CN102943115A

CN102943115A - α和β地中海贫血基因检测的核酸膜条及试剂盒

Info

Publication number: CN102943115A
Application number: CN2012104947482A
Authority: CN
Inventors: 刘福平; 梁少明; 刘晶晶; 任维
Original assignee: YANENG BIOTECHNOLOGY (SHENZHEN) CO Ltd
Current assignee: YANENG BIOTECHNOLOGY (SHENZHEN) CO Ltd
Priority date: 2012-11-28
Filing date: 2012-11-28
Publication date: 2013-02-27
Anticipated expiration: 2032-11-28
Also published as: CN102943115B

Abstract

本发明涉及地中海贫血的诊断试剂，尤其涉及一种α和β地中海贫血基因检测的核酸膜条及试剂盒。本发明的一个技术方案为提供一种α和β地中海贫血基因检测的核酸膜条，包括一基底，和固定于所述基底上的特异性寡核酸探针，所述特异性寡核苷酸探针包括针对6种常见类型的α-地贫（3种缺失型和3种突变型）以及17种突变型β-地贫的探针。本发明能一次试验能同检测缺失型α地贫、非缺失型α地贫和β地贫，相对于现有同类技术，同时检测了未见报道的2种β地贫（-30和-32）和1种非缺失型α地贫（α^WSα），这3种基因型在中国的发生率不低，不检测会大大增加地贫漏检的风险，给家庭和社会带来严重的负担。

Description

α和β地中海贫血基因检测的核酸膜条及试剂盒

技术领域

本发明涉及地中海贫血的诊断试剂，尤其涉及一种α和β地中海贫血基因检测的核酸膜条及试剂盒。

背景技术

地中海贫血（Thalassemia，以下简称地贫）是由于病人某种或某些珠蛋白链合成速率降低，造成一些肽链缺乏，另一些肽链相对过多，出现肽链数量的不平衡而导致的溶血性贫血。地贫主要有两种类型，分别为α-珠蛋白链合成减缺导致的α-地贫和β-珠蛋白合成减缺导致的β-地贫。

α-地贫（包括缺失型α-地贫和非缺失型α-地贫）是世界上最常见的单基因遗传病之一，我国南方的广西、广东、云南、海南、香港、台湾等省市及其周边地区也是本病的高发地区，全国29个省、市、自治区90万人血红蛋白病调查结果表明，人群中缺失型α-地贫的基因缺陷携带率为2.64%，其中广西、广东、江西、四川发病率分别高达14.95%、4.11%、2.60%、1.92%。我国的缺失型α-地贫在基因型上主要为-α^3.7、-α^4.2和--^SEA这三种缺失型，根据这三种缺失型在个体中的不同组合，可表现为静止型、标准型、血红蛋白H病（HbH病）和Hb Bart’s胎儿水肿综合症这四种表现型。

α-珠蛋白基因点突变类型是导致临床α地贫漏诊的主要原因之一，在我国南方非缺失型α-地贫的发病率也较高，广西地区地中海贫血的流行病调查中发现Hb CS和Hb QS的发病率分别为1.21%和0.36%，可见非缺失型突变在Hb H的基因缺陷中占较大比例，非缺失型α-地贫的突变大多位于功能较强的α2基因，故非缺失型Hb H病人的临床表现要比缺失型Hb H病人更为严重，纯合的非缺失α-地贫为严重的Hb H病，此外，非缺失型α-地贫与缺失型α-地贫双重杂合还可导致Hb H胎儿水肿综合症。

β-地贫在我国主要分布在广东、广西、云南、海南、台湾、香港等省市及相邻省区的部分地区。据报道在广东β-地贫携带率为1.83%-3.36%，广西和海南甚至更高。β-地贫多由β-珠蛋白基因点突变所致，是我国南方各省最常见、危害最大的遗传病之一。在中国人群中常见的突变位点有CD41-42，IVS-Ⅱ-654，-28，CD71-72等。

目前常见的地贫基因检测方法有Southern印迹杂交-限制性酶谱分析法、跨越断裂点PCR（GAP-PCR）法、PCR-寡核苷酸探针（ASO）和PCR-反向点杂交（PCR-RDB）法等；生产厂家主要有亚能生物技术（深圳）有限公司、深圳益生堂生物企业有限公司、中山大学达安基因股份有限公司和潮州凯普生物化学有限公司等。国内临床常用的方法为PCR-反向点杂交法、GAP-PCR法。现有主要产品见表1：

表1

上述方法中，跨越断裂点PCR（GAP-PCR）法：通过一次PCR确定缺失突变形成的各种α地贫基因类型，已广泛应用于产前基因诊断。但只能应用于缺失型α-地贫基因检测产品，对于非缺失型α-地贫和β-地贫无法检测。PCR-反向点杂交（PCR-Reverse Dot Blot，PCR-RDB）法：这一方法具有灵敏度高、特异性好和准确性高等优点，目前已广泛应用于β-地贫的临床基因诊断及正在研发阶段的非缺失型α-地贫检测。

如申请号为200710074203.5的中国发明专利“诊断α-地中海贫血的核酸膜条及试剂盒”，申请号为200510034015.0的中国发明专利“用于诊断β-地中海贫血的核酸杂交膜条及试剂盒”。上述基因检测试剂盒都分别单独检缺失型α-地贫或突变型β-地贫，虽然这些试剂盒检测灵敏度高，检出率高、特异度好，假阳性率和假阴性率低，在临床诊断中得到了一定的推广。但是由于这些产品操作要求条件高、方法繁琐、耗时长、均为独立检测导致成本高昂，尚不能满足临床诊断简便快速的要求。

发明内容

本发明的目的在于提供共一种同时检测缺失型α地贫、非缺失型α地贫和β地贫的核酸检测膜条及试剂盒。

本发明的技术方案为提供一种α和β地中海贫血基因检测的核酸膜条，包括一基底，和固定于所述基底上的特异性寡核酸探针，所述特异性寡核苷酸探针包括：

β-地中海贫血基因所对应的正常对照特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO：1-7；

α-地中海贫血基因所对应的正常对照特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO：9-11；

用于检测β-地中海贫血基因的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：12-19和SEQ ID NO：23-30；

用于检测α-地中海贫血基因的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO：20-22、SEQ ID NO：31-33。

优选的，上述的α和β地中海贫血基因检测的核酸膜条中所述基底为尼龙膜。

本发明的另一技术方案为提供一种α和β地中海贫血基因检测的试剂盒，所述试剂盒包括：

特异性扩增非缺失型α-地中海贫血基因的一对引物：

引物ATF:SEQ ID NO：34；

引物ATR：SEQ ID NO：35；

特异性扩增缺失型α-地中海贫血基因的三对引物：

引物3.7F：SEQ ID NO：36；

引物3.7R：SEQ ID NO：37；

引物4.2F：SEQ ID NO：38；

引物4,.2R：SEQ ID NO：39；

引物SEAF：SEQ ID NO：40；

引物SEAR：SEQ ID NO：41；

特异性扩增β-地中海贫血基因两对引物：

引物BF1：SEQ ID NO：42；

引物BR2：SEQ ID NO：43；

引物BF2：SEQ ID NO：44；

引物BR2：SEQ ID NO：45；

用于检测β-地中海贫血基因的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：12-19和SEQ ID NO：23-30；

优选的，上述的α和β地中海贫血基因检测的试剂盒中所述寡核苷酸探针固定在基底上。

优选的，上述的α和β地中海贫血基因检测的试剂盒中所述寡核苷酸探针固定在尼龙膜上。

优选的，上述的α和β地中海贫血基因检测的试剂盒中所述引物5’端标记生物素。

优选的，上述的α和β地中海贫血基因检测的试剂盒中包括PCR反应液I和PCR反应液II，所述的PCR反应液I各组分含量为：

去离子水：17.2μL；

10×PCR buffr：2.5μL；

25mM MgCl₂：0.5μL；

2.5mM dNTP：2μL；

100μM引物3.7F：0.07μL；

100μM引物3.7R：0.07μL；

100μM引物4.2F：0.05μL；

100μM引物4.2R：0.05μL；

100μM引物SEAF：0.03μL；

100μM引物SEAR：0.03μL；

5U/μL超纯Taq酶：0.5μL；

所述的PCR反应液II各组分含量为：

去离子水：16.82μL；

10×PCR buffr：2.5μL；

25mM MgCl₂：0.5μL；

2.5mM dATP、dCTP、dGTP、dUTP的等体积混合液：2μL；

100μM引物ATF：0.06μL；

100μM引物ATR：0.06μL；

100μM引物BF1：0.08μL；

100μM引物BR1：0.08μL；

100μM引物BF2：0.05μL；

100μM引物BR2：0.05μL；

1U/μL UNG：0.3μL；

5U/μL Taq酶：0.5μL。

本发明能一次试验能同检测缺失型α地贫、非缺失型α地贫和β地贫，即一次试验检测6种常见类型的α-地贫（3种缺失型和3种突变型）以及17种突变型β-地贫，检测时间短、成本低、操作方便。相对于现有同类技术，同时检测了未见报道的2种β地贫（-30和-32）和1种非缺失型α地贫（α^WSα），这3种基因型在中国的发生率不低，不检测会大大增加地贫漏检的风险，增加重型地贫患儿的出生概率，给家庭和社会带来严重的负担。

本发明根据DNA芯片检测目标，从相关基因数据库中选取特异性基因序列作为探针；根据所选用的核酸序列进行探针序列及其布局设计，使所设计的探针组合对待测基因的杂交特异性强、探针之间的关联性好、探针阵列及其空间布局的优化；简便易行，技术要求低，并且探针不受探针分子大小种类的限制，能根据使用者的要求简便地制出符合目的的芯片。

本发明在设计合理的基础上，不断通过大量的实验调整，使本发明PCR扩增能在一个条件下反应，做到了PCR反应液I和II能够同程序扩增，对于样本量少时一台PCR仪即可完成，大大节约了实验室资源，而其他同类技术检测一个样本必须要两台以上PCR仪。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式详予说明。

本发明提供一种用于检测α和β地贫的试剂盒，主要由PCR试剂和低密度芯片两部分组成，具体如下：

a、PCR试剂由PCR反应液I和PCR反应液II组成，其中PCR反应液I由3对缺失型α引物、Taq酶等组分组成；PCR反应液II由1对非缺失型α引物和 2对β引物、Taq酶等组成，其特征在于3对缺失型α引物分别为3.7F和3.7R，4.2F和4.2R，SEAF和SEAR；1对非缺失型α引物为ATF和ATR；2对β引物为BF1和BR1，BF2和BR2。

b、低密度芯片由带负电荷的尼龙膜和点在膜上能检测α和β地贫的33条特异性探针组成。

本发明优选将开发的芯片建立在膜芯片的基础上：基因芯片由玻璃片或尼龙膜和固定在其上的探针阵列构成，二者基本原理相似，玻璃芯片的制备工艺复杂，检测过程繁琐，尤其是信号检测需要激光扫描仪，直接导致了其使用成本高昂，在市场特别是临床检测中不能得到有效的推广，因此其研发方向主要针对科学研究机构；膜芯片的开发则具有制备相对简单、操作简便、成本低廉等明显优势，十分有利于市场的推广，更能快速、有效地实现研究成果的产业化。

一、本发明具体技术实施方案

1、引物、探针设计及筛选

在Genebank数据库中调取α和β-珠蛋白基因序列，用DNAStar和Oligo6.0设计PCR扩增获取目的DNA片段，同时在这些片段上设计特异性识别待检的23种地贫探针，要求各探针Tm值相差不超过5℃，在同一温度下具有最适宜的杂交灵敏度和特异性。

引物和探针均为人工合成寡聚核苷酸，由上海英骏生物技术有限公司合成。序列合成完毕后由公司人员核对，然后根据需要稀释成所需浓度。通过大量实验筛选到了能够高效特异扩增的6对引物和33条能特异杂交的探针。此引物和探针长度或位置的改变均会降低本试剂盒的灵敏度、特异性和重复性，引物和探针序列如表2：α和β引物序列和表3：α和β探针序列所示。

表2

探针生产代号(序列编号)	探针名称	探针序列
			H1-1（SEQ ID NO：1）	41-42N	CTTGATACCAACCTG
H1-2（SEQ ID NO：2）	654N	AGGTTCTTTGAGTCCTT
			H1-3（SEQ ID NO：3）	-28N	GGGTTAAGGCAATAGCAA
H1-4（SEQ ID NO：4）	71-72N	GGCATAAAAGTCAGGG
			H1-5（SEQ ID NO：5）	17N	TCGGTGCCTTTAGTG
H1-6（SEQ ID NO：6）	βEN	GCCCTGTGGGGCAAGGTG
			H1-7（SEQ ID NO：7）	31N	TATTCTGAGTCCAAGCTAGGCC
H1-8（SEQ ID NO：8）	27/28M	ACTTGCTGGTGCAA
			H1-9（SEQ ID NO：9）	QSN	GCCCAGGGCCTCACCA
H1-10（SEQ ID NO：10）	CSN	TAGGCTGCTGGTGG
			H1-11（SEQ ID NO：11）	WSN	TGAGGCCCCTGGGCAG
H2-1（SEQ ID NO：12）	41-42M	TGCACCATGGTGTCTG
			H2-2（SEQ ID NO：13）	654M	AGGACTCAACCTCTGG
H2-3（SEQ ID NO：14）	-28M	TTGCTATTACCTTAAC
			H2-4（SEQ ID NO：15）	71-72M	CCTGACTTCTATGCC
H2-5（SEQ ID NO：16）	17M	GGTGCCTTTAAGTGA
			H2-6（SEQ ID NO：17）	βEM	GGGGCTAGGTGAACGTG
H2-7（SEQ ID NO：18）	31M	GCAGCTACAATCCAGCTACCA
			H2-8（SEQ ID NO：19）	IVS-I-1M	CATGAAAGTCAGGG
H2-9（SEQ ID NO：20）	QSM	GGTGGTAAGGCCCTG
			H2-10（SEQ ID NO：21）	CSM	CTTAGGTGCTGGTGG
H2-11（SEQ ID NO：22）	WSM	CTGGGCAGATTGGT
			H3-1（SEQ ID NO：23）	43M	GGTGTCTGTTTGAGGT
H3-2（SEQ ID NO：24）	-32m	CAGAAAGTGGTGGCTGGTG
			H3-3（SEQ ID NO：25）	-29M	CCTGACTTTTATTCC
H3-4（SEQ ID NO：26）	-30m	CCACAAGTATCACTAAGCTCGC
			H3-5（SEQ ID NO：27）	14-15M	TGGGCACAAAAGTCA
H3-6（SEQ ID NO：28）	CAPM	GAGGTTCTTTTAGTCCTTT
			H3-7（SEQ ID NO：29）	IntM	TGCATATAAATTGTAACTGA
H3-8（SEQ ID NO：30）	IVS-I-5M	AATCATGTTCATACCTC
			H3-9（SEQ ID NO：31）	3.7	GCTACTTGGGCAGCTAGGTGTCTGAGGTTGCT
H3-10（SEQ ID NO：32）	4.2	GGCTACATGCGGTGCACCCTGGTGTCTGTT

[0083]

H3-11（SEQ ID NO：33）

SEA

TAGCTGGGACGTTGCTATCAAGGTTA

表3

2、引物、探针浓度以及反应体系其他组分浓度确定

利用正交试验方法，通过大量实验对比，最终确定最优的PCR反应体系见表4：PCR反应液I配方和表5：PCR反应液II配方所示（DNA加样量为2μL，总反应体积为25μL）。

试剂	1人份(μL)
		水	17.2
10×PCR buffer（Qiagen）	2.5
		25mM MgCl₂（Qiagen）	0.5
2.5mM dNTP	2
		100μM 3.7F	0.07
100μM 3.7R	0.07
		100μM 4.2F	0.05
100μM 4.2R	0.05
		100μM SEAF	0.03
100μM SEAR	0.03
		5U/μL Hot Star Taq 酶(Qiagen)	0.5
总量	23

表4

试剂	1人份(μL)
		水	16.82
10×PCR buffer（Qiagen）	2.5
		25mM MgCl₂（Qiagen）	0.5
2.5mM dN（U）TP	2
		100μM ATF	0.06
100μM ATR	0.06
		100μM BF1	0.08
100μM BR1	0.08
		100μM BF2	0.05
100μM BR2	0.05
		1U/μL UNG	0.3
5U/μL Hot Star Taq 酶(Qiagen)	0.5
		总量	23

表5

3、PCR反应条件的确定

经过大量实验对比优化，最终确定的最佳反应条件为：

退火温度和退火时间对PCR扩增效率和特异性扩增影响较大，上述条件优化结果显示退火温度偏低会有非特异性扩增信号导致假阳性结果；温度偏高扩增效率偏低，灵敏度下降。本实验通过控制退火温度和退火时间可以做到特异性好，扩增效率高，灵敏度可达10ng/μL。

PCR反应液I和II可以同程序扩增，减少了PCR仪的需求量，而其他同类试剂需分两个程序扩增，至少需要两台PCR仪。

4、基因芯片设计

根据DNA芯片检测目标，从相关基因数据库中选取特异性基因序列作为探针；根据所选用的核酸序列进行探针序列及其布局设计，使所设计的探针组合对待测基因的杂交特异性强、探针之间的关联性好、探针阵列及其空间布局的优化；其主要优点是可以同时检测6种α-地贫（3种缺失型和3种非缺失型）以及17种突变型β-地贫，简便易行，技术要求低，并且探针不受探针分子大小种类的限制，能根据使用者的要求简便地制出符合目的的芯片。

膜条上的探针排列顺序如表6所示，由斑点显现的位置即可判断结果。经由芯片阅读仪扫描读取分析结果，必要时可进行DNA序列分析，以证实结果的准确性。根据选择的6种α-地贫（3种缺失型和3种非缺失型）以及17种突变型β-地贫，设计探针阵列（11×3）。

41-42N

654N

-28N

71-72N

17N

βEN

31N

27/28M

QSN

CSN

WSN

41-42M

654M

-28M

71-72M

17M

βEM

31M

IVS-I-1M

QSM

CSM

WSM

43M

-32M

-29M

-30M

14-15M

CAPM

IntM

IVS-I-5M

3.7

4.2

SEA

表6

表6中：1、每一个方格代表一种探针，用以检测诊断不同的地贫基因型。2、3种缺失型α-地贫以CSN、QSN和WSN一起作为正常对照。表7为膜条上各位点代表的意义及其与正常对照的关系。

表7

5、杂交条件的确定

杂交温度对最后结果的判读影响很大，杂交温度偏低会导致PCR产物与膜条上的探针非特异结合，从而有可能误判为阳性；杂交温度偏高会导致目的产物与目的探针的结合效率下降，杂交信号强度减弱，从而有可能误判为阴性。洗膜时间和显色时间的长短对杂交结果也会有类似的影响。通过一系列优化实验，最终确定的杂交、洗膜和显色等最适条件如下：

5.1、杂交

含取15mL塑料离心管，放入标有样品编号的膜条（应在膜条的一角用铅笔标记），加入A液（2×SSC、0.1%SDS）5-6mL及PCR反应液I、II中所有（两管共50μL）PCR产物，拧紧管盖，再回旋一圈稍拧松。将离心管放入沸水浴中加热10分钟（确保杂交液液面完全位于沸水浴液面之下），取出拧紧盖子，放入杂交箱43℃杂交1.5小时以上，但不超过4小时。

取50mL塑料管，加入40mL B液（0.5×SSC、0.1%SDS）于杂交箱中进行预热至43℃。

5.2洗膜

取出膜条，移至装有预热B液的50mL管中，于43℃轻摇洗涤15分钟（每管40mL溶液，最多可同时洗涤4张膜）。

5.3、显色

按A液：POD=2000:1配制孵育液（单做两张膜只需4μLPOD母液，配制成8mL使用液，做四张膜可用6μLPOD母液，配制成12mL使用液），室温轻摇浸泡30分钟，弃去POD溶液。用A液室温轻摇洗两次，每次5分钟。用C液（0.1mol/L柠檬酸钠，pH5.0）室温洗膜1-2分钟，同时配制显色液（各成份比例：19mL C液，1mL TMB，2μL 30%的H₂O₂）。将膜条浸泡于显色液中避光显色5至10分钟即可观察结果。

二、本发明与现有同类技术的比较

本发明和现有一次试验能同检测缺失型α地贫、非缺失型α地贫和β地贫的同类专利相比，本发明增加了现有同类同时检测三种地贫专利中未见报道的2种β地贫（-30和-32）和1种非缺失型α地贫（α^WSα），这3种基因型在中国的发生率不低，不检测会大大增加地贫漏检的风险，增加重型地贫患儿的出生概率，给家庭和社会带来严重的负担。在检测23种地贫的基础上，做到了PCR反应液I和II能够同程序扩增，对于样本量少时一台PCＲ仪即可完成，大大节约了实验室资源，而其他同类专利检测一个样本也必须要两台ＰＣＲ仪。

1、本发明同现有技术中利用基因诊断技术检测地贫的对比如表8所示。

表8

2、本发明试剂盒检测临床样本中地贫发生情况

利用本试剂盒检测临床有地贫症状样本200例，所有样本均采用金标准测序法进行测序验证，检测结果见表9，统计分析对比结果见表10。

表9

表10

上述表10测序结果中阳性是指本发明试剂盒检测范围内基因型阳性，阴性是指本发明试剂盒检测范围之外的其他基因型样本阳性或者阴性。

本发明试剂盒检测200例临床样本和金标准测序结果对比，准确性为100%；对非本试剂盒检测范围的其他β地贫和非缺失型α基因型阳性（β：-90M/N，30M/N和非缺失型α：59M/N）和阴性样本，本试剂盒检测结果均为阴性，阴性符合率为100%，特异性为100%。

如表11所示为200例临床样本中各基因型测序结果和本试剂盒检测结果符合情况统计。

表11

从表11可以看到200例有地贫症状样本各地贫基因型分布情况，本试剂盒检测范围内的23种地贫均有存在，且本试剂盒检测准确性和特异性均为100%，说明仅检测20种或者更少基因型是不能满足临床地贫筛查需求的，检测本试剂盒包含的23种地贫是有必要的。

另外本试剂盒检测其他同类专利未见报道的WS、-30和-32位点各6例、4例、3例，说明WS、-30和-32位点在有地贫症状的样本中是存在的，更进一步验证了检测WS、-30和-32位点的必要性。本试剂盒检测23种地贫，能满足地贫临床筛查的需求。

3、本发明试剂盒的性能指标：

3.1、分析灵敏度：本品能稳定检出的基因组DNA的最低浓度为10ng/μL；

3.2、测定准确性：用本产品检测已知突变或缺失类型的样本，结果基因突变或缺失类型，准确性为100%。；

3.3、分析特异性：检测非地中海贫血的DNA样品，结果显示全部为正常，特异性为100%。；

3.4、稳定性：本品在有效期内使用完全可满足以上各指标。

三、本发明试剂盒的使用

1、检验原理

PCR和DNA反向点杂交。

设计特异的PCR引物且其5′端用生物素进行标记，扩增获得一定长度的DNA片段，该片段包含了所要检测的各个位点。

根据检测位点碱基差异，按照碱基互补配对原则，设计特异性识别某种基因型的寡核苷酸探针组合，分别固定在尼龙膜的特定位置上，制成检测膜条。

PCR扩增产物与探针通过分子杂交反应及显色反应，观察检测膜条上各位点蓝色信号的有无，判断该探针是否与PCR产物杂交，从而确定待检样品的基因型。

2、试剂盒主要成份如表12所示。

表12

本试剂盒检测时需要用到的其它主要试剂（盒）全血基因组提取试剂，推荐选用：QIAGEN公司的全血DNA提取试剂盒或酚-氯仿试剂。

3、储存条件及有效期

储存条件：试剂盒Ⅰ置于-18℃以下保存；试剂盒Ⅱ置于2-8℃保存。如果打开包装各组分分开保存时，除了满足各自的温度保存条件之外，需特别注意TMB应该避光保存。有效期：6个月

4、适用仪器

PCR仪：（黑马9600）分子杂交箱：（FinePCR Combi-D24）

5、样本要求

本试剂盒样本来源为抗凝全血，所用抗凝剂为枸橼酸钠或EDTA，不能使用肝素抗凝。

样本采集：抽取静脉血5mL，放入含有抗凝剂的管中，标记好样本的姓名和编号等样本信息。

血样保存：抗凝全血在室温放置不超过24小时，2-8℃保存不超过一个月，-18℃以下冰箱保存不超过两年，-70℃冰箱可长期保存，冷冻保存时应避免反复冻融。

血样运输：抗凝全血运输时需用冰壶或泡沫箱加冰袋密封，应保证冰袋不化冻，且在途时限不宜超过72小时。

6、检验方法

本试剂盒对人基因组DNA的提取方法没有指定要求，一般可用实验室常规方法（酚-氯仿抽提法）或试剂盒提取人基因组DNA，试剂盒推荐使用QIAGEN公司的全血DNA提取试剂盒。

若采用QIAGEN的全血DNA提取试剂盒，直接按说明书加样；若用酚－氯仿或其它方法提取DNA，则要测定DNA浓度并进行浓缩或稀释后才能进行检测实验；本产品要求待检基因组DNA的浓度为10-200ng/μL。

6.1、PCR扩增

取出PCR反应液，在管壁上做好标记，于5000rpm离心2秒，而后向PCR反应液I、II中分别加入已提取的待测样品DNA 2μL，反应总体系为25μL。

每次实验另取一管PCR反应液，以2μL纯水为模板，作空白对照。

PCR按以下条件进行扩增：

6.2杂交

取15mL塑料离心管，放入标有样品编号的膜条（应在膜条的一角用铅笔标记），加入A液（2×SSC、0.1%SDS）5-6mL及PCR反应液I、II中所有（两管共50μL）PCR产物，拧紧管盖，再回旋一圈稍拧松。将离心管放入沸水浴中加热10分钟（确保杂交液液面完全位于沸水浴液面之下），取出拧紧盖子，放入杂交箱43℃杂交1.5小时以上，但不超过4小时。

6.3、洗膜

6.4显色

6.5、结果判读

6.5.1膜条上的探针排列顺序如表13所示。

41-42N

654N

-28N

71-72N

17N

βEN

31N

27/28M

QSN

CSN

WSN

41-42M

654M

-28M

71-72M

17M

βEM

31M

IVS-I-1M

QSM

CSM

WSM

43M

-32M

-29M

-30M

14-15M

CAPM

IntM

IVS-I-5M

3.7

4.2

SEA

表13

表13中位点最后一个字母“N”代表正常，“M”代表突变。

7、检验结果的读取

7.1、空白对照的膜条结果应为所有位点都不显色，否则本次实验可能发生污染，应全部重做。

7.2、所有临床样品10个正常位点应至少有6个位点有蓝色斑点出现，否则可能实验不成功，该样品应重检。

7.3、当样本为缺失型α纯合或双重杂合时，非缺失α所有位点都不显色。

7.4、检验方法的局限性

该试剂盒能检测中国人常见的缺失型α-地贫、非缺失型α-地贫以及突变型β-地贫基因缺陷，共包含6种常见类型的α-地贫（3种缺失型：--^SEA、-α^3.7、-α^4.2；3种非缺失型：α^CSα、α^QSα和α^WSα）以及17种突变型β-地贫（分别为：41-42M/N、654M/N、-28M/N、71-72M/N、17M/N、βEM/N、IVS-I-1M/N、27-28M/N、43M/N、-29M/N、14-15M/N、CAPM/N、IntM/N、-30M/N、-32M/N、31M/N和IVS-I-5M/N），还有一些罕见的突变类型在本试剂盒检测范围之外，可能造成漏检，这类样本可用测序法进一步验证。

8、根据膜条上斑点显现的位置，读取相应位置上标注的基因型信息。参见以下各表所示：

8.1、正常（N/N）如表14。

表14

8.2、β-地贫杂合子（例654M/N）如表15。

表15

8.3非缺失型α-地贫杂合子（例α^CS α/αα）如表16。

表16

8.4、缺失型α-地贫（例-α^3.7/αα）如表17。

表17

8.5、β-地贫复合非缺失型α地贫（例654M/N，α^CSα/αα）如表18。

表18

8.6、β-地贫复合缺失型α地贫（例654M/N，-α^3.7/αα）如表19。

表19

8.7、非缺失型α地贫复合缺失型α地贫（例α^QSα/-α^3.7）如表20。

表20

8.8、缺失型α地贫纯合（例-α^3.7/-α^3.7）如表21。

表21

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。序列表

SEQUENCE LISTING

<110>亚能生物技术（深圳）有限公司

<120>α和β地中海贫血基因检测的核酸膜条及试剂盒

<160>45

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

aggttctttg agtcctt 17

<210>2

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

aggttctttg agtcctt 17

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gggttaaggc aatagcaa 18

<210>4

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ggcataaaag tcaggg 16

<210>5

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

tcggtgcctt tagtg 15

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gccctgtggg gcaaggtg 18

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

tattctgagt ccaagctagg cc 22

<210>8

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

acttgctggt gcaa 14

<210>9

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

gcccagggcc tcacca 16

<210>10

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

taggctgctg gtgg 14

<210>11

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

tgaggcccct gggcag 16

<210>12

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

tgcaccatgg tgtctg 16

<210>13

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

aggactcaac ctctgg 16

<210>14

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

ttgctattac cttaac 16

<210>15

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

cctgacttct atgcc 15

<210>16

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

ggtgccttta agtga 15

<210>17

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

ggggctaggt gaacgtg 17

<210>18

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

gcagctacaa tccagctacc a 21

<210>19

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

catgaaagtc aggg 14

<210>20

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

ggtggtaagg ccctg 15

<210>21

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>21

cttaggtgct ggtgg 15

<210>22

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

ctgggcagat tggt 14

<210>23

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>23

ggtgtctgtt tgaggt 16

<210>24

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>24

cagaaagtgg tggctggtg 19

<210>25

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>25

ccacaagtat cactaagctc gc 22

<210>26

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>26

ccacaagtat cactaagctc gc 22

<210>27

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>27

tgggcacaaa agtca 15

<210>28

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>28

gaggttcttt tagtccttt 19

<210>29

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>29

tgcatataaa ttgtaactga 20

<210>30

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>30

aatcatgttc atacctc 17

<210>31

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>31

gctacttggg cagctaggtg tctgaggttg ct 32

<210>32

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>32

ggctacatgc ggtgcaccct ggtgtctgtt 30

<210>33

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>33

tagctgggac gttgctatca aggtta 26

<210>34

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>34

gaaaattgga aatcctttt 19

<210>35

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>35

aagaactgga aatcctttt 19

<210>36

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>36

gttttccttg tcctcttc 18

<210>37

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>37

gttttccttg tcctcgtcct 20

<210>38

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>38

cctcttcctcgtgcaaattt 20

<210>39

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>39

cctcttcctc gtgcaaattt 20

<210>40

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>40

cgtctccatt gttttctttg 20

<210>41

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>41

tggcacgcat ctaaacg 17

<210>42

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>42

ttttctcaag gacgtgg 17

<210>43

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>43

ctctgcctgt tcacaaa 17

<210>44

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>44

ggctatcact cggttacttc at 22

<210>45

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>45

atctcacgct ctgctcctgt a 21 。

Claims

1.α和β地中海贫血基因检测的核酸膜条，包括一基底，和固定于所述基底上的特异性寡核酸探针，其特征在于，所述特异性寡核苷酸探针包括：

用于检测α-地中海贫血基因的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ IDNO：20-22、SEQ ID NO：31-33。

2.根据权利要求1所述的α和β地中海贫血基因检测的核酸膜条，其特征在于，所述基底为尼龙膜。

3.α和β地中海贫血基因检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

特异性扩增非缺失型α-地中海贫血基因的一对引物：

引物ATF:SEQ ID NO：34；

引物ATR：SEQ ID NO：35；

特异性扩增缺失型α-地中海贫血基因的三对引物：

引物3.7F：SEQ ID NO：36；

引物3.7R：SEQ ID NO：37；

引物4.2F：SEQ ID NO：38；

引物4,.2R：SEQ ID NO：39；

引物SEAF：SEQ ID NO：40；

引物SEAR：SEQ ID NO：41；

特异性扩增β-地中海贫血基因两对引物：

引物BF1：SEQ ID NO：42；

引物BR2：SEQ ID NO：43；

引物BF2：SEQ ID NO：44；

引物BR2：SEQ ID NO：45；

4.根据权利要求3所述的α和β地中海贫血基因检测的试剂盒，其特征在于，所述寡核苷酸探针固定在基底上。

5.根据权利要求4所述的α和β地中海贫血基因检测的试剂盒，其特征在于，所述寡核苷酸探针固定在尼龙膜上。

6.根据权利要求3所述的α和β地中海贫血基因检测的试剂盒，其特征在于，所述引物5’端标记生物素。

7.根据权利要求3所述的α和β地中海贫血基因检测的试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液I和PCR反应液II，所述的PCR反应液I各组分含量为：

去离子水：17.2μL；

10×PCR buffer：2.5μL；

25mM MgCl₂：0.5μL；

2.5mM dNTP：2μL；

100μM引物3.7F：0.07μL；

100μM引物3.7R：0.07μL；

100μM引物4.2F：0.05μL；

100μM引物4.2R：0.05μL；

100μM引物SEAF：0.03μL；

100μM引物SEAR：0.03μL；

5U/μL超纯Taq酶：0.5μL；

所述的PCR反应液II各组分含量为：

去离子水：16.82μL；

10×PCR buffer：2.5μL；

25mM MgCl₂：0.5μL；

2.5mM dATP、dCTP、dGTP、dUTP的等体积混合液：2μL；

100μM引物ATF：0.06μL；

100μM引物ATR：0.06μL；

100μM引物BF1：0.08μL；

100μM引物BR1：0.08μL；

100μM引物BF2：0.05μL；

100μM引物BR2：0.05μL；

1U/μL UNG：0.3μL；

5U/μL Taq酶：0.5μL。