CN108728552B - 一种影响杜洛克猪眼肌面积性状的分子标记及应用 - Google Patents

一种影响杜洛克猪眼肌面积性状的分子标记及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子标记辅助选择技术及动物遗传育种领域，公开了一种影响猪眼肌面积的SNP分子标记及其应用。所述SNP分子标记为猪基因组第6号染色体第35091111位碱基由A到G的位点突变，对应于SEQ ID NO:1所示序列中的第214bp处(命名为：g.214 T>G)。利用本发明的引物对，以猪基因组DNA为模板进行PCR扩增，可以得到与猪眼肌面积性状紧密连锁的SNP分子标记。本发明提供的分子遗传标记可以用于种猪的眼肌面积的筛选，能够有效提高猪的眼肌面积及肉质性状。

Description

一种影响杜洛克猪眼肌面积性状的分子标记及应用
技术领域
本发明属于分子标记辅助选择技术及动物遗传育种领域，特别涉及一种影响眼肌面积性状的分子标记及其应用。
背景技术
我国是世界上猪肉生产和猪肉消费的第一大国。近些年来，随着猪肉总量和人民生活水平的提高，人民对高品质的猪肉需求越来越高。眼肌也叫背最长肌，是猪全身最鲜嫩的肉，营养丰富，味美，易消化。眼肌就是高品质猪肉的代表。因此提高高品质猪肉产量成为新的育种目标，而眼肌面积作为影响猪肉品质的主要因素，成为猪育种计划的一部分。
目前，利用基因组扫描法和候选基因法已经发现了与猪的眼肌面积性状显著相关的322个QTLs，分布在所有的染色体上。但是这两种方法还是有着自身无法克服的缺陷。QTL连锁分析的一致性检验会受到不同资源家系群体的影响，而且一个QTL的区域很大，往往包括上百个候选基因，要做到精细定位QTL同时找到更多的相邻连锁标记也比较困难，而在基因定位中，由于现用定位材料的局限性，常常存在定位不准确的问题，而且在数量性状基因座QTL定位的技术中，并不是所有的目标QTL都可以被检测出来，且QTL与环境存在互作、以及大效应的QTL对小效应的QTL的掩盖等问题。候选基因法必须选择功能已知的候选基因作为目标基因，基本不能鉴别出新的基因。GWAS是目前为止鉴定SNPs、候选基因或候选基因家族的一种更为有效的方法。眼肌面积性状与产肉性能有强相关关系，眼肌面积越大，饲料利用率与瘦肉率也越高。对于眼肌面积的选择可以促进其他的经济性状的提升。
杜洛克(Duroc)是世界上著名的瘦肉型猪种之一。其具备生长快，饲料转化率高，胴体瘦肉率高，肌内脂肪含量较高，抗逆性强的特点。国内商品猪生产已建立起较为成熟的杂交配套体系。其中杜长大的杂交组合在我国的内销和外销市场中持续保持绝对的优势地位。
发明内容
为克服上述现有技术中存在的缺点与不足，本发明的首要目的是提供一种影响眼肌面积性状的SNP分子标记及其用途，以实现猪眼肌性状的遗传改良。
本发明的上述目的通过以下技术手段实现：
一方面，本发明提供了一种影响眼肌面积性状的SNP分子标记，所述的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中序列中的M是T或G，该分子标记的SNP位点为SEQ IDNO:1序列片段标注位置g.214T>G，其差异导致眼肌面积的不同。所述分子标记的SNP位点对应于国际猪参考基因组11.1版本6号染色体上第35091111bp处的T>G突变。
另一方面，本发明还提供一种用于检测上述分子标记的引物对，所述引物对的核酸序列如下所示：
上游引物如SEQ ID NO:2所示；
下游引物如SEQ ID NO:3所示。
另一方面，本发明还提供上述的分子标记、引物对、试剂盒在研究/鉴定/检测/调节的猪眼肌面积性状，或者是猪繁殖育种中的应用。进一步地，所述的繁殖育种优选为分子标记辅助选择。
另一方面，本发明还提供了一种鉴定眼肌面积性状的方法，其包含如下步骤：检测SEQ ID NO:1序列的5’端第214bp是T还是G(即SEQ ID NO:1序列中的M标记处是T还是G)。该方法可以在猪生长早期对眼肌面积性状进行鉴定，
作为优选的实施方式，采用上述的引物对进行检测。
另一方面，本发明还提供一种眼肌面积性状的遗传改良方法，所述方法包括：确定种猪核心群中种猪的上述分子标记，并根据上述分子标记做出相应的选择：种猪的继代选育国际猪参考基因组11.1版本6号染色体上35091111bp处的TT型个体，淘汰该点的GG型和GT型个体
更具体地，所述的方法包括以下步骤：
(1)提取待测猪的基因组DNA；
(2)采用上述的引物对，将所述待测猪的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；
(3)对所述PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果；
(4)基于所述测序结果，确定所述待测猪SEQ ID NO:1所述的SNP分子标记的基因型，淘汰该位点的GG型和GT型个体，以逐代提高该位点的纯合基因型TT型的频率，从而提高眼肌产量。
本发明中，所述的种猪包括杜洛克猪及其合成系。
本发明相对于现有技术具有如下优点及效果：本发明提供一种早期鉴定杜洛克猪及其合成系的眼肌面积的分子标记，使用该分子标记进行标记辅助选择，使得眼肌面积的早期鉴定更加方便易行，为选种人员更加准确判断猪眼肌面积大小，可以直接的提高眼肌产量，加快育种进程，具有重要的经济效益。
附图说明
图1为所述三种基因型个体的表型统计；
图2为全基因组关联分析(GWAS)提供的与眼肌面积性状显著相关的SNP图；
图3为检测眼肌面积显著相关SNP的测序峰图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实验猪群：本实验一共使用种猪核心群2309头纯种杜洛克猪。
实施例1为具体解释得到本发明中眼肌面积的发明过程。
表型数据采集：眼肌面积使用求积仪测定猪最后肋骨处背最长肌横截面的面积。眼肌面积＝眼肌高(cm)×眼肌宽(cm)×0.7。上述实验在广东温氏食品集团股份有限公司的华东育种种猪场中进行，所有杜洛克猪饲养于长×宽×高为2.1m×0.7m×1.1m规格的限位栏中，自由饮水，并按统一饲养标准，统一日粮饲喂，定时定量采食。
实施例2为具体解释得到本发明中基因标记的发明过程。
(1)组织DNA提取与质控：采集上述实施例1中杜洛克母猪的耳组织，及时将耳组织浸泡于75％乙醇中置于-20℃冰箱备用。参照苯酚-氯仿法提取杜洛克母猪的全基因组DNA，用Nanodrop-ND1000核酸浓度仪和琼脂糖凝胶电泳对杜洛克母猪的DNA进行浓度测定和质量检测。具体地是将核酸浓度仪测得的A260/280比值在1.8-2.0，A260/230比值在1.7-1.9判定为纯度合格，将浓度高于300纳克/微升判定为浓度合格；将纯度及浓度合格的DNA样品统一稀释成50纳克/微升。再6μl稀释过的DNA样品与2μl Loading Buffer混合，上样到1％的琼脂糖凝胶中，150V电压下电泳25min，在紫外分光光度仪和凝胶成像设备下观察并拍照，观察DNA的完整度。将浓度、纯度及完整度都合格的DNA样品判定为质量合格样品。
(2)基因分型与标记质控：将上述获得的合格DNA样品送至纽勤生物科技(上海)有限公司，在Illumina Beadstration平台上，采用公司标准化流程进行芯片杂交与结果扫描。最后通过GenomeStudio软件读取基因型数据。然后利用PLINK软件对所有样本80K芯片的基因型数据进行质量控制，剔除检出率<90％，最小等位基因频率<0.05，偏离哈代温伯格平衡(Hardy-Weinberg Equilibrium，HWE)P≤10-6以及处于未知位置和性染色体上的SNP标记，删除SNP检出率<90％的个体最终得到50206个SNP的有效基因型数据。
(3)全基因组关联(GWAS)分析：为了消除群体层化效应，本发明采用线性混合模型单点回归分析并结合GEMMA软件包进行GWAS分析，分析模型中利用个体间基因组的相似度校正层化效应。采用Bonferroni法确定全基因组关联分析的显著性阈值，基因组水平的显著阈值为0.05除以有效SNP位点数量，即0.05/50206＝9.96e-7；染色体水平显著阈值为1除以有效SNP位点数量，及1/50206＝1.99e-5。GWAS结果显示，猪6号染色体上存在与杜洛克眼肌面积性状显著相关的SNP位点(图2)。
实施例3具体解释发明检测SNP标记的发明过程。
(1)含有与杜洛克猪眼肌面积显著相关SNP位点的目的片段的扩增目的片段为6号染色体中一段745bp的核苷酸序列，序列扩增的上下游引物为：
SEQ ID NO:2上游引物5’—GGGGTTCCACACTCATATCCTC—3’
SEQ ID NO:3下游引物5’—ATGGGTACAGGGGTGAGGTAT—3’
(2)PCR扩增体系以及条件设置：配置30ul体系，其中包括DNA样品1ul，上游引物0.9ul，下游引物0.9ul，PCR Mix 15ul,ddH2O 12.2ul；PCR条件设置为94℃预变性2min，94℃变性30s，57.5℃退火30s，72℃延伸60s，共38个循环，最后延伸为72℃10min。
(3)DNA序列测序检测：PCR产物送至深圳华大基因科技有限公司进行双向测序。将测得的序列与NCBI数据库中猪基因组序列对比，得出对应SNP位点的突变。然后就可以通过SNP分子标记与纯种杜洛克眼肌面积的关联分析的应用，为猪的分子标记辅助选择提供一个新的标记。
测序结果如下所示:
SEQ ID NO:1
序列表中标注的M为突变位点，用标有下划线显示(括号中为突变碱基，为等位基因突变)，在该序列的首尾加粗显示为设计引物序列位置。
表1.分子标记的SNP位点g.214T>G与眼肌面积的相关性
根据表1可知，分子表的SNP位点g.214T>G和眼肌面积性状极显著相关(P<0.001)，说明了此分子比较显著影响猪的眼肌面积性状，可以通过对猪的该SNP位点进行辅助选择，从而加快该群体的眼肌面积的遗传进展。
根据表1还可知，GG型比GT型和TT型的眼肌面积小，说明T为优势等位基因。眼肌面积是重要的肉质性状，更大的眼肌面积意味着更大的眼肌。因此淘汰GG型和GT型，保留TT型的种猪，可以逐步的提高优势等位基因T的频率，从而带来更大的经济效益。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种影响杜洛克猪眼肌面积性状的分子标记及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 745
<212> DNA
<213> 猪(swine)
<400> 1
ggggttccac actcatatcc tccttgctca ggtggaacat ctttcatctg ccatgtatga 60
aaagctcagg gttcactctg cttggctcgg attggtcaca tgcccaaccc ggacccagcc 120
tccgtggctg agggatgcag tgctctttgg ccaggcctgg ggtacctgaa ttacatagcg 180
gcaatgtttg ctcaaggaag acagggctgc tccmacagaa ggtgggcttg ggtgctagat 240
gggctaaaaa gcctggagca ctccacctcg gtcatcagga agcatccctt tgaactttgc 300
tcatgtacca tgcaggcttg aacctgactg cctggttcta atcccaggtc tgcgtcttac 360
ttactctgtg acattgggca agttgcttaa atctctggac ctcagtttcc tcatctgtag 420
aaaggaacca acactagtac atatagccca tagggttgtt atcaagatca agtgatttaa 480
ctcagataaa gcactcagag cgatgcctgg cacataataa gcacttaaat aaatgtcagc 540
taccgctggt tttcattaat accctcactt actcattaac tctcttgcac tcagataaga 600
tgaataaatc atagtctgtg tttcataacg gaactcacag agggattctg tgattatttt 660
ttgcttattt attcaagaaa tatttattaa acacttacta tgtgcttagg tactgtgcta 720
agctatgggt acaggggtga ggtat 745
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggggttccac actcatatcc tc 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgggtacag gggtgaggta t 21

Claims (6)

1.一种引物对，其特征在于：所述引物对的核酸序列如下所示：
上游引物如SEQ ID NO：2所示；
下游引物如SEQ ID NO：3所示。
2.权利要求1所述引物对在杜洛克猪的眼肌面积性状检测中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的引物对检测SEQ ID NO:1所示的分子标记，其中序列中的M是T或G，导致猪眼肌面积的不同。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的分子标记的位点位于国际猪参考基因组11.1版本6号染色体上35091111bp处。
5.一种杜洛克种猪的遗传改良方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：确定杜洛克种猪SEQ ID NO:1所示的分子标记，选择第214位核苷酸位点的TT型个体作为杜洛克种猪；或者，杜洛克种猪的继代选育国际猪参考基因组11.1版本6号染色体上35091111bp处的TT型个体，淘汰该点的GG型和GT型个体；采用权利要求1所示的引物对扩增SEQ ID NO:1所示的分子标记。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的方法具体包括以下步骤：
提取待测杜洛克猪的基因组DNA ；
（2） 将所述待测杜洛克猪的基因组DNA 进行PCR 扩增，以便获得PCR 扩增产物；
（3） 对所述PCR 扩增产物进行测序，以便获得测序结果；
（4） 基于所述测序结果，确定所述待测杜洛克猪SEQ ID NO:1所示分子标记的基因型，淘汰该位点的GG型和GT型个体，以逐代提高该位点的纯合基因型TT型的频率，从而提高眼肌产量。
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