CN105274232A - 一种一步法定量检测TRECs基因的实时荧光定量PCR试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于定量检测TRECs基因实时荧光定量PCR检测试剂盒及其应用。本发明包括一个以实时荧光PCR技术为基础的实时荧光定量PCR反应体系。荧光PCR反应体系包括针对TRECs和β-actin基因的正、反向引物和特异性荧光探针。该试剂盒可以快速地筛查新生儿免疫系统T细胞水平，具有高灵敏度和稳定性，以及非常好的重现性，此方法适用于TRECs的定量检测，能应用于新生儿免疫系统功能筛查，具有实际的临床应用价值。

Description

一种一步法定量检测TRECs基因的实时荧光定量PCR试剂盒及应用

技术领域

本发明属于体外核酸诊断领域，涉及一种一步法定量检测游离T细胞受体切除环(T-cellreceptorexcisioncircles，TRECs)的实时荧光定量聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)试剂盒及其应用。

背景技术

原发性免疫缺陷病(PrimaryImmunodeficiencyDisease，PID)是一类因免疫系统遗传缺陷或先天发育不全造成免疫功能障碍所致的免疫缺陷病，已发现超过200个病种。PID常发生在婴幼儿期，可出现反复感染，严重的可威胁生命。其中有些可能获得有效的治疗，因此及时诊断仍很重要。2008年美国CDC在美国威斯康辛州进行重症联合免疫缺陷(SevereCombinedImmunodeficiencyDisease,SCID)新生儿筛查。从2009年起，美国马萨诸塞州、路易斯安那州、纽约州、加利福利亚州、德克萨斯州、宾夕法尼亚州、密歇根州以及波多黎各自由邦等陆续开展新生儿SCID筛查，已有超过21个州进行了新生儿SCID筛查。在世界范围内，有美国、瑞典、德国、英国、法国、土耳其、日本、沙特阿拉伯、伊朗、中国香港等多个国家和地区已开展PID筛查。其总发病率为：美国1/10000，澳大利亚2.82/100000，日本和瑞典1/5000，我国香港地区1/8000。目前国内缺乏全面的统计资料，如果按照相关研究得出的PID总发病率1/10000估算，我国每年出生的2500万个新生儿中有2500个新发的PID病例，整个儿童期累及病例达到3万-6万例。

按免疫缺陷性质的不同，原发性免疫缺陷病可分为特异性和非特异性两大类，其中特异性PID占到80％的比例。特异性PID包括体液免疫缺陷(即抗体缺乏为主的免疫缺陷)、细胞免疫缺陷以及两者兼有的联合性免疫缺陷三大类。非特异性PID有补体缺陷、吞噬细胞缺陷等。SCID是以T淋巴细胞缺乏或功能异常，伴或不伴有B淋巴细胞和NK细胞数量减少或功能缺陷为特征的一组疾病，新生儿发病率大约在1/50000至1/100000，该病发病年龄早，临床表现重，预后较差，如果没有得到及时的诊断和治疗，多在2岁内死亡。SCID是一种严重的联合免疫缺陷，患儿如果不进行有效的免疫重建，往往在婴儿期死亡，免疫重建的时间与预后的关系密切，如果在出生3个月内进行造血干细胞移植，存活率接近95％，而3个月后进行造血干细胞移植存活率降低至76％，然而，SCID患儿因携带了母亲的抗体使得其在出生的最初几个月看上去是正常的，直到大约6个月时因出现反复感染才显出异常，因此将SCID纳入新生儿筛查非常必要。

目前，SCID主要分为T-B+SCID和T-B-SCID两大类。其中T-B+SCID的致病原因有γc基因缺陷、JAK3(JanusKinase3)基因缺陷、IL-7Rɑ基因缺陷、CD45基因缺陷、CD3δ/CD3ε/CD3ζ基因缺陷、Coronin-1A基因缺陷；T-B-SCID的致病原因有RAG1/2基因缺陷、DCLRE1C基因缺陷、ADA基因缺陷、DNAPKcs基因缺陷、网状组织发育不全。此外，SCID还包括Omenn综合征、DNA连接酶VI、Cemunnos/XLF缺陷、CD40配体缺陷、嘌呤核苷酸磷酸化酶(PNP)缺陷、CD3γ缺陷、CD8缺陷、ZAP-70缺陷、MHCI类分子缺陷、MHCII类分子缺陷、钙离子通道缺陷等。导致SCID的原因繁多，诊断非常困难，但是所有SCID的共同特征是成熟T细胞的数量显著降低。

T细胞在胸腺分化的过程是发生在T细胞受体基因的重排的时候，最终是V、D和J基因片段的结合；在每个V、D和J基因片段重排的过程中，都会有被切除的环状DNA产物，被切割下来的DNA形成游离T细胞受体切除环(TRECs)，70％表达ɑβTCRs的T细胞在成熟晚期都产生δRec-φJɑTREC。TRECs在T细胞中非常稳定，并不伴随细胞的增殖而增加，而是不断被稀释，新生儿TRECs的水平最高，但在出生后5年TRECs的水平明显降低。利用定量PCR检测δRec-φJɑTREC可以反映外周血最新产生的T淋巴细胞数量，病人T细胞中TRECs缺乏或不同程度的减少，可以作为SCID的筛查方法，筛查出T细胞成熟缺陷的新生儿，有利于早诊断早治疗，减少新生儿死亡。

申请号为201210471999.9的中国专利提供了一种定量检测TRECs基因的实时荧光定量PCR试剂盒及应用。该专利包括一个以巢式PCR技术为基础的PCR反应体系和以实时荧光PCR技术为基础的实时(Realtime)荧光定量PCR反应体系。该TRECs基因检测方法为两步法。相对于基因组DNA，由于TRECs为人类基因组发育重排过程中切割下来的环状基因，含量极低，因此两步法在DNA提取之后，采用第一轮巢式PCR扩增和第二轮荧光实时定量PCR扩增共两轮扩增，极大地提升了TRECs基因DNA含量，以此达到减少假阴性结果，提高特异性的目的。

然而，上述专利采用包括巢式PCR扩增和实时荧光定量PCR扩增的两步法，操作复杂繁琐、耗时长，关键的是，所用DNA提取方法提取的DNA丰度不够且纯度不高、巢式PCR带来扩增误差、巢式PCR之后的移液操作带来样品污染，诸多环节累计的误差最终导致漏检的可能性大。在新筛过程中如发生漏检，患儿将错过最佳诊断及治疗时机。

针对上述问题，尤其是两步法漏检临界阳性样本可能性较大的问题，本发明的目的在于提供一种能减少扩增误差和样品污染，具有更高灵敏度和特异度，同时操作简便快速的一步法TRECs基因检测试剂盒来填补国内这一空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种灵敏度和特异度更高且快速简便的通过定量检测TRECs基因拷贝数，用来筛查新生儿原发性T细胞免疫缺陷的实时荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒适用于目前市场上所有类型的荧光定量PCR扩增仪。本发明能够检测新生儿T细胞的水平，判断新生儿免疫系统功能是否正常，在临床检验领域有良好的应用前景。

本发明的另一个目的是在于提供一种筛查新生儿T细胞免疫缺陷中的应用，上述试剂盒所需的样本获取、运输、储存方便，灵敏度和特异性高，检测方法简便、快速，实验结果准确可靠。

为了实现上述目的，本发明提供：

一种一步法定量检测TRECs基因的实时荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒其中包括DNA提取液、包含TRECs基因插入序列的标准品I、包含β-actin基因插入序列的标准品II、包含TRECs基因的实时荧光引物和探针的荧光PCR反应液I和包含β-actin基因的实时荧光引物和探针的荧光PCR反应液II。

在本发明的一个方案中，荧光PCR反应液I是由TRECs荧光PCR引物和探针、2.5×realtimeMix、牛血清白蛋白(BSA)、20×PCREnhancer和无菌的超纯水组成。在本发明的一个具体方案中，TRECs基因的荧光PCR正向引物(SEQNO:1)为5’-TGAGAACGGTGAATGAAGAGC-3’，反向引物(SEQNO:2)为5’-CCATGCTGACACCTCTGG-3’和探针(SEQNO:3)为FAM-ACGGTGATGCATAGGCACCTGCACC-TAMRA。

在本发明的一个方案中，荧光PCR反应液II是由β-actin荧光PCR引物和探针、2.5×realtimeMix、BSA、20×PCREnhancer和无菌的超纯水组成。在本发明的一个具体方案中，β-actin基因的荧光PCR正向引物(SEQNO:4)为5’-CTCATTTCCCTCTCAGGCATGG-3’，反向引物(SEQNO:5)为5’-CCACGTCACACTTCATGATGGA-3’和探针(SEQNO:6)为VIC-CTGTGGCATCCACGAAACT-TAMRA。

在本发明的一个方案中，荧光PCR反应液I和荧光PCR反应液II中所述TRECs和β-actin基因的特异性探针均为Taqman探针，标记探针5’端的为一种荧光发光基团，其是FAM、VIC、TET、JOE、ROX、CY3、CY5、HEX中的一种；标记探针3’端的为一种荧光猝灭基团，其是TAMRA、DABCYL、NFQ中的一种。在本发明的反应体系中，可以使用一个或者多个荧光探针，所标记的荧光报告基团可以为一种或者两种。在本发明的一个具体方案中，TRECs标记的5’端为FAM探针，3’端为TAMRA探针；β-actin标记的5’端为VIC探针，3’端为TAMRA探针。

在本发明的一个方案中，标准品I是含有插入TRECs基因131个核苷酸片段连接入pUC57载体质粒。在本发明的一个具体方案中，所述TRECs基因的插入序列为(SEQNO:7)为5’-TCGTGAGAACGGTGAATGAAGAGCAGACAGGGCCCGTGCCAGCTGCAGGGTTTAGGCACGGGGTGCAGGTGCCTATGCATCACCGTGCACAGGAGTGGGCACCTTTACAAAAACCAGAGGTGTCAGCATGG-3’。标准品I用分光光度计测A260定量，存放浓度为1.0×10⁵copies/μl、1.0×10⁴copies/μl、1.0×10³copies/μl、1.0×10²copies/μl、1.0×10¹copies/μl5个浓度梯度。

在本发明的一个方案中，标准品II是含有插入β-actin基因70个核苷酸片段连接入pUC57载体质粒。在本发明的一个具体方案中，所述β-actin基因的插入序列为(SEQNO:8)为5’-ATTTCCCTCTCAGGCATGGAGTCCTGTGGCATCCACGAAACTACCTTCAACTCCATCATGAAGTGTGACG-3’。标准品II用分光光度计测A260定量，存放浓度为1.0×10⁵copies/μl、1.0×10⁴copies/μl、1.0×10³copies/μl、1.0×10²copies/μl、1.0×10¹copies/μl5个浓度梯度。

在本发明的一个方案中，阴性对照为正常儿童样本，其浓度拷贝TRECs>60-90copies/μl。

在本发明的一个方案中，空白对照为无菌的超纯水。

在本发明的另一个方面中，还提供了一种定量检测TRECs基因的拷贝数在筛查新生儿T细胞免疫缺陷中的应用、即使用实时荧光PCR试剂盒进行新生儿T细胞免疫缺陷检测的方法，该方法包括下列步骤：用过柱法对待检样品的干血滤纸片DNA进行提取；将提取的DNA加入实时荧光定量PCR反应体系，用实时荧光定量检测仪进行PCR检测；通过比较待测样品和标准品的循环阈值，根据标准曲线计算待测样品的起始TRECs和β-actin基因拷贝数。本发明使用的DNA提取试剂盒可以选用QIAGEN的QIAampDNAmini试剂盒。

在本发明的另一个方面中，所述DNA提取步骤包括以下操作：A.将待检样本的干血滤纸片三片，放入灭菌的离心管中，加入180μl细胞裂解液1；B.85℃温育10min；C.加入20μl蛋白酶K储备液，用枪头缓慢吸打，56℃温育1h；D.加入200μl细胞裂解液2，用枪头缓慢吸打以彻底混匀，70℃温育10min；E.加入200μl无水乙醇，用枪头缓慢吸打以彻底混匀；F.将步骤E得到的液体和纸片移入收集管内的离心柱中，8000rpm离心1min，将离心柱换入新的收集管，弃置原管；G.加入500μl洗脱液1，8000rpm离心1min，将离心柱换入新的收集管，弃置原管；H.加入500μl洗脱液2，14000rpm离心3min；I.将离心柱换入新的收集管，弃置原管，14000rpm离心3min；以及J.将离心柱换入新的离心管，弃置原管；打开离心柱盖，静置5min；加入75μl洗脱液3；室温下放置1min；8000rpm离心2min；将得到的提取液再次离心。其中，在进行所述步骤B、C、D和E中的每一个的操作后，将管盖内液滴轻轻甩入管中。

在本发明的又一个方面中，将待检样品、阳性对照、阴性对照的DNA提取物加入量以及空白对照替代DNA的无菌超纯水加入量调整为标准品DNA提取物加入量的2倍以上，例如4倍。

本发明的有益效果：

1)样本获取、运输、储存方便。本发明仅需打孔钻取三片直径3mm的圆形干血滤纸片(约9μl的血量)提取DNA即可完成该项目的检测，用血量很少，非常适合不宜大量取血的新生儿筛查。同时，干血滤纸片样本性质稳定利于较长时间的运输以及长期保存，极大地减少了样本在获取、储存及运输诸环节中问题的出现，为最后检查结果的准确性及稳定性奠定了良好基础。

2)灵敏度和特异性高。采用经过改进后的过柱法提取的DNA丰度、纯度高，正常样本TRECs基因的拷贝数由改进前的十几二十个拷贝提高到六十至八十个拷贝。在对PCR反应体系进行调整之后，正常样本TRECs基因的拷贝数进一步提高到几百个拷贝，这一系列的改进加之特异性引物和探针的采用，使检测方法的灵敏度和特异性较之两步法有了大幅提升。改进后的结果是，绝对阳性样本的TRECs数值为0，临界阳性样本的TRECs的数值极低(只有几个拷贝到十几二十个拷贝)。这样，阳性结果与阴性结果差异显著，非常易于进行判断。同时也极为有效地减少了假阴性结果的出现，以避免漏检的发生。

3)通过选择样本自身的管家基因β-actin作为内参，有效地减少了假阳性结果的出现，从而保证数据的可靠性。

4)方法简单，检测时程短，检测结果准确可靠，判定一目了然。非常便于在医院及实验室推广应用。

5)临界值的界定与国际标准接轨。检测方法的临界值是最重要的参数之一。在PID筛查领域，欧美研究组的研究水平目前处于领先地位。各研究组TRECs基因筛查的PCR检测方法并不相同，不同的实验方法得出的TRECs基因的临界值不同。综合分析，多数欧美研究组将TRECs的临界值界定在25copies/μl左右，包括在此领域几个最为知名的研究组在内。本发明的一步法得到的TRECs的临界值数值为60-90copies/μl，因反应体系内待检样本DNA的加入量是标准品DNA加入量的4倍，所以用得到的临界值除以4，TRECs的初始拷贝数在22.5copies/μl左右，比照多数欧美研究组的结果是较接近的。

总之，本发明采取检测TRECs基因的一步法，在提取DNA环节，应用不同的DNA提取途径并多次改进之后能够获得稳定的纯度极高的DNA，从而省去两步法中的第一轮巢式PCR扩增环节，直接进行荧光实时定量PCR扩增。简化了流程，节省了时间成本和试剂成本，同时也减少了因多一轮巢式PCR扩增而带来的扩增误差和移液污染。在荧光实时定量PCR扩增环节，摸索调整了PCR反应体系，使得阴性结果和阳性结果对比显著，易于临界值的判定，达到减少假阴性提高特异性的目的，这在之后一步法双盲检测临床阳性样本的试验中得到了验证。本发明的试剂盒及其应用灵敏度高，特异性好，检测方法简单快捷，实验结果可靠，填补了原发性免疫缺陷病的普查及新生儿筛查的空白，不仅可以筛查抗体缺陷为主的免疫缺陷病，而且能够为其他与T细胞发育有关的原发性免疫缺陷病或其他系统疾病提供临床相关指征，有利于早期诊断及治疗。

附图说明

图1A和1B分别是TRECs标准品实时PCR扩增曲线及标准曲线。

图2A和2B分别是β-actin标准品实时PCR扩增曲线及标准曲线。

图3是正常儿童DNA样本的实时PCRTRECs扩增曲线。

图4是SCID阳性儿童DNA样本的实时PCRTRECs扩增曲线。

图5是正常儿童DNA样本的实时PCRβ-actin扩增曲线。

图6是SCID阳性儿童DNA样本的实时PCRβ-actin扩增曲线。

图7A和7B分别是阳性对照样本TRECs和β-actin实时PCR扩增曲线。

图8A和8B分别是空白对照品TRECs和β-actin实时PCR扩增曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如下：精编分子生物学指南，F.M.奥斯柏等主编，科学出版社，1995；分子克隆实验指南(第三版)，D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001；细胞实验指南，吕鸿声，科学出版社，1982，或按照制造产商所建议的条件。

实施例1：试剂盒的制备

1、引物与探针的设计与合成

根据UCSC网站上UCSCHumanGeneSorter查询TRECs和β-actin基因序列(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgNear)，利用Primer3.0在TRECs和β-actin基因上设计荧光定量PCR上下游引物和探针。所选引物对于基因的结合有很好的特异性，有较高的PCR扩增效率。引物与探针均委托LifeTechnologies公司进行合成，其中引物为PAGE纯化，探针为HPLC纯化。TRECs探针的5’端为FAM荧光基团，3’端为TAMRA荧光基团；β-actin探针的5’端为VIC荧光基团，3’端为TAMRA荧光基团。引物序列如表1。

表1插入基因、特异性引物以及探针序列

2、TRECs和β-actin标准品的构建

TRECs和β-actin标准品由上海博尚生物技术有限公司合成，载体为pUC57载体，受体菌为大肠杆菌DH5ɑ菌株，将获得的重组质粒经双向DNA测序鉴定。提取阳性DNA微量分光光度计测定其浓度和纯度，根据公式copy数/μl＝(浓度μg/ml×10^-9×6.02×10²³)/(324.5×2×bp数)计算出重组质粒的拷贝数，并根据测定的拷贝数进行稀释，获得1.0×10⁵copies/μl、1.0×10⁴copies/μl、1.0×10³copies/μl、1.0×10²copies/μl、1.0×10¹copies/μl5个浓度梯度重组质粒标准品，即获得含有TRECs基因插入序列的标准品I和含有β-actin基因插入序列的标准品II，置于-20℃保存。

3、阳性对照品的制备

用临床绝对阳性的SCID儿童样本，过柱法提取DNA作为阳性对照品。TRECs基因检测结果拷贝数均为无数值，β-actin基因拷贝数>1.0×10³copies/μl，于-20℃保存。

4、阴性对照品的制备

用TRECs和β-actin基因检测结果均正常的临床SCID阴性儿童样本，过柱法提取DNA作为阴性对照品。浓度拷贝TRECs>90copies/μl，TRECs均值＝379copies/μl，于-20℃保存。

5、空白对照品的制备

空白对照为经过121℃高压湿热灭菌20分钟的milli-Q水。

6、荧光PCR反应液I的组成，如表2。

表2荧光PCR反应液I的组成

原料名称	终浓度
		2.5×real time Mix	1×
TRECs荧光PCR引物	0.5μM
		TRECs探针	0.15μM
BSA	0.4μg/μL
		20×PCR Enhancer	1×
ddH2O	适量
		DNA模板	2.0μL
总体积	20μL

其中2.5×realtimeMix和20×PCREnhancer由天根生化科技有限公司(TIANGEN)制备。

7、荧光PCR反应液II的组成，如表3。

表3荧光PCR反应液II的组成

原料名称	终浓度
		2.5×real time Mix	1×
β-actin荧光PCR引物	0.25μM
		β-actin探针	0.2μM
BSA	0.4μg/μL
		20×PCR Enhancer	1×
ddH2O	适量
		DNA模板	2.0μL
总体积	20μL

实施例2：试剂盒的使用

1.待检样本干血滤纸片DNA的提取

操作步骤如下：

A.将用打孔器打孔获得的直径3mm的待检样本的干血滤纸片三片，放入灭菌的1.5ml离心管中，加入180μl细胞裂解液1。

B.85℃温育10min。将管盖内液滴轻轻甩入管中。

C.加入20μl蛋白酶K储备液，用枪头缓慢吸打，56℃温育1h。将管盖内液滴轻轻甩入管中。

D.加入200μl细胞裂解液2，用枪头缓慢吸打以彻底混匀，70℃温育10min。将管盖内液滴轻轻甩入管中。

E.加入200μl无水乙醇，用枪头缓慢吸打以彻底混匀。将管盖内液滴轻轻甩入管中。

F.将步骤E得到的液体和纸片小心移入装在2ml收集管内的离心柱中，勿弄湿边沿。闭管，8000rpm离心1min。将离心柱换入新的2ml收集管，弃置原管。

G.小心打开离心柱盖，加入500μlBuffer洗脱液1，勿弄湿边沿。闭管，8000rpm离心1min。将离心柱换入新的2ml收集管，弃置原管。

H.小心打开离心柱盖，加入500μl洗脱液2，勿弄湿边沿。闭管，14000rpm离心3min。

I.将离心柱换入新的2ml收集管，弃置原管。14000rpm离心3min。

J.将离心柱换入新的1.5ml离心管，弃置原管。打开离心柱盖，静置5min。加入75μl洗脱液3。室温下(15℃-25℃)放置1min。8000rpm离心2min。将得到的提取液再次离心。当天使用可置于4℃，隔天使用应置于-20℃下冷冻。

本实施例使用的DNA提取试剂盒选自QIAGEN的QIAampDNAmini试剂盒，并且本实施例采用的DNA提取方法是在对此试剂盒原有提取方法做出改进后完成的。

2.样本检测

1)实时荧光定量PCR检测TRECs基因的拷贝数

按照荧光PCR反应液I组成，配制实时荧光定量PCR反应体系，取待检样本、阳性对照品、阴性对照品的DNA提取液以及空白对照品各8.0μl，重组TRECs质粒配制成的5个标准品2.0μl，体系成分如下：

实时荧光定量PCR反应程序：

设置收集FAM荧光信号的荧光检测通道，将反应管放入ABI7300荧光PCR仪中开始扩增，反应程序如下：

表4实时荧光定量PCR反应程序

2)实时荧光定量PCR检测β-actin基因的拷贝数

按照荧光PCR反应液II组成，配制实时荧光定量PCR反应体系，取待检样本、阳性对照品、阴性对照品的DNA提取液以及空白对照品各8.0μl，重组β-actin质粒配制成的5个标准品2.0μl，体系成分如下：

实时荧光定量PCR反应程序：

设置收集VIC荧光信号的荧光检测通道，将反应管放入ABI7300荧光PCR仪中开始扩增，反应程序同表4。

3)结果判断

基线范围的C_T值(循环数)为6-15或由软件自动选择，设定阈值超过无规则扩增曲线的最高值。荧光PCR仪不同，所得基线范围的C_T值有所不同。

4)质控标准

各类对照质控品判断结果如下表：

表5质控品标准检测结果

质控品	标准检测结果
		TRECs阴性对照	>60-90copies/μl
TRECs空白对照	无扩增信号
		β-actin阴性对照	>1.0×103copies/μl
β-actin空白对照	无扩增信号

两基因的重组质粒作为标准品经扩增做出标准曲线，当相关系数>0.99可用于TRECs和β-actin拷贝数的定量分析，否则要重新实验。图1A为TRECs重组质粒标准品的扩增曲线，图1B是根据该曲线得到的标准曲线。图2A为β-actin重组质粒标准品的扩增曲线，图2B是根据该曲线得到的标准曲线。

5)结果报告

图3为多个临床SCID阴性样本的TRECs实时荧光定量PCR扩增曲线，所测样本的C_T值在12-31之间，在标准品的线性范围之内，定量结果为TRECs的拷贝数>60-90copies/μL，为阴性样本。

图4为多个临床SCID阳性样本的TRECs实时荧光定量PCR扩增曲线，结果显示拷贝数极低或无扩增信号，即为阳性样本。

图5为多个正常儿童DNA样本的β-actin的扩增曲线，所测样本的C_T值在12-26之间，在标准品的线性范围之内，定量结果为β-actin的拷贝数>1.0×10³copies/μL。

图6为多个SCID阳性儿童样本的β-actin的扩增曲线，结果与图5基本一致。

图7A和图7B分别为阳性对照样本的TRECs和β-actin扩增曲线。

图8A和图8B分别为空白对照样本的TRECs和β-actin扩增曲线，结果均无扩增信号。

样本结果的判断标准如下：

表6样本检测结果

本试剂盒临床样本检测结果与该样本使用流式细胞仪检测样本血液中的T细胞数量、基因测序结果及临床症状相一致，说明此方法结果可靠，灵敏度高，重复性好，为临床筛查新生儿SCID提供了有效的诊断手段。

Claims (11)

1.一种一步法定量检测TRECs基因的实时荧光定量PCR试剂盒，其中包括DNA提取液、包含TRECs基因插入序列的标准品I、包含β-actin基因插入序列的标准品II、包含TRECs基因的实时荧光引物和探针的荧光PCR反应液I和包含β-actin基因的实时荧光引物和探针的荧光PCR反应液II。

2.权利要求1所述的试剂盒，其中所述的荧光PCR反应液I包括：

1)实时荧光PCR检测TRECs基因的正向引物，其碱基序列如SEQNO:1所示；

2)实时荧光PCR检测TRECs基因的反向引物，其碱基序列如SEQNO:2所示；

3)用于检测TRECs基因的探针，其碱基序列如SEQNO:3所示；

其中所述的荧光PCR反应液II包括：

1)实时荧光PCR检测β-actin基因的正向引物，其碱基序列如SEQNO:4所示；

2)实时荧光PCR检测β-actin基因的反向引物，其碱基序列如SEQNO:5所示；

3)用于检测β-actin基因的探针，其碱基序列如SEQNO:6所示。

3.权利要求1所述的试剂盒，其中所述标准品I的碱基序列如SEQNO:7所示；并且，其中所述标准品II的碱基序列如SEQNO:8所示。

4.权利要求1至3所述的试剂盒，所述用于检测TRECs基因的探针和用于检测β-actin基因的探针为Taqman探针，标记探针5’端的是一种荧光发光基团，其是FAM、VIC、TET、JOE、ROX、CY3、CY5、HEX中的一种；标记探针3’端的是一种荧光猝灭基团，其是TAMRA、DABCYL、NFQ中的一种。

5.权利要求1至3所述的试剂盒，所述Taqman探针5’端标记FAM或VIC，3’端标记TAMRA。

6.权利要求1至5所述的试剂盒在新生儿T细胞免疫缺陷检测中的应用。

7.根据权利要求6所述的试剂盒在新生儿T细胞免疫缺陷检测中的应用，其包括下列步骤：

用过柱法对待检样品的干血滤纸片DNA进行提取；

将提取的DNA加入实时荧光定量PCR反应体系，用实时荧光定量检测仪进行PCR检测；

通过比较所述待测样品和标准品的循环阈值，根据标准曲线计算待测样品的起始TRECs和β-actin基因拷贝数。

8.根据权利要求7所述的试剂盒在新生儿T细胞免疫缺陷检测中的应用，所述DNA提取步骤包括以下操作：

A.将待检样本的干血滤纸片三片，放入灭菌的离心管中，加入180μl细胞裂解液1；

B.85℃温育10min；

C.加入20μl蛋白酶K储备液，用枪头缓慢吸打，56℃温育1h；

D.加入200μl细胞裂解液2，用枪头缓慢吸打以彻底混匀，70℃温育10min；

E.加入200μl无水乙醇，用枪头缓慢吸打以彻底混匀；

F.将步骤E得到的液体和纸片移入收集管内的离心柱中，8000rpm离心1min，将离心柱换入新的收集管，弃置原管；

G.加入500μl洗脱液1，8000rpm离心1min，将离心柱换入新的收集管，弃置原管；

H.加入500μl洗脱液2，14000rpm离心3min；

I.将离心柱换入新的收集管，弃置原管，14000rpm离心3min；以及

J.将离心柱换入新的离心管，弃置原管；打开离心柱盖，静置5min；加入75μl洗脱液3；室温下放置1min；8000rpm离心2min；将得到的提取液再次离心。

9.根据权利要求8所述的试剂盒在新生儿T细胞免疫缺陷检测中的应用，其中，在进行所述步骤B、C、D和E中的每一个的操作后，将管盖内液滴轻轻甩入管中。

10.根据权利要求7所述的试剂盒在新生儿T细胞免疫缺陷检测中的应用，其中，所述加入实时荧光定量PCR反应体系的DNA提取液的量为制作所述标准曲线所加入的标准品的量的两倍以上。

11.根据权利要求10所述的试剂盒在新生儿T细胞免疫缺陷检测中的应用，其中，所述加入实时荧光定量PCR反应体系的DNA提取液的量为制作所述标准曲线所加入的标准品的量的四倍。