DNA
<213> rs7280955引物
<400> 63
tgcctgcatt tcatggataa aaattcagtc attaaagtc 39
<210> 64
<211> 36
<212> DNA
<213> rs13447361引物
<400> 64
gaagaattac ttgagccctg gaatactaag ctagtg 36
<210> 65
<211> 33
<212> DNA
<213> rs17269816引物
<400> 65
aaatctccat ggtctctttg ggtgaaagac tac 33
<210> 66
<211> 39
<212> DNA
<213> rs17316592引物
<400> 66
cagaaataac ccattctatc tgttcctctc tcatgtatc 39

Claims (10)

1.一种遗传标记组合物，其特征在于：包括62个多等位SNPs以及至少两个Y-SNPs，所述62个多等位SNPs在SNP数据库中的rs号分别为：rs2490541、rs4656384、rs6665748、rs11687477、rs2705772、rs2187012、rs4973360、rs404753、rs4683078、rs9879721、rs4525830、rs62409414、rs1377902、rs10014519、rs12520142、rs12187324、rs1974790、rs1549226、rs9368129、rs752761、rs12669779、rs11975827、rs9691758、rs4872939、rs2122705、rs2634525、rs2035637、rs2002299、rs6478720、rs3006953、rs76149384、rs10837608、rs4938084、rs3107631、rs11045217、rs2172244、rs709237、rs8001988、rs9558636、rs7317569、rs4322570、rs1074004、rs34751254、rs10131888、rs4904514、rs4779204、rs8028205、rs8032485、rs7179436、rs1010351、rs12596775、rs9797242、rs12940150、rs2931275、rs72863906、rs9304194、rs1303783、rs10406637、rs2143705、rs6062145、rs1850106、rs7280955。
2.一种下一代测序分型试剂盒，其特征在于：包括用于扩增权利要求1所述62个多等位SNPs以及至少两个Y-SNPs的引物。
3.根据权利要求2所述的下一代测序分型试剂盒，其特征在于：扩增权利要求1所述62个多等位SNPs的所述引物为63条PCR扩增单端特异性引物以及与所述63条PCR扩增单端特异性引物构成常规PCR的正反向引物，所述63条PCR扩增单端特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.63所示。
4.根据权利要求3所述的下一代测序分型试剂盒，其特征在于：所述下一代测序分型试剂盒还包括MiSeq上机测序试剂；和/或所述下一代测序分型试剂盒还包括10×酶切反应缓冲液、FERA缓冲液、酶切反应中酶混合物、5×连接反应缓冲液、连接接头、DNA连接物、连接溶液、5×靶向PCR反应缓冲液、与所述63条PCR扩增单端特异性引物构成常规PCR的正反向引物、与扩增所述Y-SNPs的引物构成常规PCR的正反向引物、Taq DNA聚合酶和5×常规PCR反应缓冲液。
5.一种用于个体识别的鉴定体系，其特征在于：包括权利要求3所述的下一代测序分型试剂盒。
6.根据权利要求5所述的鉴定体系，其特征在于：还包括血液DNA提取试剂盒、QubitdsDNA HS定量试剂盒、Labchip质检分析试剂盒和KAPA文库定量试剂盒。
7.一种下一代测序分型方法，其特征在于：用权利要求5或6所述的鉴定体系进行样品检测。
8.根据权利要求7所述的下一代测序分型方法，其特征在于：所述方法至少包括以下操作步骤：
步骤a、提取待测血液的DNA，定量，采用上述试剂盒中的63条PCR扩增单端特异性引物以及扩增所述Y-SNPs的引物构建文库，定量；
步骤b、对所述文库进行片段检测，定量；
步骤c、根据步骤b的定量结果，对文库中的样本进行均一化，然后变性、稀释，测序；
步骤d、将测序结果与hg19参考基因进行序列对比，得到分型结果。
9.根据权利要求8所述的下一代测序分型方法，其特征在于：步骤a中构建文库的操作包括DNA片段化、末端加A、连接接头、清洗、靶向富集、清洗富集产物、常规PCR扩增、清洗扩增产物。
10.根据权利要求7所述的下一代测序分型方法，其特征在于：所述靶向富集的PCR反应循环参数为：95℃，13min；98℃，2min；98℃，15s，68℃，10min，8次循环；72℃，5min；4℃，5min；和/或
步骤c中，测序的操作在Illumina MiSeq FGx平台进行；和/或
步骤c中变性使用的试剂为0.2N-NaOH。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102337345A (zh) * 2011-11-04 2012-02-01 四川大学 基于20个三等位基因snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒
CN105463116A (zh) * 2016-01-15 2016-04-06 中南大学 一种基于20个三等位基因snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒及检测方法
CN110157812A (zh) * 2019-05-29 2019-08-23 苏州市公安局刑事科学技术研究所 一种同时检测常染色体和y染色体str基因座的复合扩增试剂盒
CN110257489A (zh) * 2019-06-17 2019-09-20 南方医科大学 一种基于二代测序的30个Multiple-allele SNP位点的检测技术体系

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102337345A (zh) * 2011-11-04 2012-02-01 四川大学 基于20个三等位基因snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒
CN105463116A (zh) * 2016-01-15 2016-04-06 中南大学 一种基于20个三等位基因snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒及检测方法
CN110157812A (zh) * 2019-05-29 2019-08-23 苏州市公安局刑事科学技术研究所 一种同时检测常染色体和y染色体str基因座的复合扩增试剂盒
CN110257489A (zh) * 2019-06-17 2019-09-20 南方医科大学 一种基于二代测序的30个Multiple-allele SNP位点的检测技术体系

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7463564B2 (ja) 2021-08-30 2024-04-08 司法鑑定科学研究院 次世代シーケンシング技術によりｙ－ｓｎｐハプログループを検出するプライマー組成物、キット、方法及びその使用

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