CN113699246A - 一种影响猪饲料转化效率性状的snp分子标记及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种影响猪饲料转化效率性状的SNP分子标记及其用途，所述SNP分子标记的位点对应于国际猪基因组11.1版本参考序列7号染色体上第2494262个核苷酸位点C>T突变。本发明研究并确定影响饲料转化效率相关的SNP分子标记，验证其对饲料转化效率性状的影响效应，最终建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于种猪饲料转化效率性状遗传改良中，从而降低猪的饲料转化效率，进而节约粮食，降低企业生产成本。

Description

一种影响猪饲料转化效率性状的SNP分子标记及其用途

技术领域

本发明涉及一种影响猪饲料转化效率性状的SNP分子标记及其用途。

背景技术

猪肉是人类重要的肉类来源，大约占世界人口消费的肉类的40％。受中国人肉食消费习惯影响，猪肉一直是最主要肉类食品来源。据国家统计局数据显示，2020年，我国生猪年出栏总数为5.27亿头，占世界生猪出栏数的一半；猪肉产量为4113万吨，占全球猪肉产量的42.02％，同样稳居头号交椅。随着生猪养殖逐渐朝着规模化方向发展，生猪养殖成本越来越被重点关注。其中饲料费用为最大投入，占比65-80％，已经成为掣肘生猪企业规模化发展及快速扩张的关键因素。另外，养猪场普遍采用配合饲料，对玉米、大豆等农作物的需求量逐年上升，而我国的耕地面积有限，“人猪争粮”的矛盾日益凸显。此外，提高饲料利用效率在降低农作物原材料消耗的同时，还可降低粪便产量和潜在温室气体排放总量。因此，在资源有限的情况下，如何通过合理手段提高猪的饲料利用效率，对缓解“人畜争粮”矛盾、降低养猪企业猪肉生产成本和提升企业核心竞争力意义重大。

饲料利用效率主要反映猪在采食饲料时对饲料的利用能力。常见的衡量饲料利用效率的指标有饲料转化效率(又称料肉比)。饲料转化效率是衡量畜禽对饲料利用效率高低的一项重要的经济技术指标。养猪生产是否盈利更加取决于猪群饲料转化效率的高低。假如饲料转化效率提高0.1：1，我国养猪业每年可节约饲料805万吨，相当于564万亩土地的粮食产量。按60％的配方比例计，可节约玉米483万吨，超过了目前我国一年300多万吨的玉米进口；按20％的配方比例和79％的出粕率计，可节约大豆204万吨，相当于一年大豆进口量6338万吨的1/20。饲料转化效率的提高对于解决我国饲料用粮短缺问题、缓解人畜争粮矛盾意义重大。显然，饲料转化效率无疑是种猪遗传改良工作中的首要性状。因此，如何提高饲料转化效率，减少饲料消耗是当前养猪业面临的重要问题之一。

然而，饲料转化效率作为种猪遗传改良工作中的首要性状，却少有在杜洛克猪群体中鉴定与饲料转化效率相关的分子标记。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足和缺点而提供一种影响猪饲料转化效率性状的SNP分子标记及其用途，本发明还提供了一种用于检测所述的SNP分子标记的引物对和试剂盒，本发明还提供了一种筛选优良饲料转化效率性状的猪品种的方法，本发明还提供了一种猪的遗传改良的方法。

为实现上述目的，所采取的技术方案：一种影响猪饲料转化效率性状的SNP分子标记，所述SNP分子标记的位点对应于国际猪基因组11.1版本参考序列7号染色体上第2494262个核苷酸位点C>T突变。该位点碱基的多态性导致猪饲料转化效率性状的不同。

优选地，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述SNP分子标记的位点为SEQ IDNO:1序列标注位置为152的C152-T152的核苷酸突变。

优选地，所述猪包括杜洛克及其合成系。

本发明提供了一种用于检测上述所述的SNP分子标记的引物对，所述引物对的核酸序列如下所示：

正向引物序列如SEQ ID NO：2所示；

反向引物序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明提供了一种用于检测上述所述的SNP分子标记的试剂盒，包括上述所述的引物对。

本发明提供了一种筛选优良饲料转化效率性状的猪品种的方法，包括以下步骤：检测猪7号染色体上上述所述的SNP分子标记，淘汰所述SNP分子标记的5’端第152位单核苷酸是C的个体，保留所述SNP分子标记的5’端第152位单核苷酸是T的个体为种猪。

优选地，所述检测猪7号染色体上上述所述的SNP分子标记的引物为上述所述的引物对。

本发明提供了一种猪的遗传改良的方法，所述方法包括：确定种猪核心群中的种猪的上述所述的SNP分子标记的位点，并根据所述SNP分子标记做出相应的选择：在所述种猪核心群中选择在所述第2494262位点为TT、TC基因型的种猪个体，淘汰在该位点为CC基因型的种猪个体，以逐代提高该位点的等位基因T的频率，从而降低后代猪的饲料转化效率。

优选地，所述种猪包括杜洛克及其合成系。

本发明提供了上述所述的SNP分子标记、上述所述的引物对或上述所述的试剂盒在鉴定影响猪饲料转化效率性状、筛选低剩余采食量性状的猪品种、猪遗传育种或降低后代猪的饲料转化效率中的用途。

有益效果：

本发明研究并确定影响饲料转化效率相关的分子标记，验证其对饲料转化效率性状的影响效应，最终建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于种猪饲料转化效率性状遗传改良中，从而降低猪的饲料转化效率，进而节约粮食，降低企业生产成本，提高企业利润，增加核心竞争力。

附图说明

图1为杜洛克猪在7号染色体上关于饲料转化效率性状的全基因组关联(GWAS)分析图；其中：横坐标表示猪的染色体编号；纵坐标表示-logP值。

图2是不同基因型杜洛克猪的饲料转化效率性状的表型差异结果分析图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

1、实验动物

本发明所使用的实验猪群群体为温氏食品集团股份有限公司种猪分公司的纯种美系杜洛克，为种猪分公司核心群。

本实验共选取该资源群体中1170头杜洛克猪，每个个体在30kg到100kg体重之间时用奥饲本生产性能测定系统进行数据收集。

杜洛克猪产仔数较少，大群平均仅为9～10头，但生长快，饲料转化效率高，胴体瘦肉率高，肌内脂肪含量较高，抗逆性强。国内商品猪生产已建立起较为成熟的杂交配套体系。其中杜长大的杂交组合在我国的内销和外销市场中持续保持绝对优势地位，作为终端父本的杜洛克种猪，对商品猪的遗传贡献率占50％。因此，提高杜洛克种公猪的生产性能的研究显得尤为重要。

2、实验方法

本实验所有猪全部采用圈养方式进行饲养，在生长育肥阶段每栏圈养10-12头猪(每头猪占用面积为2㎡)，只有采食饮水，并按照统一饲养标准。每千克日粮营养水平为：粗蛋白16％，消化能13.1MJ，赖氨酸0.78％，钙0.6％，磷0.5％。

每个圈安装有奥饲本种猪生产性能测定系统，能够检测每头猪的每日体重、每日采食次数和每日采食量。我们对奥饲本种猪生产性能测定系统自动生成的数据进行数据处理，剔除异常值，同时用R软件使用前后4天平均值的方法来补齐饲料转化效率缺失或者异常的数据。

3、猪全基因组50K SNP判型

选取的1170头杜洛克种猪中的每个个体采集的耳组织或者断尾组织，用标准苯酚-氯仿法提取全基因组DNA，经Nanodrop2000/2000C核酸蛋白检测仪准确测定每一份样品的DNA的浓度和OD比值(OD260/280、OD260/230)。)。检测结果OD260/280比值在1.8-2.0之间、OD260/230比值介于1.5-2.3之间则判定合格。检测合格的DNA样品，按照检测的浓度将DNA稀释至50ng/μL左右。再将6μL已提取好的待测DNA样品与2μL Loading Buffer混合，上样到质量体积比为1％的琼脂糖凝胶中，150V电压下电泳25min，在紫外分光光度仪和凝胶成像设备下观察并拍照，观察DNA的完整性。每一个样品电泳结果须有一条单一的大于50Kb的明亮条带，无RNA无蛋白污染。

DNA样品送纽勤生物科技(上海)有限公司，在Illumina Beadstration平台上根据公司标准流程进行猪全基因组50K SNP芯片(Illumina,美国)基因型判定。利用软件PLINKv1.9对所有样本50K芯片扫描分型数据进行质量控制，剔除检出个体率低于90％、家系孟德尔错误率高于0.1、最小等位基因频率小于0.05且哈代-温伯格平衡显著性水平高于10^-6的SNP。

4、重测序个体筛选和测序

进一步结合系谱信息和遗传贡献程度，利用R语言从进行SNPs分型的个体中152个加系杜洛克猪进行全基因组重测序，测序深度10X。在诺禾致源公司的Hiseq2500测序平台进行150bp得双端测序模式的高通量测序，测序结果为FASTQ格式。

5、重测序数据分析

基于最新版的软件Genome Analysis Toolkit(GATK，version4.1.4.1)联合bwa、vcftools和samtools等软件，构建了加系杜洛克重测序数据分析流程，最终获取所有个体的变异位点信息结果。

6、基因型填充

缺失基因型填充主要过程为将前期进行重测序的个体组成参考群体，并构建参考群体的参考单倍型库，再利用软件基于参考单倍型库将50K的SNPs芯片数据填充成全基因组测序数据。因为50K的SNPs芯片使用的是Illumina的TOP和BOT等位基因分型策略，所以SNPs芯片和重测序数据有时会存在同一位点的基因型不一致的情况。而高质量imputation特别依赖于研究和参考数据等位基因要求相对于参考序列位于同一条DNA物理链上(Strand)。因此在填充之前，还需要修正SNPs芯片和重测序数据同一位点基因型不一致的情况。具体流程为先将每个SNP的引物序列利用BWA软件比对到参考基因组上，确认每个SNP位于正义链还是反义链上，再根据Illumina的TOP和BOT等位基因分型策略推断出SNPs芯片基因型，最后用PLINK软件将SNP位于反义链上的等位基因互补回去。本研究采用软件EAGLE结合软件Minimac4进行基因型填充，采用交叉验证(6-fold cross validation)的方法评估其填充准确性为95％。

7、全基因组关联(GWAS)分析

选择来自美国密歇根大学的Xiang Zhou和芝加哥大学的Matthew Stephens共同研发的GEMMA软件进行全基因组关联分析。考虑到亲缘关系以及群体分层效应对关联分析造成的假阳性结果的可能性，需提前利用GEMMA软件构建n×n亲缘关系矩阵，n表示个体数。亲缘关系矩阵由SNPs芯片基因型填充后所有SNPs进行构建。

本研究采用单变量混合线性模型进行变异位点与性状之间的GWAS，其中显著性检验采用Wald检验。单变量混合线性模型如下：

y＝Wα+Xβ+u+ε

y为所有个体的表型构建的n×1向量；W表示协变量(固定效应)的指示矩阵，包括场际效应和性别，α为包括截距在内的协变量对应的相关系数；X为SNPs的基因型构成的n×1向量，β为每个标记对应的效应值；u为随机效应，ε为残差。

针对基于SNPs芯片的全基因组关联分析结果，往往会采用严格的Bonferroni多重校正法来设定显著性阈值，从而减低关联分析结果的假阳性率。而针对基因型填充的全基因组关联分析结果，Bonferroni多重校正法过于严格，基于在基因组上猪和人的独立单倍型框的数量基本相同的假设，而参考人类相关的全基因组关联分析的研究设置的基因组显著性阈值为5×10^-8，我们在研究中使用了相同的全基因组显著性阈值，此外还设定了一个更宽松的染色体显著水平的阈值5×10^-6。

8、不同基因型与饲料转化效率表型的关联性分析

根据表1和图1可知，分子标记的SNP位点g.152C>T与饲料转化效率性状极显著相关(P<0.001)，说明此分子标记显著影响猪的饲料转化效率性状，可以通过对猪的此SNP位点的辅助选择，从而降低该群体饲料转化效率，进而加快育种进程。

另外根据表1还可知，CC型比TT和TC型的平均饲料转化效率高，说明纯合子CC对平均饲料转化效率是最不利的。通过图2进一步得知，纯合子CC与TT和TC基因型显著差异，而CC与TT基因型更是差异极显著，这进一步说明纯合子CC对饲料转化效率最不利。饲料转化效率是生长性状的重要指标，饲料转化效率低说明猪的生长性能好。因此，CC基因型的猪的生长性能是最差的，我们在进行育种的过程中需要淘汰CC型的种猪，保留TT和TC型的种猪，以逐代提高该位点的等位基因T的频率。

表1分子标记的SNP位点g.152C>T与饲料转化效率的相关性

9、目的DNA序列扩增及测序

(1)引物设计

通过Ensembl网站(http://asia.ensembl.org/index.html)下载猪的7号染色体上SEQ ID NO:1的DNA序列。并利用引物设计软件primer premier 6.0设计引物。

设计的引物的DNA序列如下所示：

P001正向：5’-CAAGCAGGCATCACAAATTCTACACC-3’，

P002反向：5’-AACCCAGGATCCCTGGCTAC-3’；

(2)PCR扩增

10uL的反应体系中加入DNA模板1uL，双蒸水3.4uL，2×Tag PCR StanMix withLoading Dye 5uL，引物P001和P002各0.3ul。PCR反应条件为：94℃预变性5min后，94℃变性30s、62.5℃退火30s、72℃延伸60s，30个循环，最后72℃延伸5min。

(3)DNA序列测定

最后对PCR扩增后的产物进行测序，序列测定由赛默飞世尔科技公司完成，基因片段测序要求为双向测通。

测序结果如下所示：

注：序列表中标注的M为突变位点，用标有下划线显示(括号中为突变碱基，为等位基因突变)，在该序列的首尾加粗显示为引物序列。

10、分子标记的SNP位点g.152C>T效应分析

通过对分子标记辅助选择，对群体内基因型的CC的淘汰，我们显著降低了群体的饲料转化效率，饲料转化效率提高在0.04～0.1：1之间，以每头猪100kg，总计100000头的规模猪场计算，能够节省400～1000吨饲料。按照育肥猪饲料4500元的价格计，可节约180～450万元；按60％的配方比例计，可节约玉米240～600吨；按20％的配方比例和79％的出粕率计，可节约大豆71.1～158吨。

本发明通过对SEQ ID NO:1序列中的第152个位碱基突变位点进行检测，初步进行其基因型与猪的饲料转化效率性状之间的关联分析的应用，为猪的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种影响猪饲料转化效率性状的SNP分子标记及其用途

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 269

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 1

caagcaggca tcacaaattc tacacccccc atgcggggcg ctgggtctcc ctgaagccca 60

cccaccacct ggcaggctca gagagcacca gaaacccggc tccactggga cggggggctg 120

agagcagagg cgggaagagg agtctgggca gmcagatacc aaggccaggt tgggggtggg 180

ggttcagggg tcataacaga atccccaggt gggtgcggga caactgaata tctgggcagg 240

aggcacactg tagccaggga tcctgggtt 269

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

caagcaggca tcacaaattc tacacc 26

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

aacccaggat ccctggctac 20

Claims (10)

1.一种影响猪饲料转化效率性状的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的位点对应于国际猪基因组11.1版本参考序列7号染色体上第2494262个核苷酸位点C>T突变。

2.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述SNP分子标记的位点为SEQ ID NO:1序列标注位置为152的C152-T152的核苷酸突变。

3.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，所述猪包括杜洛克及其合成系。

4.一种用于检测权利要求1所述的SNP分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对的核酸序列如下所示：

正向引物序列如SEQ ID NO：2所示；

反向引物序列如SEQ ID NO：3所示。

5.一种用于检测如权利要求1-3任一所述的SNP分子标记的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求4所述的引物对。

6.一种筛选优良饲料转化效率性状的猪品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：检测猪7号染色体上如权利要求1-3任一所述的SNP分子标记，淘汰所述SNP分子标记的5’端第152位单核苷酸是C的个体，保留所述分子标记的5’端第152位单核苷酸是T的个体为种猪。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述检测猪7号染色体上如权利要求1-3任一所述的分子标记的引物为如权利要求4所述的引物对。

8.一种猪的遗传改良的方法，其特征在于：所述方法包括：确定种猪核心群中的种猪的权利要求1-3任一所述的SNP分子标记的位点，并根据所述SNP分子标记做出相应的选择：在所述种猪核心群中选择在所述第2494262位点为TT、TC基因型的种猪个体，淘汰在该位点为CC基因型的种猪个体，以逐代提高该位点的等位基因T的频率，从而降低后代猪的饲料转化效率。

9.根据权利要求6-8任一所述的方法，其特征在于，所述种猪包括杜洛克及其合成系。

10.如权利要求1-3任一所述的SNP分子标记、如权利要求4所述的引物对或如权利要求5所述的试剂盒在鉴定影响猪饲料转化效率性状、筛选低剩余采食量性状的猪品种、猪遗传育种或降低后代猪的饲料转化效率中的用途。

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