CN105803075A - 一种α-地中海贫血基因检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种可同时检测4种缺失型α-地中海贫血基因(-α3.7、-α4.2、--SEA和--THAI)和3种非缺失α-地中海贫血基因(αCSα、αQSα和αWSα)的试剂盒,包括DNA芯片、PCR反应液I和PCR反应液II,所述DNA芯片包括基底和固定于所述基底上的探针。本发明的有益效果在于:采用PCR-反向点杂交的检测原理,根据各基因型的突变或缺失位点,设计相应的扩增引物和探针,以生物素标记引物,以氨基标记探针,并以DNA芯片(尼龙膜)为基底,将探针固定在尼龙膜上,通过特异性引物扩增出来的PCR产物,与固定在DNA芯片上的探针进行杂交、信号显色盒判读来进行地贫的诊断。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一种在临床样本中一次实验诊断7种α-地中海贫血基因(包括4种缺失型α-地中海贫血基因和3种非缺失型α-地中海贫血基因)的试剂盒。
背景技术
地中海贫血(简称“地贫”)是由于珠蛋白基因发生缺陷,致使珠蛋白链合成减少或不能合成,使形成血红蛋白的珠蛋白链比例失衡,而导致的一种可遗传的溶血性血液病。主要包括两种类型:α-地贫和β-地贫。但α-地贫的人群携带率远高于β-地贫。
α-地贫(包括缺失型α-地贫和非缺失型α-地贫)是世界上最常见的单基因遗传病之一,中国南方的广西、广东、云南、海南、香港等省市及其周边地区是本病的高发地区。α珠蛋白基因位于16号染色体上,每条16号染色体有2个α珠蛋白基因(简称“α-基因”)。α-地贫是由于α-基因发生突变导致肽链失衡而造成的。若是染色体上的1个α-基因发生了缺失或缺陷,α-链的合成只受到了部分抑制,则称为α+地贫;若是染色体上2个α-基因都发生了缺失或缺陷称为α0地贫。只有1个α-基因发生异常,即α+地贫杂合状态时,一般没有明显的临床症状,表现型为静止型;当2个α-基因发生异常,即α+地贫纯合子或者α0杂合子状态时,仍有相当数量的α-链合成,症状轻微,表现型为标准型;当3个α-基因发生异常,即α0和α+地贫的杂合子状态时,患者仅能合成少量的α-链,症状为中度溶血性贫血,表现型为血红蛋白H病(HbH病);当4个α-基因发生异常,即α0地贫纯合子状态,无法生成α-链。正常情况下胎儿的血红蛋白主要成分为HbF,由于缺乏α-链,多余的γ-链聚合形成四聚体,即HbBart’s。HbBart’s具有很高的氧亲和性,无法解决胎儿宫内供氧的生理机能,继而引发胎儿水肿症,导致胎儿在宫内受累或分娩后半小时内死亡的妊娠结局。
中国常见的缺失型α-地贫基因型主要为-α3 . 7、-α4 . 2和--SEA,这三种缺失型在个体中的不同组合,可表现为静止型、标准型、血红蛋白H病和HbBart’s胎儿水肿综合症这四种表现型。随着α-地贫机制的进一步阐明,一些新的基因缺失型相继被发现,如泰国型α-地贫(--THAI)。
泰国型α-地贫基因缺失片段比东南亚基因缺失地贫(--SEA)片段还要长,缺失片段包括α1基因和α2基因,在临床上可以形成中重型α地中海贫血,即泰国型缺失的HbH病和泰国型缺失的巴氏水肿胎。而泰国型的血液学特征与东南亚缺失型α-地贫一致,表现为小细胞低色素性贫血,MCV水平降低,MCH量降低等,但由于泰国型属于罕见型α-地贫,不在常规的筛查范围内常常易造成漏检或误检,继而导致泰国型HbH病或泰国型巴氏水肿胎儿的出生。
在中国南方非缺失型α-地贫的发病率也较高,常见基因型为αCSα、αQSα和αWSα。非缺失型α-地贫类型是导致临床α-地贫漏诊的主要原因之一。在正常情况下,α2较α1基因的功能强,表达量也较α1基因大;当发生基因突变时,α2基因的突变一般会比α1基因突变降低基因产物的作用更大。当α2基因发生非缺失型突变时,α-链的产量比α2基因发生缺失时明显减少。因此,有些非缺失型α-地贫的纯合子可以表现为HbH病。此外,非缺失型α-地贫与缺失型α-地贫双重杂合还可导致HbH胎儿水肿综合征。对于地贫尚无理想的治疗方法,而地贫携带者又多无症状而不易察觉,因此降低其发生率的有效方法是对高发地区的婚孕人群广泛开展地贫基因筛查,若检出高危人群即患者或者携带者则应进行产前诊断,产前诊断可预防重型和中间型地贫患儿出生,对于优生优育和提高国民身体素质有着重要的意义。
目前常见的地贫基因检测方法有Southern印迹杂交-限制性酶谱分析法、跨越断裂点PCR(GAP-PCR)法、PCR-寡核苷酸探针(ASO)和PCR-反向点杂交(PCR-RDB)法等;生产厂家主要有亚能生物技术(深圳)有限公司、深圳益生堂生物企业有限公司、中山大学达安基因股份有限公司和潮州凯普生物化学有限公司等。国内临床常用的方法为PCR-反向点杂交法、GAP-PCR法。
上述地贫基因检测方法中,Southern印迹杂交-限制性酶谱分析法曾是α地贫基因诊断的主要方法,但由于操作繁琐,所需时间较长而难以推广;
跨越断裂点PCR(GAP-PCR)法通过一次PCR确定缺失突变形成的各种α地贫基因类型,已广泛应用于产前基因诊断。但只能应用于缺失型α-地贫基因检测产品,对于非缺失型α-地贫无法检测;
PCR-寡核苷酸探针(ASO)法可快速简便地检测已知突变的地贫基因,具有很高的灵敏性和准确性,但一次杂交只能检测一种突变,而且还需要同位素探针,难以推广应用;
多重连接依赖式探针扩增技术(MLPA)是2002年发展起来的一种针对待检DNA序列进行定性和半定量分析的技术,该方法能对缺失基因型进行检测,具有高效、特异的特点,在同一反应管内检测多达45个不同核酸序列拷贝数变化,;常用于α、β地贫大片段缺失基因型的检测。但其检测成本高,操作繁琐,耗时较长,检测流程长达16小时,且需要特殊的仪器设备,一般只用于研究使用,不便于分子筛查方法的推广应用;
PCR-反向点杂交(PCR-ReverseDotBlot,PCR-RDB)法具有灵敏度高、特异性好和准确性高等优点,目前已广泛应用于非缺失型α-地贫的临床基因诊断;
采用基因检测方法的地贫检测产品有亚能生物的α-地中海贫血基因检测试剂盒和非缺失型α-地中海贫血基因检测试剂盒、深圳益生堂的缺失型α-地中海贫血基因诊断试剂盒和非缺失型α-地中海贫血基因检测试剂盒、达安基因的α-地中海贫血基因检测试剂盒和非缺失型α-地中海贫血基因检测试剂盒、潮州凯普的α-地中海贫血基因检测试剂盒(PCR+导流杂交法)。
国内主要地贫产品相关信息见表1:
表1
现在市面上检测α-地贫的产品类型大多分为两类,一类是检测3种缺失型α-地贫(-α3 . 7、-α4 . 2、--SEA),另一类是检测3种非缺失型α-地贫(αCSα、αQSα和αWSα)。也有少数产品是通过Gap-PCR法检测4种缺失型α-地贫(-α3 . 7、-α4 . 2、--SEA和--THAI)或通过PCR-导流杂交法检测3种缺失型α-地贫(-α3 . 7、-α4 . 2、--SEA)和3种非缺失型α-地贫(αCSα、αQSα和αWSα)。
以上的产品和方法均存在漏检、误检非缺失型α-地贫或泰国型α-地贫的风险,导致中重型地贫患儿的出生,给患者家庭带来沉重的负担。目前还没有一种能够快速简便同时检测4种缺失和3种非缺失的试剂盒,使用非常不方便,容易造成漏检,危害巨大。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是:提供一种可同时检测4种缺失型α-地中海贫血基因(-α3 . 7、-α4 . 2、--SEA和--THAI)和3种非缺失α-地中海贫血基因(αCSα、αQSα和αWSα)的试剂盒。
为了解决上述技术问题,本发明采用的技术方案为:一种α-地中海贫血基因检测试剂盒,包括DNA芯片、PCR反应液I和PCR反应液II,所述DNA芯片包括基底和固定于所述基底上的探针,所述探针包括:
非缺失型α-地中海贫血基因所对应的正常对照探针,其碱基序列如SEQIDNO:1-3;用于检测非缺失型α-地中海贫血基因的探针,其碱基序列如SEQIDNO:5-7;用于检测缺失型α-地中海贫血基因的探针,其碱基序列如SEQIDNO:9-12;内参探针,其碱基序列如SEQIDNO:4和SEQIDNO:8;
所述PCR反应液I包括:扩增缺失型α-地中海贫血基因的引物,其碱基序列如下:引物3.7F,SEQIDNO:15;引物3.7R,SEQIDNO:16;引物4.2F,SEQIDNO:17;引物4.2R,SEQIDNO:18;引物SEAF,SEQIDNO:19;引物SEAR,SEQIDNO:20;引物THAIF,SEQIDNO:21;引物THAIR,SEQIDNO:22;内参引物,其碱基序列如下:引物IC1F,SEQIDNO:23;引物IC1R,SEQIDNO:24;
所述PCR反应液II包括:扩增非缺失型α-地中海贫血基因的引物,其碱基序列如下:引物ATF,SEQIDNO:13;引物ATR,SEQIDNO:14;内参引物,其碱基序列如下:引物IC2F,SEQIDNO:25;引物IC2R,SEQIDNO:26。
其中,所述基底为尼龙膜。
其中,所述引物5’端标记生物素。
其中,
每23体积份PCR反应液I中含有:
水:15.14体积份;
10×PCRbufferforKOD-Plus:2.5体积份;
25mMMgSO4:0.5体积份;
2.5mMdNTP:2体积份;
100μM引物3.7F:0.1体积份;
100μM引物3.7R:0.1体积份;
100μM引物4.2F:0.95体积份;
100μM引物4.2R:0.95体积份;
100μM引物SEAF:0.05体积份;
100μM引物SEAR:0.05体积份;
100μM引物THAIF:0.05体积份;
100μM引物THAIR:0.05体积份;
100μM引物IC1F:0.03体积份;
100μM引物IC1R:0.03体积份;
1U/μLKOD-Plus酶:0.5体积份;
每23体积份PCR反应液II中含有:
水:18.77体积份;
10×PCRbufferforKOD-Plus:2.5体积份;
25mMMgSO4:0.5体积份;
2.5mMdNTP:0.2体积份;
100mMdUTP:0.05体积份;
100μM引物ATF:0.06体积份;
100μM引物ATR:0.06体积份;
100μM引物IC2F:0.03体积份;
100μM引物IC2R:0.03体积份;
1U/μLUNG:0.3体积份;
5U/μLHotStarTaq酶:0.5体积份。
本发明的有益效果在于:采用PCR-反向点杂交的检测原理,根据各基因型的突变或缺失位点,设计相应的扩增引物和探针,以生物素标记引物,以氨基标记探针,并以DNA芯片(尼龙膜)为基底,将探针固定在尼龙膜上,通过特异性引物扩增出来的PCR产物,与固定在DNA芯片上的探针进行杂交、信号显色盒判读来进行地贫的诊断。
附图说明
图1为实施例1和实施例2中膜条上的探针排列顺序示意图。
图2为实施例2中正常(N/N)基因的检测结果示意图。
图3为实施例2中非缺失型α-地贫杂合子(例αCSα/αα)基因的检测结果示意图。
图4为实施例2中缺失型α-地贫(例--THAI/αα)基因的检测结果示意图。
图5为实施例2中非缺失型α地贫复合缺失型α地贫(例αQSα/-α3 . 7)基因的检测结果示意图。
图6为实施例2中缺失型α地贫纯合(例-α3 . 7/-α3 . 7)基因的检测结果示意图。
图7为实施例2中缺失型α地贫双重杂合子(例-α3 . 7/--THAI)基因的检测结果示意图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果,以下结合实施方式予以说明。
本发明最关键的构思在于:采用PCR-反向点杂交的检测原理,根据各基因型的突变或缺失位点设计相应的扩增引物和探针,以生物素标记引物,以氨基标记探针,并以DNA芯片为基底,将探针固定在DNA芯片上,通过特异性引物扩增出来的PCR产物与探针进行杂交,以信号显色盒判读来进行地贫的诊断。
本发明提到的术语:
PCR:PolymeraseChainReaction聚合酶链式反应
PCR-反向点杂交法:PCR扩增产物与探针通过分子杂交反应及显色反应,观察显色点的有无,判断该探针是否与PCR产物杂交,从而确定待检样品的基因型。
地贫:地中海贫血(Thalassemia)是由于病人某种或某些珠蛋白链合成速率降低,造成一些肽链缺乏,另一些肽链相对过多,出现肽链数量的不平衡,导致的溶血性贫血。
-α3 . 7:是指在两个α珠蛋白基因之间缺失3.7kb所造成的缺失型α地贫,类似定义的有-α4 . 2。
--THAI:是指α-珠蛋白基因发生了约33.5kb的缺失所造成的缺失型α-地贫,缺失部分包括了α1、α2基因,类似定义的有--SEA。
αQSα:是指α2珠蛋白基因的第125个密码子发生突变(CTG→CCG),使亮氨酸变成脯氨酸,从而导致肽链结果发生改变所引起的非缺失α地贫,类似定义的有αCSα和αWSα。
实施例1
1、引物、探针的设计及筛选
膜条上的探针排列顺序如图1所示,由斑点显现的位置即可判断结果。
根据选择的4种缺失型α-地贫以及3种非缺失型α-地贫,设计探针阵列(3x4),膜条上各位点代表的意义及其与正常对照的关系见表2。
表2
注:图1中每一个方格代表一种探针,用以检测诊断不同的地贫基因型。表2中4种缺失型α-地贫以QSN、CSN和WSN一起作为正常对照。最后一个字母“N”代表正常,“M”代表突变。
从GenBank数据库中获取α-珠蛋白基因序列,根据不同的缺失或突变类型,设计相应的引物与探针序列,要求各探针的Tm值相差不超过5℃,在同一温度下具有最适宜的杂交灵敏度和特异性。引物和探针均为人工合成寡聚核苷酸,其中探针由宝生物工程(大连)有限公司合成,引物有上海英骏生物技术有限公司合成。序列合成完毕后由公司人员核对,然后根据需要稀释成所需的浓度。此引物和探针长度或位置的改变均会降低本试剂盒的灵敏度、特异性和重复性,最终确定的引物序列如表3,探针序列如表4。
表3
表4
2、引物、探针浓度以及反应体系其他组分浓度确定
利用正交试验方法,通过大量实验对比,最终确定最优的PCR反应体系见表5和表6,表5为PCR反应液I配方,表6为PCR反应液II配方。
表5
表6
试剂 | 1人份(μL) |
水 | 18.77 |
10×PCR buffer for KOD-Plus(TOYOBO) | 2.5 |
25mM MgSO4(TOYOBO) | 0.5 |
2.5mM dN(U)TP | 0.2 |
100mM dUTP | 0.05 |
100μM ATF | 0.06 |
100μM ATR | 0.06 |
100μM IC2F | 0.03 |
100μM IC2R | 0.03 |
1U/μL UNG | 0.3 |
1U/μL KOD-Plus酶(TOYOBO) | 0.5 |
总量 | 23 |
3、PCR反应条件的确定
经过大量的实验对比,最终确定最佳反应条件为:
退火温度和退火时间对PCR扩增效率和特异性扩增影响较大,上述条件优化结果显示退火温度偏低会有非特异性扩增信号导致假阳性结果;温度偏高扩增效率偏低,灵敏度下降。本实验通过控制退火温度和退火时间可以做到特异性好,扩增效率高,灵敏度可达10ng/μL。
4、杂交条件的确定
杂交温度对最后结果的判读影响很大,杂交温度偏低会导致PCR产物与膜条上的探针非特异结合,从而有可能误判为阳性;杂交温度偏高会导致目的产物与目的探针的结合效率下降,杂交信号强度减弱,从而有可能误判为阴性。洗膜时间和显色时间的长短对杂交结果也会有类似的影响。通过一系列优化实验,最终确定的杂交、洗膜和显色等最适条件如下:
4.1杂交
含取15mL塑料离心管,放入标有样品编号的膜条(应在膜条的一角用铅笔标记),加入A液(2×SSC、0.1%SDS)5-6mL及PCR反应液I、II中所有(两管共50μL)PCR产物,拧紧管盖,再回旋一圈稍拧松。将离心管放入沸水浴中加热10分钟(确保杂交液液面完全位于沸水浴液面之下),取出拧紧盖子,放入杂交箱43℃杂交1.5小时以上,但不超过4小时。
取50mL塑料管,加入40mLB液(0.5×SSC、0.1%SDS)于杂交箱中进行预热至43℃。
4.2洗膜
取出膜条,移至装有预热B液的50mL管中,于43℃轻摇洗涤15分钟(每管40mL溶液,最多可同时洗涤4张膜)。
4.3显色
按A液:POD=2000:1配制孵育液(单做两张膜只需4μLPOD母液,配制成8mL使用液,做四张膜可用6μLPOD母液,配制成12mL使用液),室温轻摇浸泡30分钟,弃去POD溶液。用A液室温轻摇洗两次,每次5分钟。用C液(0.1mol/L柠檬酸钠,pH5.0)室温洗膜1-2分钟,同时配制显色液(各成份比例:19mLC液,1mLTMB,2μL30%的H2O2)。将膜条浸泡于显色液中避光显色5至10分钟即可观察结果。
实施例2
本发明试剂盒的使用说明:
1、试剂盒主要成份见表7
表7
2、本检测需要用到的其他主要试剂(盒)
全血基因组DNA提取试剂:推荐使用亚能生物技术(深圳)有限公司的“核酸提取试剂”(备案号:粤深械备20150099号;型号:全血DNA(离心柱型);规格:25人份/盒或50人份/盒。)
20×SSC:175.3gNaCl、88.2g柠檬酸钠用750mL纯水溶解,用浓盐酸调pH值至pH7.0,最后定容至1000mL,并高压灭菌保存。常温保存。
10%SDS:20gSDS用180mL纯水溶解,用1NHCl调pH值至pH7.0,最后定容至200mL。常温保存。
1M柠檬酸钠:294g柠檬酸钠用700mL溶解,用浓HCl调pH值至pH5.0,最后定容至1000mL。常温保存。
A液:100mL20×SSC,10mL10%SDS加纯水定容至1000mL。常温保存。
B液:25mL20×SSC,10mL10%SDS加纯水定容至1000mL。常温保存。
C液:100mL1M柠檬酸钠加纯水定容至1000mL。常温保存。
显色液:19mLC液加入1mLTMB和2μL30%H2O2。
3、适用仪器
基因扩增仪:Hema9600,珠海黑马医学仪器有限公司。
分子杂交仪:恒温杂交仪(YN-H16),亚能生物技术(深圳)有限公司。
4、储存条件及有效期
储存条件:试剂盒Ⅰ置于-18℃以下保存;试剂盒Ⅱ置于2-8℃保存。如果打开包装各组分分开保存时,除了满足各自的温度保存条件之外,需特别注意TMB应该避光保存。
有效期:6个月。
5、样本要求
5.1本试剂盒样本来源为抗凝全血,所用抗凝剂为枸橼酸钠或EDTA,不能使用肝素抗凝。
5.2样本采集:抽取静脉血1~5mL入含有抗凝剂的管中,标记好样本信息。
5.3血样保存:抗凝全血在室温放置不超过24小时,2~8℃保存不超过一个月,-18℃以下保存不超过两年,-70℃可长期保存,冷冻保存时应避免反复冻融。
5.4血样运输:抗凝全血运输时需用冰壶或泡沫箱加冰袋密封,应保证冰袋不化冻,且在途时限不宜超过72小时。
6、检验方法
6.1全血DNA的提取:
推荐使用亚能公司的“核酸提取试剂”提取人基因组DNA。
PCR前模板DNA浓度和纯度的测定可采用核酸定量仪或紫外分光光度计。本试剂盒要求待检基因组DNA的浓度为10-100ng/μL,纯度(A260/A280)为1.7~2.0。
6.2PCR扩增
取出PCR反应液,在管壁上做好标记,于5000rpm离心2秒,而后向PCR反应液I、II中分别加入已提取的待测样品DNA2μL,反应总体系为25μL。
每次实验另取一管PCR反应液,以2μL纯水为模板,作空白对照。
PCR按以下条件进行扩增:
取15mL塑料离心管,放入标有样品编号的膜条(应在膜条的一角用铅笔标记),加入A液5-6mL及PCR反应液I、II中所有(两管共50μL)PCR产物,拧紧管盖,再回旋一圈稍拧松。将离心管放入沸水浴中加热10分钟(确保杂交液液面完全位于沸水浴液面之下),取出拧紧盖子,放入杂交箱43℃杂交1.5小时以上,但不超过4小时。
取50mL塑料管,加入40mLB液于杂交箱中进行预热至43℃。
6.4洗膜
取出膜条,移至装有预热B液的50mL管中,于43℃轻摇洗涤15分钟(每管40mLB液,最多可同时洗涤6张膜)。
6.5显色
按A液:POD=2000:1配制孵育液(单做两张膜只需4μLPOD母液,配制成8mL使用液,做四张膜可用6μLPOD母液,配制成12mL使用液),室温轻摇浸泡30分钟,弃去POD溶液。用A液室温轻摇洗两次,每次5分钟。用C液室温洗膜1-2分钟,同时配制显色液(显色液需新鲜配制,配制方法见自备试剂)。将膜条浸泡于显色液中避光显色5至10分钟即可观察结果。
6.6结果判读
膜条上的探针排列顺序如图1,膜条上正常与突变位点的对应关系见表2。
7、参考范围
本试剂盒对检测对象进行定性分析,以检测位点出现信号与否来进行判断,信号点的强弱不能提供任何定量方面的参考。
8、检验结果的解释
8.1空白对照的膜条结果应为所有位点都不显色,否则本次实验可能发生污染,应全部重做。
8.2所有临床样品内参探针IC1、IC2位点有蓝色斑点出现,否则可能实验不成功,该样品应重检;若重检结果还是如此,则应与试剂盒生产厂家技术人员联系解决。
8.3当样本为缺失型α纯合或双重杂合时,非缺失α所有位点都不显色。
9、检验方法的局限性
该试剂盒能够检测中国人群中检出率较高的缺失型α-地贫、非缺失α-地贫基因缺陷,共包括4种缺失型α-地贫(-α3 . 7、-α4 . 2、--SEA、--THAI)以及3种非缺失型α-地贫(αCSα、αQSα和αWSα)。还有一些罕见的突变类型在本试剂盒检测范围之外,可能造成漏检,这类样本可用测序法进一步验证。
10、产品性能指标
10.1测定准确性
用21份临床阳性样本和10份临床阴性样本,选择高、中、低3个浓度,每个浓度重复3次,分别用3批产品来检测,分别计算阳性符合率和阴性符合率。结果显示相应的基因型,研究结果与测序结果完全符合,产品阳性符合率和阴性符合率都达100%;
10.2分析灵敏度
使用本发明试剂盒对7种α-地贫检测位点进行灵敏度分析,每个样本包含7个浓度梯度,确定各基因型能够稳定检出的基因组DNA最低浓度为10ng/μL;
10.3分析特异性
通过干扰筛查试验,临床正常剂量的枸橼酸钠、EDTA不是本品的干扰物质;服用过去铁胺的病人的样本用本品检测时不影响检测结果,说明去铁胺不是本品的干扰物质;溶血样本(即使是完全溶血)不会干扰本试剂盒检测结果;脂血样本中甘油三酯和黄疸样本中总胆红素的浓度分别为13.8mmol/L和359.28μmol/L,均已达到临床的极高水平,却对本品检测无干扰,所以当甘油三酯≤13.8mmol/L或总胆红素≤359.28μmol/L对本试剂盒的检测结果均无干扰,不是本品的干扰物质;肝素钠是本品的外源性干扰物质,干扰效果评价试验结果表明,按15IU肝素钠抗凝1mL血液比例处理的全血样本不适用于本试剂盒。
用本产品检测8例本产品检测范围外的临床样本,包括1例α-地贫阴性样本(αα/αα)、3例β-地中海贫血临床样本(41-42M/N、654M/N和-28M/N各1例)、1例G-6-PD临床样本、1例缺铁性贫血临床样本、1例感染弓形虫的全血样本和1例乙肝病毒DNA临床样本,前7例结果均为阴性,乙肝病毒DNA样本结果为无信号,即8例均无交叉反应。
10.4重复性
不同批号产品,不同人(2人)操作,一天做2次,共做2天,每次试验每个参考品重复3次检测。在不同实验条件下能多次重复稳定检测α-地贫基因型,结果显示一致。
根据膜条上斑点显现的位置,读取相应位置上标注的基因型信息。参见以下示意图例:
正常(N/N)见图2;
非缺失型α-地贫杂合子(例αCSα/αα)见图3;
缺失型α-地贫(例--THAI/αα)见图4;
非缺失型α地贫复合缺失型α地贫(例αQSα/-α3 . 7)见图5;
缺失型α地贫纯合(例-α3 . 7/-α3 . 7)见图6;
缺失型α地贫双重杂合子(例-α3 . 7/--THAI)见图7。
综上所述,本发明提供的α-地中海贫血基因检测试剂盒的有益效果如下:
1、本发明采用PCR-反向点杂交法,对4种缺失型α-地贫以及3种非缺失型α-地贫进行检测。与现有的能检测缺失型α-地贫以及非缺失型α-地贫的同类专利相比,本发明增加了泰国型α-地贫的检测,泰国型α-地贫基因缺失片段比东南亚型α-地贫还要长,在临床上可以形成中重型α-地贫,而这种基因型在中国人群中的发生率不低,尤其是在广西地区,具有较高的检出率,有数据表明,其检出率高达0.56%,若不进行泰国型α缺失检测会大大的增加漏检或误检的风险,增加了中重型地贫患儿的出生概率,给家庭和社会带来严重的负担。本发明可以通过一次试验既可以完成7种α-地贫的检测,大大的节省了时间、节约了成本。本发明与现有检测地贫同类专利对比如表8。
表8
2.本发明对临床样本的检测情况:本发明试剂盒检测200例临床样本,其检测结果与金标准测序结果对比,准确率为100%;对非本发明试剂盒检测范围的β-地贫和非缺失型α-地贫基因型阳性(β-地贫:41-42M/N、654M/N和非缺失型α-地贫:59M/N)和阴性样本,本发明试剂盒检测结果均为阴性,阴性符合率为100%,特异性为100%。
3.本发明试剂盒的性能指标:
3.1测定准确性
用21份临床阳性样本和10份临床阴性样本,选择高、中、低3个浓度,每个浓度重复3次,分别用3批产品来检测,分别计算阳性符合率和阴性符合率。结果显示相应的基因型,研究结果与测序结果完全符合,产品阳性符合率和阴性符合率都达100%;
3.2分析灵敏度
使用本发明试剂盒对7种α-地贫检测位点进行灵敏度分析,每个样本包含7个浓度梯度,确定各基因型能够稳定检出的基因组DNA最低浓度为10ng/μL;
3.3分析特异性
通过干扰筛查试验,临床正常剂量的枸橼酸钠、EDTA不是本品的干扰物质;服用过去铁胺的病人的样本用本品检测时不影响检测结果,说明去铁胺不是本品的干扰物质;溶血样本(即使是完全溶血)不会干扰本试剂盒检测结果;脂血样本中甘油三酯和黄疸样本中总胆红素的浓度分别为13.8mmol/L和359.28μmol/L,均已达到临床的极高水平,却对本品检测无干扰,所以当甘油三酯≤13.8mmol/L或总胆红素≤359.28μmol/L对本试剂盒的检测结果均无干扰,不是本品的干扰物质;肝素钠是本品的外源性干扰物质,干扰效果评价试验结果表明,按15IU肝素钠抗凝1mL血液比例处理的全血样本不适用于本试剂盒。
用本产品检测8例本产品检测范围外的临床样本,包括1例α-地贫阴性样本(αα/αα)、3例β-地中海贫血临床样本(41-42M/N、654M/N和-28M/N各1例)、1例G-6-PD临床样本、1例缺铁性贫血临床样本、1例感染弓形虫的全血样本和1例乙肝病毒DNA临床样本,前7例结果均为阴性,乙肝病毒DNA样本结果为无信号,即8例均无交叉反应。
3.4重复性
不同批号产品,不同人(2人)操作,一天做2次,共做2天,每次试验每个参考品重复3次检测。在不同实验条件下能多次重复稳定检测α-地贫基因型,结果显示一致。
以上所述仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是利用本发明说明书内容所作的等同变换,或直接或间接运用在相关的技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (4)
1.一种α-地中海贫血基因检测试剂盒,其特征在于:包括DNA芯片、PCR反应液I和PCR反应液II,所述DNA芯片包括基底和固定于所述基底上的探针,所述探针包括:
非缺失型α-地中海贫血基因所对应的正常对照探针,其碱基序列如SEQIDNO:1-3;
用于检测非缺失型α-地中海贫血基因的探针,其碱基序列如SEQIDNO:5-7;
用于检测缺失型α-地中海贫血基因的探针,其碱基序列如SEQIDNO:9-12;
内参探针,其碱基序列如SEQIDNO:4和SEQIDNO:8;
所述PCR反应液I包括:
扩增缺失型α-地中海贫血基因的引物,其碱基序列如下:
引物3.7F,SEQIDNO:15;
引物3.7R,SEQIDNO:16;
引物4.2F,SEQIDNO:17;
引物4.2R,SEQIDNO:18;
引物SEAF,SEQIDNO:19;
引物SEAR,SEQIDNO:20;
引物THAIF,SEQIDNO:21;
引物THAIR,SEQIDNO:22;
内参引物,其碱基序列如下:
引物IC1F,SEQIDNO:23;
引物IC1R,SEQIDNO:24;
所述PCR反应液II包括:
扩增非缺失型α-地中海贫血基因的引物,其碱基序列如下:
引物ATF,SEQIDNO:13;
引物ATR,SEQIDNO:14;
内参引物,其碱基序列如下:
引物IC2F,SEQIDNO:25;
引物IC2R,SEQIDNO:26。
2.根据权利要求1所述的α-地中海贫血基因检测试剂盒,其特征在于,所述基底为尼龙膜。
3.根据权利要求1所述的α-地中海贫血基因检测试剂盒,其特征在于,所述引物5’端标记生物素。
4.根据权利要求1所述的α-地中海贫血基因检测试剂盒,其特征在于:每23体积份PCR反应液I中含有:
水:15.14体积份;
10×PCRbufferforKOD-Plus:2.5体积份;
25mMMgSO4:0.5体积份;
2.5mMdNTP:2体积份;
100μM引物3.7F:0.1体积份;
100μM引物3.7R:0.1体积份;
100μM引物4.2F:0.95体积份;
100μM引物4.2R:0.95体积份;
100μM引物SEAF:0.05体积份;
100μM引物SEAR:0.05体积份;
100μM引物THAIF:0.05体积份;
100μM引物THAIR:0.05体积份;
100μM引物IC1F:0.03体积份;
100μM引物IC1R:0.03体积份;
1U/μLKOD-Plus酶:0.5体积份;
每23体积份PCR反应液II中含有:
水:18.77体积份;
10×PCRbufferforKOD-Plus:2.5体积份;
25mMMgSO4:0.5体积份;
2.5mMdNTP:0.2体积份;
100mMdUTP:0.05体积份;
100μM引物ATF:0.06体积份;
100μM引物ATR:0.06体积份;
100μM引物IC2F:0.03体积份;
100μM引物IC2R:0.03体积份;
1U/μLUNG:0.3体积份;
5U/μLHotStarTaq酶:0.5体积份。
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