CN110846422A - 与猪产活仔数性状关联的分子标记及其应用 - Google Patents

与猪产活仔数性状关联的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了与猪产活仔数性状关联的分子标记及其应用，所述的分子标记位于猪DKK2基因第二内含子的部分DNA序列中，所述分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，该序列长度为631bp，在该序列中第261bp处存在一处A>G碱基突变；本发明还提供了与猪产活仔数性状关联的SNP检测试剂盒，包括：如SEQ ID NO.2～3所示的引物对。本发明首次发掘了猪DKK2基因第二内含子内与猪产活仔数性状相关的分子标记，为猪产活仔数性状的标记辅助育种提供了一个新的分子育种标记。

Description

与猪产活仔数性状关联的分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及分子标记筛选技术领域，尤其涉及与猪产活仔数性状关联的分子标记及其应用。
背景技术
母猪的繁殖性状是猪重要经济性状之一，但由于其遗传力低，导致母猪繁殖性状常规选择进展缓慢。随着分子生物学技术的兴起和迅速发展，发展了常规育种与标记辅助选择(MAS)相结合的方法，可以有效地加快猪产活仔数性状的选择进展。
DKK2属于DKK蛋白家族，是一类分泌性糖蛋白，通过拮抗WNT信号通路发挥作用，主要包括信号肽序列、辅酯酶折叠和富含半胱氨酸的两段保守结构域(Niehrs,2006)。对猪产活仔数性状的SNPs的表征对于通过猪产活仔数性状标记辅助选择具有十分重要的作用。迄今为止，尚无有关猪DKK2基因作为猪产活仔数性状的分子标记的研究的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了与猪产活仔数性状关联的分子标记及其应用，本发明发掘了与猪产活仔数性状关联的分子标记，为猪产活仔数性状的分子标记辅助育种提供了一种新的分子标记。
本发明的目的之一在于提供一种与猪产活仔数性状关联的分子标记，所述的分子标记位于猪DKK2基因第二内含子的部分DNA序列中，所述分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，该序列长度为631bp，在该序列中第261bp处存在一处A>G碱基突变。
本发明的目的之二在于提供一种用于扩增所述分子标记的引物对，包括：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的目的之三在于与猪产活仔数性状相关联的DKK2基因SNP的检测试剂盒，包括：用于扩增SEQ ID NO.1所示序列的引物对：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
作为以上实施方式之一，所述检测试剂盒还包括10×buffer、dNTPs、TaqDNA聚合酶。
本发明的目的之四在于提供所述的分子标记、所述的检测试剂盒在猪产活仔数性状标记辅助选择中的应用。
本发明的目的之五在于提供猪DKK2基因产活仔数性状相关SNP的检测方法，采用所述的检测试剂盒进行检测。
具体地，包括以下步骤：
步骤1、以从待测样本中提取的基因组DNA为模板，通过所述SEQ ID NO.2～3所示PCR引物进行PCR扩增，并对PCR产物进行纯化处理；
步骤2、使用遗传学分析仪检测所述纯化后的扩增产物，并使用基因分析软件对结果进行分析。
本发明的有益效果：
本发明首次发掘了猪DKK2基因第二内含子内与猪产活仔数性状相关的分子标记(8:g.114967878A>G)，所述的分子标记位于猪DKK2基因第二内含子的部分DNA序列中，该单核苷酸多态性(SNP)可以作为猪产活仔数性状的分子标记，为猪产活仔数性状的标记辅助育种提供了一个新的分子育种标记。
附图说明
图1是猪DKK2基因SEQ ID NO.1序列片段琼脂糖凝胶电泳图谱；
图2是本发明中猪DKK2基因8:g.114967878A>G位点的SANGER测序读取结果图；A图：AA基因型；B图：AG基因型；C图：GG基因型。
具体实施方式
实施例1猪DKK2基因SNP检测片段的获得及多态性位点检测方法的建立
1、猪基因组DNA的提取
本发明的试验猪品种为湖北省农业科学院畜牧兽医研究所和湖北天之力优质猪育种有限公司联合培育的黑猪新品系。猪基因组DNA的提取采用北京擎科新业生物技术有限公司生产的动物组织基因组DNA试剂盒(按该试剂盒说明书进行操作)提取。
2、猪DKK2基因SNP遗传标记检测片段的获得
(1)PCR扩增
根据猪DKK2基因的基因组序列(GenBank ID：NC_010450.4)中的SNP遗传标记检测序列(如SEQ ID NO.1所示)设计一对引物，扩增多态性位点的片段。引物如下：
扩增SEQ ID NO.1序列的上游引物：5'ATAAGGAATGTGAAGTTGGGAGAT 3'(SEQ IDNO.2所示)，下游引物：5'GCTTTGAGGAAGGCTAGGGA3'(SEQ ID NO.3所示)。
利用上述引物在黑猪新品系基因组DNA中进行PCR扩增，PCR反应体系50μL，体系中各组分的浓度为100ng模板DNA、10×buffer(含Mg2+)4μL、上述上下游引物各0.5μM、2.5μMdNTPs、1U TaqDNA聚合酶。
PCR的运行程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
(2)PCR产物纯化
上述PCR产物用上海生工生物工程有限公司的Gel Extraction Kit试剂盒进行纯化，具体步骤见试剂盒说明书。
3、将纯化后的PCR产物纯化后通过SANGER测序检测分子标记
将回收后的PCR产物交由北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行SANGER测序。
实施例2本发明制备的分子标记在黑猪新品系中的多态性分布检测
本实施例分别在黑猪新品系中检测猪DKK2基因第二内含子8:g.114967878A>G位点的多态性，检测结果如表1所示。
表1-DKK2基因8:g.114967878A>G位点在黑猪新品系中的基因型频率和等位基因频率
Figure BDA0002331660080000041
由表1结果表明：在黑猪新品系中DKK2基因8:g.114967878A>G位点表现为AA、AG或GG三种基因型，A等位基因频率为0.9，是优势等位基因，通过卡方检验发现8:g.114967878A>G位点在黑猪新品系中均符合哈代温伯格平衡(P>0.05)。
实施例3本发明制备的分子标记与猪产活仔数性状的关联分析及应用
为了确定猪DKK2基因8:g.114967878A>G位点与猪产活仔数差异是否相关，采用实施例1建立的方法进行多态性检测，并分析猪DKK2基因8:g.114967878A>G位点的不同基因型与猪总产仔数和产活仔数性状的相关性。采用SAS统计软件(SAS Institute Inc,Version 9.1)GLM程序进行不同SNP基因型组合的方差分析，并进行显著性检验，所采用模型为：
Yij＝μ+Gi+Fj+eij；
Yij为性状表型值，μ为平均值，Gi为基因型效应(包括基因加性效应和显性效应；加性效应用1，0和-1分别代表AA、AG和GG基因型，显性效应用1，-1和1分别代表AA、AG和GG基因型)；Fj为猪场综合效应；eij为残差效应。
在黑猪新品系中进行不同基因型与总产仔数和产活仔数性状间的关联分析，统计分析结果如表2所示：
表2-DKK2基因8:g.114967878A>G位点与猪产活仔数性状的关联分析
注：a和b表示差异显著(P<0.05)，*表示差异显著(P<0.05)。
由表2可以看出，在黑猪新品系中，8:g.114967878A>G位点的GG基因型的产活仔数显著低于AA基因型和AG基因型(P<0.05)，且显性效应均达到显著水平(P<0.05)，但该SNP位点在黑猪新品系中与总产仔数无显著关联。
所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 与猪产活仔数性状关联的分子标记及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 346
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcggctcaga tctggtgttg ctgtggctct ggtgtaggcc agcagcaaca gctccaattc 60
gacccctagc ctcggaacct ccacatgcca ggccctaaaa ggaccaaaga caaaaaagtg 120
aaataaaaaa ttaaaaagta aaaggacctt gtcaagttat ttgctaaatt ttgagcctca 180
gtcagattgg gagcaacaag ctcatctaag agtgactgaa aagcaaaaga actattatca 240
tataatcaga tggtacttta aaaagacaaa catcaggaag aaagactttg ataacaaagc 300
aagtgagagt tgaaagccca agaaagtggg gaactgacca tttgca 346
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ataaggaatg tgaagttggg agat 24
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gctttgagga aggctaggga 20

Claims (10)

1.一种与猪产活仔数性状关联的分子标记，其特征在于，所述的分子标记位于猪DKK2基因第二内含子的部分DNA序列中，所述分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，该序列长度为631bp，在该序列中第261bp处存在一处A>G碱基突变。
2.如权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述序列中第261bp处的A或G的碱基多态性位点，表现为AA、AG或GG三种基因型，其中A是优势等位基因。
3.一种用于扩增权利要求1-2任一所述分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对包括：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.一种与猪产活仔数性状相关联的DKK2基因SNP的检测试剂盒，其特征在于，包括用于扩增SEQ ID NO.1所示序列的引物对：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.如权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括10×buffer、dNTPs、TaqDNA聚合酶。
6.权利要求1-2任一所述的分子标记、权利要求4-5任一所述的检测试剂盒在猪产活仔数性状标记辅助选择中的应用。
7.一种猪DKK2基因产活仔数性状相关SNP的检测方法，其特征在于，采用权利要求4所述的检测试剂盒进行检测。
8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、以从待测样本中提取的基因组DNA为模板，通过所述SEQ ID NO.2～3所示PCR引物进行PCR扩增，并对PCR产物进行纯化处理；
步骤2、使用遗传学分析仪检测所述纯化后的扩增产物，并使用基因分析软件对结果进行分析。
9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述步骤1中PCR反应体系中包括模板DNA、10×buffer、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶。
10.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述步骤1中条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
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