CN114686561B - 用于核酸样本扩增的组合物、试剂盒、方法及系统 - Google Patents
用于核酸样本扩增的组合物、试剂盒、方法及系统 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114686561B CN114686561B CN202011584421.5A CN202011584421A CN114686561B CN 114686561 B CN114686561 B CN 114686561B CN 202011584421 A CN202011584421 A CN 202011584421A CN 114686561 B CN114686561 B CN 114686561B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna
- synthetic construct
- primer
- seq
- primer set
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 45
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 45
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 18
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title abstract description 53
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title abstract description 50
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title abstract description 47
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 66
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 claims description 44
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 40
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 40
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 6
- 239000000539 dimer Substances 0.000 abstract description 16
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract description 6
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 abstract description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 223
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 42
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 26
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 17
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 17
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 15
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 13
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 11
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 7
- 238000013461 design Methods 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 101001009007 Homo sapiens Hemoglobin subunit alpha Proteins 0.000 description 6
- 101150115151 GAA gene Proteins 0.000 description 5
- 102100027685 Hemoglobin subunit alpha Human genes 0.000 description 5
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 5
- 230000036541 health Effects 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 4
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 4
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 3
- 102100027591 Copper-transporting ATPase 2 Human genes 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 101150075644 ATP7B gene Proteins 0.000 description 2
- 101150110011 CYP21A2 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 2
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 2
- 208000032170 Congenital Abnormalities Diseases 0.000 description 2
- 206010011878 Deafness Diseases 0.000 description 2
- 101150104226 F8 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150039948 F9 gene Proteins 0.000 description 2
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 2
- 102100037156 Gap junction beta-2 protein Human genes 0.000 description 2
- 101150034593 Gjb2 gene Proteins 0.000 description 2
- 206010053185 Glycogen storage disease type II Diseases 0.000 description 2
- 101150013707 HBB gene Proteins 0.000 description 2
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 2
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 2
- 208000002972 Hepatolenticular Degeneration Diseases 0.000 description 2
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 2
- 101000936280 Homo sapiens Copper-transporting ATPase 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000954092 Homo sapiens Gap junction beta-2 protein Proteins 0.000 description 2
- 101000899111 Homo sapiens Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 2
- 101000617738 Homo sapiens Survival motor neuron protein Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 102100035278 Pendrin Human genes 0.000 description 2
- 102100038223 Phenylalanine-4-hydroxylase Human genes 0.000 description 2
- 101710125939 Phenylalanine-4-hydroxylase Proteins 0.000 description 2
- 201000011252 Phenylketonuria Diseases 0.000 description 2
- 108091006507 SLC26A4 Proteins 0.000 description 2
- 101150030803 SLC26A4 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150081851 SMN1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100021947 Survival motor neuron protein Human genes 0.000 description 2
- 201000006288 alpha thalassemia Diseases 0.000 description 2
- 208000005980 beta thalassemia Diseases 0.000 description 2
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 231100000895 deafness Toxicity 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 201000004502 glycogen storage disease II Diseases 0.000 description 2
- 208000016354 hearing loss disease Diseases 0.000 description 2
- 208000009429 hemophilia B Diseases 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 101150036331 pah gene Proteins 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 208000002320 spinal muscular atrophy Diseases 0.000 description 2
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyinosine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- JTBBWRKSUYCPFY-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydro-1h-pyrimidin-4-one Chemical compound O=C1NCNC=C1 JTBBWRKSUYCPFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 2-aminopurine Chemical compound NC1=NC=C2N=CNC2=N1 MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000021 21-hydroxylase deficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000008448 Congenital adrenal hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N Digoxin Natural products O([C@H]1[C@H](C)O[C@H](O[C@@H]2C[C@@H]3[C@@](C)([C@@H]4[C@H]([C@]5(O)[C@](C)([C@H](O)C4)[C@H](C4=CC(=O)OC4)CC5)CC3)CC2)C[C@@H]1O)[C@H]1O[C@H](C)[C@@H](O[C@H]2O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)C2)[C@@H](O)C1 LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N 0.000 description 1
- 208000032007 Glycogen storage disease due to acid maltase deficiency Diseases 0.000 description 1
- 101000861263 Homo sapiens Steroid 21-hydroxylase Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 102100027545 Steroid 21-hydroxylase Human genes 0.000 description 1
- 208000031320 Teratogenesis Diseases 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-PWCQTSIFSA-N Tritiated water Chemical compound [3H]O[3H] XLYOFNOQVPJJNP-PWCQTSIFSA-N 0.000 description 1
- 208000018839 Wilson disease Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- WREGKURFCTUGRC-POYBYMJQSA-N Zalcitabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)CC1 WREGKURFCTUGRC-POYBYMJQSA-N 0.000 description 1
- 230000001780 adrenocortical effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 208000036201 autosomal recessive hearing loss Diseases 0.000 description 1
- 201000011409 autosomal recessive nonsyndromic deafness 1A Diseases 0.000 description 1
- 208000031514 autosomal recessive nonsyndromic hearing loss 1A Diseases 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000007698 birth defect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- VGONTNSXDCQUGY-UHFFFAOYSA-N desoxyinosine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N digoxin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@@H]3C[C@@H]4[C@]([C@@H]5[C@H]([C@]6(CC[C@@H]([C@@]6(C)[C@H](O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)C[C@@H]2O)C)C[C@@H]1O LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N 0.000 description 1
- 229960005156 digoxin Drugs 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N digoxine Natural products C1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(C)OC(OC2C(OC(OC3CC4C(C5C(C6(CCC(C6(C)C(O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)CC2O)C)CC1O LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 1
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000003340 mental effect Effects 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001720 vestibular Effects 0.000 description 1
- 210000002905 vestibular aqueduct Anatomy 0.000 description 1
- 229960000523 zalcitabine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及用于核酸样本扩增的组合物、试剂盒、核酸扩增方法、建库方法及系统，能够用于单基因病相关变异位点的检测，在避免引物二聚体和非特异性扩增的同时，获得高均一性和/或高覆盖度。
Description
技术领域
本发明涉及分子检测领域，具体而言，涉及用于核酸样本扩增的组合物、试剂盒、方法及系统。
背景技术
单基因遗传病(简称：单基因病)是由单个基因缺陷所导致的疾病，符合孟德尔遗传方式，因此也称为孟德尔式遗传病。是一类对人类健康造成严重损伤(致死、致残或致畸)而缺乏有效诊治手段的疾病，也是造成出生缺陷的主要原因之一。目前已发现的单基因病超过10000种，根据世界卫生组织(WHO)统计，综合发病率高达1/100。单基因病在胎儿发育期常常不表现出结构畸形，常规产检中难以发现，许多隐性遗传病往往也没有明显的家族史。研究发现，平均每个人携带2.8个隐性遗传病的致病突变，如果父母都携带相同的致病突变，他们的后代有1/4的患病机率。单基因病不仅对患者的健康造成严重危害，也给家庭和社会带来了沉重的精神和经济负担。因此亟需有效的基因检测方法进行提前预防和干预，在帮助人们了解自身健康状况的同时有效避免严重缺陷患儿的出生，实现优生优育。
现有对单基因病的基因检测技术主要有常规PCR、Sanger测序、二代高通量测序等。常规PCR、Sanger测序只能实现单一病种的检测，成本低廉。而二代高通量测序能实现多病种一次性检测，大大提高了检测效率。靶向测序技术可以将感兴趣的基因组区域富集出来测序，单个样本测序数据产出少且分析速度较快，因此更能经济高效地发挥二代高通量测序技术的优势，另外，靶向测序可以对目标区域进行深度测序，增加了目标区域内遗传变异的检测灵敏度和准确性。现已广泛应用到临床检测、健康筛查等众多领域。
靶向测序的方法主要分为两种：杂交捕获测序和多重PCR扩增子测序。杂交捕获测序，目前应用的主要是液相杂交捕获测序，即基于碱基互补配对原理，设计合成核酸探针，对DNA文库进行基于液相环境的目标区域杂交富集，并进行测序。多重PCR扩增子测序即针对感兴趣的目标区域，设计多重PCR引物进行扩增富集并进行测序的技术。
杂交捕获测序会涉及到探针序列设计，探针合成，液相杂交捕获等多个技术卡点，整个实验过程较为复杂，速度慢，对样本起始量的要求比多重PCR扩增子测序高，探针合成成本高。
相比杂交捕获测序，应用多重PCR捕获目标序列具有操作简单、成本低，对样本起始量要求低，大大缩短了检测流程和检测时间。然而，多重PCR拟捕获目标区域越多，则引物扩增的覆盖度、均一性就会受到影响，多重PCR捕获技术的实现难度越大。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明创造性的开发了用于核酸样本扩增的组合物，包括用于检测GAA基因上的至少75个致病位点的引物组5，引物组5以核酸样本为模板，可扩增出表5所示的扩增子，且意外地获得高均一性和/或高覆盖度。
本发明还提供了基于上述组合物的其他组合物、试剂盒、核酸扩增方法、建库方法及系统。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的一个实施方式中，多重PCR扩增后胶图；
图2为本发明的一个实施方式中，扩增子测序文库图。
具体实施方式
在对基因上多位点的平行获取时，其难点有二，一是如何设计出一套不同引物之间的相互作用小的组合，另一方面，如何设计出一套覆盖尽可能多位点的引物组合；突破其中任意一个难点都是需要发明人付出创造性劳动的。
发明人通过创造性地设计可用于检测靶基因变异位点的引物，不仅避免引物二聚体、减少特异性扩增，还能够将多种引物构成组合物用于多重PCR扩增和/或扩增子测序文库构建，意外地获得高均一性和/或高覆盖度，克服现有技术难点。
本发明涉及用于核酸样本扩增的组合物，包括引物组5；引物组5以核酸样本为模板，扩增出表5所示的扩增子。
在一些实施方式中，上述用于核酸样本扩增的组合物还包括引物组1-4、6-11中的至少一组；其中，所述引物组1以核酸样本为模板，扩增出表1所示的扩增子；所述引物组2以核酸样本为模板，扩增出表2所示的扩增子；所述引物组3以核酸样本为模板，扩增出表3所示的扩增子；所述引物组4以核酸样本为模板，扩增出表4所示的扩增子；所述引物组6以核酸样本为模板，扩增出表6所示的扩增子；所述引物组7以核酸样本为模板，扩增出表7所示的扩增子；所述引物组8以核酸样本为模板，扩增出表8所示的扩增子；所述引物组9以核酸样本为模板，扩增出表9所示的扩增子；所述引物组10以核酸样本为模板，扩增出表10所示的扩增子；所述引物组11以核酸样本为模板，扩增出表11所示的扩增子。
本发明还涉及用于核酸样本扩增的组合物，包括引物组5；引物组5具有如SEQ IDNO:97-SEQ ID NO:138所示的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述组合物还包括引物组1-4、6-11中的至少一组；其中，所述引物组1具有如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:46所示的核苷酸序列；引物组2具有如SEQ ID NO:47-SEQ ID NO:60所示的核苷酸序列；引物组3具有如SEQ ID NO:61-SEQ ID NO:86所示的核苷酸序列；引物组4具有如SEQ ID NO:87-SEQ ID NO:96所示的核苷酸序列；引物组6具有如SEQ ID NO:139-SEQ ID NO:144所示的核苷酸序列；引物组7具有如SEQ ID NO:145-SEQID NO:150所示的核苷酸序列；引物组8具有如SEQ ID NO:151-SEQ ID NO:162所示的核苷酸序列；引物组9具有如SEQ ID NO:163-SEQ ID NO:190所示的核苷酸序列；引物组10具有如SEQ ID NO:191-SEQ ID NO:202所示的核苷酸序列；引物组11具有如SEQ ID NO:203-SEQID NO:212所示的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述组合物除了包括引物组5以外，还包括其他引物组。例如：在一些实施方式中，所述组合物包括引物组2和引物组5。在一些实施方式中，所述组合物包括引物组1和引物组5。在一些实施方式中，所述组合物包括引物组5和引物组9。在一些实施方式中，所述组合物包括引物组1、引物组2、引物组5、引物组9。在一些实施方式中，所述组合物包括引物组5、引物组7、引物组8。在一些实施方式中，所述组合物包括引物组5、引物组6、引物组10。在一些实施方式中，所述组合物包括引物组3、引物组4、引物组5。在一些实施方式中，所述组合物包括引物组5、引物组11。在一些实施方式中，所述组合物包括引物组1-引物组11。
在一些实施方式中，上述组合物用于检测GAA基因上的变异位点。
在一些实施方式中，上述组合物还可用于检测下述至少一种基因上的变异位点：ATP7B、CYP21A2、F8、F9、GJB2、HBA1、HBA2、HBB、PAH、SLC26A4、SMN1。
在一些实施方式中，引物组1用于检测ATP7B基因上的至少98个致病位点。在一些实施方式中，引物组2用于检测CYP21A2基因上的至少10个致病位点。在一些实施方式中，引物组3用于检测F8基因上的至少16个致病位点。在一些实施方式中，引物组4用于检测F9基因上的至少9个致病位点。在一些实施方式中，引物组5用于检测GAA基因上的至少75个致病位点。在一些实施方式中，引物组6用于检测GJB2基因上的至少11个致病位点。在一些实施方式中，引物组7用于检测HBA1、HBA2基因上的至少8个致病位点。在一些实施方式中，引物组8用于检测HBB基因上的至少85个致病位点。在一些实施方式中，引物组9用于检测PAH基因上的至少212个致病位点。在一些实施方式中，引物组10用于检测SLC26A4基因上的至少9个致病位点。在一些实施方式中，引物组11用于检测SMN1基因上的至少9个致病位点。
致病位点通常是指引起疾病的变异位点，变异形式包括SNV(single nucleotidevariant，单核苷酸变异)、Short repeat(短序列重复)、Inversion(倒置)、Insertion(插入)、Deletion(缺失)、Duplication(重复)等形式。
在一些实施方式中，允许对上述任一实施方式中所述的引物组中的引物序列进行修饰；或连接建库测序所需的通用序列。
在一些实施方式中，修饰类型包括硫代、2氟代核糖核酸、2’-O-甲基核糖核酸、5-甲基脱氧胞嘧啶、脱氧次黄嘌呤、脱氧尿嘧啶、2-氨基嘌呤、5-溴-脱氧尿嘧啶、反向dT、双脱氧胞苷、间臂、氨基修饰、羧基修饰、磷酸化修饰、地高辛修饰、生物素修饰等，本领域技术人员可以根据目的对引物进行修饰，例如为了防止引物被核酸酶降解，可以对引物两端2-5个碱基进行硫代修饰。
在一些实施方式中，允许对引物组中的引物序列的5’端连接通用序列。
在一些实施方式中，通用序列包括建库引物。建库引物用于实现扩增子与测序引物、标签或接头的连接。本领域技术人员应当理解，根据不同的测序平台，不同的建库方式，建库引物有所不同。在一些实施方式中，建库引物可以是测序引物或接头的一部分核苷酸序列，在该实施方式中，通过建库引物可以实现扩增子与测序引物或接头的连接，以实现建库测序目的。在一些实施方式中，建库引物可以是测序引物或接头靠近3’端的一部分核苷酸序列。在一些实施方式中，建库引物可以是不同于测序引物、接头或标签的核苷酸序列。例如通过将建库引物引入到测序引物、接头或标签中，形成新的序列，例如将建库引物连接至测序引物的3’端，实现扩增子与测序引物的连接；例如将建库引物连接至接头的3’端，实现扩增子与接头的连接；例如将建库引物连接至标签接头的3’端，实现扩增子与标签的连接。其中，接头应当做广义理解，其核苷酸序列中包括测序引物序列，进一步还可以包括标签序列或建库引物序列等。在一些实施方式中，illumina平台的接头(又名测序接头)为5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’，其包括测序引物，建库引物可以是该接头的一部分；例如在一些实施方式中，建库引物1(对应实施例11中通用序列1)为：5’-CTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’。在一些实施方式中，illumina平台的接头(又名标签接头)为5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’，其包括测序引物和标签序列，建库引物可以是该接头的一部分；例如在一些实施方式中，建库引物2(对应实施例11中通用序列2)为：5’-CAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’。
在一些实施方式中，通用序列包括测序引物。在一些实施方式中，将测序引物连接至引物的5’端，此种情况下可以直接获得包含测序引物的扩增子。
在一些实施方式中，通用序列包括标签(index)。标签用于实现样本标记，在核酸测序文库构建过程中，可以通过添加标签实现不同样本的区分，实现高通量检测。在一些实施方式中，标签是4-18个核苷酸组成，例如随机的NNNNNN，例如测序平台推荐的标签序列，如illumina平台推荐的标签序列。在一些实施方式中，标签可以连接至引物序列的5’端。此种情况下，可以直接获得包含标签的扩增子。
在一些实施方式中，通用序列包括接头。在一些实施方式中，将接头连接至引物的5’端，在此情况下，可以直接获得包含接头的扩增子。
在一些实施方式中，通用序列可以只连接至引物对中的其中一条。在一些实施方式中，通用序列可以分别连接至引物对中的两条引物。在一些实施方式中，分别连接至引物对中的两条通用序列可以相同，也可以不同。
本发明还涉及试剂盒，包括上述任一实施方式所述的组合物。在一些实施方式中，试剂盒还包括PCR buffer、DNA聚合酶，以实现PCR扩增。在一些实施方式中，试剂盒还包括接头引物和/或标签引物，以实现扩增子文库构建。在一些实施方式中，试剂盒还包括核酸提取试剂，以实现核酸样本的获得。在一些实施方式中，试剂盒还包括纯化试剂，例如磁珠等。
本发明还涉及核酸扩增方法，包括：采用上述任一实施方式所述的组合物，对核酸样本进行扩增。在一些实施方式中，对核酸样本进行扩增在允许发生扩增的条件下进行。在一些实施方式中，例如在有PCR buffer、DNA聚合酶的体系下，根据常规扩增反应条件，对核酸样本进行扩增。在一些实施方式中，扩增反应中还可以添加荧光探针或荧光染料，指示PCR反应。
本发明还涉及建库方法，包括：采用上述任一实施方式所述的组合物，构建扩增子测序文库，用于核酸测序。在一些实施方式中，采用组合物扩增出扩增子，根据测序平台需求，对扩增子进行接头或标签连接，并且富集出扩增子测序文库，用于测序。
在上述核酸扩增方法和/或上述建库方法的一些实施方式中，所述10μL多重PCR扩增的体系为：2μL 5×Hyper PCR Buffer，1μL 0.5-10μM的引物pool工作液，0.1-3μL CADNA聚合酶，XμL gDNA(≥10ng)，(6.5-X)μL Nuclease-free Water。
在一些实施方式中，所述多重PCR扩增的条件为：94-96℃5-10min；3-5cycles(94-96℃25-35s，58-63℃1.5-2.5min，63-67℃2.5-3.5min，65-68℃0.5-1.5min，70-74℃0.5-1.5min)；12-25cycles(94-96℃30s，64-68℃2.5-3.5min)。
本发明还涉及系统，包括：建库单元；所述建库单元用于利用上述任一实施方式所述的组合物构建扩增子测序文库。
在一些实施方式中，所述系统还包括测序单元，所述测序单元用于对建库单元输出的扩增子测序文库进行测序；在一些实施方式中，测序单元对扩增子文库进行测序，例如可以嵌套常用的测序组件，对扩增子测序文库的核酸信息进行获取。
在一些实施方式中，所述系统还包括分析蛋白，所述分析单元用于对测序单元输出的下机数据进行生物信息学分析。在一些实施方式中，生物信息学分析包括标签识别、序列比对、数据去燥、数据校正或变异位点识别等分析。
在一些实施方式中，所述核酸样本是DNA。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
用于核酸样本扩增的组合物，包括引物组5。其中，糖原累积病2型(GlycogenStorage Disease II)是由GAA基因缺陷所导致的疾病，针对GAA上的75个致病位点创造性地设计引物，避免引物二聚体和特异性扩增，兼顾高均一性和高覆盖度，并经优化获得引物组5(SEQ ID NO:97-SEQ ID NO:138所示的核苷酸序列)。
实施例2
用于核酸样本扩增的组合物，包括引物组2和引物组5。其中，21-羟化酶缺乏型先天性肾上腺皮质增生症(Adrenal hyperplasia,congenital,due to21-hydroxylasedeficiency)是由CYP21A2基因缺陷所导致的疾病，针对CYP21A2上的10个致病位点创造性地设计引物，避免引物二聚体和特异性扩增，兼顾高均一性和高覆盖度，并经优化获得引物组2(SEQ ID NO:47-SEQ ID NO:60所示的核苷酸序列)；引物组5同实施例1。
实施例3
用于核酸样本扩增的组合物，包括引物组1和引物组5。其中，肝豆状核变性(Wilson Disease)是由ATP7B基因缺陷所导致的疾病，本发明针对ATP7B上的98个致病位点创造性地设计引物，避免引物二聚体和特异性扩增，兼顾高均一性和高覆盖度，并经优化获得引物组1(SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:46所示的核苷酸序列)；引物组5同实施例1。
实施例4
用于核酸样本扩增的组合物，包括引物组5和引物组9。其中，苯丙酮尿症(Phenylketonuria)是由PAH基因缺陷所导致的疾病，针对PAH上的212个致病位点创造性地设计引物，避免引物二聚体和特异性扩增，兼顾高均一性和高覆盖度，并经优化获得引物组9(SEQ ID NO:163-SEQ ID NO:190所示的核苷酸序列)；引物组5同实施例1。
实施例5
用于核酸样本扩增的组合物，包括引物组1、引物组2、引物组5和引物组9。其中，引物组5同实施例1、引物组2同实施例2、引物组1同实施例3、引物组9同实施例4。
实施例6
用于核酸样本扩增的组合物，包括引物组3、引物组4和引物组5。其中，血友病A(Hemophilia A)是由F8基因缺陷所导致的疾病，针对F8上的16个致病位点创造性地设计引物，避免引物二聚体和特异性扩增，兼顾高均一性和高覆盖度，并经优化获得引物组3(SEQID NO:61-SEQ ID NO:86所示的核苷酸序列)；血友病B(Hemophilia B)是由F9基因缺陷所导致的疾病，针对F9上的9个致病位点创造性地设计引物，避免引物二聚体和特异性扩增，兼顾高均一性和高覆盖度，并经优化获得引物组4(SEQ ID NO:87-SEQ ID NO:96所示的核苷酸序列)；引物组5同实施例1。
实施例7
用于核酸样本扩增的组合物，包括引物组5、引物组6和引物组10。其中，常染色体隐性耳聋1A型(Deafness,Autosomal Recessive 1a)是由GJB2基因缺陷所导致的疾病，针对GJB2上的11个致病位点创造性地设计引物，避免引物二聚体和特异性扩增，兼顾高均一性和高覆盖度，并经优化获得引物组6(SEQ ID NO:139-SEQ ID NO:144所示的核苷酸序列)；常染色体隐性耳聋伴前庭导水管扩张4型(Deafness,autosomal recessive 4,withenlarged vestibular aqueduc)是由SLC26A4基因缺陷所导致的疾病，针对SLC26A4上的9个致病位点创造性地设计引物，避免引物二聚体和特异性扩增，兼顾高均一性和高覆盖度，并经优化获得引物组10(SEQ ID NO:191-SEQ ID NO:202所示的核苷酸序列)；引物组5同实施例1。
实施例8
用于核酸样本扩增的组合物，包括引物组5、引物组7和引物组8。其中，α-地中海贫血(Alpha-thalassemia)是由a珠蛋白基因缺陷所导致的疾病，针对HBA1、HBA2上的8个致病位点创造性地设计引物，避免引物二聚体和特异性扩增，兼顾高均一性和高覆盖度，并经优化获得引物组7(SEQ ID NO:145-SEQ ID NO:150所示的核苷酸序列)；β-地中海贫血(Beta-thalassemia)是由HBB基因缺陷所导致的疾病，针对HBB上的85个致病位点创造性地设计引物，避免引物二聚体和特异性扩增，兼顾高均一性和高覆盖度，并经优化获得引物组8(SEQID NO:151-SEQ ID NO:162所示的核苷酸序列)；引物组5同实施例1。
实施例9
用于核酸样本扩增的组合物，包括引物组5和引物组11。其中，脊髓性肌萎缩症(Spinal muscular atrophy)是由SMN1基因缺陷所导致的疾病，针对SMN1上的9个致病位点创造性地设计引物，避免引物二聚体和特异性扩增，兼顾高均一性和高覆盖度并经优化获得引物组11(SEQ ID NO:203-SEQ ID NO:212所示的核苷酸序列)；引物组5同实施例1。
实施例10
用于核酸样本扩增的组合物，包括引物组1-引物组11，即包括SEQ ID NO:1-SEQID NO:212所示的核苷酸序列。
实施例11
1.DNA提取
实施例中核酸样本采用DNA，DNA样本来自离体的人外周血。DNA样本提取采用DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN)提取试剂盒进行全基因组DNA(gDNA)提取，提取的DNA用Nanodrop进行纯度检测，并用Qubit进行浓度测定。实施例中采用的DNA样本完整度良好。
2.多重PCR扩增
采用实施例1-10任一例的组合物。为了实现建库目的，所用引物的5’端连接有通用序列。具体例如所用引物对中的上游引物或下游引物，分别连接有通用序列1或通用序列2，具体而言，如果上游引物连接了通用序列1，则下游引物连接通用序列2；如果上游引物连接了通用序列2，则下游引物连接通用序列1，具体例如通用序列1为5’-CTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’；通用序列2为5’-CAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’。将连接了通用序列的引物溶解后，等摩尔浓度混合获得5μM的引物pool工作液。配置10μL的多重PCR反应体系，包括2μL 5×Hyper PCR Buffer(Fapo n)，1μL 5μM的引物pool工作液，0.5μL CA DNA聚合酶(Fapon)，XμL gDNA(20ng)，(6.5-X)μL Nuclease-free Water，充分混匀后放入PC R仪上进行如下反应：95℃10min；5cycles(95℃30s,63℃2min,65℃3min,67℃1min,72℃1min)；20cycles(95℃30s,66℃3min)。
3.扩增子测序文库的构建
多重PCR扩增完成后，在10μL的多重PCR反应体系中补水40μL至50μL总体积，加入60μL的Ampure XP Beads磁珠纯化，混合均匀后室温静置5min，磁力架上分离去除上清，加入200μL的新鲜配置的80％乙醇洗涤两次，室温干燥磁珠2-3min，加入20μL Nuclease-freeWater重溶磁珠，室温下放置2min后磁力架上分离，将上清转入新的离心管中。
配置50μL的扩增子测序文库PCR反应体系，包括：25μL 2×HIFI PCR Mix(Fapon),2μL 10μM Uni_接头,2μL 10μM Index_接头，4μL上一步中纯化得到的多重PCR扩增产物,17μL Nuclease-free Water；混合均匀后，PCR仪上进行如下反应：98℃45s；6cycles(98℃20s,60℃30s,72℃30s)；4℃hold。
Uni_接头：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(下划线部分为与通用序列1重叠部分)；
Index_接头：
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(下划线部分为与通用序列2重叠部分,NNNNNN为识别不同多重扩增产物的标签序列)。
PCR程序结束后，在50μL PCR扩增体系中加入50μL的Ampure XP Beads磁珠纯化，混合均匀后室温静置5min，磁力架上分离去除上清，加入200μL的新鲜配置的80％乙醇洗涤两次，室温干燥磁珠2-3min，加入20μL Nuclease-free Water重溶磁珠，室温下放置2min后磁力架上分离，将上清转入新的离心管中。纯化得到的上清即为构建好的扩增子测序文库。4.扩增子测序文库的高通量测序
满足质检要求的扩增子测序文库根据Qubit定量浓度进行等量混合后上机测序，测序平台为Illumina Hiseq 2500。
5.生物信息学分析
对获得的测序下机数据进行常规参数的质控和分析。
检测结果
1、对实施例1-10的组合物，分别按照实施例11的方法进行测试，Mapping rate均大于95％，Ontarget Rate均大于90％。各实施例的>0.2x Average Depth Rate、>30xDepth Rate和coverage如下表所示。
注：“Mapping rate”代表重测序时比对率；“Ontarget Rate”代表中靶率，表示测序数据比对到靶向扩增子的比例；“>0.2x Average Depth Rate”代表大于0.2x平均测序深度位点的比例，该值越高，扩增均一性越好；“>30x Depth Rate”代表测序深度大于30x的比例，该值越高，说明扩增子有效覆盖度越高；“coverage”表示目标位点的覆盖率，该值越高，说明目标位点覆盖度越高。
2、采用实施例10的组合物，多重PCR扩增后。用2％的琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，目的扩增片段明显，无明显引物二聚体，可见扩增效率高。
3、采用实施例10的组合物，获得构建好的扩增子测序文库，用Agilent2100Bioanalyzer进行文库大小的检测，结果如图2所示，文库主峰大小在300-400bp，无明显的小片段(引物二聚体或接头二聚体)；用Qubit浓度定量，构建好的扩增子测序文库浓度在40-60ng/μL，可见扩增效率高。
综上可见，本发明组合物能够获得优良的均一性和覆盖度，扩增效率高。其中，引物组5能够保证全部覆盖GAA基因上75个变异位点，实现优异的检出效果。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东菲鹏生物有限公司
<120> 用于核酸样本扩增的组合物、试剂盒、方法及系统
<130>
<140> 202011584421.5
<141> 2020-12-28
<160> 216
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 1
ACGCCCAAGTCCACGTACCTCTTTACAGT
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 2
CAGGAGTGTGACTATGGAAGCCCCTCC
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 3
TGCTAGCCACCACATCCAGCAAATCATT
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 4
AAGGTCCAGGAGCTCCAGAATAAAGGG
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 5
ACCTCAATAATTTTGATAATATCCCGTGGACCG
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 6
CCTGGGTCTGTGGGATTCTTGCCATCC
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 7
TCTGAACCTGAAGCTGCTGTTACCTTTGC
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 8
TCGGTGGGTGGTACTTCTACGTTCAGG
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 9
AAAGCCCAGTGAATCTAAGATATGAAAGAACAGG
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 10
CATAGGTTGTAATTTCCCATGGTCTTGGTGTT
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 11
TCAGGATGGGGAAAGCCGTGCTACAGG
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 12
CTCAACCTGCCTCTGACTCTGTCCTGT
<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 13
ACAAGGGTAAAGGCAGCTAATCCAGGAG
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 14
CCTCCTTTTTCCCCACCCCTCTCTTTTTA
<210> 15
<211> 31
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 15
ACTCTTTTGCCTGATATCTGCAGAAAACTGT
<210> 16
<211> 33
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 16
GTGAAATTGGACCATTTAGAAATAACCACAGCC
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 17
ACTGGAAGACCTGTGATCTGTCCCACT
<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 18
CACCAAGGAAGCCATGTGGTCACCCT
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 19
CTCTCCGCCTTCTCAGCCACAGCAAC
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 20
GGCCCTGTGTCGCTCATTGAACTCTCC
<210> 21
<211> 29
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 21
ACAGTTTGCAACATTAAAGGGCTGTACCT
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 22
GCAAGTGTGGTATCTTGGTGCGGGGT
<210> 23
<211> 29
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 23
ATAAATCAGTGCCAGGACCAGGTTGATGC
<210> 24
<211> 26
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 24
CGAGGCAGCCGACGTCGTCCTTATCA
<210> 25
<211> 28
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 25
TGAGAGGCAAGTTCCACTGTGCTAAGCA
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 26
TGAGTGCGAGTTCTTTCTTCCCCAGGT
<210> 27
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 27
TTAACCAGCTGCAGAGACAAAAGCCAG
<210> 28
<211> 28
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 28
CCCCTCCCTTTCACTTCACCCCTCTTGG
<210> 29
<211> 29
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 29
CCCATGTCCCCAATTTGATGGCAAACCTG
<210> 30
<211> 31
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 30
GGAACCAGCAATGAAGAAGAGTTTTGCTTTT
<210> 31
<211> 28
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 31
CCTGAGGGAACATGAAACAAGCCATCTC
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 32
AGCTGGCCTAGAACCTGACCCGGTG
<210> 33
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 33
TGCCCACACTCACAAGGTCTATTGCAA
<210> 34
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 34
TTCCTAGAGCAAAACCTCAGAAGCCCT
<210> 35
<211> 29
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 35
ACCAAGCTAAAGCACTATGTTTGCGCTTA
<210> 36
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 36
TTTGGCATCCCTGTCATGGCCTTAATG
<210> 37
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 37
TGCTCTTGATGGCAGCTTCAAATCCCA
<210> 38
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 38
GCTTCGAGGCCAGCATTGCAGAAGGAA
<210> 39
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 39
TCTAAAGGGTCCTTTTCTCCCACGCCA
<210> 40
<211> 28
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 40
GCAGGAGAGACAGATCACAGCCAGAGAA
<210> 41
<211> 28
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 41
ACGAGGTCTATACGCAGCATTCCTAAGT
<210> 42
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 42
CTACATCTGTGCAGGAAGTGGCTCCCC
<210> 43
<211> 29
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 43
ACCAGAAACGACTGAAGCCTCAAATCCCA
<210> 44
<211> 26
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 44
AGTTCTCATTCCCCTGGCTCCCCACC
<210> 45
<211> 35
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 45
CTTACCCATTCACTGATATCCTCCCTCAGATTATT
<210> 46
<211> 29
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 46
CCAGCAAAGCCCTTGTTAAGTTTGACCCG
<210> 47
<211> 25
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 47
TCAGCCTCGCCTCTCACAGTAGCCC
<210> 48
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 48
AAGTTGTCGTCCTGCCAGAAAAGGAGG
<210> 49
<211> 26
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 49
TTTCACCCTCTGCAGGAGAGCCTCGT
<210> 50
<211> 25
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 50
GCCTTTTGCTTGTCCCCAGGACGCA
<210> 51
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 51
ACTCCACCCGATCATTCCCCAGATTCA
<210> 52
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 52
CTTTCCTCACTCATCCCCAACCCTCGG
<210> 53
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 53
GGCCCCAAAACAGTCTACACAGCAGGA
<210> 54
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 54
GCCTGTAGATGGGCCCGAATTTCTGAG
<210> 55
<211> 26
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 55
GGCCCTCAGCTGCCTTCATCAGTTCC
<210> 56
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 56
TCAGGAGCCCAGCCTTACCTCACAGAA
<210> 57
<211> 25
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 57
GCTCTTCGTGGTGCTGACCCGACTG
<210> 58
<211> 28
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 58
GCAATAAAGGAGAAACTGAGGTACCCGG
<210> 59
<211> 29
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 59
GCTGAAGCAGGCCATAGAGAAGAGGGATC
<210> 60
<211> 25
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 60
CCATCATGTCCCTCCACTGGCCTGC
<210> 61
<211> 26
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 61
CTCGCAGCCCAGAACCTCCATCCTCA
<210> 62
<211> 29
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 62
ACAACTAGAAGTGAGAAAAGCGTCTGTGC
<210> 63
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 63
AGTCCCAGTCCTCCTCTTCAGCAGCAA
<210> 64
<211> 30
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 64
AGCAAGACACTCTGACATTGTTTGGTTTGT
<210> 65
<211> 31
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 65
ACTCTATAATGTCCCCTTCAGCAACACACTA
<210> 66
<211> 29
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 66
AAGTGCACTCAATATTCCTCGAAGGTCAC
<210> 67
<211> 24
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 67
GAGCTTGAGGTCCGGCCAACAGCT
<210> 68
<211> 34
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 68
AAGAATCAAGCAAGCAGACCATATAACATCTACC
<210> 69
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 69
AGGCAAGAACTCACCTGGTTTCCTCTT
<210> 70
<211> 34
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 70
AGGATTTTCCAATTCTGCCAGGAGAAATATTCAA
<210> 71
<211> 32
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 71
TTTCTTTATTCACCACCCACTGGACTTAAGTG
<210> 72
<211> 33
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 72
GACAACATCAGTAGCATTTCTTTACCCCTTTCA
<210> 73
<211> 31
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 73
ACCAGTGTTCTTGTCACAACTAGAAACCTTC
<210> 74
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 74
ACAACAGCAGCAATGCAAAAACCACTT
<210> 75
<211> 35
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 75
GTTCTTCATGAAATTCTTAGTGCCAGTCACTGTAT
<210> 76
<211> 31
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 76
ACGTAGGACTCAAAGAGATGGTTTTTCCAAG
<210> 77
<211> 29
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 77
ACCAGTCATCTCCAAGGTTAGAATGGCTA
<210> 78
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 78
CGAGGAGTCATAGCATCCCTCAAGCAA
<210> 79
<211> 32
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 79
GCCTCTCCACTGCAGCAATAAAATAGTGTCGT
<210> 80
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 80
AAAACCCACCAGTCTTGAAACGCCATC
<210> 81
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 81
ATCACAGCCCATCAACTCCATGCGAAG
<210> 82
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 82
TGGATGCTGTTGAGAAACGCACAAAGC
<210> 83
<211> 30
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 83
TGATTGTGTTCCCAGTGCCTAGACCATTTA
<210> 84
<211> 28
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 84
AATGGCTCAGGATCAAAGGATTCGATGG
<210> 85
<211> 35
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 85
CTTGACACTACTACATTTTTGCTGATATGTCCGTA
<210> 86
<211> 29
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 86
GTCAGAAGTTCTCCAGCCTCTACATCTCT
<210> 87
<211> 33
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 87
ACATTTCAGTTTTTCTTGATCATGAAAACGCCA
<210> 88
<211> 32
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 88
TGCTCTGCATCTGAAGGGTATTATGTGGAAAT
<210> 89
<211> 28
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 89
ACCGGGCATTCTAAGCAGTTTACGTGCC
<210> 90
<211> 34
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 90
ACACCAATATTGCATTTTCCAGTTTCAACTTGTT
<210> 91
<211> 32
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 91
TCAGTGGTCCCAAGTAGTCACTTAGAAAATCT
<210> 92
<211> 30
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 92
CCAGAAGGGCAATGTCATGGTTGTACTTAT
<210> 93
<211> 28
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 93
ACGAACCCTTAGTGCTAAACAGCTACGT
<210> 94
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 94
GGGTCCCCCACTATCTCCTTGACATGA
<210> 95
<211> 30
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 95
TGCATTCTGTGGAGGCTCTATCGTTAATGA
<210> 96
<211> 29
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 96
TGAAATTATGACCCTTCTGCCTTTAGCCC
<210> 97
<211> 24
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 97
GGGCTCTGGGTCACTTGGCCTGAG
<210> 98
<211> 25
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 98
CCACCCCCACCCTACCAGACTGAGC
<210> 99
<211> 21
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 99
CTTCCTTTGCCCCCGCCTGCC
<210> 100
<211> 22
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 100
GGAGTTACGTGCCCCTCCCCCA
<210> 101
<211> 21
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 101
GAGAGCCCCGTGAGTGCCGCC
<210> 102
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 102
TGAGCTGGGTGAGTCTCCTCCAGGACT
<210> 103
<211> 26
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 103
GTGCTTCTTCCCACCCAGCTACCCCA
<210> 104
<211> 25
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 104
GCAACATGCACCCCACCCTTGTGAG
<210> 105
<211> 25
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 105
CTGTACCAGCCTAGCATTCCCGGGC
<210> 106
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 106
GGAAGATGACCTGTGTGTAGGCCCCTC
<210> 107
<211> 24
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 107
CTGAAGCGCCGTCTCCTGCATGTC
<210> 108
<211> 25
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 108
CCCTCATGCGGACCTCCAGTCTCCA
<210> 109
<211> 25
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 109
GGTCTCCCCACTGCAGCCTCTCGTT
<210> 110
<211> 25
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 110
AGCCCCTGATGAAGTTGGAAGGCTC
<210> 111
<211> 20
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 111
CACCCCGGCCGTCCCAGAGC
<210> 112
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 112
CCGTGTAGCCCATTTCAGAGGAGCTCA
<210> 113
<211> 26
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 113
CACGCCCATTTGTGATCTCCCGCTCG
<210> 114
<211> 26
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 114
TGACCCAGAGCCCCACCTGCTAAGTG
<210> 115
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 115
CCCCATCCCATTCATCACCCGTATGCC
<210> 116
<211> 25
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 116
CTGCTCTGGTCTCCCGTCTCCCCAG
<210> 117
<211> 30
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 117
ACCCCCATCTCTTCTAGATCAAAGATCCAG
<210> 118
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 118
AAACAAACATGTGTCGCCCTGCCCATC
<210> 119
<211> 25
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 119
GTGTGGCCCCTTGGGTGTGAGCAAG
<210> 120
<211> 20
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 120
GCACCTGCGCTCCCCAGCTC
<210> 121
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 121
AGAGCTGCTTCCCTTCCAGATGTGGTC
<210> 122
<211> 23
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 122
AGGTGGAAGCCCAGGCCCCAGTA
<210> 123
<211> 20
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 123
CCCCAAGGCTCCCTCCTCCC
<210> 124
<211> 21
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 124
CAGCCCCTTGCCTCCCCTGCC
<210> 125
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 125
CGGAGGGACTTCACGTTCAACAAGGAT
<210> 126
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 126
ACCCTCAGAAAACATCCTCGGCGACCA
<210> 127
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 127
ACGCATGATGTCATCCCCAGCCTCATC
<210> 128
<211> 26
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 128
CCTCTGCTTTCTAACCCCCGTCCCCT
<210> 129
<211> 25
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 129
CTGCCTTCCCCGACTTCACCAACCC
<210> 130
<211> 21
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 130
GCAGCCGTCCTCAGAGCCCCT
<210> 131
<211> 22
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 131
GTTCCCGGGTAACGCCAGCCCC
<210> 132
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 132
GGCCGTAGAGGTTGTGCAGGTTGTAGT
<210> 133
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 133
CCATGATTTCCTGCTGGTTCCCCGAGA
<210> 134
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 134
CACTGTTCCTGGGTGATGGCCTTGTCA
<210> 135
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 135
CACCTCCCTGATGCCATCATGAGTCCC
<210> 136
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 136
GAGACAGGGACACCGTTGGAGAGGACC
<210> 137
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 137
GCACGGCCCAGAATCCTCAAAGCAACA
<210> 138
<211> 25
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 138
CTCCCCCACCATCTCCCTGTGCCTC
<210> 139
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 139
CAGACAAAGTCGGCCTGCTCATCTCCC
<210> 140
<211> 29
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 140
TGTGCATTCGTCTTTTCCAGAGCAAACCG
<210> 141
<211> 31
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 141
ACTCTTTATCTCCCCCTTGATGAACTTCCTC
<210> 142
<211> 31
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 142
CCGTCCTCTTCATTTTTCGCATTATGATCCT
<210> 143
<211> 29
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 143
AGGATGCAAATTCCAGACACTGCAATCAT
<210> 144
<211> 30
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 144
ATCGAGGAGATCAAAACCCAGAAGGTCCGC
<210> 145
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 145
TTCCCCACCACCAAGACCTACTTCCCG
<210> 146
<211> 22
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 146
CGCGTGATCCTCTGCCCTGCGA
<210> 147
<211> 22
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 147
CACCTCCCCGCCGAGTTCACCC
<210> 148
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 148
ATTCCGGGATAGAGAGAACCCAGGCAC
<210> 149
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 149
TGTCTCCTGCCGACAAGACCAACGTCA
<210> 150
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 150
GTGGCTCAGGTCGAAGTGCGGGAAGTA
<210> 151
<211> 31
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 151
AGAAAAGAAGGGGAAAGAAAACATCAAGCGT
<210> 152
<211> 26
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 152
CACCCTTAGGCTGCTGGTGGTCTACC
<210> 153
<211> 28
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 153
TCCCCCAGTTTAGTAGTTGGACTTAGGG
<210> 154
<211> 31
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 154
CCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCATGTTCA
<210> 155
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 155
AAAGGACTCAAAGAACCTCTGGGTCCA
<210> 156
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 156
TGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCT
<210> 157
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 157
ACTTCATCCACGTTCACCTTGCCCCAC
<210> 158
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 158
AAGCCAGTGCCAGAAGAGCCAAGGACA
<210> 159
<211> 33
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 159
AGTGTATTTTCCCAAGGTTTGAACTAGCTCTTC
<210> 160
<211> 28
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 160
ACTAAGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATT
<210> 161
<211> 30
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 161
TGGACTCAGAATAATCCAGCCTTATCCCAA
<210> 162
<211> 35
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 162
GCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCAC
<210> 163
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 163
CTTCGATTACTGAGAAACCGAGTGGCC
<210> 164
<211> 30
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 164
CTTAAGACTACCTTTCTCCAAATGGTGCCC
<210> 165
<211> 35
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 165
TGAAGACAGTGTGGAGTTACTTATGTTGCAAAATT
<210> 166
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 166
TGACTGTCTCCTCACCCTCCCCATTCT
<210> 167
<211> 29
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 167
CCAGCCAGCAATGAACCCAAACCTCATTC
<210> 168
<211> 28
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 168
TCTGACTCAGTGGTGATGAGCTTTGAGT
<210> 169
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 169
TCTCTGGAGGCCCAAATTCCCCTAACT
<210> 170
<211> 29
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 170
CCACGCAAGAGACACCCTTTGTAACTCTC
<210> 171
<211> 28
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 171
CCCCACACACACATACACGCATGCACAT
<210> 172
<211> 28
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 172
ACCAGACCTCTTCCTATGAAGCCTTGAA
<210> 173
<211> 25
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 173
GCTAGTGGCTCACCTTTGTCACCAC
<210> 174
<211> 29
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 174
TGGCCTATGGGATGCAGCAGGGAATACTG
<210> 175
<211> 34
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 175
ATTGAATGACTTAACTAAGGTCACACAGTTGGTT
<210> 176
<211> 34
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 176
TGTAGGAAACAAGCTATATTGAAGACAACTGCAA
<210> 177
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 177
TATAGCACTCCACCATCCACCCAGGGA
<210> 178
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 178
ACACACTCAGGGTCTATGTGGGCTGTT
<210> 179
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 179
TCACTGGAGAATGAGTTCCCAGGTTGC
<210> 180
<211> 29
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 180
AGTGTGCTCTCAGATTGACTTTCCATTCC
<210> 181
<211> 28
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 181
CCCAGCCCTCGTGTAAATAGGAACACAA
<210> 182
<211> 28
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 182
TGTACTCAGGACGTTGCCTTCTCTGTGT
<210> 183
<211> 28
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 183
CCTGATGTGGACTTACTCTGCAGGAACT
<210> 184
<211> 26
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 184
CCCCTGCCCTGCTTGAGACACCTATT
<210> 185
<211> 26
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 185
CCTCTCCTCTGCCTCAATCCTCCCCC
<210> 186
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 186
AAAACATGGGGCACAGTGTTCAAGACT
<210> 187
<211> 29
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 187
TCATAGAACTGTACCTGGTTTCCGCTCTT
<210> 188
<211> 29
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 188
TGCCCATTCCTCATGTAGAAAGACTGAGT
<210> 189
<211> 34
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 189
GATGACCCCAAAAGATTTACCATTATGCTCTTGA
<210> 190
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 190
ATTGGAATCCTTTGCAGTGCCCTCCAG
<210> 191
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 191
ACTAGCTGCAGTTCCTGTCGGATATGG
<210> 192
<211> 29
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 192
ACACTGAAATCCCATTTCCCTGACAACAT
<210> 193
<211> 33
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 193
ACACAAAATCCCAGTCCCTATTCCTATAGAAGT
<210> 194
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 194
TAAGAGGAACACCACACTCACCCCCTT
<210> 195
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 195
AGGAATTCATTGCCTTTGGGATCAGCA
<210> 196
<211> 28
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 196
TGAAAGGCAAATTGTCCTGCTAAGCTCG
<210> 197
<211> 28
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 197
GGAGTAGGGTAGCCTGGGAGTAGACAGA
<210> 198
<211> 33
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 198
TCCTCAGCGCTTTCAGCCTCTTATTATATACTC
<210> 199
<211> 32
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 199
TGCTGTTTCAACAAATAATGCTTTTGAGCCTG
<210> 200
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 200
TGATCTCACTCCAACAACGTCCAGGAA
<210> 201
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 201
GGCAGATCCTTTGGTTGGTGGCTTCAC
<210> 202
<211> 29
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 202
CGCCTGGCCCAGACTCAGAGAATGAATAC
<210> 203
<211> 31
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 203
GGGCAACATAGCAAGACCTCGTCTTTGTTTA
<210> 204
<211> 28
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 204
AGCCAGTATGATAGCCACTCATGTACCA
<210> 205
<211> 28
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 205
TGTCTCCAGATAATTCCCCCACCACCTC
<210> 206
<211> 35
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 206
AATGCAAGAGTAATTTAAGCCTCAGACAGTTGTAT
<210> 207
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 207
GGGCGATAACCACTCGTAGAAAGCGTG
<210> 208
<211> 23
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 208
CTGCGACCTCACCTGGCCTGTGC
<210> 209
<211> 31
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 209
GCCACTGCAAGAAAACCTTAACTGCAGCCTA
<210> 210
<211> 33
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 210
AATGTGAGCACCTTCCTTCTTTTTGATTTTGTC
<210> 211
<211> 34
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 211
AGTTGTTTTTATTTCTTACCCTTTCCAGAGCGAT
<210> 212
<211> 35
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 212
GGCTATCAACTTCTAAAGGAGGATATCACCTGATT
<210> 213
<211> 58
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 213
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
<210> 214
<211> 22
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 214
CTACACGACGCTCTTCCGATCT
<210> 215
<211> 64
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 215
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
<210> 216
<211> 22
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 216
CAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
Claims (10)
1.一种用于检测GAA基因上变异位点的引物组，其特征在于，所述引物组具有如SEQ IDNO:97-SEQ ID NO:138所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，允许对所述引物组中的引物序列进行修饰；或连接建库测序所需的通用序列。
3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，允许对所述引物组中的引物序列的5’端连接通用序列。
4.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述通用序列包括建库引物、测序引物、标签或接头。
5.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的引物组。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括引物组2-4、引物组6-7或引物组10-11中的至少一组；其中，所述引物组2具有如SEQ ID NO:47-SEQ ID NO:60所示的核苷酸序列；所述引物组3具有如SEQ ID NO:61-SEQ ID NO:86所示的核苷酸序列；所述引物组4具有如SEQ ID NO:87-SEQ ID NO:96所示的核苷酸序列；所述引物组6具有如SEQID NO:139-SEQ ID NO:144所示的核苷酸序列；所述引物组7具有如SEQ ID NO:145-SEQ IDNO:150所示的核苷酸序列；所述引物组10具有如SEQ ID NO:191-SEQ ID NO:202所示的核苷酸序列；所述引物组11具有如SEQ ID NO:203-SEQ ID NO:212所示的核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由如SEQ ID NO:97-SEQ IDNO:138所示的核苷酸序列、引物组3和引物组4组成。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由如SEQ ID NO:97-SEQ IDNO:138所示的核苷酸序列、引物组6和引物组10组成。
9.一种核酸扩增方法，其特征在于，包括：采用权利要求1-4任一项所述的引物组或权利要求5-8任一项所述的试剂盒，对核酸样本进行扩增。
10.一种建库方法，其特征在于，包括：采用权利要求1-4任一项所述的引物组或权利要求5-8任一项所述的试剂盒，构建扩增子测序文库，用于核酸测序。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011584421.5A CN114686561B (zh) | 2020-12-28 | 2020-12-28 | 用于核酸样本扩增的组合物、试剂盒、方法及系统 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011584421.5A CN114686561B (zh) | 2020-12-28 | 2020-12-28 | 用于核酸样本扩增的组合物、试剂盒、方法及系统 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114686561A CN114686561A (zh) | 2022-07-01 |
| CN114686561B true CN114686561B (zh) | 2024-04-30 |
Family
ID=82129043
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011584421.5A Active CN114686561B (zh) | 2020-12-28 | 2020-12-28 | 用于核酸样本扩增的组合物、试剂盒、方法及系统 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114686561B (zh) |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105112541A (zh) * | 2015-09-22 | 2015-12-02 | 山东山大附属生殖医院有限公司 | 人类胚胎脊髓性肌萎缩症突变基因检测试剂盒 |
| CN105603100A (zh) * | 2016-03-03 | 2016-05-25 | 南京市妇幼保健院 | 检测f8基因突变的扩增引物、试剂盒及方法 |
| CN106434859A (zh) * | 2016-05-16 | 2017-02-22 | 苏州市立医院 | 先天性肾上腺皮质增生症基因筛查试剂盒、筛查方法及其应用 |
| CN106755496A (zh) * | 2017-01-23 | 2017-05-31 | 广州奇辉生物科技有限公司 | 基于高通量测序技术检测遗传性耳聋基因的多重pcr特异性引物、试剂盒及方法 |
| CN107058307A (zh) * | 2015-11-04 | 2017-08-18 | 深圳市瀚海基因生物科技有限公司 | 引物、试剂盒以及检测hbb基因序列的方法 |
| CN107828883A (zh) * | 2017-12-08 | 2018-03-23 | 东莞博奥木华基因科技有限公司 | 一种苯丙酮尿症的检测引物组、试剂盒及基因突变检测方法 |
| CN108796054A (zh) * | 2018-09-14 | 2018-11-13 | 华大生物科技（武汉）有限公司 | 用于同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的试剂盒及其应用 |
| CN110564838A (zh) * | 2019-08-13 | 2019-12-13 | 上海千贝医疗科技有限公司 | 用于新生儿糖原累积病基因分型的多重pcr引物系统及其用途 |
| CN111647654A (zh) * | 2020-06-11 | 2020-09-11 | 首都医科大学附属北京友谊医院 | 用于检测血色病及肝豆状核变性易感基因突变的引物组合物、试剂盒及方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011050341A1 (en) * | 2009-10-22 | 2011-04-28 | National Center For Genome Resources | Methods and systems for medical sequencing analysis |
-
2020
- 2020-12-28 CN CN202011584421.5A patent/CN114686561B/zh active Active
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105112541A (zh) * | 2015-09-22 | 2015-12-02 | 山东山大附属生殖医院有限公司 | 人类胚胎脊髓性肌萎缩症突变基因检测试剂盒 |
| CN107058307A (zh) * | 2015-11-04 | 2017-08-18 | 深圳市瀚海基因生物科技有限公司 | 引物、试剂盒以及检测hbb基因序列的方法 |
| CN105603100A (zh) * | 2016-03-03 | 2016-05-25 | 南京市妇幼保健院 | 检测f8基因突变的扩增引物、试剂盒及方法 |
| CN106434859A (zh) * | 2016-05-16 | 2017-02-22 | 苏州市立医院 | 先天性肾上腺皮质增生症基因筛查试剂盒、筛查方法及其应用 |
| CN106755496A (zh) * | 2017-01-23 | 2017-05-31 | 广州奇辉生物科技有限公司 | 基于高通量测序技术检测遗传性耳聋基因的多重pcr特异性引物、试剂盒及方法 |
| CN107828883A (zh) * | 2017-12-08 | 2018-03-23 | 东莞博奥木华基因科技有限公司 | 一种苯丙酮尿症的检测引物组、试剂盒及基因突变检测方法 |
| CN108796054A (zh) * | 2018-09-14 | 2018-11-13 | 华大生物科技（武汉）有限公司 | 用于同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的试剂盒及其应用 |
| CN110564838A (zh) * | 2019-08-13 | 2019-12-13 | 上海千贝医疗科技有限公司 | 用于新生儿糖原累积病基因分型的多重pcr引物系统及其用途 |
| CN111647654A (zh) * | 2020-06-11 | 2020-09-11 | 首都医科大学附属北京友谊医院 | 用于检测血色病及肝豆状核变性易感基因突变的引物组合物、试剂盒及方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| DNA 测序法检测血友病 B 患者 F9 基因突变;马莉，等;中国输血杂志;第26卷(第11期);第1084-1086页，摘要，第1085页左列第3段，表1 * |
| 潘銮凤，等.《分子生物技术》.复旦大学出版社,2008,第121-125页. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114686561A (zh) | 2022-07-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103088433B (zh) | 全基因组甲基化高通量测序文库的构建方法及其应用 | |
| CN106591441B (zh) | 基于全基因捕获测序的α和/或β-地中海贫血突变的检测探针、方法、芯片及应用 | |
| CN110079592B (zh) | 用于检测基因突变和已知、未知基因融合类型的高通量测序靶向捕获目标区域的探针和方法 | |
| CN105986015B (zh) | 一种基于高通量测序的多样本的一个或多个靶序列的检测方法和试剂盒 | |
| CN106554955B (zh) | 构建pkhd1基因突变的测序文库的方法和试剂盒及其用途 | |
| CN109593757B (zh) | 一种探针及其适用于高通量测序的对目标区域进行富集的方法 | |
| CN104372093A (zh) | 一种基于高通量测序的snp检测方法 | |
| CN113811618B (zh) | 基于甲基化dna目标区域构建测序文库及系统和应用 | |
| CN113088562A (zh) | 一种新型的低起始量dna甲基化建库方法 | |
| CN110628891A (zh) | 一种对胚胎进行基因异常筛查的方法 | |
| CN116515977B (zh) | 基于单端接头转座酶的单细胞基因组测序试剂盒和方法 | |
| CN109825552B (zh) | 一种用于对目标区域进行富集的引物及方法 | |
| WO2012037881A1 (zh) | 核酸标签及其应用 | |
| CN114032287B (zh) | Dna甲基化测序文库及其构建方法和检测方法 | |
| CN116144736A (zh) | 甲状腺癌相关基因高通量扩增子文库的制备方法、多重pcr引物对及应用 | |
| CN116043337A (zh) | Dna甲基化标志物筛查试剂盒及方法 | |
| CN109136217B (zh) | 一种测序文库构建的方法、建库试剂及其应用 | |
| TW201321520A (zh) | 用於病毒檢測的方法和系統 | |
| CN113462748A (zh) | Dna测序文库的制备方法及试剂盒 | |
| CN114807300A (zh) | 单引物多重扩增技术在检测片段化稀有特征核酸分子中的应用及试剂盒 | |
| CN114686561B (zh) | 用于核酸样本扩增的组合物、试剂盒、方法及系统 | |
| CN114686580B (zh) | 用于核酸样本扩增的组合物、试剂盒、方法及系统 | |
| CN114686579B (zh) | 用于核酸样本扩增的组合物、试剂盒、方法及系统 | |
| CN114686562B (zh) | 用于核酸样本扩增的组合物、试剂盒、方法及系统 | |
| WO2020073748A1 (zh) | 一种测序文库的构建方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |