CN108315433A - 一种影响杜洛克种猪肌内脂肪含量的分子标记及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域,涉及一种与杜洛克猪肌内脂肪含量相关的SNP分子标记,该SNP标记的位点为国际猪参考基因组11.1版本7号染色体上第117427086个核苷酸位点,该位点的碱基是G或A。本发明通过优选该SNP的优势等位基因,能够逐代增加优势等位基因频率,提高猪肌内脂肪含量,加快猪遗传改良进展从而有效提高种猪育种的经济效益。

Description

一种影响杜洛克种猪肌内脂肪含量的分子标记及应用
技术领域
本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域,涉及一种与杜洛克种猪肌内脂肪含量相关的SNP分子标记及其用途。
背景技术
随着人们生活水平的提高,猪肉的品质受到越来越多的关注。在影响猪肉品质的众多因素中,肌内脂肪(Intramuscular Fat,IMF)作为一个重要的指标,影响着肉的嫩度、系水力、剪切力值、风味和多汁性。适量的肌内脂肪含量能使肉质嫩滑可口、味美多汁,因此,对影响猪肌内脂肪含量的因素的研究一直是育种工作者的重点。
近百年来,以杜洛克为代表的瘦肉型种猪大多以提高瘦肉率和降低背膘厚为重要的育种目标。然而,背膘厚度与肌内脂肪含量呈遗传正相关,而瘦肉量与肌内脂肪含量呈遗传负相关,因此采用常规育种方法难以获得瘦肉率高、背膘厚低而肌内脂肪高的种猪新品系。而利用分子生物学的方法,通过先找到影响肌内脂肪含量的DNA分子标记,进而筛选优势等位基因用于育种,则有望改善瘦肉型种猪的肌内脂肪含量,从而提高猪肉品质。
肌内脂肪含量是复杂的数量性状,由多基因控制。过去,人们通过候选基因法(Candidate gene approach)和QTL定位(QTL Mapping)进行QTL检测。候选基因法已鉴别到部分影响肉质性状的候选基因,如氟烷基因、酸肉基因以及PRKAG3基因等,但它们并不能直接影响猪肉的肌内脂肪含量。候选基因法虽然具有方法简单、操作方便等优点,但只能针对生物学功能已知的基因;而QTL定位方法所鉴定的候选位置基因的置信区域同样较大,这极大地限制了复杂性状分子标记在家畜遗传育种中的应用。随着高通量测序技术的发展及全基因组芯片的出现,使得全基因组关联分析(Genome-wide Association Study,GWAS)在复杂性状遗传解析中大放异彩,也打破了猪肉肌内脂肪分子标记鉴别的瓶颈。
发明内容
为克服上述现有技术中存在的缺点与不足,本发明的首要目的在于提供一种影响猪肌内脂肪含量性状的分子标记及其在猪肌内脂肪含量研究和猪遗传育种中的应用。
本发明的另一目的在于提供上述的分子标记在筛选高肌内脂肪含量性状的猪品种的方法。
本发明的另一目的在于提供一种用于鉴定上述影响猪肌内脂肪含量性状的分子标记的引物对。
本发明的目的在于提供一种猪的遗传改良的方法。
本发明的上述目的通过以下技术手段实现:
一方面,本发明提供了一种与猪肌内脂肪含量相关的SNP分子标记,所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,其中序列中的M是A或G,导致猪肌内脂肪含量的不同。
所述分子标记位于猪的7号染色体上的核苷酸序列上,所述分子标记的SNP位点为SEQ IDNO:1序列标注位置为381位的G381-A381的核苷酸突变;所述的分子标记的SNP位点对应于国际猪基因组11.1版本参考序列7号染色体上第117427086位A>G突变。
另一方面,本发明还提供了一种用于鉴定上述影响猪肌内脂肪含量性状的分子标记的引物对,所述引物对的核苷酸序列如下所示:
正向引物序列如SEQ ID NO:2所示;
反向引物序列如SEQ ID NO:3所示。
另一方面,本发明还提供了上述引物对在研究/检测/鉴定/调节/提高猪肌内脂肪含量或者是猪遗传育种中的应用。进一步地,所述的遗传育种优选为分子标记辅助育种。
另一方面,本发明还提供了一种检测肌内脂肪含量性状的的方法,具体为,检测猪7号染色体上SEQ ID NO:1所示序列中,M标记的单核苷酸是G还是A。
另一方面,本发明还提供了一种筛选高肌内脂肪含量性状的猪品种的方法。具体为,检测猪7号染色体上猪SEQ ID NO:1所示序列中,M标记的单核苷酸是G还是A(即SEQ IDNO:1所示序列中,5’端第381位单核苷酸是G还是A),淘汰A保留G。
作为本发明一种优选的实施方式,采用上述的引物对进行检测或筛选。
另一方面,本发明还提供了一种猪的遗传改良的方法,该方法包括:检测猪的国际猪参考基因组11.1版本7号染色体上第117427086个核苷酸位点的基因型,选择第117427086个核苷酸位点的GG型个体作为种猪,或者检测猪SEQ ID NO:1所示序列中,M标记的单核苷酸是G还是A,选择M是G的个体作为种猪。
更具体地,该方法包括以下步骤:
(1)提取待测猪的基因组DNA;
(2)采用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物对,将待测猪的基因组DNA进行PCR扩增,以便获得PCR扩增产物;
(3)对所述PCR扩增产物进行测序,以便获得测序结果;
(4)基于所述测序结果,确定待测猪的SEQ ID NO:1所述的SNP分子标记位点的基因型AA、AG、GG,或者在种猪核心群中选择国际猪参考基因组11.1版本7号染色体上第117427086位点,淘汰在位点为AG、AA基因型的种猪个体,以逐代提高该位点的等位基因GG型的频率,从而提高后代猪的肌内脂肪含量。
需要说明的是,本发明中,所述的猪包括杜洛克及其合成系。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
(1)本发明研究并确定影响猪肌内脂肪含量相关的分子标记,验证其对肌内脂肪含量性状的影响效应,最终建立高效准确的分子标记辅助育种技术,将其应用于种猪提高肌内脂肪含量的遗传改良中,从而提高后代猪的肉质品质,提高企业利润,增加核心竞争力。
(2)本发明提供一种用于鉴定影响肌内脂肪含量的分子标记的引物对,通过该分子标记及引物对,可建立高效准确的分子标记辅助选择育种技术,将其应用于猪肉质性状的遗传改良中,从而提高猪肌内脂肪含量,进而提高企业猪养殖的经济效益。
(3)本发明通过优选该分子标记的优势等位基因,能够增加猪肌内脂肪含量的遗传进展,从而有效提高种猪育种的经济效益,其中,通过该分子标记,本发明将AG、AA型个体全部选育成GG型个体,则猪肌内脂肪含量可以增加4.6%。
附图说明
图1为美系杜洛克猪在7号染色体上关于肌内脂肪含量性状的全基因组关联分析(GWAS)曼哈顿图;其中:横坐标表示猪的染色体编号;纵坐标表示-logP值。
图2为不同基因型猪的肌内脂肪含量的比例。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
本发明的上述发明目的具体是这样实现的:
实施例1
1、实验动物
本发明所使用的实验猪群群体为广东温氏食品集团股份有限公司种猪分公司的纯种美系杜洛克2296头,为种猪分公司核心群。
本实验共选取该资源群体中美系杜洛克种猪,猪群自由采食、饮水,整个饲喂方式、饲养条件等始终保持一致,为常规方法。
2、样本采集
收集上述仔猪断尾及耳组织浸泡于75%乙醇中,置于-20℃冰箱保存备用。
3、猪全基因组50K SNP判型
从上述资源群体中选取的2296头杜洛克种中的每个个体采集的耳组织或者断尾组织,用标准苯酚-氯仿法提取全基因组DNA,经Nanodrop2000/2000C核酸蛋白检测仪准确测定每一份样品的DNA的浓度和OD比值(OD260/280、OD260/230)。经NanoDrop2000/2000C核酸蛋白检测仪检测合格的DNA样品,按照检测的浓度将DNA稀释至50ng/μL左右。再将6μl已提取好的待测DNA样品与2μl Loading Buffer混合,上样到1%的琼脂糖凝胶中,150V电压下电泳25min,在紫外分光光度仪和凝胶成像设备下观察并拍照,观察DNA的完整性。
DNA样品送纽勤生物科技(上海)有限公司,在Illumina Beadstration平台上根据公司标准流程进行猪全基因组50K SNP芯片(Illumina,美国)基因型判定。利用R语言GenABEL包中checkmarker对所有样本50K芯片扫描分型数据进行质量控制,剔除检出个体率低于90%、家系孟德尔错误率高于0.1、最小等位基因频率小于0.05且哈代-温伯格平衡显著性水平高于10-6的SNP,最终得到33891个SNP的有效基因型数据。
4、全基因组关联(GWAS)分析
为了消除群体层化效应,本发明采用线性混合模型单点回归分析并结合R语言GenABEL软件包进行GWAS分析,分析模型中利用个体间基因组的相似度校正层化效应。采用Bonferrini法确定SNP与有效总乳头数性状关联程度的显著性阈值,基因组水平显著阈值为0.05除以有效SNP位点数量,即基因组显著水平阈值为1.48e-6,即0.05/33891(有效SNP数量);染色体水平显著阈值为1除以有效SNP位点数量,即染色体显著水平阈值为2.95e-5,即1/33891(有效SNP数量)。
GWAS分析结果如图1所示。从图1可知,在杜洛克中,在7号染色体中存在显著影响肌内脂肪含量的位点,最强关联的SNP为g.381A>G(P=6.55e-6)。
5、不同基因型与肌内脂肪含量表型的关联性分析
根据表1可知,分子标记的SNP位点g.381A>G与肌内脂肪含量性状极显著相关(P<0.001),说明此分子标记显著影响猪的肌内脂肪性状,可以通过对猪的此SNP位点的辅助选择,从而提高该群体的肌内脂肪含量,进而加快育种进程。
另外根据表1及图2可知,AA型、AG型比GG型的平均肌内脂肪含量低,GG型较AA型、AG型显著,而AA型与AG型不显著,说明等位基因A对肌内脂肪含量是不利的。肌内脂肪含量是衡量猪肉质品质的重要指标,肌内脂肪含量在适宜范围高说明猪的肉质品质好。因此,淘汰AA、AG基因型的猪可带来更多的经济效益,我们在进行育种的过程中需要淘汰AA、AG型的种猪,保留GG型的种猪,以逐代提高该位点的等位基因G的频率。
表1分子标记的SNP位点g.381A>G与肌内脂肪的相关性
6、目的DNA序列扩增及测序
(1)引物设计
通过Ensembl网站(http://asia.ensembl.org/index.html)下载猪的7号染色体上SEQ ID NO:1的DNA序列。并利用引物设计软件primer premier 6.0设计引物。
设计的引物的DNA序列如下所示:
SEQ ID NO:2
P001正向:5’-GATCGTGGTGATGGTTTC-3’,
SEQ ID NO:3
P002反向:5’-GTTTATCCCTTTAGTTTCCT-3’;
(2)PCR扩增
10uL的反应体系中加入DNA模板1uL,双蒸水3.4uL,2×Tag PCR StanMix withLoading Dye 5uL,引物P001和P002各0.3ul。PCR反应条件为:94℃预变性5min后,94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s,35个循环,最后72℃延伸5min。
(3)DNA序列测定
DNA序列测序鉴定:在深圳华大基因科技有限公司进行,基因片段测正反两个反应。将所测得的序列与NCBI基因组序列对比,得出对应SNP位点的突变。测序结果如下所示:SEQ ID NO:1
注:序列表中标注的M为突变位点,用标有下划线显示(括号中为突变碱基,为等位基因突变),在该序列的首尾加粗显示为设计引物序列位置。
7、分子标记的SNP位点g.381A>G效应分析
通过对分子标记辅助选择,对群体内基因型为AA的猪进行淘汰,我们显著提高了群体的肌内脂肪含量,使肉质嫩滑可口、味美多汁,使商品猪肉的品质更加符合人们的期待以及口味,从而带动了猪肉销量的增长,这将给企业带来巨大的经济收益。
本发明通过对SEQ ID NO:1序列中的第381个位碱基突变位点进行检测,初步进行其基因型与猪的肌内脂肪性状之间的关联分析的应用,为猪的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种影响杜洛克种猪肌内脂肪含量的分子标记及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 749
<212> DNA
<213> 猪(swine)
<400> 1
gatcgtggtg atggtttcaa aagcgaatat gaggggttcc tgtcgtggct cagtggaaac 60
gaacaccact cttatccatg aggatgagag ttctatccct ggcctcgctc agtgggttaa 120
ggatcctgca ctgccgtgag ctgaggtata ggctgcagat gaggcctgga tcctgcatgg 180
ctgtggttgc agtgtaggcc agtgactgca gctctgattc gacccctagc ctggaaactt 240
ccatatggtg cacgtgaggc cctaaaaagc caaaaaataa aataagtgta tacatacaca 300
gataaaaact tatccaactg tgcactttaa acatatacgg tttattatgt gtcaaatata 360
cctcaataaa gctgttcaaa atatgatgac atttaaatgt ttgaacaaag ggttgagaga 420
caacgtcaag gaaagttccc caaagaagaa taggaattaa gaaagtctag gagttcccgc 480
tgtggtgcag ggggctaaga atctgactgc agcagctctg gtccctgtgg aggtgcaggt 540
ttgaaccctt gctcagcaca ggggtttaaa ggatctggtg ttgccacggc tgcagttcag 600
attcagtccc tggcccagga acttccatat gccacaggtg tggacataaa aaagaaagaa 660
aagaaaagaa attctaagag ttagtcaatc caggtggttc agaatctgag aaagagagtt 720
ctaggaaata ggaaactaaa gggataaac 749
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gatcgtggtg atggtttc 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtttatccct ttagtttcct 20

Claims (9)

1.一种与猪肌内脂肪含量相关的SNP分子标记,其特征在于,所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,其序列中的M是G或A,导致猪肌内脂肪含量出现多态性。
2.根据权利要求1所述的SNP分子标记,其特征在于,所述SNP分子标记的位点为国际猪参考基因组11.1版本7号染色体上第117427086个核苷酸位点,该位点的碱基是G或A。
3.一种用于检测如权利要求1或2所述的SNP分子标记的引物对,其特征在于,所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
4.如权利要求3所述的引物对在提高猪肌内脂肪含量中的应用。
5.一种检测猪肌内脂肪的方法,其特征在于,检测猪SEQ ID NO:1所示序列中,M标记的单核苷酸是G还是A。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,采用权利要求3所述的引物对进行检测。
7.一种提高猪肌内脂肪含量的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
检测猪的国际猪参考基因组11.1版本7号染色体上第117427086个核苷酸位点的基因型,选择第117427086个核苷酸位点的GG型个体作为种猪,或者检测猪SEQ ID NO:1所示序列中,M标记的单核苷酸是G还是A,选择M为G的个体作为种猪。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)提取待测猪的基因组DNA;
(2)采用权利要求3所述的引物对,将所述待测猪的基因组DNA进行PCR扩增,以便获得PCR扩增产物;
(3)对所述PCR扩增产物进行测序,以便获得测序结果;
(4)基于所述测序结果,确定所述待测猪的如权利要求1或2所述的SNP分子标记的基因型,淘汰该位点的AA型和AG型个体,以逐代提高该位点的纯合基因型GG型的频率,从而提高后代的肌内脂肪含量。
9.根据权利要求1-2、4-8任一所述的方法,其特征在于,所述种猪包括杜洛克及其合成系。
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