CN109234403A

CN109234403A - 一种鉴定绵羊腰椎数相关性状的方法及专用引物

Info

Publication number: CN109234403A
Application number: CN201811171215.4A
Authority: CN
Inventors: 胡圣伟; 倪伟; 张翔宇; 李村院
Original assignee: Shihezi University
Current assignee: Shihezi University
Priority date: 2018-10-09
Filing date: 2018-10-09
Publication date: 2019-01-18
Anticipated expiration: 2038-10-09
Also published as: CN109234403B

Abstract

本发明公开了一种鉴定绵羊腰椎数相关性状的方法及其应用。本发明提供了鉴定绵羊腰椎数相关性状的方法，具体步骤为：采用特定引物对对待测绵羊基因组DNA进行PCR扩增，通过DNA测序与PCR‑SSCP技术进行多态性检测及快速分型，检测PCR扩增所得产物的自5’末端起第179位核苷酸为A或C，确定待测绵羊的基因型为AA或AC。该SNP位点与绵羊的腰椎数之间存在一定的相关性，AA基因型的待测绵羊的腰椎数多于AC基因型的待测绵羊。利用本发明可以对绵羊进行早期筛选，在绵羊育种方面具有一定的实践应用价值。

Description

一种鉴定绵羊腰椎数相关性状的方法及专用引物

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定绵羊腰椎数相关性状的方法及其应用。

背景技术

绵羊是重要的产肉经济动物。我国是世界养羊大国，肉羊产业发展的潜力和空间很大。绵羊肉营养价值高，蛋白质含量丰富，脂肪含量低，胆固醇含量低，已成为渐受青睐的健康肉类。椎骨数量是绵羊的重要经济性状，因为多脊椎个体中轴骨数目的增加影响其生产性能尤其是产肉性能，通过对多脊椎个体的选育可以大大提高群体的经济效益。多1个胸椎脊柱加长约2.40cm，多1个腰椎脊柱加长约3.5cm，当胸腰椎各多一个时脊柱长度增加5.9cm。无论多1个胸椎还是多1个腰椎，绵羊的活重、胴体重、净肉重和眼肌面积都明显增加，其中净肉平均增加4kg以上(张立岭,斯琴毕力格,张世铨.多脊椎蒙古羊的胸腰椎长度对产肉性能的影响[J].中国畜牧杂志,1998,34(3):24-25)。绵羊的脊椎包括颈椎、胸椎、腰椎、荐椎、尾椎，颈椎数较为固定一般为7根，荐椎和尾椎数也较为固定，多数的脊椎突变表现在胸椎和腰椎数目的改变。一般情况下，绵羊有13个胸椎，6个腰椎，通常表示为T13L6。多脊椎个体主要为三种：T14L7、T14L6和T13L7，其中T13L7突变个体最多，在被调查蒙古羊群体中占63.19％，三种多脊椎个体在群体中占到89.43％(张立岭,斯琴毕力格.蒙古羊多脊椎基因的群体遗传学研究[J].遗传,1997,19(增刊):67-69)。可见多脊椎羊占群体的绝大多数。脊椎数的增加可引起家畜体尺的加长，从而增加胴体产肉量，进而提高经济效益。因此从较为稳妥和长远的角度来看，以我国地方品种绵羊为素材，采用先进的育种方法培育我国自己的肉用绵羊品种具有重要意义。

NR6A1(nuclear receptor subfamily 6,group A,member 1)基因位于绵羊的3号染色体，编码产物是一种细胞核内的激素受体，该蛋白可以通过结合靶DNA序列，调控靶基因的表达，主要参与机体神经系统的形成以及生殖细胞的发育(GreschikH等,Characterization of the DNA-binding and dimerization properties of thenuclearorphan receptor germ cell nuclear factor.Molecular and cellular biology.1999,19:690-703)。Mikawa等对欧洲猪种比野生猪和亚洲猪多2～3个脊椎的现象进行了研究，结果显示位于猪1号和7号染色体上的2个数量性状基因座(QTL)与脊椎数目的增加相关。对1号染色体上的QTL进行精细定位，发现有一个标记在不同脊椎数的猪品种间存在突变，该标记编码的蛋白为核受体亚家族6，A类成员1(NR6A1)(Mikawa S,Hayashi T,Nii M,etal.2005.Two quantitative trait loci on Sus scrofa chromosomes 1and 7affectingthe number of vertebrae[J].Animal Science,83(10):2247-2254)。随后的研究发现，在欧洲猪种的NR6A1基因中存在一个SNP突变(NR6A1c.748C>T)，该突变使192位密码子的亮氨酸被替换成脯氨酸，从而改变了NR6A1蛋白与其共同作用的抑制蛋白的结合能力。另外在胚胎的体节中也发现了NR6A1基因的表达，这些证明NR6A1基因是影响猪脊椎数QTL的重要候选基因(Mikawa S,Morozumi T,Shimanuki S,et al.2007.Fine mapping of a swinequantitative trait locus fornumber of vertebrae and analysis of an orphannuclear receptor,germ cell nuclear factor(NR6A1)[J].Genome Research,17(5):586-593)。

发明内容

本发明的目的是提供一种与绵羊腰椎数相关的SNP位点及其应用。该SNP位点位于NR6A1基因内的绵羊基因组4.0版本参考序列3号染色体上第11204707个核苷酸位点A>C突变(记为g.11204707A>C)。本发明提供的应用具体可为如下中的任一种：(1)绵羊基因组PCR扩增所得产物的自5’末端起第179位核苷酸的单核苷酸多态性在鉴定或辅助鉴定待测绵羊的腰椎数相关性状中的应用；(2)用于检测绵羊基因组PCR扩增所得产物的自5’末端起第179位核苷酸的单核苷酸多态性的物质在鉴定或辅助鉴定待测绵羊的腰椎数相关性状中的应用。

本发明同时也提供一种用于鉴定或辅助鉴定待测绵羊的腰椎数相关性状的试剂。

本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定待测绵羊的腰椎数相关性状的试剂，是用于检测绵羊基因组中3号染色体上第11204707个核苷酸位点的单核苷酸多态性的引物对；该引物对由序列表中序列1所示的单链DNA和序列表中序列2所示的单链DNA组成的特异引物对。

进一步的，本发明提供一种鉴定或辅助鉴定待测绵羊腰椎数相关性状的方法。

具体可包括如下步骤：采用特定引物对对待测绵羊基因组DNA进行PCR扩增，通过DNA测序与PCR-SSCP技术进行多态性检测及快速分型，检测PCR扩增所得产物的自5’末端起第179位核苷酸(即绵羊基因组4.0版本参考序列3号染色体上第11204707个核苷酸)为A还是C，确定待测绵羊的基因型为AA还是AC。根据所述待测绵羊的基因组按照如下确定待测的腰椎数相关性状：AA基因型的待测绵羊的腰椎数多于AC基因型的待测绵羊。所述AA基因型为绵羊基因组3号染色体上第11204707个核苷酸位点为A的纯合型；所述AC基因型为绵羊基因组3号染色体上第11204707个核苷酸位点为A和C的杂合型。

进一步的，所述检测待测绵羊的基因组中3号染色体上第11204707个核苷酸为A还是C还是A和C的方法具体可为测序分析。所述测序分析包括PCR扩增和对PCR扩增产物进行测序两个步骤；所述PCR扩增所用的引物对满足以下条件：以待测绵羊的基因组DNA为模板进行PCR扩增所得扩增产物含有所述绵羊基因组中3号染色体上第11204707位核苷酸。

进一步的，所述PCR扩增所用的引物对具体可为由序列表中序列1所示的单链DNA和序列表中序列2所示的单链DNA组成的特异引物对。当采用所述引物对进行PCR扩增时，根据待测绵羊的基因组DNA不同，扩增得到的DNA片段为序列表中序列3所示的DNA片段或序列表中序列4所示的DNA片段。

本发明中，所述绵羊为新疆哈萨克羊。

本发明提供的方法可对待选绵羊进行早期筛选，有效的缓解实际生产中的选优良种羊时间长的问题，降低育种费用，有效增加实际生产中绵羊的腰椎数，增加产肉量，提高经济效益。本发明的检测方法操作简单，费用低，准确度高。在绵羊的育种方面具有很高的应用价值。

附图说明

图1为AA基因型个体(对应序列3)和AC基因型个体(对应序列3和序列4)绵羊NR6A1基因g.11204707A>C多态性位点附近序列的测序结果。

具体实施方式

结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细叙述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试剂、材料，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的哈萨克羊公众可从新疆乌鲁木齐华凌牛羊屠宰场获得，也可从其他地方获得，该生物材料只为本发明的相关实验所用，不可作为其它用途。

实施例1、绵羊NR6A1基因g.11204707A>C多态性位点的确定

1、实验材料选取

本实验选取新疆哈萨克绵羊为实验材料。采集腰椎数为6和7的哈萨克羊的肌肉组织分别为60和40份，分别提取基因组DNA，将每份样品的DNA浓度均调为100ng/μL，共得到100份哈萨克羊DNA样品，-80℃保存备用。

2、引物的设计与合成

从NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中调取绵羊NR6A1基因组DNA的信息，设计并合成如下引物：

U(上游引物)：5’-GAAGTCCCTCCCATTTCCTGTG-3’(序列1)

D(下游引物)：5’-AGCAAGGAAGGATTGGAAGC-3’(序列2)

3、PCR扩增

分别以步骤1得到的哈萨克绵羊的基因组DNA为模板，以U和D为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；PCR扩增体系：模板DNA100ng 1μL，2X Taq PCR MasterMix 10μL，上、下游引物各0.5μL(10pmol)，用ddH₂O补足体系至20μL；PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s；57℃退火30s；72℃延伸50s，共35个循环；最后72℃延伸10min。

4、扩增产物的单链构象多态性(SSCP)检测

取4μL扩增产物的双链DNA，与9μL上样缓冲液混合，98℃变性10min，立即冰浴5min，经非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE10％,Acr：Bis＝39：:1)电泳进行分型鉴定，电泳条件：4℃条件下300V电压预电泳，15min左右。然后120V过夜电泳12h左右终止电泳。凝胶经固定、银染、显色并拍照，然后根据不同的带型对各样品进行分型鉴定。结果表明，100个PCR扩增产物显示两种不同的带型。

5、测序及序列分析

挑选不同带型的PCR扩增产物，经回收纯化后进行测序，以确定突变位点及序列。测序结果表明，100个PCR扩增产物中，只存在一个脱氧核糖核苷酸的差异(A/C)，均为序列3和序列4中自5’末端起第179位核苷酸，该处的碱基在序列3中为A，在序列4中为C，如图1中箭头所示，该位点为绵羊基因组4.0版本参考序列3号染色体上自5’末端第11204707个核苷酸位点，因此将该位点命名为g.11204707A>C。

将在绵羊基因组4.0版本参考序列3号染色体上自5’末端第11204707个核苷酸位点(即步骤3得到的PCR产物自5’末端起第179位核苷酸)为A的纯合个体的基因型命名为AA；将在绵羊基因组4.0版本参考序列3号染色体上自5’末端第11204707个核苷酸位点(即步骤3得到的PCR产物自5’末端起第179位核苷酸)为A和C的杂合个体的基因型命名为AC。

实施案例二、绵羊NR6A1基因g.11204707A>C多态性位点与绵羊的腰椎数的关联性分析

为确定g.11204707A>C多态性位点与绵羊腰椎数是否相关，以100只哈萨克绵羊为实验材料，屠宰准确记录每个个体的腰椎数，确定其基因型，并进行基因突变位点与腰椎数的关联分析；采用SPSS13.0软件计算绵羊NR6A1基因g.11204707A>C多态性位点在群体中的基因型及等位基因频率，并使用卡方检验分析各群体中基因型是否处于Hardy-Weinberg平衡；结果如表1所示。

表1绵羊NR6A1基因g.11204707A>C多态性位点的基因频率与基因型频率在群体中的分布。

注：括号内为不同基因型或等位基因的个体数。

基因型检测结果表明，在100个个体中，AA基因型有51个个体，AC基因型为49个个体，没有检测到CC基因型个体。我们推测可能不存在该基因型，或者与样本量太少没有检测到该基因型有关。等位基因A与等位基因C在群体中的分布情况见表1，在该位点A等位基因为优势基因，在T13L7表型中AA基因型的频率为0.675，显著高于T13L6表型中AA基因型的频率。AA基因型的绵羊的腰椎数多于AC基因型的绵羊。经独立性卡方检验后，发现基因型频率在两种不同表型间差异达到显著水平(P<0.01)。

上述结果表明，用NR6A1基因内的绵羊基因组4.0版本参考序列3号染色体上自5’末端第11204707位单核苷酸多态性可用于鉴定绵羊的腰椎数相关性状。在实际绵羊育种中，为获得多腰椎数的绵羊，最好选择AA基因型的绵羊进行育种。

<110> 石河子大学

<120> 一种鉴定绵羊腰椎数相关性状的方法及专用引物

<160> 4

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

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gaagtccctcccatttcctgtg 22

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<212> DNA

<213> 人工序列

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agcaagaaggattggaagc 20

<210> 3

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<212> DNA

<213> 绵羊（Ovis aries）

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gaagtccctc ccatttcctg tggtcttttt tcacagatat caggggtctg accagtgcct 60

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<210> 4

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<213> 绵羊（Ovis aries）

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<400> 4

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Claims

1.一种鉴定绵羊腰椎数相关性状的方法，包括如下步骤：

a)采用所述引物对对待测绵羊基因组DNA进行PCR扩增，通过DNA测序与PCR-SSCP技术进行多态性检测及快速分型，检测PCR扩增所得产物的自5’末端起第179位核苷酸即绵羊基因组4.0版本参考序列3号染色体上第11204707个核苷酸为A或C，确定待测绵羊的基因型为AA或AC；

b)根据所述待测绵羊的基因组按照如下确定待测的腰椎数相关性状：AA基因型的待测绵羊的腰椎数多于AC基因型的待测绵羊；

所述AA基因型为绵羊基因组3号染色体上第11204707个核苷酸位点为A的纯合型；

所述AC基因型为绵羊基因组3号染色体上第11204707个核苷酸位点为A和C的杂合型。

2.根据权利要求1所述鉴定绵羊腰椎数相关性状的方法，其特征在于：所述确定待测绵羊的基因组3号染色体上第11204707个核苷酸位点为A或C的方法为测序分析，所述测序分析包括PCR扩增和对PCR扩增产物进行测序两个步骤；所述PCR扩增所用的引物对需满足以下条件：以待测绵羊的基因组DNA为模板进行PCR扩增所得扩增产物含有绵羊的基因组3号染色体上第11204707个核苷酸。

3.权利要求1所述鉴定绵羊腰椎数相关性状的方法，其特征在于：所述PCR扩增所用的引物对具体为由序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的引物对，

序列1：U(上游引物)：5’-GAAGTCCCTCCCATTTCCTGTG-3’

序列2：D(下游引物)：5’-AGCAAGGAAGGATTGGAAGC-3’。

4.权利要求1所述鉴定绵羊腰椎数相关性状的方法，其特征在于：所述待测绵羊为哈萨克羊。

5.权利要求1-4中所述鉴定绵羊腰椎数相关性状的方法在绵羊的育种中应用。

6.权利要求1-4中所述鉴定绵羊腰椎数相关性状的方法在培育具有多腰椎数性状的绵羊中的应用，包括如下步骤：检测待测绵羊的基因组中3号染色体上第11204707个核苷酸为A或C，若为A，则将待测绵羊的基因型记为AA；选取基因型为AA的待测绵羊进行育种。

7.一种用于鉴定绵羊腰椎数扩增时使用的引物，其特征在于：

U(上游引物)：5’-GAAGTCCCTCCCATTTCCTGTG-3’

D(下游引物)：5’-AGCAAGGAAGGATTGGAAGC-3’。