CN113846169A - 一种与猪肌肉生长性状相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents

一种与猪肌肉生长性状相关的snp分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种与猪肌肉生长性状相关的SNP分子标记，SNP分子标记中包括9个与猪肌肉生长性状相关的连锁突变位点，还提供了其应用，用于鉴定猪肌肉生长性状。本发明的SNP分子标记中的与猪肌肉生长性状相关的连锁突变位点课用于对猪进行选择育种和对猪肌肉性状的鉴定。

Description

一种与猪肌肉生长性状相关的SNP分子标记及其应用
技术领域
本发明属于分子遗传学技术领域，具体涉及一种与猪肌肉生长性状相关的SNP分子标记及其应用。
背景技术
猪肉是我国日常食用最多的肉类，同时在畜牧业生产中作为主体发展，随着人们生活水平的提高，对于猪肉的品质有较高的要求，对于其中的肌肉的食用，其中适当的肌内脂肪含量和肌纤维数量能显著改善其口感。在畜牧生产中，这种生长性状特性受到多种转录因子等的调控作用，在育种过程中，由于肌肉表观差异的分辨困难，使得对优质肉类的猪选育停留在浅层次的状态，而从基因组层面对其进行分析，根本上区分了不同类型的肌肉生长性状，分子标记的辅助选择，对育种方面有着重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种与猪肌肉生长性状相关的SNP分子标记及其应用，该SNP分子标记中的与猪肌肉生长性状相关的连锁突变位点课用于对猪进行选择育种和对猪肌肉性状的鉴定。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种与猪肌肉生长性状相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
优选地，所述SNP分子标记中与猪肌肉生长性状相关的连锁突变位点包括9个：A-2367G、A-2290G、T-2249A、T-2247C、C-2204G、T-2159C、C-2094T、A-2045G和C-2035T；
所述A-2367G位于所述SNP分子标记的核苷酸序列的第904位碱基；
所述A-2290G位于所述SNP分子标记的核苷酸序列的第981位碱基；
所述T-2249A位于所述SNP分子标记的核苷酸序列的第1022位碱基；
所述T-2247C位于所述SNP分子标记的核苷酸序列的第1024位碱基；
所述C-2204G位于所述SNP分子标记的核苷酸序列的第1067位碱基；
所述T-2159C位于所述SNP分子标记的核苷酸序列的第1112位碱基；
所述C-2094T位于所述SNP分子标记的核苷酸序列的第1177位碱基；
所述A-2045G位于所述SNP分子标记的核苷酸序列的第1226位碱基；
所述C-2035T位于所述SNP分子标记的核苷酸序列的第1236位碱基；
所述SNP分子标记的核苷酸序列的第904碱基处存在A/G核苷酸多态性位点、第981处碱基存在A/G核苷酸多态性位点、第1022处碱基存在T/A核苷酸多态性位点、第1024处碱基存在T/C核苷酸多态性位点、第1067处碱基存在C/G核苷酸多态性位点、第1112处碱基存在T/C核苷酸多态性位点、第1177处碱基存在C/T核苷酸多态性位点、第1226处碱基存在A/G核苷酸多态性位点和第1236处碱基存在C/T核苷酸多态性位点，且为连锁位点。
上述9个SNP位点在基因组上完全连锁，只需检测A-2367G位点的基因型，就可得到其他8个位点基因型。
上述9个连锁突变原生型记为AA基因型，杂合型记为AG基因型，突变纯合记为GG基因型。
本发明还提供了上述的与猪肌肉生长性状相关的SNP分子标记的应用，所述SNP分子标记用于鉴定猪肌肉生长性状，该鉴定方法为：
S1、提取待检测猪的基因组DNA；
S2、对S1中所述待检测猪的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR产物；
所述PCR扩增的反应体系为：2×Taq PCR Master Mix 25μL、待检测猪的基因组DNA 3μL、正向引物1μL、反向引物1μL、ddH2O 20μL；
所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；进行38个循环：95℃预变性30s，55℃梯度退火30s，72℃延伸50s；72℃延伸5min；
所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
S3、对S2中得到的PCR产物进行测序，用Chromas Pro软件将测序文件与如SEQ IDNo.1所示的SNP分子标记的核苷酸序列进行比对分析，根据目的序列第433bp处判断待检测猪的基因型；
当所述PCR产物扩增的大小为996bp的目的序列的第433bp处的碱基为AA基因型时，猪肌肉生长性状为低等肌肉纤维性状；
当所述PCR产物扩增的大小为996bp的目的序列的第433bp处的碱基为AG基因型时，猪肌肉生长性状为中等肌肉纤维性状；
当所述PCR产物扩增的大小为996bp的目的序列的第433bp处的碱基为GG型基因时，猪肌肉生长性状为高等肌肉纤维性状。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
本发明的SNP分子标记中的与猪肌肉生长性状相关的连锁突变位点课用于对猪进行选择育种和对猪肌肉性状的鉴定。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1是本发明的实施例1的SNP分子标记中与猪肌肉生长性状相关的连锁突变位点图。
图2是本发明的实施例2的PCR产物电泳图。
图3是本发明的实施例3的双荧光素酶活性检测图。
图4是本发明的实施例4的采样群体三种基因型的背最长肌进行组织切片图。
图5是本发明的实施例4的采样群体背最长肌组织切片数据分析图。
具体实施方式
实施例1
本实施例的与猪肌肉生长性状相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述SNP分子标记中与猪肌肉生长性状相关的连锁突变位点包括9个：A-2367G、A-2290G、T-2249A、T-2247C、C-2204G、T-2159C、C-2094T、A-2045G和C-2035T；
所述A-2367G位于所述SNP分子标记的核苷酸序列的第904位碱基；
所述A-2290G位于所述SNP分子标记的核苷酸序列的第981位碱基；
所述T-2249A位于所述SNP分子标记的核苷酸序列的第1022位碱基；
所述T-2247C位于所述SNP分子标记的核苷酸序列的第1024位碱基；
所述C-2204G位于所述SNP分子标记的核苷酸序列的第1067位碱基；
所述T-2159C位于所述SNP分子标记的核苷酸序列的第1112位碱基；
所述C-2094T位于所述SNP分子标记的核苷酸序列的第1177位碱基；
所述A-2045G位于所述SNP分子标记的核苷酸序列的第1226位碱基；
所述C-2035T位于所述SNP分子标记的核苷酸序列的第1236位碱基；
所述SNP分子标记的核苷酸序列的第904碱基处存在A/G核苷酸多态性位点、第981处碱基存在A/G核苷酸多态性位点、第1022处碱基存在T/A核苷酸多态性位点、第1024处碱基存在T/C核苷酸多态性位点、第1067处碱基存在C/G核苷酸多态性位点、第1112处碱基存在T/C核苷酸多态性位点、第1177处碱基存在C/T核苷酸多态性位点、第1226处碱基存在A/G核苷酸多态性位点和第1236处碱基存在C/T核苷酸多态性位点，且为连锁位点。
上述9个SNP位点在基因组上完全连锁，只需检测A-2367G位点的基因型，就可得到其他8个位点基因型。
上述9个连锁突变原生型记为AA基因型，杂合型记为AG基因型，突变纯合记为GG基因型。
本实施例中与猪肌肉生长性状相关的SNP筛选方法为：
(1)选择大白猪(西藏林芝市地区)的耳组织样品，采用苯酚/氯仿法提取耳组织中的DNA样品；
(2)从NCBI下载MYL4基因序列，利用Primer Premier5.0设计引物，在大白猪基因组DNA进行PCR扩增目的基因，引物1(SEQ ID No.2-SEQ ID No.3)扩增猪MYL4基因5’UTR区-2799bp～-1804bp,目的片段长度为996bp；引物2(SEQ ID No.4-SEQ ID No.5)扩增猪MYL4基因5’UTR区-2019bp～-1403bp,目的片段长度为617bp；引物3(SEQ ID No.6-SEQ IDNo.7)扩增猪MYL4基因5’UTR区-1517bp～-617bp,目的片段长度为901bp；引物4(SEQ IDNo.8-SEQ ID No.9)扩增猪MYL4基因5’UTR区-712bp～+35bp,目的片段长度为748bp；
上述引物在大白猪基因组DNA进行扩增，得到PCR产物；所述PCR扩增的反应体系为：2×Taq PCR Master Mix 25μL、待检测猪的基因组DNA3μL、正向引物1μL、反向引物1μL、ddH2O 20μL；
所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；进行38个循环：95℃预变性30s，55℃梯度退火30s，72℃延伸50s；72℃延伸5min；
对产物进行测序，在猪MYL4基因在上游2200bp左右检测到9个SNP位点，通过扩大样本量，发现该9个SNP位点完全连锁。
如图1所示，为9个SNP突变位点的测序峰图，9个SNP呈同时突变的连锁现象，每一行为一个突变位点，第一列为AA型，第二列为GG型，第三列为AG型。
实施例2
本实施例提供了实施例1所述的与猪肌肉生长性状相关的SNP分子标记的应用，所述SNP分子标记用于鉴定猪肌肉生长性状，该鉴定方法为：
S1、提取待检测猪的基因组DNA；
S2、对S1中所述待检测猪的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR产物；
所述PCR扩增的反应体系为：2×Taq PCR Master Mix 25μL、待检测猪的基因组DNA 3μL、正向引物1μL、反向引物1μL、ddH2O 20μL；
所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；进行38个循环：95℃预变性30s，55℃梯度退火30s，72℃延伸50s；72℃延伸5min；
所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，溴化乙淀染色，在凝胶成像系统中可以看到扩增到的大小为996bp的条带(图2)。
S3、对S2中得到的PCR产物进行测序，用Chromas Pro软件将测序文件与如SEQ IDNo.1所示的SNP分子标记的核苷酸序列进行比对分析，根据目的序列第433bp处判断待检测猪的基因型；
当所述PCR产物扩增的大小为996bp的目的序列的第433bp处的碱基为AA基因型时，猪肌肉生长性状为低等肌肉纤维性状；
当所述PCR产物扩增的大小为996bp的目的序列的第433bp处的碱基为AG基因型时，猪肌肉生长性状为中等肌肉纤维性状；
当所述PCR产物扩增的大小为996bp的目的序列的第433bp处的碱基为GG型基因时，猪肌肉生长性状为高等肌肉纤维性状。
实施例3
本实施例为猪MYL4基因5’调控区启动子活性检测：
根据实施例1测序结果，对猪MYL4基因5’UTR区SNP位点设计引物，引物序列(SEQID No.2-SEQ ID No.3)扩增猪MYL4基因5’UTR区-2799bp～-1804bp，目的片段长度为996bp，包含9个SNP位点，得到两种单倍型序列，记为AA和GG，对目的片段进行酶切、纯化、连接为重组体PGL4.10-MYL4，通过lipo2000脂质体方法转染到293T细胞中，以海肾荧光素酶载体pRL-TK为内参(图3中PGL4.10-Control)，利用双荧光素酶活性检测法，通过酶标仪(TECAN infinite E200)对发光值进行检测检测结果如图3所示，图中可以看出GG型的序列(图3中PGL4.10-GG)荧光素酶活性极显著高于AA型(图3中PGL4.10-AA)，说明当MYL4基因5’UTR区该9个SNP位点为GG型时启动子有较高的调控性，具有上调MYL4基因表达的作用。在细胞层面，GG型的表达也有极显著的高于AA型的变化。
通过双荧光素酶活性检测实验，连接有正常突变前序列细胞荧光素检测极显著高于空载细胞，连接突变后序列细胞荧光素检测极显著高于突变前，表明突变导致UTR调控MYL4基因极显著表达。
实施例4
本实施例为实施例3的SNP分子标记用于鉴定猪肌肉生长性状的方法，对大白猪群体中MYL4基因型与肌肉生长性状相关分析：
用实施例3的SNP分子标记用于鉴定猪肌肉生长性状的方法对73头大白猪的基因型进行测序分析，结果如表1所示：
表1 73头大白猪MYL4基因型进行测序分析
Figure BDA0003226758190000071
其中出现的三种基因型中AA型频率0.493，AG型基因频率0.384，GG型频率0.123。
图4为采样群体三种基因型的背最长肌进行组织切片图，通过对该采样群体背最长肌进行组织切片观察与数据分析，结果如图5所示，从图中可以看出，GG型猪在肌纤维数量上极显著高于AG型，而AG型又极显著高于AA型；GG型猪在肌纤维直径和肌纤维面积上极显著低于AG型，而AG型又极显著低于AA型，可见A/G等位基因是猪肌肉生长性状的分子标记，可用于遗传育种方面。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
序列表
<110> 西藏农牧学院
<120> 一种与猪肌肉生长性状相关的SNP分子标记及其应用
<130> 2020.5.12
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3270
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 1
ataatgaggc tggtgtcagg tatcttgact cacaacgtgt ggctttttct gggaaaccac 60
agctctcttc cagtggcttc tgagtaccag ttgcttgttt agctggggtt gcttaaagag 120
aatcagaaac cgatttgagg agatgctcct cccccactga ggtttcaggc atgcaggcca 180
ctcatctgag tgttgctgac aggcaggctg tctggcccca gggacctgct acatgctttc 240
tgagccacaa atatttcaca ccgtgggtac tcagcagccg tccttcccct ccccagttcc 300
cttccacctc ttccttgttc ctaaatccac actctacagt cacgttagcc agggccacct 360
tacccatccc tccctcctgt gggcctctct ccgggcactg ctttccggaa aaccagacac 420
ctgagcatgc ctctagcttc ctctgccttg gaaggcaagg taaaacccac agctgtgatt 480
gtctcctatg tgtaatacat aaaacactta ggagtggtgc tgattgaagc ggcaggggta 540
ggggagcccc agacctggcc tctctgcgtc ccttactgcc agaagcaagt taaggatgcc 600
ttaggtgtct gttgcacact ttgaaatccc ctgactatct ctccttgtag agataagaaa 660
gctgaggccc agagagggga agtggctgga gtcaggacag tggcgtctag ctcttgtagc 720
ttctagcctg cagttttcca cagtttgtgt acctctgcaa accccagaca ccttgtccag 780
ggaggggatg ctgggggtgg gggtggggga gggggagagg ctcggcttcc tcatccctcc 840
ttcctcatca ccagcaacct gagctcccag ccccctgggg aatgagggag agggagagag 900
ccgagaatgc tgaagggtgc aagcagaggc acatgggagc aggtgacaag gagtcagaag 960
gaagagaaag ggcagaagag aggaagtggg gaggggaaaa gagccaagga gctgccgtgc 1020
ctgtccagga ccaggactgg cctagggttg gggccctggc cttgctctag gatccccttg 1080
ggggaagtcc tggcctcctt tcctgcctca gttttctttg aagtcttccc tgctcactag 1140
tggtacagtg agagcaggta cagggtaggg gaggggcggg tggtgtcaga gcatcacacg 1200
cagggagccg ggcttagctg gctccactcc gcctgcgaat agctgagggt cttgaggtgg 1260
ctccgaagtc tcctgcctta gattcctcac ctgtcaaagc agagggggtg agacgatctc 1320
taagggccct tttggctcta aatatctggg aaatgaaact atggagcccg tgcttaggga 1380
acccagagaa tgggcagatg tgggctccag ggcatcagga attatgtggt ctatcaacct 1440
tgttttatag atgaggaaac tggacctaga aaggcaaagt gacttctctt tcagctttat 1500
ttctcttcat cctctgaact gtagagtcgt aagattcagc tcaaagtaat tctgtgcagt 1560
ggttaagttt tctgttgttt ttctgacatt ttttgacttt taactttttt ttttttttac 1620
aaaaacagta catgcttgtt gaaaaaaatt tccgttaata caggaagtga aaaaagtaaa 1680
aaactgaaaa ttgctgttat cctcctgtcc tcaccctttg agtccccagg ggtgtctcct 1740
gttaatggtc taatatgtat tcatcctaac ctttctgatg aacacacaga cgtatatggg 1800
ctcccccgaa ctgggattat aatatgcatt attcaagcat tacctttaca atcagacata 1860
cctgcttctc atgctagttt attgtgaatt agctctgacc ttgttatttg atcagtttta 1920
gcctcagtct catgtgtgaa atgggagtga taataaagat attattatta ttaccttaca 1980
ggattatagt gaggattttt tttttaattc tttttttttt ttttttgtct tttgtctttt 2040
tgttgttgtt gttgttgttg ctatttcttg ggccgctccc gcggcatatg gaggttccca 2100
ggctaggggt tgaatcggag ctgtagccac cagcctacgc cagagccaca gcaacgtggg 2160
atccaagccg agtctgtgcc ctacaccaca gctctcggca acgccggatc cctaacccac 2220
tgagcaaggg cagggaccga acccgcaacc tcatggttcc tagtcggatt cgttaaccac 2280
tgcgccacga cgggaactcc tatagtgaag atttaatgag attttatatg aatggcactt 2340
aactatcagg cctgatacat aaagagccct acacacacac acacacacac acacacacac 2400
acacacacac acacacacac acaaccagga ggcgcacagt gagttagaag tatatagtaa 2460
aaatgagacc tgagatcctg acctctgatc tcattgcatt tgagccaacc cctctgcttc 2520
tcaccctagc tcctctggac acaagttgag cactcagtat ttgttgaagg agtgattgag 2580
gttgtgcggg tggacctagg gatttgaggg ctggggagtt cttggggagc tggctctgga 2640
agatggaggg ttttaccctg tgggttggga gggtgtggga cagcctgggt tggctggacc 2700
agctgttgct tcagggctcc aggcctgtga gttgaacttc agggcagagc cgaggccccg 2760
gaatggctct cagcttaaag gatcttggct taaaaggaat gtgcagtggg ctgcctctgc 2820
tcaggagggg ctaaaaaaag cttcaccctc ccctgggctt tgtgtgaggg ttatcaactg 2880
ctcaagtcag ctcatctctc tggctggact ctggcatttt tgggagggtc tgttttcctg 2940
gcccctcttg gtctccacca actggcagga agggtcagtc tgtcccagag gtggaggccg 3000
tgagtgtgtg aggtgggggt gaggggtggg gtggggactg gtagccccaa acctggtgac 3060
aatacacagt tgtcagctgt accctgctgg tgtttcttcc ttttatagtc agccacagtt 3120
gctcacgctc tcacccagcc cctctgtggg ggctcctgcc caggataaaa ggggcgggag 3180
gcagcccagt ctcccatctc atctcctggg cgccgcgtct cttgagtcct tcctgggtgc 3240
cacctccgcg gaagatctca gcaagacaac 3270
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 2
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<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 3
aggtccagtt tcctcatcta t 21
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 4
ttgaggtggc tccgaagtc 19
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 5
agaagcaggt atgtctgatt gtaaa 25
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 6
ccacctcctt ctccatctg 19
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 7
aactaacaaa aatgtgctcc ct 22
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 8
tatgtattca tcctaacctt tctg 24
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 9
aaaaccctcc atcttccag 19

Claims (3)

1.一种与猪肌肉生长性状相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种与猪肌肉生长性状相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记中与猪肌肉生长性状相关的连锁突变位点包括9个：A-2367G、A-2290G、T-2249A、T-2247C、C-2204G、T-2159C、C-2094T、A-2045G和C-2035T；
所述A-2367G位于所述SNP分子标记的核苷酸序列的第904位碱基；
所述A-2290G位于所述SNP分子标记的核苷酸序列的第981位碱基；
所述T-2249A位于所述SNP分子标记的核苷酸序列的第1022位碱基；
所述T-2247C位于所述SNP分子标记的核苷酸序列的第1024位碱基；
所述C-2204G位于所述SNP分子标记的核苷酸序列的第1067位碱基；
所述T-2159C位于所述SNP分子标记的核苷酸序列的第1112位碱基；
所述C-2094T位于所述SNP分子标记的核苷酸序列的第1177位碱基；
所述A-2045G位于所述SNP分子标记的核苷酸序列的第1226位碱基；
所述C-2035T位于所述SNP分子标记的核苷酸序列的第1236位碱基；
所述SNP分子标记的核苷酸序列的第904碱基处存在A/G核苷酸多态性位点、第981处碱基存在A/G核苷酸多态性位点、第1022处碱基存在T/A核苷酸多态性位点、第1024处碱基存在T/C核苷酸多态性位点、第1067处碱基存在C/G核苷酸多态性位点、第1112处碱基存在T/C核苷酸多态性位点、第1177处碱基存在C/T核苷酸多态性位点、第1226处碱基存在A/G核苷酸多态性位点和第1236处碱基存在C/T核苷酸多态性位点，且为连锁位点。
3.一种如权利要求1或2所述的与猪肌肉生长性状相关的SNP分子标记的应用，其特征在于，所述SNP分子标记用于鉴定猪肌肉生长性状，该鉴定方法为：
S1、提取待检测猪的基因组DNA；
S2、对S1中所述待检测猪的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR产物；
所述PCR扩增的反应体系为：2×Taq PCR Master Mix 25μL、待检测猪的基因组DNA 3μL、正向引物1μL、反向引物1μL、ddH2O 20μL；
所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；进行38个循环：95℃预变性30s，55℃梯度退火30s，72℃延伸50s；72℃延伸5min；
所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQID No.3所示；
S3、对S2中得到的PCR产物进行测序，用Chromas Pro软件将测序文件与如SEQ ID No.1所示的SNP分子标记的核苷酸序列进行比对分析，根据目的序列第433bp处判断待检测猪的基因型；
当所述PCR产物扩增的大小为996bp的目的序列的第433bp处的碱基为AA基因型时，猪肌肉生长性状为低等肌肉纤维性状；
当所述PCR产物扩增的大小为996bp的目的序列的第433bp处的碱基为AG基因型时，猪肌肉生长性状为中等肌肉纤维性状；
当所述PCR产物扩增的大小为996bp的目的序列的第433bp处的碱基为GG型基因时，猪肌肉生长性状为高等肌肉纤维性状。
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