CN110468215B - 猪spata6基因第十内含子内与猪精液品质性状相关的单倍型标记与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了猪SPATA6基因第十内含子内与猪精液品质性状相关的单倍型标记，所述的单倍型标记位于猪SPATA6基因第十内含子的部分DNA序列中，所述单倍型标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述单倍型标记包括：rs330516022位点的SNP：在所述序列的第34bp处存在一个C/T的等位基因突变；以及rs342323574位点的SNP：在第120bp处存在一个G/A的等位基因突变；本发明还提供了猪SPATA6基因精液品质性状相关SNP的检测试剂盒，包括：如SEQ ID NO.2～3所示的引物对；如SEQ ID NO.4～5所示的SNaPshot单碱基延伸引物。为猪精液品质性状的分子标记辅助育种提供了一种新的单倍型标记。

Description

猪SPATA6基因第十内含子内与猪精液品质性状相关的单倍型 标记与应用

技术领域

本发明涉及猪单倍型标记筛选技术领域，尤其涉及猪SPATA6基因第十内含子内与猪精液品质性状相关的单倍型标记与应用。

背景技术

公猪的繁殖力在猪生产中发挥重要的作用，一般通过鉴定精液的品质来衡量公猪的繁殖性能。精液品质的指标包括精液量、精子密度、精子形态及精子活力等。遗传作用和环境作用是影响精液品质的两个重要因素，环境因素可以进行人为的控制和改善，但只有提高遗传效率才能从根本上提高精液品质，提高公猪的繁殖力。由于公猪繁殖性状的遗传力低，导致常规选择进展缓慢。随着分子生物学技术的兴起和迅速发展，发展了常规育种与标记辅助选择(MAS)相结合的方法，可以有效地加快公猪精液品质性状的选择进展。

SPATA6蛋白是一个精子发生相关蛋白，在脊椎动物中高度保守，特异表达在精子细胞和成熟精子中(Oh et al.2003)，且SPATA6基因在大白猪性成熟前后的睾丸组织中差异表达(Song et al.2015)。有研究表明SPATA6基因在睾丸生殖细胞肿瘤形成与睾丸的发育中起重要作用(Huo et al.2015)。SPATA6基因对于精子躯干中段组装和精子头尾紧密连接起着至关重要作用，SPATA6基因失活造成无头精子症并导致小鼠不育(Yuan etal.2015)。

综上所述，SPATA6基因参与调控精子发生过程。对猪精液品质性状的SNPs的表征对于通过猪精液品质性状标记辅助选择具有十分重要的作用。但经检索，但目前未见已鉴定的关于SPATA6基因影响精液品质的单倍型标记。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了猪SPATA6基因第十内含子内与猪精液品质性状相关的单倍型标记与应用，本发明发掘了猪SPATA6基因第十内含子内与猪精液品质性状相关的单倍型标记，为猪精液品质性状的分子标记辅助育种提供了一种新的单倍型标记。

本发明的目的之一在于提供一种猪SPATA6基因第十内含子内与猪精液品质性状相关的单倍型标记，所述的单倍型标记位于猪SPATA6基因第十内含子的部分DNA序列中，所述单倍型标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，该序列长度为202bp；所述单倍型标记包括：rs330516022位点的SNP：在所述序列的第34bp处存在一个C/T的等位基因突变；以及rs342323574位点的SNP：在第120bp处存在一个G/A的等位基因突变。

本发明的目的之二在于提供所述的单倍型标记在猪精液品质性状标记辅助选择中的应用。

本发明的目的之三在于提供一种猪SPATA6基因精液品质性状相关SNP的检测试剂盒，包括：

用于扩增所述SEQ ID NO.1所示序列的引物对：上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

以及2个SNaPshot单碱基延伸引物：用于检测rs330516022位点的延伸引物如SEQID NO.4所示，和用于检测rs342323574位点的延伸引物如SEQ ID NO.5所示。

本发明的目的之四在于提供使用所述检测试剂盒检测猪SPATA6基因精液品质性状相关SNP的方法，包括以下步骤：

步骤1、以从待测样本中提取的基因组DNA为模板，通过选自所述SEQ ID NO.2～3所示PCR引物对构建多重PCR扩增体系进行PCR扩增，并对PCR产物进行纯化处理；

步骤2、以所述纯化的PCR产物为模版，通过选自所述SEQ ID NO.4～5所示SNaPshot单碱基延伸引物构建SNaPshot反应体系进行单碱基延伸反应，并对反应制备的单碱基延伸产物进行纯化处理；

步骤3、使用遗传学分析仪检测所述纯化后的单碱基延伸产物，并使用基因分析软件对结果进行分析。

本发明的目的之五在于提供所述的检测试剂盒在猪精液品质性状标记辅助选择中的应用。

本发明人从猪精液中提取基因组DNA。登录NCBI数据库中下载猪SPATA6基因的DNA序列设计特异引物。分别以杜洛克猪和大白猪的DNA为模板进行PCR扩增(如图2所示)，得到如序列表SEQ ID NO.1所示的基因片段。对PCR产物回收并通过SNaPshot技术进行检测，SNaPshot PCR的rs330516022和rs342323574位点的延伸引物序列如序列表SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；根据测序结果筛查DNA序列变异，在SEQ ID NO.1第34bp处(rs330516022)存在一个C/T的等位基因突变，以及在第120bp处(rs342323574)存在一个G/A的等位基因突变(如图3所示)，并在杜洛克猪和大白猪中对这2个SNP位点的组合基因型与精液品质性状进行关联分析。

本发明的有益效果：

本发明发掘了猪SPATA6基因第十内含子内与猪精液品质性状相关的单倍型标记(rs330516022和rs342323574位点)，所述的单倍型标记位于猪SPATA6基因第十内含子的部分DNA序列中，该单核苷酸多态性(SNP)可以作为猪精液品质性状的单倍型标记，本发明为猪精液品质性状的分子标记辅助育种提供了一种新的单倍型标记。

附图说明

图1是本发明中猪SPATA6基因rs330516022的GeneMapper V4.0软件读取结果图；注：由于rs330516022位点的延伸引物是反向引物，因此检测到的基因型是其互补基因型；A图：CC基因型；B图：CT基因型；C图：TT基因型；

图2是本发明中猪SPATA6基因rs342323574的GeneMapper V4.0软件读取结果图；注：由于rs342323574位点的延伸引物是反向引物，因此检测到的基因型是其互补基因型；A图：GG基因型；B图：GA基因型；C图：AA基因型；

图3是猪SPATA6基因SEQ ID NO.1序列片段琼脂糖凝胶电泳图谱。

具体实施方式

实施例1 猪SPATA6基因片段的获得及多态性检测方法的建立

1、猪基因组DNA的提取

本发明的试验猪品种为杜洛克猪和大白猪，样本来源于华中农业大学。猪基因组DNA的提取采用北京百泰克生物技术有限公司生产的基因组DNA试剂盒(按该试剂盒说明书进行操作)提取，具体步骤如下所述：

(1)吸取100μL精子沉淀；加入400μL ddH₂O、100μL5*精子提取液、10μL蛋白酶K(20mg/mL)充分混匀，55℃水浴直至充分消化至透明。

(2)加入200μL结合液CB，充分颠倒混匀，70℃放置10min。

(3)冷却后加入100μL异丙醇，剧烈颠倒充分混匀。

(4)用1mL的枪头吸取上述混合物，加入吸附柱AC中，10000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液。

(5)加入500μL抑制物去除液IR，12000rpm离心30s，弃废液。

(6)加入700μL漂洗液WB，12000rpm离心30s，倒掉废液。

(7)重复操作步骤6。

(8)将吸附柱AC放回收集管中，12000rpm离心2min，尽量去除漂洗液，以免残留的乙醇抑制下游反应。

(9)取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位加50-100μL洗脱缓冲液EB，室温放置3-5min，12000rpm离心1min，将溶液收集到离心管中。

(10)对提取出的DNA的浓度及质量进行检测后置于-20℃下保存备用。

2、猪SPATA6基因片段的获得

(1)PCR扩增

根据猪SPATA6基因的基因组序列(GenBank登陆号：NC_010448.4)设计以下引物对：

扩增SEQ ID NO.1序列上游引物：5'GCGTGTCGATTCCAACTACCT 3'(SEQ ID NO.2所示)，

扩增SEQ ID NO.1序列下游引物：5'CTAACACGCTGCTGTGTGGAC 3'(SEQ ID NO.3所示)。

利用上述引物在杜洛克猪和大白猪基因组DNA中进行PCR扩增，PCR反应体系50μL，体系中各组分的浓度为100ng模板DNA、10×buffer(含Mg²⁺)4μL、上述上下游引物各0.5μM、2.5μM dNTPs、1U TaqDNA聚合酶。

PCR的运行程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，60℃退火20s，72℃延伸10s，35个循环；72℃延伸1min；4℃保存。

(2)PCR产物纯化

上述PCR产物用上海生工生物工程有限公司的Gel Extraction Kit试剂盒进行纯化，具体步骤如下：首先从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管，加入400μL溶胶液，50-60℃水浴至胶彻底融化，加热融胶时，每2min混匀一次，冷却至室温；将离心柱放入收集管中，把混合液移至离心柱，室温放置2min；12000r/min离心1min，此时DNA被吸附到柱上；倒掉收集管中废液，将离心柱放入同一个收集管中，加入700μL洗脱液，12000r/min离心1min；倒掉收集管中的废液，12000r/min离心1min；将离心柱放入一预先准备好的灭菌1.5mL离心管中，加入40μL洗脱液或双蒸水(pH＞7.0)，室温或37℃放置2-3min；12000r/min离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段。

3、将纯化后的PCR产物纯化后通过SNaPshot方法检测单倍型标记

SNaPshot法：该技术由美国应用生物公司(ABI)开发，是基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术，也称小测序，主要针对中等通量的SNP分型项目。在一个含有测序酶、四种荧光标记ddNTP、紧临多态位点5’-端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中，引物延伸一个碱基即终止，经ABI测序仪检测后，根据峰的移动位置确定该延伸产物对应的SNP位点，根据峰的颜色可得知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型。对于PCR产物模板可通过多重PCR反应体系来获得。

本发明人根据猪SPATA6基因的基因组序列(GenBank登陆号：NC_010448.4)设计rs330516022和rs342323574以下SNaPshot延伸引物：

rs330516022延伸引物：5'TTTCAATAACAAGACATAAGAGGGG 3'(SEQ ID NO.4所示)，

rs342323574延伸引物：

5'TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGGACCATGTAGAGGTTAACA 3'(SEQ IDNO.5所示)。

在15μL纯化后的PCR产物中加入5 U SAP和2 U Exo I，震荡混匀，37℃保温1h，然后75℃保温15min以灭活SAP(New England Biolabs)和Exo I酶(New England Biolabs)；使用Applied Biosystems公司的SNaPshot Multiplex Kit将处理后的15μL PCR产物吸出3μL进行SNaPshot检测，PCR反应体系10μL，Reaction Mix试剂5μL，SAP和Exo I酶处理后PCR产物3μL，rs330516022和rs342323574延伸引物各0.5μL，去离子水1μL，PCR扩增程序为96℃变性10s，50℃退火5s，60℃延伸30s，25个循环，4℃保存；将SNaPshot产物稀释20倍，稀释体系为Hi-Di Formamide 9.25μL,GS-120LIZ 0.25μL,SNaPshot产物0.5μL，反应体系为95℃变性5min，冰浴4min；配制含有350μL Hi-Di甲酰胺和50μL Matrix标准品的混合液，95℃变性5min，迅速冰冷5min，平分2管，分装至上机板后对3730XL DNA Analyzer仪器进行光谱校正；使用3730XL DNA Analyzer对制备好的样品进行毛细管电泳并搜集信号；最后使用GeneMapper V4.0软件对实验结果进行分析(如图1和图2所示)。

实施例2 本发明制备的分子遗传标记在杜洛克猪和大白猪中的多态性分布检测

本实施例分别在杜洛克猪和大白猪群体中检测猪SPATA6基因第十内含子rs330516022和rs342323574位点的多态性，即SPATA6基因rs330516022和rs342323574位点在杜洛克猪和大白猪中的基因型频率和等位基因频率，检测结果如表1所示。

表1

由表1可知：在杜洛克猪和大白猪中，rs330516022和rs342323574位点完全连锁，其中rs330516022位点的优势等位基因为C，而rs342323574位点的优势等位基因G，具体地：所述rs330516022位点，表现为CC、CT或TT三种基因型，C等位基因频率在杜洛克猪和大白猪种分别为0.84和0.79，均是优势等位基因。所述rs342323574位点，表现为GG、GA或AA三种基因型，G等位基因频率在杜洛克猪和大白猪种分别为0.84和0.79，均是优势等位基因。通过卡方检验发现这2个SNP位点在杜洛克猪和大白猪中均符合哈代温伯格平衡。

实施例3 本发明制备的分子遗传标记与猪产仔数性状的关联分析及应用

为了确定猪SPATA6基因rs330516022和rs342323574位点与猪精液品质差异是否相关，采用实施例1建立的方法进行多态性检测，并分析猪SPATA6基因rs330516022和rs342323574位点的不同基因型与猪精液品质性状的相关性。采用SAS统计软件(SASInstitute Inc,Version 9.1)GLM程序进行不同SNP基因型组合的方差分析，并进行显著性检验，所采用模型为：

Yij＝μ+Gi+Fj+eij；

Yij为性状表型值，μ为平均值，Gi为基因型效应(包括基因加性效应和显性效应；加性效应用1，0和-1分别代表CC/GG、CT/GA和TT/AA基因型，显性效应用1，-1和1分别代表CC/GG、CT/GA和TT/AA基因型)；Fj为猪场综合效应；eij为残差效应。

本实施例分别在杜洛克猪和大白猪中进行不同基因型与精液品质性状间的关联分析，即SPATA6基因rs330516022和rs342323574位点与公猪精液品质性状的关联分析，统计分析结果总结于表2。

表2

注：a和b表示差异显著(P<0.05)，A和B表示差异极显著(P<0.01)；*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)。

由表2可知，在杜洛克猪中TT/AA基因型的精子密度极显著高于CT/GA基因型和CC/GG基因型(P<0.01)，且加性效应和显性效应均达到极显著水平(P<0.01)，TT/AA基因型的精子活力也显著高于CC/GG基因型(P<0.05)，加性效应为-1.71％(P<0.05)。在大白猪中TT/AA基因型的精子密度极显著高于CT/GA基因型(P<0.01)，显著高于CC/GG基因型(P<0.05)，且加性效应和显性效应均达到显著水平(P<0.05)。以上结果表明在杜洛克猪和大白猪中SPATA6基因rs330516022和rs342323574位点的TT/AA基因型相对其他基因型具有更高的精子密度，可为公猪精液品质的遗传改良提供一种新的单倍型。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 猪SPATA6基因第十内含子内与猪精液品质性状相关的单倍型标记与应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 202

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> allele

<222> (34)..(34)

<223> y=c或t

<220>

<221> allele

<222> (120)..(120)

<223> k=g或a

<400> 1

gcgtgtcgat tccaactacc ttgcctttca tttycccctc ttatgtcttg ttattgcatt 60

ttggcatgtg agcaatattt ttaagtcact tcctttgtaa gtcatagata tctgttaaak 120

tgttaacctc tacatggtcc caaatactta tttttcagag cacaggtata atcttttaga 180

agtccacaca gcagcgtgtt ag 202

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcgtgtcgat tccaactacc t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctaacacgct gctgtgtgga c 21

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tttcaataac aagacataag agggg 25

<210> 5

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttgggac catgtagagg ttaaca 56

Claims (6)

1.一种猪SPATA6基因第十内含子内与猪精液品质性状相关的单倍型标记，其特征在于，所述的单倍型标记位于猪SPATA6基因第十内含子的部分DNA序列中，所述单倍型标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，该序列长度为202bp；所述单倍型标记包括：rs330516022位点的SNP：在所述序列的第34bp处存在一个C/T的等位基因突变；以及rs342323574位点的SNP：在第120bp处存在一个G/A的等位基因突变。

2.如权利要求1所述的单倍型标记，其特征在于，所述序列的第34bp处的C或T的碱基多态性位点，表现为CC、CT或TT三种基因型，其中C是优势等位基因。

3.如权利要求1所述的单倍型标记，其特征在于，所述序列的第120bp处的G或A的碱基多态性位点，表现为GG、GA或AA三种基因型，其中G是优势等位基因。

4.权利要求1-3任一所述的单倍型标记在制备猪精液品质性状标记辅助选择试剂中的应用；

所述猪的品种为杜洛克猪或大白猪。

5.一种猪SPATA6基因精液品质性状相关SNP的检测试剂盒，其特征在于，包括：

用于扩增SEQ ID NO.1所示序列的引物对：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

以及2个SNaPshot单碱基延伸引物：用于检测rs330516022位点的延伸引物如SEQ IDNO. 4所示，和用于检测rs342323574位点的延伸引物如SEQ ID NO. 5所示；

所述猪的品种为杜洛克猪或大白猪。

6.一种使用权利要求5所述检测试剂盒检测猪SPATA6基因精液品质性状相关SNP的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、以从待测样本中提取的基因组DNA为模板，通过选自所述SEQ ID NO. 2～3所示PCR引物对构建多重PCR扩增体系进行PCR扩增，并对PCR产物进行纯化处理；

步骤2、以所述纯化的PCR产物为模版，通过选自所述SEQ ID NO. 4～5所示SNaPshot单碱基延伸引物构建SNaPshot反应体系进行单碱基延伸反应，并对反应制备的单碱基延伸产物进行纯化处理；

步骤3、使用遗传学分析仪检测所述纯化后的单碱基延伸产物，并使用基因分析软件对结果进行分析；

所述猪的品种为杜洛克猪或大白猪；

所述检测猪SPATA6基因精液品质性状相关SNP的方法不用于疾病的诊断和治疗。

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