CN104561306A - 一种与猪眼肌面积性状有关的猪unc13b基因snp标志物 - Google Patents

一种与猪眼肌面积性状有关的猪unc13b基因snp标志物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种与猪眼肌面积性状有关的猪UNC13B基因SNP标志物，该标志物为UNC13B(Sscrofa？10.2)基因chr1:263861722位点T-C的突变。本发明还提供了用于检测所述SNP标志物的特异性引物。利用本发明所提供的方法可以通过对猪UNC13B基因单碱基多态的判断获得猪眼肌面积性状，从而为猪的育种工作提供指导，选育具有最大猪眼肌面积的TT型猪进行育种和培养。

Description

一种与猪眼肌面积性状有关的猪UNC13B基因SNP标志物
技术领域
本发明涉及分子遗传学中的遗传标记检测领域，具体涉及一种与猪眼肌面积性状有关的猪UNC13B基因SNP标志物。
背景技术
我国是一个养猪大国，猪肉产量和质量的市场需求日益增加，提高猪肉产量、改善猪肉胴体质量，成为育种科学家长期以来不断探索的工作。早期的育种工作主要集中于猪的表型选择，随着基因组工作的不断推进和遗传标记的广泛开发，分子选择正逐步成为可靠而有效的选择方法，结合表型与遗传标记的群体全基因组关联分析被广泛应用。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指群体中正常个体的基因组DNA内特定核苷酸位置上存在两种或两种以上不同的碱基(等位基因)，其中最少一种在群体中的频率不少于1％。SNP作为第3代遗传标记，具有量大、高频率、低突变率等优点，广泛应用于基因组分析、生物信息自动化检测、简单和复杂疾病的遗传研究、畜牧育种遗传标记及全球种族遗传学研究等。
目前，对猪SNP遗传标记的开发和研究已取得一定的成果，如ESR和FSH基因的多态性影响繁殖性状，IGF1基因SNP影响生长性状，MSTN和FST基因跟猪胴体性状相关，Ha1基因影响猪肉质性状等。随着基因组技术的开展，已经找到的猪单碱基突变达两千八百多万，然而如何有效的利用现有的数据和愈来愈低的测序成本挖掘出的新数据，开展猪的育种工作，改善猪的胴体质量，将成为育种工作者长期而艰巨的任务。
猪眼肌面积指猪最长肌的横断面面积，眼肌面积＝眼肌高(cm)×眼肌宽(cm)×0.7。猪个体的瘦肉率越高眼肌面积越大，由于眼肌面积性状与家猪产肉性能有强相关性，所以在育种上显得尤为重要。UNC13B基因在肾皮质上皮细胞中表达，在高血糖症细胞中表达上调，关于该基因的GO注释有甘油二酯结合活力和信号传导活力，但目前还没有就该基因的单核苷酸多态性与眼肌面积的相关性的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用UNC13B基因单碱基多态判断猪眼肌面积(LM)性状的方法。
为达到以上目的，本发明的发明人研究了温氏大崀原种场杜洛克F2代资源群体，记录了F0、F1和F2代个体的眼肌面积等性状，前期工作随机挑选5头杜洛克公猪和5头杜洛克母猪对UNC13B(Sscrofa 10.2)基因设计引物进行长片段PCR扩增，PCR产物胶回收后进行ion torrent平台测序和samtools筛选SNPs，结果在基因组位置为1号染色体正链263861722的位点找到一个T-C的突变，对应UNC13B基因CDS区发生AAT(天冬酰胺)-AAC(天冬酰胺)的同义突变，以该SNP位点上下游序列为模板设计基因分型引物(ASP1和ASP2)，利用GT48.48芯片(Fludigm)，在200个大崀原种场杜洛克F2代资源群体进行Fludigm基因分型，考虑性别以广义线性模型进行基因型与眼肌面积性状关联分析，各基因型的最小二乘均值：TT型纯合子的眼肌面积为46.99±1.90，TC型杂合子的眼肌面积为38.59±0.56，CC型纯合子的眼肌面积为39.30±0.53，结果显示TT型纯合子的猪眼肌面积性状显著高于杂合子和CC型纯合子的猪(P＝0.0597)。
由此，得到一种与猪眼肌面积性状有关的猪UNC13B基因SNP标志物，该标志物为UNC13B(Sscrofa 10.2)基因chr1:263861722位点T-C的突变
本发明还提供了一种用于检测所述的SNP标志物的特异性引物，所述引物为：
STA：5′-CACACTCATTGTATCAATCATAGAGGAA-3′
LSP：5′-AACCACCAAAGAGAGAGAGCCA-3′
ASP1：5′-AGAATTCCTACACGCTTGTTCTGAAT-3′
ASP2：5′-GAATTCCTACACGCTTGTTCTGAAC-3′
其中，STA(SEQ ID NO.1)为预扩增上游引物，LSP(SEQ IDNO.2)为预扩增下游引物，ASP1(SEQ ID NO.3)为分型引物1，ASP2(SEQ ID NO.4)为分型引物2；
STA和LSP用于通过预扩增PCR获得UNC13B(Sscrofa 10.2)基因chr1:263861722位点上下游共99bp的序列，ASP1和ASP2用于鉴定待测猪个体的UNC13B(Sscrofa 10.2)基因chr1:263861722位点的基因型。
本发明提供了一种检测所述的SNP标志物的方法，包括以下步骤：
预扩增PCR：以待测猪基因组DNA为模板，本发明所提供的引物STA和LSP通过PCR反应获得UNC13B(Sscrofa 10.2)基因chr1:263861722位点上下游共99bp的序列(如SEQ ID NO.5所示):CACACTCATTGTATCAATCATAGAGGAAGATAAGAATTCCTACACGCTTGTTCTGAA[T/C]CAGTAAGTATCACCTCACTTGGCTCTCTCTCTTTGGTGGTT，其中[T/C]所标注的位置为SNP位点。
鉴定PCR：以预扩增产物为模板、ASP1和ASP2为引物，获得鉴定PCR扩增产物，判定UNC13B(Sscrofa 10.2)基因chr1:263861722位点的SNP标志物的基因型。
其中，所述预扩增PCR的反应体系为：
预扩增PCR的反应程序为：95℃预变性15min；95℃变性15s，60℃退火4min，14个循环；72℃延伸5-8min。
其中，所述鉴定PCR的反应可以根据所使用的基因分型芯片的说明书所给出的反应程序和体系进行。例如，所述基因分型芯片可以为基于Fludigm基因分型平台的基因分型芯片(美国FLUDIGM公司生产)。
本发明还提供了一种检测猪眼肌面积性状的试剂盒，所述试剂盒中含有本发明所提供的特异性引物。
本发明还提供了所述SNP标志物或所述引物在猪育种中的应用。所述应用包括：通过利用所述特异性引物对猪UNC13B(Sscrofa 10.2)基因chr1:263861722位点的基因型进行检测，选择与最大猪眼肌面积性状相关的TT型猪进行培育。
利用本发明所提供的方法可以通过对猪UNC13B基因单碱基多态的判断获得猪眼肌面积性状，从而为猪的育种工作提供指导，选育具有最大猪眼肌面积的TT型猪进行育种和培养。
具体实施方式
下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。
实施例1
本实施例为利用Fludigm基因分型方法检测杜洛克不同个体基因型以及与眼肌面积性状关联分析。
1、试验材料
200个大崀原种场杜洛克F2代资源群体。
2、实验试剂
基因组提取试剂盒购自Promega，PCR预扩增酶试剂盒购自Qiagen，基因分型芯片和基因分型试剂盒购自Fludigm，基因分型PCR酶试剂盒购自Biotium，染料ROX购自Invitrogen。
3、基因组DNA的提取
杜洛克猪耳组织经组织提取液和蛋白酶K过夜消化后，用Promega公司的DNA Purification Kit提取，ddH2O溶解,终浓度调节至80-120 ng/μl，-20℃保存。
4、PCR预扩增
预扩增反应体系为：
预扩增反应条件为：95℃预变性15min；95℃变性15s，60℃退火4min，14个循环；72℃延伸5-8min。
5、GT48.48芯片的初始化
将300μl控制液注入GT48.48，去除芯片底部的蓝色保护膜，将芯片转入MX收集器，运行Prime(124x)程序。
6、引物配制：
1)配制Assay mix：
ASP1/2(100μM):   3μl
LSP(100μM):      8μl
ddH2O:            29μl
2)配制10 X Assay
2 X Assay Loading Reagent:         2.5μl
ddH2O:                             1.5μl
Assay mix:                         1μl
7、样品混合物配制：
8、芯片进样
取4μl 10X Assay和5μl样品混合物分别加入芯片的引物上样孔和样品上样孔，加好样的芯片放回MX控制器中，运行Mix(124X)程序完成进样。
9、数据收集
完成进样的芯片置入BioMark HD机器，利用基因分型PCR程序进行扩增并搜集荧光信号，实验完成后利用SNP GenotypingAnalysis软件得到样品的基因型信息。
10、数据分析
利用Fludigm基因分型得到各个体的基因型，结合温氏大崀原种场F2代杜洛克资源群体的表型记录，将性别作为固定效应，由于表型记录均已通过年龄校正，因此，不考虑年龄作为固定效应，根据广义线性模型Y＝μ+Xβ+ε，利用SAS System for Windows 9.0进行基因型与眼肌面积性状的关联分析：
结果显示TT型纯合子的猪眼肌面积性状显著高于杂合子和CC型纯合子的猪(P＝0.0597)，各基因型的最小二乘均值如表1所示。
表1
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种与猪眼肌面积性状有关的猪UNC13B基因SNP标志物，其特征在于，该标志物为UNC13B(Sscrofa 10.2)基因chr1:263861722位点T-C的突变。
2.一种用于检测权利要求1所述的SNP标志物的特异性引物，其特征在于，所述引物为：
STA：5′-CACACTCATTGTATCAATCATAGAGGAA-3′
LSP：5′-AACCACCAAAGAGAGAGAGCCA-3′
ASP1：5′-AGAATTCCTACACGCTTGTTCTGAAT-3′
ASP2：5′-GAATTCCTACACGCTTGTTCTGAAC-3′
其中，STA为预扩增上游引物，LSP为预扩增下游引物，ASP1为分型引物1，ASP2为分型引物2；
STA和LSP用于通过预扩增PCR扩增UNC13B(Sscrofa 10.2)基因chr1:263861722位点上下游的序列获得99bp预扩增产物，ASP1和ASP2用于鉴定待测猪个体的UNC13B(Sscrofa 10.2)基因chr1:263861722位点的基因型。
3.一种检测权利要求1所述的SNP标志物的方法，其特征在于，包括利用权利要求2中所述的引物进行以下步骤：
预扩增PCR：以待测猪基因组DNA为模板，STA和LSP为引物通过PCR反应获得UNC13B(Sscrofa 10.2)基因chr1:263861722位点上下游共99bp的预扩增产物；
鉴定PCR：以预扩增产物为模板、ASP1和ASP2为引物，获得鉴定PCR扩增产物，判定所述SNP标志物的基因型。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，预扩增PCR的反应体系为：
预扩增PCR的反应程序为：
95℃预变性15min；95℃变性15s，60℃退火4min，14个循环；72℃延伸5-8min。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，鉴定PCR的反应以预扩增产物为模板、ASP1和ASP2为引物，按照所使用的基因分型芯片所给出的程序进行SNP位点基因型鉴定。
6.一种检测猪眼肌面积性状的试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的特异性引物。
7.权利要求1所述的SNP标志物或权利要求2所述的引物在猪育种中的应用。
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