CN101899516B

CN101899516B - 一种检测鸭群体中体尺性状的方法及试剂盒

Info

Publication number: CN101899516B
Application number: CN2010102343173A
Authority: CN
Inventors: 李宁; 黄银花; 吴非
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-07-23
Filing date: 2010-07-23
Publication date: 2012-11-14
Anticipated expiration: 2030-07-23
Also published as: CN101899516A

Abstract

本发明公开了一种检测鸭群体中体尺性状的方法及试剂盒。本发明提供的检测鸭群体中体尺性状的方法是检测鸭的FABP2基因第三外显子的一个错义突变SNP是T或是C，判定待测鸭样本的基因型，以确定其体尺性状。本发明所提供的试剂盒，包括特异扩增FABP2基因第三外显子的PCR扩增引物；其他PCR扩增试剂；限制性核酸内切酶Hpy99I及其酶切缓冲液。本发明方法及试剂盒操作简单快捷，结果稳定可靠，用于辅助育种筛选，具有早期筛选、节省时间、成本低廉、准确性高的优点，将有广阔的应用前景。

Description

一种检测鸭群体中体尺性状的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及检测鸭群体中体尺性状的方法及试剂盒。

背景技术

体尺性状一直都是畜牧业生产中重要的经济性状，也是肉鸭品种选育中的重要指标。随着家禽生产性状相关的遗传学研究的深入，大量的性状已经定位到染色体上较小的区间，为候选基因的研究以及后续遗传标记辅助育种的应用奠定了良好的基础。

SNP(Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性)主要是指在基因组DNA序列上发生的单个核苷酸碱基的变异，包括转换、颠换、插入或缺失突变。在基因组中含有大量的SNP，禽类基因组大约100个碱基存在一个SNP，由于其分布广泛，同时适合大量快速筛查和基因分型分析，SNP标记已广泛的应用于基因定位、序列进化分析等研究，对在农业动物中进行的分子标记辅助育种选择也有巨大的促进作用。

SNP的筛查一般采用测序的方法，如Sanger测序法。针对特定SNP的检测也有很多适合不同通量水平的成熟技术，检测1-10个少量SNP通常采用单链构象多态性(SSCP)、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、焦磷酸测序(Pyrosequencing)等技术。

细胞内脂肪酸结合蛋白(Fatty Acid-Binding Protein，FABPs)属于一个约有20个家族成员的多基因家族，至少可分为肝脏、肠、心脏三种类型，是一类分子量较小(14-15kDa，千道尔顿)的蛋白。一般认为它参与长链脂肪酸及其酰基辅酶A酯的吸收[Glatz JF，Luiken JJ，van Nieuwenhoven FA，Van der Vusse GJ.Molecular mechanism ofcellular uptake and intracellular translocation of fatty acids.Prostaglandins Leukot.Essent.Fatty Acids(1997)57(1)：3-9.]、细胞内代谢和/或转运[Storch J，Thumser AE.The fatty acid transport function offatty acid-binding proteins.Biochim.Biophys.Acta(2000)1486(1)：28-44.]，同时对细胞生长和增殖也有调控作用。

肠型FABP2基因是小肠上皮细胞中极其丰富的胞质蛋白，在人类疾病研究中表明，54位密码子存在多态性(丙氨酸与苏氨酸的变化)，该变异与脂肪氧化和胰岛素耐受相关[Chiu KC，Chuang LM，Yoon C.The A54T polymorphism at the intestinal fatty acid bindingprotein 2is associated with insulin resistance in glucose tolerantCaucasians.BMC Genet(2003).2：7]。FABP2参与富含甘油三酸酯的脂蛋白合成，对饱和的长链脂肪酸有较高亲和力，可能作为脂质传感器维持着机体的能量自稳平衡[Kaikaus RM，Bass NM，Ockner RK.Functions of fatty acid binding proteins.Experientia(1990)46(6)：617-30.]。因此，将FABP2基因作为候选基因研究其与生长性状(体尺性状)的关系对肉鸭的育种有很大的价值和意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测鸭群体不同体尺性状的方法以及用于该体尺性状检测的试剂盒。

本发明研究发现位于鸭的FABP2基因第三外显子的该SNP与体尺性状具有显著相关的特性，可以作为鸭的遗传标记。

进而，本发明提供一种检测鸭群体体尺性状的方法，其是通过检测鸭FABP2基因的第92位核苷酸来确定鸭群体体尺性状。所述的鸭FABP2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1或2所示。当待检鸭基因组中的FABP2基因的第92位核苷酸为纯合T时，为AA型；当为纯合C时为BB型；当为T/C时，为AB型。

BB基因型鸭群体的体尺性状均值在统计学上均高于AA和AB基因型的鸭群体相应体尺性状均值。因而所述基因型可作为鸭群体体尺性状育种的辅助选择标记。

上述SNP位点可以通过扩增该段序列直接进行检测，或者用特异探针检测。本发明进一步包括用于鸭FABP2基因的第92位核苷酸鉴定的探针或引物。

在本发明实施例中，优选的鉴定引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.3和4所示。

用该引物鉴定的方法是：分别以每只待测鸭的基因组DNA为模板，该引物对进行PCR扩增，用限制性内切酶Hpy99I酶切PCR产物；得到一条DNA片段，待测鸭的基因型为AA；如果得到两条DNA片段，待测鸭的基因型为BB；如果得到三条DNA片段，待测鸭的基因型为AB。所述一条DNA片段具体为373bp的DNA片段；两条DNA片段具体为172bp的DNA片段和201bp的DNA片段；所述三条DNA片段具体为172bp的DNA片段、201bp的DNA片段和373bp的DNA片段。

以上任一所述的方法中，所述待测鸭具体可为CAU北京鸭资源家系的个体，更具体可为CAU北京鸭资源家系的F2代个体。

以上任一所述的方法中，所述体尺性状具体可为胸宽、体斜长、胫围和颈长。

本发明还包括含有上述探针或引物的试剂盒。当该试剂盒包含上述引物时，其还可以包括以下试剂中的一种或多种：PCR缓冲液、Mg²⁺、DNA聚合酶、dNTPs，限制性核酸内切酶Hpy99I及其酶切缓冲液。

本发明提供的方法和试剂盒可进行辅助育种，快速准确的辅助筛选，具有早期筛选、节省时间、成本低廉、准确性高的优点。

附图说明

图1为PCR扩增产物电泳图谱示意图；M：100bp Marker；1-3泳道：CAU北京鸭资源家系的3个不同个体；CK：空白对照。

图2为PCR产物酶切后电泳图谱；M：100bp Marker。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。

CAU北京鸭资源家系：由中国农业大学李宁教授课题组建立的用于定位研究影响鸭重要经济性状QTL、寻找克隆主效基因的F2杂交实验群体，亲本分别为北京鸭IV系(肉用型)和V系(蛋用型)；资源群体参考文献：Yinhua Huang，Yonghui Zhao，Chris S.Haley，Shengqiang Hu，Jinping Hao，Changxin Wu and Ning Li.[A Genetic andCytogenetic Map for the Duck(Anas platyrhynchos)].Genetics 173：287-296(May 2006)。

实施例1

由于鸭的全基因组序列未测，根据QTL初步定位结果，通过比较基因组学分析，获得已测序的鸟类——鸡染色体上的同源区域，分析这一区域的基因信息可以找到一些基因作为影响鸭体尺性状的候选基因进行深入研究，再通过文献检索分析，我们选择了影响机体脂肪合成、代谢和细胞增长的FABP2基因作为候选基因。

根据已公布的鸡FABP2基因序列(NC_006091)，比对得到鸭FABP2基因序列，并对其结构进行分析。针对外显子区域设计引物(正向引物：5′-AGACTTGAGGATTCTAACT-3′；反向引物：5′-CTCCCTTAAAGCACTC-3′)，对CAU北京鸭资源家系F1代个体进行测序分析，查找SNP。挑选SNP了位于第三外显子的一个错义突变SNP，在资源群体F2代个体中进行判型，并与体尺性状进行关联分析，并分析其作为标记辅助育种的价值。

一、FABP2基因错义突变SNP在F2代个体中的基因分型

实验材料：CAU北京鸭资源家系F2代个体，224个样本。

1、基因组DNA的提取

鸭7周龄时翅静脉采血，抗凝处理后裂解，经蛋白酶K消化后，用酚仿抽提，TE溶解-20℃保存。

2、利用试剂盒检测鸭群体的基因型

该试剂盒包括：PCR扩增的一对引物，正向引物序列为序列表中的序列3，反向引物序列为序列表中的序列4；其他PCR扩增试剂；限制性核酸内切酶Hpy99I及其酶切缓冲液。

(1)PCR扩增

PCR反应体系(20μl)：模板2μl(40ng步骤1提取的基因组DNA)，扩增缓冲液(10×buffer)2μl，10mM dNTP 1μl，正向引物0.3pm/ul，反向引物0.3pm/ul，DNA聚合酶(TaqE，高保真)0.2μl，加水补至20μl。

PCR反应条件：94℃、3min预变性；94℃、30sec，53℃、30sec，72℃、25sec，35循环；72℃、7min延伸。

PCR产物进行2％琼脂糖凝胶(见图1)，CAU北京鸭资源家系F2代个体均得到一条清晰的PCR扩增产物，大小近400bp(实际为373bp)，回收目的DNA片段。

(2)酶切

PCR产物纯化回收片段用Hpy99I进行酶切(37℃3h)。酶切体系(20μl)：PCR产物10μl，10倍缓冲液2μl，100μg/ml BSA，1UHpy99I(NEB公司)，用水补至20μl。

酶切产物用4％琼脂糖凝胶检测(见图2)。

产生三种带型：

第一种带型：只有一个条带，为373bp；将基因型命名为AA；

第二种带型：有两个条带，分别为172bp和201bp；将基因型命名为BB；

第三种带型：有三个条带，分别为172bp、201bp和373bp；将基因型命名为AB。

统计结果如表1。

表1：FABP2外显子3错义突变基因型频率和等位基因频率

从表1结果看，AB型为实验所用群体中的主要基因型，比例达到62.9％。

二、关联分析

采用SAS(9.0版)统计分析软件包的PROC GLM(广义线性模型)过程进行统计分析，对供试鸭群体的基因型和体尺性状进行方差统计分析。

统计分析模型：

Y_ijkl＝μ+G_i+S_j+H_k+F_l+e_igkl

Y_ijkl为个体的表型性状(体尺)观察值；

μ为群体均值；

G_i为基因型对表型性状的效应值；

S_j为性别对表型性状的效应值；

H_k为不同批次对表型性状的效应值；

F₁为家系对表型性状的效应值；

e_igkl为对应于观察值的随机残差效应。

分析结果见表2。

表2FABP2基因PCR-Hpy99I-RFLP的多态性与鸭群体体尺性状的

最小二乘均数

注：上标^a·b表示差异显著(P＜0.05)；^A、B表示差异极显著(P＜0.01)

其中在胸宽中，BB型对AA型达到差异显著(P＜0.05)；在体斜长中，BB型对AB型达到差异显著(P＜0.05)；而在胫围和颈长中，BB型对AB型达到差异极显著(P＜0.01)。

同时分析结果表明：在不同的体尺性状中，BB基因型群体性状均值均大于AA和AB基因型群体性状均值，BB型为优势基因型。本SNP位点可以作为一个遗传标记，应用于鸭体尺性状的分子遗传标记辅助选择，提高肉鸭的选种速度和育种准确性。

Claims

1.一种检测鸭群体体尺性状的方法，其通过检测鸭FABP2基因的第92位核苷酸来确定鸭群体体尺性状，所述的鸭FABP2基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1或2所示核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，如果待测鸭为具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的纯合体，其基因型为AA型；如果待测鸭为具有SEQ ID No1和2所示核苷酸序列的杂合体，其基因型为AB；如果待测鸭为具有SEQ ID No.2所示核苷酸序列的纯合体，其单倍型基因型为BB。

3.用于鸭FABP2基因的第92位核苷酸鉴定的探针。

4.用于鸭FABP2基因的第92位核苷酸鉴定的引物，其为：

Pf：AGACT TGAG ATTCT AACT

Pr：CTCCC TTAAA GCACT C。

5.含有权利要求3所述探针或含有权利要求4所述引物的试剂盒。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，其还包括以下试剂：PCR缓冲液、Mg²⁺、DNA聚合酶、dNTPs，限制性核酸内切酶Hpy99 I及其酶切缓冲液。

7.权利要求3所述的探针、权利要求4所述的引物或权利要求5或6所述试剂盒在鸭选育中的应用。