CN103173534A

CN103173534A - 一种定量检测TRECs基因的实时荧光定量PCR试剂盒及应用

Info

Publication number: CN103173534A
Application number: CN2012104719999A
Authority: CN
Inventors: 王晓川; 刘丹如; 王牧; 房聪
Original assignee: WUXI UNI-KING CLINICAL TESTING INSTITUTE Co Ltd
Current assignee: WUXI UNI-KING CLINICAL TESTING INSTITUTE Co Ltd
Priority date: 2012-11-20
Filing date: 2012-11-20
Publication date: 2013-06-26
Anticipated expiration: 2032-11-20
Also published as: CN103173534B

Abstract

本发明涉及一种用于定量检测TRECs基因实时荧光定量PCR检测试剂盒及其应用。本发明包括一个以巢式PCR技术为基础的PCR反应体系和以实时荧光PCR技术为基础的实时荧光定量（Real time）PCR反应体系。其中巢式PCR反应体系包括针对TRECs和β-actin基因的正、反向引物；荧光PCR反应体系包括针对TRECs和β-actin基因的正、反向引物和特异性荧光探针。该试剂盒可以快速地筛查新生儿免疫系统T细胞水平，具有高灵敏度和稳定性，以及非常好的重现性。此方法适用于TRECs定量检测，能应用于新生儿免疫系统功能筛查，具有实际的临床应用价值。

Description

一种定量检测TRECs基因的实时荧光定量PCR试剂盒及应用

技术领域

本发明属于体外核酸诊断领域，涉及一种定量检测游离T细胞受体切除环（T-cell receptor excision circles，TRECs）基因的实时荧光定量聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）试剂盒及其用途。

背景技术

原发性免疫缺陷病（Primary Immunodeficiency Disease，PID）是因免疫系统遗传缺陷或先天发育不全造成免疫功能障碍所致的免疫缺陷病，其总发病率为：美国1/10000，澳大利亚2.82/100000人，日本和瑞典1/5000人，我国香港地区1/8000人。国内缺乏全面的统计资料，如果按照1/10000的发病率，我国每年出生的2500万个新生儿中有2500个新发的PID病例，整个儿童期累计患者达到3万-6万例。原发性免疫缺陷病，与遗传相关，常发生在婴幼儿，可出现反复感染，严重时可威胁生命。因其中有些可能获得有效的治疗，因此及时诊断仍很重要。

2001年11月，美国疾病控制和预防中心（Centers for DiseaseControl and Prevention,CDC）在乔治亚洲首府亚特兰大召开专题研讨会，建立针对新生儿筛查（Newborn Screening,NBS）实验和早期识别PID的方案，以便能早期诊断和治疗PID患者。2009年美国CDC在美国维斯康星州进行重症联合免疫缺陷（Severe CombinedImmunodefieieney Disease，SCID）新生儿筛查。

按免疫缺陷性质的不同，原发性免疫缺陷病可分为体液免疫缺陷为主（即抗体缺乏为主的免疫缺陷）、细胞免疫缺陷为主以及两者兼有的联合性免疫缺陷三大类。此外，补体缺陷、吞噬细胞缺陷等非特异性免疫缺陷也属于本组。重症联合免疫缺陷病（Severe CombinedImmunodeficiency,SCID）是以T淋巴细胞缺乏或功能异常，伴或不伴有B淋巴细胞和NK细胞数量减少或功能缺陷为特征的一组疾病，新生儿发病率大约在1/50000至1/100000，该病发病年龄早，临床表现重，预后较差，如果没有得到及时的诊断和治疗，多在2岁内死亡。SCID是一种严重的联合免疫缺陷，患儿如果不进行有效的免疫重建，往往在婴儿期死亡，免疫重建的时间与预后的关系密切，如果在出生3个月内进行造血干细胞移植存活率接近95%，而3个月后进行造血干细胞移植存活率降至76%，因此将SCID纳入NBS非常必要。

目前SCID主要分为T^-B⁺SCID和T^-B^-SCID两大类，其中T^-B⁺SCID的致病原因有γc基因缺陷、JAK3基因缺陷、IL-7Rα基因缺陷、CD45基因缺陷、CD3δ/CD3ε/CD3ζ基因缺陷；T^-B^-SCID的致病原因有RAG1/2基因缺陷、DCLRE1C基因缺陷、ADA基因缺陷、DNA PKcs基因缺陷、网状组织发育不全。除此以外，SCID还包括Oemnn综合征、DNA连接酶Ⅵ、Cemunnos/XLF缺陷、CD40配体缺陷、CD40缺陷、嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）缺陷、CD3γ缺陷、CD8缺陷、ZAP-70缺陷、MHCⅠ类分子缺陷、MHCⅡ类分子缺陷、钙离子通道缺陷等。导致SCID的原因繁多，诊断非常困难，但是所有SCID的共同特征是成熟T细胞的数量显著降低。

T细胞在胸腺中分化的过程是发生在T细胞受体基因的重排，最终是V、D和J基因片段的结合；在每个V、D和J基因片段重排的过程中，都会有被切除的环状DNA产物，被切割下来的DNA形成游离T细胞受体切除环（T-cell receptor excision circles,TRECs），70%表达αβTCRs的T细胞在成熟晚期都产生

TRECs。TREC在T细胞中非常稳定，并不随着细胞的增殖而增加，而是不断被稀释，新生儿TRECs的水平最高，但在出生后5年TRECs的水平明显降低。利用定量PCR检测δRec-ψJαTRECs可以反映外周血最新产生的T淋巴细胞数量，病人T细胞中TRECs缺乏或不同程度的减少，可以作为SCID的新生儿筛查方法，筛查出T细胞成熟缺陷的新生儿，有利于早诊断早治疗，减少新生儿死亡。

目前已有的的TRECs试剂盒包括DNA提取及实时定量PCR两部分，由于TRECs为人类基因组发育重排过程中切割下来的环状基因，相对于基因组DNA，含量极低，要求极高的DNA纯度，而一步法实时定量PCR，对于临界值很难判定，造成假阴性，在筛查新生儿过程中会漏检，患儿错过最佳诊断及治疗时机。因此，需要一种新的TRECs试剂盒，人为地提高TRECs基因含量，减少假阴性结果，提高特异性。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种通过定量检测TRECs基因的拷贝数，用来筛查新生儿重症联合免疫缺陷的实时荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒适用于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，本发明能够检测新生儿T细胞的水平，判断新生儿免疫系统功能正常与否，在临床检验领域有良好的应用前景。

本发明的另一个目的是在于提供了筛查新生儿T细胞免疫缺陷中的应用，上述试剂盒所需的样本获取、储存方便，灵敏度和特异性高，检测方法简便、快速，实验结果可靠。

为了实现上述的目的，本发明提供：

一种定量检测TRECs基因的实时荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒主要包括DNA提取液、巢式PCR反应液、包含TRECs基因插入序列的标准品I、包含β-actin基因插入序列的标准品II、阴性对照品、空白对照品、包含TRECs基因的实时荧光引物和探针的荧光PCR反应液I和包含β-actin基因的实时荧光引物和探针的荧光PCR反应液II。

在本发明的一个优选方案中，巢式PCR反应液是由TRECs和β-Actin的PCR正向引物、反向引物,2×taq PCR MasterMix，1mM MgCl₂和无菌的超纯水组成。在本发明的一个具体方案中，TRECs基因的巢式PCR正向引物(SEQ NO:1)为5’-GAGGGCAGCCCTCTCCAAGGCAAAATGG-3’，反向引物(SEQ NO:2)为5’-TGATCTTGTCTGACATTTGCTCCGTGGT-3’。β-actin基因的巢式PCR正向引物(SEQNO:3)为5’-CTCATTTCCCTCTCAGGCATGG-3’，反向引物(SEQ NO:4)为5’-CCACGTCACACTTCATGATGGA-3’。

在本发明的一个优选方案中，荧光PCR反应液I是由TREC荧光PCR引物和探针、2.5×real time Mix、牛血清白蛋白（BSA）、20×PCREnhancer和无菌水组成。在本发明的一个具体方案中，TRECs基因的荧光PCR正向引物(SEQ NO:5)为5’-TGAGAACGGTGAATGAAGAGC-3’，反向引物(SEQ NO:6)为5’-CCATGCTGACACCTCTGG-3’和探针(SEQ NO:7)为FAM-ACGGTGATGCATAGGCACCTGCACC-TRAMA。

在本发明的一个优选方案中，荧光PCR反应液II是由β-actin荧光PCR引物和探针、2.5×real time Mix、BSA、20xPCR Enhancer和无菌水组成。在本发明的一个具体方案中，β-actin基因的荧光PCR正向引物(SEQ NO:8)为5’-CTCATTTCCCTCTCAGGCATGG-3’，反向引物(SEQ NO:9)为5’-CCACGTCACACTTCATGATGGA-3’和探针(SEQNO:10)为VIC-CTGTGGCATCCACGAAACT-TRAMA。

在本发明的一个优选方案中，荧光PCR反应液I和荧光PCR反应液II中所述的TRECs和β-actin基因的特异性探针均为Taqman探针，标记探针5’端的为一种荧光报告基团，是FAM、VIC、TET、JOE、ROX、CY3、CY5、HEX中的一种；3’端为荧光淬灭基团，是TAMRA、DABCYL、NFQ的一种。在本发明的反应体系中，可以使用一个或者多个荧光探针，所标记的荧光报告基团可以为一种或者两种。在本发明的一个具体方案中，TRECs标记探针5’端为FAM探针，3’端为TAMRA探针；β-actin标记探针5’端为VIC探针，3’端为TAMRA探针。

在本发明的一个优选方案中，标准品Ⅰ是含有插入TRECs基因131个核苷酸片段连接入pUC57载体质粒。所述的TRECs基因的插入序列(SEQ NO:11)为5’-TCGTGAGAACGGTGAATGAAGAGCAGACAGGGCCCGTGCCAGCTGCAGGGTTTAGGCACGGGGTGCAGGTGCCTATGCATCACCGTGCACAGGAGTGGGCACCTTTACAAAAACCAGAGGTGTCAGCATGG-3’。标准品Ⅰ用分光光度计测A₂₆₀定量，存放浓度为1.0×10⁸拷贝/ul、1.0×10⁷拷贝/ul、1.0×10⁶拷贝/ul、1.0×10⁵拷贝/ul、1.0×10⁴拷贝/ul、1.0×10³拷贝/ul 6个浓度梯度。

在本发明的一个优选方案中，标准品Ⅱ是含有插入β-actin基因70个核苷酸片段连接入pUC57载体质粒。所述的β-actin基因的插入序列(SEQ NO:12)为：5’-ATTTCCCTCTCAGGCATGGAGTCCTGTGGCATCCACGAAACTACCTTCAACTCCATCATGAAGTGTGACG-3’。标准品II用分光光度计测A₂₆₀定量，存放浓度为1.0×10⁸拷贝/ul、1.0×10⁷拷贝/ul、1.0×10⁶拷贝/ul、1.0×10⁵拷贝/ul、1.0×10⁴拷贝/ul、1.0×10³拷贝/ul 6个浓度梯度。

在本发明的一个优选方案中，阴性对照品为TRECs和β-actin重组质粒，其浓度为5.0×10⁵拷贝/ul。

在本发明的一个优选方案中，空白对照品为无菌的超纯水。

在本发明的另一个方面，还提供了一种通过定量检测TRECs基因的拷贝数，在筛查新生儿重症联合免疫缺陷病中的应用，实时荧光PCR试剂盒对新生儿T细胞免疫缺陷的检测方法，该方法包括下列步骤：

1）用DNA提取液对干血滤纸片DNA进行提取：

2）将标准品和待测样品加入巢式PCR反应液，用PCR检测仪对TRECs和β-actin基因进行扩增；

3）将扩增后的PCR产物加入实时荧光定量PCR反应体系，用荧光定量检测仪检测进行PCR检测；

4）通过比较待测样品和标准品的循环域值，根据标准曲线计算待测样品的起始TRECs和β-actin基因拷贝数。

本发明的有益效果：

1）样本获取、储存方便。本发明对新生儿干血滤纸片仅取3mm直径的纸片提取DNA即可完成该项目的检测，干血滤纸片为新生儿常规获得，并且用血量很少，减少新生儿抽取的血量，同时干血滤纸片有利于长期保存，大大降低了样本的获得、储存及运输等问题的出现。

2）灵敏度和特异性高。采取特异性引物、探针及巢式PCR，并对样本提取的DNA进行普通PCR扩增18个循环，有效的提高了检测基因的拷贝数，提高了对样本检测的灵敏性，而阳性样本中的TRECs几乎没有，使得样本检测结果的阴性与阳性很容易进行判定。

3）检测方法简单，检测速度快，结果以拷贝数表示，定量结果准确可靠。有利于在医院及实验室推广应用。

4）通过选择样本自身的管家基因β-actin作为内参，若扩增的内参的拷贝数在正常范围内，TRECs的拷贝数非常低，则阳性结果可靠，否则需重新测定，因此能更有效地减少假阳性结果的出现，从而保证数据的可靠性。

总之本发明灵敏度高，特异性好，检测方法简单快速，实验结果可靠。本发明填补了原发性免疫缺陷病的普查及新生儿筛查的空白，不仅可以筛查SCID免疫缺陷病，而且能够为其他与T细胞发育相关的原发性免疫缺陷病或其他系统疾病提供临床相关指征，有利于早起诊断及治疗。

附图说明

图1.TRECs标准品的扩增曲线及标准曲线。

图2.β-actin标准品的扩增曲线及标准曲线。

图3.正常儿童DNA样本TRECs基因的扩增曲线。

图4.SCID阳性儿童DNA样本TRECs基因的扩增曲线。

图5.空白对照品的扩增曲线。

图6.正常儿童DNA样本β-actin基因的扩增曲线。

图7.SCID阳性儿童DNA样本β-actin基因的扩增曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：精编分子生物学指南，F.M.奥斯柏等主编，科学出版社，1995，分子克隆实验指南（第三版）；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南；吕鸿声，科学出版社，1982，或接照制造厂商所建议的条件。

实施例1：试剂盒的制备

1.引物与探针的设计与合成

根据UCSC网站上UCSC Human Gene Sorter查询TRECs和β-actin基因序列（http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgNear），利用Primer3.0在TRECs的基因上设计巢式PCR的上下游引物和荧光定量PCR上下游引物和探针，其中TRECs的巢式PCR上游引物与该基因的结合位置在其实时荧光定量PCR上游引物与该基因结合位置的上游，TRECs的巢式PCR下游引物与该基因的结合位置在其实时荧光定量PCR下游引物与该基因结合位置的下游。所选引物对于基因的结合有很好的特异性，有较高的PCR扩增效率。引物与探针均委托Life Technologies公司进行合成，其中引物为PAGE纯化，探针为HPLC纯化。TRECs的探针5’端标记为FAM荧光基团，3’端标记为TAMRA荧光基团；β-actin的探针5’端标记为VIC荧光基团，3’端标记为TAMRA荧光基团。引物序列如表1。

表1插入基因、特异性引物以及探针序列

2.TRECs和β-actin标准品的构建

将TRECs基因和β-actin基因经巢式PCR特异性引物扩增产物的理论序列由上海博尚生物技术有限公司人工合成，将其克隆到pUC57载体上，受体菌为大肠杆菌DH5α菌株，将获得的重组质粒经双向DNA测序鉴定。提取阳性重组质粒，使用DNA微量分光光度计测定其浓度和纯度，根据公式copy数/μl=(浓度μg/ml×10^-9×6.02×10²³)/(324.5×2×bp数)计算出重组质粒的拷贝数，并根据测定的拷贝数进行梯度稀释，获得1.0×10⁸拷贝/ul、1.0×10⁷拷贝/ul、1.0×10⁶拷贝/ul、1.0×10⁵拷贝/ul、1.0×10⁴拷贝/ul、1.0×10³拷贝/ul 6个浓度梯度重组质粒标准品，即获得含有TRECs基因插入序列的标准品Ⅰ和含有β-actin基因插入序列的标准品Ⅱ，于-20℃保存。

3.阴性对照品的制备

将上海博尚生物技术有限公司制备的分别含有TRECs基因和β-actin基因的重组质粒的大肠杆菌DH5α菌株，分别提取质粒，使用DNA微量分光光度计测定其浓度和纯度，并根据测定的拷贝数进行稀释，获得5.0×10⁵拷贝/ul的阴性对照品，于-20℃保存。

4.空白对照品的制备

空白对照品为经过121℃高压湿热灭菌20分钟的milli-Q水。

5.巢式PCR反应液组成，如表2。

表2巢式PCR反应液组成

其中2×taq PCR MasterMix由天根生化科技有限公司（TIANGEN）制备。

6.荧光PCR反应液Ⅰ组成，如表3。

表3荧光PCR反应液Ⅰ组成

其中2.5×real time Mix和20×PCR Enhancer由天根生化科技有限公司（TIANGEN）制备。

7.荧光PCR反应液Ⅱ组成，如表4。

表4荧光PCR反应液Ⅱ组成

实施例2：试剂盒的使用

1．干血滤纸片DNA的提取

操作步骤如下：

A．用打孔器获得直径3mm的干血滤纸片，放入灭菌的1.5ml离心管中，加入90μl的Generation DNA purif.Soln I，3700rpm离心30秒，使滤纸片浸没在溶剂中；

B．静置15分钟后，3700rpm离心5分钟，尽量吸去溶液；

C．重复A-B步骤，其中静置时间为10分钟；

D．加入无菌的milli-Q水，3700rpm离心30秒，尽量吸去milli-Q水；

E．加入30μl Generation DNA Elution Soln II，3700rpm离心1分钟，置于99℃水浴锅中25分钟；

F．待冷却至室温后3700rpm离心30秒，当天使用可置于4℃，隔天使用应置于-20℃下冷藏。

2．样本检测

1）．巢式PCR扩增TRECs和β-actin基因

取步骤1提取的DNA样本按照巢式PCR反应液的组成配制成巢式PCR反应体系，体系各主要成分如下：

巢式PCR反应程序：

将配置好的巢式PCR反应管放入普通PCR仪开始扩增，反应程序如下：

表5巢式PCR反应程序

2）．实时荧光定量PCR检测巢式PCR扩增后的TRECs基因的拷贝数

按照荧光PCR反应液Ⅰ组成，配制实时荧光定量PCR反应体系，取步骤A扩增后反应液2.0μl，和由重组TRECs质粒配制成的6个标准品以及阴性对照品、空白对照品各2.0μl，体系各主要成分如下：

实时荧光定量PCR反应程序：

设置收集FAM荧光信号的荧光检测通道，将反应管放入荧光PCR仪（ABI 7300）开始扩增，反应程序如下：

表6实时荧光定量PCR反应程序

3）．实时荧光定量PCR检测巢式PCR扩增后的β-actin基因的拷贝数

按照荧光PCR反应液Ⅱ组成，配制实时荧光定量PCR反应体系，取步骤A扩增后反应液稀释1000倍后的稀释液2.0μl，和由重组β-actin质粒配制成的6个标准品以及阴性对照品、空白对照品各2.0μl，体系各主要成分如下：

实时荧光定量PCR反应程序：

设置收集VIC荧光信号的荧光检测通道，将反应管放入荧光PCR仪（ABI 7300）开始扩增，反应程序如2）步骤相同。

4）结果判断

基线范围的Ct值（循环数）为6-15或由软件自动选择，设定阈值超过无规则扩增曲线的最高值。荧光PCR仪不同，所得基线范围的Ct值有所不同。

5）质控标准

各类对照质控品判断结果如下表：

表7质控品标准检测结果

两基因的重组质粒作为标准品经扩增扩增做出标准曲线，当相关系数>0.99可用于TRECs和β-actin拷贝数的定量分析，否则要重新实验。图1为TRECs重组质粒的标准品的扩增曲线，以及根据该曲线得到的标准曲线。图2为β-actin重组质粒的标准品的扩增曲线，以及根据该曲线得到的标准曲线。

6）结果报告

图3为临床SCID阴性样本的TRECs实时荧光定量PCR扩增曲线，所测样本的Ct值在12-28之间，在标准品的线性范围之内，定量结果为TRECs的拷贝数是10⁴~10⁵拷贝/μl左右，为阴性标本。图4为临床SCID阳性样本的TRECs实时荧光定量PCR扩增曲线，结果显示无扩增信号。图5为空白对照品的扩增曲线，结果无扩增信号。图6为临床SCID阴性样本的β-actin扩增曲线，所测样本的Ct值在14-30之间，在标准品的线性范围之内，定量结果为β-actin的拷贝数是10⁴~10⁵拷贝/μl左右。图7为临床SCID阳性样本的的β-actin扩增曲线，结果与图6一致。

样本结果的判断标准如下：

表8报告样本检测结果

本试剂盒临床样本检测结果与该样本使用流式细胞仪检测样本血液中T细胞数量及临床症状相一致，说明此方法结果可靠，灵敏度高和重复性好，为临床上筛查新生儿SCID提供了有效的诊断手段。

Claims

1.一种定量检测TRECs基因的实时荧光定量PCR试剂盒，其中包括DNA提取液、巢式PCR反应液、包含TRECs基因插入序列的标准品I、包含β-actin基因插入序列的标准品II、包含TRECs基因的实时荧光引物和探针的荧光PCR反应液I和包含β-actin基因的实时荧光引物和探针的荧光PCR反应液II。

2.权利要求1所述的试剂盒，其中所述的巢式PCR反应液包括：

1）巢式PCR扩增TRECs基因的正向引物，其碱基序列如SEQNO:1所示；

2）巢式PCR扩增TRECs基因的反向引物，其碱基序列如SEQNO:2所示；

3）巢式PCR扩增β-actin基因的正向引物，其碱基序列如SEQ NO:3所示；

4）巢式PCR扩增β-actin基因的反向引物，其碱基序列如SEQ NO:4所示。

3.权利要求1所述的试剂盒，其中所述的荧光PCR反应液I包括：

1）实时荧光PCR检测TRECs基因的正向引物，其碱基序列如SEQNO:5所示；

2）实时荧光PCR检测TRECs基因的反向引物，其碱基序列如SEQNO:6所示；

3）用于检测TRECs基因的探针，其碱基序列如SEQ NO:7所示；

其中所述的荧光PCR反应液II包括：

1）实时荧光PCR检测β-actin基因的正向引物，其碱基序列如SEQNO:8所示；

2）实时荧光PCR检测β-actin基因的反向引物，其碱基序列如SEQNO:9所示；

3）用于检测β-actin基因的探针，其碱基序列如SEQ NO:10所示。

4.权利要求1所述的试剂盒，其中所述的标准品I，其碱基序列如SEQ NO:11所示；其中所述的标准品II，其碱基序列如SEQ NO:12所示。

5.权利要求1至4所述的试剂盒，所述的特异性荧光探针为Taqman探针，标记探针5’端的为一种荧光发光基团，是FAM、VIC、TET、JOE、ROX、CY3、CY5、HEX中的一种；标记探针3’端的为一种荧光淬灭基团，是TAMRA、DABCYL、NFQ中的一种。

6.权利要求1至4所述的试剂盒，所述的Taqman探针5’端标记FAM，3’端标记TAMRA。

7.权利要求1至6所述的试剂盒在新生儿T细胞免疫缺陷检测中的应用。