CN111139305B - 与猪总产仔数性状相关的分子标记及其组合应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一组与猪总产仔数性状相关的分子标记及其组合应用，所述分子标记组合包括rs318687930、rs346259996和rs332860516处的SNP位点。通过检测猪rs318687930、rs346259996和rs332860516处基因型，根据基因型能够预测猪总产仔数的高低，利于提高优秀母猪的选种效率，加快高总产仔数猪的育种过程。

Description

与猪总产仔数性状相关的分子标记及其组合应用

技术领域

本发明涉及猪育种领域，具体涉及用来提高猪繁殖效率的与猪总产仔数性状相关的SNP分子标记及其组合应用。

背景技术

母猪的繁殖性能在很大程度上影响着现代化规模养猪的生产能力和效益，因此成为评价养猪业经济效益的一个重要指标，但是，母猪繁殖能力受到多种因素的调控和影响，包括遗传因素、营养水平、饲养管理和环境状况等。就遗传因素而言，母猪的繁殖性状属于低遗传力性状，例如产仔数的遗传力仅在0.11左右，难以实现早期选育。而单核苷酸多态性(SNP)作为一种广泛存在于动植物基因组中的基因遗传变异，其多态性具有准确性高、稳定性强以及可实现早期选择的优点，使得我们可以利用它在筛选繁殖性能优秀的母猪时进行早期选留。猪的繁殖性状属于数量性状，受多个基因控制，随着猪全基因组测序以及基因组图谱绘制的完成，为SNP的检测提供了强有力的工具，将其作为遗传标记应用于优秀母猪的选育，对复杂性状的遗传变异具有较大的研究意义。

Luman募集因子(Luman Recruting Factor，LRF)是近年来发现的一个转录因子，因其C端区域能够与Luman亮氨酸拉链区域相结合，促进Luman降解而得名，而Luman是CREB家族中的成员CREB3，因此LRF又叫做CREBRF。目前对CREBRF的研究实验主要集中在小鼠上，前人研究表明，CREBRF在小鼠生殖系统中呈现时空表达特征，CREBRF基因敲除雌性小鼠在哺乳期存在严重的母性行为缺失，乳腺发育缺陷以及显著的糖皮质激素受体(GR)信号增强。母鼠因缺少照顾幼崽的本能，导致80％的幼崽在出生后24h内死亡，初产的CREBRF基因敲除母鼠也显示出更多的与照顾幼鼠无关的活动；在机体内质网应激反应中，CREBRF能够募集Luman进入CREBRF的核小体，以阻止Luman的活化作用，加速Luman的降解，对ER-stress(endoplasmic reticulum stress，内质网应激反应)与UPR(Unfolded Protein Response，未折叠蛋白反应)起到负反馈调节作用，进而可能在ERS(endoplasmic reticulum stress，内质网应激反应)诱导的颗粒细胞凋亡中具有负反馈调节作用。

基于前期的研究和相关报道，我们可以看出CREBRF基因在机体代谢以及哺乳动物繁殖过程中的生物学功能在猪上几乎没有报道，其在母猪繁殖性能方面的调控作用以及分子机制还有待揭示。

为此，本发明的目的在于明确与母猪繁殖效率特别是总产仔数相关的基因，提供与母猪的总产仔数相关的SNP分子标记及其单倍型；同时提供一种高繁殖效率猪的选育方法，利用该SNP分子标记及其单倍型选育种猪，实现我国猪育种理论和技术水平的提升。

发明内容

针对上述问题，本发明人进行了锐意研究，对CREBRF基因的多态性与重要的繁殖性状进行了关联分析，首次在该猪基因中找到了与总产仔数相关的SNP分子标记及其单倍型，以应用于优秀母猪的筛选育种，提高优秀母猪的选种效率，从而完成本发明。

本发明的目的在于提供以下方面：

(1)一种与猪总产仔数相关的遗传标记组合，所述遗传标记组合包括以下SNP位点：

位于猪16号染色体的51174074位的SNP位点，Ensembl参考SNP编号为rs318687930；

位于猪16号染色体的51182920位的SNP位点，Ensembl参考SNP编号为rs346259996；

位于猪16号染色体的51206449位的SNP位点，Ensembl参考SNP编号为rs332860516。

(2)一种用于检测上述(1)所述的遗传标记组合的试剂盒，所述试剂盒包括扩增引物P₁和P₂以及延伸引物P₃、P₄和P₅；核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.5所示。

(3)一种鉴定或辅助鉴定猪总产仔数性状的方法，所述方法包括检测猪rs318687930、rs346259996和rs332860516处基因型，根据基因型预测猪总产仔数的高低。

(4)一种高总产仔数猪的育种方法，所述方法包括选择rs318687930处基因型为AA、rs346259996处基因型为AA并且rs332860516处基因型为AA的猪作为亲本进行育种的步骤。

(5)上述(1)所述的遗传标记组合物在鉴定或辅助鉴定猪总产仔数方面的用途，或者在选育高总产仔数猪方面的用途。

上述(2)中涉及的扩增引物或延伸引物在鉴定或辅助鉴定猪总产仔数方面的用途，或者在选育高总产仔数猪方面的用途。

上述(2)所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定猪总产仔数方面的用途，或者在选育高总产仔数猪方面的用途。

根据本发明提供的与猪总产仔数性状相关的SNP分子标记及其组合应用，具有以下有益效果：

本发明人在众多基因中选择特定的CREBRF基因进行猪繁殖性状关联性分析，首次发现该基因中特定SNP分子标记及其单倍型与总产仔数存在相关性，可有效用于鉴定或辅助鉴定高总产仔数母猪，加快高总产仔数母猪的筛选育种过程。

附图说明

图1示出包含rs318687930处的基因片段的多态性位点信息峰图；

图2示出包含rs346259996处的基因片段的多态性位点信的峰图；

图3示出包含rs332860516处的基因片段的多态性位点信的峰图。

具体实施方式

下面通过对本发明进行详细说明，本发明的特点和优点将随着这些说明而变得更为清楚、明确。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

本发明的目的在于提供一组与母猪的繁殖性状特别是总产仔性状相关的SNP分子标记及其单倍型，以应用于优秀母猪的筛选育种。其中，单倍型指的是同一条染色体或线粒体上，紧密连锁的多个等位基因的线性组合，每一种组合方式即为一种单倍型，单倍型是具有统计学关联性的遗传标记，可由多个SNP位点组成，能够很好的反应多个位点之间联合的信息；同时，由于某一性状往往不是由单个SNP位点引起的，而是由若干个SNP位点联合作用导致的，因此，在性状关联分析中，基于多个位点SNPs的研究往往比基于单个SNP位点的研究更有成效。

本发明在众多待筛选的基因中选择特定的基因即CREBRF基因，进而确定该基因上的SNP分子标记及其基因型，极大提高了对于相关SNP分子标记及其基因型确定的成功率。

本发明提供了CREBRF基因中与猪总产仔数相关的SNP分子标记及其基因型，所述SNP分子标记分别位于猪16号染色体的51174074位，16号染色体的51182920位，以及16号染色体的51206449位；Ensembl参考SNP编号分别为rs318687930、rs346259996和rs332860516。

本发明中，总产仔数是指：母猪在繁殖年限期间所有胎次产仔数的平均每胎产仔数。

应当指出的是，以上SNP位点是根据Ensembl的SNP数据库的命名方式来表示的，该方式是以rs加数位阿拉伯数字来表示一个确定的SNP位点。本领域人员应该知道，一个SNP位点还可以有其他表示方式，采用其他表示方式来标注指代与本发明一样的SNP位点或SNP位点组合属于本发明的范围。

本发明中，SNP分子标记rs318687930的两种等位基因为A和G(rs318687930处的突变类型为A/G突变)；脱氧核糖核苷酸A的基因频率高于脱氧核糖核苷酸G的基因频率。该SNP分子标记对应的三种基因型分别为AA、GG和AG。

SNP分子标记rs346259996的两种等位基因为A和T；脱氧核糖核苷酸A的基因频率高于脱氧核糖核苷酸T的基因频率。该SNP分子标记对应的三种基因型分别为AA、TT和TA。

SNP分子标记rs332860516的两种等位基因为A和G；脱氧核糖核苷酸A的基因频率高于脱氧核糖核苷酸G的基因频率。该SNP分子标记对应的三种基因型分别为AA、GG和GA。

AA基因型为猪SNP分子标记的脱氧核糖核苷酸为A的纯合体；GG基因型为猪SNP分子标记的脱氧核糖核苷酸为G的纯合体；AG基因型为猪SNP分子标记的脱氧核糖核苷酸为A和G的杂合体；TT基因型为猪SNP分子标记的脱氧核糖核苷酸为T的纯合体；TA基因型为猪SNP分子标记的脱氧核糖核苷酸为T和A的杂合体。

本发明人经过实验研究发现，rs318687930处基因型为AA的猪相较于基因型为GG和AG的猪有更高的总产仔数；rs346259996处基因型为AA的猪相较于基因型为TT和TA的猪有更高的总产仔数；rs332860516处基因型为AA的猪相较于基因型为GG和GA的猪有更高的总产仔数。

本发明中，与猪总产仔数性状相关的单倍型由包括以下SNP位点确定的等位基因构成：rs318687930、rs346259996和rs332860516。

进一步地，与猪总产仔数性状相关的单倍型由以下SNP位点确定的等位基因构成：rs318687930、rs346259996和rs332860516。

更进一步地，与猪总产仔数性状相关的基因型为(rs318687930)AA-(rs346259996)AA-(rs332860516)AA。

我们知道，SNP分子标记基因型的确定过程中，涉及猪基因组DNA的提取，PCR扩增反应和单碱基延伸反应等步骤。如利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)技术测定基因型：首先PCR扩增目标序列，然后加入SNP序列特异性延伸引物，在SNP分子标记上延伸1个碱基。将制备的样品分析物与芯片基质共结晶后在质谱仪的真空管经瞬时纳秒(10^-9s)强激光激发，核酸分子解吸附并转变为亚稳态离子，电场中离子飞行时间与离子质量成反比，通过飞行时间检测器检测核酸分子在真空管中的飞行时间而获得样品分析物的精确分子量，从而检测出SNP分子标记信息，该方法也称为Sequenom MassArray SNP基因型分析技术。

为此，我们提供了用于PCR扩增的扩增引物P₁和P₂，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

我们还提供了用于单碱基延伸的延伸引物及其组合，延伸引物组合中，rs318687930处的延伸引物P₃的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；rs346259996处的延伸引物P₄的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；rs332860516处的延伸引物P₅的核苷酸序列如SEQID NO.5所示。

另一方面，本发明提供了一种与猪总产仔数相关的SNP分子标记基因型的检测方法，该方法包括以下步骤：

(1)提取猪的基因组DNA；

(2)以待测猪的基因组DNA为模板，利用扩增引物和延伸引物进行SequenomMassArray检测或测序分析，确定猪rs318687930、rs346259996和rs332860516处的基因型。

其中，所述PCR扩增反应中扩增引物(P₁和P₂)分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；rs318687930处的延伸引物P₃的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；rs346259996处的延伸引物P₄的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；rs332860516处的延伸引物P₅的核苷酸序列如SEQID NO.5所示。

进而，通过检测得到上述与猪总产仔数相关的SNP分子标记基因型，即可得到与猪总产仔数相关的单倍型。

本发明中，与猪总产仔数相关的SNP分子标记基因型(或单倍型)的检测方法，还包括试剂盒测定法。

所述试剂盒包括(1)PCR扩增引物P₁和P₂；优选还包括(2)PCR反应试剂：包括PCR缓冲液、dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸的缩写，是包括dATP，dGTP，dTTP,dCTP等在内的统称)、PfuDNA聚合酶，SNaPshot混合液；(3)SNP分子标记的PCR延伸引物；(4)PCR产物纯化试剂：包括核酸外切酶、虾-碱性磷酸酶，以及纯化用缓冲液。

本发明中提供的检测试剂盒的使用方法为：从猪耳或其他组织细胞中提取DNA样品；配制PCR反应体系，进行PCR扩增、纯化PCR产物；PCR产物与SNP位点的延伸引物同时进行延伸反应；对延伸产物进行毛细管电泳分析；SNP分子标记分析，进而得到基因分型信息。上述SNP分子标记分析可以利用自动测序仪。

再一方面，利用上述SNP分子标记基因型(或单倍型)的检测方法，本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定猪总产仔数性状的方法，或者提供了一种高总产仔数种猪筛选方法：包括检测猪rs318687930、rs346259996和rs332860516处基因型，根据基因型预测猪总产仔数的高低：

其中，rs318687930处基因型为AA、rs346259996处基因型为AA并且rs332860516处基因型为AA的猪相较于其他基因型组合的猪具有更高的总产仔数。

进一步的，利用上述SNP分子标记基因型(或单倍型)的检测方法，鉴定或辅助鉴定猪总产仔数性状的方法，或者高总产仔数种猪筛选方法，本发明还提供了一种高总产仔数猪的育种方法：包括选择rs318687930处基因型为AA、rs346259996处基因型为AA并且rs332860516处基因型为AA的猪作为亲本进行育种的步骤。具体的：

步骤1，选择rs318687930处基因型为AA、rs346259996处基因型为AA并且rs332860516处基因型为AA的猪作为亲本(F0)配种，获得第一代(F1代)仔猪；

步骤2，对F1代仔猪进行基因型分析，选育rs318687930处基因型为AA、rs346259996处基因型为AA并且rs332860516处基因型为AA的仔猪，成年后继续配种得F2代仔猪；

重复上述步骤2，最终得到高总产仔数遗传性的种猪。上述方法遵从自然繁殖，通过较少人工干预，获得高总产仔数的种猪；同时，所述育种方法为非转基因方法，群众的接受度更高，可有效促进养猪业发展，提升我国种猪业的核心竞争力。

本发明还提供了一种上述SNP分子标记及其组合在鉴定或辅助鉴定猪总产仔数方面的用途。

本发明还提供了一种用以检测上述SNP分子标记的延伸引物或扩增引物在鉴定或辅助鉴定猪总产仔数方面的用途。

本发明还提供了一种用以检测上述SNP分子标记基因型的方法在鉴定或辅助鉴定猪总产仔数方面的用途。

实施例实施例1SNP分子标记的获得

1、实验样品采集

逐个采集山东某猪场248头有繁殖信息记录的大白猪和47头黑猪1g左右的耳组织样品，放在含有1mL 75％酒精的Axgen管中，-20℃保存，待提DNA，用于CREBRF基因的测序及SNP分型。

2、CREBRF基因SNP分型

2.1猪基因组DNA的提取与检测

(1)剪取50mg左右的猪耳组织，尽量剪碎将其放进1.5ml的Axgen管中；

(2)终浓度为0.4mg/ml的蛋白酶K和裂解缓冲液混合均匀，向装有耳组织的1.5ml的离心管中各加入0.5ml混合液，上下轻轻震荡，充分混匀；

(3)将离心管平行均匀的放置于恒温水浴锅的摇板上(严封管盖，以免液体外渗)，55℃震荡6个小时以上，直至组织溶解(无明显肉眼可见组织块，混合液成乳状)；

(4)待样品充分消化后，向每管中加入0.3ml饱和氯化钠溶液，上下颠倒混匀6-8次，然后放于冰上15分钟；

(5)冰浴过后，12000rpm室温离心15分钟，小心缓慢的将上清转移至新的1.5mlAxgen离心管中；

(6)加入与上清等体积约0.7ml的异丙醇于各管，充分颠倒震荡直至溶液中有絮状沉淀出现(若无絮状沉淀，可将溶液-20℃冰箱放置2小时或4℃冰箱放置过夜)；

(7)12000rpm室温离心15分钟，管底和管壁出现白色DNA沉淀，弃上清；

(8)在各离心管中加入0.5ml预冷的70％乙醇，轻轻颠倒以充分洗涤DNA沉淀；

(9)10000rmp离心30s，用200ul微量移液枪将离心管中的乙醇吸掉，将沉淀的DNA留在管中；

(10)自然风干DNA10分钟；

(11)用移液枪取0.1ml的TE缓冲液于各管中，溶解DNA沉淀，置于55℃放置2小时，定时摇晃数次，以使DNA充分溶解；

(12)待DNA充分溶解后，用紫外分光光度计测定浓度，1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测所提DNA质量；

(13)将DNA溶液放置4℃过夜，次日取1μl进行PCR(DNA溶液可4℃保存；若长时间不使用，需放置于-20℃冰箱中)。2.2SNP芯片基因型判定及基因型数据的质控

将248头大白猪和47头黑猪共295个DNA样品，SNP的相关信息、扩增引物和延伸引物交给北京康普森生物有限公司进行核酸质谱测序。

以样本DNA为模板，加入PCR扩增引物对以及单碱基延伸引物对CREBRF基因进行分段扩增，对PCR扩增产物进行测序，得到每一段序列的多态性位点信息的峰图，检测目的基因的SNP位点。

其中，包含rs318687930、rs346259996和rs332860516处的基因片段的多态性位点信息峰图如图1至图3所示。

表1 PCR扩增体系

表2 PCR扩增程序

2.3数据整理与分析

1)表型数据分析

利用SAS9.2统计分析软件，对猪总产仔数性状测定值进行描述性统计分析，包括计算性状的平均值、标准差、最大值和最小值，进而与SNP位点进行关联分析。

2)单倍型分析

单核苷酸多态性的基因型和等位基因频率的计算是使用PopGene3.2实现的。利用SAS9.4软件中的GLM过程分析SNP和产仔数等性状的关联分析，固定效应模型如下：

y＝μ+gi+mk+e

y为繁殖性状的表型记录；μ为性状的总平均值；gi为基因型效应；mk为生产月份效应；e为随机误差。数据以概率值和平均值±标准差表示，*(P值＜0.05)表示具有显著性差异，**(P值＜0.01)表示具有极显著性差异。

2.4结果分析

通过上述Sequenom MassArray，测得大白猪和黑猪CREBRF基因SNP分型结果，如表3所示。

表3

研究发现了CREBRF基因中存在与母猪的繁殖性状显著相关的SNP分子标记rs318687930、rs346259996和rs332860516，分别位于猪16号染色体的51174074位、16号染色体的51182920位、以及16号染色体的51206449位。其中，rs318687930基因型检测结果表明：GA的基因型频率高于AA和GG；rs346259996基因型检测结果表明：TA的基因型频率高于AA和TT；rs318687930基因型检测结果表明：GA的基因型频率高于AA和GG。

利用SAS9.4软件对各SNP位点基因型和母猪的总产仔数进行统计分析，并做样本间多重比较。结果如表4～表7所示。

表4 rs318687930与总产仔数关联分析

注：**是基因型AA组相较于GG组存在极显著性差异。

表5 rs346259996与总产仔数关联分析

注：**是基因型AA组相较于TT组存在极显著性差异。

表6 rs332860516与总产仔数关联分析

注：**是基因型AA组相较于GG组存在极显著性差异。

表7位点不同组合与总产仔数的关联分析

rs318687930-rs346259996-rs332860516	母猪数目(头)	总产仔数(头)
			AA-AA-AA	104	10.16±0.19**
AA-TA-GA	4	9.9±1.15
			GA-TA-GA	156	9.67±0.16
GA-TT-GG	3	9.81±1.15
			GG-TT-GG	26	8.60±0.38

注：**是基因型AA-AA-AA组相较于GG-TT-GG组存在极显著性差异。

关联分析结果显示，rs318687930、rs346259996、rs332860516该三个SNP位点的多态性与母猪的总产仔数有着极显著的相关关系，单标记SNP筛选母猪总产仔数较高的个体时，以下标记属于优势基因型：

rs318687930的优势基因型AA：总产仔数为10.10±0.20

rs346259996的优势基因型AA：总产仔数为10.10±0.20

rs332860516的优势基因型AA：总产仔数为10.08±0.20

而通过对以上三个SNP位点进行组合，应用于筛选总产仔数较高的个体时，结果显示：

rs318687930-rs346259996-rs332860516的AA-AA-AA组合母猪个体的总产仔数为10.16±0.19，优于单标记SNP对总产仔数性状的选择。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 与猪总产仔数性状相关的分子标记及其组合应用

<130> 2018

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增引物P1（Sus scrofa ）

<400> 1

gccaggcagt tcaccctaat 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增引物P2（Sus scrofa ）

<400> 2

aagtgctgga acaaccccaa 20

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 延伸引物P3（Sus scrofa ）

<400> 3

gctgaacata tgtaagtaaa taaaac 26

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 延伸引物P4（Sus scrofa ）

<400> 4

cctcctacct tccaaccaag 20

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 延伸引物P5（Sus scrofa ）

<400> 5

ccccggacct cttaatactg aaaagc 26

Claims (3)

1.一种鉴定或辅助鉴定猪总产仔数性状的方法，其特征在于，所述方法包括检测猪rs318687930、rs346259996和rs332860516处基因型，根据基因型预测猪总产仔数的高低，

rs318687930处基因型为AA、rs346259996处基因型为AA并且rs332860516处基因型为AA的猪相较于其他基因型组合的猪具有更高的总产仔数。

2.一种高总产仔数猪的育种方法，其特征在于，所述方法包括选择rs318687930处基因型为AA、rs346259996处基因型为AA并且rs332860516处基因型为AA的猪作为亲本进行育种的步骤。

3.根据权利要求2所述的育种方法，其特征在于，包括以下具体步骤：

步骤1，选择rs318687930处基因型为AA、rs346259996处基因型为AA并且rs332860516处基因型为AA的猪作为亲本配种，获得第一代仔猪；

步骤2，对F1代仔猪进行基因型分析，选育rs318687930处基因型为AA、rs346259996处基因型为AA并且rs332860516处基因型为AA的仔猪，成年后继续配种得F2代仔猪；

重复上述步骤2，最终得到高总产仔数遗传性的种猪。

Images