CN110373476A - 一种与绵羊先天小耳畸形相关的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与绵羊先天小耳畸形相关的分子标记及其应用。本发明公开的与绵羊先天小耳畸形相关的分子标记为序列表中序列1的第511‑586位的所示的DNA片段，将该片段记为片段1，绵羊基因组DNA中对应于序列表中序列1所示的DNA片段含有两个连续的所述片段1或含有一个所述片段1。该分子标记与绵羊先天小耳畸形相关，可以通过鉴定该分子标记来筛选绵羊先天小耳畸形，进而快速有效剔除小耳畸形发育个体、降低群体中该先天遗传缺陷的发生提高绵羊福利。

Description

一种与绵羊先天小耳畸形相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及动物分子生物学和育种领域中，一种与绵羊先天小耳畸形相关的分子标记及其应用。

背景技术

绵羊先天小耳畸形与人类先天性小耳畸形类似，表现为不同程度的外耳发育不全，是研究人类小耳畸形理想的动物模型。与其它反刍动物相比，绵羊先天小耳畸形更常见。目前尚未发现绵羊先天小耳畸形伴随其它器官异常的报道。小耳畸形的绵羊更容易受到惊吓，推测其听力可能受到损伤，影响绵羊福利。小耳畸形的绵羊不易佩戴耳标，给绵羊饲养管理和生产性能测定带来一定困难。遗传因素是形成先天性小耳畸形的主要因素。前人通过分析小耳畸形绵羊不同交配(正常与小耳，正常与无耳，小耳与小耳，小耳与无耳，无耳与无耳)后代的耳朵表型，证实先天性小耳畸形完全符合孟德尔遗传，属于常染色体显性遗传，并推测耳朵完全缺失的为突变纯合子、正常的为野生型纯合子、小耳的为杂合子。Lauvergne等(1988)对不同国家和地区不同绵羊品种先天性小耳畸形分布和频率进行了综述，发现伊朗的Kurdi羊和土库曼斯坦的 Karakul小耳畸形的频率最高，并推测调控绵羊先天性小耳畸形的基因和突变可能起源于中亚地区绵羊品种。

发明内容

本发明的目的是提供一种与绵羊先天小耳畸形相关的分子标记，该分子标记可用于检测绵羊的耳朵性状。

本发明首先提供了绵羊小耳分子标记或检测所述绵羊小耳分子标记的物质在鉴定或辅助鉴定绵羊耳朵性状中的应用；所述绵羊小耳分子标记为序列表中序列1的第 511-586位的所示的DNA片段，将该片段记为片段1，绵羊基因组DNA中对应于序列表中序列1所示的DNA片段含有两个连续的所述片段1或含有一个所述片段1。

上述应用中，所述检测所述绵羊小耳分子标记的物质为引物对，所述引物对由名称分别为P-F和P-R的单链DNA组成，所述P-F为在绵羊基因组中与序列1的第511 位上游特异结合的单链DNA，所述P-R为在绵羊基因组中与序列1的第662位下游特异结合的单链DNA。

所述引物对满足：以绵羊基因组DNA为模板进行PCR扩增得到的DNA片段含有所述绵羊小耳分子标记。

上述应用中，所述P-F可为序列表中序列3所示的单链DNA；所述P-R可为序列表中序列4所示的单链DNA。

本发明还提供了检测绵羊基因型的方法，所述基因型为AA基因型、AB基因型和BB基因型，所述方法包括：检测待测绵羊染色体中对应于序列表中序列1的第 511-586位的DNA片段，如所述待测绵羊两条染色体均为下述g1)的染色体，所述待测绵羊为AA基因型绵羊；如所述待测绵羊两条染色体均为下述g2)的染色体，所述待测绵羊为BB基因型绵羊；如所述待测绵羊两条染色体中一条为下述g1)的染色体，另一条为下述g2)的染色体，所述待测绵羊为AB基因型绵羊；

g1)含有两个连续的序列表中序列1的第511-586位的DNA片段；

g2)含有一个序列表中序列1的第511-586位的DNA片段。

上述方法中，检测待测绵羊染色体中对应于序列表中序列1的第511-586位的 DNA片段可采用所述引物对进行，所述方法包括L1)和L2)：

L1)以待测绵羊基因组DNA为模板，采用所述引物对进行PCR扩增得到PCR产物；

L2)下述L21)或L22)：

L21)检测步骤L1)得到的PCR产物的序列，根据所述PCR产物序列确定绵羊基因型：如所述PCR产物中含有序列1所示的DNA片段、且不含有序列表中序列2所示的DNA片段，所述待测绵羊为AA基因型绵羊；如所述PCR产物中含有序列2所示的 DNA片段、且不含有序列表中序列1所示的DNA片段，所述待测绵羊为BB基因型绵羊；如所述PCR产物中含有序列1和2所示的两种DNA片段，所述待测绵羊为AB基因型绵羊；

L22)检测步骤L1)得到的PCR产物的大小，根据所述PCR产物大小确定绵羊基因型：如所述PCR产物中含有1009bp的DNA片段、且不含有933bp的DNA片段，所述待测绵羊为AA基因型绵羊；如所述PCR产物中含有933bp的DNA片段、且不含有1009bp 的DNA片段，所述待测绵羊为BB基因型绵羊；如所述PCR产物中含有1009bp和933bp 两种大小的DNA片段，所述待测绵羊为AB基因型绵羊。

利用所述引物对进行PCR扩增，所述P-F和所述P-R在反应体系中的浓度均可为0.2pmol/μL。具体可采用如下反应体系进行PCR扩增：10pmol/μL正反向引物各 0.5μL，2×Taq PCR Mastermix 12.5μL，50ng/μL DNA模板1μL，余量用水补足。其中，2×Taq PCRMastermix为天根生化科技(北京)有限公司产品，货号为KT201。

利用所述引物对进行PCR扩增时的退火温度可为58℃。利用所述引物对进行 PCR扩增具体可采用如下反应条件：94℃5分钟；94℃30秒，58℃30秒，72℃60 秒，35个循环；72℃10min。

检测所述PCR产物的大小可通过电泳进行，也可通过测序进行。

本发明还提供了下述X1)或X2)或X3)的方法：

X1)鉴定绵羊耳朵性状的方法，包括：按照所述检测绵羊基因型的方法检测待测绵羊的基因型，BB基因型绵羊为或候选为正常耳朵绵羊，AB基因型绵羊为或候选为小耳绵羊，AA基因型绵羊为或候选为小耳绵羊；

X2)鉴定绵羊耳朵性状的方法，包括：按照所述检测绵羊基因型的方法检测待测绵羊的基因型，AA基因型和AB基因型绵羊耳朵小于或候选小于BB基因型绵羊耳朵，AA基因型和AB基因型绵羊耳朵无差异或候选无差异；

X3)绵羊育种方法，包括：按照所述检测绵羊基因型的方法检测绵羊的基因型，选择BB基因型绵羊作为亲本进行育种。

所述小耳绵羊的特征是：外耳发育不全，耳朵明显小于正常绵羊耳朵，和/或耳朵较厚。

所述绵羊小耳分子标记，也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了具有如下Y1)-Y4)中任一用途的物质，所述物质包括所述引物对：

Y1)检测绵羊小耳分子标记；

Y2)制备检测绵羊小耳分子标记的产品；

Y3)鉴定或辅助鉴定绵羊耳朵性状；

Y4)制备鉴定或辅助鉴定绵羊耳朵性状产品。

所述物质可仅为所述引物对。

本发明还提供了下述任一应用：

H1)所述绵羊小耳分子标记在绵羊育种中的应用；

H2)检测所述绵羊小耳分子标记的物质在绵羊育种中的应用；

H3)检测所述绵羊小耳分子标记的物质在制备鉴定或辅助鉴定绵羊耳朵性状产品中的应用；

H4)所述检测绵羊基因型的方法在鉴定或辅助鉴定绵羊耳朵性状的应用。

上述应用中，检测所述绵羊小耳分子标记的物质可为所述引物对。

本发明中，所述绵羊可为阿勒泰羊、中国美利奴、德国肉用美利奴、巴什拜羊、巴音布鲁克羊、策勒黑羊或多浪羊。

本发明公开的绵羊小耳分子标记与绵羊先天小耳畸形相关：两条染色体均含有两个连续的片段1(即序列表中序列1的第511-586位)的AA基因型绵羊均为先天小耳畸形绵羊；两条染色体均只含有一个片段1的BB基因型均为正常耳朵绵羊；一条染色体含有两个连续的片段1、另一条染色体只含有一个片段1的AB基因型绵羊为先天小耳畸形绵羊。因此，可以通过鉴定该分子标记来筛选绵羊先天小耳畸形，进而快速有效剔除小耳畸形发育个体、降低群体中该先天遗传缺陷的发生提高绵羊福利。

附图说明

图1为部分绵羊PCR产物的凝胶电泳检测结果。SE1-SE6均为先天小耳畸形阿勒泰羊，NE1-NE3均为正常阿勒泰羊，M为DNA分子量标准，从上至下依次为1500bp、 1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA 的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

实施例1、一个与绵羊先天小耳畸形相关的分子标记的发现

本实施例发现了一个与绵羊先天小耳畸形相关的分子标记，记为绵羊小耳分子标记。绵羊小耳分子标记为序列表中序列1的第511-586位所示的DNA片段(记为片段 1)。在绵羊群体中，根据该绵羊小耳分子标记将绵羊分为三种基因型，第一种是两条染色体均含有两个连续的片段1(即序列1的第511-662位)的绵羊，记为AA基因型；第二种是两条染色体均只含有一个片段1，记为BB基因型；第三种是一条染色体含有两个连续的片段1，另一条仅含有一个片段1，记为AB基因型。

根据该分子标记设计引物，记为引物对P，引物对P由正向引物(P-F)和反向引物(P-R)组成，正反向引物的序列分别为序列表中序列3和4，利用引物对P对绵羊基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物有三种：AA基因型绵羊的PCR产物含有序列表中序列1所示的DNA片段，且不含有序列2所示的DNA片段；BB基因型绵羊的PCR产物含有序列表中序列2所示的DNA片段，且不含有序列1所示的DNA片段；AB基因型的 PCR产物含有序列表中序列1和2所示的两种DNA片段。

利用引物对P检测包括29只正常阿勒泰羊和26只先天小耳畸形阿勒泰羊(有耳朵，但耳朵小于正常阿勒泰羊)的绵羊群体基因型与表型的步骤如下：

1、提取基因组DNA

采集绵羊血液，提取各绵羊的基因组DNA。

2、PCR扩增：

以各绵羊的基因组DNA为模板，利用引物对P对进行PCR扩增。

25μL PCR反应体系：10pmol/μL正反向引物各0.5μL，2×Taq PCR Mastermix 12.5μL，50ng/μL DNA模板1μL，余量用水补足。其中，2×Taq PCR Mastermix 为天根生化科技(北京)有限公司产品，货号为KT-201。

PCR反应程序：94℃5分钟；94℃30秒，58℃30秒，72℃60秒，35个循环； 72℃10min。

3、表型与基因型分析

将得到的各绵羊的PCR产物在2.0％琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像系统照相(图1)，从琼脂糖凝胶电泳看，26只先天小耳畸形阿勒泰羊两种基因型，3 只绵羊为AA基因型，23只绵羊为AB基因型，29只正常阿勒泰羊均为BB基因型。表明，本发明的绵羊小耳分子标记和基因型与绵羊耳朵性状相关：两条染色体均含有两个连续的片段1的AA基因型绵羊均为小耳畸形绵羊(有耳朵，但耳朵小)；两条染色体均只含有一个片段1的BB基因型均为正常耳朵绵羊；一条染色体含有两个连续的片段1、另一条染色体只含有一个片段1的AB基因型绵羊为小耳畸形绵羊(有耳朵，但耳朵小)。

实施例2、绵羊小耳分子标记在检测绵羊耳朵性状中的应用

待测绵羊：另外选取75只小耳畸形阿勒泰羊(有耳朵，但耳朵小)和54只正常耳朵阿勒泰羊、18只中国美利奴、20只德国肉用美利奴、20只巴什拜羊、20只巴音布鲁克羊、20只策勒黑羊和25只多浪羊。

提取各待测绵羊的基因组DNA，按照实施例1的PCR反应体系和反应条件进行PCR扩增，结果显示，75只小耳畸形阿勒泰羊中有3只为AA基因型，72只为AB基因型，其余绵羊均为BB基因型(表1)。该检测结果与实施例1一致。

在绵羊育种中可选留BB基因型个体，剔除AA和AB基因型个体，从而在群体中消除绵羊小耳畸形的个体。

表1、各待测绵羊基因型检测结果

待测绵羊	AA基因型	AB基因型	BB基因型
				小耳畸形阿勒泰羊	3	72	0
正常阿勒泰羊	0	0	54
				中国美利奴	0	0	18
德国肉用美利奴	0	0	20
				巴什拜羊	0	0	20
巴音布鲁克羊	0	0	20
				策勒黑羊	0	0	20
多浪羊	0	0	25

<110> 新疆畜牧科学院生物技术研究所（新疆畜牧科学院中国-澳大利亚绵羊育种研究中心）

<120> 一种与绵羊先天小耳畸形相关的分子标记及其应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1009

<212> DNA

<213> 绵羊

<400> 1

tgccctgaga actttgcatc tgaactttgc tagggctgca ctcaaaagtc acgtcaaggc 60

agtttcgatt aacaaaaaga aaggaaagaa agagaaaggg agagaaggaa gggggcccgg 120

agaaggcctt ccgcaattac cctttgaaat tagaatattc tagcagatgt ttctgctttc 180

gccctgtcct gctctctttc caatccagcg aaattagttc caaagtcatt attcacctaa 240

tcacactaat agtttaacat ccgatctgcc ccctgtccag acgggagggc gagcccccaa 300

agctctgcct tagcgcttcc tccctcggat ccttaatgaa gtggcatctg ttctaacaca 360

agttaaatat tgcagttgac tttatttact ttctcccggt cctccgggcc ccgggatggg 420

gcgagataaa gtgaaacaca tttgcttccc cgggcggggt gggggggcgg tgggggcgga 480

caccgagctg cctctctgga aacgcggccc atcaatcata aactgattac aaattcgtca 540

ccttgaatca atttctgttc acaagttcaa aaggcgctcg gagctcatca atcataaact 600

gattacaaat tcgtcacctt gaatcaattt ctgttcacaa gttcaaaagg cgctcggagc 660

tcggggctat ctggaatatt ctacatgtgg agaggattaa catttgatcg aattcctctt 720

tctgaggagg aggccggctc ggctacactt ggggttgcgg tggggggggg ggttgcgttt 780

cgagacgcgt ctgccttagc ctttcaaagc tggcgcttgc tggttcccag ggtgtccagg 840

actcccgacg acccgggggc gggggagggg atgcggatgg gatcttgtct gattcagtca 900

aatcgcaccc acgccggcca ccatttctct gatacacagt ctgctttaaa agcattgtct 960

tgaaggcagc aactctctgt gtgtgtgagc aagagagaga gggtggctg 1009

<210> 2

<211> 933

<212> DNA

<213> 绵羊

<400> 2

tgccctgaga actttgcatc tgaactttgc tagggctgca ctcaaaagtc acgtcaaggc 60

agtttcgatt aacaaaaaga aaggaaagaa agagaaaggg agagaaggaa gggggcccgg 120

agaaggcctt ccgcaattac cctttgaaat tagaatattc tagcagatgt ttctgctttc 180

gccctgtcct gctctctttc caatccagcg aaattagttc caaagtcatt attcacctaa 240

tcacactaat agtttaacat ccgatctgcc ccctgtccag acgggagggc gagcccccaa 300

agctctgcct tagcgcttcc tccctcggat ccttaatgaa gtggcatctg ttctaacaca 360

agttaaatat tgcagttgac tttatttact ttctcccggt cctccgggcc ccgggatggg 420

gcgagataaa gtgaaacaca tttgcttccc cgggcggggt gggggggcgg tgggggcgga 480

caccgagctg cctctctgga aacgcggccc atcaatcata aactgattac aaattcgtca 540

ccttgaatca atttctgttc acaagttcaa aaggcgctcg gagctcgggg ctatctggaa 600

tattctacat gtggagagga ttaacatttg atcgaattcc tctttctgag gaggaggccg 660

gctcggctac acttggggtt gcggtggggg ggggggttgc gtttcgagac gcgtctgcct 720

tagcctttca aagctggcgc ttgctggttc ccagggtgtc caggactccc gacgacccgg 780

gggcggggga ggggatgcgg atgggatctt gtctgattca gtcaaatcgc acccacgccg 840

gccaccattt ctctgataca cagtctgctt taaaagcatt gtcttgaagg cagcaactct 900

ctgtgtgtgt gagcaagaga gagagggtgg ctg 933

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

tgccctgaga actttgcatc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

cagccaccct ctctctcttg 20

Claims (10)

1.绵羊小耳分子标记或检测所述绵羊小耳分子标记的物质在鉴定或辅助鉴定绵羊耳朵性状中的应用；所述绵羊小耳分子标记为序列表中序列1的第511-586位的所示的DNA片段，将该片段记为片段1，绵羊基因组DNA中对应于序列表中序列1所示的DNA片段含有两个连续的所述片段1或含有一个所述片段1。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测所述绵羊小耳分子标记的物质为引物对，所述引物对由名称分别为P-F和P-R的单链DNA组成，所述P-F为在绵羊基因组中与序列1的第511位上游特异结合的单链DNA，所述P-R为在绵羊基因组中与序列1的第662位下游特异结合的单链DNA。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述P-F为序列表中序列3所示的单链DNA；所述P-R为序列表中序列4所示的单链DNA。

4.检测绵羊基因型的方法，所述基因型为AA基因型、AB基因型和BB基因型，所述方法包括：检测待测绵羊染色体中对应于序列表中序列1的第511-586位的DNA片段，如所述待测绵羊两条染色体均为下述g1)的染色体，所述待测绵羊为AA基因型绵羊；如所述待测绵羊两条染色体均为下述g2)的染色体，所述待测绵羊为BB基因型绵羊；如所述待测绵羊两条染色体中一条为下述g1)的染色体，另一条为下述g2)的染色体，所述待测绵羊为AB基因型绵羊；

g1)含有两个连续的序列表中序列1的第511-586位的DNA片段；

g2)含有一个序列表中序列1的第511-586位的DNA片段。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：检测待测绵羊染色体中对应于序列表中序列1的第511-586位的DNA片段采用权利要求3中所述引物对进行，所述方法包括L1)和L2)：

L1)以待测绵羊基因组DNA为模板，采用权利要求3中所述引物对进行PCR扩增得到PCR产物；

L2)下述L21)或L22)：

L21)检测步骤L1)得到的PCR产物的序列，根据所述PCR产物序列确定绵羊基因型：如所述PCR产物中含有序列1所示的DNA片段、且不含有序列表中序列2所示的DNA片段，所述待测绵羊为AA基因型绵羊；如所述PCR产物中含有序列2所示的DNA片段、且不含有序列表中序列1所示的DNA片段，所述待测绵羊为BB基因型绵羊；如所述PCR产物中含有序列1和2所示的两种DNA片段，所述待测绵羊为AB基因型绵羊；

L22)检测步骤L1)得到的PCR产物的大小，根据所述PCR产物大小确定绵羊基因型：如所述PCR产物中含有1009bp的DNA片段、且不含有933bp的DNA片段，所述待测绵羊为AA基因型绵羊；如所述PCR产物中含有933bp的DNA片段、且不含有1009bp的DNA片段，所述待测绵羊为BB基因型绵羊；如所述PCR产物中含有1009bp和933bp两种大小的DNA片段，所述待测绵羊为AB基因型绵羊。

6.下述X1)或X2)或X3)的方法：

X1)鉴定绵羊耳朵性状的方法，包括：按照权利要求4或5所述的方法检测待测绵羊的基因型，BB基因型绵羊为或候选为正常耳朵绵羊，AB基因型绵羊为或候选为小耳绵羊，AA基因型绵羊为或候选为小耳绵羊；

X2)鉴定绵羊耳朵性状的方法，包括：按照权利要求4或5所述的方法检测待测绵羊的基因型，AA基因型和AB基因型绵羊耳朵小于或候选小于BB基因型绵羊耳朵，AA基因型和AB基因型绵羊耳朵无差异或候选无差异；

X3)绵羊育种方法，包括：按照权利要求4或5所述的方法检测绵羊的基因型，选择BB基因型绵羊作为亲本进行育种。

7.权利要求1中所述绵羊小耳分子标记。

8.具有如下Y1)-Y4)中任一用途的物质，包括权利要求2或3中所述引物对：

Y1)检测绵羊小耳分子标记；

Y2)制备检测绵羊小耳分子标记的产品；

Y3)鉴定或辅助鉴定绵羊耳朵性状；

Y4)制备鉴定或辅助鉴定绵羊耳朵性状产品。

9.下述任一应用：

H1)权利要求1中所述绵羊小耳分子标记在绵羊育种中的应用；

H2)检测权利要求1中所述绵羊小耳分子标记的物质在绵羊育种中的应用；

H3)检测权利要求1中所述绵羊小耳分子标记的物质在制备鉴定或辅助鉴定绵羊耳朵性状产品中的应用；

H4)权利要求4或5所述的方法在鉴定或辅助鉴定绵羊耳朵性状的应用。

10.根据权利要求1-3中任一所述的应用，或权利要求4-6中任一所述的方法，或权利要求9所述的应用，其特征在于：所述绵羊为阿勒泰羊、中国美利奴、德国肉用美利奴、巴什拜羊、巴音布鲁克羊、策勒黑羊或多浪羊。