CN103602752A

CN103602752A - 一种检测稀有缺失型地中海贫血的引物组和试剂盒

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Publication number: CN103602752A
Application number: CN201310656450.1A
Authority: CN
Inventors: 李印淑; 刘福平; 刘晶晶; 任维
Original assignee: YANENG BIOTECHNOLOGY (SHENZHEN) CO Ltd
Current assignee: YANENG BIOTECHNOLOGY (SHENZHEN) CO Ltd
Priority date: 2013-12-06
Filing date: 2013-12-06
Publication date: 2014-02-26
Anticipated expiration: 2033-12-06
Also published as: CN103602752B

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测稀有缺失型地中海贫血的引物组和试剂盒。可直接用于国内11种已知稀有缺失型地中海贫血进行快速、稳定的检测。本发明的用于检测稀有缺失型地中海贫血的引物组，包括引物组A和引物组B；所述引物组A包括检测α-地贫缺失基因型的12条引物，所述引物组B包括检测β-地贫缺失基因型的10条引物。本发明试剂盒可采用多重Gap-PCR技术对11种稀有缺失基因型进行检测，可以直接一次检测多达11种稀有缺失地贫基因型，较在产前诊断利用巢式PCR结合遗传分析操作简单、省时、节约成本，为更全面的进行地贫筛查创造条件，为婚前、产前检测和孕期胎儿的地中海贫血诊断提供科学的依据。

Description

一种检测稀有缺失型地中海贫血的引物组和试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测稀有缺失型地中海贫血的引物组和试剂盒。

背景技术

地贫是世界上最常见的人类单基因遗传血液病之一，被世界卫生组织列入危害人类健康的6种常见病，也是中国南方各省最常见、危害最大的遗传病。

α-地中海贫血（Thalassemia，以下简称α-地贫），是一组因α-珠蛋白链合成减少或不能合成，α-链/非α-链比例失衡为特征的遗传溶血性血红蛋白病。我国最常见的缺失类型为-α^3.7、-α^4.2、--^SEA3种，随着α-地中海贫血机制的进一步阐明，一些新的基因缺失类型相继被发现，例--^11.1、--^FIL、--^THAI、-α^27.6、-α^2.4、-α^2.8，--^11.1、--^FIL、--^THAI均是缺失了两个α基因，当与--^SEA结合时可产生一定量的HbBarts，而-α^27.6、-α^2.4、-α^2.8均是缺失了一个α基因，当这些基因型结合--^SEA时，会引起Hb H病，这些新缺失类型的发现说明我国α-地贫有较广的基因谱，对目前地贫基因缺陷的筛查有重要的补充作用，提醒我们要避免异常基因型的漏检。

β-地中海贫血(简称β-地贫)是位于11号染色体末端11p15.3位点上的人β-珠蛋白基因(HBB)的先天性遗传缺陷。β-缺陷的后果是珠蛋白肽链合成减少或缺如，导致Hb生成障碍，而产生溶血性贫血。β-地贫主要是因点突变(或少数几个核苷酸的插入或缺失)使β-珠蛋白肽链合成障碍(减少或缺如)所致。此外，由于β-珠蛋白基因簇的大片段缺失而导致的遗传性持续性胎儿血红蛋白综合征(hereditary persistence of fetal hemoglobin，HPFH)和δβ-地中海贫血(简称δβ-地贫)在中国人群中也占有相当的比例，其共同特征是基因发育阶段特异性表达失控而使出生后胎儿血红蛋白(fetal hemoglobin，HbF)持续增高，是一组遗传异质性很大的血红蛋白病。

目前世界上在不同种族中已报道了至少40种此类因β-珠蛋白基因簇的大段缺失而引起的血红蛋白病，中国人群中最常见的类型是β^{Chinese(Aγδβ)0}(中国型)、β^SEA ^β0（东南亚型，SEA）、β^{Thai(Aγδβ)0}（泰国型），另外β^{Yunnanese(Aγδβ)0}（云南型）、β^{Catonese(Aγδβ)0}（广东型）、β^Taiwaneseβ0(台湾型)也有报道。缺失型β-地贫杂合子与β-地贫点突变杂合子婚配后，有生育缺失突变复合β-地贫点突变患儿的风险，此类双重杂合子患儿多表现为中间型或重症β-地贫，也是需要重点预防的类型。缺失型β-地贫具有特异的表型，在临床上较易被发现，但目前暂时没有相关的基因检测试剂盒上市，给产前诊断带来一定困难，因此，开展并推广缺失型β-地贫的表型筛查和基因诊断技术，有助于我国β-地贫高发区产前诊断水平的进一步提高。

目前，地贫还没有效的根治方法，主要以预防为主。因此开展稀有缺失型地贫的检测，提早发现地贫异常基因的携带者，对指导婚前及产前诊断具有重要的意义。

1、现有地贫检测技术简介：

（1）Southern印迹杂交-限制性酶谱分析法：曾是α-地贫基因诊断的主要方法，但由于操作繁琐，所需时间较长，一般只适合研究使用，不适于临床的推广应用；（2）RFLP(限制性片段长度多态性)连锁分析：其先决条件是在该家庭中至少有一个患儿或一个正常儿，以前是β地贫产前诊断最常用的方法，限制性片段长度的差异反应了各种基因型的差异，是一种间接测试法，对部分家系不能诊断，且操作比较繁琐；（3）寡核苷酸探针技术：这一技术可快速简便地检测已知突变的地贫基因，具有很高的灵敏性和准确性，但一次杂交只能检测一种突变，而且还需要同位素探针，难以推广应用；（4）依赖探针连接扩增技术（MLPA)：MLPA能对所有的缺失基因型检测以及未知的基因型开展检测，具有高效、特异的特点，常用于α、β-地贫大片段缺失基因型的检测，但由于检测成本高，操作繁琐，耗时较长，检测流程长达16小时，且需要特殊的仪器设备，一般只用于研究使用，不便于分子筛查方法的推广应用；（5）测序技术：测序技术直接对DNA序列的分析，一直被认为是临床检测的金标准；目前测序技术面临着标本的处理（核酸提取）扩增标准化认证问题，信号检测、测序平台特异的出错和纠错问题，以及生物信息学方面可能出现的问题，临床验证程序和标准化问题等，一直没有有效的解决，因此还未能在临床中推广应用；（6）反向斑点杂交（Reverse Dot Blot，RDB）法：这一方法具有灵敏度高、特异性好和准确性高等优点，目前已广泛应用于α、β-地贫点突变的临床产前诊断和基因诊断。这种方法灵敏，但耗时较长，一般用于点突变检测；（7）实时荧光定量PCR（Taqman探针法）：实时荧光定量PCR是目前临床诊断系统最受欢迎的检测平台。在地中海贫血检测中，报道的均只局限于一种基因型的检测，工作量大，由于探针需要进行荧光标记，检测成本高；（8）Gap-PCR及其改进的技术：由于其易操作，此技术广泛用于缺失地贫的分子诊断，在缺失区域两端设计一对引物，正常情况下两引物扩增产物很长不属于扩增的范围，而出现缺失区域的时候能出现特异性的扩增。目前市场上以Gap-PCR开发的试剂盒只能检测中国最常见的3种缺型-α^3.7、-α^4.2和--^SEA，而不能检测--^11.1、--^FIL、--^THAI、-α^27.6、-α^2.4、-α^2.8等非常见的α-地贫缺失基因型和β^{Chinese(Aγδβ)0}(中国型)、β^SEAβ0（东南亚型，SEA）、β^{Thai(Aγδβ)0}（泰国型）、β^{Yunnanese(Aγδβ)0}（云南型）、β^Taiwaneseβ0(台湾型)等β-地贫缺失基因型。

2、现有产品及专利：

尽管检测地贫的方法和产品很多，但是目前尚未有直接、快速、同时检测多种稀有缺失型地贫的产品。本公司相关专利为《诊断α-地中海贫血的核酸膜条及试剂盒》（专利号为ZL200710074203.5）、《用于诊断β-地中海贫血的核酸杂交膜条及试剂盒》（专利号为ZL200510034015.0）和《α和β地中海贫血基因检测的核酸膜条及试剂盒》(专利号为ZL201210494748.2)，这些专利和本申请发明专利不属于同一个技术平台，与本申请发明专利相关的已经公开或者有权的专利相关统计对比如下，见表1。

表1与本申请专利相关的已经公开或者有权的部分专利

3、现有产品及其缺点：

（1）目前我国临床应用的诊断缺失型α地贫的试剂盒均是基于多重Gap-PCR原理开发的，如亚能生物技术（深圳）有限公司、深圳益生堂生物科技有限公司和广州达安基因公司各自开发的α-地中海贫血检测试剂盒，这些产品均只能实现这3种常见的缺失地贫基因型（--^SEA、-α^3.7、-α^4.2）的检测。

（2）目前我国临床应用的诊断β-地贫基因点突变的试剂盒均是基于PCR-RDB法，对缺失型β-地贫检测还未有上市的产品或已申请的发明专利。

（3）目前稀有型地贫的检测均是根据临床表型，借助现有地贫检测试剂盒并结合遗传分析父母基因型来实现的，没有一种快速、直接的用于检测稀有型地贫的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速、简单，可直接用于国内11种已知稀有缺失型(6种α-地贫缺失基因型：--^11.1、--^FIL、--^THAI、-α^27.6、-α^2.4、-α^2.8；5种β-地贫缺失基因型：β^{Chinese(Aγδβ)0}、β^SEAβ0、β^{Thai(Aγδβ)0}、β^{Yunnanese(Aγδβ)0}、β^Taiwaneseβ0)检测的引物组及试剂盒。

本发明的技术方案为提供一种用于检测稀有缺失型地中海贫血的引物组，包括引物组A和引物组B；

所述引物组A包括检测α-地贫缺失基因型的12条引物，所述12条引物的序列分别如下：引物A1：SEQ ID NO：1；引物A2：SEQ ID NO：2；引物A3：SEQ ID NO：3；引物A4：SEQ ID NO：4；引物A5：SEQ ID NO：5；引物A6：SEQ ID NO：6；引物A7：SEQ ID NO：7；引物A8：SEQ ID NO：8；引物A9：SEQ ID NO：9；引物A10：SEQ ID NO：10；引物A11：SEQ ID NO：11；引物A12：SEQ ID NO：12；

所述引物组B包括检测β-地贫缺失基因型的10条引物，所述10条引物的序列分别如下：引物B1：SEQ ID NO：13；引物B2：SEQ ID NO：14；引物B3：SEQ ID NO：15；引物B4：SEQ ID NO：16；引物B5：SEQ ID NO：17；引物B6：SEQ ID NO：18；引物B7：SEQ ID NO：19；引物B8：SEQ ID NO：20；引物B9：SEQ ID NO：21；引物B10：SEQ ID NO：22。

本发明的另一技术方案为提供一种用于检测稀有缺失型地中海贫血的试剂盒，包括PCR反应液A和PCR反应液B，所述PCR反应液A包含如上所述的引物组A，所述PCR反应液B包含如上所述的引物组B。

优选的，上述的用于检测稀有缺失型地中海贫血的试剂盒中，所述PCR反应液A还包括dNTP、taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液和PCR增强剂组合（5×Q Solution+Surfactin），所述PCR反应液B还包括dNTP、taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液和PCR增强剂组合（5×Q Solution+Surfactin）。

优选的，上述的用于检测稀有缺失型地中海贫血的试剂盒中，所述的PCR反应液A各组分含量为：

5×Q Solution：5μL；

10×CoralLoad PCR Buffer：2.5μL；

2.5mM dNTP：2.0μL；

25μM Surfactin:1.0μL;

100μM引物A1：0.051μL；

100μM引物A2：0.052μL；

100μM引物A3：0.05μL；

100μM引物A4：0.05μL；

100μM引物A5：0.047μL；

100μM引物A6：0.049μL；

100μM引物A7：0.035μL；

100μM引物A8：0.038μL；

100μM引物A9：0.04μL；

100μM引物A10：0.037μL；

100μM引物A11：0.05μL；

100μM引物A12：0.05μL；

5U/μL Hotstar-Taq DNA polymerase：0.5μL；

去离子水：9.451μL。

优选的，上述的用于检测稀有缺失型地中海贫血的试剂盒中，所述的PCR反应液B各组分含量为：

5×Q Solution：5.0μL；

10×CoralLoad PCR Buffer：2.5μL；

2.5mM dNTP：2.0μL；

25μM Surfactin:1.0μL;

100μM引物B1：0.03μL；

100μM引物B2：0.03μL；

100μM引物B3：0.033μL；

100μM引物B4：0.035μL；

100μM引物B5：0.028μL；

100μM引物B6：0.028μL；

100μM引物B7：0.036μL；

100μM引物B8：0.033μL；

100μM引物B9：0.04μL；

100μM引物B10：0.043μL；

5U/μL Hotstar-Taq DNA polymerase：0.5μL；

去离子水：9.664μL。

本发明有益效果：

1、本发明试剂盒可采用多重Gap-PCR技术对11种稀有缺失基因型进行检测，可以直接一次检测多达11种稀有缺失地贫基因型，较在产前诊断利用巢式PCR结合遗传分析操作简单、省时、节约成本，为更全面的进行地贫筛查创造条件，为婚前、产前检测和孕期胎儿的地中海贫血诊断提供科学的依据。

2、本发明根据文献已报道的各种稀有缺失型断裂点位置，在其两端设计Gap-PCR专用引物，以应用多重PCR对多种基因型进行同管检测为目的（两管分别对应α、β地贫），克服引物之间的相互影响，最终选择一批特异性好的引物，能满足临床快速、方便检测地贫的需求。

3、本发明试剂盒的各组引物的浓度梯度及PCR增强剂做了大量的优化工作，最终确定的浓度配方，可针对多重PCR体系中各个区域不同GC含量模板达到相似的扩增效率。

附图说明

图1gap-PCR检测3.7、4.2和SEA原理图解；

图2新发现α地贫的基因缺失类型图谱；

图3各个缺失型β-地贫基因型图谱；

图4本发明试剂盒对12例稀有缺失型α地贫样本检测结果；

图5本发明试剂盒对9例稀有缺失型β地贫样本检测结果；

图6本发明试剂盒对11种稀有缺失型地贫样本的检测结果。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。

现有市面上检测缺失型α-地中海贫血的产品只限于中国人群常见的--^SEA、-α^3.7、-α^4.2三种α-地贫基因，技术原理均基于Gap-PCR，引物设计特点如下图1所示，各种新发现的缺失型断裂位置如下图2所示。

从引物设计原理图和新缺失基因型图谱可以看出，现有市面产品检测会出现以下3种情况的漏检：（1）检出αα正常基因型时，可能会出现--^11.1、--^FIL、--^THAI的漏检，（2）检出--^SEA纯合子时会出现-α^27.6、-α^2.8的漏检，（3）检测出αα、-α^3.7、-α^4.2、--^SEA任一基因型时均会出现-α^2.4的漏检。这些漏检的产生可能会给患者家庭后代带来健康隐患，因此检测这些新的缺失型有重要意义。

虽然缺失型β-地贫具有特异的表型，在临床上较易被发现，但目前暂时没有与β^{Chinese(Aγδβ)0}、β^SEAβ0、β^{Thai(Aγδβ)0}、β^{Yunnanese(Aγδβ)0}、β^Taiwaneseβ0等β-地贫缺失基因型相关的基因检测试剂盒上市。我们根据各个基因型的断裂点位置图谱（见图3）设计特异Gap-PCR引物，建立了稀有缺失型地贫的基因诊断试剂盒。

实施例1

1、引物的设计及筛选：

本发明利用文献报道的各个缺失型引物对收集的临床已知基因型阳性样本进行确认，以此阳性样本作为阳性对照模板，进行引物筛选及PCR程序优化。

考虑到多重PCR体系中可多至5～6对引物，而且α基因簇之间的高度同源性和高GC含量，无法达到与β基因进行良好的同管扩增条件，因此将α、β两种类型的引物扩增分管操作。我们根据文献已报道的各种稀有缺失型断裂点位置（见表2），和相关基因数据库中的序列，在其两端设计Gap-PCR特异性扩增引物，以应用多重PCR对多种基因型进行同管检测为目的（两管分别对应α、β地贫），而多重PCR引物设计难度较大，我们通过控制以下几个关键点达到最优引物的筛选：（1）首先，通过设计软件评估各条引物间的兼容性，排除复杂引物二聚体的产生，降低非特异性扩增，（2）其次，将各条引物的退火温度设计在同一个温度范围内，避免不同退火温度引起的非特异性扩增和效率高低不等的现象，（3）最终，设计不同长度的扩增片段对各个目的产物进行区分。将设计好的引物进行随机组合，利用热启动PCR程序，优化退火温度梯度及退火延伸时间，最终选择一批特异性好的引物，能满足临床快速、方便检测地贫的需求。因此，引物的序列作为本发明的保护内容。各个稀有缺失基因型的扩增引物优选组合序列见表3。

表2新缺失基因型检测引物序列

基因型	5’断裂点	3’断裂点	参考序列
				--^11.1	31695-31724	42846-42867	NG000006.1
--^FIL	11684	43534	NG000006.1+Z69706.2
				-α^27.6	9079	36718	NG000006.1
-α^2.8	32485	35381	NG000006.1
				-α^2.4	36860	39241	NG000006.1
--^THAI	10664	44164	NG000006.1+Z69706.2
				β^{Chinese(Aγδβ)0}	48795	127698	NG000007.3
β^SEAβ0	313941	3982	AC104389.8
				β^{Thai(Aγδβ)0}	45595	124872	NG000007.3
β^{Yunnanese(Aγδβ)0}	47630	137630	NG000007.3
				β^Taiwaneseβ0	69997	71353	NG000007.3

2、PCR增强剂的筛选与优化

通过合理设计，选择特异性好的扩增引物，为了达到引物扩增效率更高，本申请还选择了一批不同的PCR增强剂或热稳定剂进行筛选优化。

PCR增强剂可增加所需PCR产物的产量或减少非特异性产物。有许多PCR增强剂，原理各不相同，且不能对所有PCR反应都起作用，根据作用原理可大致分为三类：

（1）、用于扩增高GC含量或形成复杂二级结构的模板（共溶剂）；

（2）、用于保护DNA聚合酶的活性和稳定性；

（3）、用于优化引物和模板的结合。

本申请先选择2种商品化的PCR增强剂Qiagen的5×Q Solution、Tiangen的5×Enhancer进行扩增效率验证，同时对上述几种类型的部分试剂进行尝试筛选及优化，诸如1%～5%DMSO（二甲基亚砜）、1%～5%甘油、1.25%～10%(v/v)甲酰胺、0.5mM～2mM甜菜碱、0.01%～0.1%(w/v)BSA（牛血清白蛋白）、0.1M～1M海藻糖，以及对一种环状脂肽Surfactin做了验证。

Surfactin（莎梵婷），是枯草芽孢杆菌产生的脂肽类表面活性剂，是一种大环内脂型脂肽类化合物，有较好的表面张力，在水溶液中呈“马鞍形”结构，我们推测这种结构可起到与具有大环结构的DMSO等亚砜类化合物增强PCR效率的类似效果，这种环状结构化合物通过破坏模板DNA大沟和小沟里带有供体和受体互补氢键构象的作用，或者通过限制DNA链的自由旋转而使得DNA骨架的相邻基团间位间排斥减小，进而提高复杂二级结构模板DNA的PCR扩增效率。

通过对比上述不同浓度的各种增强剂效果与不同搭配组合，发现以Qiagen的5×Q Solution作为主要的PCR增强剂、Surfactin做辅助增强剂这一组合体系，可以大大提高本发明试剂盒中2管多重PCR体系的扩增效率和特异性，而单独利用5×Q Solution、5×Enhancer、BSA、DMSO、甘油、海藻糖等任一种增强剂或者其他搭配组合均比5×Q Solution与Surfactin两者组合的效率有显著性降低，因此5×Q Solution与Surfactin为最佳增强剂组合，分别加入到A、B两管反应液中进行体系优化，最终确定Surfactin的终浓度为1μM。

表3

3、引物浓度以及反应体系其他组分浓度确定

引物终浓度范围在0.1～1μmol/L，MgCl₂终浓度选择1.5mM-9mM，等浓度的四种脱氧三磷酸腺苷（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）混合液dNTP终浓度选择100nM-300nM，Surfactin终浓度选择0.1μM～2.5μM，DNA聚合酶终浓度选择1-7.5U/反应，利用正交试验方法，通过不同浓度实验对比，最终确定最优的PCR反应体系配方见表4、表5。

其中，A、B两管体系中引物数量分别多达12和10条，而且各引物浓度对扩增效率影响较大，浓度太高会抵制其他引物的扩增甚至与其他引物发生非特异扩增，浓度太低会降低本身的扩增效率，为了使各个片段的扩增达到相似效果，在我们前期引物序列合理设计的基础上，我们进一步对各组引物的浓度梯度做了分批优化工作，最终确定的浓度配方，可针对各个区域不同GC含量模板达到相似的扩增效率。

表4PCR反应液A配方

试剂	1人份（μL)
		纯水（去离子水）	9.451
5×Q Solution（Qiagen)	5.0
		10×CoralLoad PCR Buffer（Qiagen)	2.5
2.5mM dNTP	2.0
		25μM Surfactin	1.0
100μM PrimerA1	0.051
		100μM PrimerA2	0.052
100μM PrimerA3	0.05
		100μM PrimerA4	0.05
100μM PrimerA5	0.047
		100μM PrimerA6	0.049
100μM PrimerA7	0.035
		100μM PrimerA8	0.038
100μM PrimerA9	0.04
		100μM PrimerA10	0.037
100μM PrimerA11	0.05
		100μM Primer A12	0.05
5U/μL Hotstar-Taq DNA polymerase	0.5
		总量	21.0

表5PCR反应液B配方

试剂	1人份（μL)
		纯水（去离子水）	9.664
5×Q Solution（Qiagen)	5.0
		10×CoralLoad PCR Buffer（Qiagen)	2.5
2.5mM dNTP	2.0
		25μM Surfactin	1.0
100μM PrimerB1	0.03
		100μM PrimerB2	0.03
100μM PrimerB3	0.033

100μM PrimerB4	0.035
		100μM PrimerB5	0.028
100μM PrimerB6	0.028
		100μM PrimerB7	0.036
100μM PrimerB8	0.033
		100μM PrimerB9	0.04
100μM Primer B10	0.043
		5U/μL Hotstar-Taq DNA polymerase	0.5
总量	21.0

注：DNA加样量为4μL，总反应体积为25μL。

3.PCR反应条件的确定

PCR反应条件以下表6步骤优化。

表6

经过不同退火时间及温度梯度的实验对比优化，反应液A、B可同台PCR仪器扩增，最佳反应条件为表7所示。

表7

退火温度和退火时间对PCR扩增效率和特异性扩增影响较大，上述条件优化结果显示退火温度偏低会有非特异性扩增条带，导致假阳性结果；温度偏高扩增效率偏低，灵敏度下降。本实验通过第一轮10个循环的touch down PCR程序对困难模板进行富集，再通过第二轮25个恒温退火PCR程序进行大量扩增，兼顾了目的产物扩增的特异性和高效性，灵敏度可达10ng/μL。

4.本发明具有上述PCR反应液A和PCR反应液B的检测稀有缺失型地中海贫血的试剂盒检测过程依次包括如下步骤：

（1）提取待检测样品DNA：从外周血提取基因组DNA，浓度在10～200ng。

（2）PCR扩增：以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物。

（3）电泳检测鉴定PCR产物：取PCR扩增中的产物3.0μL；点样于1.5%的琼脂糖胶外加适量核酸染料；在5V/cm电压下电泳约50分钟，取出于凝胶成像系统里观察结果并拍照保存。

（4）结果判读：各个缺失型扩增产物长度依次是612bp（--^11.1）、931bp（--^FIL）、1107bp（-α^27.6）、451bp（--^THAI）、779bp（-α^2.8）、636bp（-α^2.4）、320bp（β^{Chinese(Aγδβ)0}）、422bp（β^SEAβ0）、904bp（β^{Thai(Aγδβ)0}）、510bp（β^{Yunnanese(Aγδβ)0}）、743bp（β^Taiwaneseβ0）。

（5）对检测为阳性的PCR产物进行直接测序验证，测序用引物为扩增用引物。

5、本发明上述试剂盒对临床样本的检测情况：

参见图4（其中1～4：‐α^27.6；5～6：‐‐^FIL；7：‐α^2.8；8：‐α^2.4；9～11：‐‐^THAI；12：‐‐^11.1；13：空白对照；M：DL2000Markers）。

图5（其中1～5：β^{Chinese(Aγδβ)0}；6：β^SEAβ0；7：β^{Yunnanese(Aγδβ)0}；8：β^Taiwaneseβ0；9：β^{Thai(Aγδβ)0}；10：空白对照；M：DL2000Markers）。

图4、图5表明，利用上述试剂盒对已知的12例稀有缺失基因型α地贫阳性样本和9例β地贫阳性样本进行了PCR扩增电泳检测，条带大小相符，且把PCR产物送测序，可从测序结果中清晰查找到各个稀有缺失型阳性样本的断裂点位置，说明本发明试剂盒检测的准确率为100%。

实施例2

具有实施例1中PCR反应液A和PCR反应液B的检测稀有缺失型地中海贫血的试剂盒的使用：

1、预期用途

对国内11种已知稀有缺失型(--^11.1、--^FIL、--^THAI、-α^27.6、-α^2.4、-α^2.8等α-地贫缺失基因型和β^{Chinese(Aγδβ)0}、β^SEAβ0、β^{Thai(Aγδβ)0}、β^{Yunnanese(Aγδβ)0}、β^Taiwaneseβ0等β-地贫缺失基因型)进行检测，实现对上述11种已知稀有缺失型定性检测，为地贫的遗传筛查提供全面、可靠的依据。在做表型和遗传分析时，对于有中间型或重型α-地贫表型患者，用现有的α-地中海贫血检测试剂盒（针对-α^3.7、-α^4.2、--^SEA）检测有1.8kb一条电泳条带（提示结果为正常基因型αα/αα）、或检测仅有1.3kb一条带（提示结果为SEA纯合子--^SEA/--^SEA）时均可做6种稀有缺失型α地贫检测；对于有中间型或重型β-地贫表型患者，用现有市场上的β-地中海贫血的检测试剂盒（针对17种点突变）检测为正常基因型或有一个点突变的，均可做5种稀有缺失型β-地贫检测。

2、适用仪器

PCR基因扩增仪：ABI9700、黑马9600、C1000Touch^TM ThermalCycler(Bio-RAD)；电泳仪：Powerpac Basic（Bio-RAD）；凝胶成像分析系统：UV-3C（珠海黑马）。

3、储存条件及有效期

储存条件：试剂盒避光储存于-18℃以下，避免反复冻融。

有效期：6个月。

4、样本要求

（1）试剂盒样本来源为抗凝全血，所用抗凝剂为枸橼酸钠或EDTA，不能使用肝素抗凝。

（2）样本采集：抽取静脉血1～5mL入含有抗凝剂的管中，标记好样本信息。

（3）血样保存：抗凝全血在室温放置不超过24小时，2～8℃保存不超过一个月，-18℃以下保存不超过两年，-70℃可长期保存，冷冻保存时应避免反复冻融。

（4）血样运输：抗凝全血运输时需用冰壶或泡沫箱加冰袋密封，应保证冰袋不化冻，且在途时限不宜超过72小时。

5、检验方法

（1）DNA的提取：

本试剂盒对人基因组DNA的提取方法没有指定要求，一般可用实验室常规方法（酚-氯仿抽提法）或试剂盒提取人基因组DNA，推荐使用QIAGEN公司的全血DNA提取试剂盒。若采用QIAGEN的全血DNA提取试剂盒，直接按说明书加样；若用酚-氯仿或其它方法提取DNA，则要测定DNA浓度，必要时进行浓缩或稀释，将DNA浓度调整至10～200ng/μL后才能进行检测实验。

（2）PCR扩增

取出试剂盒的PCR反应液A或B，在管壁或管盖上做好标记，于5000rpm短暂离心，然后分别加入已提取的待测样本DNA4μL，反应总体系为25μL，设置阴、阳性对照，短暂离心后置于PCR检测仪中进行扩增。

扩增程序如表8所示。

（3）电泳检测:取3μL扩增产物直接点样电泳（已加电泳染料)，1.5%的琼脂糖胶外加适量核酸染料；5V/cm电压下电泳50分钟，电泳结束后，取出于凝胶成像系统里观察结果并拍照保存。

（4）实验成立条件的设定

1）本产品要求每次检测都应设置一个空白质控对照，以对污染进行监测，空白质控对照的结果应为电泳没有条带。若空白质控有一条或多条带，则提示本次实验有污染，应消除污染后重新检测。

2）结果判读：各个单一稀有型样本的扩增只出现一条带，结果如图6所示，泳道1～6分别为-α^27.6、--^FIL、-α^2.8、-α^2.4、--^11.1、--^THAI缺失基因型，泳道8～12分别是β^{Chinese(Aγδβ)0}、β^SEAβ0、β^{Yunnanese(Aγδβ)0}、β^Taiwaneseβ0、β^{Thai(Aγδβ)0}缺失基因型，泳道7为空白对照，泳道M为DL2000Markers。

6、检验结果的解释

（1）PCR扩增没有产物

1）确认DNA提取及PCR过程无操作失误。

2）提取的样品DNA浓度过低，PCR时应增加DNA用量。

3）患者基因型在本试剂盒检测范围外，本试剂盒无扩增。

（2）.扩增产物浓度太高：建议降低跑胶检测时的上样量或者选取较大点样孔进行跑胶。

7、结果

请参阅图6为利用上述试剂盒对11种稀有缺失型地贫样本的检测。其中1：-α^27.6；2：--^FIL；3：-α^2.8；4：-α^2.4；5：--^11.1；6：--^THAI；7：空白对照；8：β^Chinese ^(Aγδβ)0；9：β^SEAβ0；10：β^{Yunnanese(Aγδβ)0}；11：β^Taiwaneseβ0；12：β^{Thai(Aγδβ)0}；M：DL2000Markers。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.用于检测稀有缺失型地中海贫血的引物组，其特征在于，包括引物组A和引物组B；

所述引物组A包括检测α‐地贫缺失基因型的12条引物，所述12条引物的序列分别如下：引物A1：SEQ ID NO：1；引物A2：SEQ ID NO：2；引物A3：SEQ ID NO：3；引物A4：SEQ ID NO：4；引物A5：SEQ ID NO：5；引物A6：SEQ ID NO：6；引物A7：SEQ ID NO：7；引物A8：SEQ ID NO：8；引物A9：SEQ ID NO：9；引物A10：SEQ ID NO：10；引物A11：SEQ ID NO：11；引物A12：SEQ ID NO：12；

所述引物组B包括检测β‐地贫缺失基因型的10条引物，所述10条引物的序列分别如下：引物B1：SEQ ID NO：13；引物B2：SEQ ID NO：14；引物B3：SEQ ID NO：15；引物B4：SEQ ID NO：16；引物B5：SEQ ID NO：17；引物B6：SEQ ID NO：18；引物B7：SEQ ID NO：19；引物B8：SEQ ID NO：20引物B9：SEQ ID NO：21；引物B10：SEQ ID NO：22。

2.一种用于检测稀有缺失型地中海贫血的试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液A和PCR反应液B，所述PCR反应液A包含如权利要求1所述的引物组A，所述PCR反应液B包含如权利要求1所述的引物组B。

3.根据权利要求2所述的用于检测稀有缺失型地中海贫血的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液A还包括dNTP、taq DNA聚合酶、Mg²⁺和PCR反应缓冲液、PCR增强剂组合，所述PCR反应液B还包括dNTP、taq DNA聚合酶、Mg²⁺和PCR反应缓冲液、PCR增强剂，所述PCR增强剂组合包括5×Q Solution和Surfactin。

4.根据权利要求2所述的用于检测稀有缺失型地中海贫血的试剂盒，其特征在于，所述的PCR反应液A各组分含量为：

5×Q Solution：5μL；

10×CoralLoad PCR Buffer：2.5μL；

2.5mM dNTP：2.0μL；

25μM Surfactin:1.0μL;

100μM引物A1：0.051μL；

100μM引物A2：0.052μL；

100μM引物A3：0.05μL；

100μM引物A4：0.05μL；

100μM引物A5：0.047μL；

100μM引物A6：0.049μL；

100μM引物A7：0.035μL；

100μM引物A8：0.038μL；

100μM引物A9：0.04μL；

100μM引物A10：0.037μL；

100μM引物A11：0.05μL；

100μM引物A12：0.05μL；

5U/μL Hotstar-Taq DNA polymerase：0.5μL；

去离子水：9.451μL。

5.根据权利要求2所述的用于检测稀有缺失型地中海贫血的试剂盒，其特征在于，所述的PCR反应液B各组分含量为：

5×Q Solution：5.0μL；

10×CoralLoad PCR Buffer：2.5μL；

2.5mM dNTP：2.0μL；

25μM Surfactin:1.0μL;

100μM引物B1：0.03μL；

100μM引物B2：0.03μL；

100μM引物B3：0.033μL；

100μM引物B4：0.035μL；

100μM引物B5：0.028μL；

100μM引物B6：0.028μL；

100μM引物B7：0.036μL；

100μM引物B8：0.033μL；

100μM引物B9：0.04μL；

100μM引物B10：0.043μL；

5U/μL Hotstar-Taq DNA polymerase：0.5μL；

去离子水：9.664μL。