CN108796054A - 用于同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的试剂盒及其应用 - Google Patents
用于同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的试剂盒及其应用。其中该试剂盒包含多个用于扩增地中海贫血基因的扩增引物组，所述扩增引物组包括针对α珠蛋白基因和β珠蛋白基因设计的引物，其中，所述扩增引物组包括针对HBA1基因、HBA2基因、HBB基因的突变型检测引物，以及针对α地贫缺失型–α3.7、–α4.2、‑‑SEA、‑‑THAI，以及β缺失型SEA‑HPFH、中国型、中国台湾型的缺失型检测引物。利用该试剂盒能够同时检测地贫缺失型与突变型，具体地能够同时检测常见的7种缺失型与超过300种突变类型，并可以发现新的突变类型，且成本低廉，相对于现有地贫检测试剂盒优势显著。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体而言，涉及一种用于同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的试剂盒及其应用。
背景技术
地中海贫血(在本文中有时简称“地贫”)是一种常见的溶血性单基因遗传病，多发于中东、中亚、非洲、东南亚和中国南方等地区。导致地贫的分子机理是：珠蛋白基因发生缺陷使其编码的肽链一种或几种合成减少或缺失，致使血红蛋白的组成成分比例失衡，进而导致血红蛋白不稳定。
根据缺陷的珠蛋白基因种类不同，地贫主要分为α地贫和β地贫。α地贫是由于α珠蛋白基因的缺失或者突变导致α珠蛋白肽链合成受到抑制而引起的溶血性贫血疾病。α珠蛋白基因簇位于16p13.3，每条染色体各有2个α珠蛋白基因，一对染色体共有4个α珠蛋白基因。α珠蛋白基因的缺失或突变是产生α地贫的最常见原因，α地贫主要包括缺失型和非缺失型。β地贫是由于β珠蛋白基因突变导致β珠蛋白肽链缺陷或合成不足而引起的遗传性溶血性贫血疾病。β珠蛋白基因位于β珠蛋白基因簇，该基因簇定位于染色体11p15，β地贫的分子病理具有高度异质性，主要为β珠蛋白基因点突变、小的缺失或插入。
地贫患者长期贫血会导致脏器功能减退、导致心功能衰竭、肝脾肿大等，影响患者的生长发育，目前国内外尚无有效的治疗方法，只能通过定期输血等方法维持生命，给患者自身及家庭和社会带来沉重的负担。因而，控制地贫，预防是关键，通过对地贫高发人群的地贫筛查和婚育指导可有效降低重型地贫的发生率。目前地贫有多种筛查方法，但基因检测是诊断地贫的金标准，基因检测能够大大提高地贫检测的准确性，减少地贫的漏检率，这对地贫的诊治和预防有重要意义。
然而，据珠蛋白数据库统计，全球已发现地贫类型超过400种，我国常规检测23-27种的地贫检测技术存在约2％-5％的漏检。因而，目前用于地贫基因检测的方法和试剂盒仍有待改进。
发明内容
首先，需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现和工作而完成的：
发明人针对目前的地贫基因检测方法和试剂盒进行了一系列的理论研究和实验探索，结果发现：
目前地贫分子诊断的方法有很多，利用高通量测序技术检测地贫突变型的方法亦有报道。这些地贫常用基因检测方法及其优缺点如下表所示：
目前市售的地贫检测试剂盒主要有下列3种：
(1)中山大学达安基因股份有限公司的“地中海贫血(α/β型)基因检测试剂盒(PCR-流式荧光杂交法)”，用于定性检测全血样本中的α-珠蛋白基因3种缺失(--SEA、-α3.7和-α4.2)、3种突变(WS122、QS125和CS142)及β-珠蛋白基因17种突变(CD41-42、IVS-2-654、CD17、-28、CD26、CD71-72、CD43、 -29、Int、CD14-15、CD27-28、-32、-30、IVS-1-1、IVS-1-5、CD31和Cap)；
(2)亚能生物技术(深圳)有限公司的“地中海贫血基因检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)”，用于体外定性检测人全血基因组DNA样本，能够检出中国人常见的3种缺失型α-地中海贫血基因突变 (--SEA、-α3.7和-α4.2)、3种非缺失型α-地中海贫血基因突变(αConstant Springα(αCSα)、α Quong Szeα(αQSα)和αWestmeadα(αWSα))和17种β-地中海贫血基因突变(41-42M、654M、-28M、 71-72M、17M、βEM、IVS-I-1M、IVS-I-5M、27/28M、43M、-29M、-30M、31M、-32M、14-15M、IntM 和CAPM)；
(3)深圳益生堂生物企业有限公司的“β地中海贫血基因检测试剂盒(PCR探针法)”与“α-地中海贫血基因检测试剂盒(Gap-PCR法)”、“非缺失型α地中海贫血基因检测试剂盒(PCR探针法)”，分别用于定性检测人基因组DNA中的17种β珠蛋白基因突变和定性检测抗凝外周血样本中的东南亚型缺失 (--SEA/)、左侧缺失(-α4.2/)、右侧缺失(-α3.7/)和泰国型缺失(--THAI/)4种α-地中海贫血基因缺失型，以及常见的3种α-地中海贫血基因突变型(CS、QS、WS)。
综上，发明人发现：各种地贫基因检测方法均有不同程度的缺点，例如，Gap-PCR方法只能检测缺失型；各种突变型的检测方法中，PCR-ARMS可检测突变的种类少，PCR-ASO、PCR-RDB和Realtime PCR 方法虽然检测成本低，能够快速检测多种突变类型，但仅能针对常见热点突变进行检测(例如检测国内 15-20种突变类型)，无法检测其他罕见突变型及新突变，存在一定的漏检率。而PCR-sequencing方法不仅可以检测多种突变类型，还可以发现新的突变类型，在检测结果方面不失为最优选择，但也同样存在成本高的缺点。而上述现阶段的市售各试剂盒可检测的突变类型少，针对β缺失型突变的检测能力不足，且无法检测罕见的异常血红蛋白突变与各种新发突变。
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。
为此，本发明的一个目的在于提供一种检测范围除涵盖上述所有试剂盒的检测类型外，在突变型检测方面还可检测出较为罕见的异常血红蛋白突变与各种新发突变，在缺失型检测方面还可检测出β缺失型的试剂盒，即同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的试剂盒，以及相应的检测方法。
进而，在本发明的第一方面，本发明提供了一种用于同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包含多个用于扩增地中海贫血基因的扩增引物组，其中所述多个包括1个的情形，所述扩增引物组包括针对α珠蛋白基因和β珠蛋白基因设计的引物，其中，所述扩增引物组包括针对HBA1基因、HBA2基因、HBB基因的突变型检测引物，以及针对α地贫缺失型–α 3.7、–α4.2、--SEA、--THAI，以及β缺失型SEA-HPFH、中国型、中国台湾型的缺失型检测引物。
根据本发明的实施例，利用本发明的试剂盒能够有效地扩增地中海贫血基因相关片段，进而结合建库和高通量测序技术后，即可有效检测地中海贫血基因，并且能够同时检测地贫缺失型与突变型。具体地，本发明的试剂盒能够同时检测常见的7种缺失型与超过300种突变类型，并可以发现新的突变类型，且成本低廉，相对于突变类型检测范围小、缺失型检测能力缺乏的现有地贫检测试剂盒，优势显著。
其中，需要说明的是，所述扩增引物组是发明人通过一系列精巧构思和科学的实验设计、探索筛选而最终获得的。由于地贫基因突变情况复杂，既有大片段的基因缺失和重复，又有序列相似程度很高的假基因和同源基因；同时要兼顾第二代测序技术读长较短的因素，这给引物设计造成了极大的困难。进而，发明人针对α珠蛋白基因和β珠蛋白基因分别设计PCR引物。首先，设计突变型的引物：对HBA1、 HBA2、HBB基因(分别为两个α珠蛋白基因和一个β珠蛋白基因)序列进行生物信息学分析，并将HBA 基因序列相似度很高的假基因ψα1，ψα2以及β珠蛋白基因簇中的其他基因列入生物信息学分析范围，找出HBA1、HBA2、HBB基因的保守和特异序列，然后设计引物；将设计得到的引物序列进行全基因组比对(blast)分析，除精确比对到目标HBA1、HBA2、HBB基因外，在基因组的其它位置无精确比对的引物做为候选引物，然后再挑选扩增片段小于1Kb的引物对作为初级候选引物对；将初级候选引物对做PCR 实验筛选，挑选PCR反应成功并无明显非特异扩增的引物作为次级候选引物对；用已知突变型的样本作为测试样本，用筛选出来的次级候选引物对做PCR扩增，PCR产物做sanger测序，测序结果与参考基因序列做比对，序列一致并且测序峰图质量较好的，作为最终确定的引物对，并且，由于HBA1、HBA2、 HBB基因经扩增后测序片段较长，为了保证产出数据满足信息分析需要，发明人在HBA1和HBA2的PCR 扩增片段中间各增加一条引物，即各两对(三条)引物，针对HBB则采用两对(四条)引物。接着，设计缺失型的引物：发明人基于跨越断裂点PCR(GAP-PCR)的原理，针对常见的α地贫缺失型–α3.7、–α4.2、--SEA、--THAI，以及β缺失型SEA-HPFH、中国型、中国台湾型，共计7种缺失型分别设计引物；并且设计了可扩增HBA2基因片段(–α3.7、–α4.2、--SEA、--THAI这4种型别共同缺失的基因片段) 的一对引物，用于质控PCR反应成功与否，并辅助判断各种α地贫缺失型是杂合缺失还是纯合缺失，以及用于扩增HBA1和HBA2两个基因中基因序列相同的一段，以便辅助判断各种α地贫缺失型是杂合缺失还是纯合缺失，并可提示是否出现其他罕见的HBA基因拷贝数变异的情况的一对引物。由此，发明人成功获得了前面所述的用于扩增地中海贫血基因的扩增引物组，进而得到了本发明的用于同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的试剂盒。
具体地，根据本发明的一些实施例，所述扩增引物组的引物序列如SEQ ID NO：1-27所示。其中，根据本发明的一些具体示例，突变型的引物序列如下表所示：
缺失型的引物序列如下所示：
其中，3.7-F和α2-R即为上述的可扩增HBA2基因片段(–α3.7、–α4.2、--SEA、--THAI这4种型别共同缺失的基因片段)，在本发明中用于质控PCR反应成功与否，并辅助判断各种α地贫缺失型是杂合缺失还是纯合缺失的一对引物。HBA-F和HBA-R即是扩增HBA1和HBA2两个基因中基因序列相同的一段，用于辅助判断各种α地贫缺失型是杂合缺失还是纯合缺失，并可提示是否出现其他罕见的HBA 基因拷贝数变异的情况的一对引物。
由此，SEQ ID NO：1-27所示的27条引物组成的扩增引物组，即可有效地扩增获得中海贫血基因相关片段，进而用于建库和测序后能够有效实现同时检测地中海贫血基因的7种缺失型与超过300种突变类型，并可以发现新的突变类型。并且，检测结果准确可靠，可重复性好。
进一步，由于SEQ ID NO：1-27所示的27条引物组成的扩增引物组，是15对引物，用于扩增后会产出15种不同的产物DNA片段，如果不做多重PCR，需要15个PCR反应。并且这些引物的扩增区域有重叠，如果全部混合到一起，会有交叉反应，干扰检测。因而，针对SEQ IDNO：1-27所示的27条引物，发明人又进行了一系列的多重PCR反应应用的筛选研究：(1)基于上述27条引物序列，挑选混合后无错配的引物对作为候选多重组合；(2)将候选多重组合的引物对1:1组合，用已知地贫类型的样本，做PCR扩增试验，然后将无明显非特异条带的作为最终多重引物组合；(3)将确定的最终多重引物组合继续做PCR扩增试验，测试不同的引物投入量，挑选PCR反应成功、无明显非特异条带、并且同一个 PCR反应中所有目的条带的亮度基本均一的引物浓度作为最终的引物投入量。由此，发明人成功确定了 SEQ ID NO：1-27所示的27条引物的多重PCR反应应用的引物组合，从而将27条引物分为5个引物组，并确定了针对每个样本的引物投入量，即各引物的重量份数。
因而，根据本发明的一些具体示例，在所述试剂盒中，SEQ ID NO：1-27所示的引物被分为如下所示的5个引物组：
，其中，5个引物组分开放置，而针对每个引物组，其引物混合放置。由此，利用本发明的试剂盒，针对一个待测样本，无需进行15个PCR反应，而是将待测样本的5等份DNA模板，分别利用引物组1-5 进行PCR反应，从而每个样本仅需进行5个PCR反应(这5个PCR反应相对独立，即相互不关联，可平行完成)，5个PCR反应完成后，将产物混合即得该待测样本的PCR扩增产物，用于后续的建库测序，从而实现地贫检测。
根据本发明的另一些实施例，每个扩增引物组中各引物的重量份数如下表所示：
上表显示了一个扩增引物组的5个引物组对应的各引物的重量份数。本领域技术人员可以理解，每个扩增引物组具有5个引物组，每个引物组中各引物的重量份数如上表所示。根据本发明的实施例，引物的重量单位为ng，则以引物组1为例，其引物SEQ ID NO：1-3，重量均为50ng。
由此，可以使每个扩增引物组的各引物组的含量均适于扩增待测样本的一份DNA模板，应用方便。
此外，根据本发明的实施例，发明人进一步利用本发明的扩增引物组，结合使用引物标签(primer index)标记的DNA分子标签技术，将多样本PCR产物分别以不同的primerindex标记，从而在后续文库构建实验环节将多个样本混合(pooling)成一个文库；同时结合第二代测序技术的文库标签(adaptor index)技术，即使得一次上机测序可检测数千份样本。最终，每个样本的检测结果通过双index找回，从而达到检测通量大幅提高的目的，同时实验操作相对较简单。因而，根据本发明的实施例，本发明的扩增引物组中各引物还可以进一步携带引物标签。
具体地，根据本发明的一些实施例，在所述试剂盒中，所述扩增引物组的每条引物的5’端均添加有引物标签序列，且在每个扩增引物组内，引物组1、引物组3、引物组4和引物组5的引物标签序列相同，并与引物组2的引物标签序列不同，而所述多个扩增引物组之间的所有引物标签序列相互不同。由此，在扩增完成，进而进行建库和测序后，能够有效地基于测序读段中的引物标签序列对样本进行区分。
根据本发明的一些具体示例，所述引物标签序列的长度为5-10bp，优选7bp。由此，不影响扩增、建库和测序，检测效果好。
根据本发明的一些实施例，针对每个扩增引物组，引物组1、引物组3、引物组4和引物组5携带相同的引物标签序列，且所述引物标签序列为选自下列的任意之一：
根据本发明的另一些实施例，针对每个扩增引物组，引物组2的引物标签序列为选自下列的任意之一：
换言之，根据本发明的实施例，在所述试剂盒中，可以采用如上所述的所述引物标签序列。从而，本发明的试剂盒可以具有96个扩增引物组，整个试剂盒共采用192种引物标签(针对每个扩增引物组，引物组1、引物组3、引物组4和引物组5均采用一种引物标签序列，而引物组2采用另一种标签，则基于192种标签序列，可以获得96个扩增引物组)。由此，能够同时实现对96个样本的地贫基因相关片段的扩增，以及突变型与缺失型的检测，且检测效果准确可靠。此外，本领域技术人员可以理解，本发明的试剂盒中的扩增引物组的数量不受限制，采用的引物标签序列数量更多时，则携带不同引物标签的扩增引物组的数量就更多，本发明的试剂盒就能够同时对更多的待测样本进行扩增和地贫检测。
进一步，发明人对本发明的试剂盒的应用方法也进行研究和探索，由此确定了其应用检测方法。
进而，在本发明的第二方面，本发明提供了一种用于同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的测序文库的构建方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：利用前面所述的试剂盒中的多个扩增引物组，分别对多个待测样本进行PCR扩增，以便获得多个待测样本的PCR产物，其中，各扩增引物组的每条引物的5’端均添加有引物标签序列，且在每个扩增引物组内，引物组1、引物组3、引物组4和引物组5的引物标签序列相同，并与引物组2的引物标签序列不同，而各扩增引物组之间的所有引物标签序列相互不同，以便使所述多个待测样本的PCR产物的引物标签序列相互不同；以及将所述多个待测样本的PCR产物混合，以便获得所述用于同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的测序文库。由此，对获得的测序文库进行高通量测序，即可有效实现同时对多个待测样本进行地贫检测，且能够同时常见的7 种缺失型与超过300种突变类型，并可以发现新的突变类型，且需时少、效率高、成本低廉，而检测结果准确可靠。
根据本发明的实施例，将所述多个待测样本的PCR产物混合后进一步包括：混合PCR产物打断、末端修复、加“A”、接头连接、片段筛选的步骤。由此，有利于后续测序的进行。并且，在实际建库过程中，本领域技术人员还可以根据实际需要增加其他常规的建库步骤，以及根据对应的测序平台和测序仪选择其他相应的建库步骤，例如当采用MGISEQ2000进行测序时，需要增加单链环化的步骤。
根据本发明的一些实施例，在所述多个待测样本的PCR产物混合之后，以及混合PCR产物打断、末端修复、加“A”、接头连接和片段筛选的至少一个步骤之后进一步包括对产物进行纯化的步骤。由此，后续对测序文库的测序效果好，分析结果准确可靠。
根据本发明的实施例，所述接头为标签接头。根据本发明的一些具体示例，针对多个测序文库使每个测序文库的标签接头的标签序列相互不同，以便将分别携带不同文库标签的多个测序文库混合形成能够同时上机测序的混合测序文库。由此，对混合测序文库进行一次上机测序后，基于文库标签的序列即可有效区分不同的测序文库的测序结果，进而基于前述的引物标签序列能够有效区分同一个测序文库内的不同待测样本的测序结果，从而最终实现对各个待测样本的检测分析。
根据本发明的实施例，所述片段筛选步骤回收的DNA片段长度为180bp-600bp。由此，建库效果好，有利于后续测序分析步骤的进行。
根据本发明的实施例，针对每个待测样本，所述PCR扩增包括5个PCR反应，各PCR反应采用引物组和引物序列如下表所示：
| PCR反应 | 引物组 | 引物序列 |
| PCR反应1 | 引物组1 | SEQ ID NO：1-3 |
| PCR反应2 | 引物组2 | SEQ ID NO：4-6 |
| PCR反应3 | 引物组3 | SEQ ID NO：7-10 |
| PCR反应4 | 引物组4 | SEQ ID NO：11-15 |
| PCR反应5 | 引物组5 | SEQ ID NO：16-27 |
，其中，5个PCR反应分别独立进行，每个待测样本的PCR产物均由5个PCR反应的产物组成。根据本发明的一些具体示例，这5个PCR反应平行完成，由此可以节省时间，提高检测效率。根据本发明的一些实施例，针对每个待测样本，采用5等份DNA模板，分别进行5个PCR反应。
根据本发明的一些具体示例，针对每个待测样本，5个PCR反应的引物的重量份数如下表所示：
根据本发明的一些实施例，引物的重量单位为ng，则以引物组1为例，其引物SEQID NO：1-3，重量均为50ng。
根据本发明的实施例，针对每个待测样本，5个PCR反应的反应体系均为：无核酸酶水5.37μL，2×GC buffer I 12.5μL，dNTP(2.5mmol/L)3μL，TaKaRaTaq HS 0.13μL，相应引物组的引物混合物2μL， DNA模板2μL。由此，PCR扩增效果好，有利于后续的建库测序分析，最终地贫检测结果准确、可靠。
根据本发明的一些具体示例，针对每个待测样本，5个PCR反应的反应程序分别为：
PCR反应1：95℃10min；95℃30s→63℃30S→72℃50S，36个循环→72℃5min；15摄氏度，保存，
PCR反应2：95℃10min；95℃30s→63℃30S→72℃50S，36个循环→72℃5min；15摄氏度，保存，
PCR反应3：95℃10min；95℃30s→58℃30S→72℃50S，36个循环→72℃5min；15摄氏度，保存，
PCR反应4：95℃10min；95℃30s→61℃30S→72℃2min15S，36个循环→72℃5min；15摄氏度，保存，
PCR反应5：95℃10min；95℃30s→60℃30S→72℃30S，32个循环→72℃5min；15摄氏度，保存。
由此，PCR扩增效果好，有利于进行后续的建库测序分析，从而使地贫检测结果准确、可靠。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种用于同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的测序文库。根据本发明的实施例，该测序文库是通过前面所述用于同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的测序文库的构建方法构建获得的。由此，利用本发明的测序文库，基于高通量测序，即可实现同时对多个待测样本的地贫检测，并且能够同时检测地中海贫血基因的7种缺失型与超过300种突变类型，还可以发现新的突变类型。并且，检测结果准确可靠，可重复性好。
此外，本发明还提供了前面所述的同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的试剂盒以及基于该试剂盒构建的测序文库的应用方法。具体地，在本发明的第四方面，本发明还提供了一种同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的方法。根据本发明的实施例，所述方法为将前面所述的用于同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的测序文库进行测序和分析。由此，能够同时实现对多个待测样本的地贫检测，并且能够同时检测地中海贫血基因的7种缺失型与超过300种突变类型，还可以发现新的突变类型。并且，检测结果准确可靠，可重复性好。
根据本发明的实施例，利用MGISEQ2000进行所述测序。
根据本发明的实施例，所述分析包括：利用测序结果中携带的文库标签区分各个测序文库，进而利用引物标签区分同一个测序文库内的各个待测样本，然后利用引物序列将每个待测样本的读段比对至各个突变型和缺失型基因位点。由此，能够有效将测序结果进行区分和详细的信息分析，从而实现对多个测序文库、多个待测样本的多个突变型和缺失型基因位点的检测。
根据本发明的一些具体示例，样本测序完成后，首先根据adaptor index和primerindex序列将测序数据分配到每个样本，然后根据引物序列将已分配到样本的测序数据继续分配到该样本的每个扩增子，进而按照以下方法进行信息分析：
(1)缺失型信息分析方法
将已分配至每个样本的每个扩增子的测序数据用特异性的固定识别序列进行搜索，与固定识别序列完全匹配的测序数据量做一个统计，统计数值大于最低检出限的判定为该缺失型阳性检出，否则判定为阴性。
(2)突变型信息分析方法
将已分配至每个样本的每个扩增子的测序数据用BWA软件比对到参考序列中，然后用samtools找出其中的SNP和小indel组成，根据质量值对找出的SNP和小indel进行过滤，将过滤后的SNP和小indel 比对到地贫突变数据库中，得到地贫突变型分析的最终结果输出。
由此，分析结果准确可靠。
在本发明的第五方面，本发明还提供了前面所述的用于同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的试剂盒或者测序文库在同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型中的用途。如前所述，利用本发明的试剂盒或者基于该试剂盒构建的测序文库，能够同时实现对多个待测样本的地贫检测，并且能够同时检测地中海贫血基因的7种缺失型与超过300种突变类型，还可以发现新的突变类型。并且，检测结果准确可靠，可重复性好。
需要说明的是，本发明所述的引物标签、文库标签，其标签序列本领域技术人员可以根据需要进行调整，并不局限于本发明的实施例提供的具体标签序列，只要能够对样本、测序文库进行区分即可。
此外，还需要强调的是，本发明的试剂盒及其应用相对于现有技术至少具有以下有益效果的至少之一：
(1)本发明的试剂盒检测范围除涵盖上述所有试剂盒的检测类型外，在突变型检测方面还可检测出较为罕见的异常血红蛋白突变与各种新发突变，在缺失型检测方面还可检测出β缺失型。具体地，本发明的同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的试剂盒，能够有效地扩增地中海贫血基因相关片段，进而结合建库和高通量测序技术后，即可有效检测地中海贫血基因，并且能够同时检测地贫缺失型与突变型。本发明的同时检测常见的7种缺失型与超过300种突变类型，并可以发现新的突变类型；
(2)本发明的同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的方法，基于上述的同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的试剂盒，结合高通量测序技术，一方面：以便同时检测常见的7种缺失型与超过300 种突变类型，并可以发现新的突变类型；另一方面，保留了测序技术的优势高通量测序技术高通量和成本低廉的优势又弥补了传统PCR-sequencing方法成本高的缺点。
(3)相对于现有的地贫检测试剂盒，本发明的突变类型检测范围广、可检测出β缺失型，且成本低廉，优势显著。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是实施例1中所述的利用标签引物扩增获得的PCR产物的结构示意图；
图2是实施例1中所述的添加了adaptor index的文库片段的结构示意图；
图3是根据本发明实施例的方法中结果分析的测序数据分类流程示意图；以及
图4是实施例2中得到的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
发明人针对地贫的α珠蛋白基因和β珠蛋白基因分别设计PCR引物，进而对获得PCR引物进行了多重PCR组合筛选，并设计了配套的引物标签序列。具体如下：
1、引物设计
(1)突变型引物设计
首先，对HBA1、HBA2、HBB基因(分别为两个α珠蛋白基因和一个β珠蛋白基因)序列进行生物信息学分析，并将HBA基因序列相似度很高的假基因ψα1，ψα2以及β珠蛋白基因簇中的其他基因列入生物信息学分析范围，找出HBA1、HBA2、HBB基因的保守和特异序列，然后设计引物。将设计得到的引物序列进行全基因组比对(blast)分析，除精确比对到目标HBA1,HBA2,HBB基因外，在基因组的其它位置无精确比对的引物做为候选引物，然后再挑选扩增片段小于1Kb的引物对作为初级候选引物对。
接着，将初级候选引物对做PCR实验筛选，挑选PCR反应成功并无明显非特异扩增的引物作为次级候选引物对。
接下来，用已知突变型的样本作为测试样本(本发明中所用的已知突变型样本来源于郴州市人民医院)，用筛选出来的次级候选引物对做PCR扩增，PCR产物做sanger测序，测序结果与参考基因序列做比对，序列一致并且测序峰图质量较好的，作为最终确定的引物对。
然后，确定的引物对PCR扩增片段长度分别为HBA1(923bp)，HBA2(916bp)，HBB(由于需测序片段较长,用两对引物分别扩增，PCR扩增片段长度分别为766bp和599bp)。为了保证产出数据满足信息分析需要，在HBA1和HBA2的PCR扩增片段中间各增加一条引物，使得PCR扩增片段长度变为HBA1 (923bp与690bp)，HBA2(916bp与690bp)。
最后确定的引物为：HBA1和HBA2各两对(三条)引物，HBB基因两对(四条)引物。HBA1、 HBA2、HBB基因对应的引物列表如下：
表1.突变型检测的引物序列
(2)缺失型引物设计
基于跨越断裂点PCR(GAP-PCR)的原理，针对常见的α地贫缺失型–α3.7、–α4.2、--SEA、--THAI，以及β缺失型SEA-HPFH、中国型、中国台湾型，共计7种缺失型设计如下引物：
表2.缺失型检测的引物序列
如表2中所示，3.7-F和3.7-R是扩增–α3.7基因片段的正反向引物，4.2-F和4.2-R是扩增–α4.2 基因片段的正反向引物，SEA-F和SEA-R是扩增—SEA基因片段的正反向引物，THAI-F和THAI-R是扩增—THAI基因片段的正反向引物，SEAB-F和SEAB-R是扩增SEA-HPFH基因片段的正反向引物， CHB-F和CHB-R是扩增中国型基因片段的正反向引物，TaiwanF1和TaiwanR1是扩增中国台湾型基因片段的正反向引物。3.7-F和α2-R作为一对引物可扩增HBA2基因片段(–α3.7、–α4.2、--SEA、--THAI这 4种型别共同缺失的基因片段)，在本发明中用于质控PCR反应成功与否，并辅助判断各种α地贫缺失型是杂合缺失还是纯合缺失。HBA-F和HBA-R是扩增HBA1和HBA2两个基因中基因序列相同的一段，用于辅助判断各种α地贫缺失型是杂合缺失还是纯合缺失，并可提示是否出现其他罕见的HBA基因拷贝数变异的情况。
2、多重PCR组合筛选
如上表1和表2所示，获得的引物共计27条，是15对引物，如果不做多重PCR，需要进行15个 PCR反应。并且这些引物的扩增区域有重叠，如果全部混合到一起，会有交叉反应，干扰检测。因而，针对SEQ ID NO：1-27所示的27条引物，发明人又进行了多重PCR反应应用的筛选研究。
多重PCR组合的筛选流程：
(1)根据表1和表2中的27条引物序列，挑选混合后无错配的引物对作为候选多重组合。
(2)将候选多重组合引物对1:1组合，用已知地贫类型的样本，做PCR扩增试验，无明显非特异条带的作为最终多重引物组合。
(3)将确定的最终多重引物组合继续做PCR扩增试验，测试不同的引物投入量，挑选PCR反应成功、无明显非特异条带、并且同一个PCR反应中所有目的条带的亮度基本均一的引物浓度作为最终的引物投入量。
由此，得到的多重PCR的引物组合与引物投入量如下表所示：
表3多重PCR反应的引物组合与引物配比
3、引物标签设计
为同时对多个待测样本进行扩增、检测，发明人根据表1和表2中设计好的27条引物序列，结合引物标签设计原理设计并筛选了一系列长度为7bp的引物标签。其中，针对每一个待测样本，由于PCR反应2中部分引物序列与PCR反应1中引物序列相同，为示区别，发明人对PCR反应2与PCR反应1、3、 4、5使用不同的引物标签序列。由此，发明人针对PCR反应1、3、4、5设计了引物标签序列T01-T96，针对PCR反应2设计了引物标签序列S01-S96，具体见下表4。
表4引物标签序列
4、96个扩增引物组及试剂盒的获得
根据上述步骤3的设计要求，将表4所示的不同引物标签序列与表1和表2中的引物序列的5’端相连接，构成标签引物，以便得到96套标签引物，也即96个携带引物标签序列的扩增引物组(每套标签引物中，其引物组1、3、4、5采用表4所示的T01-T96的引物标签序列的其中一种，引物组2采用表4所示的S01-S96的引物标签序列的其中一种)。进而，基于该96个扩增引物组，得到本发明的用于同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的试剂盒。
实验时，当存在多个待测样本时，通过PCR在每个样本的PCR产物两端同时引入primer index；把多个带有不同primer index的PCR产物混合在一起，用于构建测序文库。其中，各PCR产物的结构如图1所示。
此外，当需要构建多个测序文库时，可通过添加带有不同adaptor index，来标记各个测序文库，并得到经primer index和adaptor index双重标记后的测序文库(添加了adaptor index的文库片段如图2所示)。文库构建完毕后，将带有不同adaptor index标记的多个测序文库混合在一起同时进行上机测序(不同 adaptor index标记的测序文库之间的primer index可以相同)。测序结果出来后，通过对测序结果中adaptor index和primerindex序列信息的筛选，可获得每个样本的DNA序列信息。
一般方法：
根据本发明实施例，利用本发明的用于同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的试剂盒(如实施例1获得的试剂盒)同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的方法，一般流程如下：
利用本发明的用于同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的试剂盒进行地贫检测的过程一般包括：DNA提取、PCR扩增、PCR产物pooling与建库、上机测序以及结果分析。具体地：
(1)样本DNA提取
采用常规DNA提取方法从外周血中提取DNA，要求DNA浓度大于30ng/ul，体积为100ul，OD260/280为1.8-2.0。
(2)PCR扩增
利用PCR反应板对多个待测样本进行PCR扩增，其中，将多个携带引物标签序列的扩增引物组(即多套标签引物)对应到具有多孔的PCR反应板中，使每套标签引物对应一个样本，每个样本采用5等份 DNA模板分别独立平行地进行表3所示的5个PCR反应，以便扩增如表1和表2所示的突变型和缺失型共计15个基因位点的相应基因片段，实现检测。
(3)建库与测序
将用标签引物PCR扩增得到的产物进行混合，将每一个样本的PCR产物混合到一个EP管中，经纯化后按照高通量测序技术的文库制备流程进行文库构建，确定文库Raw-cluster密度，然后上机测序。
其中，当需要将多个测序文库一次进行上机测序时，将各测序文库分别添加标签接头，使每个测序文库的标签接头的标签序列相互不同，进而将分别携带不同文库标签的多个测序文库混合形成能够同时上机测序的混合测序文库。由此，基于文库标签的序列即可有效区分不同的测序文库的测序结果，进而基于前述的引物标签序列能够有效区分同一个测序文库内的不同待测样本的测序结果，从而最终实现对各个待测样本的检测分析。
(4)结果分析
测序完成后，对数据进行分析，数据分析过程主要包括以下部分：
1)测序数据的分类
根据adaptor index(文库标签)和primer index(引物标签)序列将测序数据分配到每个样本，然后根据引物序列将已分配到样本的测序数据继续分配到该样本的每个扩增子(对应基因检测位点)。其中 HBB1和HBB2需要将测得的reads混合作为一个位点HBB输出(如图3所示)。
2)突变型分析
将测得的reads分别比对到HBA1,HBA2,HBB基因的参考序列，找出与参考序列不一致的点即为突变点，作为结果输出。
将已分配至每个样本的每个扩增子的测序数据用BWA软件比对到参考序列中(HBA1,HBA2,HBB 基因的参考序列)，找出与参考序列不一致的点即为突变点，作为结果输出。具体地，用samtools找出其中的SNP和小的indel组成，根据质量值对找出的SNP和小indel进行过滤，将过滤后的SNP和小indel 比对到地贫突变数据库中，得到地贫突变型分析的最终结果输出。
3)缺失型分析
将已分配至每个样本的每个扩增子的测序数据用特异性的固定识别序列进行比对搜索，接着将与固定识别序列完全匹配的测序数据量进行统计，并与信息分析流程中的最低检出限做比较，统计数值大于最低检出限的判定为该缺失型阳性检出，否则判定为阴性。
实施例2
利用实施例1获得的具有96套标签引物的试剂盒，参照上述的“一般方法”，对经sanger测序后结果已知(包括7种缺失型、无突变、常见突变、罕见突变和新发现突变)的95份样本进行检测。具体如下：
1、样本提取
使用KingFisher自动提取仪从95份血样中提取DNA，其中各血样均来源于郴州市人民医院。主要提取步骤如下：取出3个Kingfisher自动提取仪配套的深孔板及1个浅孔板，根据说明书分别加入一定量配套的试剂并标记，将所有已加好试剂的孔板按要求置于相应的位置，选定程序“Bioeasy_200ul Blood DNA_KF.msz”程序，按下“star”执行该程序进行核酸提取。程序结束后收集plate Elution中的100ul左右的洗脱产物即为提取的DNA，作为下一步PCR中的模板。要求DNA浓度大于30ng/ul，体积为100ul， OD260/280为1.8-2.0。
2、PCR扩增
把样本提取步骤中所得的95份DNA依次编号1-95，用实施例1获得的96套标签引物分别扩增95 份DNA样本，其中第96套标签引物扩增的为不添加模板的阴性对照。PCR反应在96孔板中进行，每个样本需进行5个PCR反应，因此一共需5个96孔板，编号Q1-Q5，分别对应表3的PCR反应1-5，实验的同时，记录下每个样本对应的引物标签编号。
针对每个样本，5个PCR反应的反应体系均为如下：
5个PCR反应的反应程序分别为：
PCR反应1：95℃10min；95℃30s→63℃30S→72℃50S，36个循环→72℃5min；15摄氏度，保存，
PCR反应2：95℃10min；95℃30s→63℃30S→72℃50S，36个循环→72℃5min；15摄氏度，保存，
PCR反应3：95℃10min；95℃30s→58℃30S→72℃50S，36个循环→72℃5min；15摄氏度，保存，
PCR反应4：95℃10min；95℃30s→61℃30S→72℃2min15S，36个循环→72℃5min；15摄氏度，保存，
PCR反应5：95℃10min；95℃30s→60℃30S→72℃30S，32个循环→72℃5min；15摄氏度，保存。
PCR反应在Applied Biosystems Veriti Thermal Cycler PCR仪上运行。各PCR完成后，取2ul PCR产物进行2.0％的琼脂糖凝胶电泳检测(如图4)。
3、PCR产物混合和纯化
从Q1-5这5板剩余的PCR产物中，每板每个孔各取等量产物混合到一个5ml EP管中(此步骤为 pooling)，振荡混匀，从中取200ul pooling产物经AxyPrep Mag PCR Clean-upkit纯化(具体纯化步骤详见说明书)，纯化所得的80ul产物，经Nanodrop 8000(ThermoFisher Scientific公司)测定浓度为94.47ng/ul。
4、文库构建
(1)样本打断并纯化
将上一步骤纯化所得的80ul产物用Covaris E220打断仪做打断(80ul打断体系)。打断条件如下表所示。
打断参数
| Duty Factor | Peak Incident Power(W) | Cycles/Burst | Time(Seconds) |
| 21％ | 500 | 500 | 20s×8个循环 |
打断完成后，产物经AxyPrep Mag PCR Clean-up kit纯化，纯化后溶于38ul TEbuffer。
(2)末端修复
a)提前5分钟左右准备末端修复混合液，涡旋混匀后备用：
注：Buffer需要提前取出后融化，使用前震荡混匀，低速离心；反应混合物配置完成后置于常温；如果需要配置多个样本反应，按照15％损耗进行反应混合物配置。
b)将已经打断后的38μL DNA混匀，离心；往样本管中加入12.5μL配置好的末端修复混合液，混匀，离心。
c)将样品置入PCR仪中反应，反应条件：20℃30min；4℃forever；反应完成后，产物经AxyPrep Mag PCR Clean-up kit纯化，纯化后溶于32.5ul TE buffer，备用。
(3)加“A”
a)提前5分钟左右准备加“A”混合液，涡旋混匀后备用：
注：Buffer需要提前取出后融化，使用前震荡混匀，低速离心；反应混合物配置完成后置于常温；如果
需要配置多个样本反应，按照15％损耗进行反应混合物配置。
b)在(2)中得到的32.5ul产物中加入18ul配置好的加“A”混合液，混匀，离心。
c)将样品置入PCR仪中反应，反应条件：37℃30min；4℃forever；反应完成后，产物经AxyPrep Mag PCR Clean-up kit纯化，纯化后溶于38ul TE buffer，备用。
(4)接头连接
a)提前5分钟左右准备连接酶混合液，涡旋混匀后备用：
注：Buffer需要提前取出后融化，使用前震荡混匀，低速离心。反应混合物配置完成后置于常温。
如果需要配置多个样本反应，按照15％损耗进行反应混合物配置。
b)在(3)中得到的38ul产物中加入8bp Adapter(50uM)2ul，混匀，离心。
c)再往样本管中加入10μL连接酶混合液，混匀，离心
d)将样品置入PCR仪中反应，反应条件：16℃过夜(大于16h)；4℃forever；(注意：PCR仪无需热盖)
(4)加接头样品片段筛选
将已完成AdA接头连接反应的样品转移至新1.5ml不粘管中，用AxyPrep MagFragmentSelect-I purification kit做片段筛选(具体步骤详见说明书)，纯化后回收DNA片段范围180-600bp，溶于30ul TE buffer中。
5、MGISEQ2000测序
按照测序仪的操作要求，做样品单链环化等操作并做上机测序。
6、结果分析
下机数据按照上述“一般方法”的分析流程进行地贫突变型与缺失型的分析。整个过程由计算机完成。所得结果与已知结果100％相符。具体请见下表5。
表5 95份样本分析结果汇总
对比例1
针对实施例2的95份样本，分别采用以下已获国家食品药品监督管理总局批准的地中海贫血基因检测试剂盒进行地贫检测：地中海贫血(α/β型)基因检测试剂盒(PCR-流式荧光杂交法)(国械注准 20153401068)、地中海贫血基因检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)(国械注准20153401272)、β地中海贫血基因检测试剂盒(PCR探针法)(国械注准20163400273)、α-地中海贫血基因检测试剂盒(Gap-PCR法) (国械注准20153400626)和非缺失型α地中海贫血基因检测试剂盒(PCR探针法)(国械注准 20143402140)。
结果发现：这些已获批的地中海贫血基因检测试剂盒无法检测出β缺失型SEA-HPFH、中国型、中国台湾型，罕见突变型：-90(C->T)beta+、Hb New York、Alpha2Codon30del GAG、Codon 39(C>T)beta0、 Codon 51(-C)beta0、Codon 72/73(+T)beta(0)、Codon41(-C)beta0、Codon 37(TGG>TAG)beta0、-88(C>T) beta+、Codon 41(-C)beta0、IVS-II-848(C>T)beta+、IVS-II-705(T>G)beta+、Codon 116(G>T)、Codon 5 (-CT)CCT(Pro)>C--beta0、α2Codon 31(AGG>AAG)；新发突变型HBA2:c.6_7insTG；而本发明针对上述型别均可检出。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
SEQUENCE LISTING
<110> 华大生物科技（武汉）有限公司
深圳华大临床检验中心
<120> 用于同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的试剂盒及其应用
<130> PIDC3184676D
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<170> PatentIn version 3.5
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agctgtgcag agaagagggt cagt 24
Claims (10)
1.一种用于同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含多个用于扩增地中海贫血基因的扩增引物组，其中所述多个包括1个的情形，
所述扩增引物组包括针对α珠蛋白基因和β珠蛋白基因设计的引物，
其中，所述扩增引物组包括针对HBA1基因、HBA2基因、HBB基因的突变型检测引物，以及针对α地贫缺失型–α3.7、–α4.2、--SEA、--THAI，以及β缺失型SEA-HPFH、中国型、中国台湾型的缺失型检测引物。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增引物组的引物序列如SEQ IDNO：1-27所示。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，在所述试剂盒中，SEQ ID NO：1-27所示的引物被分为如下所示的5个引物组：
，
其中，5个引物组分开放置，而针对每个引物组，其引物混合放置。
4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，在所述试剂盒中，所述扩增引物组的每条引物的5’端均添加有引物标签序列，且在每个扩增引物组内，引物组1、引物组3、引物组4和引物组5的引物标签序列相同，并与引物组2的引物标签序列不同，而所述多个扩增引物组之间的所有引物标签序列相互不同，
任选地，所述引物标签序列的长度为5-10bp，优选7bp，
任选地，针对每个扩增引物组，引物组1、引物组3、引物组4和引物组5携带相同的引物标签序列，且所述引物标签序列为选自下列的任意之一：
任选地，针对每个扩增引物组，引物组2的引物标签序列为选自下列的任意之一：
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，每个扩增引物组中各引物的重量份数如下表所示：
6.一种用于同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的测序文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
利用权利要求1-5任一项所述的试剂盒中的多个扩增引物组，分别对多个待测样本进行PCR扩增，以便获得多个待测样本的PCR产物，其中，各扩增引物组的每条引物的5’端均添加有引物标签序列，且在每个扩增引物组内，引物组1、引物组3、引物组4和引物组5的引物标签序列相同，并与引物组2的引物标签序列不同，而各扩增引物组之间的所有引物标签序列相互不同，以便使所述多个待测样本的PCR产物的引物标签序列相互不同；以及
将所述多个待测样本的PCR产物混合，以便获得所述用于同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的测序文库，
任选地，将所述多个待测样本的PCR产物混合后进一步包括：混合PCR产物打断、末端修复、加“A”、接头连接、片段筛选的步骤，
任选地，在所述多个待测样本的PCR产物混合之后，以及混合PCR产物打断、末端修复、加“A”、接头连接和片段筛选的至少一个步骤之后进一步包括对产物进行纯化的步骤，
任选地，所述接头为标签接头，
任选地，针对多个测序文库使每个测序文库的标签接头的标签序列相互不同，以便将分别携带不同文库标签的多个测序文库混合形成能够同时上机测序的混合测序文库，
任选地，所述片段筛选步骤回收的DNA片段长度为180bp-600bp。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，针对每个待测样本，所述PCR扩增包括5个PCR反应，各PCR反应采用引物组和引物序列如下表所示：
，
其中，5个PCR反应分别独立进行，每个待测样本的PCR产物均由5个PCR反应的产物组成，
任选地，针对每个待测样本，采用5等份DNA模板，分别进行5个PCR反应，
任选地，针对每个待测样本，5个PCR反应的引物的重量份数如下表所示：
任选地，针对每个待测样本，5个PCR反应的反应体系均为：无核酸酶水5.37μL，2×GCbuffer I 12.5μL，dNTP(2.5mmol/L)3μL，TaKaRaTaq HS 0.13μL，相应引物组的引物混合物2μL，DNA模板2μL，
任选地，针对每个待测样本，5个PCR反应的反应程序分别为：
PCR反应1：95℃10min；95℃30s→63℃30S→72℃50S，36个循环→72℃5min；15摄氏度，保存，
PCR反应2：95℃10min；95℃30s→63℃30S→72℃50S，36个循环→72℃5min；15摄氏度，保存，
PCR反应3：95℃10min；95℃30s→58℃30S→72℃50S，36个循环→72℃5min；15摄氏度，保存，
PCR反应4：95℃10min；95℃30s→61℃30S→72℃2min15S，36个循环→72℃5min；15摄氏度，保存，
PCR反应5：95℃10min；95℃30s→60℃30S→72℃30S，32个循环→72℃5min；15摄氏度，保存。
8.一种用于同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的测序文库，其是通过权利要求6或7所述的方法构建获得的。
9.一种同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的方法，其特征在于，将权利要求8所述的测序文库进行测序和分析，
任选地，所述分析包括：利用测序结果中携带的文库标签区分各个测序文库，进而利用引物标签区分同一个测序文库内的各个待测样本，然后利用引物序列将每个待测样本的读段比对至各个突变型和缺失型基因位点。
10.权利要求1-5任一项所述的试剂盒或者权利要求8所述的测序文库在同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型中的用途。
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