CN109837348B - 一种与公猪精子浓度性状关联的分子标记 - Google Patents

Abstract

本发明属于猪分子标记筛选技术领域，具体涉及一种与公猪精子浓度性状关联的分子标记，该分子标记克隆自登陆号为WU_10.2_17_4574599的基因片段，通过基因芯片技术对该基因进行分型，筛选得到一种与猪精子浓度性状关联的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，在该序列的第101位的碱基处存在一个T/C的等位基因突变，当SEQ ID NO：1上的第101位的核苷酸为C时，判定猪具有更高的精子浓度。本发明为猪精液性状的标记辅助选择提供了新的SNP分子标记资源。

Description

一种与公猪精子浓度性状关联的分子标记

技术领域

本发明涉及猪分子标记制备技术领域，具体涉及一种与公猪精子浓度性状关联的分子标记。本发明所述的分子标记可用于公猪精精子浓度性状的标记辅助选择。

背景技术

规模化和集约化养猪是我国生猪养殖模式主要的发展趋势。自20世纪50年代猪人工授精技术在广西成功的应用开始，猪人工授精技术已在全国得到广泛的推广。目前，在规模化猪场中，人工授精技术使用比例已达到85％以上。究其原因，猪人工授精技术具有以下优点： (1)减少公猪饲养数量，降低公猪饲养成本；(2)利于实施异地配种，快速改良猪群遗传潜力；(3)方便控制生物安全、高效监测公猪健康状况和控制疾病传播，(李日伟,刘金兰,陈国琼.普及猪人工授精技术促进科学养猪[J].养殖与饲料,2009(02):12-14.)。

公猪常规精液性状包括，精液量、精子浓度、精子活力和精子畸形率等。对于猪人工授精站来说，公猪精液品质的好坏是决定其经济效益的重要因素。一方面，精液品质差是导致公猪淘汰的主要原因之一，由于精液品质问题导致的公猪更替比例高达10～30％(Robinson J A B,Buhr M M.Impact of genetic selection on management of boarreplacement[J].Theriogenology, 2005,63(2):0-678.)，非正常因素的公猪更替导致公猪饲养成本增加；另一方面，公猪生产更多的合格精液能为人工授精站产生更高的经济回报。因此，猪人工授精站对公猪精液性状的表现格外关注。研究表明，公猪精液性状属于中低遗传力性状，在对公猪繁殖性状和生长性状的相关研究中发现，杜洛克公猪精子浓度遗传力为0.05，精子活力遗传力为0.07，总精子数遗传力为0.18，杜洛克公猪精子浓度与饲料转化率呈中等遗传正相关(0.59)，与精子活力呈高遗传正相关(0.81)(Chang H L,Lai YY,Wu M C,et al.Genetic correlations between male reproductive traits andgrowth traits in growth performance tested Duroc,Landrace and Yorkshire breedboars.[J].Animal Science Journal,2017,88(9).)。中低遗传力表明，可以通过对公猪精液性状进行选择来进行性状的有效改良。由于公猪精子浓度与饲料转化率和精子活力呈现中、高遗传正相关，因而对精子浓度的选择，还可以间接提升饲料转化率和精子活力，进而提高猪场的经济收益。

自关于人类黄斑病的全基因组关联分析(GWAS)文章于2005年发表以来(Klein RJ,Zeiss C,Chew E Y,et al.Complement Factor H Polymorphismin Age-RelatedMacular Degeneration[J]. Science,2005,308(5720):385-389.)，GWAS已成为挖掘人类疾病及农业重要经济性状候选基因的有效工具。通常，GWAS方法利用全基因组范围内的单核苷酸多态性(SNPs)和性状表现的信息记录，筛选出与表型显著相关的SNP位点，再通过SNP位点与基因间的连锁不平衡，确定影响性状的重要候选基因。本专利使用MVP软件中的FarmCPU模型进行分析(Liu X,Huang M,Fan B,et al.Iterative Usage of Fixed andRandom Effect Models for Powerful and Efficient Genome-Wide AssociationStudies[J].PLoS Genetics,2016,12(2):e1005767.)，通过全基因组关联分析筛选出与杜洛克公猪精子浓度显著相关的SNP位点，为公猪精液性状DNA 标记辅助选择和全基因组选择的开展提供了新的遗传基础。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，完善公猪精子浓度性状关联的SNP分子标记，利用50K的基因芯片对SNP进行分型，并使用全基因组关联分析(GWAS)筛选与公猪精子浓度显著相关的SNP，为猪的遗传育种提供了新的分子标记资源和标记辅助选择方法。

本发明的技术方案如下所述：

申请人通过基因分型技术并参阅Ensembl数据库，得到登陆号为WU_10.2_17_4574599 基因片段的SNP的上下游100bp的核苷酸序列，具体序列如下所述(即序列表SEQID NO:1 所示的核苷酸序列)：

AAAATAATCATGTCCAAATTTTCTTCCTCAAGGATCCTGATTTTAATTCCTCAGAATTAGTTTCAC TTGTGCTTGCCTGTGATCTATTATAGAATCCAGTY(T/C)ACCAAGTATCCTATTTTCTTCGACTG TGAAAATTAATATTATACTAGATCAGTCAATCTGAGGAGATCACCAGAAAATAATAAGTGCAATCA CTCTAAAT，

上述序列的第101碱基处的Y为一个等位基因突变(T101-C101)，该突变引起上述序列产生了核苷酸多态性。该片段即为本发明筛选的SNP分子标记(即SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列)，可以作为检测与公猪精子浓度性状关联的SNP分子标记，且当SEQ ID NO：1上的第101 位核苷酸为C时，所述的公猪具有更高的精子浓度。

上述核苷酸序列可以作为检测与公猪精子浓度性状相关的SNP分子标记。

申请人提供了一种筛选公猪精子浓度性状相关SNP分子标记的方法，所述的方法包括如下步骤：

①提取杜洛克公猪精子总DNA，并对DNA进行质量检测；

②利用基因芯片技术对杜洛克公猪基因型进行分型；

③公猪精液性状属于重复测量性状，需要利用混合线性模型(MLM)，采用公猪站、年份和月份的联合效应作固定效应，日龄、采精间隔作协变量，个体作随机效应，计算个体随机效应，作为构建新表型(pseudo-phenotypes)用于后续GWAS分析；

④基于多标记关联模型的方法，采用控制群体遗传背景的主成分作为协变量，利用R统计环境下MVP软件包中的FarmCPU模型进行GWAS分析；

⑤对FarmCPU模型筛选出来的显著SNP位点与杜洛克公猪精子浓度进行关联分析。

本发明筛选的分子标记可用于非诊断目的对杜洛克公猪相关基因或基因型与杜洛克公猪精子浓度的关联分析中，提供了一个新的分子标记用于杜洛克公猪精液性状的分子标记辅助选择。

与现有技术相比本发明具有的有益效果：

本发明可通过在体外采用基因芯片技术检测猪的基因型，作为非诊断目的的评价猪的精液质量，与目前的PCR-RFLP等方法相比，本发明具有简单、快捷、灵敏度高和特异性好等突出优点。

更详细的技术方案请参见说明书的《附图说明》及《具体实施方式》。

附图说明

图1：本发明的总体技术流程示意图。

图2：是本发明克隆的登陆号为WU_10.2_17_4574599基因片段的SNP的上下游100bp核苷酸序列和本发明分子标记的核苷酸序列。附图标记说明：图2显示核苷酸序列的第101位碱基处存在一个T/C等位基因突变(101bp处的英文字母“Y”为突变位点)。

图3：是本发明制作的曼哈顿图。附图标记说明：研究标的是杜洛克公猪精子浓度性状，黑色圆圈及箭头指向的标记为本发明筛选的分子标记，该标记位于猪第17号染色体上。

具体实施方式

对序列表的说明：

序列表SEQ ID NO:1是本发明克隆和筛选的与公猪精子浓度性状关联的分子标记的核苷酸序列，序列长度为201bp，在该序列的第101bp处存在一个等位基因突变(C/T)，该突变导致SEQ ID NO:1所示的核苷酸产生多态性。

本发明中的序列和全基因组关联分析结果，基于猪基因组11.2版本。

实施例1：基因分型检测

(1)利用磁珠法精子基因组提取试剂盒(购自武汉纳磁生物科技有限公司)自动提取杜洛克公猪精子总DNA，具体步骤为：

(1)取适量杜洛克公猪的精液(5～15μL)至1.5mL离心管中；

(2)向离心管中加入500μL裂解液(上述试剂盒自带)和5μL蛋白酶K(20mg/mL)，振荡混匀30秒后，置于65℃烘箱或金属浴中，裂解30分钟～1小时；

(3)裂解完成后，取全部上清转移至深孔板(标记为①号)，并向每个样孔中加入350μL 异丙醇；

(4)将①号深孔板，置于核酸提取仪工位1上，将装有磁珠、洗涤液①、洗涤液②和③以及洗脱液的深孔板分别置于工位2～6上。打开仪器电源，待仪器完成自检后，按表1的设计，设置仪器的工作参数。

表1核酸提取仪的预设工作参数

(5)开始运行程序，待程序结束后，核酸提取仪会自动停止，并且工位6会进入4℃保存程序，暂时保存样品；

(6)DNA样品可以直接用于下游试验，或封装后于4℃下短暂保存数日。若要长时间保存DNA样品，可以将DNA样品封装或转移至新的容器中，并置于-20℃下的冰箱中长期保存。 (2)SNP基因型的判定及质量控制

使用GeneSeek Porcine 50K SNP芯片进行分型，用PLINK v1.9对获得的基因型数据进行质量控制，剔除检出率<90％、次等位基因频率(minor allele frequency,MAF)<0.05、偏离哈代温伯格(Hardy-Weinberg Equilibrium,HWE)<10-7的SNP标记和检出率<90％的个体，最终有 1440个个体和35813个SNP用于GWAS研究。

实施例2 WU_10.2_17_4574599分子标记分型方法在杜洛克公猪精液性状关联分析中的应用

(1)杜洛克公猪精液性状表型预处理

公猪精液性状属于重复测量性状，需要利用混合线性模型(MLM)，采用公猪站、年份和月份的联合效应作固定效应，日龄、采精间隔作协变量，个体作随机效应，计算个体随机效应，作为新构建表型(pseudo-phenotypes)用于后续GWAS分析。利用R统计环境下lme4包进行分析，数据包含2020个个体，105201次采精记录。具体模型如下：

其中，y_ijklm是第l个个体第m次的精液性状(精子浓度)原始表型值；μ是群体均值；HYM_i是公猪站、年份和月份联合效应(固定效应)；AGE_j、

是日龄效应及其平方项(协变量)、INT_k、

是采精间隔效应及其平方项(协变量)，b₁、b₂是日龄效应协变量对应的回归系数，b₃、b₄是采精间隔效应协变量对应的回归系数；ID_l是个体效应(随机效应)，假定服从正态分布：

表示个体效应方差；ε_ijklm是模型残差效应，假定服从正态分布：

表示残差方差，I为相应的单位关联矩阵。

(2)杜洛克公猪精子浓度全基因组关联分析

用于基因型与精液性状关联分析所用的试验猪群是纯种杜洛克公猪(为常规品种，包括3 个品系：丹系、美系、华系)。基因分型所用的DNA由纯种杜洛克公猪(说明书正文和表中所称的“杜洛克公猪”统一简称为“猪”)精子中提取。基于多标记关联模型的方法，采用控制群体遗传背景的主成分作为协变量，利用R统计环境下MVP软件包中的FarmCPU模型进行 GWAS分析。具体的模型如下：

y_ijk＝b₁×PC1+b₂×PC2+b₃×PC3+M_i+S_j+ε_ijk

其中，y_ijk是性状根据混合线性模型计算出的第k个个体随机效应值 (pseudo-phenotypes)；PC1、PC2、PC3是控制群体遗传背景的前三大主成分效应；b₁、b₂、b₃是对应的回归系数；M_i是i个pseudo QTNs的基因型效应；S_j是第j个标记效应；ε_ijk是残差效应，假定服从正态分布：

表示残差方差，I为单位关联矩阵。

(3)WU_10.2_17_4574599分子标记分型结果与精子浓度关联分析

使用混合线性模型(MLM)进行WU_10.2_17_4574599分子标记与精子浓度的关联分析。

具体模型如下：

其中，y_ijklmno是第j种品系、第n个个体、第o次的精液性状(精子浓度)原始表型值；μ是群体均值；G_i是基因型效应、B_j是品系效应、HYM_k公猪站、年份和月份联合效应(固定效应)；AGE_l、

是日龄效应及其平方项(协变量)，INT_m、

是采精间隔效应及其平方项(协变量)，b₁、b₂是日龄效应协变量对应的回归系数，b₃、b₄是采精间隔效应协变量对应的回归系数；ID_n是个体效应(随机效应)，假定服从正态分布：

表示个体效应方差；ε_ijklmno是模型残差效应，服从正态分布：

表示残差方差， I为相应的单位关联矩阵。关联分析结果用最小二乘均数±标准误表示。关联分析结果见表2。

表2 WU_10.2_17_4574599的多态性以及不同基因型对猪精子浓度的影响

表1说明：P<0.05为差异显著；P<0.01为差异极显著。

由表1可知，对于精子浓度性状，基因型为CC的个体精子浓度极显著高于基因型为TT的个体，基因型为CC的个体精子浓度极显著高于CT个体，基因型为CT的个体精子浓度极显著高于TT个体。因此，C是有利于精子浓度的等位基因。

主要参考文献：

[1]张腾.提高母猪人工授精受胎率和产仔数的综合措施[D].西北农林科技大学,2011；

[2]薛振华等,.猪人工授精方式研究进展[J].当代畜牧,2009(05):40-42；

[3]李日伟,刘金兰,陈国琼.普及猪人工授精技术促进科学养猪[J].养殖与饲料,2009(02):12-14. [4]Robinson J AB,Buhr M M.Impact of genetic selection onmanagement of boar replacement[J].Theriogenology,2005,63(2):0-678；

[5]Robinson J A B,Buhr M M.Impact of genetic selection on managementof boar replacement[J].Theriogenology,2005,63(2):0-678；

[6]Liu X,Huang M,Fan B,et al.Iterative Usage of Fixed and RandomEffect Models for Powerful and Efficient Genome-Wide Association Studies[J].PLoS Genetics,2016, 12(2):e1005767；

[7]Klein R J,Zeiss C,Chew E Y,et al.Complement Factor HPolymorphismin Age-Related Macular Degeneration[J].Science,2005,308(5720):385-389；

[8]Chang H L,Lai Y Y,Wu M C,et al.Genetic correlations between malereproductive traits and growth traits in growth performance tested Duroc,Landrace and Yorkshire breed boars.[J]. Animal Science Journal,2017,88(9)。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种与公猪精子浓度性状关联的分子标记

<141> 2019-01-15

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 201

<212> DNA

<213> 猪(sus scrofa)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(201)

<220>

<221> mutation

<222> (101)..(101)

<400> 1

aaaataatca tgtccaaatt ttcttcctca aggatcctga ttttaattcc tcagaattag 60

tttcacttgt gcttgcctgt gatctattat agaatccagt caccaagtat cctattttct 120

tcgactgtga aaattaatat tatactagat cagtcaatct gaggagatca ccagaaaata 180

ataagtgcaa tcactctaaa t 201

Claims (1)

1.一种分子标记在公猪精子浓度标记辅助选择中非诊断目的的应用，所述分子标记的核苷酸序列如下所述：

AAAATAATCATGTCCAAATTTTCTTCCTCAAGGATCCTGATTTTAATTCCTCAGAATTAGTTTCACTTGTGCTTGCCTGTGATCTATTATAGAATCCAGTYACCAAGTATCCTATTTTCTTCGACTGTGAAAATTAATATTATACTAGATCAGTCAATCTGAGGAGATCACCAGAAAATAATAAGTGCAATCACTCTAAAT，

上述序列101位碱基处的Y是T或C，其导致所述序列的核苷酸产生多态性。

Images