CN112662754B - 用于预测小耳畸形发生概率的组合物的应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开提供了用于确定胎儿在孕早期患小耳畸形概率的标志物组、方法和试剂盒的用途。本发明公开部分基于以下发现：相对于匹配的对照组，来自孕早期胎儿母亲外周血生物样品中的游离DNA上的生物标志物具有预测胎儿未来将发展为小耳畸形的风险。本文所公开了测定一组生物标志物用作对测试样品分类、预测小耳畸形发生概率、监控孕早期胎儿发育的组合物、试剂盒和方法。

Description

用于预测小耳畸形发生概率的组合物的应用方法

技术领域

本发明总体上涉及个性化医学领域，并且具体地，涉及用于预测涉及用于预测胎儿患小耳畸形风险的组合物和方法。

背景技术

小耳畸形(microtia)的表型多样，从不明显的外耳轻微畸形直到无耳畸形(anotia)。Hunter于2009年在前人分类标准的基础上结合胚胎发育、治疗手段提出的，他将外中耳畸形分为4型：I度、II度、III度、IV度(无耳畸形)。小耳畸形各亚型从发育生物学角度和病因学角度来看并无明显差异，因此，在病因学研究中大部分学者将各种亚型合而为一进行研究。小耳畸形患者约90％存在面部严重不对称，同时患侧还会出现耳道闭锁、面裂、咬合面倾斜等症状，严重影响患者的身心健康，由此导致的每个患者的诊疗和修复费用高达数十万元，给家庭和社会带来沉重负担。

在世界范围内，小耳畸形的发病率在不同人群和地理区域间差异较大。基于群体的统计资料显示小耳畸形的发病率为0.8-4.3/万人，而基于医院的统计显示其发病率为1.3-12.0/万人。在中国，出生缺陷监测数据显示小耳畸形的发病率为5.18/万人，是仅次于唇腭裂的第二大头面部先天畸形疾病。及早预测和评估，识别出真正小耳畸形高风险胎儿是减少该病发生的关键。目前国内用于小耳畸形发病风险评估的位点仍未见报道，亟待开发一种可用于检测先天小耳畸形的检测方法。

小耳畸形目前只能通过患儿出生后的整形外科手术来重建外耳组织，但对患者的外耳道闭锁、中耳畸形以及患侧听力丧失等症状仍旧无法通过手术的方式恢复，或需要巨额花费才能部分修复。

及早预测和评估，识别出真正小耳畸形高风险胎儿是减少该病发生的关键。针对小耳畸形的研究虽已发现了若干致病基因如HOXA2，但这些基因都是针对国外样本发现的，在国内的小耳畸形样本中尚未发现上述致病突变，因此挖掘中国人群的小耳畸形的致病突变，并基于突变进行发病风险预测亟待解决。

随着现代分子生物学技术的发展，游离核苷酸被广泛研究并被应用的重要分子标记物。游离核酸又称为胞外核酸，是广泛存在于血浆、唾液、肺泡灌洗液、尿液、精液、胸腹水等体液以及细胞培养液中的细胞外游离DNA(cell free DNA，cfDNA)和RNA(cell freeRNA，cfRNA)。研究发现，孕妇的血浆中含有胎儿来源cfDNA和cfRNA，使无创产前检测技术得到了快速的发展，避免了创伤性产前检测引起的流产、致畸风险。

多项研究已证实可以使用导致疾病发生的生物标志物进行疾病风险预测，特别是遗传病的风险预测，但目前为止小耳畸形发病风险的精准预测在中国人群的胎儿风险预测方面仍未开展。原因之一就是目前尚无明确报道我国小耳畸形的真正风险致病基因和致病突变。本专利针对中国小耳畸形家系进行了二代测序研究，发掘了小耳畸形的新风险致病基因FOXI3，并针对该基因上的致病突变开发了在孕早期即可检测小耳畸形发病风险的方法，对该病的评估和预防具有重要的意义。

本发明通过提供用于确定孕早期胎儿是否处于患小耳畸形风险的标志物组合和检测方法解决了该需求，还提供了相关优势。

发明内容

发明概述

本发明提供了一种方法，用于预测孕早期胎儿患小耳畸形的风险。该方法基于特定生物标志物的检测，其中这些生物标志物是通过对孕早期胎儿的生物样品进行基因型或序列分析得出的。本发明还提供了与此方法相配套的试剂盒，用于进行上述的基因型或序列分析。

在本发明的一个方面，我们提出了一种基于生物标志物的检测方法，用于预测孕早期胎儿患小耳畸形的风险。该方法特别强调了对特定单核苷酸多态性(SNP)位点的基因型分析，这些SNP位点与小耳畸形的风险相关。具体来说，本发明涉及检测表1中列出的特定SNP位点的变异。

在一些实施方式中，本发明通过分析特定的SNP位点，如FOXI3:c.706C/T、FOXI3:c.713G/A、FOXI3:c.718G/A和FOXI3:c.719C/T等，来评估胎儿患小耳畸形的风险。这些SNP位点的检测基于从孕妇的生物样品中提取的核酸，并且只有当这些特定位点的基因型与已知的高风险基因型匹配时，才表明胎儿存在患小耳畸形的增加风险。

在进一步的实施方式中，本发明提供了基于核酸序列分析的生物标志物组合物。特别是，本发明涉及对FOXI3基因的特定区域，例如c.706-726区域内的突变，进行核酸序列分析。这种分析有助于更精确地确定胎儿是否存在患小耳畸形的风险。

本发明还包括一种基于核酸或蛋白序列变异的生物标志物组合物的方法。具体来说，本发明涉及检测诸如GCGGCGCTTTCGCTTCCGACG、CGTCGGAAGCGAAAGCGCCGC等核酸序列的变异。这些变异的检测旨在评估与小耳畸形风险相关的特定序列改变，并且仅当检测到特定的变异时，才表明存在患病风险。

本发明还提供了一种基于特定生物标志物的检测方法，用于预测孕早期胎儿患小耳畸形的风险。此方法特别关注对FOXI3基因的特定单核苷酸多态性(SNP)位点的基因型分析，如c.706C/T、c.706G/A、c.718G/A、c.719C/T等位基因的突变。该方法包括从孕早期胎儿母亲的生物样品中提取核酸，并利用专门设计的基因检测试剂盒进行上述SNP位点的检测。这些试剂盒包括针对特定SNP位点设计的TaqMan探针和引物，以及其他必要的试剂。此外，该方法还可以包括利用测序技术获取更详细的基因型信息。所获得的测试结果将用于评估胎儿患小耳畸形的风险，其中分析包括将受试样本的生物标志物基因型与已知风险相关的基因型进行比较。

在本发明的一些实施方式中，使用基因芯片技术来检测与孕早期胎儿患小耳畸形风险相关的生物标志物。所述基因芯片包括固相载体，以及固定在该载体上的用于检测特定生物标志物的寡核苷酸探针。这些探针被设计用于检测表1-7所列的生物标志物的特定变异。此方法的关键在于利用基因芯片技术高效地检测多个生物标志物，以便快速评估胎儿的风险。

在另一些实施方式中，本发明使用基因检测试剂盒来检测一组与小耳畸形风险相关的生物标志物。所述试剂盒包含用于检测至少一种分离的生物标志物组的可测量特征的引物或芯片。这些分离的生物标志物选自表1-7所列的生物标志物，每一种生物标志物都有其可测量特征，如SNP位点变异。通过检测这些特征，可评估胎儿患小耳畸形的风险。

在本发明的一些实施方式中，使用测序方法来检测与孕早期胎儿患小耳畸形风险相关的生物标志物。所述测序方法包括使用专门设计的富集探针或随机探针来检测至少一种分离的生物标志物组。这些分离的生物标志物选自表1-7所列的生物标志物组，每一种生物标志物均具有可测量的特征，例如特定的SNP位点变异。本发明的这一方面特别强调使用高通量测序技术(如二代测序)，以全面分析并确定与小耳畸形风险相关的基因型变异。

本发明还提供了一种基于生物标志物检测结果的方法，用于确定孕早期胎儿患小耳畸形的风险。该方法涉及测定表1-7中所列生物标志物的N种生物标志物组的可测量特征，例如特定SNP位点的基因型或核酸序列变异。然后，通过对比受试者样本的生物标志物结果与已知的小耳畸形相关生物标志物特征，来确定样本是否具有患小耳畸形的风险。

在本发明的一些实施方案中，提供了一种综合评估孕早期胎儿患小耳畸形风险的方法。该方法包括以下步骤：(a)从孕妇样本中分离和测定特定SNP位点的生物标志物，如FOXI3基因的c.706C/T、c.706G/A、c.718G/A、c.719C/T等位基因突变；(b)基于这些数据，开发和优化一个统计模型，用于预测胎儿患小耳畸形的风险；(c)对模型进行验证，以确保其预测准确性；(d)将待测孕妇样本中检测到的特定SNP位点变异纳入模型中，从而评估和计算该样本胎儿患小耳畸形的风险。此方法的目的是提供一种准确且可靠的风险评估工具，用于临床决策支持。

根据详细说明和权利要求，本发明的其他特征和优势将是显而易见的。

发明详述

本发明基于的关键发现是，孕早期胎儿母亲的生物样品中分离的来自胎儿的核酸物质中，特定单核苷酸多态性(SNP)位点的变异，例如FOXI3基因的c.706C/T、c.706G/A、c.718G/A、c.719C/T等位基因突变，与小耳畸形风险增加有关联。本发明特别说明了这些特定SNP位点的检测方法，用于评估胎儿是否具有较高的小耳畸形风险。本发明描述了如何利用这些SNP位点作为生物标志物，用于分类测试样品，并据此预测小耳畸形的风险。

本发明提供了一套生物标志物组合、方法和试剂盒，用于确定胎儿是否存在小耳畸形风险。本发明的优势在于可以在妊娠早期准确评估胎儿患小耳畸形的风险，使临床医生能够及时监控和管理可能的胎儿发育异常。本发明尤其适用于早期识别出生缺陷风险因素，并在其未被明确诊断之前采取预防措施的胎儿。本发明详细描述了用于评估风险的特定生物标志物，以及这些标志物如何被用于风险分析。

本发明包括一种方法，通过分析与样品相关的数据集来确定胎儿是否有患小耳畸形的风险。该数据集包含特定SNP位点的变异分析数据，这些SNP位点被明确鉴别为与小耳畸形风险相关。这些数据集将输入到分析模型中，以产生关于胎儿小耳畸形风险的评估结果。本发明具体描述了分析数据的收集方法，包括特定SNP位点的基因型变异、核苷酸序列变异等，并提供了与这些变异相关的其他生物分子特征的分析。

本发明不仅考虑了通过公共数据库等资源中已知的变异位点编号、序列或特定生物标志物，还包括了与所举例说明的特定生物标志物(如FOXI3基因的特定SNP位点变异)不同的生物标志物变体。这些变体可能包括但不限于多态性、突变、结构变异等。本发明提供的示例性变异位点编号和相关数据库链接有助于鉴定其他可能与小耳畸形风险相关的生物标志物。适用的生物样品包括但不限于血液、血浆、血清、羊膜水等。在本发明的具体实施方式中，可以使用血浆作为生物样品。本发明描述了检测这些生物标志物的各种技术方法，包括但不限于基于芯片、探针、测序等的测定方法。

本发明提供了包含一种或多种分离的生物标志物的生物标志物组，这些生物标志物选自特定的SNP位点变异，如FOXI3基因的c.706C/T、c.706G/A、c.718G/A、c.719C/T等位基因突变，以及其他可能与小耳畸形风险相关的生物标志物。在所公开的方法中，所检测的生物标志物数量可以是1个或多个，具体取决于预测模型的设计和所需的预测准确度。本发明所述的方法对于确定孕早期胎儿是否有较高的小耳畸形风险非常有用，尤其适用于临床诊断和风险评估。

在本发明的某些实施方式中，分离的生物标志物组包含一种、两种、三种或多种分离的生物标志物。这些生物标志物中包含FOXI3基因的c.706C/T、c.706G/A、c.718G/A、c.719C/T等位基因突变，这些变异被鉴别为与小耳畸形风险相关。此外，本发明还考虑了其他可能与小耳畸形风险相关的生物标志物，以提供更全面的风险评估。

在本发明的一些实施方式中，分离的生物标志物组包含一种、两种、三种或多种分离的生物标志物。这些生物标志物来自FOXI3基因的细胞核定位序列，具体的在核酸层面的生物标志物位置为FOXI3,c.706-726。生物标志物的正义链核酸序列为：GCGGCGCTTTCGCTTCCGACG，生物标志物的反义链核酸序列为：CGTCGGAAGCGAAAGCGCCGC。在蛋白层面，生物标志物的位置为FOXI3,p.235-341，其序列为：RRKRKRR。本发明明确描述了如何鉴别和使用这些特定位置的生物标志物，以评估小耳畸形的风险。

本说明书和所附权利要求中所使用的“一个”和“所述”，除非文中有明确的指示，应理解为包括单个或多个相应对象。因此，例如，本文中对“生物标志物”的提及应包括单个或多个生物标志物的组合。本发明详细说明了如何通过组合不同的生物标志物来提高预测小耳畸形风险的灵敏度和准确性。

本文中使用的术语“孕早期”是指怀孕开始至怀孕第22周的时间段。在本发明的研究实施方案中，所采用的孕早期为怀孕8-14周。本发明的应用范围包括(但不限于)孕早期。本发明提供的生物标志物和方法同样适用于怀孕其他时期，以检测胎儿患小耳畸形的风险。本发明详细描述了在不同怀孕阶段应用这些生物标志物和方法的适应性。

如本文所使用的，术语“包含”、“包括”、“含有”及其任何变化旨在涵盖非排他的包括，如包含、包括或含有元素或元素列表的过程、方法、过程产物或物质组合物不仅包括这些成分，还可以包括这些过程、方法、过程产物或物质组合物中未明确列出或固有的其他成分。

如本文所使用的，术语“组”是指包含一个或多个生物标志物的组合物，如阵列或集合。该术语还可以表示本文所述的一种或多种生物标志物的表达类型的谱图或指数。用于生物标志物组的生物标志物的数目基于生物标志物值的特定组合的灵敏度和特异性值。

如本文所使用的并且除非另作说明，术语“分离”通常描述以从其天然环境(例如，如果它是天然存在的，自然环境)中除去并因此通过人手从其自然状态改变的物质组合物。分离的蛋白质或核酸不同于其自然存在的方式。

术语“生物标志物”是指生物分子或生物分子基因型，其变化与样本特征有关。在整个发明公开中，术语“标志物”和“生物标志物”是可互换使用的。例如，本发明的生物标志物与小耳畸形发生可能性提高有关。这些生物标志物包括(但不限于)变异位点、拷贝数变异、结构性变异、蛋白质变异。

本发明还提供了确定孕早期胎儿母亲所怀胎儿患小耳畸形风险的方法，所述方法包括测定得自所述孕早期胎儿母亲的生物样品中选自表1-7中所列的生物标志物的Ν种生物标志物中的每一种的可测量特征，并分析所述可测量特征以确定所述胎儿患小耳畸形的风险。

本发明提供了一种检测生物标志物的方法，该方法涉及测定来自孕早期胎儿母亲的生物样品中，选自表1-7中所列的N种生物标志物(组)的每一种的可测量特征，并分析这些可测量特征以确定所怀胎儿发生小耳畸形的风险。该方法包括使用基因芯片、基因检测试剂盒、捕获测序、全基因组测序等产品。其中，可测量特征包括但不限于生物标志物的基因型、核酸序列、蛋白序列，以及其他可识别样本间生物标志物差异的特征。

在本发明的一些实施方式中，使用基因芯片来检测生物标志物的可测量特征。所述基因芯片包括固相载体和固定在固相载体上的寡核苷酸探针。这些寡核苷酸探针用于检测至少1种分离的生物标志物组的可测量特征，其中所述分离的生物标志物选自表1-7所列的N种生物标志物(组)的每一种。本发明描述了基因芯片的具体构造和使用方法，以及如何通过该芯片有效检测所需生物标志物。

生物芯片在本发明中用于捕获和检测生物标志物。在本领域中，多种基因生物芯片是已知的，包括但不限于由Illumina、Affymetrix、华联(台湾)、博奥等公司生产的基因生物芯片。这些芯片通常包含具有表面的基底，将捕获试剂或吸附剂连接至基底表面。通常，所述表面包括多个可寻址的地址，每个地址具有结合的捕获试剂。这些捕获试剂可以是生物分子，如核酸、探针等，它们以特异性方式捕获其他生物标志物。本发明详细说明了如何利用这些生物芯片进行有效的生物标志物捕获和检测。

生物样品中mRNA的测量可以用作生物样品中相应基因生物标志物的基因型检测的替代。因此，还可以通过检测适当的RNA来检测本文所述的任何生物标志物或生物标志物组。

在一些实施方式中，本发明使用基因检测试剂盒来检测一组生物标志物的可测量特征，所述基因检测试剂盒包含用于检测至少1种分离的生物标志物组的可测量特征的引物或芯片，所述分离的生物标志物选自表1-7所列的生物标志物的N种生物标志物(组)中的每一种的可测量特征。

在一些实施方式中，本发明使用试剂盒结合测序方法来检测一组生物标志物的可测量特征，所述测序方法包含用于检测至少1种分离的生物标志物组的可测量特征的富集探针或随机探针，所述分离的生物标志物选自表1-7所列的生物标志物的N种生物标志物中的每一种的可测量特征。

所述试剂盒可以包括用于检测生物标志物的一种或多种试剂，用于容纳分离自孕早期胎儿母亲的生物样品的容器，和将试剂与生物样品或生物样品的一部分反应以检测生物样品中分离的生物标志物的存在或量的打印的说明书。所述试剂可以包装在单独的容器中。所述试剂盒还可以包含一个或多个对照参考样品和用于实施基因型测定的试剂。

所述测序产品试剂盒可以包含用于包含在所述试剂盒内的组合物的一个或多个容器。组合物可以处于液体形式或者可以是冷冻干燥的。适合用于所述组合物的容器包括(例如)瓶、小瓶、注射器和试管。所述容器可以由多种材料形成，包括玻璃或塑料。所述试剂盒还可以包含包装说明书，其含有确定小耳畸形风险的方法的书面说明。

“可测量特征”是可以确定并且与受试者中胎儿患小耳畸形风险相关的任何性质、特性或方面。对于生物标志物，这些可测量特征可以包括(例如)生物样品中生物标志物或其基因型中等位基因的存在状态，如核苷酸组合形式，如结构变异的形式，蛋白质的氨基酸存在形式，如氨基酸序列，结构变异形式。

在本发明的背景中，术语“样品”、“生物样品”包括采集自孕早期胎儿母亲并且含有表1-7中所列的一种或多种生物标志物的任何样品。在本发明的背景中，适合的样品包括(例如)血液、血浆、血清、羊膜水。在一些实施方式中，所述生物样品选自全血、血浆和血清。在具体的实施方式中，所述生物样品是血浆。如本领域技术人员将理解的，生物样品可以包括血液的任何部分或组分，无限制地，T细胞、单核细胞、嗜中性白细胞、红细胞、血小板和微囊，如外来体和外来体样微囊。在具体的实施方式中，所述生物样品是血浆。

在本发明中，术语“探针”指能与另一个分子的特定序列或亚序列或其他部分相结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可以直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。本发明中的示例性探针包括PCR引物以及基因特异性DNA寡核苷酸探针，例如固定于微阵列基底上的微阵列探针、定量核酸酶保护检验探针、与分子条形码连接的探针、以及固定于磁珠上的探针。

在本发明中，“试剂盒”中还含有用于标记核酸、蛋白质样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。

在本发明的背景中，术语“捕获试剂”是指可以特异性结合至靶标的具体生物标志物的化合物。该术语包括核酸、抗体、抗体片段、核酸基蛋白结合试剂、核酸捕获试剂、小分子或其变体。可以配置捕获试剂以特异性结合至靶标，具体的生物标志物。捕获试剂可以包括(但不限于)有机分子，如多肽、多核苷酸以及技术人员可鉴别的其他非聚合物分子。在本文所公开的实施方式中，捕获试剂包括可以用于检测、纯化、分离或富集靶标的具体生物标志物的任何试剂。任何本领域已知的亲合捕获技术可以用于选择性分离和富集/浓缩作为在所公开的方法中使用的生物培养基的复杂混合物的成分的生物标志物。

术语“基因型”或“等位基因”是指染色体DNA上的碱基位置上碱基组成，包括“A”、“T”、“C”、“G”四种碱基中的任意两种的组成形式。当生物标志物为插入或缺失时，也可表现为上述四种碱基的特定序列组成形式。

本文所公开的一些实施方式涉及确定孕早期胎儿母亲中胎儿患小耳畸形风险的评估方法。一种或多种生物标志物的基因型检测和/或生物标志物比值的确定可以用于确定胎儿患小耳畸形风险。可以将这些检测方法(例如)用于状况的早期评估以确定受试者是否对小耳畸形易感，以监控小耳畸形的发展或者治疗规程的进展，以评价小耳畸形的严重性，以帮助确定适合的治疗和预防措施。

可以无限制地通过如上所述的方法以及本领域中已知的任何其他方法确定生物样品中生物标志物的基因型和序列。然后，将因此所获得的基因型/序列数据进行分析分类法。在该方法中，根据算法调控原始数据，其中已通过训练数据组对算法进行预定义，例如，如本文所提供的实例中所述的。算法可以使用本文所提供的训练数据组，或者可以使用本文所提供的指导以通过不同的数据组产生算法。

在一些实施方式中，分析可测量特征来确定胎儿患小耳畸形风险包括预测模型的使用。在其他实施方式中，分析可测量特征来确定胎儿患小耳畸形风险包括将所述可测量特征与参考特征相比较。如本领域技术人员可以理解的，这种比较可以是与参考特征的直接比较或者是其中已将参考特征引入预测模型的间接比较。

为了产生小耳畸形预测模型，在训练组中使用稳健数据集，其包括已知对照样品和对应于所关心的小耳畸形分类的样品。可以使用公认标准选择样本容量。如以上所讨论的，可以使用不同的统计方法来获得高精度预测模型。

在一些实施方案中，在一些实施方案中，本发明提供了预测胎儿患小耳畸形风险的高低的方法，所述方法包括：(a)将孕妇分为训练组和验证组；(b)从训练组受试者采集的标本中测定表1-7所列的生物标志物组的N种生物标志物(组)中的可测量特征；(c)建预测模型，使用验证组对风险预测模型进行验证，检验所建模型的预测准确度；(d)将待测样本的生物标志物的可测量特征代入模型，计算该样本患小耳畸形的风险高低。

根据上述说明，显而易见的是可以对本文所述的发明做出改变和变化以使其适合于多种用途和条件。这些实施方式也在以下权利要求的范围内。

在本文中，对变量的任何定义中的元素列表的列举包括该变量作为任何单个元素或所列元素组合(或子组合)的定义。在本文中，对实施方式的列举包括作为任何单个实施方式或者与任何其他实施方式或其部分组合的实施方式。

表1小耳畸形致病变异位点列表

编号	染色体	物理位置	等位基因	生物标志物核酸	生物标志物蛋白
						1	chr2	88748283	C/T	FOXI3,c.706C	FOXI3,p.236Arg
4	chr2	88748276	G/A	FOXI3,c.713G	FOXI3,p.238Arg
						3	chr2	88748271	G/A	FOXI3,c.718G	FOXI3,p.240Arg
2	chr2	88748270	C/T	FOXI3,c.719C	FOXI3,p.240Arg

表2小耳畸形致病序列列表

编号	物理位置	链	序列
				1	FOXI3,c.706-726	正义链	GCGGCGCTTTCGCTTCCGACG
2	FOXI3,c.706-726	反义链	CGTCGGAAGCGAAAGCGCCGC
				3	FOXI3,p.235-341	N端-C端	RRKRKRR
4	FOXI3,p.235-341	C端-N端	RRKRKRR

附图说明

图1 FOXI3:c.706C>T杂合子一代测序峰图；

图2 FOXI3:c.713G>A杂合子一代测序峰图；

图3 FOXI3:c.718G>A杂合子一代测序峰图；

图4 FOXI3:c.719C>T杂合子一代测序峰图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未标明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

验证生物标志物判断小耳畸形可靠性

样本：从从中国医学科学院整形外科医院获取了4个小耳畸形家系。家系1包含32名成员，有8名成员患小耳畸形，家系2，3，4均为3名成员的家系，其中家系的结构均为父母和一名患病孩子。我们获取所有家系成员的外周血开始检测。

实验检测：使用天根生物的全血DNA提取试剂盒获取DNA，使用安捷伦公司提供的全外显子捕获试剂盒(v6)捕获所有样本的全外显子组，使用Illumina公司的Hi-seq X10完成二代测序。

数据分析：使用fastqc、cutadapt软件对数据进行质控，使用BWA软件将测序数据和人类参考基因组(hg19)进行比对，使用GATK软件获取外显子组上的突变位点。提取本发明提供的4个生物标志物的基因型如表3：

表3.针对4个家系成员验证小耳畸形风险

结果：从结果可见，所有患小耳畸形的家庭成员均至少存在一个生物标志物和本发明提供的生物标志物基因型不同，均被认定为高风险。而所有不患病的家系成员的4个位点的基因型均和本发明提供的生物标志物相同，被认定为低风险。可见，本发明专利能极好的使用生物标志物重现小耳畸形患病状态。

实施例2

使用一代测序检测方法检测出小耳畸形

样本：从中国医学科学院整形外科医院获取了4个小耳畸形家系。每个家系包含3名成员。四个家系先证者均为小耳畸形患者，先证者母亲再次怀孕第10周时，抽取母亲外周血进行未出生胎儿的小耳畸形检测。

实验检测：父母外周血采集使用天漠游离DNA(cfDNA)保存管(货号TS002)，cfDNA提取使用Zymo公司的快速cfDNA提取试剂盒(货号R1072)，血液保存和cfDNA提取的方法遵照试剂盒说明书。

引物设计和合成：分别针对FOXI3:c.706，FOXI3:c.713，FOXI3:c.718，FOXI3:c.719四个位点设计PCR引物，引物序列为：正向引物-5’GAGAGCCCTTCTTCGGACTT3’；反向引物-5’CTGCTCTCCTCCCAGAAATG3’PCR引物，测序引物为5’CTGCTCTCCTCCCAGAAATG3’，均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应和测序反应均在北京金诺锐杰基因科技有限公司完成。

数据分析：针对测序结果，使用ABI公司的SequenceScaner软件获取本发明专利提供的生物标志物序列，结果如图1、图2、图3、图4和表4。

表4.针对4个家系判定小耳畸形患病风险

结果：所有不同于本发明提供的生物标志物的序列均被预测为高风险，在本实施例中，生物标志物为序列CGTCGGAAGCGAAAGCGCCGC，携带不同于该序列的生物样本可判定为小耳畸形高风险。本实施例共检测了12个样本，其中4个样本为真实待检样本，结果发现2个样本的序列不同于本发明提供的序列，故判定为高风险，而2个样本与本发明提供的序列相同，故判定为低风险。经孕妇在第26周进行三维彩超排畸时，发现2个阳性样本的胎儿存在小耳畸形，而两个阴性样本所怀胎儿出生为正常健康。

实施例3

使用二代测序检测方法检测出小耳畸形

样本：从中国医学科学院整形外科医院小耳畸形患者群中选取了66个怀孕孕妇，孕龄为8-14周。

实验检测：父母外周血采集使用天漠游离DNA(cfDNA)保存管(货号TS002)，cfDNA提取使用Zymo公司的快速cfDNA提取试剂盒(货号R1072)，血液保存和cfDNA提取的方法遵照试剂盒说明书。二代测序使用安捷伦公司的全外显子捕获试剂盒(SureSelect HumanAll Exon V6)，测序使用Illumina公司建库试剂盒，二代测序在Illumina公司的Hiseq X10上完成，实验步骤严格按照公司提供的说明书进行。

数据分析：针对二代测序结果，使用BWA进行基因组比对，使用GATK完成变异位点获取，结果见表5。

表5二代测序获得样本的基因型结果

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结果：在66个检测的生物样本中，发现7个样本携带的生物标志物与本发明提供的生物标志物不同，判定为高风险。对这7个样本后期的三维彩超检查中均发现胎儿存在外耳畸形。但同时实施例还发现有8个生物样本携带的生物标志物与本发明提供的生物标志物相同，但后期的三维彩超中发现外中耳畸形，提示：本发明专利提供的位点存在假阴性，未发现假阳性。假阴性的引入是由于小耳畸形风险致病因素复杂，致病基因较多，仍需要更多的研究来挖掘新的小耳畸形风险生物标志物。

实施例4

使用taqman探针试剂盒判定小耳畸形风险

样本：从中国医学科学院整形外科医院小耳畸形患者群中选取了20个怀孕孕妇(取自实施例3的样本，包括所有三维彩超判定为小耳畸形的15例样本和5例非小耳畸形样本)，孕龄为8-14周。

cfDNA提取：父母外周血采集使用天漠游离DNA(cfDNA)保存管(货号TS002)，cfDNA提取使用Zymo公司的快速cfDNA提取试剂盒(货号R1072)，血液保存和cfDNA提取的方法遵照试剂盒说明书。

Taqman探针试剂盒：本发明针对所提出的生物标志物设计taqman探针，并设计检测试剂盒，试剂盒包括taqman探针和引物，荧光定量PCR体系内的酶、各类试剂。其中，taqman探针如表6。实验按照公司推荐的标准流程进行。检测结果见表7。

表6.taqman探针试剂盒包含的寡核苷酸序列

表7.Taqman探针试剂盒判定半侧颜面短小畸形结果

结果：使用taqman探针试剂盒所获得的检测结果与实施例4中采用二代测序方法检测的结果完全相同，表明预测小耳畸形的可靠性，同时也反映了试剂盒的可靠性。

本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.荧光定量PCR检测试剂在制备评估孕早期胎儿小耳畸形发生概率的试剂盒中的用途，所述荧光定量PCR检测试剂包含以下引物和探针：

第1组：正向引物：CCACTGTGGAGCCATTGCT

反向引物：AGAAAATGTTTGACAATGGGAACTT

探针1：CTTTCGCTTCCAACG

探针2：CTTCCGACGGAAGTT

第2组：正向引物：ATGAGGCAGTACTCTTGGTGCC

反向引物：AGTGGCTGCTGGGACATCA

探针1：CTCTCTTCTTCCGGCTTC

探针2：CTTCTGGCTTCCCACCCA

第3组：正向引物：CACTCCAGACCCCAATCCTG

反向引物：CTCAGGAAAGGGTAATTATTGGACTC

探针1：CAGAGCGGCGCTT

探针2：GGCGCTTTCGCTT

第4组：正向引物：TGAGGCAGTACTCTTGGTGCC

反向引物：AATGGCTCCACAGTGGCTG

探针1：TTCTTCTGGCTTCCCACCCA

探针2：GCTTTCCACCCACTCC。