CN114657261B - 一种与绵羊胸椎数相关的snp分子标记、引物组、试剂盒及检测方法和应用 - Google Patents

一种与绵羊胸椎数相关的snp分子标记、引物组、试剂盒及检测方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种与绵羊胸椎数相关的SNP分子标记、引物组、试剂盒及检测方法和应用，属于绵羊SNP分子标记技术领域。本发明提供了一种与绵羊胸椎数相关的SNP分子标记，所述SNP位点位于绵羊第5号染色体上第40945978bp位点处；所述SNP位点位于ABCA7基因外显子区。基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v3.1，该位点的碱基存在G/A突变，与绵羊胸椎数具有显著的相关性，在绵羊育种过程中，可将GA型个体选留下来，从而提高绵羊群体的胸椎数。

Description

一种与绵羊胸椎数相关的SNP分子标记、引物组、试剂盒及检 测方法和应用
技术领域
本发明涉及绵羊SNP分子标记技术领域，具体涉及一种与绵羊胸椎数相关的SNP分子标记、引物组、试剂盒及检测方法和应用。
背景技术
绵羊是我国优良的畜种之一，增加绵羊产肉率可对我国绵羊业的可持续发展将带来巨大的经济效益。绵羊胸椎存在变异一般胸椎为13-14个。多脊椎蒙古羊可通过改善胴体长、胴体重、背长长度和眼肌面积影响羊的产肉量。这种胸腰椎的变异已经在猪、牛、小鼠和羊中有所体现。家畜胸椎数的增加可以改变一些经济性状，例如体尺长度、背膘厚度和肌间脂肪含量，还可以增加繁殖性能和生长性能，对绵羊的生产是有利的。因此，利用全基因组分析绵羊的胸椎数性状，探究基因多态性与胸椎数之间的关联性，并可作为潜在的绵羊多胸椎数分子标记，为提高绵羊胸椎数、改良绵羊生长发育可以提供理论基础。但目前仍缺乏与绵羊多胸椎数相关的分子标记。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与绵羊胸椎数相关的SNP分子标记、引物组、试剂盒及检测方法和应用。本发明所述SNP位点的G/A碱基突变与绵羊胸椎数紧密相关，通过筛选基因型为GA的绵羊即可得到胸椎数多的绵羊。
本发明提供了一种与绵羊胸椎数相关的SNP分子标记，所述SNP位点位于绵羊第5号染色体上第40945978bp位点处；所述SNP位点位于ABCA7基因外显子区。
本发明还提供了基于上述技术方案所述分子标记的利用SequenomSNP技术检测绵羊胸椎数的引物组，包括第一引物、第二引物和延伸引物；所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述第二引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
本发明还提供了基于上述技术方案所述分子标记或上述技术方案所述引物组的利用SequenomSNP技术检测绵羊胸椎数的试剂盒，包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、MgCl2、PCR反应缓冲液和SAP酶，还包括权利要求2所述的引物组。
优选的是，所述试剂盒还包括标准阳性模板DNA。
本发明还提供了基于上述技术方案所述试剂盒的绵羊胸椎数的检测方法，包括以下步骤：
1)提取待测绵羊的基因组DNA；
2)以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述引物组中的第一引物和第二引物进行PCR扩增反应，获得PCR扩增产物；
3)用SAP酶对步骤2)获得的PCR扩增产物进行消化，获得消化后的产物；
4)以步骤3)获得的消化后的产物为模板，利用权利要求2所述引物组中的延伸引物进行延伸反应，获得延伸产物；
5)利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术分析延伸产物，确定ABCA7基因的基因型。
优选的是，步骤2)中，所述PCR扩增反应的体系以196孔PCR板+38％的试剂损耗计，包括：
所述PCR扩增反应的反应程序为：
预变性94℃2min；变性94℃20s，退火56℃30s，延伸72℃60s，45个循环；72℃保持3min。
优选的是，步骤3)中，所述消化的体系以196孔PCR板+38％的试剂损耗计，包括：
所述消化的程序为：37℃，40min；85℃，5min。
优选的是，步骤4)中，所述延伸反应的体系以196孔PCR板+38％的试剂损耗计，包括：
所述延伸反应的程序为：
94℃30s；[94℃5s，(52℃5s，80℃5s)]；其中所述(52℃5s，80℃5s)进行5个循环，所述[94℃5s，(52℃5s，80℃5s)]进行40个循环；72℃3min。
本发明还提供了上述技术方案所述的分子标记或上述技术方案所述的引物组或上述技术方案所述的试剂盒在绵羊育种中的应用，所述绵羊育种包括培育绵羊胸椎数多的品种。
优选的是，所述绵羊育种过程中，筛选基因型为GA的绵羊作为胸椎数多的绵羊。
本发明提供了一种与绵羊胸椎数相关的SNP分子标记，所述SNP位点位于绵羊第5号染色体上第40945978bp位点NC_056058.1(41220691..41238733)处；所述SNP位点位于ABCA7基因外显子区。基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v3.1，该位点的碱基存在G/A突变，与绵羊胸椎数具有显著的相关性。
本发明基于所述分子标记或基于与其对应的引物组或试剂盒，利用SequenomSNP技术检测检测ABCA7基因型并预测小尾寒羊胸椎数，更灵敏，准确性更高，性价比更高，能同时对数百至数千份样本中数十到数百个SNP位点进行检测。ABCA7基因存在GA和GG两种基因型，本发明利用Sequenom/>SNP技术实现单核苷酸型检测，筛选基因型为GA的绵羊作为胸椎数多的绵羊。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的延伸产物的质谱检测结果。
具体实施方式
本发明提供了一种与绵羊胸椎数相关的SNP分子标记，所述SNP位点位于绵羊第5号染色体上第40945978bp位点(NC_056058.1(41220691..41238733))处；所述SNP位点位于ABCA7基因外显子区。所述位点上存在G/A碱基突变，与绵羊胸椎数(肋骨数)具有显著的相关性，检测该基因变异位点在群体中的多态性，可作为绵羊肋骨数性状候选基因及分子标记。具体的，当所述位点的基因型为GG时，绵羊具有少胸椎数性状，当所述位点的基因型为GA时，绵羊有多胸椎数性状。在本发明中，所述SNP位点信息基于绵羊基因组序列信息版本号：Oar_v3.1。
本发明还提供了基于上述技术方案所述分子标记的利用SequenomSNP技术检测绵羊胸椎数的引物组，包括第一引物、第二引物和延伸引物；所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：5’-ACGTTGGATGGGAGAAGTGAGGAAAGAGTG-3’(后文简称2nd-PCRP)；所述第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：5’-ACGTTGGATGGCCTCTACCTACAGCAGATG-3’(后文简称1st-PCRP)；所述延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：5’-TGCCCTACCCCTGCTAC-3’(后文简称(S1))。
本发明还提供了基于上述技术方案所述分子标记或上述技术方案所述引物组的利用SequenomSNP技术检测绵羊胸椎数的试剂盒，包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、MgCl2、PCR反应缓冲液和SAP酶，还包括上述技术方案所述的引物组。
在本发明中，所述第一引物和第二引物的使用浓度优选为0.50μmol/L；所述延伸引物的使用浓度优选为0.6～1.3μmol/L。在本发明中，所述dNTPs的使用浓度优选为25μmol/L；所述Taq DNA聚合酶的使用浓度优选为5U/μL；所述MgCl2的使用浓度优选为25mmol/L；所述PCR反应缓冲液优选为10×PCR反应缓冲液；所述SAP酶的酶活优选为1.7U/μL。本发明中所述试剂盒优选的还包括10×SAP Buffer。
本发明还提供了基于上述技术方案所述试剂盒的绵羊胸椎数的检测方法，包括以下步骤：
1)提取待测绵羊的基因组DNA；
2)以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用上述技术方案所述引物组中的第一引物和第二引物进行PCR扩增反应，获得PCR扩增产物；
3)用SAP酶对步骤2)获得的PCR扩增产物进行消化，获得消化后的产物；
4)以步骤3)获得的消化后的产物为模板，利用上述技术方案所述引物组中的延伸引物进行延伸反应，获得延伸产物；
5)利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术分析延伸产物，确定ABCA7基因的基因型。
本发明提取待测绵羊的基因组DNA。本发明对所述待测绵羊的种类没有特殊要求，任何种类的绵羊均可，在本发明实施例中采用的是小尾寒羊绵羊；本发明对所述待测绵羊基因组的提取方法没有特殊限定，采用本领域常规的动物细胞基因组提取方法即可。
本发明在获得所述待测绵羊的基因组DNA后，以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用上述技术方案所述引物组中的第一引物和第二引物进行PCR扩增反应，获得PCR扩增产物。在本发明中，所述PCR扩增反应的体系优选以196孔PCR板+38％的试剂损耗计，包括：
所述PCR扩增反应的反应程序优选为：
预变性94℃2min；变性94℃20s，退火56℃30s，延伸72℃60s，45个循环；72℃保持3min。本发明在所述PCR扩增完成后，优选的将PCR扩增产物保存于4℃。本发明所述PCR扩增反应结束后，所述PCR扩增产物中含有目标SNP位点所在的DNA片段。
得到PCR扩增产物后，本发明用SAP酶对PCR扩增产物进行消化，获得消化后的产物。在本发明中，所述消化的体系优选以196孔PCR板+38％的试剂损耗计，包括：
所述消化的程序优选为：37℃，40min；85℃，5min。
在本发明中，所述消化后的产物优选的保存于4℃。本发明所述消化的作用为消化掉PCR扩增反应体系中的引物序列和剩余的dNTPs。
得到消化后的产物后，本发明以消化后的产物为模板，利用上述技术方案所述引物组中的延伸引物进行延伸反应，获得延伸产物。在本发明中，所述延伸反应的体系优选以196孔PCR板+38％的试剂损耗计，包括：
所述延伸反应的程序优选为：
94℃30s，1个循环；[94℃5s，(52℃5s，80℃5s)]；其中所述(52℃5s，80℃5s)进行5个循环，所述[94℃5s，(52℃5s，80℃5s)]进行40个循环；72℃3min，如表1所示。
表1延伸反应的程序
得到延伸产物后，本发明利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术分析延伸产物，确定ABCA7基因的基因型。
本发明还提供了上述技术方案所述的分子标记或上述技术方案所述的引物组或上述技术方案所述的试剂盒在绵羊育种中的应用，所述绵羊育种包括培育绵羊胸椎数多的品种。在本发明中，在所述绵羊辅助育种过程中，优选筛选基因型为GA的绵羊作为胸椎数多的绵羊。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种与绵羊胸椎数相关的SNP分子标记、引物组、试剂盒及检测方法和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
一种利用SequenomSNP技术检测绵羊ABCA7基因型并预测绵羊胸椎数的方法
1、实验材料
选取196只小尾寒羊绵羊为检测对象。
2、试剂及仪器
试剂：Complete Genotyping Reagent Kit forCompact；
基因扩增：ABI9700Dual；
质谱点样：MassARRAYNanodispenserRS1000；
质谱分析：MassARRAYCompact System；
所有试剂和仪器均购自北京康普森生物技术有限公司(Beijing CompassBiotechnology Co.,Ltd)。
3、基因组DNA的提取
采取绵羊背最长肌为组织样品，使用DNA提取试剂盒进行组织DNA提取。
4、SequenomSNP技术进行基因分型
针对绵羊第5号染色体上第409455978bp位点NC_056058.1(41220691..41238733)，基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v3.1设计引物组合。
PCR扩增引物的核苷酸序列如下：
2nd-PCRP：ACGTTGGATGGGAGAAGTGAGGAAAGAGTG(SEQ ID NO.1)；
1st-PCRP：ACGTTGGATGGCCTCTACCTACAGCAGATG(SEQ ID NO.2)；
延伸引物序列及延伸产物如表2所示。
表2延伸引物序列及延伸产物
上述引物由北京康普森生物技术有限公司合成。
检测流程如下：
1、提取待测绵羊的基因组DNA；
2、以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用上述引物2nd-PCRP和1st-PCRP进行PCR扩增反应；
3、用SAP酶对PCR扩增产物进行消化；
4、以消化后的PCR扩增产物为模板，利用所述延伸引物S1进行延伸反应；
5、分析延伸产物，从而对绵羊ABCA7基因型进行判定。
其中，PCR扩增反应使用的反应体系以196孔PCR板+38％的试剂损耗计为：10ng/μL基因组DNA270μL，10×PCR反应缓冲液168.75μL，25mmol/LMgCl287.75μL，25μmol/L dNTPs27μL，0.5μmol/L PCR Primermix 270μL，5U/μLTaqDNA聚合酶54μL，去离子水472.5μL；
PCR扩增反应的扩增程序为：94℃2min；94℃20s，56℃30s，72℃60s，45个循环；72℃3min；4℃保存。
对PCR扩增产物进行消化，使用的SAP酶消化体系以196孔PCR板+38％的试剂损耗计为：10×SAP Buffer45.9μL，1.7U/μL SAP Enzyme 81μL，去离子水413.1μL；
反应条件为：37℃40min，85℃5min，4℃保存。
延伸反应体系以196孔PCR板+38％的试剂损耗计为：10×iplex Buffer Plus 54μL，iplex Terminator 54μL，0.6～1.3μmol/L primer mix 217μL，iplex Enzyme 11.1μL，去离子水203.9μL；
反应条件为：94℃30s，1个循环；[94℃5s，(52℃5s，80℃5s)]；其中所述(52℃5s，80℃5s)进行5个循环，所述[94℃5s，(52℃5s，80℃5s)]进行40个循环；72℃3min；4℃保存。
将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上，进行MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解析电离飞行时间质谱)反应，利用Typer4.0软件检测质谱峰，并根据质谱峰图判读各样本目标位点基因型。
经质谱分析得到PCR扩增产物大小为402bp，延伸产物的质谱检测结果如图1所示。
分析：经SequenomMassARRAYSNP技术检测，质谱仪分析结果如图1，该图表示了每个体具体分型结果。
在196只小尾寒羊中，其中g.40945978G>A位点GG型191只、GA型4只，检出195个个体，检出率99.5％。
统计结果：
待测绵羊第5号染色体上第409455978bp位点不同基因型分析统计结果见表3。
表3待测绵羊第5号染色体上第409455978bp位点不同基因型分析统计
分析过程：
总个体数196只，其中GG个体数191只，GA个体数4只。
基因型频率(GG)＝基因型为GG的个体数/总个体数＝191/196＝0.97；
基因型频率(GA)＝基因型为GA的个体数/总个体数＝4/196＝0.02；
基因频率(G)＝(GG的基因型频率×2+GA的基因型频率)/(GG的基因型频率×2+GA的基因型频率×2)＝(0.97×2+0.02)/(0.97×2+0.02×2)＝0.99；
基因频率(A)＝GA的基因型频率/(GG的基因型频率×2+GA的基因型频率×2)＝0.02/(0.97×2+0.02×2)＝0.01；
多态信息含量＝1-(G的基因频率的平方+A的基因频率的平方)＝1-(0.992+0.012)＝0.02；
杂合度＝2×G的基因频率×A的基因频率＝2×0.99×0.01＝0.02
有效等位基因数＝1/(1-杂合度)＝1/(1-0.02)＝1.02
P值使用SPSS26.0通过卡方检验计算。
结论：ABCA7基因的g.40945978G>A位点中小尾寒羊多态信息含量是0.02，属于低度多态(PIC<0.25)；此位点中小尾寒羊P值为0.885，处于哈代温伯格平衡状态(P>0.05)。
待测绵羊第5号染色体上第409455978bp位点不同基因型与小尾寒羊胸椎数关联分析统计结果见表4。
表4待测绵羊第5号染色体上第409455978bp位点不同基因型与小尾寒羊(STH)胸椎数关联分析(平均值±标准误)
分析过程：使用SPSS 26.0软件计算基因型与胸椎数之间是否有显著关联。
结果显示：在小尾寒羊中，ABCA7基因的g.40945978G>A的位点与胸椎数呈显著相关(P<0.05)。
结论：在小尾寒羊群体中，ABCA7基因的g.40945978G>A位点突变可以增加胸椎数，在今后的育种过程中需要通过人工选择，增加g.40945978G>A位点A的频率，从而辅助小尾寒羊的培育。ABCA7基因的g.40945978G>A位点可做为潜在的多胸椎数的分子辅助选择标记。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 一种与绵羊胸椎数相关的SNP分子标记、引物组、试剂盒及检测方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acgttggatg ggagaagtga ggaaagagtg 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgttggatg gcctctacct acagcagatg 30
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgccctaccc ctgctac 17

Claims (7)

1.一种与绵羊胸椎数相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP位点位于绵羊第5号染色体上第40945978bp位点处；所述SNP位点位于ABCA7基因外显子区；基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v3.1，该位点的碱基存在G/A突变；所述SNP分子标记由核苷酸序列如SEQID No.1所示的第一引物和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示第的二引物扩增得到。
2.基于利用Sequenom SNP技术检测绵羊胸椎数的试剂盒的绵羊胸椎数的检测方法，包括以下步骤：
1)提取待测绵羊的基因组DNA；
2)以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用引物组中的第一引物和第二引物进行PCR扩增反应，获得PCR扩增产物；
3)用SAP酶对步骤2)获得的PCR扩增产物进行消化，获得消化后的产物；
4)以步骤3)获得的消化后的产物为模板，利用引物组中的延伸引物进行延伸反应，获得延伸产物；
5)利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术分析延伸产物，确定ABCA7基因的基因型；
所述试剂盒包括利用Sequenom SNP技术检测绵羊胸椎数的引物组；所述引物组包括第一引物、第二引物和延伸引物；所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述第二引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述延伸引物的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤2)中，所述PCR扩增反应的体系以196孔PCR板+38％的试剂损耗计，包括：
所述PCR扩增反应的反应程序为：
预变性94℃2min；变性94℃20s，退火56℃30s，延伸72℃60s，45个循环；72℃保持3min。
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤3)中，所述消化的体系以196孔PCR板+38％的试剂损耗计，包括：
所述消化的程序为：37℃，40min；85℃，5min。
5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤4)中，所述延伸反应的体系以196孔PCR板+38％的试剂损耗计，包括：
所述延伸反应的程序为：
94℃30s；94℃5s，52℃5s，80℃5s；其中所述52℃5s，80℃5s进行5个循环，所述94℃5s，52℃5s，80℃5s进行40个循环；72℃3min。
6.权利要求1所述的分子标记在绵羊育种中的应用，所述绵羊育种包括培育绵羊胸椎数多的品种。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述绵羊育种过程中，筛选基因型为GA的绵羊作为胸椎数多的绵羊。
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VRTN及NR6A1基因多态性与苏尼特羊胸椎数变异的相关性及组织表达分析;孙庆;刘树军;狄冉;胡文萍;王翔宇;马琳;张效生;张金龙;刘秋月;储明星;;农业生物技术学报(第05期);全文 *
孙庆 ; 刘树军 ; 狄冉 ; 胡文萍 ; 王翔宇 ; 马琳 ; 张效生 ; 张金龙 ; 刘秋月 ; 储明星 ; .VRTN及NR6A1基因多态性与苏尼特羊胸椎数变异的相关性及组织表达分析.农业生物技术学报.2019,(第05期),全文. *

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