CN110229914B - 一种影响猪肌纤维直径的snp分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种影响猪肌纤维直径的SNP分子标记及其应用。所述的影响猪肌纤维直径的SNP分子标记的SNP位点对应于国际猪的参考基因组Sscrofa11.1版本4号染色体上自5′末端起第69991162位碱基多态性位点处。本发明还提供一种用于鉴定上述SNP分子标记的引物，通过该分子标记及引物，可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，通过优选该SNP分子标记的优势等位基因，能够选择猪肌纤维密度性状的遗传进展，从而有效提高种猪育种的经济效益。

Description

一种影响猪肌纤维直径的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及生物育种技术领域，尤其是提供一种影响猪肌纤维直径的SNP分子标记及其应用。

背景技术

猪肉质品质是猪的重要经济性状，它与人们的肉食营养、肉食品加工和养猪业经济效益都密切相关。影响猪肉质主要因素的肌纤维直径也愈来愈受到研究者和育种者们的关注，成为猪育种计划的一部分。

分子育种可以通过筛选与性状关联分子标记进行育种工作，避免屠宰。现有技术也有对猪肉肌纤维直径QTL进行定位分析，将这性状QTL定位于2号染色体82.7–129.0Mb区间、4号染色体81.7–121.6Mb区间和18号染色体0.6–5.7Mb区间内。这几个区间内的脱氧核糖核酸总数在9100万个以上，脱氧核糖核酸数量太多导致针对这几个区间开展脱氧核糖核酸变异的检测十分困难。这些区间内与猪肌纤维直径显著关联的SNP的报道几乎未见。

发明内容

本发明为了克服现有技术中筛选检测与猪肌纤维直径性状关联的QTL定位于2号染色体82.7–129.0Mb区间、4号染色体81.7–121.6Mb区间和18号染色体0.6–5.7Mb区间的脱氧核糖核酸总数过多，从其中筛选可作为分子标记的SNP难度很大的不足，提供一种影响猪肌纤维直径的更加便捷，高效的SNP分子标记。

本发明的另一目的在于提供上述影响猪肌纤维直径大小的SNP分子标记在猪肌纤维直径筛查检测和猪育种中的应用。

本发明的再一目的在于提供一种用于测定上述影响猪肌纤维直径的SNP分子标记的引物。

本发明的第四个目的在于提供一种检测猪肌纤维直径的方法。

本发明的第五个目的在于提供一种猪的遗传改良的方法。

本发明通过下述技术方案实现：

一种影响猪肌纤维直径的SNP分子标记，其SNP位点对应于国际猪参考基因组Sscrofa11.1版本4号染色体上自5′末端起第69991162位碱基处的A>G突变，猪参考基因组Sscrofa11.1版本为GenBank中更新于2017年2月的猪参考基因组序列。

所述的影响猪肌纤维直径的SNP分子标记在检测猪肌纤维直径和猪育种中的应用。选择上述位点碱基为A的个体，可以获得肌纤维直径更大的猪。

优选的猪为北京黑猪。

一种用于检测上述的影响猪肌纤维直径的SNP分子标记的引物，包含上游引物PCR-F和下游引物PCR-R；

上游引物PCR-F：5’-TCTCCACAAATTAAACTACCGTGTT-3’；

下游引物PCR-R：5’-AGGTGAGGTTGCCCTGCTT-3’。

所述的用于检测影响猪肌纤维直径的SNP分子标记的引物在检测猪肌纤维直径和猪育种中的应用。

优选的猪为北京黑猪。

一种检测猪肌纤维直径的方法，包含如下步骤：以待测猪的基因组DNA为模板，加入引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，检测待测猪的PCR扩增产物，如果PCR扩增产物自5′末端起第349位碱基为A，则所述猪的基因型为AA基因型，如果PCR扩增产物自5’末端起第349位的碱基为A和G，则所述猪的基因型为AG基因型，如果PCR扩增产物自5’末端起第349位的碱基为G，则所述猪的基因型为GG基因型。

一种猪的遗传改良的方法，包含如下步骤：确定种猪核心群中种猪的SNP分子标记，并根据SNP分子标记做出相应的选择：种猪的继代选育国际猪参考基因组Sscrofa11.1版本4号染色体上自5′末端起第69991162位碱基处选择AA型个体，提高后代猪的肌纤维直径。

优选地，所述的种猪为北京黑猪。

一种猪的遗传改良的方法，包含如下步骤：确定种猪核心群中种猪的SNP分子标记，并根据SNP分子标记做出相应的选择：种猪的继代选育国际猪参考基因组Sscrofa11.1版本4号染色体上自5′末端起第69991162位碱基处选择GG基因型和/或AG基因型的猪个体，降低后代猪的肌纤维直径。

优选地所述的种猪为北京黑猪。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明使用分布于全基因组范围的45423个SNP位点，针对猪肌纤维直径开展了全基因组关联研究，发现位于国际猪参考基因组Sscrofa11.1版本4号染色体上自5′末端起第69991162bp处的A>G突变与肌纤维直径显著关联，其关联性P值约为3.72E-11，本发明基于这个SNP位点的各种基因型对肌纤维直径的影响，可作为猪肌纤维直径的分子标记，使猪肌纤维直径的检测效率明显提升。本发明使用该分子标记进行标记辅助选择，能够方便高效地对待选猪进行筛选，解决实际生产中的肌纤维直径无法活体测定的问题。

本发明提供一种用于测定影响猪肌纤维直径标记的引物对，通过该分子标记及引物对，可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于种猪肌纤维密度性状遗传改良中，从而提高生产效率，降低企业生产成本，增加企业核心竞争力。

附图说明

图1为AA基因型个体猪参考基因组Sscrofa11.1的4号染色体上g.69991162A>G多态性位点附近序列的测序结果。

图2为GG基因型个体猪参考基因组Sscrofa11.1的4号染色体上g.69991162A>G多态性位点附近序列的测序结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步描述。本发明的实施方式不限于此.

实施例1、鉴定猪的肌纤维直径大小

一、猪SSC4g.69991162A>G多态性位点的确定

(一)以两头北京黑猪为实验材料，分别提取其耳缘组织的基因组DNA。

(二)引物的设计与合成

根据猪参考基因组11.1的序列，设计并合成如下引物：

U(上游引物)：5’-TCTCCACAAATTAAACTACCGTGTT-3’(SEQ ID No.1)；

D(下游引物)：5’-AGGTGAGGTTGCCCTGCTT-3’(SEQ ID No.2)。

(三)PCR扩增

分别以步骤(一)得到的北京黑猪的基因组DNA为模板，以U和D为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，分别命名为产物1和产物2。

PCR扩增体系：基因组DNA 200ng，10×PCR扩增缓冲液5μl，dNTPs终浓度为10mM，上、下游引物各50ng，Taq DNA聚合酶0.75U，Mg²⁺2.5mmol/L，用ddH₂O补足体系至50μl。

PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸10min。

(四)测序及序列分析

将产物1和产物2进行测序，得到产物1的序列，如SEQ ID No.3所示，和产物2的序列，如SEQ ID No.4所示。SEQ ID No.3和SEQ ID No.4只存在一个碱基的差异，均为SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4中自5’末端起第349位，该处的碱基为G或A，如图1中箭头所示，该位点为猪参考基因组Sscrofa11.1，更新日为2017年2月，4号染色体上自5′末端起第69991162位碱基，因此将该位点命名为SSC4g.69991162A>G。

在猪参考基因组Sscrofa11.1，更新日为2017年2月，4号染色体上自5′末端起第69991162位碱基，或步骤(三)得到的PCR扩增产物自5’末端起第349位的碱基为G的个体，该个体为纯合型个体，将该个体的基因型命名为GG，在猪参考基因组Sscrofa11.1，更新日为2017年2月，4号染色体上自5′末端起第69991162位碱基，或步骤(三)得到的PCR扩增产物自5’末端起第349位的碱基为A的个体，该个体为纯合型个体，将该个体的基因型命名为AA，在猪参考基因组Sscrofa11.1，更新日为2017年2月，4号染色体上自5′末端起第69991162位碱基，或步骤(三)得到的PCR扩增产物自5’末端起第349位的碱基，为G和A的个体，该个体为杂合型个体，将该个体的基因型命名为AG。

二、猪SSC4g.69991162A>G多态性位点与猪的肌纤维直径的关联性分析

为确定SSC4g.69991162A>G多态性位点与猪的肌纤维直径性状是否相关，以148头北京黑猪为实验材料，进行如下试验：

(一)提取每头猪的耳缘组织的基因组DNA，分别按照步骤一中(三)的方法进行PCR扩增，得到各PCR扩增产物，按照步骤一中(四)的方法确定每头猪的基因型是GG、AG还是AA。

(二)用苏木精-伊红染色(HE)法进行背最长肌切片染色后，使用Image-Pro图像分析软件统计每头猪的肌纤维直径、I型纤维比例、IIA型纤维比例和IIB型纤维比例。

(三)对猪的基因型与猪肌纤维直径以最小二乘法开展关联分析，具体方法可参见文献“Zhang L，Wang L，Li Y，Li W，Yan H，Liu X，Zhao K，Wang L.A substitution withinerythropoietin receptor gene D1domain associated with litter size in BeijingBlack pig，Sus scrofa.Anim Sci J.2011；82(5):627-632”。

所用模型如下：

Y＝S+G+e

其中Y为性状测定值，S为性别效应，G为基因型效应，e为残差效应。

结果如表1所示。

表1猪SSC4 g.69991162A>G位点基因型与猪肌肌纤维性状关联性分析

注：同列上标不同字母表示差异显著(P<0.05)，同列无上标字母表示差异不显著

表1表明，在猪的肌纤维直径性状中，AA基因型猪的肌纤维直径显著大于AG基因型和GG基因型的猪的肌纤维直径，P<0.05，AG基因型与GG基因型的猪的肌纤维直径差异不显著。

结果表明，本发明用猪参考基因组Sscrofa11.1，更新日为2017年2月，4号染色体上自5′末端起第69991162位碱基多态性鉴定猪的肌纤维直径的结果与猪的肌纤维直径的实际测定结果一致。在实际的猪育种中，为获得更大肌纤维直径的猪，最好选择AA基因型的猪进行育种；为获得更小肌纤维直径的猪，最好选择AG基因型和/或GG基因型的猪进行育种。

本技术领域的技术人员根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120>一种影响猪肌纤维直径的SNP分子标记及其应用

<160>4

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

TCTCCACAAA TTAAACTACC GTGTT 25

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

AGGTGAGGTT GCCCTGCTT 19

<210>3

<211>414

<212>DNA

<213>猪（Sus scrofa）

<400>3

TCTCCACAAA TTAAACTACC GTGTTTTTGC AAATTTCACA AAAATGTTTA GTCTGTGAAC 60

TCATTGTTAG AGCCTCTCCC AGGACTTTGG AAGGAGCTGG TGTAAATGAG GAGCTCTGAG 120

GCCACAGCTT TATTAAGCAA CCCAAGAAAA CCCACCTGTG CCTCTGCTAG AGCAGTGGTT 180

TTCAGGAAGG AATTATCCAG CCCAAAATGT CCATCGTGCC TCCACTGAGA AACATGTGCT 240

GGAGTGAGGA AACCTGAAGA AAAGAGGCTG GCAGACTCTT CTTGGGTGGT CTTGGGGAAC 300

ACCCAAAGAC CCTTCCAAAG ACCCTTCCAC CGTGGACCAG CTGTTCTCAC TCTTGGCCTG 360

GGAAGATGGT GGAAGTGGGG AAAGTATAAT CCTTTAAGCA GGGCAACCTC ACCT 414

<210>4

<211>414

<212>DNA

<213>猪（Sus scrofa）

<400>4

TCTCCACAAA TTAAACTACC GTGTTTTTGC AAATTTCACA AAAATGTTTA GTCTGTGAAC 60

TCATTGTTAG AGCCTCTCCC AGGACTTTGG AAGGAGCTGG TGTAAATGAG GAGCTCTGAG 120

GCCACAGCTT TATTAAGCAA CCCAAGAAAA CCCACCTGTG CCTCTGCTAG AGCAGTGGTT 180

TTCAGGAAGG AATTATCCAG CCCAAAATGT CCATCGTGCC TCCACTGAGA AACATGTGCT 240

GGAGTGAGGA AACCTGAAGA AAAGAGGCTG GCAGACTCTT CTTGGGTGGT CTTGGGGAAC 300

ACCCAAAGAC CCTTCCAAAG ACCCTTCCAC CGTGGACCAG CTGTTCTCGC TCTTGGCCTG 360

GGAAGATGGT GGAAGTGGGG AAAGTATAAT CCTTTAAGCA GGGCAACCTC ACCT 414

Claims (7)

1.影响猪肌纤维直径的SNP分子标记在检测猪肌纤维直径和猪育种中的应用，所述SNP分子标记为SEQ ID NO.1的第349位的A>G突变。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的猪为北京黑猪。

3.用于检测影响猪肌纤维直径的SNP分子标记的引物在检测猪肌纤维直径和猪育种中的应用，所述SNP分子标记为SEQ ID NO.1的第349位的A>G突变；

所述引物为：

上游引物PCR-F：5’-TCTCCACAAATTAAACTACCGTGTT-3’；

下游引物PCR-R：5’-AGGTGAGGTTGCCCTGCTT-3’。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的猪为北京黑猪。

5.一种猪的遗传改良的方法，其特征在于，包含如下步骤：确定种猪核心群中种猪的SNP分子标记，所述SNP分子标记为SEQ ID NO.1的第349位的A>G突变，并根据SNP分子标记做出相应的选择；选择AA基因型个体，提高后代猪的肌纤维直径。

6.一种猪的遗传改良的方法，其特征在于，包含如下步骤：确定种猪核心群中种猪的SNP分子标记，所述SNP分子标记为SEQ ID NO.1的第349位的A>G突变，并根据SNP分子标记做出相应的选择；选择GG基因型和/或AG基因型的猪个体，降低后代猪的肌纤直径。

7.根据权利要求5或6所述的猪的遗传改良的方法，其特征在于：所述的种猪为北京黑猪。

Images