CN105524991B - 一种与猪精液品质性状相关的遗传标记及应用 - Google Patents

一种与猪精液品质性状相关的遗传标记及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于猪遗传标记筛选与应用技术领域，具体涉及一种与猪精液品质性状相关的遗传标记及应用，该遗传标记是从猪RNF4基因3’非翻译区克隆得到，其单核苷酸多态性(SNP)可以作为猪精液品质性状的遗传标记，该遗传标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示，在序列表SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4序列的487bp处存在一个等位基因突变，该突变导致AluI‑RFLP多态性。本发明筛选步骤为：从猪血液中提取基因组DNA，设计引物，PCR扩增，PCR产物克隆、测序，序列比较分析，单核苷酸多态性检测，标记与精液品质性状间相关性分析。本发明的遗传标记可在猪标记辅助选择中应用。

Description

一种与猪精液品质性状相关的遗传标记及应用
技术领域
本发明涉及猪遗传标记筛选技术领域，具体涉及一种与猪精液品质性状相关的分子遗传标记及应用，本发明的遗传标记从RNF4基因3’非翻译区中获得SNP，本发明还包括猪RNF4基因突变位点的检测方法与应用。
背景技术
公猪的繁殖力在猪生产中发挥重要的作用，一般通过鉴定精液的品质来衡量公猪的繁殖性能。精液品质的指标包括精液量、精子密度、精子形态及精子活力等。遗传作用和环境作用是影响精液品质的两个重要因素，环境因素可以进行人为的控制和改善，但只有提高遗传效率才能从根本上提高精液品质，提高公猪的繁殖力。由于公猪繁殖性状的遗传力低，导致常规选择进展缓慢。随着分子生物学技术的兴起和迅速发展，发展了常规育种与标记辅助选择(MAS)相结合的方法，可以有效地加快公猪精液品质性状的选择进展。
RNF4蛋白是一个核内转录因子，在睾丸组织中高表达(Moilanen etal.Identification of an ovel RING finger protein as a co-regulator in steroidreceptor-mediated gene transcription.Mol Cell Biol,1998,18:5128-5139)。有研究表明RNF4极有可能参与精子细胞成熟的过程，因为其mRNA和蛋白质在圆形精子和长形精子细胞中都高表达(Yan et al.A Nuclear RING finger protein SNURF/RNF4is expressedin the last steps of spermatid maturation during rat testis development.MechDev,2002,118(s 1-2):247-253)。RNF4蛋白可以与雄激素受体互作在雄激素受体依赖型的转录调控中发挥共激活因子的作用，也有研究表明RNF4可以与PATA蛋白互作，减弱雄激素受体依赖型的转录调控能力，导致生精功能的障碍(Pero et al.PATZ attenuates theRNF4-mediated enhancement of androgen receptor-dependent transcription.J BiolChem.2002,277(5):3280-3285)。我们前期的工作表明RNF4基因第五内含子中的一个单核苷酸多态性(SNP)与母猪的产仔数性状存在显著的关联(Niu et al.Identification ofpolymorphism and association analysis with reproductive traits in the porcineRNF4gene.Anim Reprod Sci.2009,110(3):283-292)，且在大白猪性成熟前后的睾丸组织中差异表达(Luo et al.Microarray-based approach identifies differentiallyexpressed microRNAs in porcine sexually immature and mature testes.PLoSOne.2010,5(8):e11744)，推测RNF4基因在精子发生过程中也发挥重要的作用。
发明内容
本发明的目的在于获得一种与猪精液品质性状相关的遗传标记，通过克隆猪RNF4基因序列，寻找突变位点以及基因多态性的检测方法，为猪的标记辅助提供一种选择方法。
本发明的技术方案如下：
本发明获得了一种猪精液品质性状的遗传标记，它是大白猪、梅山猪RNF4基因的部分DNA序列，其中涉及大白猪的遗传标记是SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，涉及梅山猪的遗传标记是SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；通过对上述序列进行MUSCLE比对发现位于该扩增片段487碱基处存在1个C/T的等位基因突变(如图2所示)，该突变导致PCR-AluI-RFLP多态性。
申请人设计了一种扩增猪RNF4基因DNA序列的引物对，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示。
申请人提供了一种筛选猪精液品质性状的遗传标记的方法，所述的方法包括下述步骤：
从猪血液中提取基因组DNA。登录NCBI数据库中下载猪RNF4基因序列作为靶序列，设计特异引物(该引物的序列如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示)。以大白猪和梅山猪的DNA为模板进行PCR扩增(图1)，对PCR产物回收和克隆测序，得到如序列表SEQ ID NO：3(大白猪)和SEQ ID NO：4(梅山猪)所示的基因片段；进而进行序列MUSCLE比对，筛查SNP(如图2下划线所示碱基)，在序列SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的487碱基处(即，该基因的全序列的3’非翻译区566bp处)发现C/T等位基因突变，该突变表现了大白猪和梅山猪种间差异，并引起了AluI酶切位点(AG↓CT)多态性，SNP位点检测如图4所示。
本发明提供了鉴定上述序列C/T变异的AluI-RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法。其引物序列分别如序列表SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示，在猪基因组DNA中进行PCR扩增，PCR扩增片段经AluI酶切分型及检测。
进一步，本发明提供了利用AluI-RFLP方法确定猪不同基因型个体与精液品质性状间的关联分析的应用。
更详细的发明方案见《具体实施方式》所述。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1：是制备SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4特异基因片段所用的正向引物。
序列表SEQ ID NO：2：是制备SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4特异基因片段所用的反向引物。
序列表SEQ ID NO：3：是扩增的国外血缘猪种“大白猪”的核苷酸序列(即本发明的遗传标记)。
序列表SEQ ID NO：4：是扩增的中国血缘猪种“梅山猪”的核苷酸序列(即本发明的遗传标记)。
序列表SEQ ID NO：5：是实施猪RNF4基因3’非翻译区C/T变异的AluI-RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法的正向引物。
序列表SEQ ID NO：6：是实施猪RNF4基因3’非翻译区C/T变异的AluI-RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法的反向引物。
图1：是包括猪RNF4基因序列片段琼脂糖凝胶电泳图谱。琼脂糖凝胶浓度为1.5％。附图标记说明：图中：M泳道为DNA Marker DL2,000；大白猪和梅山猪泳道分别如序列表SEQID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物在大白猪和梅山猪种中的扩增片段，片段大小为649bp。
图2：是大白猪和梅山猪RNF4基因序列片段比对结果和SNP位点。附图标记说明：序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物在不同猪种中的扩增片段，片段大小为649bp。图2中下划线的碱基为突变碱基。
图3：是实施猪RNF4基因基因型分型的引物扩增片段琼脂糖凝胶电泳图谱。琼脂糖凝胶浓度为1.5％。附图标记说明：图中：M泳道为DNA Marker DL2,000；泳道1-8为序列表SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示引物在不同猪种中的扩增片段，片段大小为153bp。
图4：是猪RNF4基因片段AluI-RFLP检测结果的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。聚丙烯酰胺凝胶浓度为20％；附图标记说明：图中：M泳道为PBR322DNA/BsuRⅠ(HaeⅢ)Marker 5；1、3泳道为TT基因型，片段大小分别为69bp，49bp，23bp，12bp；2、4-11泳道为CC基因型，片段大小为69bp，61bp，23bp；12泳道为TC基因型，片段大小为69bp，61bp，49bp，23bp，12bp。
图5：是本发明筛选的一种与猪精液品质性状相关的遗传标记的核苷酸序列。在该序列的487位碱基处的R是一个等位基因突变位点。
根据本发明的标记和方法可以用于开发成诊断方法或试剂盒，从而在育种计划中利用这些方法来选择携带有利等位基因的猪，从而可以达到较好的选择效果。
具体实施方式
实施例1：猪RNF4基因片段的获得及多态性检测方法的建立
登录NCBI数据库，下载猪RNF4基因序列作为靶序列，利用Primer Premier 5软件设计引物。该引物的序列如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，具体序列如下所述：正向引物RNF4-F:AGA ACG CTA ACA CTT GCC,反向引物RNF4-R:CAC GGT GAC CTC TGA CTC。扩增区域包括猪RNF4基因3’非翻译区的649bp的基因组核苷酸序列，如图1所示。PCR反应体系为25μl，其中模板DNA为50ng，dNTPs浓度为200μmol/L，每条引物浓度为0.4μmol/L，3U的Taq DNA聚合酶(Biostar International,Canada)，加去离子水至总体积25μl；PCR反应程序：94℃预变性4min；然后94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸40s，共35个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物经纯化(UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程技术有限公司)，克隆后，进行序列测定，序列测定由上海生工生物工程技术有限公司完成。不同猪种的PCR产物序列经MUSCLE软件进行序列比对，序列间比对结果见图2。上述扩增片段大小为649bp，位于该片段487碱基处(即，该基因的全序列的3’非翻译区566bp处)C/T突变，该突变引起了AluI酶切位点(AG↓CT)多态性。
对上步AluI酶切位点(AG↓CT)的多态性进行PCR扩增，扩增本发明遗传标记的引物序列如序列表SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示，具体序列如下所述：正向引物RNF4-AluI-F:ATT TGC TGC GAC GTT TGC,反向引物RNF4-AluI-R:GAT GGA CCT TGT CTG CCT TG。扩增区域包括猪RNF4基因3’非翻译区的153bp的基因组核苷酸序列，如图3所示。取8.5μl PCR产物加入0.5μl(10U/μl)限制性内切酶和1μl 10×buffer(含10×BSA)，37℃AluI酶切8h，取8μl酶切产物用20％的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，记录酶切结果，如图4所示：此扩增片段大小为153bp，在74bp处有AluI酶切位点，若该处碱基为C，则不存在AluI酶切位点，用AluI酶切检测结果有69bp，61bp，23bp三条片段(C等位基因)，当该位点为T时，结果导致一个AluI酶切位点的产生，酶切得到四条片段，长度分别为69bp，49bp，23bp和12bp(T等位基因)。
实施例2：本发明筛选的遗传标记在不同猪群中的多态性分布检测
猪基因组DNA的提取(样本见表1所示)方法参照：熊远著《猪生化及分子遗传实验导论》中国农业出版社，1999报道的方法进行。
在3个国外血缘猪群体中检测猪RNF4基因PCR-AluI-RFLP多态性，检测结果如表1所示。结果表明：在杜洛克猪、大白猪和长白猪中存在3种基因型；在杜洛克猪群体中，C等位基因频率为0.84，是优势等位基因；在大白猪群体中T等位基因频率为0.78，是优势等位基因；在长白猪群体中，C等位基因频率和T等位基因频率分别为0.44和0.56，是无明显优势的等位基因(见表1)。
表1猪RNF4基因PCR-AluI-RFLP在不同猪种中的分布结果
表1说明：上述群体材料均为中国公开推广的品种。
实施例3：本发明筛选的遗传标记与猪精液品质性状的关联分析上的应用
为了确定猪RNF4基因PCR-AluI-RFLP与猪精液品质差异是否相关，选择广西扬翔种猪场培育的杜洛克猪、大白猪和长白猪群为试验材料，采用实施例1建立的AluI-RFLP方法进行多态性检测，并分析猪AluI-RFLP不同基因型与猪精液品质性状的相关关系。采用SAS统计软件(SAS Institute Inc,Version 8.0)GLM程序进行单标记方差分析，同时采用REG程序计算基因加性效应和显性效应，并进行显著性检验，所采用模型为：
Yij＝μ+Gi+Fj+eij
Yij为性状表型值，μ为平均值，Gi为基因型效应(包括基因加性效应和显性效应；加性效应用1，0和-1分别代表TT、TC和CC基因型，显性效应用1，-1和1分别代表TT、TC和CC基因型)；Fj为猪场综合效应；eij为残差效应。
在杜洛克猪、大白猪和长白猪中进行不同基因型与精液品质性状间的关联分析，统计分析结果总结于表2。
由表2可以看出，在杜洛克猪中，CC基因型的精液量显著多于TC基因型(P<0.05)。在大白猪中，TC基因型的精子密度显著大于CC和TT基因型(P<0.05)。在长白猪中，CC基因型的精液量显著多于TT基因型(P<0.05)，TC基因型的精子密度显著大于CC基因型(P<0.05)。
表2猪RNF4基因PCR-AluI-RFLP基因型精液品质性状的统计分析表
表2的说明：以上数值为最小二乘均值±标准误；含有相同字母表示差异不显著，小写字母表示差异显著；加性效应正值表示T等位基因增加性状表型值。*表示P<0.05。

Claims (1)

1.RNF4基因片段作为猪精液品质性状相关的遗传标记的应用，其特征在于，所述的遗传标记的核苷酸序列如下所示：
AGAACGCTAACACTTGCCCAACTTGCAGGAAAAAGATCAACCACAAACGATACCACCCCATTTATATATGAAGTGTCGCGAGCTGCTCAGGAGAGTCGGATGGACAGACAGAGCCTGGCTGGGTTCGCCACGTGGCCTTATGTGGGTTCTCTGCCTCCAGTTTCTTGAGCGCAAAAAGACTGATTTCAAAATCAGCGTCTGATATGTAACTGCTCTCTTGTTTCCACCCCCCTTAGATCCTTCCTTTGCCTCTAGTTTGATGCTGTGGAGCTGGAGCTGGAGCTGGAGCCAGATCCCTCCCTGGCCAGGGTCTACACCTGCTCCTCTGGGTGGTCTGGTTCCAGGATAGGAGAGAGGGAGGGGGGCCCGTGGGAATGAACGCCGTGGTTCCAGCCTCCGTCCAGAACCCGCACATTTGCTGCGACGTTTGCCTCAGCTTCCTGCCGGCAGCGTCGTGGAGGGGCTGGCCCAGGTCGGAGAGCAAGCRGCTCCGCCAGCTCCTGTGGGCGTGCTACCTCGTCCCAGGCATCTGCCCACCCCAGTGACCAAGGCAGACAAGGTCCATCCGGCGCGAGGATCCCAAGTGTAGCACAGCCCGGAGCGACCAGCCGCTGGACTCTTCTTCCCTTGAGAGTCAGAGGTCACCGTG，
上述序列中487位碱基处的R是T或C，该突变导致AluI-RFLP多态性。
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